CN116286371B - 一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方，包括豌豆蛋白粉15‑20重量份、甜菜碱10‑15重量份、分枝低聚糖3‑8重量份、羟丙基甲基纤维素醚6‑10重量份、硫胺素0.2‑0.5重量份、VPP 0.05‑0.1重量份、游离氨基酸6‑10重量份、透明质酸12‑18重量份。本发明处理后的豌豆蛋白粉可以稳定细胞膜成分，减少菌体细胞损伤又不会被分解，使冻干粉的组分一直处于平衡状态；甜菜碱具有极佳的吸水性能，其主要功能为保护蛋白分子不失水变性失活。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体为一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方。
背景技术
冻干技术在微生物领域主要有以下应用：微生物菌种的冻干保存是冻干技术在微生物领域的重要技术之一；冻干法是目前最常用的也是最有效的菌种保存方法，适用于绝大多数微生物菌种，保存期长，成活率高，目前已经是长期保存细菌，酵母等真菌的主要方式。
嗜黏蛋白阿克曼氏菌是一种人类肠道的正常菌，是一种粘蛋白分解细菌，菌株MucT于2004年分离，为卵圆形，革兰阴性的厌氧菌，是疣微菌门的代表。该类菌株与肥胖、糖尿病、心血管疾病和低度炎症呈负相关。口服嗜粘蛋白阿克曼菌可改善小鼠代谢疾病的相关症状，嗜粘蛋白阿克曼菌有望成为治疗2型糖尿病和肥胖的候选药物。
该细菌与现有的革兰氏阴性菌不同的是其可以分解人类肠道黏蛋白，并且对动物蛋白有一定的分解作用，所以，现有的冻干保护剂不适合该细菌的冻干保护，并且使用现有的冻干保护剂不但降低该类冻干细菌的成活率，而且其生物活性也会明显降低。因为目前的冻干保护剂主要有脱脂乳、海藻糖、三聚磷酸钾和抗坏血酸作为保护剂，主要原因包括如下几点。脱脂乳不管单独使用还是与其他冻干保护剂混合使用均具有良好的保护作用，它在冻干过程中能使溶液呈过冷状态，抑制细胞内蛋白质的变性失活，维持细胞内稳态以降低细胞死亡率，另外，它含有大量的蛋白质，能够减少细胞暴露于氧气和介质中的表面积，给细胞提供了保护性的外衣，减少细胞壁损伤。海藻糖在冻干过程中能扩散至胞内并填充在胞内酶和其他蛋白质等活性大分子周围，当细胞失水时，海藻糖的羟基可与胞内的生物活性大分子的极性基团形成氢键，代替极性基团周围失去的水分子，从而维持细胞内蛋白质分子的稳定性。抗坏血酸的羟基能够与乳酸菌菌体细胞壁中磷脂分子的磷酸基团之间形成氢键，从而抑制细胞膜因失水而受损。三聚磷酸钾能够在胞内液中结合水分子，发生水合作用，使胞内液的粘性增加，从而在冻干过程中弱化了水的结晶过程，降低了体系中水转化成冰的比例，使其直接进入升华阶段。
申请人进行保藏的嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851，经过试验测定，采用现有的冻干保护剂进行冻干的嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851，其成活率不到28%，并且生物活性不到原来的1/10。另外冻干保护剂不仅要从细胞学角度对菌种的稳定性进行考虑，更要考虑到在冻干过程中外界因素对细胞的毒性侵害。为解决现有技术中存在的问题，申请人的研发人员对该问题进行了深入研究，研发出一种针对提高嗜黏蛋白阿克曼氏菌株冻干效果的冻干保护剂配方。
发明内容
本发明的目的在于解决上述背景技术中提出的至少问题之一，为此本发明提供一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方，采用本发明的配方制备的冻干保护剂具有对嗜黏蛋白阿克曼氏菌具有高成活率，高活性的优点。
具体方案为：一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方，包括豌豆蛋白粉15-20重量份、甜菜碱10-15重量份、分枝低聚糖3-8重量份、羟丙基甲基纤维素醚6-10重量份、硫胺素0.2-0.5重量份、VPP 0.05-0.1重量份、游离氨基酸6-10重量份、透明质酸12-18重量份。
丙基甲基纤维素醚的分子量小于240。
所述游离氨基酸为天然α—氨基酸。
所述豌豆蛋白粉经过如下处理，本发明还提供一种豌豆蛋白粉的处理工艺，具体为：
选普通的豌豆蛋白粉10-20g加入0.05-0.2mol/L、pH8-9的硼酸钠缓冲液200mL，缓慢搅拌，之后加入20-30g海藻糖，在3000-5000LEX强度波长520-600nm紫外光下照射并同时搅拌30-50min，同时加温至50-60℃，进行接枝反应，得到的产物中含有海藻糖接枝的豌豆蛋白粉。反应完毕后，分三次加入去离子水进行透析清洗，每次600-800ml，洗掉小分子后将获得的产物进行干燥，得到含有部分海藻糖接枝的豌豆蛋白粉混合物复合物，即本技术方案中的处理后的豌豆蛋白粉。
所述甜菜碱为磷酸酯甜菜碱。
所述磷酸酯甜菜碱为十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱和十四烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱的任一种或两种混合。
所述硫胺素和VPP 的重量份数比为3:1-6:1。
本发明还提出一种冻干保护剂的制备方法：采用本发明冻干保护剂的配方，称取冻干保护剂重量份2-3倍的去离子水，将配方中的冻干保护剂加入去离子水中，搅拌均匀，然后杀菌处理，处理方式1为升温至95-103℃，保持温度30min，然后冷却至常温，得到冻干保护剂；处理方式2为紫外线杀菌处理。经过测试发现，优选处理方式2。
本发明还提出一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌冻干剂的制备方法，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌冻干粉包括嗜黏蛋白阿克曼氏菌的菌泥和本发明的冻干保护剂，制备温度和工艺参考现有菌株冻干粉的加工工艺。
本发明中涉及的菌株嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851，申请人于2022年3月14日将其保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：62290，保藏单位名称为：广东省科学院微生物研究所，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类学名称为：Akkermansia muciniphila。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
1、本发明处理后的豌豆蛋白粉可以稳定细胞膜成分，减少菌体细胞损伤又不会被分解，使冻干粉的组分一直处于平衡状态；甜菜碱具有极佳的吸水性能，其主要功能为保护蛋白分子不失水变性失活；分枝低聚糖在抑制其他细菌的同时可以促进嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌体细胞繁殖，羟丙基甲基纤维素醚因具有较多的氢键、疏水键能够维持细胞膜上及细胞膜内蛋白质的三级结构稳定性，硫胺素和VPP混合主要功能为可以促进菌群生长，游离氨基酸能够维持菌体pH值相对稳定，防止菌体生物活力下降，透明质酸具有很好的保湿效果，和甜菜碱组合保护细菌细胞膜不失水的同时，还有效调节细胞内渗透压的平衡。
2、通过处理方式2得到的冻干保护剂效果更佳，发明人推测其原理为质酸、分枝低聚糖等小分子糖和豌豆蛋白粉在紫外光照作用下发生反应，部分糖类小分子接枝到蛋白上，得到了吸湿性能更佳的络合物，提高了对冻干菌株的保护效果。
附图说明
附图1为采用实施例1、5、6、7的冻干保护剂制备的嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851冻干剂活性测试结果。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
处理豌豆蛋白粉：选普通的豌豆蛋白粉18g加入0.1mol/L、pH8-9的硼酸钠缓冲液200mL，缓慢搅拌，之后加入22g海藻糖，在3000-5000LEX强度波长520-600nm紫外光下照射并同时搅拌35min，同时加温至50-60℃，进行接枝反应，得到的产物中含有海藻糖接枝的豌豆蛋白粉。反应完毕后，分三次加入去离子水进行透析清洗，每次600-800ml，洗掉小分子后将获得的产物进行干燥，得到含有部分海藻糖接枝的豌豆蛋白粉混合物复合物，即本技术方案中的豌豆蛋白粉。
一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方及制备：冻干保护剂原料包括豌豆蛋白粉18g、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱12g、分枝低聚糖6g、羟丙基甲基纤维素醚6g、硫胺素0.2g、VPP 0.05g、天然α—氨基酸8g、透明质酸15g。
提高菌株冻干效果的冻干保护剂的制备方法为：采用以上冻干保护剂的配方原料，称取冻干保护剂重量份2倍的去离子水，将配方中的冻干保护剂加入去离子水中，搅拌均匀，然后杀菌处理，处理方式1为升温至100℃，保持温度30min，然后冷却至常温，得到实施例1的冻干保护剂。
将实施例1的冻干保护剂和嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851的菌泥进行混合，冻干保护剂的用量为菌泥的2倍，然后通过多阶段低温冻干处理，得到嗜黏蛋白阿克曼氏菌冻干粉。
实施例2：
参考实施例1，制备冻干保护剂的工艺不同，具体为：采用实施例1的冻干保护剂的配方原料，称取冻干保护剂重量份2倍的去离子水，将配方中的冻干保护剂加入去离子水中，搅拌均匀，然后杀菌处理，处理方式2为在紫外线波长为520nm强度为3200LEX温度为45℃下处理30min，得到实施例2的冻干保护剂。
实施例3：
参考实施例2，区别为原料采用的是普通豌豆粉。冻干保护剂原料包括豌豆蛋白粉16g、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱14g、分枝低聚糖5g、羟丙基甲基纤维素醚5g、硫胺素0.5g、VPP 0.1g、天然α—氨基酸6g、透明质酸12g。
冻干保护剂的制备方法为：采用上述冻干保护剂的配方原料，称取冻干保护剂重量份2倍的去离子水，将配方中的冻干保护剂加入去离子水中，搅拌均匀，然后杀菌处理，处理方式2为在紫外线波长为520nm强度为3200LEX温度为45℃下处理30min，得到实施例3的冻干保护剂。
实施例4：
参考实施例3，但区别为冻干保护剂的制备方法，具体为：采用实施例3的冻干保护剂的配方原料，称取冻干保护剂重量份2倍的去离子水，将配方中的冻干保护剂加入去离子水中，搅拌均匀，然后杀菌处理，处理方式1为升温至100℃，保持温度30min，然后冷却至常温，得到实施例4的冻干保护剂。
实施例5：
一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方及制备：冻干保护剂原料包括豌豆蛋白粉18g、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱12g、分枝低聚糖6g、羟丙基甲基纤维素醚6g、硫胺素0.5g、VPP 0.05g、天然α—氨基酸8g、透明质酸15g。
提高菌株冻干效果的冻干保护剂的制备方法为：采用以上冻干保护剂的配方原料，称取冻干保护剂重量份2倍的去离子水，将配方中的冻干保护剂加入去离子水中，搅拌均匀，然后杀菌处理，处理方式2为在紫外线波长为520nm强度为3200LEX温度为45℃下处理30min，得到实施例5的冻干保护剂。
实施例6：
部分配方参考实施例5，制备方法参考实施例5。
一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方及制备：冻干保护剂原料包括豌豆蛋白粉18g、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱12g、分枝低聚糖6g、羟丙基甲基纤维素醚6g、硫胺素0g、VPP 0.1g、天然α—氨基酸8g、透明质酸15g。
提高菌株冻干效果的冻干保护剂的制备方法为：采用以上冻干保护剂的配方原料，称取冻干保护剂重量份2倍的去离子水，将配方中的冻干保护剂加入去离子水中，搅拌均匀，然后杀菌处理，处理方式2为在紫外线波长为520nm强度为3200LEX温度为45℃下处理30min，得到实施例6的冻干保护剂。
实施例7：
部分配方参考实施例6，制备方法参考实施例6。
一种提高菌株冻干效果的冻干保护剂配方及制备：冻干保护剂原料包括豌豆蛋白粉18g、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱12g、分枝低聚糖6g、羟丙基甲基纤维素醚6g、硫胺素0.5g、VPP 0g、天然α—氨基酸8g、透明质酸15g。
提高菌株冻干效果的冻干保护剂的制备方法为：采用以上冻干保护剂的配方原料，称取冻干保护剂重量份2倍的去离子水，将配方中的冻干保护剂加入去离子水中，搅拌均匀，然后杀菌处理，处理方式2为在紫外线波长为520nm强度为3200LEX温度为45℃下处理30min，得到实施例7的冻干保护剂。
将实施例1-7的冻干保护剂和嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851的菌泥进行混合，冻干保护剂的用量为菌泥的2倍，然后通过0℃低温冻干处理，得到实施例1-7的嗜黏蛋白阿克曼氏菌冻干粉。
将以上冻干粉进行冻干存活率测试，测试方法为：
冻干前总活菌数检测：分别称量1g实施例1-7冻干前的仿生培养基的菌泥，加入到19mL含有玻璃珠的生理盐水中，振荡30min，取1mL菌液至19mL生理盐水中进行梯度稀释，取1mL稀释液于培养皿内，加入仿生动物培养基，摇匀，倾注3个梯度，每个梯度3个平行，将凝固后的培养皿放于37℃恒温培养箱中培养48h后取出计数，再乘以菌泥重量，得到冻干前总活菌数；
冻干后总活菌数检测：分别称量1g实施例1-7的嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851的冻干粉，加入到19mL含有玻璃珠的生理盐水中，振荡30min，取1mL菌液至19mL生理盐水中进行梯度稀释，取1mL稀释液于培养皿内，仿生动物培养基，摇匀，倾注3个梯度，每个梯度3个平行，将涂布后的培养皿放于37℃恒温培养箱中培养48h后取出计数，得到冻干后总活菌数。
冻干存活率检测：
冻干存活率计算公式为，
冻干存活率(％)＝冻干后总活菌数÷(冻干前菌泥总活菌数×冻干前菌泥重量/(2×冻干后菌粉重量))×100％；
通过试验结果如下：
表1-冻干后活菌含量和成活率测试结果
关于冻干粉活性的测试：
将嗜黏蛋白阿克曼氏菌仿生培养基高温灭菌并冷却后，向培养基中加入实施例1-7的嗜黏蛋白阿克曼氏冻干粉0.1g，然后置于封闭的容器，同时放入两个厌氧产气袋，在37℃下进行培 养，4d后取出，3000rpm离心10min，再用2mL的无菌PBS重悬沉淀后，加入到96孔板中，每孔 200μL，使用酶标仪于595nm处，测定菌液的OD值，重复测三次，取平均值，所得结果如表2所示。
表2-OD595测试结果
结合表格数据可知，嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851不同冻干保护剂活的菌数和成活率如表1、表2所示，实施例1、2、4保持较高的活菌数和较好的活性，由此可见，虽然实施例3采用的是普通豌豆蛋白粉，但因冻干保护剂制备方法中采用的是紫外线微热照射杀菌处理，紫外线同时对原料之间的接枝、交联等反应起到了较大的促进作用，制备的冻干保护剂效果也非常突出。通过实施例1和实施例2相比，紫外线照射可以提高配方之间的交联或络合，提高了冻干保护剂的保护效果；实施例1与实施例5相比，硫胺素和VPP的比例对冻干保护剂的功能影响较大，硫胺素和VPP的重量份数比为10:1时，已经降低了冻干保护剂的促进作用，尤其是实施例2的数据可以看出，成活率100%即冻干粉中嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851的死亡率=嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851的增殖率，所以硫胺素和VPP在4-5:1时，其促进该菌的增殖效果较好。通过实施例6、7也可以看出，仅仅其中一种维生素对嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851的促进增殖效果极不明显。
通过实施例1、3、4的试验数据分析，普通豌豆蛋白粉处理后作为原料加工的冻干保护剂可以提高嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851的成活率和活性，但如果使用普通豌豆蛋白粉，在冻干粉加工过程中采用紫外光照射处理，也可以提高冻干保护剂的保护性能。
为了进一步试验本发明的配方，实施例8的配方中删除了甜菜碱，实施例9的配方中删除了分枝低聚糖，制备方法参考实施例1，结果发现嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851的成活率低于40%，OD值小于0.83。所以本发明的配方中有多种原料的配合才能提高该冻干保护剂对嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851的保护效果。
将实施例1和实施例5、6、7的冻干保护剂加工为嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851冻干剂，再进行37℃下培养，测定菌株活性数据如附图1，通过以上数据可以清楚地得出，实施例1的冻干保护剂加工的嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851，其活性更加稳定。
实施例1-9的冻干保护剂加工为实施例1-9的嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851冻干剂，在-20℃下不同时间段保存后活菌数量如下表3：
表3—-20℃下保存活菌数量统计表
实施例1-9的冻干保护剂加工为实施例1-9的嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851冻干剂，在4℃下不同时间段保存后活菌数量如下表4：
表4 —4℃下保存活菌数量统计表
实施例1-9的冻干保护剂加工为实施例1-9的嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851冻干剂，在常温22℃下不同时间段保存后活菌数量如下表5：
表5 —常温22℃下保存活菌数量统计表
通过以上表格发现，本发明的实施例1-4，尤其是实施例1、2、4的嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851活菌数值稳定，成活率高，并且在不同温度下保存，实施例1-4的活菌数量均相对稳定，实施例1、2、4的冻干保护剂配方对嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851的冻干保护效果较好。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种提高菌株冻干存活率的冻干保护剂配方，其特征在于：包括处理后的豌豆蛋白粉15-20重量份、十二烷基羟丙基磷酸酯甜菜碱10-15重量份、分枝低聚糖3-8重量份、羟丙基甲基纤维素醚5-6重量份、硫胺素0.2-0.5重量份、VPP 0.05-0.1重量份、天然α—氨基酸6-10重量份、透明质酸12-18重量份；
所述处理后的豌豆蛋白粉经过如下步骤得到，具体为：选普通的豌豆蛋白粉10-20g加入0.05-0.2mol/L、pH8-9的硼酸钠缓冲液200mL，缓慢搅拌，之后加入20-30g海藻糖，在3000-5000LEX强度波长520-600nm紫外光下照射并同时搅拌30-50min，同时加温至50-60℃，进行接枝反应，得到的产物中含有海藻糖接枝的豌豆蛋白粉；反应完毕后，用去离子水进行透析清洗，将洗掉小分子后将获得的产物进行干燥，得到含有部分海藻糖接枝的豌豆蛋白粉混合物复合物，即处理后的豌豆蛋白粉；
所述硫胺素和VPP 的重量份数比为4:1-5:1；
所述菌株为嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851，保藏编号为：GDMCC No：62290，分类学名称为：Akkermansia muciniphila。
2.根据权利要求1所述的一种提高菌株冻干存活率的冻干保护剂配方，其特征在于：所述羟丙基甲基纤维素醚的分子量小于240。
3.一种提高菌株冻干存活率的冻干保护剂的制备方法：其特征在于：采用权利要求1-2任一项所述的冻干保护剂的配方，称取冻干保护剂重量份2-3倍的去离子水，将配方中的冻干保护剂加入去离子水中，搅拌均匀，然后杀菌处理，得到提高菌株冻干存活率的冻干保护剂。
4.根据权利要求3所述的一种提高菌株冻干存活率的冻干保护剂的制备方法，其特征在于：杀菌处理的方式为升温至95-103℃，保持温度30min，然后冷却至常温。
5.根据权利要求3所述的一种提高菌株冻干存活率的冻干保护剂的制备方法，其特征在于：杀菌处理的方式为紫外线杀菌处理。
6.一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌冻干粉，其特征在于：所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌冻干粉包括嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851的菌泥和根据权利要求4-5任一项所述制备方法所得到的提高菌株冻干存活率的冻干保护剂；
所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌M1851，保藏编号为：GDMCC No：62290，分类学名称为：Akkermansia muciniphila。
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- 2023-03-07 CN CN202310211619.6A patent/CN116286371B/zh active Active
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