CN1816616A - 核苷酸生物合成有关化合物作为冷冻保护剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种有助于保护冷冻或冷冻干燥微生物培养物稳定性及代谢活性的新型冷冻保护剂，该冷冻保护剂由核苷酸生物合成有关化合物组成。本发明提供了微生物培养物的制备及使用方法。这些微生物培养物作为发酵剂用于食品及饲料产品的制造。本发明中的发酵剂包括乳酸菌(如乳酸乳球菌)及其它菌种的培养物。
Description
有关申请的相互参照
本发明申请要求美国临时专利申请书(申请号60/484,126，2003年7月2日归档)及欧洲专利申请书(申请号03077079.62，2003年7月2日归档)的专利保护，此二者以参考文献形式完整合并于本发明申请书中。
技术领域
本发明涉及冷冻或冷冻干燥微生物培养物及核苷酸生物合成有关化合物作为冷冻保护剂的技术领域。更为显著地，本发明涉及通过使用此类冷冻保护剂获得的培养物，此类冷冻保护剂除具有冷冻保护活性外，当将培养物接种于培养基中进行发酵或转化时还可以使其代谢活性增加。这些冷冻或冷冻干燥微生物培养物用于许多食品及饲料产品的制造。
技术背景
微生物涉及食品及饲料产品(包括大多数乳制品)的制造。细菌培养物，尤其是通常作为乳酸菌分类的细菌培养物是所有发酵乳制品、乳酪及奶油制造中所必需的。然而，某些非细菌微生物，如某些酵母和真菌的培养物用于加工食品及饲料产品。这些微生物培养物常被称作发酵剂，通过发挥多种功能而使各种乳制品具有特有的特点。发酵剂在多种工业中具有广泛的应用，例如乳品工业、酒类制造工业、饮料制造工业及肉类加工工业。
微生物培养物在粮食的生物防腐中也具有重要的作用(Andersen等，1997)。
商业乳品发酵剂通常由乳糖和柠檬酸发酵细菌组成。乳酸菌是一群革兰氏阳性、不运动、微需氧或厌氧性细菌，可以发酵糖类产生包括乳酸的酸类。工业上一些最有用的乳酸菌包括乳酸乳球菌、链球菌、肠球菌、乳杆菌、明串珠菌及片球菌。
通常使用的乳酸菌乳品发酵剂一般分为嗜温型(最适生长温度约为30℃)和嗜热型(最适生长温度约为35-45℃)。属于嗜温型的乳酸菌包括乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、肠膜样明串珠菌乳脂亚种、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳亚种二乙酰乳酸(diacetylactis)变型及副酪乳杆菌副酪亚种。嗜热乳酸菌包括嗜热链球菌、屎肠球菌、德氏乳杆菌乳亚种、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种及嗜酸乳杆菌。
对于乳品发酵剂还根据其具体的菌种组分和优选的工业使用进行分类。单一发酵剂仅由单一菌种组成，而混合发酵剂由两种或多种不同菌种组成。常根据发酵剂的最适生长温度或最大酶活性对其进行分类。嗜温型发酵剂最适生长温度约为30℃，而嗜热发酵剂最适生长温度约为35-45℃(Nielsen和Ullum，1999)。商业型嗜温混合发酵剂包括：
O型发酵剂：由乳酸乳球菌乳亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种组成。
D型发酵剂：由乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种及乳酸乳球菌乳亚种二乙酰乳酸(diacetylactis)变型组成。
L型发酵剂：由乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种及明串珠菌组成。
LD型发酵剂：由乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳亚种二乙酰乳酸(diacetylactis)变型及明串珠菌组成。
O型发酵剂用于制造无孔乳酪(Cheddar、Cheshire、Feta)。D型发酵剂用于制造奶油。L型发酵剂用于制造无小孔乳酪(如cottage乳酪)及低CO2生产的凝固乳制品。LD型发酵剂用于生产正常洞孔大小的乳酪、凝固乳制品(凝乳食品)及酸奶油。LD型发酵剂是目前商业上使用最多的混合发酵剂之一。
商业嗜热型混合发酵剂包括：
保加利亚酸乳发酵剂(由嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种组成)和嗜热乳酪发酵剂(由嗜热链球菌和瑞士乳杆菌组成)。
保加利亚酸乳发酵剂用于制造保加利亚乳酪及特殊的意大利乳酪。嗜热乳酪发酵剂用于制造Emmentaler乳酪及特殊的意大利乳酪。
另外，丙酸杆菌常用作乳品发酵剂，尤其用于乳酪的制造。短杆菌属及双岐杆菌属也通常用作食品发酵剂。
另一组微生物发酵剂是用于某些类型乳酪和饮料制造的真菌发酵剂，包括酵母菌及丝状真菌，例如娄地青霉菌、念珠青霉菌、念珠地丝菌、克菲尔(圆)酵母、克菲尔圆酵母及酿酒酵母。
发酵剂还广泛用于肉类加工工业，如各种香肠及意大利腊肠的制造。
商业发酵剂通常以冷冻培养物供应。在低温下，冷冻培养物中细胞的大部分代谢活动停止，可以在此停滞但有活力的状态长期保存。
浓缩冷冻发酵剂因可以直接被接种至生产容器中而在商业上引起人们极大的兴趣。通过使用浓缩冷冻发酵剂，最终使用者避免了必须的、耗时的中间发酵步骤(在此期间发酵剂扩增)，而且最终使用者减少了严重污染的危险。浓缩冷冻发酵剂可以被称作直投式酸奶发酵剂(DVSTM)。
作为浓缩冷冻发酵剂的选择之一，浓缩冷冻干燥DVSTM发酵剂可以被制备。这些发酵剂另一个优点是无需冷藏即可装运。
一般而言，冻融对活细胞活力的可能损伤效应可归因于冻存中细胞脱水及于细胞溶胶中冰晶的形成。
已发现许多冻存保护剂可以控制及最低限度损伤的方式影响细胞溶胶的浓缩，从而在冻存过程中防止细胞溶胶中冰晶形成或使其最小化。
F.J.Chavarri等的文章(生物技术通讯，第10卷，第1期，11-16(1988)，“Cryoprotective agents for frozen concentrated starters from non-bitter Streptococcus Lactisstrains”)描述了通过添加5％乳糖或5％蔗糖可以改善冻存单一乳链球菌发酵剂的保存活力，乳糖或蔗糖被用作冻存保护剂。乳链球菌是乳酸乳球菌乳亚种的曾用名。
类似地，R.Cárcoba等的文章(Eur Food Res Technol(2000)211，433-437，“Influence of cryoprotectants on the viability and acidifying activity of frozen andfreeze-dried cells of the novel starter strain Lactococcus lactis subsp.lactis CECT 5180”)描述了冷冻单一乳酸乳球菌乳亚种发酵剂的保存活力可通过添加不同的冻存保护剂如糖类(乳糖、蔗糖及海藻糖)、谷氨酸及明胶而改善。
冷冻干燥发酵剂的活力也可通过使用冻存保护剂而改善。例如EP259739描述了多种用于冷冻干燥发酵剂的不同冷冻保护剂。
有多种提供冻存保护的方法如碳水化合物、蛋白质及某些表面活性剂。
一般而言，为获得冷冻保护效果需要相对大量的冷冻保护剂。虽然在某些情况是无关紧要的问题，但对食品加工业来说是重要的，因为由冷冻保护剂导致发酵或加工制品即使很小的非期望味道偏差都是不利的。我们没有意识到含有大量冻存保护剂的商业用浓缩冷冻发酵剂。
除碳水化合物、蛋白质及某些表面活性剂以外的介质已用于改善低温下发酵剂的稳定性。
WO 00/39281描述了IMP及DNA生物合成有关化合物用于稳定液体发酵剂的代谢活性(非冷冻或冷冻干燥发酵剂的稳定性)。
WO 00/19817描述了一种冷冻保护剂的组分，其中混合化合物而非单一组分用于冷冻保护。混合物包括钙通道阻滞剂、细胞营养基质、水及腺苷。然而，药物活性物质如钙通道阻滞剂不被食品工业应用所接受。
JP 05308956描述了亚硝酸细菌培养物的培养基含有高分子量多糖(其中一个单位包括1分子α-L-鼠李糖、1分子D-葡萄糖醛酸、2分子线性聚合D-葡萄糖)及ATP。于此培养基中培养的亚硝酸细菌可以被冷冻保存。未表明培养基组分于冷冻浓缩发酵剂之前添加其中可作为冷冻保护剂使用。
可添加于食品工业使用的浓缩发酵剂的有效的冷冻保护剂仍为需要。
发明内容
过去认为对于商业相关的浓缩冷冻乳酸菌发酵剂不存在重要的保存稳定性问题，现在尽管很好地认识到大多数活细胞要经受冷冻及后来的融解，而对于商业相关的浓缩冷冻乳酸菌发酵剂其活力问题一般不受重视。因此，商业用浓缩冷冻发酵剂无大量的冷冻保护剂，这可能是因为一些商业发酵剂似乎对于冻融的损伤效应具有很强的抵抗力。
例如，对许多商业浓缩乳酸菌发酵剂(已冻存2-3个月)进行了稳定性研究，2-3个月的冷冻发酵剂于低于-45℃的温度下一年，培养活性无显著降低。因此，认为商业相关发酵剂无重要的保存稳定性问题。
本发明的发明者观察到冷冻LD型发酵剂于最初1-3周的冻存中活力显著丧失(如实施例1所述)。最初几周之后，活力的进一步丧失相对不显著，与上述已知结果一致。
本发明的发明者确定了几种类型商业相关的浓缩冷冻乳酸菌发酵剂(如商业用冷冻LD型发酵剂)与冷冻及保存初期相关而未被认识到的稳定性问题，尤其当发酵剂保存于现代工业致冷机提供的温度(典型的-50℃左右)时。
本发明的发明者确定了新型冷冻保护剂，既解决了发酵剂的稳定性问题而且提高其代谢活性。
本发明的一个实施方案涉及浓缩冷冻或冷冻干燥培养物，其中所述培养物含有选自包括一种或多种核苷酸生物合成相关化合物或一种或多种任一此类化合物衍生物的组群的一种或多种冷冻保护剂。
优选地，在冷冻或冷冻干燥活力细菌之前添加冷冻保护剂于其中。
本发明还提供了一种制备冷冻培养物或冷冻干燥培养物的方法，包括如下步骤：于活菌中添加选自包括一种或多种核苷酸生物合成相关化合物或一种或多种任一此类化合物衍生物的组群的一种或多种冷冻保护剂；冷冻材料以获得冷冻物，及以适当的方法包装冷冻物(或冷冻干燥物)。至于制备冷冻干燥发酵剂的方法包括一个在包装步骤之前水从冷冻物升华的步骤。
根据本发明，还提供了一种制备食品或饲料产品的方法，包括根据本发明发酵剂的使用。优选地，食品选自奶制品，肉类产品，蔬菜类产品及饮料。
本发明描述的新型冷冻保护剂的另一个优点是其可以维持复原细胞的活力及代谢活性且不以不利方式影响发酵或加工制品的味道。
定义
在讨论本发明详细实施方案之前，提供了与本发明各方面及实施方案有关的具体术语的定义。
本发明使用的术语“乳酸菌”(LAB)指革兰氏染色阳性、微需氧或厌氧细菌，可以发酵糖类产生酸类物质，包括乳酸(主要产生的酸类)、乙酸及丙酸。工业上最常使用的乳酸菌为乳酸乳球菌、链球菌、乳杆菌、明串珠菌、片球菌、短杆菌、肠球菌及丙酸杆菌。另外，属于严格厌氧性细菌双岐杆菌群的细菌，即常单独或与乳酸菌联合用作食品发酵剂的双岐杆菌，通常被包括在乳酸菌群中。
术语“浓缩培养物”是指活细胞的浓度(菌落形成单位，CFUs)至少为108CFU/ml，更优选地至少为109CFU/ml，更优选地至少为1010CFU/ml，更优选地至少为1011CFU/ml，或更优选地至少为1012CFU/ml。如实施例中所示，浓缩培养物可以通过离心分离获得。
术语“包装”应该从广义上理解。它是指以可提供与使用者的方式包装冷冻或冷冻干燥培养物。可以瓶子、tetra-pack、袋子等进行包装。
术语“冷冻保护剂”指能够改善冷冻或冷冻干燥培养物冷冻及保存初期诱发的损伤效应抵抗力的物质。本申请书上下文中，可以是单一的特定冷冻保护剂或是两种或多种不同的介质。因此，冷冻保护剂于培养物中的百分含量(w/w)应该理解为冷冻保护剂的总量。确定一种物质是否为能够改善冷冻培养物对冷冻及保存初期诱发的损伤效应抵抗力的冷冻保护剂的优选方法是按本发明描述方法将培养物分成两个样品，添加特定量的的冷冻保护剂于其中之一，将二者均冷冻，于冷冻当天及冷冻保存定期监测培养物于相关培养基(如牛奶)中的酸化活性。如果带有冷冻保护剂的培养物在保存期间活性改善(如改善了的酸化牛奶活性)，此物质为冷冻保护剂。酸化牛奶活性的适当测定方法在实施例中给出。
本发明的实施方案仅以实施例的方式描述如下。
本发明详细内容
如前所述，浓缩冷冻或冷冻干燥培养物被认为是稳定的。然而，与本领域通常的看法相反，本发明的发明者另人吃惊地观察了至今未被认识到的某些商业相关浓缩冷冻乳酸菌发酵剂(例如商业用冷冻LD型发酵剂，见下列实施例1)冷冻及保存初期相关的稳定性问题。本发明考虑到当商业冷冻或冷冻干燥发酵剂被适当检验时此稳定性问题将被广泛发现。
对多种可能的介质进行了测定以观察其是否可以克服此问题。试验介质选自包括一种或多种核苷酸生物合成有关化合物的(先前由发明者揭示可改善非冷冻液体发酵剂的稳定性)的组群。
WO 00/39281描述了使用IMP及DNA生物合成相关化合物稳定液体发酵剂的代谢活性，但与在冷却过程中仍为液体的发酵剂相比，冷冻的发酵剂经受一些直接与冷冻过程有关的潜在损伤。
在冷冻温度下，因培养物开始冷冻及细胞内外形成冰而死亡和受到损伤。冰的形成使细胞遭受机械损伤，进一步产生细胞外高渗透压，造成细胞脱水。由于冷冻，离子强度及水相pH值变化还破坏许多细胞成分及大分子(依赖这些因素维持其稳定性)的结构与功能(Adams，2000)。
液体发酵剂与冷冻发酵剂稳定性不同可以进一步由Mazur(1961)报道的实验进行说明。在此实验中，酵母细胞于-15℃浸浴。结果显示当系统仍为液体时97％的细胞仍存活，但当外部培养基在-15℃冻结时，仅27％的细胞存活(Mazur 1961)。
因此，必须由有效冷冻保护剂提供的措施依据冷冻保护剂用于保护液体发酵剂还是冷冻发酵剂而有很大区别，作为液体发酵剂有效冷冻保护剂的添加剂对于冷冻发酵剂不一定有效。此添加剂例子之一是甲酸钠。如WO 00/39281中所报道3％甲酸钠对于增加液体乳酸菌发酵剂浓缩物的保存稳定性是有效的。然而，如下述实施例15中所述，3％甲酸钠降低冷冻乳酸菌发酵剂的保存稳定性。
因此，当实验显示IMP及核苷酸生物合成有关化合物改善冷冻及冷冻干燥浓缩培养物的稳定性时十分另人吃惊。
如下述实施例2中所显示，添加一种此类化合物次黄嘌呤核苷-5′-一磷酸(IMP)，可以显著改善冷冻及保存初期诱导的损伤效应的抵抗力。如下面的实施例9所述，添加IMP还可显著改善冷冻干燥培养物的稳定性。从下面的实施例10可以明确不仅IMP，而且选自构成核苷酸生物合成有关化合物的组群的较大范围的介质作为冷冻保护剂是有效的。
如实施例10所述，无论核苷酸还是核苷均可用作冷冻保护剂。因此，在优选的实施方案中，用于改善发酵剂冷冻及保存初期诱导的损伤效应的抵抗力的冷冻保护剂是选自包括核苷酸生物合成相有关化合物的组群的化合物，包括嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷及核苷酸。这些化合物通过次黄嘌呤核苷-5′-一磷酸(IMP)、腺苷-5′-一磷酸(AMP)、鸟苷-5′-一磷酸(GMP)、尿苷-5′-一磷酸(UMP)、胞苷-5′-一磷酸(CMP)、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核甙、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、乳清酸核苷、胸腺嘧啶脱氧核苷、次黄嘌呤核苷、及任一化合物的衍生物或其混合物来举例说明。
如较早的WO 00/19817提供了钙通道阻滞剂、细胞营养基质、水及腺苷的混合物作为冷冻保护剂。但是，单一组分(如腺苷)可能的冷冻保护活性未予讨论。然而，腺苷作为冷冻保护剂不一定有效，如实施例12及15所述，其中所述的腺苷可以降低细菌培养物的稳定性。另外，Demetriou(WO 00/19817)使用2.7-3.6mM的腺苷。另外，我们的实验显示了次黄嘌呤核苷作为冷冻保护剂是非常有效的，腺苷及次黄嘌呤核苷均为嘌呤核苷酸。此观察可以扩展至一磷酸。我们的实验显示作为冷冻保护剂，IMP而非AMP是有效的。这甚至更另人吃惊，因为在微生物中，IMP由AMP通过水解去氨基作用合成(White，1973)。因此，本发明优选的实施方案中，一种或多种冷冻保护剂选自嘧啶核苷酸和次黄嘌呤核苷的组群。
本发明另一个优选的实施例中，一种或多种冷冻保护剂选自一磷酸核苷组群。在优选的实施方案中至少一种或唯一的冷冻保护剂是IMP。
碳水化合物或蛋白酵素类冷冻保护剂一般不被描述可以增加融解或复原发酵剂的代谢活性。本发明的冷冻保护剂除其冷冻保护活性外，当将发酵剂接种于培养基中进行发酵、加工或转化时还可使其代谢活性增加(增强效应)。
因此，本发明的一个实施方案是冷冻或冷冻干燥培养物，其中冷冻保护剂是单一或混合介质，除冷冻保护活性外还具有增强效应。
术语“增强效应”用于描述当将融解或复原的发酵剂接种于培养基中进行发酵或转化时，冷冻保护剂可以使其代谢活性增加(增强效应)的情况。活力与代谢活性并非同义概念。商业冷冻或冷冻干燥发酵剂可以保持其活力，但可丧失大部分代谢活性，例如即使于较短期时间保存，发酵剂也可以丧失其产酸(酸化)活性。因此活力及增强效应须通过不同测定方法进行评价。活力是通过活力测定实验如测定菌落形成单位而评价，增强效应是通过融解或复原发酵剂的与培养活力相关的有关代谢活性进行定量而评价。下面描述的酸化活性测定是融解或复原培养物有关代谢活性定量测定的实施例。增强效应在实施例3中进一步说明。
尽管在本发明中举例说明了产酸活性，本发明意于包括发酵剂任何类型代谢活性的稳定性。因此，术语“代谢活性”是指发酵剂的脱氧活性，产酸活性(即如乳酸、乙酸、甲酸和/或丙酸的产生)，或其代谢产物产生活性，如芳香化合物(如乙醛、α-乙酰乳酸、乙偶姻、联乙醯及2，3-丁二醇)的产生。
在本发明的实施方案中，冻存培养物含有大约0.2％-20％(以％w/w表示)的冷冻保护剂或其混合物。然而，优选地添加冷冻保护剂或其混合物的量按重量计算大约为0.2％-15％，更优选地为0.2％-10％，更优选地为0.5％-7％，更优选地为1％-6％，包括2％-5％(按重量计算以冷冻物的％w/w表示)。在优选的实施方案中，培养物含有大约3％(按重量计算以％w/w表示)的冷冻保护剂或其混合物。优选的约3％的冷冻保护剂的量对应浓度为100mM。必须认识到本发明实施方案的每一方面可以增大描述范围。
术语“培养物材料”是指包括活力菌及冷冻保护剂的培养物有关物质，可能的包装不包括在内，因此，培养物材料的重量不包括可能的包装重量。
在培养物为冷冻干燥培养物的情况下，优选地添加冷冻保护剂或其混合物的量(按重量计算)为0.8％-60％，或0.8％-55％，或1.3％-40％，或3％-30％，或6％-25％，包括10％-24％。在优选的实施方案中，冷冻干燥培养物含有约16％冷冻保护剂或其混合物(按重量计算以冷冻干燥材料的％w/w表示)。
另外，冷冻或冷冻干燥培养物可含有其它传统添加剂包括各种营养素如酵母提取物、糖类、抗氧化剂、惰性气体及维生素等。根据本发明表面活性剂化合物(包括Tween)也可以用作培养物的其它添加剂。
根据本发明可添加至培养物的传统添加剂的其它例子，还可选自蛋白质、蛋白质水解物、及氨基酸。优选的合适的例子包括选自谷氨酸，、赖氨酸、谷氨酸钠、酪蛋白酸钠、麦芽浸膏、脱脂奶粉、乳清粉、酵母提取物、谷蛋白、胶原、明胶、弹力蛋白、角蛋白及白蛋白或其混合物构成的组群的添加剂。
更为优选地，传统的添加剂为碳水化合物，合适的例子为选自包括戊糖(如核糖、木糖)、己糖(如果糖、甘露糖、山梨糖)、二糖(如蔗糖、海藻糖、蜜二糖、乳果糖)、低聚糖(如蜜三糖)、低聚果糖(如Actilight、Fribroloses)、多糖(如糊精、黄单胞菌胶、果胶、藻酸盐、维晶纤维素、右旋糖酐、聚乙二醇)及糖醇(山梨糖醇、Manitol及纤维醇)的组群的添加剂。
尽管本发明涉及任何浓缩冷冻或冷冻干燥培养物，但是特别针对于食品及饲料产品(包括大多数乳制品)相关的微生物培养物。本发明的优选实施方案包括细菌培养物，尤其是通常作为乳酸菌分类，在所有发酵乳制品、乳酪及奶油制造中所必需的细菌培养物。这样的细菌培养物常被称为发酵剂，通过发挥多种功能而使各种乳制品具有特有的特点。然而，特别应用于某些类型乳酪及饮料的制造的真菌培养物(包括酵母菌及丝状真菌培养物)组成的培养物也被称为发酵剂。用于加工其它类型食品或饲料产品的培养物也被称为发酵剂。用于青贮饲料制造的培养物也常被称为发酵剂。
依据本发明，在食品或饲料工业(包括乳品工业)有用的的任何发酵剂微生物均可使用。因此，发酵剂可以由选自包括乳酸菌、双岐杆菌、短杆菌、丙酸杆菌或真菌(如圆酵母、青霉菌、隐球菌、德巴利酵母菌(Debraryomyces spp.)、柯里夫酵母菌(Klyveromyces spp.)及酵母菌)的组群的一种或多种微生物组成。乳酸菌(LAB)组群合适的培养物包括通常使用的乳酸乳球菌、链球菌、乳杆菌(包括嗜酸乳杆菌)、肠道球菌、片球菌、明串珠菌、酒球菌(Oenococcus spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)及广泛使用的乳酸乳球菌(包括乳球菌乳酸乳球菌乳亚种及乳球菌乳酸乳球菌乳脂亚种，通常用于结构致密干酪如Cheddar干酪、Feta干酪及cottage干酪的制造)。
可以理解的是发酵剂微生物可以选自一种或多种上述乳酸菌株或任何其它发酵剂菌株的基因修饰菌株。本发明使用的术语“基因修饰细菌”以常规意义使用，即指通过使细菌菌株经受任何常规使用的诱变处理(包括化学诱变剂如乙基乙烷磺酸酯(EMS)或N-甲基-N′-硝基-N-硝基胍(NTG)的处理)、紫外线或自发突变(包括经典突变)而获得的菌株。另外，可能提供随机诱变接着自发突变选择(即不使用重组DNA技术)的基因修饰细菌。另外，乳酸菌突变体及其它潜在有用的发酵剂微生物可以通过包括位点突变及PCR技术及其它特定DNA序列的体内外修饰(一旦此序列被确定及分离)的技术方法提供。另外，还考虑到有用的发酵剂微生物可以通过使用重组DNA技术获得。从食品管理角度通过特定微生物固有的DNA序列重组(即自我克隆)获得有用的发酵剂微生物的可能性尤为引人注目。
通常在乳品工业中，发酵剂由菌株混合物组成，包括不同乳酸菌的菌株混合物，如嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的混合物。
通常使用的乳品发酵剂一般分为嗜温型(本申请书上下文中，最适生长温度约为30℃的微生物)和嗜热型(本申请书上下文中，最适生长温度约为40-45℃的微生物)。
本发明发酵剂菌株的选择依据所要制造的发酵食品或饲料产品的特定类型。例如，对于乳酪和奶油的制造，广泛使用嗜温型培养物乳酸乳球菌、明串珠菌及乳杆菌。因此，根据本发明的一个实施方案，发酵剂由一种或多种最适生长温度为约为30℃的嗜温菌组成。属于这种嗜温菌的典型生物包括乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、肠膜样明串珠菌乳脂亚种、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳亚种diacetylactis变型、干酪乳杆菌及副酪乳杆菌副酪亚种。
根据本发明的另一个实施方案，发酵剂由一种或多种最适生长温度约为40℃-45℃的的嗜热菌组成。嗜热菌常用作生产保加利亚酸乳及其它发酵乳制品，某些乳酪，如Emmentaler乳酪及特殊的意大利乳酪也通过使用嗜热型发酵剂生产。属于这种嗜热菌的典型微生物包括选自包括嗜热链球菌、屎肠球菌、德氏乳杆菌乳亚种、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种及嗜酸乳杆菌的组群的细菌。
特别地，乳酸菌发酵剂(LAB-发酵剂)已在商业上具有广泛的应用。因此，本发明的一个优选实施方案是LAB-发酵剂，由选自包括乳酸乳球菌、链球菌、肠球菌、乳杆菌、明串珠菌、片球菌及双岐杆菌的组群的一种或多种微生物组成。
商业发酵剂常根据其用途进行分类。O型发酵剂用于制造无孔乳酪(Cheddar、Cheshire、Feta)，典型地由选自包括乳酸乳球菌乳亚种及乳酸乳球菌乳脂亚种的组群的一种或多种微生物组成。D型发酵剂用于制造奶油，典型地由一种或多种乳酸乳球菌(即乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳亚种二乙酰乳酸(diacetylactis)变型)组成。L型发酵剂可用于生产仅带小孔的乳酪(cottage乳酪)及低CO2产量的凝固乳制品。L型发酵剂的典型微生物为乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种及明串珠菌。最后，LD型发酵剂用于制造正常孔洞大小的乳酪、凝固乳制品(凝乳食品)及酸奶油。商业上，LD型发酵剂是目前使用最多的混合发酵剂。LD型发酵剂典型地由选自包括乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳亚种二乙酰乳酸(diacetylactis)变型及明串珠菌的组群的一种或多种微生物组成。
如其它类型的混合发酵剂那样，LD型发酵剂中单一菌种的具体数量可以根据具体使用需要而不同。专业人员应该知道这个而且能够根据所需确定优选的混合发酵剂组分。
例如，如需要香味，则应该优选产香味细菌乳酸乳球菌乳亚种二乙酰乳酸(diacetylactis)变型及明串珠菌的最佳组分。
优选的LD型发酵剂由下列成分组成：
表1 LD型发酵剂组分
| 乳酸乳球菌乳亚种乳酸乳球菌乳脂亚种 | 60-95％，优选70-90％ |
| 乳酸乳球菌乳亚种二乙酰乳酸(diacetylactis)变型明串珠菌 | 5-40％，优选地0，1-30％ |
在上述范围内，优选地明串珠菌为0.25-6％，乳酸乳球菌乳亚种二乙酰乳酸(diacetylactis)变型为7-30％。
当然，四种不同的LAB菌种的总百分比不能超过100％。然而，如果LD型发酵剂中存在除四种提到的细菌外其它的细菌，则总百分比可小于100％。实施例2提供了稳定的LD型发酵剂的例子。
真菌培养物是根据本发明可以使用的另一组微生物发酵剂。真菌培养物，如酵母菌、丝状真菌常用于某些类型乳酪及饮料的制造。目前使用的真菌培养物包括娄地青霉菌、念珠青霉菌、念珠地丝菌、克菲尔圆酵母、克菲尔酵母菌及酿酒酵母。
本发明特有的优选实施方案是由嗜酸乳杆菌组成的发酵剂。
另一方面，本发明提供了制备冷冻培养物的方法，包括以下步骤：1)于浓缩的活菌培养物中添加选自包括一种或多种核苷酸生物合成相关化合物或一种或多种任一化合物衍生物的组群的冷冻保护剂；2)对材料进行冷冻以获得冷冻物；及3)以适当的方法包装冷冻物。
应该理解冷冻及包装步骤可以采用多种方法进行。
冷冻步骤应该最优化以确保细胞的存活。某些细胞(如大多数LAB)可以直接冷冻，即可直接使其接触处于冷冻保存温度的介质。直接冷冻方法包括直接将细胞滴落、喷雾、注入或灌人“低温”液体如液氮、液态CO2或液态氦中。本发明上下文中低温是指低于-50℃的温度，优选地低于-150℃(123°K)的温度。细胞也可以直接接触冷冻固体，例如液氮冷冻的钢块。低温液体还可以被直接倾注至细胞包装物上，直接方法还包括在低温下以气体(包括空气)接触细胞，氮气或氦气的低温气流可直接被吹至或冒泡至细胞悬液。间接方法为以包装物包装细胞，在低温下以固体、液体或气体接触包装物。间接冷冻方法的包装物不一定要对气体或液体无渗透性。例如，塑料袋或Tetra-Pak是合适的。
在一个优选的实施方案中，通过离心或超滤方法浓缩培养物，添加冷冻保护剂至培养物中，接着将培养物滴入液氮中形成冷冻培养物小颗粒。冷冻的培养物小颗粒可以瓶子、Tetra-Pak、袋子或其它合适的包装物进行包装。冷冻及包装的培养物小颗粒在确保其用于接种培养基以发酵或加工之前保持冷冻状态的温度下以典型方法保存及供应。
另一方面，本发明提供了制备冷冻干燥培养物的方法，包括以下步骤：1)于活菌中添加选自包括一种或多种核苷酸生物合成相关化合物或一种或多种任一化合物衍生物的组群的冷冻保护剂；2)对材料进行冷冻以获得冷冻物；3)水自冷冻物升华；及4)以适当的方法包装冷冻干燥物。冷冻保护剂的添加、可选择的浓缩步骤、冷冻(或冷冻干燥)及包装步骤可以按所述进行
冷冻培养物需要在低温下装运及保存，冷冻干燥或冷冻脱水培养物只要保持在干燥条件下，可以无需长期冷藏装运及保存。然而，即使是冷冻干燥培养物，也建议在0℃以下保存。
根据本发明冷冻及冷冻干燥培养物以商业DVS发酵剂或Redi-Set发酵剂提供。DVS发酵剂的一个优点是可以冷冻或冷冻干燥细胞形式直接添加至含培养基的生产发酵罐或容器中。这导致活细胞几乎同时再生。商业上的许多发酵剂为乳酸菌培养物，因此，本发明的一个优选的实施例是如前述所获得的冷冻或冷冻干燥乳酸菌(LAB)培养物。
另一方面，本发明涉及制备食品或饲料产品的方法，根据本发明所述方法包括使用冷冻或冷冻干燥培养物。
在具体的实施方案中，食品为乳制品，如乳酪、保加利亚酸乳、奶油，或液体发酵乳制品，如酪乳、Ymer、奶油或饮用保加利亚酸乳。在本发明的另一实施方案中，食品为乳酪，包括：软乳酪，包括但不限于Camenbert、Brie、Argentine Port Salut、Crezenza及Gorgonzola；Emmenthal乳酪，包括但不限于Emmenthal及Gruyère；Cottage乳酪，包括但不限于Cottage乳酪；Feta乳酪，包括但不限于Feta及White乳酪；Continental乳酪，包括但不限于Gouda、Edam、Maasdam、Samsoe、Saint Paulin、Raclette、Manchego及Prato；Pasta Filata乳酪，包括但不限于Mozzarella、Pizza乳酪、Provolone及Kaskawal；Cheddar乳酪，包括但不限于Cheddar、Territorials、American Cheddar、Monterey Jack及Colby；及Grana乳酪，包括但不限于Grana、Parmesan及Sbrinz。
另外，食品可以选自肉类制品、蔬菜类制品及饮料，如葡萄酒及啤酒。
根据本发明方法的另一重要应用是被称作益生菌剂的液体发酵剂的使用。术语“益生菌剂”在本申请上下文中被理解为一种被人或动物以活细胞形式摄取可以改善健康状况的微生物培养物，例如，通过抑制胃肠道内有害微生物，增强免疫系统或促进营养消化。此益生活性制品的典型例子是“甜酸乳”。
在另一实施方案中，根据本发明的方法用于生产动物饲料如青贮饲料(如草、谷类、豌豆、苜蓿或甜菜叶)，接种细菌培养物于待青贮的饲料中以获得防腐作用，或接种于蛋白丰富的动物废弃物如屠宰废弃物及鱼废弃物中，也是为了保存动物饲料用废弃物。
本发明在下面的非限制性实施例及图表中进一步说明。
图1显示了商业冷冻浓缩发酵剂F-DVSTM Fl-Da N(Chr.Hansen A/S Item.No.501691)-50℃保存初期的稳定性。发酵剂的活性通过使用0.01％ w/v的接种物进行酸化活性测定来确定。于牛奶中30℃培养6小时后测定pH值。注：较高的pH值表示发酵剂的酸化活性较低(即代谢活性较低)。
图2显示冷冻浓缩发酵剂F-DVSTM CH-N 14(Chr.Hansen A/S产品号No.200118)添加及未添加3％ w/w IMP以酸化活性表示的保存稳定性。注：纵座标表示在30℃培养6小时后测得的pH值，接种物的量为0.01％ w/v。较高的pH值表示发酵剂的酸化活性较低(即代谢活性较低)。空心正方形表示添加IMP的培养物，而菱形表示未添加IMP的培养物。
图3显示F-DVSTM CH-N 14发酵剂(Chr.Hansen A/S Item.No.200118)添加及未添加IMP的酸化活性，于-50℃保存2个月后对培养物进行发酵，按照表2的Danbo温度变化曲线以低温巴氏消毒的全奶检测发酵作用。添加的发酵剂量以％(w/v)给出。注：纵座标表示在30℃培养6小时后测得的pH值，较高的pH值表示培养物的酸化活性较低(即代谢活性较低)。
图4说明F-DVSTM CH-N 19(Chr.Hansen A/S产品号No.501593)在冷冻期间活性的丧失。检测发酵剂的活性同于发酵剂的生产(在第0天)。误差棒表示标准差。注：纵座标表示在30℃培养6小时后测得的pH值，接种物的量为0.01％ w/v，较高的pH值表示发酵剂的酸化活性较低(即代谢活性较低)。
图5显示F-DVSTM Fl-Da N发酵剂(Chr.Hansen A/S Item.No.501691)添加一定量IMP酸化活性的丧失。浓缩物在冷冻之前以液体保存于8℃5小时。误差棒表示标准差。注：纵座标表示在30℃培养6小时后测得的pH值，接种物的量为0.01％ w/v，较高的pH值表示发酵剂的酸化活性较低(即代谢活性较低)。
图6显示添加及未添加3％ w/w IMP的冷冻干燥浓缩发酵剂DVSTM Fl-Da N以酸化活性表示的保存稳定性，于-50℃保存7天后检测发酵剂的活性。误差棒表示标准差。注：纵座标表示在30℃培养6小时后测得的pH值，接种物的量为0.01％ w/v，较高的pH值表示发酵剂的酸化活性较低(即代谢活性较低)。
图7显示冷冻浓缩发酵剂F-DVSTM Fl-Da N(Chr.Hansen A/S产品号No.501691)于保存初期添加或未添加3％ w/w IMP、GMP、次黄嘌呤核苷或未添加任何化合物以酸化活性表示的保存稳定性。注：纵座标表示在30℃培养6小时后测得的pH值，接种物的量为0.01％ w/v，较高的pH值表示培养物的酸化活性较低(即代谢活性较低)。实心菱形表示添加3％ w/w IMP，灰正方形表示添加3％ w/w GMP，实心三角表示添加3％ w/w次黄嘌呤核苷，圆形表示未添加冷冻保护剂。
图8显示冷冻浓缩发酵剂(F-DVSTM Fl-Da N，Chr.Hansen A/S Item.No.501691)于保存期间添加或不添加3％ w/w IMP、GMP、次黄嘌呤核苷或不添加任何化合物以酸化活性表示的保存稳定性。注：纵座标表示在30℃培养6小时后测得的pH值，接种物的量为0.01％ w/v，较高的pH值表示培养物的酸化活性较低(即代谢活性较低)。实心菱形表示添加3％ w/w IMP，实心正方形表示添加3％ w/w GMP，实心三角形表示添加3％ w/w次黄嘌呤核苷，十字形表示未添加冷冻保护剂。
图9显示冷冻干燥浓缩发酵剂Fl-Da N培养物添加及未添加各种添加剂于-50℃保存1日后以酸化活性表示的保存稳定性。注：纵座标表示在30℃培养6小时后测得的pH值，接种物的量为0.05％ w/v，较高的pH值表示培养物的酸化活性较低(即代谢活性较低)。酸化分析结果表示每一种添加剂。大多数添加剂是嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷及核苷酸。IMP是次黄嘌呤核苷-5′-一磷酸的简写形式，AMP是腺苷-5′-一磷酸的简写形式，UMP是尿苷-5′-一磷酸的简写形式，CMP是胞苷-5′-一磷酸的简写形式，MSG是谷氨酸单钠的简写形式。添加剂的百分比是指添加至浓缩培养物的添加剂的％ w/w。未显示％值的地方表示添加3％w/w的量。
图10显示冷冻干燥浓缩发酵剂Fl-Da N培养物添加及未添加各种添加剂于-50℃保存2个月后以酸化活性表示的保存稳定性。具体内容见图9的说明。
图11显示添加及未添加添加剂(3％IMP+2％次黄嘌呤核苷)的冷冻保加利亚乳酸菌的活力，冷冻速度为1℃/min左右，满条表示于冷冻之前添加保护剂的培养物，酸化分析以0.02％ w/w接种物为基础且于40℃进行5小时。较高的pH值表示培养物的酸化活性较低(即代谢活性较低)。
图12显示对快速冷冻的婴儿双岐杆菌培养物(A)活力的影响(与两组缓慢冷冻的婴儿双岐杆菌培养物(B及C)进行比较)。3％ w/w IMP及2％w/w次黄嘌呤核苷作为冷冻保护剂添加入培养物C中。培养物B及C的冷冻速度为1℃/min左右，而培养物A通过滴注于液态氮中冷冻。
图13显示添加及未添加各种添加剂的快速冷冻浓缩发酵剂CH-N 19培养物于-50℃保存1日后以酸化活性表示的保存稳定性。注：纵座标表示在30℃培养6小时后测得的pH值，接种原料的量：0.05％ w/v，较高的pH值表示培养物的酸化活性较低(即代谢活性较低)。酸化分析结果表明了每一种保护剂及其混合物的情况。
图14显示添加及未添加各种添加剂的快速冷冻浓缩发酵剂CH-N 19培养物于-50℃保存6日后以酸化活性表示的保存稳定性。详细内容见图13的说明。
实施例：
材料与方法
培养物：
下列使用的商业发酵剂为Fl DaN、CH N 14及CH N19，这三种发酵剂均为冷冻直投式发酵剂(F-DVSTM)形式的商业冷冻LD型发酵剂(来自丹麦的Chr.Hansen A/S公司)，分别为：F-DVSTM Fl-Da N(Chr.Hansen A/S产品号No.501691)、F-DVSTM CH-N14(Chr.Hansen A/S产品号No.200118)、F-DVSTM CH-N 19(Chr.Hansen A/S产品号No.501593)。
发酵培养基及发酵条件
LD型发酵剂培养基组分
LD型发酵剂在含如下组分的培养基中培养：酪蛋白水解产物(Oxoid，Basingstoke，英国，产品编号L41)，30g/l；Primatone(一种动物组织的可溶性消化物)，RL(Quest，Naarden，荷兰，产品编号5X59051)，30g/l；大豆蛋白胨(Oxoid，Basingstoke，英国，产品编号L44)，30g/l；酵母提取物(Oxoid，Basingstoke，英国，产品编号L21)，15g/l；硫酸镁(MgSO4)，1.5g/l；维生素C钠，3g/l；及乳糖50g/l。
培养基以超高温处理进行灭菌(143℃、8分钟)。终培养基pH值为6.5。
LD型发酵剂的发酵条件
使用1％(w/w)上述作为接种物的发酵剂于100l发酵罐中30℃进行发酵，采用顶部空间为氮气及顶部空间压力约0.2bar进行厌氧发酵，使培养物酸化至pH值6.0。随后通过控制性添加13.4N N NH4OH维持pH值在6.0。
[113]当未检测到进一步的基质消耗，将各培养物冷却至约10℃。
LD型发酵剂的发酵后处理：
冷却后，通过离心将发酵液中的细菌浓缩10-20倍，添加添加剂，如无其它说明，随后在一个大气压下于液氮内以粒状沉淀冷冻。除非另有说明，冷冻之后在不同的时间段测定粒状沉淀的酸化活性，余下的粒状沉淀保存在-50℃直至进行进一步的分析。
添加剂：
添加剂的来源如下：次黄嘌呤核苷-5′-一磷酸(IMP)(Alsiano A/S，Birkeroed，DK)，腺苷-5′-一磷酸(AMP)(Sigma A2252)，尿苷-5′-一磷酸(UMP)(Sigma U6375)，胞苷-5′-一磷酸(CMP)(Sigma C1006)，甲酸钠(Kirsch PH值arma，Salzgitter，DE)，腺苷(Alsiano A/S，Birkeroed，DK)，鸟苷(Alsiano A/S，Birkeroed，DK)及次黄嘌呤核苷(AlsianoA/S，Birkeroed，DK)。
酸化活性测定及菌落形成单位(CFU)分析：
以0.01％(w/w)水平接种冷冻发酵剂于200ml含9.5％(w/w)固体物质及于99℃加热30分钟超高温灭菌的复原脱脂牛奶(RSM)(LAB奶)中。于30℃培养RSM6小时，以使底物酸化。酸化活性根据实施例6(分析规程QAm-052，“酸化活性-超高温”，Chr.Hansen A/S(丹麦))所述进行测定
DANBO温度变化曲线后的模拟乳酪生产：
根据反映温度时程(给定的乳品(DANBO乳酪)生产中使用的培养物要遇到的)的温度变化曲线进行酸化测定。
如表2所示在固定的时间测定pH值
表2 Danbo温度变化曲线
| 时间，分钟 | 温度，℃ | 变化 |
| 02:40 | 31.0℃ | ±0.2℃ |
| 00:15 | 斜线温度31.0℃to | ±0.5℃ |
| 38.0℃ | ||
| 00:35 | 38.0℃ | ±0.2℃ |
| 04:24 | 斜线温度38.0℃to16.0℃* | ±0.5℃ |
| up to 16:00 | 16.0℃ | ±0.2℃ |
根据实施例7所述测定酸化活性：分析规程QAm-043，酸化活性-“程序温度变化曲线”Chr.Hansen A/S(丹麦)。
如实施例8：分析规程Q-AM-071，“微生物的计数”Chr-Hansen A/S(丹麦)所述评价与计算CFU分析结果。
实施例1：Fl-Da N冷冻LD型发酵剂的稳定性研究
在此实施例中，对通过商业生产的LD型发酵剂F-DVSTM FI-Da N F(Chr.HansenA/S产品号No.501691)酸化活性测定稳定性6个月。如“材料及方法”部分中描述生产发酵剂并于-50℃保存。
与通常情况不同，此实施例中初次活性测定在培养物于液氮中以沉淀冷冻后立即进行，其后，于-50℃保存1天、2天、12天、20天及188天后再测定。
本实验结果示于图1。
在保存的最初几天，酸化活性大幅度降低。保存仅一周之后，酸化活性降低0.26pH值单位，这一降低相当于保存仅一周酸化活性降低50％。保存两周后培养物酸化活性丧失不显著，在余下的保存期发酵剂的酸化活性仅轻度降低。
此实验出人意料的结果使发明者认识到与某些类型商业浓缩冷冻乳酸菌发酵剂(如商业冷冻LD型发酵剂)冷冻及保存初期有关的重要、至今未认识到的稳定性问题。
实施例2：使用IMP作为冷冻保护剂的CH N14冷冻LD型发酵剂的稳定性研究
本实施例描述以IMP作为冷冻保护剂的冷冻直投式发酵剂(F-DVSTM)CH N14稳定性研究。在实验中，IMP的浓度保持在每克浓缩菌3％ w/w。以30％ w/w无菌溶液添加IMP至浓缩菌中。
发酵之后，收获细菌并通过离心F-DVSTM CH N 14发酵液进行浓缩。细胞浓缩物分成两份，300g/份，于每份中添加IMP。混合添加剂剂及浓缩物30分钟，在液氮中冷冻，-50℃保存。冷冻发酵剂活菌含量至少为每g冷冻物1010CFU，-50℃保存3天后测定牛奶(LAB奶)中的培养活性，定期检测活性直至保存65天。
以酸化活性给出的F-DVSTM CH N 14稳定性数据于图2中概述。
很明显无添加剂的F-DVSTM CH N 14丧失活性。F-DVSTM CH N 14于-50℃保存65天后其稳定性降低0.25pH值单位。0.25pH值单位几乎相当于酸化活性丧失50％(即稳定培养物约为不稳定培养物的2倍)。
实施例3：使用IMP作为冷冻保护剂的CH N 14冷冻LD型发酵剂于温度变化曲线之后的稳定性研究
本实验中，对实施例2所述的培养物样品于-50℃保存约两个月后进行检测。根据模拟的“Danbo”温度变化曲线(见表2)在培养期间的几个时间点测定酸化活性。发酵培养基为低温巴氏消毒全奶，与常规用于Danbo乳酪商业生产的牛奶相似。
对培养物冷冻之前添加及未添加IMP的发酵剂的酸化活性进行了比较。
于一组低温巴氏消毒全奶瓶中接种未添加IMP的冷冻CH N 14发酵剂，发酵剂的添加量分别为0.01％、0.02％及0.03％(w/w％)。
于另一组低温巴氏消毒全奶瓶中接种冷冻之前添加3％(w/w％)IMP的冷冻CH N 14培养物，培养物的添加量分别为0.01％(w/w％)。
从实施例2可以看出，未添加IMP的发酵剂酸化活性丧失约50％，相当于与未添加IMP相似量的相似培养物相比，添加IMP的培养物活性约为其2倍。
为说明IMP的增强效应，使用三个不同量的CH N 14发酵剂进行未添加IMP样品的接种。从实施例1获得的结果(即未添加IMP发酵剂于保存期间活性丧失稍低于50％)判断，预期添加IMP的发酵剂的0.01％接种物其酸化活性介于未添加IMP的培养物0.01％与0.02％接种物酸化活性之间。
然而，如图3所述，情况并非如此。0.01％添加IMP的发酵剂接种物酸化活性介于0.02％与0.03％未添加IMP的发酵剂接种物酸化活性之间。额外的活性规因于所添加IMP的增强效应。
本实验显示与相似量未添加IMP的相似培养物相比添加IMP于发酵剂导致活性增强2-2.5倍。
实施例2中的增强效应不明显，因为实施例2中的牛奶经受强热力灭菌法程序，即LAB奶。在我们的实验中，用于乳酪制造的牛奶中增强效应非常显著，因为此牛奶为低温巴氏消毒牛奶。
实施例4：CH-N 19冷冻过程中活性的丧失
此实施例描述以IMP作为冷冻保护剂的CH-N 19发酵剂冷冻过程中活性丧失。实验中，IMP的浓度保持在每g浓缩菌3％ w/w(以30％ w/w无菌溶液添加)。
发酵之后，收获细菌并通过离心CH-N 19培养物发酵液进行浓缩。细胞浓缩物分成两份，300g/份，于每份中添加IMP。混合添加剂及浓缩物30分钟，在液氮中每份冷冻150g。培养物活菌含量为每g冷冻物至少1010CFU，对添加及未添加IMP的冷冻及非冷冻发酵剂于其增长后测定酸化活性。测定于牛奶(热力灭菌LAB奶)中的培养活性。
图4的结果显示如果发酵剂未添加IMP冷冻其酸化活性丧失0.06pH值单位。0.06pH值单位的丧失相当于酸化活性丧失5-10％。然而，如果于此培养物中添加IMP，则无明显的活性丧失。0.01pH值单位的差异与图中误差棒显示的标准差相同。
推断IMP也可以作为冷冻保护剂，抵抗此类型培养物冷冻造成的影响。
实施例5：使用IMP的F-DVSTM Fl-Da N发酵剂的剂量反应
本实施例描述以IMP作为冷冻保护剂的冷冻发酵剂Fl-Da-N(F-DVSTM)剂量反应研究。实验中IMP的浓度为每g浓缩菌0％、0.1％、0.5％、1％、3％及6％ w/w。添加剂以30％无菌溶液添加于浓缩物中。
发酵之后，收获细菌并通过离心Fl-DaN发酵液进行浓缩。细胞浓缩物分成6份，300g/份，于每份中添加IMP。为模拟与工业生产情形相似的情况，在冷冻过程中，混合添加剂与浓缩物，8℃保存5个小时，之后于液氮中冷冻，-50℃保存。因此此实施例不可与前述实施例进行比较。冷冻发酵剂活菌量为每g冷冻物至少1010CFU，于配制冷冻培养物当天测定于牛奶(LAB奶)中的培养活性。
结果示于图5。
从这些结果可以看出未添加IMP冷冻的浓缩培养物，酸化活性丧失最大。添加3％(w/w％)IMP获得了最佳结果(即酸化活性的降低最小)。
实施例6：分析规程QAm-052，“酸化活性-超高温”，Chr.Hansen A/S(丹麦)
应用
此方法用于确定酸化活性。
原理
对于F-DVSTM及FD-DVS：
稀释发酵剂，接种于牛奶中。于给定温度、给定时间培养。培养后测定pH值。
对于冷冻Redi-Set(F-RS)及冷冻干燥Redi-SetFD-RS：
对于这些制品，活性分析包括2个生长步骤。在牛奶中于给定时间和温度增殖发酵剂制备生产用发酵剂，之后，于牛奶中接种生产用发酵剂，于新的增殖培养后测定pH值。
分析参数
可于实验室咨询管理系统(LIMS)中读取制品分析参数说明。例如：牛奶类型、第一次及第二次称重时牛奶的温度、培养时间、培养温度、样品的接种百分数及对照标准。
仪器及试剂
pH值计；pH值计电极；校准缓冲液；pH值7.00±0.01及pH值4.01±0.01；温度调节水浴，精密度为±0.2℃；温度传感器；天平，精密度0.01g，最小两位小数；旋转仪；温度计；手表；磁性搅拌器；磁体；烧杯，50ml。
操作程序：
分析的准备：
注：所有烧瓶均为同一批(日期相同)。
在实验开始之前至少16小时松开所有瓶子的封盖。调节水浴至培养温度。调节第一次称重的瓶子至培养温度(可以是冷或热牛奶)。在校准pH值计之前，在培养温度下置pH值4.01及pH值7.00缓冲液于水浴中至少30分钟。
注：例如，在培养之前置于4℃冰浴中，由计时器启动水浴加热。
分析前样品的准备
冷冻培养物：于第一次称重之前将冷冻样品/对照标准置于带有干冰的泡沫盒中，保存至完成所有称重。
使用之前融解冷冻培养物：
对于使用完整纸盒的冷冻培养物，根据说明进行融解。融解之后，使用前保持样品于4℃至多30分钟。对于罐装冷冻发酵剂，置罐于22℃水浴20分钟以融解内容物。融解之后，使用前保持培养物于4℃至多30分钟。
冷冻干燥培养物：
实验之前，冷冻干燥样品/对照标准在室温适应至少15分钟。
接种操作过程
第一次称重/稀释
将第一次称重的瓶子置于天平上，调零。
制品/对照标准的称重直接于牛奶中进行。
当于温牛奶接种时，总把第一次称重的时间记录在内，接种物的实际量(第一次称重)以至少两位小数记录。
小心摇晃冻融的发酵剂至其散开或至多10次，之后瓶子直立大约50秒。
对于冷冻干燥发酵剂，使用旋转仪(速度2)5分钟或直至制品散开。
注：对于嗜酸乳杆菌、双岐杆菌或干酪样乳杆菌的冷冻干燥发酵剂，所有接种均在净化台内进行。
第二次称重
将第二次称重的瓶子置于天平上，调零。
对于冻融的发酵剂，在第二次称重之前小心摇晃稀释瓶。根据目前的质量控制(Qc)规程进行以1分钟的时间进行第二次称重。
对于冷冻干燥发酵剂，根据目前的质量控制(Qc)规程进行第二次称重。
当接种为冷/温时，记录第二次称重的时间。以至少两位小数记录接种物的实际量。
翻转活性瓶，下一样品/对照重复接种过程。
对于从相同的第一次称重接种的活性瓶进行顺序接种。
注：混合发酵剂的称重：
首先，从每一对照标准/单一菌株进行第一次称重，对相同的活性瓶进行第二次称重，这将包含所有对照标准/单一菌株。
对于冷冻发酵剂，从第一次称重至第二次称重的时间最多为5分钟，对于冷冻干燥发酵剂，从第一次称重至第二次称重的时间最多为10分钟。
最后，将一未接种的牛奶瓶置于水浴中。
对于冷牛奶进行第一次称重的发酵剂：
Time(测量)＝Time第二次称重+Time接种
对于热牛奶进行第一次称重的发酵剂：
Time(测量)＝Time第一次称重+Time接种
注：对于另外进行长期酸化分析的发酵剂，可于酸化活性接种同时进行接种。
从用于酸化活性的第一次称重，第二次称重可以于冷活性牛奶中进行(在加热至培养温度的水浴中培养之前，将冷活性牛奶置于4℃)。此时，将瓶子培养多于给定培养时间半小时。
注：对于样品/对照标准进行培养及pH值测定的发酵剂，由于，在正常工作时间内不可能长时间的酸化，可于冷牛奶中进行第一次和第二次称重。
活性牛奶的接种之后，将瓶子置于水浴中冷却。将接触手表的温度传感器置于水浴中未接种的牛奶瓶中(置于水浴中)。连接接触手表于给定时间开始水的加热，当达到有关发酵剂所需温度时培养时间开始。
注：如有必要使用一个以上水浴，则必须于同一水浴中将对照标准与其连接的样品一起培养。
pH值计电极的测量
根据当前有关电极校准及维护的说明书进行校准。
必须于测量时间(Time测量)测量样品/对照标准的pH值，如果时间超过1分钟，要作记录。如果时间超过2分钟，则放弃测量。于测量之前，翻转瓶子180°。
pH值计的测量
pH值的测量于瓶子或注入带磁力搅拌的50ml烧杯的样品中进行。
pH值以两位小数记录。
记录关于测量的可能评述。测量过程持续至所有样品/对照标准及未接种的牛奶测量完毕。于接种的牛奶瓶中测量水浴温度并记录于记录簿中。
最后，测量校准缓冲液的pH值
实施例7：分析规程QAm-043，酸化活性-“程序温度变化曲线”Chr.Hansen A/S(丹麦)
应用
此方法根据Pearce试验用于测定酸化活性及其它根据温度变化曲线(如Danbo变化曲线)进行酸化的情况。仅Pearce试验被包括在国际奶业标准(IDF)中。
原则
根据反映温度变化过程的温度变化曲线(发酵剂用于乳业中进行给定乳制品的生产时将遇到)进行酸化。
对于Pearce试验在Cheddar生产过程中此为干酪的制造温度。
在固定时间测量pH值。
对于分析过程中未添加粗制凝乳酶的发酵剂，可以连续测量pH值。
分析参数
制品特有的分析参数于实验室咨询管理系统(LIMS)中给出。
温度变化曲线的定义(对于未使用Pearce变化曲线的制品)。
使用的对照标准。
pH值测量的类型。
样品及对照标准的培养百分比。
稀释牛奶：206.9g冷(4℃)LAB-牛奶(即含9.5％(w/w)固体物质、于加热99℃ 30分钟的超高温灭菌复原脱脂奶(RSM))。
活性牛奶：200g冷(4℃)低温巴氏消毒全奶(3.5％脂肪)。
粗制凝乳酶：Naturén规格190，以水1∶40稀释。
仪器与试剂
pH值计/半连续pH值测量pH值计eks.RadiometerPH值M92。
pH值计电极RadiometerPFC2401。
缓冲液：pH值7.00±0.01及pH值4.01±0.01。
根据预定的温度变化曲线±0.2℃加热的温度调节水浴。
温度传感器。
天平，精密度0.01g(最小两位小数)。
手表。
磁力搅拌器。
磁体。
烧杯，50ml。
小塑料杯。
旋转仪。
操作程序
分析的准备
所有瓶子为同一批(即日期相同)。
调节水浴至使用的变化曲线温度的起始温度。
将稀释(第一次称重)及活性(第二次称重)瓶子置于4℃直至使用。
在pH值计校准之前至少30分钟，将pH值4.01及pH值7.00缓冲液置于具体测量温度±0.2℃的水浴中。
分析之前样品的准备
冷冻发酵剂：
将冷冻样品/对照标准于第一次称重之前置于带有干冰的泡沫盒中，并保存至所有称重完毕。
使用前融解的冷冻发酵剂：
对于使用完整纸盒的冷冻发酵剂，根据说明书进行融解。
融解后，于使用前将样品保持在4℃至多30分钟。
冷冻干燥发酵剂：
在分析开始之前使冷冻干燥样品及对照标准于室温适应至少15分钟。
如果样品于日后用于再测定，则可保存于+8℃。
培养过程
样品/对照标准的称重直接于牛奶中进行。
接种物的实际量(第一次称重)以至少两位小数记录。
小心翻转冻融发酵剂4次，之后，直立瓶子约50秒。
对于冷冻干燥发酵剂必须使用旋转仪。快速运行5分钟或至制品彻底溶解。通过将瓶子置于桌上片刻然后观察瓶底检查溶液进行控制。
注：
如方便，于第二次称重之前将第一次称重的冷瓶子置于室温至多15分钟。
第二次称重：
第二次称重之前翻转稀释瓶。
接种物的实际量(第二次称重)以至少两位小数记录。
翻转活性瓶，重复样品/对照标准的接种过程。
对于同是第一次接种的活性瓶顺序给予接种。
在第二次称重之前或之后于每瓶添加2ml粗制凝乳酶。之后，翻转瓶子以使粗制凝乳酶分散开。
粗制凝乳酶不被添加至Danbo变化曲线。
(非国际乳业(IDF)标准)
随后如实施例6所述同时培养瓶子。
最后，将两只未接种的牛奶瓶置于水浴。一只用于测量水浴温度，一只用于测量pH值。
培养
注：当需要更多水浴时，与样品对应的对照标准必须在同一水浴中培养。
所有活性瓶在同一时间、变化曲线温度的确定起始温度下于预热的水浴中进行培养。
在将瓶子置于水浴的同时开始温度变化曲线。
此后，由依照温度变化曲线的自动调温器控制培养温度，Pearce试验见表3，Danbo试验见表4。
水浴中的水位应高于牛奶水平至少2cm。
表3：Pearce温度变化曲线的温度方案(依照IDF)
| 时间，分钟 | 温度，℃ | 变化 |
| 0 | 31.0 | ±0.2℃ |
| 50 | 31.0 | ±0.2℃ |
| 54 | 31.7 | ±0.5℃ |
| 58 | 32.2 | ±0.5℃ |
| 62 | 32.8 | ±0.5℃ |
| 66 | 33.3 | ±0.5℃ |
| 70 | 33.9 | ±0.5℃ |
| 73 | 34.4 | ±0.5℃ |
| 76 | 35.0 | ±0.5℃ |
| 79 | 35.6 | ±0.5℃ |
| 82 | 36.1 | ±0.5℃ |
| 85 | 36.7 | ±0.5℃ |
| 87.5 | 37.2 | ±0.5℃ |
| 90 | 37.8 | ±0.2℃ |
| 360 | 37.8 | ±0.2℃ |
表4：Danbo温度变化曲线
| 时间，分钟 | 温度，℃ | 变化 |
| 02:40 | 31.0℃ | ±0.2℃ |
| 00:15 | 斜线温度31.0℃-38.0℃ | ±0.5℃ |
| 00:35 | 38.0℃ | ±0.2℃ |
| 04:24 | 斜线温度38.0℃-16.0℃* | ±0.5℃ |
| 直至16:00 | 16.0℃ | ±0.2℃ |
注：在3小时30分钟时，打开冷却水。
*06:00小时+/-2分钟之后的pH值手动测量符合25.5℃+/-0.5℃的水浴温度。
pH值计电极的校准
根据当前有关电极校准和维护的说明书在起始温度进行校准。
pH值的测量
培养后充分振摇瓶子，测量pH值。
于瓶子或磁力搅拌下注入50ml烧杯的样品中测量pH值。
以至少两位小数记录pH值。
记录关于测量的可能评述。
测量过程持续至所有样品/对照标准及未接种牛奶被测量完毕。
最后，测量缓冲液pH值并记录。
连续的pH值测量。
从温度变化曲线开始时，取样测量pH值。培养完成后，记录起始温度时两种缓冲液中所测得的pH值。
实施例8：分析规程Q-AM-071，“微生物的计数”Chr-Hansen A/S(丹麦)
应用领域
此方法用于各种发酵剂中乳酸菌的计数及交叉污染的计数。根据当前质量控制(Qc)规程此方法仅可与有关培养物分析程序一同应用，因为本发明中必须给予分析参数的参照。
原则
此方法为定量方法，结果以CFU/g报告。
已知量的样品以稀释剂同质加工处理并进行十进位稀释。稀释液与Leesment琼脂混合或散布于表面。培养之后，计数所有菌落数量。
取样
根据已建立的微生物学操作规范取样，以使样品尽可能代表待测制品。仪器与玻璃器皿
250ml瓶子
20ml带帽试管
高压灭菌器(±1℃)
pH值计(灵敏度为±0.2)
天平(±0.01g)
漩涡搅拌器
Stomacher
无菌Stomacher袋，400ml
细菌培养箱(±1℃)
水浴(±1℃)
无菌移液管
Petri培养皿(9cm)
无菌Drigalski接种勺
培养基
表5 稀释剂液，内容物
| 酪蛋白胨氯化钠防沫剂FG-10.2％ | 15.0g9.0g1.14ml |
制备
将成分悬浮于1000ml蒸馏水中，快速搅拌下加热至沸点。分装稀释液至瓶子或试管内，121℃高压灭菌15分钟。
高压灭菌之后pH值为7.0±0.2。
高压灭菌之后瓶中内容物为99.0±1.0ml。
高压灭菌之后试管中内容物为9.00±0.05ml。
如果稀释液(表5)被立即使用，则冷却至20℃或更低。
贮存
制备好的稀释液(表5)5℃下于暗处保存6个月。
表6 Leesment琼脂，内容物
| 胰蛋白胨(Oxoid L42)酵母提取物(Oxoid L21)明胶乳糖氯化钠二水柠檬酸三钠(Merck 6432)五水乳酸钙(Merck 2102)琼脂(So-Bi-Gel) | 20.0g5.0g2.5g10.0g4.0g2.0g8.0g12.0g |
制备
将成分悬浮于1000ml蒸馏水中，快速搅拌加热至沸点至完全溶解。将培养基分装至瓶子内，121℃高压灭菌15分钟，高压灭菌之后pH值为6.8±0.2。
如果培养基被立即使用，于水浴中将其冷却至约47℃。使用前于200ml用于所有CR-发酵剂的Leesment琼脂(表6)中添加2ml 50％葡萄糖溶液。
如果培养基用于平板涂布，倾倒12-15ml熔化的培养基至Petri培养皿中，将培养基置于净化台中干燥30分钟。
葡萄糖溶液
于100ml蒸馏水中融解2.0g葡萄糖，溶液以0.20nM过滤器过滤除菌。
Leesment葡萄糖琼脂
在使用之前于200ml Element琼脂中添加50％葡萄糖溶液2ml。(表6)
贮存
制备好的Leesment琼脂可于暗处5℃保存6个月。
塑料袋装倾注平皿可于暗处5℃保存10日。
操作程序
从称量完毕样品至倾倒平板或涂布平板的过程不超过30分钟。
于微生物学检查开始之前，于沸水浴或通过于高压灭菌器中煮沸熔化培养基，然后在水浴中冷却至47±1℃。
注：如果使用预先倾倒的培养皿，则于培养之前培养基表面必须保持干燥。
在有关制品的分析程序或质量标准中给出以下参数：
a)第一次稀释(D1)使用的克数(X)
b)于Stomacher中的分钟数(M)
c)适当的稀释(D2)
d)待接种量(Aml)
e)培养参数
f)平皿培养法
稀释液的制备
称量X克制品于无菌Stomacher袋内，称量足量的无菌稀释液进行第一次稀释(D1)，将袋子放入Stomacher，处理(M)分钟。如方便，将袋子内容物倾入空的无菌瓶中，使用无菌移液管从最低稀释度溶液中取0.1ml或1.0ml转移至装有无菌稀释液的瓶子或试管内，进行第二次稀释(此时为最低)。
30°角度振摇瓶子7秒20-25次以混合瓶子内容物，于漩涡搅拌器上以最大速度3×1秒混合试管内容物。
使泡沫沉降，重复4-5点至达到适当的稀释(D2)。
倾注平皿
使用无菌移液管转移Aml适当的稀释液(D2)至Petri培养皿中。于每一Petri培养皿中倾倒10-12ml不超过47±1℃熔化的培养基，与样品充分混合。倾倒10-12ml熔化培养基于一空Petri培养皿中作为无菌对照。将培养皿置于一清洁水平面至培养基凝固。将培养皿倒置，根据有关制品质量控制(Qc)进行培养。
平板涂布
使用无菌移液管转移Aml适当的稀释液(D2)至培养基表面，使用无菌Drigalski接种勺涂布整个培养基。使用未接种带培养基的Petri培养皿作为无菌对照。倒置培养皿之前使样品被培养基吸收，根据有关制品质量控制(Qc)进行培养。
菌落计数
对于总体活细胞计数，选择含30-300菌落的Petri培养皿。计数所有菌落数。
对于交叉污染的计数，选择含不超过300菌落的Petri培养皿。计数所有菌落数。
注：对于交叉污染的计数，待分析制品(于背景中将产生云片状)可产生针尖状菌落。因此，仅计数云片中大于针尖状菌落的菌落。
计算
根据标准统计学规程，计数后对于平板计数必须进行χ2检验。
注：当此方法用于交叉污染的计数时不进行χ2检验。
如果χ2检验不被接受，则必须放弃实验结果，重复分析。
如果χ2检验被接受，则根据下列公式计算CFU/g的平均数(N)。
N＝(∑c)/((n1+0.1n2)d)
其中：
∑c是所有Petri培养皿的菌落数；
n1第一次稀释Petri培养皿的数量；
n2第二次稀释Petri培养皿的数量；
d与第一次稀释相对应的稀释系数。
分析结果报告
计数的计算可以按上述实施例报告或以带两个有效数字的约整数报告。
外部报告的结果必须四舍五入。
例
19184四舍五入成19000，报告为1.9×104。
294×108四舍五入成290×108，报告为2.9×104。
对于三个数字的数，使第三位数四舍五入为零：如果第三位数是5，前面的数是偶数，则舍去，如果前面的数字为奇数，则舍入。
例28500四舍五入为28000及
11500四舍五入为12000。
实施例9：Fl-Da N冷冻干燥LD发酵剂的稳定性研究
此实施例中，对于Fl-Da-N冷冻干燥发酵剂(FD-DVS)制造过程中添加及未添加IMP作为冷冻保护剂的不同作一比较。实验中IMP的浓度为每g浓缩菌0％及3％ w/w，冷冻添加剂以30％无菌溶液添加至浓缩菌中。
发酵之后，由Fl-Da N发酵液收获细菌并通过离心进行浓缩。将细菌浓缩物分成两份，每份300g，于每份中添加IMP。为在冷冻过程中模拟工业生产情形，混合添加剂与浓缩物，于8℃保存5小时，接着在液态氮中冷冻，冷冻干燥之前于-50℃保存1天。冷冻干燥完毕之后，于-50℃保存发酵剂直至分析。冷冻发酵剂活菌含量至少为每g冷冻物1010CFU。-50℃保存7天之后检测于牛奶(LAB奶)中的培养活性。
结果示于图6。
很明显未添加IMP的冷冻干燥DVS Fl-Dn N丧失大部分活性。Fl-Dn N于-50℃保存7天后稳定性降低0.25pH值单位，0.25pH值单位相当于酸化活性丧失50％。
实施例10：F-DVSTM FI-DaN冷冻LD型发酵剂使用不同核苷酸生物合成有关化合物作为冷冻保护剂的稳定性研究
此实施例描述添加核苷酸(IMP或GMP)或核苷(次黄嘌呤核苷)作为冷冻保护剂的冷冻直投式发酵剂F-DVSTM FI-Da N(Chr.Hansen A/S产品号No.501691)的稳定性研究。实验中，IMP、GMP或次黄嘌呤核苷浓度保持在每g浓缩菌3％w/w。IMP及GMP以25％ w/w无菌水溶液添加至浓缩菌中。而次黄嘌呤核苷以干粉添加。对于次黄嘌呤核苷，于发酵剂中添加的水量与IMP或GMP相等。
发酵之后，由F-DVSTM FI-Da N发酵液收获细菌并通过离心进行浓缩。将细菌浓缩物分成四份，每份300g，于每份中添加IMP、GMP、次黄嘌呤核苷或不添加任何化合物。混合添加剂与浓缩物30分钟，在液态氮中冷冻，-50℃保存。冷冻发酵剂活菌含量至少为每g冷冻物1010CFU。于发酵剂冷冻当天检测牛奶(LAB奶)中的培养活性并直至冷冻13天内定期进行检测。
以酸化活性给出的F-DVSTM FI-Da N的稳定性数据概括于图7。
很明显未添加添加剂的F-DVSTM FI-Da N丧失活性。F-DVSTM FI-Da N于-50℃保存13天后，与次黄嘌呤核苷稳定的发酵剂相比，未添加次黄嘌呤核苷的发酵剂稳定性降低0.41pH值单位。0.41pH值单位相当于酸化活性丧失60％。同样，添加或未添加GMP的F-DVSTM FI-Da N发酵剂之间稳定性差异为0.31pH值单位，相当于酸化活性丧失50％。
实施例11：F-DVSTM FI-Da N冷冻LD型发酵剂使用不同核苷酸生物合成有关化合物作为冷冻保护剂的长期稳定性研究
此实施例描述添加核苷酸(IMP或GMP)或核苷(次黄嘌呤核苷)作为冷冻保护剂的冷冻直投式发酵剂F-DVSTM FI-Da N(Chr.Hansen A/S产品号No.501691)的长期稳定性研究。实验内容如实施例10所述，除活性监测时间延长。
F-DVSTM FI-DaN稳定性数据(以酸化活性给出)概括于图8。
所报告的F-DVSTM FI-Da N保存初期的趋势可以延长至21或甚至49天。在长期保存期间，作为F-DVSTM FI-Da N的冷冻保护剂，次黄嘌呤核苷似乎优于GMP，而GMP又优于IMP。另外，本实验表明在保存初期使用次黄嘌呤核苷作为冷冻保护剂的优点也可以扩展至长期保存情况。因此，使用次黄嘌呤核苷作为冷冻保护剂预期可使制品酸化活性即使是长期保存之后也可增强大于两倍。
[346]此为一重要结果，因为商业冷冻发酵剂的平均保存期为1年。
实施例12：不同添加剂对Fl-Da N冷冻干燥LD型发酵剂的稳定性的影响
本实施例描述添加及未添加不同添加剂(可作为冷冻保护剂)的Fl-DaN冷冻干燥LD型发酵剂(FD-DVS)的稳定性，除非图中另有说明，实验中各种添加剂的浓度为每g浓缩菌3％ w/w。
发酵之后，如“材料与方法”部分所述，由FI-Da N发酵液收获细菌并通过离心进行浓缩。细菌浓缩物将细菌浓缩物分成几份，于每份中添加添加剂。为在冷冻过程中模拟工业生产情形，混合添加剂与浓缩物，于8℃保存5小时，接着在液态氮中冷冻，冷冻干燥之前于-50℃保存1天。冷冻干燥完毕之后，于-50℃保存发酵剂直至分析。冷冻干燥发酵剂活菌含量至少为每g冷冻干燥物1010CFU。-50℃保存1天及2个月之后通过酸化活性测定检测于牛奶(LAB奶)中的培养活性。
实验结果示于图9及图10。
从本实验可以看出，不同的添加剂对冷冻干燥DVS-Da N培养物稳定性的影响不同。另外，本实验显示，在保存初期表现最佳的添加剂在长期保存期间不一定是最佳。这通过于发酵剂中添加3％ w/w次黄嘌呤核苷或腺苷的作用来说明。-50℃保存仅1天后的检测显示3％ w/w次黄嘌呤核苷及3％ w/w腺苷均对确保发酵剂的稳定性高度有效，但-50℃保存2个月后显示3％ w/w的CMP、UMP或IMP为优选。另人吃惊的是，-50℃保存2个月的稳定性实验结果(图10)表明腺苷对发酵剂有害。为进行对照将已知的冷冻保护剂谷氨酸钠(MSG)(Font de Valdez，1983)并入本实验中。另外，应该注意到甲酸钠的浓度为％ w/w(因3％w/w对冷冻发酵剂有害)，见下面的实施例15。
实施例13：添加剂组合物对冷冻保加利亚乳杆菌发酵剂(冷冻速度为1℃/min)稳定性的影响
本实施例描述添加两种可能的冷冻保护剂(IMP及次黄嘌呤核苷)组合物对冷冻保加利亚乳杆菌发酵剂制造中的活性的影响。本实施例中对添加及未添加此组合物的培养物活性进行了比较。
于MRS培养基(Difco)40℃培养保加利亚乳杆菌培养物12小时。将培养物冷却至12℃并调节其pH值至6.0。冷却之后，通过离心浓缩发酵液细菌10-20倍，添入添加剂，接着于冷冻机内缓控制冷却缓慢冷冻，保证冷却速度约1℃/分钟，直至达-50℃。酸化试验之前将发酵剂于-50℃保存至第二天(约18小时)。酸化试验按照“材料与方法”部分所述进行，本试验接种物浓度为0.02％ w/w，40℃下进行5小时。
本实验中添加3％ w/w IMP及2％ w/w作为冷冻保护剂，w/w是指每g浓缩菌添加剂的重量，IMP及次黄嘌呤核苷以水溶液添加至浓缩菌中，至培养物的体积增加13％。此增加在图11的数据中有所说明。因此，冷冻保护效果甚至比图中显示的要大。
本实验显示根据本发明两种添加剂(3％ w/w IMP及2％ w/w次黄嘌呤核苷)的组合物使发酵剂更加稳定。对于-50℃保存一天的保加利亚乳杆菌，稳定性差异等于0.26pH值单位。0.26pH值单位约相当于酸化活性的50％差异(即稳定的发酵剂约为未稳定发酵剂活性的2倍。本实验进一步显示IMP及次黄嘌呤核苷的冷冻保护效果可以扩大到包括缓慢冷冻的发酵剂。
实施例14：添加剂组合物对冷冻婴儿双岐杆菌活力的影响
本实施例探索了3％ w/w IMP及2％ w/w次黄嘌呤核苷组合物对缓慢冷冻的婴儿双岐杆菌稳定性的影响。
于MRS培养基(Difco)中培养婴儿双岐杆菌培养物，将发酵剂冷却至12℃并调节其pH值至6.0。冷却后，通过离心浓缩发酵液细菌10-20倍，添入添加剂，之后通过滴注浓缩培养物至液态氮快速冷冻(A培养物)或于冷冻机控制冷却确保冷却速度约1℃/分钟至达到-50℃而缓慢冷冻(B培养物及C培养物)。在如“材料与方法”部分所述进行活力测定(CFU测定)之前，于-50℃保存培养物至次日(约18小时)。
[357]本实验显示与婴儿双岐杆菌快速冷冻培养物(A培养物)相比，缓慢冷冻培养物(B培养物)的活力显著下降。重要的是，本实验进一步表明根据本发明冷冻(C培养物)之前添加两种添加剂(3％ w/w IMP及2％ w/w次黄嘌呤核苷)的组合物，缓慢冷冻培养物的CFU数与快速冷冻培养物几乎相等。
我们推断对于缓慢冷冻的婴儿双岐杆菌3％ w/w IMP及2％ w/w次黄嘌呤核苷的组合物作为冷冻保护剂是有效的。
实施例15：不同添加剂对冷冻发酵剂F-DVSTM CH-N 19稳定性的影响
本实施例描述了添加及未添加不同添加剂(可作为冷冻保护剂)的CH-N 19培养物的冷冻直投式发酵剂(F-DVSTM)的稳定性。
发酵之后，由F-DVSTM CH-N 19发酵液收获细菌并通过离心进行浓缩。将细菌浓缩物分成几份，如图中所示添加各种发酵剂。图中各种发酵剂的浓度以每g浓缩菌％w/w给出。
将添加剂与细菌浓缩物混合30分钟，于液态氮内滴加冷冻，于-50℃保存。
于-50℃保存1天(图13)及6天(图14)后以酸化活性测定在牛奶(LAB奶)中的培养活性。活性测定以0，005％ w/v接种物为基础，30℃培养6小时。
如实施例12所示，本实验还显示不同的添加剂对冷冻发酵剂的稳定性具有不同的影响作用。有趣的是，本实验显示腺苷及腺苷-5′-一磷酸对发酵剂的活性有害。本实验还证明3％ w/w甲酸钠对冷冻发酵剂的活性是有害的。
实施例16：添加IMP及次黄嘌呤核苷(实施例15)的CH-N 19TM用于Gouda 45+乳酪生产的试验
Gouda 45+乳酪于150g乳酪槽中的生产
1.牛奶
全脂牛奶来自Borup Dairy(丹麦)，已于72℃巴氏消毒15秒(有机奶，76-78℃消毒15秒)并冷却至5℃。蛋白含量为3.4-3.7％(正常)。所接收的牛奶于Milkoscanner(Foss Electric A/S，Hillerd，丹麦)分析脂肪及蛋白百分含量(％)。测量牛奶温度，取样进行微生物学分析。至使用前牛奶保存于冷室。
2.标准化
Gouda 45+生产用牛奶脂肪含量应为3.00％(蛋白含量为3.4％)，终乳酪干品中脂肪含量将为45％。使用本领域标准方法计算脂肪：蛋白比例。乳酪牛奶通过添加计算量的奶油或脱脂乳进行标准化。标准化之后，于热交换器内预热牛奶至32℃的预熟化温度，倒入乳酪槽内。持续缓慢搅动(235rpm)至牛奶中的粗制凝乳酶分散开。
3.CaCl2及硝酸钾
硝酸钾添加浓度为0.020％，即每150kg牛奶30g。CaCl2于牛奶中的添加量为每150kg牛奶0-20g(如需要可以34％溶液添加)。
4.发酵剂
本实验中，生产4批并进行对比。第一组批中，每一批接种冷冻前添加IMP及次黄嘌呤核苷的0.005％ F-DVS CH-N 19(1B批)。对照批接种未添加IMP及次黄嘌呤核苷的0.01％ F-DVS CH-N 19(1A批)。第二组批接种冷冻前添加IMP及次黄嘌呤核苷的0.005％ F-DVS CH-N 19(2B批)。对照批接种未添加IMP及次黄嘌呤核苷的0.01％F-DVS CH-N 19(2A批)。在添加粗制凝乳酶之前，使发酵剂于32℃生长35分钟。
5.粗制凝乳酶
以0.022％ w/w(每150kg30.0g)添加粗制凝乳酶CHY-MAX Plus(200IMCU/mL)。粗制凝乳酶于使用前以清洁冷自来水稀释达3倍体积。添加粗制凝乳酶之后持续搅拌(235rpm)不超过1分钟，将搅拌器从槽内移除。添加粗制凝乳酶35分钟后可以看到牛奶已经凝固。
Gouda 45+的制造
牛奶的凝固正常情况下需要30-45分钟。由绳线之间为5mm的切割器切凝块，在乳酪槽内首先水平运行切割器，接着垂直运行切割器。然后沿槽边垂直切割凝块三次，直至得到5mm的立方块。此时小心处理凝块，以使乳清的损失最小化。将搅拌器置于槽内，预先缓慢搅拌(350rpm)凝块15-20分钟，之后，排出45kg乳清，然后调整搅拌器至较快搅拌水平(415rpm)20分钟。于20分钟内将第一组批的温度提高至38℃开始烫热，第二组批温度提高至40℃开始热烫。需要缓慢、平稳及控制性的温度增加。达到38℃或40℃之后，进行搅拌，总搅拌时间共85分钟(即38℃或40℃时为35-45分钟)。
6.压榨
搅拌95分钟之后，移除搅拌器，将凝块置于槽内。使用预压板预压使对凝块的作用压力达2.5bar30分钟。预压之后，将凝块切成两块。将干酪块放于合适的模具(30×30cm)中，边向与预压过程相同。将模具置于压榨机械中，以2bar压榨20分钟，后以4-6bar压榨1-2小时。压制结束后，测量干酪的高度，称重，鉴定及测量pH值。最后，保存干酪于模具中至pH值达5.7，之后直接于盐水中加盐。
7.加盐
于20％ NaCl+0.25％ CaCl2的盐水10-12℃加盐20-24小时，使最终干酪的含盐量为1.7％。重要的是在盐水加盐过程中适当分离干酪并没于盐水中以获得所需的盐浓度。加盐之后，包装前使干酪干燥1-2小时。
8.包装
包装前，以游霉素(300ppm水溶液)喷洒干酪，然后以Cryovac塑料袋(BK1L)真空包装，放入硬塑料盒(30×30cm)内。包装之后，塑料盒于14℃贮存4周，之后于5-8℃贮存。
发酵条件：
第1组批：
A.)添加IMP及次黄嘌呤核苷的F-DVS CH-N 19实验发酵剂
热烫温度38℃、接种0.005％
| 处置 | 添加IMP及次黄嘌呤核苷的CH-N19 | |||||||
| 批号 | 1B | |||||||
| 时间 | 温度 | 搅拌速度 | pH值 | 效价 | ||||
| 设定 | 实际 | 设定 | 实际 | 设定 | 实际 | |||
| 添加牛奶 | 09:30 | 32.0 | 235 | 6.64 | ||||
| 添加硝酸钾 | 09:35 | |||||||
| 添加发酵剂 | 09:45 | |||||||
| 添加辅料 | 10:15 | |||||||
| 添加粗制凝乳酶， | 10:20 | 6.55 | ||||||
| 切割 | 10:55 | |||||||
| 预搅拌 | 11:00 | 350 | ||||||
| 排出乳清 | 11:20 | 32.0 | 6.53 | 0.14 | ||||
| 中间搅拌 | 11:25 | 390 | ||||||
| 热烫开始/搅拌 | 11:35 | 6.52 | 0.14 | |||||
| 热烫结束 | 11:50 | 38.0 | 390 | 6.51 | 0.15 | |||
| 搅拌结束 | 12:30 | 6.48 | 0.16 | |||||
| 预压 | 12:35 | |||||||
| 预压结束 | 13:05 | 6.34 | 0.17 | |||||
| 装于模具中 | 13:10 | |||||||
| 第一次压榨 | 13:15 | |||||||
| 第二次压榨 | 13:45 | |||||||
| 第三次压榨 | 15:15 | |||||||
| 压榨结束 | 15:15 | |||||||
| 6小时后的pH值 | 15:45 | 5.75 | ||||||
于水中 16:00
于盐水中 17:15盐水：21％ NaCl，pH值5.2，温度：11.5℃ 5.48
出盐水 15:45 22.5h
预压 2.5bar 30分钟
30小时后的pH值 5.21
B.)未添加IMP及次黄嘌呤核苷的F-DVS CH-N 19对照发酵剂热烫温度38℃、接种0.01％
| 处置 | 对照 CHN-19 | |||||||
| 批号 | 1A | |||||||
| 时间 | 温度 | 搅拌速度 | pH值 | 效价 | ||||
| 设定 | 实际 | 设定 | 实际 | 设定 | 实际 | |||
| 添加牛奶 | 09:00 | 32,0 | 235 | 6.63 | ||||
| 添加硝酸钾 | 09:05 | |||||||
| 添加发酵剂 | 09:15 | |||||||
| 添加辅料 | 09:45 | |||||||
| 添加粗制凝乳酶， | 09:50 | 6.57 | ||||||
| 切割 | 10:25 | |||||||
| 预搅拌 | 10:30 | 350 | ||||||
| 排出乳清 | 10:50 | 32,0 | 6.53 | 0.15 | ||||
| 中间搅拌 | 10:55 | 390 | ||||||
| 热烫开始/搅拌 | 11:05 | 6.52 | 0.15 | |||||
| 热烫结束 | 11:20 | 38,0 | 390 | 6.52 | 0.15 | |||
| 搅拌结束 | 12:00 | 6.51 | 0.16 | |||||
| 预压 | 12:05 | |||||||
| 预压结束 | 12:35 | 6.41 | 0.17 | |||||
| 装于模具中 | 12:40 | |||||||
| 第一次压榨 | 12:45 | |||||||
| 第二次压榨 | 13:15 | |||||||
| 第三次压榨 | 14:45 | |||||||
| 压榨结束 | 14:45 | |||||||
| 6小时后的pH值 | 15:15 | 5.92 | ||||||
于水中 15:30
于盐水中 16:45盐水：21％ NaCl，pH值5.2，温度：11.5℃ 5.70
出盐水 15:15 22.5h
预压 2.5bar 30分钟
30小时后的pH值 5.20
第2组批：
A.)添加IMP及次黄嘌呤核苷的F-DVS CH-N 19实验发酵剂热烫温度40℃、接种0.005％
| 处置 | 添加IMP及次黄嘌呤核苷的CH-N19 | |||||||
| 批号 | 2B | |||||||
| 时间 | 温度 | 搅拌速度 | pH值 | 效价 | ||||
| 设定 | 实际 | 设定 | 实际 | 设定 | 实际 | |||
| 添加牛奶 | 08:30 | 32.0 | 235 | 6.63 | ||||
| 添加硝酸钾 | 08:35 | |||||||
| 添加发酵剂 | 08:45 | |||||||
| 添加辅料 | 09:15 | |||||||
| 添加粗制凝乳酶， | 09:20 | 6.54 | ||||||
| 切割 | 09:55 | |||||||
| 预搅拌 | 10:00 | 350 | ||||||
| 排出乳清 | 10:20 | 32.0 | 6.52 | 0.14 | ||||
| 中间搅拌 | 10:25 | 390 | ||||||
| 热烫开始/搅拌 | 10:35 | 6.52 | 0.15 | |||||
| 热烫结束 | 10:50 | 40.0 | 390 | 6.50 | 0.15 | |||
| 搅拌结束 | 11:30 | 6.47 | 0.16 | |||||
| 预压 | 11:35 | |||||||
| 预压结束 | 12:05 | 6.36 | 0.16 | |||||
| 装于模具中 | 12:10 | |||||||
| 第一次压榨 | 12:15 | |||||||
| 第二次压榨 | 12:45 | |||||||
| 第三次压榨 | 14:15 | |||||||
| 压榨结束 | 14:15 | |||||||
| 6小时后的pH值 | 14:45 | 6.02 | ||||||
于水中 16:00
于盐水中 19:00 5.60
出盐水 17:30 22.5h
预压 2.5 bar 30分钟
30小时后的pH值 5.22
B.)未添加IMP及次黄嘌呤核苷的F-DVS CH-N 19对照发酵剂热烫温度40℃、接种0.01％
| 处置 | 对照 CHN-19 | |||||||
| 批号 | 2A | |||||||
| 时间 | 温度 | 搅拌速度 | pH值 | 效价 | ||||
| 设定 | 实际 | 设定 | 实际 | 设定 | 实际 | |||
| 添加牛奶 | 08:00 | 32.0 | 235 | 6.60 | ||||
| 添加硝酸钾 | 08:05 | |||||||
| 添加发酵剂 | 08:15 | |||||||
| 添加辅料 | 08:45 | |||||||
| 添加粗制凝乳酶， | 08:50 | 6.54 | ||||||
| 切割 | 09:25 | |||||||
| 预搅拌 | 09:30 | 350 | ||||||
| 排出乳清 | 09:50 | 32.0 | 6.54 | 0.14 | ||||
| 中间搅拌 | 09:55 | 390 | ||||||
| 热烫开始/搅拌 | 10:05 | 6.53 | 0.14 | |||||
| 热烫结束 | 10:20 | 40.0 | 390 | 6.51 | 0.14 | |||
| 搅拌结束 | 11:00 | 6.49 | 0.15 | |||||
| 预压 | 11:05 | |||||||
| 预压结束 | 11:35 | 6.41 | 0.16 | |||||
| 装于模具中 | 11:40 | |||||||
| 第一次压榨 | 11:45 | |||||||
| 第二次压榨 | 12:15 | |||||||
| 第三次压榨 | 13:45 | |||||||
| 压榨结束 | 13:45 | |||||||
| 6小时后的pH值 | 14:15 | 6.24 | ||||||
于水中 15:30
于盐水中 19:00 盐水：21％ NaCl，pH值5.2，温度：11.5℃ 5.84
出盐水 17:30 22.5h
预压 2.5bar 30分钟
30小时后的pH值 5.32
结果：
8周以后对干酪进行评价。确定化学分析以确保处于此类干酪4周需要量的范围内(含水量、含盐量、脂肪含量)。还进行干酪的感官评价以确保其具有合适的眼孔形状、结构及香味。
对于干酪制品进一步进行下列缺陷分析：
1.)外部缺陷(形状、表皮、颜色、香味)
2.)内部缺陷(颜色、结构、一致性)
3.)香味及味道缺陷
对各批制品进行评分(使用数字0、3、6、8、9、10、11、12或13)。最佳为13。
第一组批
1A.)热烫温度38℃的对照槽406F-DVS CHN-19
·眼孔形状好，11分。
·香味好、纯净，11分。
·味道为Gouda，非常好，11分(奶油味、微酸咸、质硬)。
1A.)407槽添加IMP及次黄嘌呤核苷的F-DVS CHN-19，热烫温度为38℃
·眼孔形状好，11分。
·香味好、纯净，11分。
·味道为Gouda，非常好，11分(奶油味、微酸咸、质硬)。
·与现有的发酵剂无差异并检测到试验发酵剂。
第二组批
2A.)对照槽404F-DVS CHN-19，热烫温度40℃
·眼孔形状不太理想，眼孔太小，9分。
·香味好、纯净，11分。
·味道为Gouda，非常好，11分(奶油味、稍咸但很好)，11分。
2B.)405槽添加IMP及次黄嘌呤核苷的F-DVS CHN-19，热烫温度为38℃
·眼孔形状稍优于其它几批，但仍期望较大的洞孔，11分。
·香味好、纯净，11分。
·味道为Gouda，稍咸但非常好，11分。
·与现有的发酵剂无差异并检测到试验发酵剂。
实施例17：于F-DVS R-604添加IMP及次黄嘌呤核苷用于Cheddar干酪生产的试验于150kg干酪槽生产Cheddar干酪的标准说明
Cheddar是生产最为广泛的干酪，最初仅于英国制造，但现在遍布全世界，主要于澳大利亚、加拿大、爱尔兰、纽西兰及美国。Cheddar干酪制造基本原则在所有国家仍为相同，变更很少。
其颜色范围为淡黄色至深黄色。某些情况下添加胭脂树红以产生橙色/红色。结构坚固、致密，切割时不碎。大多数Cheddar成熟3-5月时售出且味道很清淡。好的Cheddar干酪咬入口中时具有坚果样风味，9-12之后成熟最佳。
本操作程序描述传统Cheddar制造过程，用于确定添加IMP及次黄嘌呤核苷对发酵剂接种物的冷冻保护作用。
3.牛奶
牛奶从Borup Dairy(丹麦)订购，为全脂牛奶，约72℃(162°F)巴氏消毒15秒，然后冷却至约30-32℃。要制造有色Cheddar时于每50001牛奶中添加475-600ml Chr.Hansen’s Annatto A320WS。制备同批次的发酵剂以比较添加IMP及次黄嘌呤核苷对F-DVS R-604的冷冻保护作用。
4.发酵剂
未添加IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保存的F-DVS R-604对照发酵剂(第1批)作为接种物，浓度为750g/5000升发酵剂。添加IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保存的F-DVS R-604试验发酵剂(第2批)作为接种物，浓度为500g/5000升发酵剂。
5.粗制凝乳酶
于每一批添加粗制凝乳酶CHY-MAX Powder Extra，添加量为每100l牛奶2.5-3g。添加粗制凝乳酶之后，30-45分钟内形成凝胶。
6.Cheddar干酪的制造
下列操作程序对于检测的每一批尽可能相近。将凝块切成5×5mm大小的立方体。40-50分钟提高温度至约38-40℃，依据所需的含水量搅拌凝块与乳清30-50分钟。
7.Cheddaring
分离凝块与乳清，使凝块融化，然后将凝块“Cheddared”，将融化的凝块切成小块，每10-15分钟翻转一次，当小块的乳清酸度达pH值5.5-5.6时，磨碎凝块，将大的干酪块切成手指大小的碎块。
8.加盐
于凝块添加约2％的盐，使干酪中最终的盐浓度为1.6-1.8％(含水量为4.5-5％)。
9.包装
成型与压榨在部分真空下以快速机械压榨方式于塔式装置内进行，干酪形成20kg的块状，真空包装于塑料袋内。根据所需风味的强度(即清淡或浓郁)，于7-10℃成熟3-12个月。
结论
对于每批所生产的Cheddar干酪将比较其味道、结构及其它特征以确定以IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保护的接种物对最终的Cheddar干酪制品有无影响。含IMP及次黄嘌呤核苷混合物的接种物生产的干酪其特征实际上与无IMP及次黄嘌呤核苷混合物的接种物生产的干酪相同。本发明另一个优点是：如果浓缩接种物含有IMP及次黄嘌呤核苷混合物则其使用量可以减少。
实施例18：于F-DVS ST-M3添加IMP及次黄嘌呤核苷用于Cottage干酪生产的试验于150kg干酪槽生产Cottage干酪的标准说明
Cottage干酪在注重体重的英国及美国是非常受欢迎的低脂软干酪。纯Cottage干酪非常清淡，所以通常添加细香葱、洋葱等使制品具有风味。使用了Cottage干酪制造的两种方法：短设定方法和长设定方法，提供了两种方法的内容。短设定方法马上描述，接着于第五部分描述长设定方法。
1.牛奶
牛奶从Borup Dairy(丹麦)订购，为全脂牛奶，经约72℃(162°F)巴氏消毒15秒，然后冷却至约34℃
2.发酵剂
对于短设定方法，未添加IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保存的F-DVS ST-M3对照发酵剂(第1批)作为接种物，浓度为2500g/5000升发酵剂。添加IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保存的F-DVS ST-M3试验发酵剂(第2批)作为接种物，浓度为2000g/5000升发酵剂。
3.粗制凝乳酶
于每一批添加粗制凝乳酶CHY-MAX Powder Extra，添加量为每5000l牛奶0.2-0.5g。
4.Cottage干酪的制造
下列操作程序对于检测的每一批尽可能相近。培养牛奶4.5-5小时至pH值达到4.65-4.8，将凝块切成约12mm大小相等的立方体，静置10-15分钟，轻轻搅拌凝块，60-75分钟内达到55-58℃开始热烫。当凝块足够坚硬时，排出乳清。凝块如下清洗及排放三次：
首先，以13-15℃水清洗以降低凝块温度至29-32℃。其次，以13-15℃水清洗以降低凝块温度至18℃。最后，以2-5℃水清洗以降低凝块温度至2-5℃。最终排放之后，以甜味或发酵调味品调和凝块，调味品以各种奶油、牛奶及脱脂奶粉制品制造。
5.长设定方法
除发酵剂接种浓度，培养温度及培养时间外，程序与短设定方法相似。对于长设定方法，未添加IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保存的F-DVS ST-M3对照发酵剂(第1批)作为接种物，浓度为500g/5000升发酵剂。添加IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保存的F-DVS ST-M3试验发酵剂(第2批)作为接种物，浓度为300g/5000升发酵剂。较低的接种浓度及20-22℃培养温度将导致达到预期终点pH值所需培养时间较长(正常情况下需要14-18小时)。
结论
对于每一批所生产的Cottage干酪将比较其味道、结构及其它特征以确定以IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保护的接种物对最终的Cottage干酪制品有无影响。含IMP及次黄嘌呤核苷混合物的接种物生产的干酪其特征实际上与无IMP及次黄嘌呤核苷混合物的接种物生产的干酪相同。本发明另一个优点是：如果浓缩接种物含有IMP及次黄嘌呤核苷混合物则其使用量可以减少。
实施例19：于F-DVS ST-M3添加IMP及次黄嘌呤核苷用于MozzareHa/Pizza干酪生产的试验
于150kg干酪槽生产MozzareHa/Pizza干酪的标准说明
此类型Mozzarella主要用作Pizza干酪。由于较松软Mozzarella干酪坚硬，所以较容易磨碎。不同类型的Mozzarella干物中水及脂肪含量不同。部分脱脂、低含水量Mozzarella常用作Pizza干酪。在凝块与热水混合及拉伸之前常将其发酵至pH值5.0-5.2。发酵剂的选择对Pizza干酪的特性(即拉伸、褐色、熔化及脱油)影响较大。
1.牛奶
牛奶从Borup Dairy(丹麦)订购，为全脂牛奶，约72℃(162°F)巴氏消毒15秒，然后冷却至约36-38℃。
2.发酵剂
未添加IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保存的F-DVS ST-M3对照发酵剂(第1批)作为接种物，浓度为750g/5000升发酵剂。添加IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保存的F-DVSST-M3试验发酵剂(第2批)作为接种物，浓度为500g/5000升发酵剂。发酵剂于35-38℃培养30-45分钟。
3.粗制凝乳酶
于每一批添加粗制凝乳酶CHY-MAX Powder Extra，添加量为每1001牛奶1-3g。
4.Mozzarella干酪的制造
下列操作程序对于检测的每一批尽可能相近。将凝块切成5-8mm大小的立方体并复原5分钟。然后搅拌下提高温度至约40-43℃15-20分钟，然后使用Cheddar凝块制作方法处理干酪，排出所有乳清，将凝块切成小块，发酵过程中翻动干酪块。于pH值5-5.25磨碎凝块。当达到预期pH值时，将干酪放入拉伸机械中，以75-80℃热水混合。此过程约需10-15分钟，凝块温度至约58-65℃。将拉伸干酪成型并立即以冷水冷却至5-10℃，以中止进一步的酸化。使用10℃或更低温度的饱和盐水浸没干酪。
对于每批所生产的Mozzarella/Pizza干酪将比较其味道、结构及其它特征以确定以IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保护的接种物对最终的Mozzarella/Pizza干酪制品有无影响。含IMP及次黄嘌呤核苷混合物接种物生产的干酪其特征实际上与无IMP及次黄嘌呤核苷混合物的接种物生产的干酪相同。本发明另一个优点是：如果浓缩接种物含有IMP及次黄嘌呤核苷混合物则其使用量可以减少。
实施例20：于F-DVS CH-N 11添加IMP及次黄嘌呤核苷用于Maasdammer干酪生产的试验
于150kg干酪槽生产Maasdammer干酪的标准说明
Maasdammer为一种瑞士干酪，以荷兰的Maas河命名。此干酪具有较大的眼孔形状，由于添加丙酸杆菌味道清淡及呈坚果味。
1.牛奶
牛奶从Borup Dairy(丹麦)订购，为全脂牛奶，约72℃(162°F)巴氏消毒15秒或65-70℃热处理20秒，然后冷却至约30-32℃。
2.发酵剂
未添加IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保存的F-DVS CH-N 11对照发酵剂(第1批)作为接种物，浓度为750g/5000升发酵剂。添加IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保存的F-DVSCH-N 11试验发酵剂(第2批)作为接种物，浓度为500g/5000升发酵剂。发酵剂于32℃培养10-40分钟。
3.粗制凝乳酶
于每一批添加粗制凝乳酶CHY-MAX Powder Extra，添加量为每1001牛奶1-3g。
4.Maasdammer干酪的制造
约30-45分钟形成凝胶。将凝块切成5-7mm大小的立方体，缓慢搅拌15-25分钟，约排出35-45％乳清，轻轻搅拌凝块15分钟。添加约60℃15-20％(起始体积)热水，凝块温度约35-38℃，搅拌30-45分钟。排出大部分乳清，于2-4kg/cm2轻压凝块15-30分钟以排放剩余的乳清，将凝块切成适于模具合适大小的小块，轻压模具20分钟，接着4-6kg/cm2按压1-2小时，将凝块直接堆入pH值为5.6-5.7的冷盐水，干酪的目标盐浓度为1-1.5％。
对于每批所生产的Maasdammer干酪将比较其味道、结构及其它特征以确定以IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保护的接种物对最终的Maasdammer干酪制品有无影响。含IMP及次黄嘌呤核苷混合物的接种物生产的干酪其特征实际上与无IMP及次黄嘌呤核苷混合物的接种物生产的干酪相同。本发明另一个优点是：如果浓缩接种物含有IMP及次黄嘌呤核苷混合物则其使用量可以减少。
实施例21：于F-DVS CHN-12添加IMP及次黄嘌呤核苷用于Brie/Camembert干酪生产的试验
于150kg干酪槽生产Brie/Camembert干酪的标准说明
稳定的Brie/Camembert干酪不同于传统的Brie/Camembert干酪，因为在凝块制造末，其pH值最小值为4.9-5.4，而传统Brie/Camembert干酪pH值最小值为4.6-4.8，干酪心的软化不具有时间依赖性。使用白色模具以使干酪具有其特性、白色外皮及其味道。有两种稳定干酪pH值的主要方法：
1.)稳定-清洗凝块，即去除乳糖，从而减少转化为乳酸的糖量，这有助于达到预期的高pH值，对于稳定的Brie/Camembert干酪，嗜温型发酵剂和嗜热型发酵剂均被使用(正常情况下嗜温型发酵剂为30％，嗜热型发酵剂为70％)。
2.)溶解-当pH值接近预期水平时，如通过加盐或冷却抑制发酵剂，此类型仅使用嗜热型发酵剂制备，因与嗜温型发酵剂相比嗜热型发酵剂对低温更为敏感。
1.牛奶
牛奶从Borup Dairy(丹麦)订购，为全脂牛奶，约72℃(162°F)巴氏消毒15秒，然后冷却至约35-37℃。
2.发酵剂
未添加IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保存的F-DVS CH-N 12对照发酵剂(第1批)作为接种物，浓度为250g/5000升发酵剂。添加IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保存的F-DVSCH-N 12试验发酵剂(第2批)作为接种物，浓度为200g/5000升发酵剂。模具中每1000升引入3-5u的液体PCa 1、PCa 3或PCa FD，及0.5-1u的GEO CD1。
3.粗制凝乳酶
于每一批添加粗制凝乳酶CHY-MAX Powder Extra，添加量为每1001牛奶2.5-3g。
4.Brie/Camembert干酪的制造
约30-45分钟形成凝胶。将凝块切成10mm大小的立方体，排出40％的乳清，于40-45℃添加相同体积的水，静置凝块30-50分钟，偶尔轻轻搅拌。从槽中舀取凝块放入模具内，1小时后第一次翻转，3小时后第二次翻转，8小时后第三次翻转，从模具移除凝块，浸没于18％盐水中。以每100公斤干酪1-2u的PCa 1、PCa 3或PCa FD喷洒干酪。于14-15℃及85％的相对湿度成熟1天，然后12℃及95％的相对湿度成熟8-10天。当霉菌生长满意，干燥干酪表面，包装，4℃保存。每一干酪以不透油的纸包装，放于卡纸板盒或粗纸板盒中。
对于每批所生产的Brie/Camembert干酪将比较其味道、结构及其它特征以确定以IMP及次黄嘌呤核苷冷冻保护的接种物对最终的Brie/Camembert干酪制品有无影响。含IMP及次黄嘌呤核苷混合物接种物生产的干酪其特征实际上与无IMP及次黄嘌呤核苷混合物的接种物生产的干酪相同。本发明另一个优点是：如果浓缩接种物含有IMP及次黄嘌呤核苷混合物则其使用量可以减少。
实施例22：于DVSTM FD-N添加IMP及次黄嘌呤核苷用于3升级发酵酪乳生产的试验
发酵酪乳
建议配方
预处理
含0.5％脂肪的高品质、标准化匀脂牛奶于槽中通过90℃巴氏消毒20分钟进行预处理。
3％ w/w IMP及2％次黄嘌呤核苷作为稳定剂添加至DVS FD-N浓缩培养物中，然后冷冻混合物。冷冻制品名称现为F-DVSTM FD-N。
F-DVSTM FD-N培养物不添加IMP及次黄嘌呤核苷进行冷冻作为对照。所有F-DVSTM培养物使用前于-50℃保存2个月。
含IMP及次黄嘌呤核苷的DVS FD-N浓缩培养物用于接种牛奶，浓度为0.005％，25℃培养牛奶至3升发酵罐内pH值约为4.5。未添加IMP及次黄嘌呤核苷冷冻的DVSTMFD-N的对照培养物以0.01％用于接种牛奶，25℃培养牛奶至3升发酵罐内pH值约为4.5。
试验号 培养物 接种量 发酵时间 至pH值
1 添加IMP及次黄嘌呤 0.005％ 15 4.51
核苷的FD-N
2 未添加IMP及次黄嘌 0.01％ 15 4.51
呤核苷的FD-N
后处理
当pH值达4.51，先于槽中用手工搅拌器搅拌制品，然后Ystral混和器55伏搅拌1分钟。搅拌之后，将槽置于冷水浴中并以手工搅拌器定时搅拌下冷却至18℃，然后将制品倒入瓶中，8℃保存。
结果：
于第1天及第8天测定发酵酪乳的合适风味
第1天：
添加IMP及次黄嘌呤核苷的FD-N：新鲜、低CO2、香味好
未添加IMP及次黄嘌呤核苷的FD-N：新鲜、低CO2、香味好
第8天：
添加IMP及次黄嘌呤核苷的FD-N：新鲜、低CO2、香味好
未添加IMP及次黄嘌呤核苷的FD-N：高口感、新鲜、低CO2、香味好
对于添加IMP及次黄嘌呤核苷0.005％ F-DVS FD-N接种物，使用同样的发酵时间和pH值以与未添加IMP及次黄嘌呤核苷的0.01％ F-DVS对比。添加IMP及次黄嘌呤核苷不会产生发酵酪乳的粘性或香味/风味的改变。
结果显示如果接种物添加有IMP及次黄嘌呤核苷混合物，与未添加IMP及次黄嘌呤核苷的接种物相比，其量可以减半。无论使用实验接种物还是对照接种物，所生产的干酪味道及结构方面的特征相似。
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Claims (30)
1.含有选自包括一种或多种核苷酸生物合成有关化合物或一种或多种任何此类化合物衍生物的组群的一种或多种冷冻保护剂的冷冻或冷冻干燥培养物。
2.根据权利要求1的培养物，其中所述的一种或多种冷冻保护剂选自包括嘌呤碱基、嘧啶碱基、核苷及核苷酸的组群。
3.根据权利要求1的培养物，其中所述的一种或多种冷冻保护剂为核苷或其衍生物。
4.根据权利要求3的培养物，其中所述的核苷为选自包括IMP、GMP及AMP的组群的核苷一磷酸。
5.根据权利要求3的培养物，其中所述的冷冻保护剂为IMP。
6.根据权利要求1、2或5的培养物，其中所述的一种或多种冷冻保护剂为除冷冻保护活性外还具有增强效应的一种介质或介质混合物。
7.根据权利要求1、2或5的培养物，其中所述的培养物含有约0.1％-20％(以冷冻物的％w/w表示)的冷冻保护剂或其混合物。
8.根据权利要求7的培养物，其中所述的培养物含有约2％-5％(以冷冻物的％w/w表示)的冷冻保护剂或其混合物。
9.根据权利要求1、2或5的培养物，其中所述的培养物由包括双岐杆菌、短杆菌、丙酸杆菌、乳球菌、乳杆菌、链球菌、肠球菌、片球菌、明串珠菌、酒球菌(Oenococcusspp.)或真菌的组群的一种或多种微生物组成。
10.根据权利要求9的培养物，其中所述的培养物由一种或多种最适生长温度约30℃的嗜热菌组成。
11.根据权利要求10的培养物，其中所述的培养物由包括乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、肠膜样明串珠菌乳脂亚种、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳亚种二乙酰乳酸(diacetylactis)变型、干酪乳杆菌干酪亚种及副酪乳杆菌副酪亚种的组群的一种或多种微生物组成。
12.根据权利要求1、2或5的培养物，其中所述的培养物由最适生长温度约35℃-45℃的嗜热菌组成。
13.根据权利要求12的培养物，其中所述的培养物由选自包括嗜热链球菌、屎肠球菌、德氏乳杆菌乳亚种、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种及嗜酸乳杆菌的组群的一种或多种嗜热菌组成。
14.一种制备冷冻培养物的方法，包括如下步骤：
i.于包括双岐杆菌、短杆菌、丙酸杆菌、乳球、乳杆菌、链球菌、肠球菌、片球菌、明串珠菌、酒球菌(Oenococcus spp)或真菌的一种或多种活菌中添加冷冻保护剂，
ii.或真菌的一种或多种活菌中添加冷冻保护剂，
iii.冷冻含冷冻保护剂及一种或多种活菌的混合物以获得冷冻物，及
iv.包装冷冻物。
15.一种制备冷冻干燥培养物的方法，包括如下步骤：
v.于包括双岐杆菌、短杆菌、丙酸杆菌、乳球、乳杆菌、链球菌、肠球菌、片球菌、明串珠菌、酒球菌(Oenococcus spp)或真菌的一种或多种活菌中添加冷冻保护剂，
i.或真菌的一种或多种活菌中添加冷冻保护剂，
ii.冷冻含冷冻保护剂及一种或多种活菌的混合物以获得冷冻物，
iii.从冷冻物中升华水以冷冻干燥材料，及
iv.包装冷冻干燥物。
16.根据权利要求9的方法，其中所述的微生物为乳酸乳球菌，包括一种或多种乳酸乳球菌乳亚种及乳酸乳球菌乳脂亚种。
17.根据权利要求9的方法，其中所述的微生物为乳杆菌，包括嗜酸乳杆菌。
18.根据权利要求9的方法，其中所述的微生物为真菌，包括包括一种或多种青霉菌、隐球菌、德巴利酵母菌(Debraryomyces spp.)、柯里夫酵母菌(Klyveromyces spp.)及酵母菌。
19.根据权利要求14的方法，其中所述的微生物为乳酸乳球菌，包括一种或多种乳酸乳球菌乳亚种及乳酸乳球菌乳脂亚种。
20.根据权利要求14的方法，其中所述的微生物为乳杆菌，包括嗜酸乳杆菌。
21.根据权利要求14的方法，其中所述的微生物为真菌，包括一种或多种青霉菌、隐球菌、德巴利酵母菌(Debraryomyces spp.)、柯里夫酵母菌(Klyveromyces spp.)及酵母菌。
22.根据权利要求15的方法，其中所述的微生物为乳酸乳球菌，包括一种或多种乳酸乳球菌乳亚种及乳酸乳球菌乳脂亚种。
23.根据权利要求15的方法，其中所述的微生物为乳杆菌，包括嗜酸乳杆菌。
24.根据权利要求15的方法，其中所述的微生物为真菌，包括一种或多种青霉菌、隐球菌、德巴利酵母菌(Debraryomyces spp.)、柯里夫酵母菌(Klyveromyces spp.)及酵母菌。
25.一种生产发酵食品的方法，包括以权利要求1的培养物发酵前身物质并获得发酵食品。
26.根据权利要求25的方法，其中所述的发酵食品由乳类前身物质生产。
27.根据权利要求26的方法，其中所述的发酵食品为酪乳。
28.根据权利要求26的方法，其中所述的发酵食品为选自Cheddar、Gouda、Cottage、Emmental、Grana、Mozzarella/Pizza、Maasdammer及硬Brie或硬Camembert的干酪。
29.根据权利要求2的培养物，其中所述的一种或多种核苷酸冷冻保护剂为次黄嘌呤核苷或其衍生物。
30.根据权利要求2的培养物，其中所述的一种或多种冷冻保护剂为核苷酸。
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