CN106619543A - 抗肿瘤海鞘多肽cs5931冻干粉针制剂及其制备方法 - Google Patents

抗肿瘤海鞘多肽cs5931冻干粉针制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂及其制备方法，其特征在于：所述制剂包括海鞘多肽CS5931和赋形剂。本发明针对海鞘多肽的特性，将其与辅料制成冻干粉针剂，制成的制剂溶解性及溶液稳定性良好，且大大提高了抗肿瘤海鞘多肽药物生物利用度。

Description

抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于药学科学领域，具体地涉及一种抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂及其制备方法。
背景技术
玻璃海鞘广泛分布于山东沿海地区，它是发育与进化生物学研究的重要生物，且近年来研究发现它具有抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、免疫调节以及生物催化等作用，因而引起人们广泛关注。玻璃海鞘具有广泛的应用价值，因此被《Science》杂志称为生物学研究的后起之秀，具有良好的应用前景。
从萨氏海鞘(Cionasavignyi)中分离出的一种新型多肽CS5931具有显著的抗肿瘤活性，N-末端序列分析发现，CS5931与人颗粒体蛋白(granulin，GRN)有同源性。本课题组已成功通过大肠杆菌原核表达系统表达了重组萨氏海鞘多肽CS5931，其同样具有显著的抗肿瘤活性。为提高海鞘多肽的稳定性和利用率，发挥其抗肿瘤的临床作用，因此发明一种将海鞘多肽制成抗肿瘤的冻干药物制剂具有十分重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂及其制备方法。
本发明采用如下技术方案实现：
一种抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂，其特征在于：所述制剂包括海鞘多肽CS5931和赋形剂。
进一步的，所述赋形剂选自糖类、多元醇类、聚合物类中的一种或几种；所述糖类选自葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、菊糖、纤维素中的一种或几种，多元醇选自甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、肌醇和硫醇中的一种或几种，聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、右旋糖苷、聚乙二醇、明胶、β-环糊精、纤维素中的一种或几种。
更进一步的，所述海鞘多肽CS5931与赋形剂的重量份数1：1～4，优选1：2。
本发明还提供了所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂的制备方法，其特征在于：称取海鞘多肽，加入适量注射用水溶解，加入赋形剂使溶解，补加注射用水至全量，用0.22μm滤膜无菌过滤，灌装，将混合后的溶液装入清洁无菌的西林瓶中，用胶塞半扣塞，冷冻干燥，即得。
进一步的，冻干过程是：预冻：板层温度为-35℃～-25℃，保温4-5小时；低温升华干燥：真空度0～30Pa，板层温度为-35℃～0℃，保温15-17小时；二次干燥：板层温度20～30℃，保温4-5小时以上。
更进一步的，冻干过程是：预冻：板层温度为-35℃，保温4小时；低温升华干燥：真空度0～30Pa，板层温度为-35℃～0℃，保温16小时；二次干燥：板层温度25℃，保温4小时以上。
本发明还提供了所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931的制备方法，其特征在于：将克隆编码多肽CS5931的基因在大肠杆菌中表达，并通过DEAE离子交换和Superdex75分子筛凝胶层析制备目的多肽；经变性复性后，制备好不带His标签的有活性的目的多肽；具体步骤如下：
1)海鞘多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵：克隆编码多肽CS5931的基因连接入质粒PET-21a载体上，导入表达菌BL21(DE3)构成工程菌BL21(DE3)/pET21a-CS5931(简称pET21a-CS5931,下同)，将pET21a-CS5931接种在含有氨苄的培养基上进行活化，活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中培养，接种后4-5h时加入IPTG进行诱导，继续发酵培养4.5-8.5h；
所述的IPTG添加的终浓度为0.4mM-0.7mM；所述的活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中的接种量在3-6％；所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基中发酵的装液量在20-45％；所述IPTG加入后的发酵温度为23℃-30℃；
2)海鞘多肽CS5931的分离纯化：通过DEAE阴离子交换柱层析和Superdex75分子筛凝胶层析制备；使目的多肽得到纯化；
3)所述的变性复性：向纯化好的目的多肽溶液中分次缓慢加入8M尿素，1-3mML-半胱氨酸，0.3-0.6mML-精氨酸，0.3-0.6mMEDTA，反应3-5h；多肽样品变性完成后，将变性样品放于透析袋中，在复性液中透析24-30h，期间换1次复性液；复性完成后，将复性液更换为透析液，透析3-5h，将透析完成的样品浓缩冻干得到纯化后的抗肿瘤海鞘多肽CS5931。
进一步，所述IPTG添加的终浓度为0.6mM时诱导表达效果最好；所述IPTG的添加时间为接种后4.5h；所述活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中接种量在4％，加入IPTG后发酵培养温度30℃，所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基发酵的装液量在20％；
进一步，所述的复性液的成份及其终浓度为0.3-0.6mML-精氨酸、0.5M尿素、1-3mML-半胱氨酸或还原型谷胱甘肽作为还原剂，0.1-0.3mML-胱氨酸或氧化型谷胱甘肽作为氧化剂，还原剂和氧化剂两者摩尔比为10:1，上述物质溶解在TGE缓冲液中。
TGE缓冲液的成份及其终浓度为是：0.05-0.15MTris，0.25-0.75mMEDTA，0.05-0.15MNaCl，加1.0L蒸馏水，1M盐酸调pH到8.0，加20-100mL甘油，混匀后定容至2L。透析液的成份及其终浓度为：0.05-0.15MTris，0.3-0.6mML-精氨酸、加600mL蒸馏水，1M盐酸调PH到8.0，溶解后定容到1000mL。
进一步，多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵：取-80℃保存的甘油菌pET21a-CS5931于含100μg/mLAmp的3mLLB培养基中，37℃，200r/min培养过夜后涂平板，37℃倒置培养12h，从平板上挑含有目的基因的表达菌BL21(DE3)的单菌落接于含100μg/mLAmp的10mLLB培养基中，37℃，200r/min活化培养12h，将活化的种子液以4％的接种量转接入50mLLB培养基中，培养基中含有100μg/mL的Amp，装液量为20％，37℃，200r/min培养，待OD600达到0.6左右时加入IPTG进行诱导，继续培养6.5h；
进一步，所述的海鞘多肽CS5931的分离纯化：将发酵所得菌体离心，收集菌体沉淀，称量菌重；冰上融解菌体沉淀，按每克菌加3-5mL细菌裂解液的比例加细菌裂解液，冰上裂解40-60min；超声波破碎菌体后，离心，取上清，用滤膜过滤；利用蛋白纯化系统，以0.05-0.5M的NaCl缓冲液作为洗脱液进行DEAE阴离子交换柱层析，收集0.15MNaCl缓冲液洗脱组分，待用；将上述收集的洗脱组分经Superdex75分子筛凝胶层析，用超纯水做洗脱液，流速为0.5-1.2mL/min，收集洗脱组分，待用。
采用冻干粉制剂，研究不同配方对制剂稳定性的影响，研究了甘露醇、蔗糖等赋形剂对多肽稳定性的影响，通过外观观察、稳定性试验等确定了冻干制剂的最佳配方。观察冻干制剂的外观，测定冻干制剂对结肠癌细胞的抑制作用。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明经大肠杆菌表达和层析分离纯化制备不带His标签的海鞘多肽CS5931；将纯化得到的多肽样品进行变性复性处理，可得到具有较好的肿瘤细胞体外增殖抑制作用的重组多肽CS5931，该方法制备的多肽保留了天然多肽的结构特点和生物活性；将海鞘多肽与辅料甘露醇制备成冻干粉制剂，在优化的配比下制成的制剂溶解性及溶液稳定性良好，且大大提高了抗肿瘤海鞘多肽药物生物利用度。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但这些实施例不以任何方式限制本发明。
实施例1：多肽CS5931大肠杆菌表达体系
克隆编码多肽CS5931的基因连接入质粒PET-21a载体上，导入表达菌BL21(DE3)。取-80℃保存的甘油菌pET21a-CS5931于含100μg/mLAmp的3mLLB培养基中，37℃，200r/min培养过夜后涂平板，37℃倒置培养12h。从平板上挑单菌落接于含100μg/mLAmp的10mLLB培养基中，37℃，200r/min活化培养12h。实验在250mL摇瓶中进行，将活化的种子液转接入50mLLB培养基中，培养基中含有100μg/mL的Amp，待培养至OD600达到0.6左右时加入0.6mMIPTG进行诱导，继续培养7h。
实施例2：海鞘多肽CS5931的分离纯化
(1)将发酵所得菌体离心，收集菌体沉淀，称量菌重。
(2)冰上融解菌体沉淀，按每克菌加3mL细菌裂解液的比例加细菌裂解液，冰上裂解40min。超声波破碎菌体后，10000r/min离心90min，取上清，用0.45μm滤膜过滤。
(3)利用AKTA-purifier蛋白纯化系统，以0.05-0.5M的NaCl缓冲液作为洗脱液进行DEAE阴离子交换柱层析，收集0.15MNaCl缓冲液洗脱组分，待用；
(4)将上述收集的洗脱组分经Superdex75分子筛凝胶层析，用超纯水做洗脱液，流速为0.5-1.2mL/min，收集洗脱组分，即为纯化好的目的多肽。
实施例3：海鞘多肽CS5931的变性和复性
向纯化得到的目的多肽溶液中分次缓慢加入8M尿素，2mML-半胱氨酸，0.5mML-精氨酸，0.5mMEDTA，反应4h；蛋白样品变性完成后，将变性样品放于透析袋中，在复性液中透析24h，期间换1次复性液；然后更换透析液，在透析液中透析3-5h，除去样品中的盐等杂质。复性液的配方为所述的复性液的配制方法为0.5mML-精氨酸、0.5M尿素、2mML-半胱氨酸，或2mM还原型谷胱甘肽，0.2mML胱氨酸或0.2mM氧化型谷胱甘肽，两者摩尔比为10:1，用TGE缓冲液定容至2L。TGE缓冲液的配方为24.2gTris，0.244gEDTA，5.85gNaCl，加1.0L蒸馏水，1M盐酸调PH到8.0，加20mL甘油，混匀后定容至2L。
实施例4：海鞘多肽冻干粉针剂的制备
1.海鞘多肽和辅料的类型及比例
按照冻干粉针剂的特点，所制备的样品外观应洁白、细腻、加水能迅速溶解，所得溶液应澄明。为使本发明的冻干粉针具有上述特点，设定4个不同的样品，详细见表1。
表1海鞘多肽和辅料的类型及比例
结果表明采用50mg CS5931+100mg蔗糖(配方2)或50mg CS5931+100mg(配方4)甘露醇效果最好。
2.冻干工艺：冷冻干燥包括预冻、低温升华和解吸干燥3个阶段，根据这3个阶段的冷冻干燥原理，设计3个冻干工艺分别考察样品的各项指标，按表2进行实验优选出最佳的冻干工艺。结果见表3。
表2冻干工艺参数
考察3种工艺所得样品的各项指标，结果见表3
表3冻干样品的结果比较
据表3结果可知，冻干工艺3所得样品的成型性和机械强度均较前两个工艺好，溶解性方面3个工艺相差不大，综合考虑，冻干工艺3作为本品的冻干工艺。
3.稳定性考察：
将样品分别置于强光(4500±500)LX、RH75、RH92.5、高温(60℃)下放置10d，分别于0，5，10d取样考察样品形状、pH值、溶液的澄清度、水分、含量。
表4配方2稳定性考察试验结果
表5配方4稳定性考察试验结果
实验研究表明：本发明的两种配方的海鞘多肽粉针剂在强光、高温、高湿等条件下各项指标均无明显化，具较佳的稳定性。
4.药效学研究(体外抗肿瘤活性)
采用MTT法测定冻干制剂对结肠癌细胞的抑制作用。取对数生长期的细胞，去除原细胞培养液，用PBS缓冲液冲洗2次，加入适量胰蛋白酶液进行消化，离心收集细胞。去除上清液，加入适量新鲜的细胞培养液，轻轻吹打细胞制成单细胞悬液。对细胞计数，按每孔180μL接种于96孔细胞培养板中，调整细胞密度，使每孔中的细胞数目在5000个左右。细胞培养箱中培养过夜，细胞覆盖微孔50％左右的面积时，每孔加入20μL待测样品，设置3个平行孔。阴性空白对照每孔加入20μLPBS。细胞培养箱中孵育48h，每孔加入MTT溶液20μL，继续孵育4h。终止培养，小心吸除150μL培养基，每孔加入二甲亚砜150μL，置多功能微孔板检测仪中低速振荡10min，使蓝紫色结晶完全溶解。用多功能微孔板检测仪测定490nm/562nm波长处各孔的吸光值。取三个平行孔的平均OD值，按照如下公式计算细胞抑制率，当细胞抑制率为50％时，所对应的药物浓度为半数抑制浓度IC50。
细胞抑制率(％)＝(OD对照组-OD实验组)/OD对照组×100％
不同样品对结肠癌表现出不同的抗肿瘤活性，结果见表6，说明配方4具有更好的抗肿瘤作用。
表6海鞘多肽冻干制剂对结肠癌的增殖抑制作用

Claims (10)

1.一种抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂，其特征在于：所述制剂包括海鞘多肽CS5931和赋形剂。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂，其特征在于：所述赋形剂选自糖类、多元醇类、聚合物类中的一种或几种；所述糖类选自葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、菊糖、纤维素中的一种或几种，多元醇选自甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、肌醇和硫醇中的一种或几种，聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、右旋糖苷、聚乙二醇、明胶、β-环糊精、纤维素中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂，其特征在于：所述海鞘多肽CS5931与赋形剂的重量份数1：1～4，优选1：2。
4.一种如权利要求1中所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂的制备方法，其特征在于：称取海鞘多肽，加入适量注射用水溶解，加入赋形剂使溶解，补加注射用水至全量，用0.22μm滤膜无菌过滤，灌装，将混合后的溶液装入清洁无菌的西林瓶中，用胶塞半扣塞，冷冻干燥，即得。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂的制备方法，其特征在于：冻干过程是：预冻：板层温度为-35℃～-25℃，保温4-5小时；低温升华干燥：真空度0～30Pa，板层温度为-35℃～0℃，保温15-17小时；二次干燥：板层温度20～30℃，保温4-5小时以上。
6.一种如权利要求1中所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931冻干粉针制剂的制备方法，其特征在于：冻干过程是：预冻：板层温度为-35℃，保温4小时；低温升华干燥：真空度0～30Pa，板层温度为-35℃～0℃，保温16小时；二次干燥：板层温度25℃，保温4小时以上。
7.一种如权利要求1中所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931的制备方法，其特征在于：将克隆编码多肽CS5931的基因在大肠杆菌中表达，并通过DEAE离子交换和Superdex75分子筛凝胶层析制备目的多肽；经变性复性后，制备好不带His标签的有活性的目的多肽；具体步骤如下：
1)海鞘多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵：克隆编码多肽CS5931的基因连接入质粒PET-21a载体上，导入表达菌BL21构成工程菌BL21/pET21a-CS5931，简称pET21a-CS5931，将pET21a-CS5931接种在含有氨苄的培养基上进行活化，活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中培养，接种后4-5h时加入IPTG进行诱导，继续发酵培养4.5-8.5h；
所述的IPTG添加的终浓度为0.4mM-0.7mM；所述的活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中的接种量在3-6％；所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基中发酵的装液量在20-45％；所述IPTG加入后的发酵温度为23℃-30℃；
2)海鞘多肽CS5931的分离纯化：通过DEAE阴离子交换柱层析和Superdex75分子筛凝胶层析制备；使目的多肽得到纯化；
3)所述的变性复性：向纯化好的目的多肽溶液中分次缓慢加入8M尿素，1-3mML-半胱氨酸，0.3-0.6mML-精氨酸，0.3-0.6mMEDTA，反应3-5h；多肽样品变性完成后，将变性样品放于透析袋中，在复性液中透析24-30h，期间换1次复性液；复性完成后，将复性液更换为透析液，透析3-5h，将透析完成的样品浓缩冻干得到纯化后的抗肿瘤海鞘多肽CS5931。
8.根据权利要求1中所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述IPTG添加的终浓度为0.6mM时诱导表达效果最好；所述IPTG的添加时间为接种后4.5h；所述活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中接种量在4％，加入IPTG后发酵培养温度30℃，所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基发酵的装液量在20％；
所述的复性液的成份及其终浓度为0.3-0.6mML-精氨酸、0.5M尿素、1-3mML-半胱氨酸或还原型谷胱甘肽作为还原剂，0.1-0.3mML-胱氨酸或氧化型谷胱甘肽作为氧化剂，还原剂和氧化剂两者摩尔比为10:1，上述物质溶解在TGE缓冲液中；TGE缓冲液的成份及其终浓度为是：0.05-0.15MTris，0.25-0.75mMEDTA，0.05-0.15MNaCl，加1.0L蒸馏水，1M盐酸调pH到8.0，加20-100mL甘油，混匀后定容至2L。透析液的成份及其终浓度为：0.05-0.15MTris，0.3-0.6mML-精氨酸、加600mL蒸馏水，1M盐酸调pH到8.0，溶解后定容到1000mL。
9.根据权利要求1中所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931的制备方法，其特征在于：步骤1)中，多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵：取-80℃保存的甘油菌pET21a-CS5931于含100μg/mLAmp的3mLLB培养基中，37℃，200r/min培养过夜后涂平板，37℃倒置培养12h，从平板上挑含有目的基因的表达菌BL21(DE3)的单菌落接于含100μg/mLAmp的10mLLB培养基中，37℃，200r/min活化培养12h，将活化的种子液以4％的接种量转接入50mLLB培养基中，培养基中含有100μg/mL的Amp，装液量为20％，37℃，200r/min培养，待OD600达到0.6左右时加入IPTG进行诱导，继续培养6.5h。
10.根据权利要求1中所述的抗肿瘤海鞘多肽CS5931的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述的海鞘多肽CS5931的分离纯化：将发酵所得菌体离心，收集菌体沉淀，称量菌重；冰上融解菌体沉淀，按每克菌加3-5mL细菌裂解液的比例加细菌裂解液，冰上裂解40-60min；超声波破碎菌体后，离心，取上清，用滤膜过滤；利用蛋白纯化系统，以0.05-0.5M的NaCl缓冲液作为洗脱液进行DEAE阴离子交换柱层析，收集0.15MNaCl缓冲液洗脱组分，待用；将上述收集的洗脱组分经Superdex75分子筛凝胶层析，用超纯水做洗脱液，流速为0.5-1.2mL/min，收集洗脱组分，待用。
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