CN115558620A - 一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和应用，所述乳酸菌冻干保护剂包括如下组分：海藻糖5～15份；低聚糖2～5份；小分子多元醇1～5份；甘露糖2～5份；游离氨基酸0.1～1份；乳清粉0.5～3份。本发明通过海藻糖保护蛋白分子不变性失活，低聚糖促进菌体繁殖，小分子多元醇能够维持蛋白质的三级结构稳定性，甘露糖促进菌群生长，游离氨基酸能够维持菌体pH值相对稳定，防止菌体生物活力下降，乳清粉能够用于稳定细胞膜成分，减少细胞损伤，本发明通过将海藻糖、低聚糖、小分子多元醇、甘露糖、游离氨基酸和乳清粉搭配使用，能够协同作用提高发酵剂菌株，尤其是嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的发酵活力。

Description

一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物制剂领域，具体涉及一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和应用。
背景技术
乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称，这类细菌在自然界分布极为广泛，除极少数外，其绝大部分都是人体内必不可少的、且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中。
乳酸菌以乳酸为主要代谢产物，是人类长期利用并公认为安全的细菌。发酵剂菌株通常是可利用乳或乳制品的乳酸菌，并可以在乳或含乳制品中快速发酵产生令人愉悦的风味改，变发酵基质质地结构。发酵剂菌株是乳制品发酵工业的“心脏”，对酸奶、奶酪和酸酪乳等的工业生产有着重要作用。
在乳制品发酵工艺中，主要起快速产酸作用发酵剂菌株的是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，此外某些奶酪制品或乳制品可能会加入乳酸乳球菌或其他乳酸菌。发酵剂菌株的工业化生产主要是发酵菌体经离心浓缩后，加入冷冻干燥保护剂在经过冷冻干燥制得，但是冷冻干燥过程通常会对细胞造成一定损伤或结构改变，冷冻干燥保护剂的选择和冻干过程对发酵剂菌株存活有重要的意义。
CN114107104A公开了一种保加利亚乳杆菌冻干粉及其制备方法，制备方法包括以下步骤：(1)将保加利亚乳杆菌种子液接种至发酵培养基中培养，得到菌泥；(2)将菌泥与保护剂混合，得到重悬液，冷冻干燥，得到所述保加利亚乳杆菌冻干粉；保护剂包括小分子多元醇、多糖、高分子添加剂和缓冲物质。通过培养基与保护剂搭配使用，能够协同提高保加利亚乳杆菌冻干粉的存活率，同时保护剂中小分子多元醇、多糖、高分子添加剂和缓冲物质的搭配使用，能够进一步协同提高保加利亚乳杆菌冻干粉的存活率，有效延长保加利亚乳杆菌冻干粉的保存时间。但是影响发酵剂菌株发挥作用的除了菌株的存活率外，发酵剂菌株的发酵活力同样影响着生产效率，现有技术中只针对菌株的存活率进行优化，因此，有效提升发酵菌株的发酵活力显得尤为重要。
CN113652359A公开了一种乳酸菌冻干粉、制备方法及其冻干保护剂，该发明冻干保护剂包括含量为100-400g/L的小分子多元醇和/或糖类，含量为5-20g/L的游离氨基酸或其盐类物质，含量为5-30g/L的维生素C或其盐类物质，含量为10-100g/L的高分子保护剂，含量为5-30g/L的缓冲盐；小分子多元醇和/或糖类与游离氨基酸或其盐类物质的含量比为5-80:1，该发明通过抗逆性诱导和冻干保护剂两方面协同提高乳酸菌冻干粉的活菌数、存活率及保存时限，但是，冻干后的乳酸菌菌粉或多或少的会产生细胞的损伤，冻干菌粉计数活菌数高但可能在牛乳中活力恢复慢，发酵酸奶延迟期增加，增加生产成本，因此，乳酸菌发酵剂菌株活力的迅速恢复是发酵剂的重要性能。
虽然现有技术中已经公开了一些针对乳酸菌冻干的保护剂，但是，目前对发酵剂菌株冻干保护剂的研究及工艺改进方向主要为提高发酵剂菌株的活菌数，大量实践表明，发酵剂菌株除了活菌数外，发酵活力对生产影响也很大，发酵活力通常是发酵牛乳的能力，即在短时间内在牛乳中快速生长及发酵产酸的能力。
因此，开发一种可以保证发酵剂冻干菌粉活菌数外，还能兼顾提高发酵剂菌株的发酵活力的乳酸菌冻干粉，以克服在冻干菌粉发挥发酵效用速度慢和效率低的问题，是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和应用，所述乳酸菌冻干保护剂在保证发酵剂冻干粉的活菌数的同时可以有效提高发酵剂菌株的发酵活力，克服在冻干粉发挥发酵效用时速度慢和效率低的问题。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种乳酸菌冻干保护剂，按照重量份计所述乳酸菌冻干保护剂包括如下组分：
Figure BDA0003875955740000031
本发明通过海藻糖保护蛋白分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程，低聚糖在维持菌体的生物活性同时可以促进菌体繁殖，小分子多元醇能够维持蛋白质的三级结构稳定性，甘露糖维持菌体生物活性促进菌群生长，游离氨基酸能够维持菌体pH值相对稳定，防止因pH剧烈变化导致菌体生物活力下降，乳清粉能够用于稳定细胞膜成分，减少细胞损伤，本发明通过将海藻糖、低聚糖、小分子多元醇、甘露糖、游离氨基酸和乳清粉搭配使用，能够协同作用提高发酵剂菌株的发酵活力。
所述海藻糖为5～15份，例如可以为6份、8份、10份、12份或14份等。
所述低聚糖为2～5份，例如可以为2.5份、3份、3.5份、4份或4.5份等。
所述小分子多元醇为1～5份，例如可以为1.5份、2份、3份、4份或4.5份等。
所述甘露糖为2～5份，例如可以为2.5份、3份、4份或4.5份等。
所述游离氨基酸为0.1～1份，例如可以为0.15份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份或0.9份等。
所述乳清粉为0.5～3份，例如可以为0.6份、0.8份、1份、1.2份、1.4份、1.6份、1.8份、2份、2.2份、2.4份、2.6份或2.8份等。
优选地，所述低聚糖选自低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚麦芽糖、低聚木糖、低聚半乳糖中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为低聚异麦芽糖。
优选地，所述小分子多元醇包括山梨糖醇和/或甘露醇，优选为山梨糖醇。
优选地，所述游离氨基酸包括谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸、酪氨酸中的任意一种或至少两种的组合，优选为甲硫氨酸。
优选地，所述乳酸菌冻干保护剂的pH值为6-7，例如可以为6.3、6.5、6.7或6.9。
优选地，所述乳酸菌冻干保护剂以重量份计包括如下组分：
Figure BDA0003875955740000041
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的乳酸菌冻干保护剂的制备方法，所述制备方法包括：将海藻糖、低聚糖、小分子多元醇、甘露糖、游离氨基酸、乳清粉和水混合，得到所述乳酸菌冻干保护剂。
优选地，以重量份计，所述水的用量为80～120份，例如可以为85份、90份、95份、100份、105份、110份或115份等。
作为本发明的优选技术方案，所述制备过程中加入水，使所述乳酸菌冻干保护剂中的各组分充分溶解，混合均匀。
优选地，所述混合后还包括调节pH值的步骤，调节冻干保护剂的pH值为6-7，例如可以为6.3、6.5、6.7或6.9。
优选地，所述调节pH值的调节剂为食品级氢氧化钠或食品级盐酸。
优选地，所述制备方法中还包括灭菌的步骤。
优选地，所述灭菌的温度为105～118℃，例如可以为106℃、108℃、110℃、112℃、114℃或116℃等，所述灭菌的时间为10～20min，例如可以为12min、14min、16min或18min等。
优选地，所述制备方法具体包括：将海藻糖、低聚糖、小分子多元醇、甘露糖、游离氨基酸、乳清粉和水混合，得到混合液；调节所述混合液的pH值为6～7后，105～118℃灭菌处理10～20min，冷却，得到所述乳酸菌冻干保护剂。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的乳酸菌冻干保护剂在乳酸菌冻干粉中的应用。
优选地，所述乳酸菌包括乳杆菌、链球菌、乳球菌或其他乳酸菌。
优选地，所述乳杆菌包括保加利亚乳杆菌。
优选地，所述链球菌包括嗜热链球菌。
第四方面，本发明提供一种乳酸菌冻干粉，所述乳酸菌冻干粉包括乳酸菌的菌泥和如第一方面所述的乳酸菌冻干保护剂。
第五方面，本发明提供一种如第四方面所述的乳酸菌冻干粉的制备方法，所述制备方法包括：将乳酸菌的菌泥与第一方面所述的乳酸菌冻干保护剂混合后冷冻干燥，得到所述乳酸菌冻干粉。
优选地，所述菌泥的制备方法包括：将乳酸菌种子液接种至发酵培养基中培养后进行离心，得到所述菌泥。
所述乳酸菌种子液的制备方法包括：将乳酸菌接种至培养基中，培养转接2～3代作为种子培养基，每代培养11～12h，得到所述乳酸菌种子液。
优选地，所述培养基为MRS肉汤培养基和/或M17肉汤培养基。
优选地，所述乳酸菌种子液的接种量为2～4％，例如可以为2.5％、3％或3.5％等。
优选地，所述发酵培养基包括糖类、牛肉浸粉、蛋白胨、酵母浸膏、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、硫酸镁、吐温80和水的组合。
优选地，所述发酵培养基以质量百分含量计包括：
Figure BDA0003875955740000061
余量为水。
所述糖类为2～3％，例如可以为2.3％、2.5％、2.7％或2.9％等。
所述牛肉浸粉为0.5～1.5％，例如可以为0.6％、0.8％、1％、1.2％或1.4％等。
所述蛋白胨为0～1％，例如可以为0.2％、0.4％、0.6％或0.8％等。
所述酵母浸膏为0.5～1.5％，例如可以为0.6％、0.8％、1％、1.2％或1.4％等。
所述磷酸氢二钾为0.1～0.3％，例如可以为0.15％、0.19％、2％、0.23％或0.27％等。
所述柠檬酸氢二铵为0.4～0.6％，例如可以为0.45％、0.5％或0.55％等。
所述硫酸镁为0.01～0.03％，例如可以为0.015％、0.02％或0.025％等。
所述吐温80为0.05～0.2％，例如可以为0.07％、0.09％、0.11％、0.13％、0.15％、0.17％或0.19％等。
优选地，所述糖类包括葡萄糖和/或乳糖。
优选地，所述发酵培养基的pH值为6～7，例如可以为6.1、6.3、6.5、6.7、6.9等，进一步优选为6.5～6.8。
优选地，所述培养的过程中体系的pH值为5～6，例如可以为5.1、5.3、5.5、5.7或5.9等，进一步优选为5.5～5.8。
优选地，所述培养的温度为35～43℃，例如可以为37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃等，所述培养的时间为8～14h，例如可以为9h、10h、11h、12h或13h等。
优选地，所述培养的终点为：所述发酵培养基中的菌液OD600值为7～12，优选为9～11，例如可以为9.5、10或10.5等。
所述OD600值为所述发酵培养基中菌液在600nm波长处的吸光值。
所述乳酸菌冻干粉中所述菌泥与所述乳酸菌冻干保护剂的水溶液的质量比为1：(0.5～2)，例如可以为1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8或1:1.9等。
优选地，所述冷冻干燥的时间在13.5h以上，例如可以为14h、16h、18h、20h或22h等。
优选地，所述冷冻干燥为梯度升温的冷冻干燥。
优选地，所述梯度升温的冷冻干燥包括依次进行的第一区段、第二区段、第三区段、第四区段、第五区段和第六区段。
所述第一区段的温度为-50～-45℃，例如可以为-49℃、-48℃、-47℃或-46℃等，持续时间为100～200min，例如可以为120min、140min、160min或180min等；所述第二区段的温度为-35～-30℃，例如可以为-34℃、-33℃、-32℃或-31℃等，持续时间为200～300min，例如可以为220min、240min、260min或280min等；所述第三区段的温度为-25～-15℃，例如可以为-24℃、-22℃、-20℃、-18℃或-16℃等，持续时间为200～300min，例如可以为220min、240min、260min或280min等；所述第四区段的温度为-5～0℃，例如可以为-4℃、-3℃、-2℃或-1℃等，持续时间为100～200min，例如可以为120min、140min、160min或180min等；所述第五区段的温度为10℃，持续时间为100～200min，例如可以为120min、140min、160min或180min等；所述第六区段的温度为20～30℃，例如可以为22℃、24℃、26℃或28℃等，持续时间为100min以上，例如可以是105min、110min、115min或120min等，100min后进行5min升压测试，若测试结果小于10Pa，结束程序。
优选地，所述第一区段控制压力为常压，其余区段控制压力为3～20Pa，例如可以为5Pa、7Pa、9Pa、12Pa、14Pa、16Pa或18Pa等。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明乳酸菌冻干保护剂中低聚糖在维持菌体的生物活性同时可以促进菌体繁殖，小分子多元醇维持蛋白质的三级结构的稳定性，甘露糖维持菌体生物活性促进菌群生长，游离氨基酸能够维持菌体pH值相对稳定，乳清粉有效稳定细胞膜成分，减少细胞损伤，本发明通过将海藻糖、低聚糖、小分子多元醇、甘露糖、游离氨基酸和乳清粉搭配使用，能够协同作用保证发酵剂菌株的存活率，维持活菌数的同时有效提高发酵剂菌株的发酵活力。
附图说明
图1为应用例1与对比应用例5中冻干粉发酵活力的测试结果图；
图2为应用例10与对比应用例10中冻干粉发酵活力的测试结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本文所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，还可包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。
本发明所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例性地”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本文中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。
实施例1
一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法，所述乳酸菌冻干保护剂按照重量份计包括：海藻糖15份，低聚异麦芽糖5份，山梨糖醇1份，甘露糖5份，甲硫氨酸1份，乳清粉0.5份。
所述乳酸菌冻干保护剂的制备方法如下：按照前述配方量将各组分充分混合后溶于100份水中，充分溶解后使用食品级盐酸将混合液pH值调节至6.5，在110℃条件下灭菌20min，灭菌后冷却至30℃以下，得到所述乳酸菌冻干保护剂的水溶液。
实施例2
一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法，所述乳酸菌冻干保护剂按照重量份计包括：海藻糖5份，低聚异麦芽糖5份，山梨糖醇5份，甘露糖3份，甲硫氨酸1份，乳清粉3份。
所述乳酸菌冻干保护剂的制备方法与实施例1相同。
实施例3
一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法，所述乳酸菌冻干保护剂按照重量份计包括：海藻糖10份，低聚异麦芽糖3份，山梨糖醇3份，甘露糖3份，甲硫氨酸0.6份，乳清粉2份。
所述乳酸菌冻干保护剂的制备方法与实施例1相同。
实施例4
一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法，所述乳酸菌冻干保护剂按照重量份计包括：海藻糖12份，低聚异麦芽糖2份，低聚果糖1份，山梨糖醇4份，甘露糖2份，甲硫氨酸0.8份，乳清粉2份。
所述乳酸菌冻干保护剂的制备方法与实施例1相同。
实施例5
一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法，所述乳酸菌冻干保护剂按照重量份计包括：海藻糖10份，低聚异麦芽糖4份，山梨糖醇3份，甘露糖3份，甲硫氨酸0.6份，谷氨酸0.2份，乳清粉2份。
所述乳酸菌冻干保护剂的制备方法与实施例1相同。
实施例6
一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法，其与实施例1的区别仅在于，将低聚异麦芽糖用等质量的低聚果糖替换；其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例7
一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法，其与实施例1的区别仅在于，将山梨糖醇用等质量的甘露醇替换；其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例8
一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法，其与实施例1的区别仅在于，将甲硫氨酸用等质量的谷氨酸替换；其他组分、用量及制备方法均与实施例1相同。
对比例1
一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法，其与实施例1的区别仅在于，将低聚异麦芽糖用等质量的麦芽糖替换，其他组分的种类、用量和制备方法均与实施例1相同。
对比例2
一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法，其与实施例1的区别仅在于，将乳清粉用等质量的大豆蛋白替换，其他组分的种类、用量和制备方法均与实施例1相同。
对比例3
一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法，其与实施例1的区别仅在于，将甘露糖改用等质量的水，其他组分的种类、用量和制备方法均与实施例1相同。
对比例4
一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法，其与实施例1的区别仅在于，将甘露糖改用等质量的葡萄糖，其他组分的种类、用量和制备方法均与实施例1相同。
应用例1-8，对比应用例1-4
一种保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法，按照重量比例计所述保加利亚乳杆菌冻干粉的制备方法如下：
将保加利亚乳杆菌LB42接种至MRS肉汤培养基中，培养基中转接3代作为种子培养基，每代培养12小时得到保加利亚乳杆菌的种子液，转接至发酵罐中，接种量3％，培养温度37℃。发酵罐培养基配比为葡萄糖3％，牛肉浸粉0.5％，酵母浸膏1.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸氢二铵0.5％，硫酸镁0.02％，吐温80 0.1％。其余为纯水；初始PH调节为6.8,发酵过程中控制pH为5.8，培养12小时，检测菌液的OD600值为8，停止发酵，发酵液在118℃条件下灭菌20min后进行离心，离心力设置为为12000g，收集菌泥，将菌泥与冻干保护剂的水溶液进行重量比例1:1混合，混合均匀后得到乳化液，将乳化液置于冻干盘中，乳化液厚度1.8cm，放入冷冻干燥机中，按照梯度升温模式进行冷冻干燥，冷冻干燥设置如下：第一区段的温度为-48℃，持续时间为200min，压力为常压；所述第二区段的温度为-35℃，持续时间为200min，压力为15Pa；所述第三区段的温度为-25℃，持续时间为240min，压力为13Pa；所述第四区段的温度为-5℃，持续时间为160min，压力为13Pa；所述第五区段的温度为10℃，持续时间为100min，压力为10Pa；所述第六区段的温度为25℃，持续时间为105min，压力为10Pa，105min后进行5min升压测试，测试结果为8Pa，结束程序，得到保加利亚乳杆菌冻干粉。
前述冻干保护剂分别为实施例1-8、对比例1-4提供的乳酸菌冻干保护剂。
对比应用例5
将应用例1中的冻干保护剂替换为现有技术中的保加利亚乳杆菌冻干保护剂，组分如下：乳糖22份、脱脂乳粉26份、抗坏血酸钠4.6份、聚乙二醇40000.3份、聚乙烯吡咯烷酮PVP(K30)0.4份、牛血清白蛋白0.7份和100份水混合后充分溶解，在110℃条件下灭菌15min，灭菌后冷却至30℃以下得到保加利亚乳杆菌冻干保护剂。
应用例9-16，对比应用例6-9
一种嗜热链球菌冻干粉的制备方法，按照重量比例计所述嗜热链球菌冻干粉的制备方法如下：
将嗜热链球菌ST81接种与M17肉汤培养基中，培养基转接2代作为种子培养基，每代培养11小时得到嗜热链球菌的种子液，转接至发酵罐中，接种量3％，培养温度37℃，发酵罐培养基配比为乳糖2％，牛肉浸粉1.5％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸氢二铵0.5％，硫酸镁0.02％，吐温80 0.1％,其余为纯水；初始PH调节为6.5，发酵控制pH为5.5，培养10h，检测菌液的OD600值为10，停止发酵，发酵液在118℃条件下灭菌20min后进行离心，离心力为13000g，收集菌泥，将菌泥分别与冻干保护剂的水溶液进行重量比例1:1混合，混合均匀后得到乳化液，将乳化液置于冻干盘中，乳化液厚度1.6cm，放入冷冻干燥机中，按照梯度升温模式进行冷冻干燥，冷冻干燥设置如下：第一区段的温度为-45℃，持续时间为160min，压力为常压；所述第二区段的温度为-30℃，持续时间为200min，压力为17Pa；所述第三区段的温度为-20℃，持续时间为300min，压力为15Pa；所述第四区段的温度为-5℃，持续时间为120min，压力为12Pa；所述第五区段的温度为10℃，持续时间为100min，压力为10Pa；所述第六区段的温度为25℃，压力为10Pa，持续时间为100min，100min时进行5min升压测试，测试结果为9Pa，结束程序，得到嗜热链球菌冻干粉。
前述冻干保护剂分别为实施例1-8、对比例1-4提供的乳酸菌冻干保护剂。
对比应用例10
将应用例10中的冻干保护剂替换为现有技术中的嗜热链球菌冻干保护剂，组分如下：脱脂乳粉14份、棉籽糖4份、大豆低聚糖6份、右旋糖苷D40 2.6份、三聚磷酸钠0.6份、没食子酸丙酯0.01份和蒸馏水100份混合后充分溶解，在110℃条件下灭菌15min，冷却至30℃以下得到嗜热链球菌冻干保护剂。
测试例1
本测试例对应用例1-16、对比应用例1-10制得的乳酸菌冻干粉进行冻干存活率测试，测试方法如下：
冻干前总活菌数检测：分别称量1g应用例1-16、对比应用例1-10得到的菌泥，加入到9mL含有玻璃珠的生理盐水中，振荡30min，取1mL菌液至9mL生理盐水中进行梯度稀释，取1mL稀释液于培养皿内，倾注MRS固体培养基，摇匀，倾注3个梯度，每个梯度3个平行，将凝固后的培养皿放于37℃恒温培养箱中培养48h后取出计数，再乘以菌泥重量，得到冻干前总活菌数；
冻干后总活菌数检测：分别称量1g应用例1-16、对比应用例1-10得到的乳酸菌冻干粉，加入到9mL含有玻璃珠的生理盐水中，振荡30min，取1mL菌液至9mL生理盐水中进行梯度稀释，取1mL稀释液于培养皿内，倾注MRS固体培养基，摇匀，倾注3个梯度，每个梯度3个平行，将涂布后的培养皿放于37℃恒温培养箱中培养48h后取出计数，得到冻干后总活菌数。
冻干存活率检测：
冻干存活率计算公式为，
冻干存活率(％)＝冻干后总活菌数÷(冻干前菌泥总活菌数×冻干前菌泥重量/(2×冻干后菌粉重量))×100％
应用例1-16、对比应用例1-10制得的乳酸菌冻干粉，在冻干后的活菌数和冻干存活率测试结果如表1、表2所示；其中表1为保加利亚乳杆菌保护剂应用例1-8、对比应用例1-5的活菌数和存活率测试结果；表2为嗜热链球菌保护剂应用例9-16、对比应用例6-10的活菌数和存活率测试结果。
测试例2
本测试例对应用例1-16、对比应用例1-10制得的乳酸菌冻干粉进行发酵活力测试，测试方法如下：
制备脱脂乳培养基：将10％脱脂乳，1％蔗糖和纯水充分混合，95℃灭菌30min，冷却至30℃以下得到脱脂乳培养基。
将应用例1-16、对比应用例1-10制备得到的乳酸菌冻干粉以30g/吨的接种量接种至脱脂乳培养基中，培养2h后每隔0.5h对培养基中菌株的pH值和滴定酸度进行检测并记录，相同的时间pH越低、酸度越高证明发酵活力越好。保加利亚乳杆菌通常7-10小时到达发酵终点，嗜热链球菌通常5-7小时到达发酵终点。
应用例1与对比应用例5冻干粉发酵活力结果测试如图1所示，应用例1中乳酸菌冻干粉的发酵酸奶活力优于对比应用例5，应用例1的pH变化曲线始终在对比应用例5之下，酸度变化曲线始终在对比应用例5之上。应用例1在2～3h时发酵效率增速明显高于对比应用例5，pH值下降较快，更早进入对数生长期。
应用例10与对比应用例10冻干粉发酵活力测试结果如图2所示，应用例10中乳酸菌冻干粉的发酵酸奶活力明显优于对比应用例10，应用例10的pH变化曲线始终在对比应用例10之下，酸度变化曲线始终在对比应用例10之上。应用例10在1～2h时发酵效率增速明显高于对比应用例10，发酵pH值下降较快，酸度增加速度加快，大大减少了发酵前期的延缓时间。
应用例1-16、对比应用例1-10制得的乳酸菌冻干粉的发酵活力测试结果如表3、表4所示；其中表3为保加利亚乳杆菌保护剂应用例1-8、对比应用例1-5的发酵活力测试结果；表4为嗜热链球菌保护剂应用例9-16、对比应用例6-10的发酵活力测试结果。
表1
Figure BDA0003875955740000161
Figure BDA0003875955740000171
表2
编号 冻干后活菌数(cfu/g) 冻干存活率(％)
应用例9 3800 77.6％
应用例10 4500 91.8％
应用例11 3900 79.6％
应用例12 4000 81.6％
应用例13 4300 87.8％
应用例14 3500 71.4％
应用例15 3200 65.3％
应用例16 3700 75.5％
对比应用例6 3000 61.2％
对比应用例7 2400 49.0％
对比应用例8 2300 46.9％
对比应用例9 2700 55.1％
对比应用例10 2500 51.0％
表3
Figure BDA0003875955740000181
表4
Figure BDA0003875955740000182
Figure BDA0003875955740000191
结合表格数据可知，保加利亚乳杆菌不同保护剂活菌数和发酵活力情况如表1、表3所示，此保护剂应用例1-8相对于对比应用例均可保持较高的活菌数和较好的发酵活力，虽然部分应用例5-8活菌数与对比应用例接近，但发酵活力好于对比应用例。嗜热链球菌不同保护剂活菌数和发酵活力如表2、表4所示，此保护剂应用例9-16相对于对比应用例均可保持较高的活菌数和较好的发酵活力。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种乳酸菌冻干保护剂，其特征在于，按照重量份计所述乳酸菌冻干保护剂包括如下组分：
Figure FDA0003875955730000011
2.根据权利要求1所述的乳酸菌冻干保护剂，其特征在于，所述低聚糖选自低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚麦芽糖、低聚木糖、低聚半乳糖中的任意一种或至少两种的组合，优选为低聚异麦芽糖；
优选地，所述小分子多元醇包括山梨糖醇和/或甘露醇，优选为山梨糖醇。
3.根据权利要求1或2所述的乳酸菌冻干保护剂，其特征在于，所述游离氨基酸包括谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸、酪氨酸中的任意一种或至少两种的组合，优选为甲硫氨酸；
优选地，所述乳酸菌冻干保护剂的pH值为6-7；
优选地，所述乳酸菌冻干保护剂以重量份计包括如下组分：
Figure FDA0003875955730000012
Figure FDA0003875955730000021
4.一种如权利要求1-3任一项所述的乳酸菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将海藻糖、低聚糖、小分子多元醇、甘露糖、游离氨基酸、乳清粉和水混合，得到所述乳酸菌冻干保护剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，以重量份计，所述水的用量为80-120份；
优选地，所述混合后还包括调节pH值的步骤；
优选地，所述调节pH值的调节剂为氢氧化钠或盐酸；
优选地，所述制备方法中还包括灭菌的步骤；
优选地，所述灭菌的温度为105～118℃，所述灭菌的时间为10～20min；
优选地，所述制备方法具体包括：将海藻糖、低聚糖、小分子多元醇、甘露糖、游离氨基酸、乳清粉和水混合，得到混合液；调节所述混合液的pH值为6～7后，105～118℃灭菌处理10～20min，冷却，得到所述乳酸菌冻干保护剂。
6.一种如权利要求1-3任一项所述的乳酸菌冻干保护剂在乳酸菌冻干粉中的应用。
7.一种乳酸菌冻干粉，其特征在于，所述乳酸菌冻干粉包括乳酸菌的菌泥和权利要求1-3任一项所述的乳酸菌冻干保护剂。
8.根据权利要求7所述的乳酸菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将所述菌泥与所述乳酸菌冻干保护剂混合后冷冻干燥，得到所述乳酸菌冻干粉。
9.根据权利要求8所述的乳酸菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述菌泥的制备方法包括：将乳酸菌种子液接种至发酵培养基中培养后进行离心，得到所述菌泥；
优选地，所述乳酸菌种子液的接种量为2～4％；
优选地，所述培养的温度为35～43℃，所述培养的时间为8～14h；
优选地，所述发酵培养基包括糖类、牛肉浸粉、蛋白胨、酵母浸膏、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、硫酸镁、吐温80和水的组合；
优选地，所述糖类包括葡萄糖和/或乳糖；
优选地，所述发酵培养基的pH值为6～7，优选为6.5～6.8；
优选地，所述培养的过程中体系的pH值为5～6，优选为5.5～5.8；
优选地，所述培养的终点为：所述发酵培养基中的菌液OD600值为7～12，优选为9～11。
10.根据权利要求8所述的乳酸菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述乳酸菌冻干保护剂以其水溶液的形式与菌泥混合；
优选地，所述菌泥与所述乳酸菌冻干保护剂的水溶液的质量比为1：(0.5～2)；
优选地，所述冷冻干燥的时间在13.5h以上；
优选地，所述冷冻干燥为梯度升温的冷冻干燥；
优选地，所述梯度升温的冷冻干燥包括依次进行的第一区段、第二区段、第三区段、第四区段、第五区段和第六区段；
所述第一区段的温度为-50～-45℃，持续时间为100～200min；所述第二区段的温度为-35～-30℃，持续时间为200～300min；所述第三区段的温度为-25～-15℃，持续时间为200～300min；所述第四区段的温度为-5～0℃，持续时间为100～200min；所述第五区段的温度为10℃，持续时间为100～200min；所述第六区段的温度为20～30℃，持续时间为100min以上，100min后进行5min升压测试，若测试结果小于10Pa，结束程序。
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