CN105341149B - 酸奶发酵剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酸奶发酵剂及其制备方法，该酸奶发酵剂由德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)NJ 441和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21两种冻干菌粉组成；作为起主要产酸作用的NJ 441，由其发酵得到的酸奶的pH值较市售德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵的酸奶的pH值稍高，体现在口感上本发明的菌发酵的酸奶酸味绵柔不刺激不强烈；组合物中的NJ21经过对牛奶的发酵试验，发现其发酵获得的酸奶质地黏软，入口即化，改善了酸奶的质地和口感，并且其凝乳时间短，提高了生产效率，节约了发酵成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种酸奶发酵剂及其制备方法。
背景技术
酸奶发酵剂的品质直接影响产品的质量，目前酸奶发酵剂主要分为三种类型，即液态发酵剂、冷冻发酵剂和干燥发酵剂三种。其中的干燥发酵剂是指乳酸菌种经液体增殖培养、浓缩分离后，与保护介质混溶，再经一定方式干燥而成的发酵剂。干燥发酵剂保存、运输和管理简单，具有更强的稳定性和乳酸菌活力，减少了菌体性状变异和噬菌体污染的机会；另外，干燥发酵剂接种方便，只需简单的复水处理就可以直接用于生产。目前的酸奶发酵剂中的乳酸菌由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌组成。
例如中国专利文献CN 10502287 B(申请号200910056881.8)公开了一种直投式酸奶发酵剂的制备方法，将筛选出的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌在25℃～45℃的培养基中分别培养,然后使用发酵罐再分别培养，待发酵液中活菌数达到一定数量后，将发酵液分离，向得到的两种菌泥中分别就菌泥活性保护剂，然后分别经过冷冻干燥，干燥后得到单一冻干高活性菌粉；将嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的冻干菌粉按1：10～1：100比例混合，再加入奶粉和抗氧化剂组成的载体保护剂，充分混匀复配即得到直投式酸奶发酵剂。
中国专利文献CN 101422193 B(申请号200810202071.4)也公开了一种家用直投式酸奶发酵剂及其制备方法，所述酸奶发酵剂为一由包括保护剂和益生菌的组合物制备得到的冻干粉，组合物中保护剂和益生菌的重量比为保护剂：益生菌＝1.0：0.1～100。所述家用直投式酸奶发酵剂的制备方法包括下列步骤：益生菌高密度培养、真空冷冻干燥，制成单菌冻干粉；各单菌冻干粉复配成家用直投式酸奶发酵剂。所述益生菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌。
现有部分酸奶发酵剂存在香味不够浓郁，酸味太强烈的问题，口感不是非常理想，以至于需要添加甜味剂和香料等添加剂的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种发酵酸奶口感更佳、香味更浓郁的酸奶发酵剂及其制备方法。
实现本发明第一目的的技术方案是一种酸奶发酵剂，包括乳酸菌组合物和载体保护剂，乳酸菌组合物和载体保护剂的质量比为1:5～100，所述乳酸菌组合物由嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21冻干菌粉和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)NJ 441冻干菌粉组成。
所述嗜热链球菌菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.M2014250；所述德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2014249。
其中嗜热链球菌NJ21冻干菌粉的质量百分含量为50％～80％，德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441冻干菌粉的质量百分含量为20％～50％；每克嗜热链球菌NJ21冻干菌粉中嗜热链球菌NJ21的活菌数为1*109cfu～1*1010cfu，每克德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ441冻干菌粉中德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441的活菌数为1*109cfu～1*1010cfu。
所述载体保护剂由90％～95％的奶粉和余量的维生素C组成。
实现本发明第二目的的技术方案是如上所述的酸奶发酵剂的制备方法，包括以下步骤：
首先分别制备嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21冻干菌粉和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)NJ 441冻干菌粉；每克嗜热链球菌NJ21冻干菌粉中嗜热链球菌NJ21的活菌数为1*109cfu～1*1010cfu，每克德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441冻干菌粉中德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441的活菌数为1*109cfu～1*1010cfu。
然后将两种冻干菌粉按照嗜热链球菌NJ21冻干菌粉的质量百分含量为50％～80％，德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441冻干菌粉的质量百分含量为20％～50％的比例混合均匀得到乳酸菌组合物。
最后向乳酸菌组合物中加入载体保护剂，再次混匀后得到酸奶发酵剂。
其中嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21冻干菌粉的制备方法如下：
(1)嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21的分离，包括以下步骤：
①用无菌枪头取1mL经无菌离心管采集回来的保加利亚山里人家的自制酸奶，转移入无菌试管中，向试管中加入生理盐水9mL，充分振荡溶解均匀得到稀释度为10-1的菌液。
②取步骤①的菌液1mL于另一试管中，向试管中加入生理盐水9mL，充分振荡溶解均匀得到稀释度为10-2的菌液，重复上述步骤四次，依次得到稀释度为10-3的菌液、10-4的菌液、10-5的菌液和10-6的菌液。
③分别从步骤②的五支试管中取菌液涂布于M17琼脂培养基平板，剩余的五个稀释度的菌液置于冰箱中备用，将M17琼脂培养基平板在36℃恒温下培养2至3天；M17琼脂培养基平板的准备方法如下：取大豆胨5.0g,蛋白胨2.5g,酪蛋白胨2.5g,酵母浸粉2.5g,牛肉浸粉5.0g,乳糖5.0g,抗坏血酸钠0.5g,B-甘油磷酸钠19.0g,硫酸镁0.25g,琼脂12.75g，依次加入200mL蒸馏水中并将蒸馏水补充到1000mL，用醋酸调节液体pH至6.3，搅拌均匀后加热，煮沸2min，在121℃、0.1Mpa下灭菌30min，然后倾注平板，冷却后得到M17琼脂培养基平板。
④用接种针或接种环挑取单菌落的一半进行革兰氏染色，菌落的另一半接种于含有10％乳清的M17琼脂培养基。
(2)生化鉴定步骤(1)分离得到的菌株为嗜热链球菌。
(3)嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21扩大培养。
(4)冻干菌粉的制备，将扩大培养后的物料通过膜过滤或者离心分别得到菌泥，向菌泥中加入活性保护剂，将菌泥与活性保护剂混合均匀后，冷冻干燥得到嗜热链球菌NJ21冻干菌粉。
其中嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21扩大培养时所用的培养基为M17琼脂培养基，准备时取大豆胨5.0g,蛋白胨2.5g,酪蛋白胨2.5g,酵母浸粉2.5g,牛肉浸粉5.0g,乳糖5.0g,抗坏血酸钠0.5g,B-甘油磷酸钠19.0g,硫酸镁0.25g,琼脂12.75g，依次加入200mL蒸馏水中并将蒸馏水补充到1000mL，用醋酸调节液体pH至6.3，搅拌均匀后加热，煮沸、灭菌得到M17琼脂培养基。
所述德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ 441冻干菌粉的制备方法如下：
(1)德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ 441的分离，包括以下步骤：
①用无菌枪头取1mL经无菌离心管采集回来的保加利亚山里人家的自制酸奶，转移入无菌试管中，向试管中加入生理盐水9mL，充分振荡溶解均匀得到稀释度为10-1的菌液。
②取步骤①的菌液1mL于另一试管中，向试管中加入生理盐水9mL，充分振荡溶解均匀得到稀释度为10-2的菌液；重复上述步骤四次，依次得到稀释度为10-3的菌液、10-4的菌液、10-5的菌液和10-6的菌液。
③分别从步骤②的五支试管中取0.05mL菌液涂布于MRS琼脂培养基平板，剩余的五个稀释度的菌液置于冰箱中备用；将MRS琼脂培养基平板在36℃恒温下厌氧培养2至3天。
上述MRS琼脂培养基平板的准备方法如下：取蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-801.0g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.29g、碳酸钙20.0g、琼脂15.0g依次加入蒸馏水并将蒸馏水补充到1000mL，将pH调至6.3，搅拌均匀后加热，煮沸2min，在121℃、0.1Mpa下灭菌30min，然后倾注平板，冷却后得到MRS琼脂培养基平板。
④用接种针或接种环挑取单菌落的一半进行革兰氏染色，菌落的另一半接种于含有10％乳清的MRS琼脂培养基，待做生化鉴定。
(2)步骤(1)分离的菌种鉴定为德氏乳杆菌保加利亚亚种。
(3)德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ 441扩大培养。
(4)冻干菌粉的制备，将扩大培养后的物料通过膜过滤或者离心分别得到菌泥，向菌泥中加入活性保护剂，将菌泥与活性保护剂混合均匀后，冷冻干燥得到嗜热链球菌德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441。
其中德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ 441扩大培养时所用的培养基为MRS琼脂培养基，准备时取蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-801.0g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.29g、碳酸钙20.0g、琼脂15.0g依次加入蒸馏水并将蒸馏水补充到1000mL，将pH调至6.3，搅拌均匀后加热，煮沸、灭菌得到MRS琼脂培养基。
本发明具有积极的效果：(1)本发明的酸奶发酵剂中的两种乳酸菌由申请人分离自保加利亚山里人家的传统发酵乳制品，得益于保加利亚人食用酸奶悠久的历史和保加利亚优越的自然条件，在显微镜下观察，本发明的嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)NJ21较市售的菌株个头大，生长状态好，看上去更为强壮；本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)NJ 441较市售的菌株个头大，粗、长，状态更好。
(2)作为起主要产酸作用的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subspecies bulgaricus)NJ 441，由其发酵得到的酸奶的pH值较市售德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵的酸奶的pH值稍高，体现在口感上是本发明的菌发酵的酸奶酸味绵柔不刺激不强烈。
(3)酸奶发酵剂的乳酸菌组合物中的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21经过对牛奶的发酵试验，发现其发酵酸奶时凝乳时间短，对于工业化生产，凝乳时间短就使得发酵时间变短，提高了生产效率，节约了发酵成本。
另外，经过对牛奶的发酵试验，乳酸菌组合物中的嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)NJ21发酵酸奶时，对牛奶中脂肪的降解率更高，从而使得发酵获得的酸奶质地黏软，入口即化，改善了酸奶的质地和口感；对于酸奶的风味也进一步改善，由嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21发酵的酸奶闻起来更香，即酸奶的香味更为浓郁，具有诱人的滋气味。
(4)本发明将乳酸菌组合物中嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21冻干菌粉的质量百分含量设置为50％～80％，将德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subspecies bulgaricus)NJ 441冻干菌粉的质量百分含量设置为20％～50％，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21的数量多于德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)NJ 441，由上述组合的乳酸菌发酵获得的酸奶气味上香味更为浓郁，酸奶质地黏软细腻，口感更爽滑。
附图说明
图1为本发明的酸奶发酵剂的乳酸菌组合物中的嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)NJ21的革兰氏染色菌体在1000倍显微镜下的观察照片；
图2为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21的平板菌落形态；
图3为本发明酸奶发酵剂和对比酸奶发酵剂发酵得到的酸奶的照片，其中图3(a)为本发明酸奶发酵剂发酵得到的酸奶的照片，图3(b)为对比酸奶发酵剂发酵得到的酸奶的照片。
具体实施方式
(实施例1、酸奶发酵剂)
本实施例的酸奶发酵剂包括乳酸菌组合物和载体保护剂，乳酸菌组合物和载体保护剂的质量比为1:5～100。
所述乳酸菌组合物由嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21冻干菌粉和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)NJ441冻干菌粉组成，其中嗜热链球菌NJ21冻干菌粉的质量百分含量为50％～80％，德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441冻干菌粉的质量百分含量为20％～50％。
每克嗜热链球菌NJ21冻干菌粉中嗜热链球菌NJ21的活菌数为1*109cfu～1*1010cfu，每克德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441冻干菌粉中德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441的活菌数为1*109cfu～1*1010cfu。
所述保护剂由90％～95％的奶粉和余量的维生素C组成。
(实施例2、酸奶发酵剂的制备方法)
本实施例的酸奶发酵剂的制备方法为：首先分别制备嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)NJ21冻干菌粉和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubspecies bulgaricus)NJ 441冻干菌粉；每克嗜热链球菌NJ21冻干菌粉中嗜热链球菌NJ21的活菌数为1*109cfu～1*1010cfu，每克德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441冻干菌粉中德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441的活菌数为1*109cfu～1*1010cfu。
其中的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21，保藏日期2014年6月9日，保藏地点中国典型培养物保藏中心(地址为中国，武汉，武汉大学)，其简称为CCTCC。保藏编号为CCTCC NO.M2014250。
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ 441，保藏日期2014年6月9日，保藏地点中国典型培养物保藏中心(地址为中国，武汉，武汉大学)，其简称为CCTCC。保藏编号为CCTCC NO.M2014249。
然后将两种菌粉按照比例混合均匀得到乳酸菌组合物，其中嗜热链球菌NJ21冻干菌粉的质量百分含量为50％～80％，德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441冻干菌粉的质量百分含量为20％～50％。
最后向乳酸菌组合物中加入载体保护剂，再次混匀后得到酸奶发酵剂。乳酸菌组合物和载体保护剂的质量比为1:5～100。所述载体保护剂由90％～95％的奶粉和余量的维生素C组成。
所述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21冻干菌粉的制备方法如下：
(1)嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21的分离，包括以下步骤：
①用无菌枪头取1mL经无菌离心管采集回来的保加利亚山里人家的自制酸奶，转移入无菌试管中，向试管中加入生理盐水9mL，充分振荡溶解均匀得到稀释度为10-1的菌液。本发明的嗜热链球菌NJ21菌株从保加利亚山里人家的自制酸奶中分离获得，保加利亚自然条件优越，境内低地、丘陵、山地各约占三分之一。本发明所述的山里人家指的是生活在山地地区的人家。保加利亚属温带大陆性气候，空气中含氧量高；森林资源丰富，适宜优质乳酸杆菌的生长；当地人民很早就开始自制酸奶，在自然进化过程中获得凝乳状态好、风味独特的优良乳酸菌。
②取步骤①的菌液1mL于另一试管中，向试管中加入生理盐水9mL，充分振荡溶解均匀得到稀释度为10-2的菌液。重复上述步骤四次，依次得到稀释度为10-3的菌液、10-4的菌液、10-5的菌液和10-6的菌液。将装有10-2的菌液、10-3的菌液、10-4的菌液、10-5的菌液和10-6的菌液的试管分别标号为1号、2号、3号、4号和5号。
③分别从步骤②的五支试管中取0.05mL菌液涂布于M17琼脂培养基平板，剩余的五个稀释度的菌液置于4℃的冰箱中备用。将M17琼脂培养基平板在36℃恒温下培养2至3天(本实施例中为72h)。72小时后平板菌落形态见图2。
上述M17琼脂培养基平板的准备方法如下：取大豆胨5.0g,蛋白胨2.5g,酪蛋白胨2.5g,酵母浸粉2.5g,牛肉浸粉5.0g,乳糖5.0g,抗坏血酸钠0.5g,B-甘油磷酸钠19.0g,硫酸镁0.25g,琼脂12.75g，依次加入200mL蒸馏水中并将蒸馏水补充到1000mL，用醋酸调节液体pH至6.3，搅拌均匀后加热，煮沸2min，在121℃、0.1Mpa下灭菌30min，然后倾注平板，冷却后得到M17琼脂培养基平板。
④用接种针或接种环挑取单菌落的一半进行革兰氏染色，菌落的另一半接种于含有10％乳清的M17琼脂培养基，待做生化鉴定。
(2)嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21的鉴定。
接种环挑取单菌落的一半革兰氏染色结果为阳性，革兰氏染色菌体在1000倍显微镜下的观察照片见图1。
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21的鉴定结果如下：
一、菌株的生理生化特性见下表1和表2
表1菌株生理生化特性–利用碳源产酸
+：阳性，-：阴性，w：弱阳性
表2菌株生理生化特性–酶活、碳源同化
+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应
二、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21的16S rRNA基因序列为：
TGCAAGTAGAACGCTGAAGAGAGGAGCTTGCTCTTCTTGGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAATGGATGACACATGTCATTTATTTGAAAGGGGCAATTGCTCCACTACAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTAGGTGAGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGTCAAGAACGGGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACTGTGACGGTAGCTTACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTGATAAGTCTGAAGTTAAAGGCTGTGGCTCAACCATAGTTCGCTTTGGAAACTGTCAAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGATCCTTTCCGGGATTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGATGCTATTTCTAGAGATAGAAAGTTACTTCGGTACATCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGAGTTGCGAGTCGGTGACGGCGAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAA
三、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21的序列同源性分析，进入美国国家生物技术信息中心网站，利用BLAST检索：
经对待检菌株的生理生化特性检测，以及与Genbank中发表的序列比对，本发明的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21菌株被证实属于嗜热链球菌。
(3)嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21的扩大培养。
将嗜热链球菌NJ21先在锥形瓶中在M17琼脂培养基中培养10h～25h，M17琼脂培养基准备时取大豆胨5.0g,蛋白胨2.5g,酪蛋白胨2.5g,酵母浸粉2.5g,牛肉浸粉5.0g,乳糖5.0g,抗坏血酸钠0.5g,B-甘油磷酸钠19.0g,硫酸镁0.25g,琼脂12.75g，依次加入200mL蒸馏水中并将蒸馏水补充到1000mL，用醋酸调节液体pH至6.3，搅拌均匀后加热，煮沸2min，在121℃、0.1Mpa下灭菌30min得到M17琼脂培养基。
然后接入发酵罐中发酵培养，在25℃～45℃下培养15～35h，待发酵液中活菌数达1*108cfu～1*109cfu停止培养。
(4)冻干菌粉的制备。
将发酵罐中的物料通过膜过滤或者离心分别得到菌泥，向菌泥中加入活性保护剂。活性保护剂中按照质量百分含量计算含有维生素C 0.1％～1.5％，谷氨酸钠0.1％～5％，乳糖0.1％～8％，奶粉1％～25％，吐温-800.1％～5.0％，余量为水。
将菌泥与活性保护剂混合均匀后，冷冻干燥得到嗜热链球菌NJ21冻干菌粉。冷冻干燥时先在-40℃预冻3小时，然后在-60℃真空冷冻干燥30小时，干燥后即得活菌数为1*109cfu～1*1010cfu的冻干菌粉。
所述德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ 441
冻干菌粉的制备方法如下：
(1)德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ 441的分离，包括以下步骤：
①用无菌枪头取1mL经无菌离心管采集回来的保加利亚山里人家的自制酸奶，转移入无菌试管中，向试管中加入生理盐水9mL，充分振荡溶解均匀得到稀释度为10-1的菌液。
②取步骤①的菌液1mL于另一试管中，向试管中加入生理盐水9mL，充分振荡溶解均匀得到稀释度为10-2的菌液。
重复上述步骤四次，依次得到稀释度为10-3的菌液、10-4的菌液、10-5的菌液和10-6的菌液。
将装有10-2的菌液、10-3的菌液、10-4的菌液、10-5的菌液和10-6的菌液的试管分别标号为1号、2号、3号、4号和5号。
③分别从步骤②的五支试管中取0.05mL菌液涂布于MRS琼脂培养基平板，剩余的五个稀释度的菌液置于4℃的冰箱中备用。将MRS琼脂培养基平板在36℃恒温下厌氧培养2至3天(本实施例中为72h)。
上述MRS琼脂培养基平板的准备方法如下：取蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-801.0g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.29g、碳酸钙20.0g、琼脂15.0g依次加入蒸馏水并将蒸馏水补充到1000mL，将pH调至6.3，搅拌均匀后加热，煮沸2min，在121℃、0.1Mpa下灭菌30min，然后倾注平板，冷却后得到MRS琼脂培养基平板。
④用接种针或接种环挑取单菌落的一半进行革兰氏染色，菌落的另一半接种于含有10％乳清的MRS琼脂培养基，待做生化鉴定。
步骤④挑取的菌落革兰氏染色结果为阳性。选择革兰氏阳性的菌落进一步划线分离，直至分离得到纯德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ 441菌种为止。
(2)德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ 441的鉴定：
一、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ 441的细胞形态为杆状，形成芽孢结果为阴性，接触酶结果为阴性，氧化酶结果为阴性，发酵葡萄糖产气结果为阴性。
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ 441的理化试验-碳水化合物产酸(API 50CH)试验结果如下：
2、遗传学特征
二、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ 44l的16S rRNA基因序列如下：
GTCGAGCGAGCTGAATTCAAAGACCCTTCGGGATGATTTGTTGGACGCTAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTAAAGACTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAACAACATGAATCGCATGATTCAAGTTTGAAAGGCGGCGTAAGCTGTCACTTTAGGATGAGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCAATGATGCGTAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGCAGTAACTGGTCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAATGATAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAACTGCATCGGAAACTGTCATTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGCGCTAGGTGTTGGGGACTTTCCGGTCCTCAGTGCCGCAGCAAACGCATTAAGCGCTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTGTGCTACACCTAGAGATAGGTGGTTCCCTTCGGGGACGCAGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGTACAACGAGAAGCGAACCCGCGAGGGTAAGCGGATCTCTTAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTCTGCAATGCCCAAAGTCGGTGGGATAACCTTTATAGGAGTCA
三、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ 44l的pheS基因序列如下：
PheS基因序列测定结果
AAAACCAGAGTAGACGCTTGGGTCAATGCCGGCGGCAGACAAAACATTCGGGTGAACGATCCCGGCACCCAGAACTTCGATCCAGCCGGTGTTCTTGCAGATCGCGCAGCCCTTGCCGCCGCATTCAAAGCAGGAAACGTCCATTTCAACTGATGGTTCAGTAAATGGGAAGTAGCTTGGCCGCAGGCGGGTTTCCCGGTCCTGGCCGAATTCGTGCTTGGCCACCAGTTCCAAGGTCCCCTTAAGGTCACTCAAGGAGATGCTCTTGCCGACAACCAGCCCTTCCATCTGCATGAACTGGTGGGAGTGGGTGGCGTCGTCATCGTCTCTTCTGTAAACCTTGCCTGGGGAGATCATCTTGAGGTCCCCTTTATCGAAGTCATGCTTTTCCATGGTCCGGGCTTGAACTGGTGAAGTCTGGCTCCGCAGCAGGTGGTCAGCGTCAACGTAGAAAGTAGCCTGCATATC
根据细胞形态、生理化学特征、16S rRNA基因序列和pheS基因序列等试验数据综合分析，本实施例的菌种鉴定为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubspecies bulgaricus)(以上鉴定结果由中国科学院微生物研究所作出，2014微检字第111号)。
(3)德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspeciesbulgaricus)NJ 441的扩大培养。
将德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441先在锥形瓶中在MRS琼脂培养基中培养10h～25h。MRS琼脂培养基准备时取蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-801.0g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.29g、碳酸钙20.0g、琼脂15.0g依次加入蒸馏水并将蒸馏水补充到1000mL，将pH调至6.3，搅拌均匀后加热，煮沸2min，在121℃、0.1Mpa下灭菌30min,得到MRS琼脂培养基。
然后接入发酵罐中发酵培养，在25℃～45℃下培养15～35h，待发酵液中活菌数达到1*108cfu～1*109cfu mL停止培养。
(4)冻干菌粉的制备。
将发酵罐中的物料通过膜过滤或者离心分别得到菌泥，向菌泥中加入活性保护剂。活性保护剂中按照质量百分含量计算含有维生素C 0.1％～1.5％，谷氨酸钠0.1％～5％，乳糖0.1％～8％，奶粉1％～25％，吐温-800.1％～5.0％，余量为水。
将菌泥与活性保护剂混合均匀后，冷冻干燥得到嗜热链球菌德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441。冷冻干燥时先在-40℃预冻3小时，然后在-60℃真空冷冻干燥30小时，干燥后即得活菌数为1*109cfu～1*1010cfu的冻干菌粉。
(应用例1、用酸奶发酵剂发酵牛奶制备酸奶)
首先准备杀菌乳，向4.5kg鲜牛奶中加入0.3kg蔗糖，溶解后过滤除去杂质，再预热至60℃，然后在15Mpa下均质10min，得到均匀液体于95℃下杀菌5min，然后冷却至30℃备用。
向1L消毒后的牛奶中加入10g本发明的酸奶发酵剂，搅拌均匀后，在35℃～45℃温度下保温3～10小时。本实施例中在42℃温度下保温5小时，5小时后得到发酵好的酸奶。保温时间根据个人口感确定，需要酸奶粘稠些延长保温时间，需要酸奶稀一些，缩短保温时间。
(对比例1、酸奶发酵剂中的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subspecies bulgaricus)NJ 441与现有德氏乳杆菌的性能比较)
参比菌株来源于用川秀菌粉(川秀双歧杆菌7菌酸奶发酵剂1.0L型)发酵鲜牛奶得到的酸奶中，先使用市售川秀菌粉发酵鲜牛奶，得到酸奶后，按照实施例2的方法分离得到其中的德氏乳杆菌。
然后准备杀菌乳，向4.5kg鲜牛奶中加入0.3kg蔗糖，溶解后过滤除去杂质，再预热至60℃，然后在15Mpa下均质10min，得到均匀液体于95℃下杀菌5min，然后冷却至30℃备用。
分别向0.04kg杀菌乳中分别接入3环上述分离得到的德氏乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)NJ441，培养24小时使细胞计数在108～109cfu/mL之间，分别得到接种菌液待用。
分别向1L消毒后的牛奶中加入0.03kg德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subspecies bulgaricus)NJ441接种菌液和参比菌株接种菌液，搅拌均匀后，在40℃温度下保温4小时40分钟发酵完成，保温过程中在不同时间点取适量酸奶放入烧杯中，检测各时间点的pH值，检测结果如下：
由上表数据对比可知，起主要产酸作用的本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)NJ 441发酵后得到的酸奶的pH值较市售德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵的酸奶的pH值稍高，品尝发现本发明的菌发酵的酸奶酸味绵柔不刺激不强烈，食用口感更佳。另一方面，由本发明的菌发酵的酸奶的香味更为浓郁，对于酸奶的风味也进一步改善。
(对比例2、酸奶发酵剂中的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21与现有嗜热链球菌的性能比较)
参比菌株来源于用川秀菌粉(川秀双歧杆菌7菌酸奶发酵剂1.0L型)发酵鲜牛奶得到的酸奶中，先使用市售川秀菌粉发酵鲜牛奶，得到酸奶后，按照实施例2的方法分离得到其中的嗜热链球菌。
然后准备杀菌乳，向4.5kg鲜牛奶中加入0.3kg蔗糖，溶解后过滤除去杂质，再预热至60℃，然后在15Mpa下均质10min，得到均匀液体于95℃下杀菌5min，然后冷却至30℃备用。
分别向0.04kg杀菌乳中分别接入3环上述分离得到的嗜热链球菌和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21，培养24小时使细胞计数在108～109cfu/mL之间，得到接种菌液待用。
分别向1L消毒后的牛奶中加入0.03kg嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)NJ21接种菌液和参比菌株接种菌液，搅拌均匀后，在45℃温度下保温，保温过程中在不同时间点取适量酸奶放入烧杯中，检测发酵过程中各时间点的pH值，检测结果如下(NJ21在170min时终止保温发酵)：
由上表数据可见，本发明的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)NJ21在170min时即能将酸奶的pH值发酵至4.7，而参比菌株需要280min才将酸奶的pH值下降至4.72，体现在酸奶发酵工艺上，本发明的嗜热链球菌菌株对酸奶发酵凝乳时间更短，对于工业化生产，凝乳时间短就使得发酵时间变短，提高了生产效率，节约了发酵成本，另外，本发明的菌株对牛奶中脂肪的降解率更高，从而发酵获得的酸奶质地黏软，并且酸奶香味更为浓郁。
(对比例3、酸奶发酵剂发酵酸奶对比)
对比菌粉选用市售川秀双歧杆菌7菌酸奶发酵剂1.0L型，按照应用例1的方法分别使用本发明的酸奶发酵剂和对比酸奶发酵剂发酵酸奶：分别向1L消毒后的牛奶中加入10g本发明的酸奶发酵剂和对比酸奶发酵剂，搅拌均匀后，在42℃温度下保温3.5小时后完成发酵。
见图3，对发酵得到的酸奶性状进行对比如下：
| 性状 | 本发明发酵剂 | 对比发酵剂 |
| 气味 | 乳香浓郁 | 气味很淡 |
| 口感 | 香、滑 | 粘、没味道 |
| 凝固状态 | 凝固性好、成块状 | 凝固性差、不成块 |
| 成形 | 成形速度快 | 几乎不成形 |
保温过程中在不同时间点取适量酸奶放入烧杯中，检测各时间点的pH值，检测结果如下：
由上述表格数据可见：用本发明酸奶发酵剂制作酸奶，香味浓郁，口感更香滑，pH值下降快，凝乳时间短，使得发酵时间变短，提高了生产效率，节约了发酵成本。
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<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus
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gcataacaat ggatgacaca tgtcatttat ttgaaagggg caattgctcc actacaagat 180
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ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300
ggcagcagta gggaatcttc ggcaatgggg gcaaccctga ccgagcaacg ccgcgtgagt 360
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agttcacact gtgacggtag cttaccagaa agggacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtcccgag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg 540
tttgataagt ctgaagttaa aggctgtggc tcaaccatag ttcgctttgg aaactgtcaa 600
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<213> Lactobacillus delbrueckii
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Claims (3)
1.一种酸奶发酵剂，包括乳酸菌组合物和载体保护剂，其特征在于：乳酸菌组合物和载体保护剂的质量比为1:5～100，所述乳酸菌组合物由嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）NJ21冻干菌粉和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckiisubspecies bulgaricus）NJ 441冻干菌粉组成；
所述嗜热链球菌菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2014250；所述德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO. M2014249；
其中嗜热链球菌NJ21冻干菌粉的质量百分含量为50%～80%，德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441冻干菌粉的质量百分含量为20%～50%；每克嗜热链球菌NJ21冻干菌粉中嗜热链球菌NJ21的活菌数为1*109cfu～1*1010cfu，每克德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441冻干菌粉中德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441的活菌数为1*109cfu～1*1010cfu。
2.根据权利要求1所述的酸奶发酵剂，其特征在于：所述载体保护剂由90%～95%的奶粉和余量的维生素C组成。
3.如权利要求1所述的酸奶发酵剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
首先分别制备嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）NJ21冻干菌粉和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus）NJ 441冻干菌粉；每克嗜热链球菌NJ21冻干菌粉中嗜热链球菌NJ21的活菌数为1*109cfu～1*1010cfu，每克德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441冻干菌粉中德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441的活菌数为1*109cfu～1*1010cfu；
然后将两种冻干菌粉按照嗜热链球菌NJ21冻干菌粉的质量百分含量为50%～80%，德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ 441冻干菌粉的质量百分含量为20%～50%的比例混合均匀得到乳酸菌组合物；
最后向乳酸菌组合物中加入载体保护剂，再次混匀后得到酸奶发酵剂。
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Effective date of registration: 20190505 Address after: 215300 Sanjia Road 388, Zhangpu Town, Kunshan City, Suzhou City, Jiangsu Province Patentee after: Good health biotechnology (Suzhou) Co., Ltd. Address before: 213022 403, room 3, 3 crystal Industrial Park, 18 Huashan Road, Xinbei District, Changzhou, Jiangsu. Patentee before: Chen Yongmei |
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