CN109749964A

CN109749964A - 提高嗜酸乳杆菌发酵与冻干活菌数的培养基处理方法

Info

Publication number: CN109749964A
Application number: CN201910140769.6A
Authority: CN
Inventors: 宋锦安; 马章献; 陈齐; 郑建丰
Original assignee: Biogrowing Shanghai Co ltd
Current assignee: Biogrowing Shanghai Co ltd
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2019-05-14

Abstract

本发明涉及菌种培养基技术领域，具体地说是一种提高嗜酸乳杆菌发酵与冻干活菌数的培养基处理方法。本发明同现有技术相比，根据嗜酸乳杆菌营养需求，在添加有机豌豆蛋白粉增菌试验的基础上，减少发酵液离心、乳化、冻干后的杂质，以提高嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数。

Description

提高嗜酸乳杆菌发酵与冻干活菌数的培养基处理方法

技术领域

本发明涉及菌种培养基技术领域，具体地说是一种提高嗜酸乳杆菌发酵与冻干活菌数的培养基处理方法。

背景技术

嗜酸乳杆菌是栖息在人体肠道内的有益菌之一，当存在一定数量时，它能有利地调节肠道内有益和有害微生物菌群间的平衡，从而达到促进宿主健康的功效，它作为目前乳酸菌家族中极为重视研究和开发价值的益生菌，被视为第三代乳酸发酵剂菌种。乳酸菌活菌制剂是以其所含活菌的积极生命活动而达到调节其宿主微生态平衡的，其中活菌含量的高低始终是评定产品质量的一项关键指标。国内关于嗜酸乳杆菌的研究已经不少，但产品活菌数相对较低。因此，优化设计嗜酸乳杆菌增菌培养基是一项十分重要的基础研究工作。

嗜酸乳杆菌有复杂的营养要求，需要较低的氧分压、可发酵的糖类、蛋白质、氨基酸、肽、核酸衍生物、脂肪或脂肪酸类物质、微量元素、大量的B族维生素满足它们的生长。

因此，需要设计一种提高嗜酸乳杆菌发酵与冻干活菌数的培养基处理方法，满足嗜酸乳杆菌营养需求，以提高嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种提高嗜酸乳杆菌发酵与冻干活菌数的培养基处理方法，满足嗜酸乳杆菌营养需求，以提高嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数。

为了达到上述目的，本发明是一种提高嗜酸乳杆菌发酵与冻干活菌数的培养基处理方法，其特征在于：按如下步骤进行：步骤1，在250ml平底瓶中装200ml的MRS种子培养基，接种保存的嗜酸乳杆菌甘油管，置于37℃恒温培养箱并静置培养12小时，形成嗜酸乳杆菌种子；步骤2，转接2%的嗜酸乳杆菌种子至200ml的MRS种子培养基中，培养6至8小时，形成2%嗜酸乳杆菌种子；步骤3，取10g/L的有机豌豆蛋白粉，倒入含10%质量浓度酒精的水中，搅拌均匀，在35~40℃的温度下，浸泡3小时，浸泡完成后，在60℃~80℃的温度下，蒸煮2小时，形成蒸煮后的有机豌豆蛋白粉；步骤4，蒸煮后的有机豌豆蛋白粉采用6000r/min的速度进行10分钟的离心，离心后，取上清加水定容至2L，加入发酵培养基原料并搅拌均匀，用质量浓度为20%的NaOH溶液调整pH值至7.0,在115℃的温度下进行15分钟的灭菌处理后，冷却至室温，形成发酵培养基；步骤5，将2%嗜酸乳杆菌种子放入发酵培养基中，置于37℃恒温培养箱并静置培养12小时后，检测OD₆₀₀值、pH值及发酵液活菌数；步骤6，采用6000r/min的速度进行15分钟的离心，形成菌泥，加入菌泥重量20%的乳粉，乳化15分钟，在温度-80℃条件下，预冻4小时，预冻后，在冷阱温度低于-55℃，真空度0.1Pa条件下，冷冻干燥22~30小时，形成冻干粉。

所述的MRS种子培养基包括20 g/L的葡萄糖，10 g/L的牛肉浸粉，10 g/L的蛋白胨，5 g/L的酵母膏，5 g/L的无水乙酸钠，2 g/L的磷酸氢二钾，2 g/L的柠檬酸氢二铵，1 g/L的吐温-80，0.25 g/L的硫酸镁，0.05 g/L的硫酸锰。

所述的发酵培养基原料包括20 g/L的葡萄糖，10 g/L的牛肉浸粉，10 g/L的蛋白胨，14 g/L的酵母膏，5 g/L的无水乙酸钠，2 g/L的磷酸氢二钾，2 g/L的柠檬酸氢二铵，1g/L的吐温-80，0.25 g/L的硫酸镁，0.05 g/L的硫酸锰，1g/L的半胱胺酸盐，1g/L的鱼胶原蛋白肽。

所述的嗜酸乳杆菌的分类名为嗜酸乳杆菌 LA-G80（Lactobacillus acidophilusLA-G80），保藏地点为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2013337，保藏时间为：2013年7月16日。

本发明同现有技术相比，根据嗜酸乳杆菌营养需求，在添加有机豌豆蛋白粉增菌试验的基础上，减少发酵液离心、乳化、冻干后的杂质，以提高嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数。

具体实施方式

现对本发明做进一步描述。

本发明中采用的嗜酸乳杆菌的分类名为LA-G80（Lactobacillus acidophilusLA-G80），保藏地点为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2013337，保藏时间为：2013年7月16日。

本发明是一种提高嗜酸乳杆菌发酵与冻干活菌数的培养基处理方法，按如下步骤进行：

步骤1，在250ml平底瓶中装200ml的MRS种子培养基，接种保存的嗜酸乳杆菌甘油管，置于37℃恒温培养箱并静置培养12小时，形成嗜酸乳杆菌种子。

步骤2，转接2%的嗜酸乳杆菌种子至200ml的MRS种子培养基中，培养6至8小时，形成2%嗜酸乳杆菌种子。

步骤3，取10g/L的有机豌豆蛋白粉，倒入含10%质量浓度酒精的水中，搅拌均匀，在35~40℃的温度下，浸泡3小时，浸泡完成后，在60℃~80℃的温度下，蒸煮2小时，形成蒸煮后的有机豌豆蛋白粉。

步骤4，蒸煮后的有机豌豆蛋白粉采用6000r/min的速度进行10分钟的离心，离心后，取上清加水定容至2L，加入发酵培养基原料并搅拌均匀，用质量浓度为20%的NaOH溶液调整pH值至7.0,在115℃的温度下进行15分钟的灭菌处理后，冷却至室温，形成发酵培养基。

步骤5，将2%嗜酸乳杆菌种子放入发酵培养基中，置于37℃恒温培养箱并静置培养12小时后，检测OD₆₀₀值、pH值及发酵液活菌数。

步骤6，采用6000r/min的速度进行15分钟的离心，形成菌泥，加入菌泥重量20%的乳粉，乳化15分钟，在温度-80℃条件下，预冻4小时，预冻后，在冷阱温度低于-55℃，真空度0.1Pa条件下，冷冻干燥22~30小时，形成冻干粉。

MRS种子培养基包括20 g/L的葡萄糖，10 g/L的牛肉浸粉，10 g/L的蛋白胨，5 g/L的酵母膏，5 g/L的无水乙酸钠，2 g/L的磷酸氢二钾，2 g/L的柠檬酸氢二铵，1 g/L的吐温-80，0.25 g/L的硫酸镁，0.05 g/L的硫酸锰。

发酵培养基原料包括20 g/L的葡萄糖，10 g/L的牛肉浸粉，10 g/L的蛋白胨，14g/L的酵母膏，5 g/L的无水乙酸钠，2 g/L的磷酸氢二钾，2 g/L的柠檬酸氢二铵，1 g/L的吐温-80，0.25 g/L的硫酸镁，0.05 g/L的硫酸锰，1g/L的半胱胺酸盐，1g/L的鱼胶原蛋白肽。

对有机豌豆蛋白粉进行预处理的原因是有机豌豆蛋白粉沉淀物较多，影响发酵液离心冻干后菌粉活菌数及质量。

经过检测，如未对有机豌豆蛋白粉进行预处理，发酵液的OD₆₀₀值：有沉淀，pH值：4.16，发酵液活菌数：35.2亿cfu/ml，但由于有较多的沉淀，导致离心乳化后的冻干菌粉中杂质含量超高，冻干菌粉活菌数为1940亿cfu/g，且难以提高。

而经过本发明有机豌豆蛋白粉进行预处理后的发酵液几乎不含杂质沉淀，OD₆₀₀值：12.3，pH值：4.22，发酵液活菌数：34.9亿cfu/ml，与未对有机豌豆蛋白粉进行预处理的活菌数接近，冻干菌粉活菌数为3670亿cfu/g，远高于未对有机豌豆蛋白粉进行预处理的活菌数。

本发明的活菌计数方法如下：菌粉先用生理盐水溶解混匀，形成发酵液，取0.5mL发酵液加到装有4.5mL生理盐水的试管中混匀，形成10^-1浓度的菌悬液。然后从10^-1浓度的菌悬液中取0.5mL菌悬液到另外一个装有4.5mL生理盐水的试管中混匀，形成10^-2浓度的菌悬液，重复此操作直至得到10^-8浓度的菌悬液。取适宜梯度的菌悬液500μL到不同的空平板中，再倒入适量液体的MRS琼脂培养基，摇晃均匀后做好标记置于37℃恒温培养箱中倒置培养2天左右，待单菌落成熟后，进行计数，根据梯度得到最终发酵液活菌数或冻干菌粉活菌数。

Claims

1.一种提高嗜酸乳杆菌发酵与冻干活菌数的培养基处理方法，其特征在于：按如下步骤进行：步骤1，在250ml平底瓶中装200ml的MRS种子培养基，接种保存的嗜酸乳杆菌甘油管，置于37℃恒温培养箱并静置培养12小时，形成嗜酸乳杆菌种子；步骤2，转接2%的嗜酸乳杆菌种子至200ml的MRS种子培养基中，培养6至8小时，形成2%嗜酸乳杆菌种子；步骤3，取10g/L的有机豌豆蛋白粉，倒入含10%质量浓度酒精的水中，搅拌均匀，在35~40℃的温度下，浸泡3小时，浸泡完成后，在60℃~80℃的温度下，蒸煮2小时，形成蒸煮后的有机豌豆蛋白粉；步骤4，蒸煮后的有机豌豆蛋白粉采用6000r/min的速度进行10分钟的离心，离心后，取上清加水定容至2L，加入发酵培养基原料并搅拌均匀，用质量浓度为20%的NaOH溶液调整pH值至7.0,在115℃的温度下进行15分钟的灭菌处理后，冷却至室温，形成发酵培养基；步骤5，将2%嗜酸乳杆菌种子放入发酵培养基中，置于37℃恒温培养箱并静置培养12小时后，检测OD₆₀₀值、pH值及发酵液活菌数；步骤6，采用6000r/min的速度进行15分钟的离心，形成菌泥，加入菌泥重量20%的乳粉，乳化15分钟，在温度-80℃条件下，预冻4小时，预冻后，在冷阱温度低于-55℃，真空度0.1Pa条件下，冷冻干燥22~30小时，形成冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种提高嗜酸乳杆菌发酵与冻干活菌数的培养基处理方法，其特征在于：所述的MRS种子培养基包括20 g/L的葡萄糖，10 g/L的牛肉浸粉，10 g/L的蛋白胨，5 g/L的酵母膏，5 g/L的无水乙酸钠，2 g/L的磷酸氢二钾，2 g/L的柠檬酸氢二铵，1g/L的吐温-80，0.25 g/L的硫酸镁，0.05 g/L的硫酸锰。

3.根据权利要求1所述的一种提高嗜酸乳杆菌发酵与冻干活菌数的培养基处理方法，其特征在于：所述的发酵培养基原料包括20 g/L的葡萄糖，10 g/L的牛肉浸粉，10 g/L的蛋白胨，14 g/L的酵母膏，5 g/L的无水乙酸钠，2 g/L的磷酸氢二钾，2 g/L的柠檬酸氢二铵，1g/L的吐温-80，0.25 g/L的硫酸镁，0.05 g/L的硫酸锰，1g/L的半胱胺酸盐，1g/L的鱼胶原蛋白肽。

4.根据权利要求1所述的一种提高嗜酸乳杆菌发酵与冻干活菌数的培养基处理方法，其特征在于：所述的嗜酸乳杆菌的分类名为LA-G80（Lactobacillus acidophilus LA-G80），保藏地点为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2013337，保藏时间为：2013年7月16日。