CN1685058A - 制备具有抗高血压特性的肽的方法 - Google Patents
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Abstract
使用包含有约200kDa的细胞壁蛋白酶的乳酸菌制备具有抗高血压特性的肽以及得到此乳酸菌的方法。
Description
技术领域
本发明是有关使用一种包含有约200kDa的细胞壁蛋白酶的乳酸菌,制备具有抗高血压特性的肽以及得到此乳酸菌的方法。
背景技术
已经有报告指出在工业化国家中高血压(high blood pressure)是对于心脏病发作非常重要的一个危险因素,高血压通常是使用强效抑制血管紧张素转变酶(ACE)的药物予以治疗。早期预防高血压发展成为疾病,可以选择药物加以治疗,现在大量由食物取得的生物活性化合物也被考虑使用,用以促进一般人的健康状况。
血压的调节中,血管紧张素I-转变酶(ACE)扮演一重要角色,ACE的作用可以提升血压。在肾激素-血管紧张素系统,ACE将血管紧张素-I转换为血管紧张素-II,在激肽释放酶-激肽(Kallikrein-kinin)系统中,ACE不活化缓激肽(bradykinin),有助于血管舒张作用,因此ACE抑制剂可用于降低血管压力,现在已有多种ACE抑制剂存在。第一个所报告的ACE抑制剂是在蛇毒中发现的天然肽,自此以后,有许多其它的ACE抑制剂也陆续被发现。
已知经由乳酸菌(LAB)发酵的牛奶可以产生抗高血压作用,这是由于乳酸菌的水解作用使得牛奶中的酪蛋白释放出肽,此肽作用如同ACE抑制剂。
Calpis Food Industry公司的发表论文[Yamamoto等人(1994,J.DairySci.,77:917-922)]所述,利用纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillushelveticus)CP790品种发酵牛奶,以产生抗高血压作用,是由于乳酸菌的纤维二糖乳酸杆菌蛋白分解作用使得牛奶中的酪蛋白释放出肽,此肽作用如同ACE抑制剂。这种肽的抗高血压作用已经测试于自发性高血压大鼠。利用没有蛋白分解活性的纤维二糖乳酸杆菌等基因的突变体发酵的牛奶,不能显示出任何抗高血压作用。
论文[Gobbetti M.等人(2000,Appl Environ Microbiol,66(9),3898-3904.)]所述,是使用Lactococcus lactis亚种cremoris FT4或是使用Lactobacillus delbrueckii亚种bulgaricus SS1来发酵牛奶,以产生包含有ACE抑制肽的牛奶。
在专利案EP821968(Calpis Food Industry)中所述,是使用寄存编号为FERM BP-4835的纤维二糖乳酸杆菌品种发酵产生包含有ACE抑制肽的发酵牛奶。
于EP1016709(Calpis Food Industry)中所述,是使用寄存编号为FERMBP-6060的纤维二糖乳酸杆菌品种发酵产生包含有ACE抑制肽的发酵牛奶。
于WO01/32836(Valio Ltd)中所述,经由使用寄存编号为DSM13137的纤维二糖乳酸杆菌品种发酵产生包含有ACE抑制肽的发酵牛奶。
因为乳酸菌(LAB)是多种氨基酸营养缺陷型菌株,LAB依赖于复杂的蛋白质水解体系,以便从牛奶中的酪蛋白获得必要的氨基酸。使用LAB将酪蛋白水解成氨基酸是开始于藉由细胞壁蛋白酶水解酪蛋白成为寡肽,然后藉由寡肽传输系统将寡肽传输至菌胞内,一但寡肽进入到细胞内,细胞内的肽酶会将其水解成为自由氨基酸。
威斯康新大学(University of Wisconsin)与犹它州立大学(Utah StateUniversity)的论文[Pederson等(1999,J.of Bacteriology,181:4592-4597)]中描述了来自纤维二糖乳酸杆菌CNRZ32品种的prtH 204kDa细胞壁蛋白酶的DNA和氨基酸序列,但此论文没有叙述也不建议使用这一品种来制造具有抗高血压特性的肽。
Calpis Food Industry公司的论文[Yamamoto等(2000),Biosci.Biotechnol.Biochem.,64(6):1217-1222]中描述了来自纤维二糖乳酸杆菌CP790品种的prtY 45kDa细胞壁蛋白酶的DNA和氨基酸序列,CP790品种不包括prtH 204kDa细胞壁蛋白酶[参照Yamamoto等(2000)的“讨论”部分]。CP790品种是被使用于Calpis Food Industry的商业产品如“材料和方法”部分所记载,“CP790,是从Calpis培养菌原分离出来的,是日本发酵牛奶产品”。
发明概述
本发明所要解决的问题是提供一种方法,以获得具有增进特性的乳酸菌(LAB),特别是有关制造具有抗高血压特性的肽。
本发明的解决方案是基于本发明人已确定包含特定性质细胞壁蛋白酶的乳酸菌具有这样的特性。在此所指的细胞壁蛋白酶称为prtH200。本文实施例5中是说明具有prtH200细胞壁蛋白酶的乳酸菌于体内的情形,在此所述是其具有制造增进抗高血压特性的肽的功能。
在此所述的prtH200蛋白酶与威斯康新大学与犹它州立大学的论文[Pederson等(1999)](如上)所述的来自纤维二糖乳酸杆菌CNRZ32品种的一prtH 204kDa细胞壁蛋白酶相符合,但在此论文中没有叙述也无建议使用CNRZ32品种来制造具有抗高血压性能的肽。
依据本发明人的了解,没有任何参考文件明白叙述包含有细胞壁蛋白酶的乳酸菌,该细胞壁蛋白酶对应于本发明例所述的prtH200蛋白酶。
实施例3是实验性说明使用寄存编号DSM 13137的纤维二糖乳酸杆菌品种如WO01/32836(Valio Ltd)所述,不包含prtH200细胞壁蛋白酶基因序列,其是由在此所述的特殊prtH200的PCR引物来识别,如Calpis FoodIndustry公司的论文[Yamamoto等(2000)]所叙述(如上),在最新的日本发酵牛奶产品Calpis Food Industry包含一不具有prtH200细胞壁蛋白酶的品种(CP790)。
存在于乳酸菌中的基因序列编码成prtH200蛋白酶已被使用适当设计的聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)引物(primer)的PCR扩增方法证实。当熟悉本领域的技术人员具有适当设计的PCR引物,对他而言,使用其一般知识来选择一特定适当的PCR扩增法去验证此基因序列是否存在于乳酸菌中是相当容易的。
所以,熟悉本领域的技术人员可以筛选(screen)出乳酸菌的数量,验明包含有prtH200基因序列的乳酸菌,并因此得到具有改良工业相关特性的特选乳酸菌。
因此,本发明的第一个方面是有关一种获取乳酸菌的方法,包含:
(i)研究任一种乳酸菌,此乳酸菌是包含有一基因序列编码成一细胞壁蛋白酶(称为prtH200),其中此基因序列是使用PCR引物组的乳酸菌的基因组DNA的PGR扩增方法来进行识别鉴定,所述PCR引物选自下列组成的群组[有义序列(sense sequence)称为S;反义序列(antisense sequence)称为A]:
PrtH200:(a):(S):5’CGATGATAATCCTAGCGAGC 3’,
(A):5’TGGCAGAACCTGTGCCTA 3’;
(b):(S):5’GCCAAGACGCCTCTGGTA 3’,
(A):5’TAGGTATAGTTTCCATCAGGA 3’;和
(c):(S):5’AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA 3’,
(A):5’GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK 3’;以及
(ii)假如该乳酸菌符合步骤(i)标准,则可获得该乳酸菌;或
(iii)假如该乳酸菌不符合步骤(i)标准,则重复步骤(i)研究其它乳酸菌,
本实施例中的乳酸菌为纤维二糖乳酸杆菌CNRZ32品种。
被称为“纤维二糖乳酸杆菌CNRZ32品种”的品种描述于威斯康新大学与犹它州立大学的论文[Pederson等(1999)](如上)。
纤维二糖乳酸杆菌DSM 14998的prtH200的DNA及氨基酸序列如SEQ ID NO1及SEQ ID NO 2所示。
基于prtH200序列及其同源基因的适当PCR引物,可以为常规验证,以验证位于SEQ ID NO 1的prtH200基因及其同源基因,如下所述。
因此,本发明的第二个方面是有关一种获得乳酸菌的方法,包含:
(i)研究任一种乳酸菌,此乳酸菌包含一基因序列编码成一细胞壁蛋白酶(称为prtH200),其中此基因序列定义为:prtH200的基因序列为一去氧核糖核酸(DNA)序列编码成一酶释出细胞壁蛋白酶活性,此DNA序列选自由下列组成的群组:
(a)SEQ ID NO 1的1-5550的位置所示的DNA序列;
(b)一DNA序列,包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment),其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有50%的同一性;
(c)一DNA序列,可编码一多肽,包含至少200氨基酸(aa)的片段,其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的多肽序列的对应片段至少有30%的同一性;
(d)一DNA序列,与包含SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize);以及
(e)一DNA序列,其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段;以及
(ii)假如该乳酸菌符合步骤(i)标准,则可获得该乳酸菌;或
(iii)假如该乳酸菌不符合步骤(i)标准,则重复步骤(i)研究其它乳酸菌,
本实施例中的乳酸菌为纤维二糖乳酸杆菌CNRZ32品种。
如上所述,包含有prtH200蛋白酶的乳酸菌的一优点为,可以增加有关制造具有抗高血压特性的肽的特性。
因此,本发明的第三个方面是有关制备具有抗高血压特性的肽的方法,此方法包含发酵食材,其包含动物性牛奶蛋白或植物性蛋白,经由乳酸菌作用使得发酵食材获得具有抗高血压特性的肽,其特征在于该乳酸菌是包含有一基因序列编码成一细胞壁蛋白酶(称为prtH200),且此基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因组DNA的PCR扩增方法来进行识别鉴定,此PCR引物选自[有义序列(sense sequence)称为S;反义序列(antisense sequence)称为A]由下列组成的群组:
PrtH200:(a):(S):5’CGATGATAATCCTAGCGAGC3’,
(A):5’TGGCAGAACCTGTGCCTA 3’;
(b):(S):5’GCCAAGACGCCTCTGGTA 3’,
(A):5’TAGGTATAGTTTCCATCAGGA 3’;和
(c):(S):5’AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA 3’,
(A):5’GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK 3’。
第四个方面,本发明是有关一种制备具有抗高血压特性的肽的方法,此方法是利用乳酸菌发酵一食材,其包含动物性牛奶蛋白或植物性蛋白,以得到一发酵食材,其包含具有抗高血压特性的肽,其特征在于此乳酸菌包含有一基因序列编码成一细胞壁蛋白酶(称为prtH200),其中此基因序列是定义为prtH200的基因序列为一去氧核糖核酸(DNA)序列编码成一酶释出细胞壁蛋白酶活性,此DNA序列选自由下列组成的群组:
(a)SEQ ID NO 1的1-5550的位置所示的DNA序列;
(b)一DNA序列,包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment),其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有50%的同一性;
(c)一DNA序列,可编码一多肽,包含至少200氨基酸(aa)的片段,其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的多肽序列的对应片段至少有30%的同一性;
(d)一DNA序列,与包含SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize);以及
(e)一DNA序列,其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
如上所述,依据本发明人(群)所拥有的知识,没有在任何参考文件有明白叙述如本发明第三、四方面的工艺中使用乳酸菌的作用。然而,可能需要更进一步实验验证乳酸菌,在本发明申请日前所述的应用,已使用在根据第三及第四方面的工艺中,但其并无包含有于此叙述的prtH200基因序列。在这类高血压案例中特定的乳酸菌将无法达到本发明的第三及第四方面的主张目标,换而言之,第三和第四方面将包含一声明,即可视为“例外的可能特定乳酸菌种”。
本发明的第五个方面是有关一种制备肽的工艺,包含:
(i)获得一乳酸菌,其是利用根据本发明第一与第二方面取得乳酸菌的方法取得;以及
(ii)发酵一材料,其包含具有在(i)中获得的乳酸菌的蛋白质,以获得含有肽的发酵材料。
本发明的第五个方面的一个实施方案为制备具有抗高血压特性的肽的工艺,包含:
(i)获得一乳酸菌,其是利用根据本发明第一或/及第二方面取得乳酸菌的方法取得;以及
(ii)发酵一食材,其包含动物性牛奶蛋白或植物性白,此食材具有在(i)中获得的乳酸菌,以获得含有抗高血压特性的肽的发酵食材。
如上放弃讨论的涉及本发明第三与第四方面的步骤,是与第五方面及其具体实施方案间并无重大关系。第五方面包含一对于现有所讨论的prtH200蛋白酶的乳酸菌活性研究的步骤。对于现有的背景而言,这是一新的步骤。
于此所生产的肽,可以用来制造具有抗高血压特性的发酵食品。
因此,本发明的第六个方面是有关一种制备含有具有抗高血压特性的肽的发酵食品的工艺,此工艺包含下列几个步骤:
(i)根据在此描述的制备具有抗高血压特性的肽的方法来制备一发酵食材;
(ii)以适当方式包装此发酵食材,获得一功能性食品。
有关“包装”应该可以被广泛的了解,其是指当一食材被发酵而得到一发酵食材,此发酵食材可以被包装起来以提供给消费者。它可以被包装在一瓶子或一利乐包(tetra pack)内等,最好是在包装上或相对应的销售工具上能够指明此功能性食品具有抗高血压特性。
第六方面的工艺说明了以上所述的工艺的一个优点。使用所述含有prtH200蛋白酶的乳酸菌直接提供作为发酵作用,产生大量有用具有良好的抗高血压特性的肽。因此,就不需要更进一步的从发酵食材中纯化或再浓缩出肽。此发酵食材可以直接包装,并作为功能性食品直接提供到市场。
在本发明所述的第七个方面是有关具有抗高血压特性的肽,其是由在此描述的制备具有高血压特性的肽的工艺来取得。
经由所述的包含有prtH200蛋白酶的乳酸菌发酵所产生的肽,不同于不包含有这种蛋白酶的乳酸菌发酵所产生的肽,这可验证包含有prtH200蛋白酶的乳酸菌发酵所产生的肽具有增加抗高血压效力的功能性。
于本发明所述的第八个方面是有关一种包含具有抗高血压的肽的功能性食品,其是由所述的制造功能性食品的工艺所取得。
于本发明所述的第九个方面是有关一种使用第七方面的具有抗高血压特性的肽,用以制造治疗高血压的药剂。
于本发明所述的第十个方面是有关一种使用第八方面的含有具有抗高血压特性的肽的功能性食品,用以制造治疗高血压的药剂。
定义:
在讨论本发明的具体实施方式之前提供有关本发明主要方面的各特殊术语的定义。
术语“乳酸菌”的定义是指革兰氏阳性菌、无细菌芽胞增殖菌(non-sporingbacteria)的组群,其能使糖发酵而产生出乳酸。
根据惯用的定义,术语“基因”的定义为遗传的基本物理与功能单位。一种基因为在特定染色体的特定位置上的整齐序列的核甘酸(例如DNA或RNA),以编码成一特定功能的产品(例如蛋白质或RNA分子)。
“退化引物的命名(nomenclature of degenerated primers)”是根据现有技术的标准命名法,Y=C或T;R=A或G;M=A或C;K=G或T;S=G或C;W=A或T;H=A或C或T;B=G或T或C;V=G或C或A;D=G或A或T;N=G、A、C或T。
术语“片段”与DNA/氨基酸序列有关,是包含表示一连续的部分序列的片段。例如,在具有600个氨基酸的氨基酸序列的75至300位置。
术语“对应片段(corresponding fragment)”与比较二序列的片段的对应长度有关,优选的,此二片段比较后的长度差异少于50%;换而言之,假如一片段为100bp,另一片段则最好少于150bp。更优选的,此二片段比较后的长度差异小于25%,以及最优选的,此二片段比较后的长度差异小于5%。
本发明的具体实施方式藉由实施例描述如下。
附图说明
图1:纤维二糖乳酸杆菌CHCC5951品种(寄存编号DSM 14998)的脉冲式凝胶电泳(PFGE)分析鉴定。
发明详述
prtH200细胞壁蛋白酶
存在于乳酸菌中的细胞壁蛋白酶的活性已被证实,一合适的策略是以在基因编码成细胞壁蛋白酶的分解中利用一致命突变(lethal mutation)构建一乳酸菌,然后此构建细菌的蛋白质水解活性(以下述适当检测)可与相同的野生型细菌(wild type bacterium)进行比较。实验证明具致命突变的乳酸菌与野生型细菌比较蛋白质水解活性减少,且此基因编码成细胞壁蛋白酶被分解为基因编码成一活性乳酸菌细胞壁蛋白酶。
熟悉本领域的技术人员知道如何利用适当的致命突变来构建一乳酸菌,其制造方式请参考如Pederson等人(1999)及Yamamoto等人(1994)的论文。
在本发明的申请日,国家生物技术信息中心(NCBI)在其网站(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上提供了进行一标准BLAST计算机序列同源性搜寻的可能性。
SEQ ID NO 1及SEQ ID NO 2所示的纤维二糖乳酸杆菌DSM 14998的prtH200的DNA及氨基酸序列已经公布在GeneBank数据库中,登记号为AF133727,且其数据库序列标识(database sequence identification)为gi/5758038/gb/AF133727.1/AF133727。
标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]搜寻是使用SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的prtH200氨基酸序列作为参考序列,其中,搜寻结果如下所示(斜体字代表数据库序列标识,此报告明白确认已发表的序列,且熟悉本领域的技术人员知道如何藉此得到这些序列):
gi/129346/sp/P15293/P2P_LACLC:PII型蛋白酶前驱物(Lactocepin)(细胞壁-结合丝蛋白酶)。
有机体:Lactococcus lactis subsp.cremoris.
同一性:一1600氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有50%的同一性。
gi/149582/gb/AAA25248.1/:蛋白酶。
有机体:Lactobacillus paracasei.
同一性:一1632氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有49%的同一性。
gi/1381114/gb/AAC41529.1/:(L48487)蛋白酶前驱物。
有机体:Lactobacillus delbrueckii.
同一性:一1682氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有32%的同一性。
gi/18568398/gb/AAL76069.1/:(AF468027)细胞膜蛋白酶。
有机体:Lactobacillus pentosus.
同一性:一415氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有63%的同一性。
Gi/9963932/gb/AAG09771.1/AF243528_1:(AF243528)细胞膜蛋白酶。
有机体:Streptococcus thermophilus.
同一性:一781氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有30%的同一性。
gi/482386/pir/A44833:PII型蛋白酶前驱物(EC 3.4.21.96)。
有机体:Lactococcus lactis.
同一性:一264氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有61%的同一性。
这些特定的序列全部代表一DNA序列,其编码成一多肽,释出细胞壁蛋白酶活性,包含至少200氨基酸(amino acids,aa)片段,其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的多肽序列的对应片段至少有30%的同一性。
标准核甘酸-核甘酸BLAST[blastn]搜寻是使用SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的prtH200 DNA序列作为参考序列,其中,搜寻结果如下所示:
gi/149580/gb/M83946.1/LBAMPRO.蛋白酶(prtP)基因。
有机体:Lactobacillus paracasei.
同一性:一102bp片段与SEQ ID NO 1的prtH200 DNA序列的对应片段有84%的同一性。
gi/47197/emb/X14130.1/SLPRT763.质体pLP763 prt基因,细胞壁-结合丝蛋白酶。
有机体:Streptococcus lactis
同一性:一81bp片段与SEQ ID NO 1的prtH200 DNA序列的对应片段有86%的同一性。
gi/472834/gb/M24767.1/STRWGPROT.Wg2蛋白酶基因。
有机体:S.Cremoris
同一性:一81bp片段与SEQ ID NO 1的prtH200 DNA序列的对应片段有86%的同一性。
gi/149476/gb/J04962.1/LACPRASE.PIII型蛋白酶(prtP)及成熟蛋白质。
有机体:Lactococcus lactis.
同一性:一81bp片段与SEQ ID NO 1的prtH200 DNA序列的对应片段有86%的同一性。
gi/18568397/gb/AF468027.1/.细胞膜蛋白酶(prtP)基因。
有机体:Lactobacillus pentosus
同一性:一102bp片段与SEQ ID NO 1的prtH200 DNA序列的对应片段有83%的同一性。
这些特定的序列全部代表一DNA序列,包含至少75个碱基对(bp)片段,其与SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的DNA序列的对应片段至少有50%的同一性。
其它“指纹”基因序列(orfF3,orfF4及orfF1)
在此讨论的prtH200基因序列可以看作乳酸菌(LAB)的“指纹”。
orfF3:
优选的,除了prtH200基因序列之外,乳酸菌还包括一含有称为orfF3开放读码框(open reading frame)的基因,此基因可视为一附加的指纹。
纤维二糖乳酸杆菌DSM 14998的orfF3的DNA及氨基酸序列请参见SEQ IDNO 3及SEQ ID NO 4所示。实施例3的研究显示基于适当的引物来确认orfF3。
因此,在一优选实施例中,在此段描述的乳酸菌包括prtH200基因和一基因序列(称为orfF3)编码成一开放读码框,其中此基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因组PCR扩增方法来进行识别鉴定,此PCR引物选自下列所组成的群组[有义序列(sense sequence)称为S;反义序列(antisense sequence)称为A]:
orfF3:(a):(S):5’CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC 3’,
(A):5’CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG 3’;和
(b):(S):5’ASTCWRRYTTYGATRATGCW 3’,
(A):5’BHKYAMSAWARTTTGGATCR 3’。
上述合适的PCR引物可以基于在此揭露的序列进行识别确认。
因此,在一优选实施例中,在此段描述的乳酸菌包括prtH200基因和一基因序列编码成一开放读码框(称为orfF3),其中定义为orfF3的DNA序列为一去氧核糖核酸(DNA)序列编码成一开放读码框,且此DNA序列选自由下列组成的群组:
(a)SEQ ID NO 3的1-2679的位置所示的DNA序列;
(b)一DNA序列,包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment),其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有40%的同一性;
(c)一DNA序列,编码一多肽,包含至少200氨基酸(aa)的片段,其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示的多肽序列的对应片段至少有30%的同一性;
(d)一DNA序列,与包含SEQ ID NO 3的1-2679位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize);以及
(e)一DNA序列,其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
术语“开放读码框(open reading frame)”表示为一DNA的延伸,其包含将足够长的氨基酸编码成一蛋白质的转译过程的开始讯号以及转译的终止讯号,并因此而验证一蛋白质编码基因的存在。
在本发明的申请日,一标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]搜寻是使用SEQID NO 4的1-893位置所示的演绎orfF3氨基酸序列作为参考序列,且其相对限制的最终结果与已发表的同源序列有关。
然而,无须受限于理论,在此描述的orfF3基因编码成一细胞壁蛋白酶为可信的,因此,在一优选实施例中描述的orfF3基因可编码成一细胞壁蛋白酶。
orfF4:
优选的,除了prtH200基因序列之外,所述乳酸菌还包括一含有开放读码框的基因,在此称为orfF4。
纤维二糖乳酸杆菌DSM 14998的orfF4的DNA及氨基酸序列请参见SEQ IDNO 5及SEQ ID NO 6所示。实施例3显示了基于适当的引物来确认orfF4。
因此,在一优选实施例中,所描述的乳酸菌包括此prtH200基因和一基因序列(称为orfF4)编码成一开放读码框,其中此基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因组PCR扩增方法来进行识别鉴定,此PCR引物选自由下列组成的群组[有义序列(sense sequence)称为S;反义序列(antisense sequence)称为A]:
orfF4:(a):(S):5’GGTGTTGCTCCTGAAGC 3’
(A):5’ACTCTAGCACCAGCTAATTGAACATCATG 3’。
上述合适的PCR引物可以基于在此揭露的序列进行识别确认。
因此,在一优选实施例中,在此描述的乳酸菌包括prtH200基因和一基因序列编码成一开放读码框(称为orfF4),其中定义为orfF4的基因序列是DNA序列编码成一开放读码框,且此DNA序列选自由下列组成的群组:
(a)SEQ ID NO 5的1-4881的位置所示的DNA序列;
(b)一DNA序列,包含一至少75碱基对(bp)的片段,其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有40%的同一性;
(c)一DNA序列,编码一多肽,包含至少200氨基酸(aa)的片段,其与SEQ ID NO 6所示的1-1627位置的多肽序列的对应片段至少有30%的同一性;
(d)一DNA序列,与包含SEQ ID NO 5的1-4881位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交;以及
(e)一DNA序列,其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
在本发明的申请日,一标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]搜寻是使用SEQID NO 6的1-1627位置所示的演绎orfF4氨基酸序列作为参考序列,且其相对限制的最终结果与已发表的同源序列有关。
然而,无须受限于理论,在此描述的orfF4基因编码成一细胞壁蛋白酶是可信的,因此,在一优选实施例中描述的orfF4基因可编码成一细胞壁蛋白酶。
优选的,在此描述的乳酸菌包括所叙述的prtH200基因、orfF3基因以及orfF4基因。
orfF1:
优选的,除了prtH200基因序列之外,所述乳酸菌还包括一含有开放读码框的基因,在此称为orfF1。
纤维二糖乳酸杆菌DSM 14998的orfF1的DNA及氨基酸序列请参见SEQ IDNO 19及SEQ ID NO 20所示。
因此,在一优选实施例中,在此描述的乳酸菌是包括此prtH200基因和一基因序列编码成一开放读码框(称为orfF1),其中所述定义为orfF1的基因序列是DNA序列编码成一开放读码框,且此DNA序列选自由下列组成的群组:
(a)SEQ ID NO 19的1-5358的位置所示的DNA序列;
(b)一DNA序列,包含一至少75碱基对(bp)的片段,其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有40%的同一性;
(c)一DNA序列,其编码成一多肽,包含至少200氨基酸(aa)的片段,其与SFQ ID NO 20的1-1785位置所示的多肽序列的对应片段至少有30%的同一性;
(d)一DNA序列,与包含SEQ ID NO 19的1-5358位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交;以及
(e)一DNA序列,其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
在本发明的申请日,一标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]搜寻是使用SEQID NO 20的1-1785位置所示的演绎orfF1氨基酸序列作为参考序列,且其相对限制的最终结果与已发表的同源序列有关。
然而,无须受限于理论,在此描述的orfF1基因编码成一细胞壁蛋白酶是可信的,因此,在一优选实施例中描述的orfF1基因可编码成一细胞壁蛋白酶。
优选的,在此描述的乳酸菌包括所叙述的prtH200基因、orfF3基因、orfF4基因以及orfF1基因。
脉冲式凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分析鉴定
另一个揭示所述LAB特征的适当方法是利用所谓的脉冲式凝胶电泳(PFGE)分析鉴定技术。
PFGE分析鉴定是一现有的标准技术,在此所偏好的模式是关于从关注的细菌中分离出独立染色体DNA,使用限制酶SmaI做完全消化和使用适当的MW标志在琼脂(agarose gel)上跑。于此所述的实施例7更详细叙述PFGE方案。
借助分析琼脂,可以定义所关注的LAB的特定DNA频带。如图1显示出于此所述优选的纤维二糖乳酸杆菌CHCC5951(寄存编号为DSM 14998)。图1和实施例7显示了CHCC5951的PFGE分析鉴定定义至少12个染色体的频带,这些频带是:
频带编号1:283kbp
频带编号2:259kbp
频带编号3:219kbp
频带编号4:138kbp
频带编号5:127kbp
频带编号6:119kbp
频带编号7:106kbp
频带编号8:88kbp
频带编号9:71kbp
频带编号10:59kbp
频带编号11:54kbp
频带编号12:46kbp
一些已经获得相同的PFGE分析鉴定的菌种,包含于上述背景技术章节中所描述的Calpis Food Industry和Valio Ltd的菌种。
测试菌种中没有一个包含有与283kbp的频带编号1和219kbp的频带编号3二频带相同的结合;而且,测试菌种中没有一个包含有与46kbp的频带编号12相同者。
这些频带编码信息是用来负责改进所述乳酸菌的特性。
因此,在一优选实施例中所述的乳酸菌包含有prtH200基因以及,登记号码为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌的PFGE分析鉴定为结合二种PFGE分析鉴定频带对应至283kbp频带和219kbp频带者,其中PFGE分析鉴定是藉由包含分离出的乳酸菌的独立染色体DNA的方案,并使用限制酶SmaI做完全消化染色体DNA和在琼脂上对消化过的DNA跑电泳。
所称的“PFGE分析鉴定频带相对应至登记号码为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌的特殊大小的PFGE分析鉴定频带”应该理解为DSM 14998纤维二糖乳酸杆菌有可能视为参考品种,优选的,有兴趣的LAB必须制造相同PFGE鉴定分析(使用相同协议)与DSM 14998纤维二糖乳酸杆菌。有兴趣的LAB的消化DNA和DSM 14998纤维二糖乳酸杆菌据此都可以使用适当的MW标志在琼脂上跑电泳。藉由分析电泳琼脂,熟悉本领域的技术人员可以藉由基本法则判断有兴趣的LAB的频带对应于特定大小频带的DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌,如熟悉本领域的技术人员所熟知的,其大小上可能会有一些微细变异,在现有的内容,如此的微细变异最好在±5kbp之内,因此,如果DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌的参考频带是例如283kbp,则相关的有兴趣的LAB的分析频带大小最好是283kbp±5kb。
在另一优选实施例中,于此所述的乳酸菌,包含有prtH200基因以及,登记号码为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌的PFGE分析鉴定频带对应于PFGE分析鉴定46kbp频带者,其中PFGE分析鉴定是藉由包含分离出的乳酸菌的独立染色体DNA的方案,并使用限制酶SmaI做完全消化染色体DNA和在琼脂上对消化过的DNA跑电泳。
更优选的使用相同方法分析乳酸菌,于此所述包含下列所有PFGE分析鉴定频带:
频带对应于DSM 14998纤维二糖乳酸杆菌的283kbp频带;
频带对应于DSM 14998纤维二糖乳酸杆菌的219kbp频带;以及
频带对应于DSM 14998纤维二糖乳酸杆菌的46kbp频带。
最优选的,在此所述的乳酸菌包含对应至上面所述所有的纤维二糖乳酸杆菌DSM 14998的十二种PFGE分析鉴定频带。
聚合酶链反应(PCR)扩增
如上所述,在此描述的基因序列的存在最好利用此使用PCR引物的PCR扩增来证实,且此PCR引物的设计是根据在此所教导的。当熟悉本领域的技术人员具有适当设计的PCR引物时,对他而言,使用一般知识来选择一特定适当的PCR扩增方案去验证这些基因是否存在于乳酸菌中是相当容易的。
优选的,此PCR扩增方案(反应)是根据实施例1所描述的内容来制定。
一旦进行PCR扩增,研究产生的PCR扩展序列是否相当于在此段描述的基本片段,对熟悉本领域的技术人员而言,为其研究惯常的程序。由于熟悉本领域的技术人员一般概略地知道一阳性PCR片段会有多大的长度,所以通常可基于PCR片段的长度来进行验明,且阳性PCR片段与在此段描述的基因PCR片段有关。选择性地,PCR片段可以为DNA片段,然后产生的DNA序列可与在此揭露的序列相比较;再者,相当于此PCR片段的具有基因致命变种的乳酸菌可被制造,然后此制造细菌的蛋白质水解活性(参下面)可以与相对的野生细菌进行比较,且在此二细菌间的蛋白质水解活性的测量变化可被实验确认,而不管相当于扩展PCR片段的基因是否为一基因编码成一乳酸细胞壁蛋白酶,如此段所描述。
总之,不管一特定乳酸菌是否包含能给予相对阳性PCR片段的基因,熟悉本领域的技术人员可使用在此教导所设计的PCR引物来进行验明。
PCR是用来研究此基因是否存在于乳酸菌中最好的方式,然而,也可以以其它进行,例如,利用南方墨点分析法(Southern blot analysis)。
PCR引物
如上述说明,关于PrtH200基因的适当PCR引物为:
PrtH200:(a):(S):5’CGATGATAATCCTAGCGAGC3’,
(A):5’TGGCAGAACCTGTGCCTA 3’;
(b):(S):5’GCCAAGACGCCTCTGGTA 3’,
(A):5’TAGGTATAGTTTCCATCAGGA 3’;和
(c):(S):5’AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA 3’,
(A):5’GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK 3’。
PrtH200:(a):(S)为SEQ ID NO 7所示;PrtH200:(a):(A)为SEQ IDNO 8所示;PrtH200:(b):(S)为SEQ ID NO 9所示;PrtH200:(b):(A)为SEQ ID NO 10所示;PrtH200:(c):(S)为SEQ ID NO 11所示;PrtH200:(c):(A)为SEQ ID NO 12所示。
当使用(a)的引物时,此扩展的PrtH200 PCR片段优选的长度应该介于400bp至800bp之间,更优选的长度则介于500bp至700bp之间。当使用(b)的引物时,此扩展的PrtH200 PCR片段优选的长度应该介于200bp至500bp之间,更优选的长度则介于250bp至375bp之间。当使用(c)的引物时,此扩展的PrtH200 PCR片段优选的长剫该介于400bp至800bp之间,更优选的长度则介于500bp至700bp之间。
最优选的PrtH200相关的PCR引物为编号(a)的引物以及编号(b)的引物。
如上述说明,关于orfF3的适当PCR引物为:
orfF3:(a):(S):5’CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC 3’,
(A):5’CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG 3’;和
(b):(S):5’ASTCWRRYTTYGATRATGCW 3’,
(A):5’BHKYAMSAWARTTTGGATCR 3’。
orfF3:(a):(S)为SEQ ID NO 13所示;orfF3:(a):(A)为SEQ ID NO14所示;orfF3:(b):(S)为SEQ ID NO 15所示;orfF3:(b):(A)为SEQID NO 16所示。
当使用(a)的引物时,此扩展的orfF3 PCR片段优选的长度应该介于1250bp至1900bp之间,更优选的长度则介于1500bp至1725bp之间。当使用(b)的引物时,此扩展的orfF3 PCR片段优选的长度应该介于1250bp至1900bp之间。更优选的长度则介于1500bp至1725bp之间。
最优选的orfF3相关的PCR引物为编号(a)的引物。
如上述说明,关于orfF4的适当PCR引物为:
orfF4:(a):(S):5’GGTGTTGCTCCTGAAGC 3’
(A):5’ACTCTAGCACCAGCTAATTGAACATCATG 3’。
orfF4:(a):(S)为SEQ ID NO 17所示;orfF4:(a):(A)为SEQ ID NO 18所示。
当使用(a)的引物时,此扩展的orfF4 PCR片段优选的长度应该介于700bp至1150bp之间,更优选的长度则介于875bp至1025bp之间。
DNA序列的同源/一致性
参照上述内容,DNA序列的同源/一致性由二序列,第一序列与第二序列,两者间的同一性差异程度所决定。
在本发明的申请日,国家生物技术信息中心(NCBI)将其提供至其网站(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),以供一标准BLAST计算机序列同源性的搜寻。
BLAST程序叙述于[Altschul等(1997),″Gapped BLAST and PSI-BLAST:anew generation of protein database search programs″,Nucleic Acids Res.25:3389-3402]。
在本文中,优选的计算机同源搜寻程序为“标准核甘酸-核甘酸BLAST[blastn]”搜寻,且在本申请案的申请日,在NCBI网站已具有过滤性(filter):低复杂性;预期性(expect):10,及序列长度:11等设定。
此参考序列采用此程序,且此程序一起验明已发表序列与一参考序列的对应片段间的同一性百分比。
使用标准核甘酸-核甘酸BLAST计算机程序,在此描述的prtH200序列通常为含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列,其与SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的prtH200 DNA序列的对应片段至少有60%的同一性;更优选的,含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列与SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的prtH200 DNA序列的对应片段至少有70%的同一性;最优选的,含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列与SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的prtH200 DNA序列的对应片段至少有80%的同一性。
就上述所提供的同一性百分比而言,此片段通常为至少100碱基对(bp),优选的片段为至少200碱基对(bp),更优选的片段为至少400碱基对(bp),最优选的片段则为至少1500碱基对(bp)。
使用标准核甘酸-核甘酸BLAST计算机程序,在此描述的orfF3序列通常为含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列,其与SEQ ID NO 3的1-2679位置所示的orfF3 DNA序列的对应片段至少有60%的同一性;更优选的,含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列与SEQ ID NO 3的1-2679位置所示的orfF3 DNA序列的对应片段至少有70%的同一性;以及,最优选的,含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列与SEQ ID NO 3的1-2679位置所示的orfF3 DNA序列的对应片段至少有80%的同一性。
就上述所提供的同一性百分比而言,此片段通常为至少100碱基对(bp),优选的片段为至少200碱基对(bp),更优选的片段为至少400碱基对(bp),最优选的片段则为至少1500碱基对(bp)。
使用此标准核甘酸-核甘酸BLAST计算机程序,在此描述的orfF4序列通常为含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列,其与SEQ ID NO 5的1-4881位置所示的orfF4 DNA序列的对应片段至少有60%的同一性;更优选的,含有至少75碱基对片段的DNA序列与SEQ ID NO 5的1-4881位置所示的orfF4 DNA序列的对应片段至少有70%的同一性;以及,最优选的,含有至少75碱基对片段的DNA序列与SEQ ID NO 5的1-4881位置所示的orfF4 DNA序列的对应片段至少有80%的同一性。
就上述所提供的同一性百分比而言,此片段通常为至少100碱基对(bp),优选的片段为至少200碱基对(bp),更优选的片段为至少400碱基对(bp),最优选的片段则为至少1500碱基对(bp)。
选择性地,此同源/一致性可适当地利用任何已知的计算机程序工具来决定,例如,在GCG程序软件包中所提供的GAP(Program Manual for theWisconsin Package,Version 8,1994年8月,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970),Journal of Molecular Biology,48,443-453)。
使用GAP来进行DNA序列比对具有下列设定:GAP创造罚分(creationpenalty)为5.0且GAP延伸罚分(extension penalty)为0.3,当使用GAP时,关于BLAST程序所提供的同一性百分比也可为优选的同一性。
氨基酸序列的同源(Homology to amino acid sequences)
相似于核甘酸同源分析,在本文中,一优选的计算机同源搜寻程序为“标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]”搜寻,且在本申请案的申请日,在NCBI网站已具有成分统计:是,过滤性:低复杂性;预期性:10,序列长度:3,矩阵:BLOSUM 62,间隔损失:存在11延伸1等设定。
使用此标准蛋白质-蛋白质BLAST计算机程序,在此描述的prtH200序列是编码成一多肽(polypeptide),释出细胞壁蛋白酶活性,包含有至少200氨基酸(amino acids,aa)片段的DNA序列,其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的prtH200多肽序列的对应片段至少有40%的同一性;优选的,这一编码成多肽,释出细胞壁蛋白酶活性,包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列,其与SEQ ID NO 2的1-1849位置的prtH200多肽序列的对应片段至少有50%的同一性;更优选的,这一编码成多肽,释出细胞壁蛋白酶活性,包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列,其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的prtH200多肽序列的对应片段至少有65%的同一性;最优选的,这一编码成多肽,释出细胞壁蛋白酶活性,包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列,其与SEQ IDNO 2的1-1849位置所示的prtH200多肽序列的对应片段至少有80%的同一性。
就上述所提供的同一性百分比而言,此片段通常为至少300氨基酸(aa),较优选的片段为至少400氨基酸(aa),更优选的片段为至少800氨基酸(aa),最优选的片段则为至少1200氨基酸(aa)。
使用此标准蛋白质-蛋白质BLAST计算机程序,在此描述的orfF3序列编码成一多肽(polypeptide),包含有至少200氨基酸(amino acids,aa)片段的DNA序列,其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示的orfF3多肽序列的对应片段至少有40%的同一性;较优选的,这一编码成多肽,包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列,其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示的orfF3多肽序列的对应片段至少有50%的同一性;更优选的,这一编码成多肽,包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列,其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示的orfF3多肽序列的对应片段至少有65%的同一性;最优选的,这一编码成多肽,包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列,其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示的orfF3多肽序列的对应片段至少有80%的同一性。
就上述所提供的同一性百分比而言,此片段通常为至少300氨基酸(aa),优选的片段为至少400氨基酸(aa),更优选的片段为至少800氨基酸(aa),最优选的片段则为至少1200氨基酸(aa)。
使用此标准蛋白质-蛋白质BLAST计算机程序,在此描述的orfF4序列是编码成一多肽,包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列,其与SEQ ID NO 6的1-1627位置所示的orfF4多肽序列的对应片段至少有40%的同一性;优选的,这一编码成多肽,包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列,其与SEQ IDNO 6的1-1627位置所示的orfF4多肽序列的对应片段至少有50%的同一性;更优选的,这一编码成多肽,包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列,其与SEQ ID NO 6的1-1627位置所示的orfF4多肽序列的对应片段至少有65%的同一性;最优选的,这一编码成多肽,包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列,其与SEQ ID NO 6的1-1627位置所示的orfF4多肽序列的对应片段至少有80%的同一性。
就上述所提供的同一性百分比而言,此片段通常为至少300氨基酸(aa),优选的片段为至少400氨基酸,更优选的片段为至少800氨基酸,最优选的片段则为至少1200氨基酸。
选择性地,此同源性可适当地利用任何已知的计算机程序工具来决定,例如,在GCG程序软件包中所提供的GAP(Program Manual for the WisconsinPackage,Version 8,1994年8月,Genetics Computer Group,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA 53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970),Journal of Molecular Biology,48,443-453。
使用GAP来进行多肽序列比对具有下列设定:GAP创造罚分为3.0且GAP延伸罚分为0.1,当使用GAP时,关于BLAST程序所提供的同一性百分比也可为优选的同一性。
杂交反应(Hybridisation)
此杂交反应根据前文所预期包含一同功DNA序列(analogous DNAsequence),其是杂交至一双股DNA探针。在一核甘酸探针与一同源DNA或RNA序列之间决定杂交反应为低严格性、中严格性或高严格性的适当实验条件包含,将含有欲杂交DNA片段或RNA的滤膜(fliter)预浸(pre-soaking)在5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠,Sambrook等.1989)溶液中10分钟,并将滤膜置于5×SSC、5×Denhard’s溶液(Sambrook等.1989)、0.5%SDS及100mu g/ml改质超声处理的鲑鱼精DNA(Sambroo等.1989)的溶液中进行预杂交(prehybridization),随后在含有10ng/ml随机引物(Feinberg,A.P.andVogelstein,B.(1983)Anal.Biochem.132:6-13)、P-dCTP-标记(特定活性>1×10cpm/mu g)探针的相同溶液中杂交12小时,且其温度为45℃。然后此滤膜在2×SSC、0.5%SDS溶液下清洗二次30分钟,其温度为至少55℃(低严格性),优选的温度为至少60℃(中严格性),仍为优选的温度为至少65℃(中/高严格性),更优选的温度为至少70℃(高严格性),以及最优选的温度为至少75℃(很高严格性)。
利用X光片(X-ray film)侦测在上述条件下的寡核甘酸探针杂交的分子。
包含蛋白质的发酵材料
术语“包含蛋白质的材料”的相关表述如“包含具乳酸菌的蛋白质的发酵材料”,在此表示任何包含有蛋白质的材料皆可以使用乳酸菌使其增长和制造成为含有肽的发酵材料,需了解的是肽的取得必须是藉由乳酸菌细胞壁蛋白酶水解蛋白质而来。
举例而言,包含蛋白质的材料可以是适当的标准乳酸菌发酵介质如M17琼脂或MRS琼脂,此介质优选的是包含动物性牛奶蛋白,牛奶蛋白的构成要素举例而言,如同全脂或脱脂牛奶或牛奶酪蛋白。
食材
本发明的食材包含动物乳汁蛋白质或是植物蛋白质。
优选的,食材包含有所列举的动物乳汁蛋白质,例如全脂或脱脂动物乳汁或乳汁酪白质等的乳汁蛋白质成分。
优选的,食材包含所列举的植物蛋白质,例如谷物、谷物蛋白质、小麦、小麦蛋白质、大豆、脱脂大豆或大豆蛋白质。
乳酸菌
有关“乳酸菌”的命名是指革兰氏阳性菌、无细菌芽胞增殖(non-sporingbacteria)的组群,其能使糖发酵而产生乳酸。
其中,包括乳酸杆菌属乳酸菌(genus Lactobacillus),例如纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillusdelbruekii subsp.bulgaricus)等;乳酸球菌属乳酸菌(genus Lactococcus),例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis);链球菌属乳酸菌(genusStreptococcus),例如嗜热性链球菌唾液亚种(Streptococcus salivariussubsp.thermophilus);明串球菌属乳酸菌(genus Leuconostoc),例如乳酸明串球菌(Leuconostoc lactis);双歧杆菌属乳酸菌(genusBifidobacterium),例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)或短双歧杆菌(Bifidobacterium breve);以及片球菌属乳酸菌(genus Pediococcus)。
乳酸菌可用来作为含有其它微生物体的混合物,例如,酵母(yeasts)。
对于熟悉本领域的技术人员,许多不同的乳酸菌为可公开获得的,请参照德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH,DSMZ),以及国家生物技术信息中心(NCBI)的网际网络分类浏览器(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.)。
为了验证识别一合适的具体乳酸菌,对熟悉本领域的技术人员而言是简单的日常工作,例如,取得足够数量的可公开获得的不同乳酸菌,并识别一或多种具体菌种,其包含在此讨论的基因序列。优选的,是利用在此描述的PCR扩增方案来完成的。
优选地,乳酸菌为一种杆菌门(phylum Firmicutes)的细菌,优选的是杆菌纲(class Bacillus),更好的是乳酸杆菌目(order Lactobacillales),在此目中的乳酸菌为一种乳酸杆菌科(family Lactobacillaceae),优选的为乳酸杆菌属,更好地,它是一种纤维二糖乳酸杆菌种。有关分类法更进一步地详细说明记载于与Bergey细菌分类手册第二版第一册(Bergey’s Manual ofSystematic Bacteriology,Second Edition,Volume 1:The Archea and theDeeply Branching and Phototrophic Bacteria)。
一个特别好的纤维二糖乳酸杆菌种(Lactobacillus helveticusstrain)CHCC5951的样品已经保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,DSMZ),取得的登记号为DSM 14998,保藏日为2002年5月15日。此保藏是根据国际认可的有关微生物保存布达佩斯条约(Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Micro organisms for the Purposes of PatentProcedure)的规定为了专利程序而做的。
所以,有关在此使用的乳酸菌的一优选实施例为登记号DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌。
在此关系中,本发明的一个独立方面是有关一种登记号DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌或其突变种。
使用菌原材料是培养出DSM14998的菌种,熟悉本领域的阅读者可藉由一般的突变发展或再离析技术获得更进一步的突变体或衍生物,并保持适当的能力来制造具抗高血压特性的肽。
另外,一纤维二糖乳酸杆菌种(Lactobacillus helveticus strain)CHCC4080的样品已经保藏在DSMZ(徳国微生物和细胞培养物保藏中心,DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)内,取得的登记号为DSM 14997,保藏日为2002年5月15日。此保藏是根据国际认可的有关微生物保存布达佩斯条约的规定为了专利程序而做的。
乳酸菌的蛋白水解活性(Proteolytic activity of the lactic acid
bacteria)
于此段描述的prtH200、orfF3及orfF4基因序列可视为指纹,其具有高度适合证明在此描述的乳酸菌。无须受限于学理,理论上,尽管在此描述的指纹基因序列无法展现任何有利的特性,一些品种仍然可以存在。
因此,一旦验证在乳酸菌中具有本文描述的指纹基因序列存在时,其是有利于测试乳酸菌的蛋白水解活性。在本文中,一个优选的乳酸菌是具有较佳的蛋白水解活性,详细说明如下。
在本文中,当一乳酸菌具有合成一活性细胞壁蛋白酶的能力时,此乳酸菌被认为具有蛋白水解活性;换而言之,证明蛋白酶可于细菌的细胞部分外的活性能力。再者,此蛋白酶应该具有使其降解(degrade)蛋白质(例如牛奶中的酪蛋白)的专一性能力,以得到具有抗高血压特性的肽。
优选的,一细菌的蛋白水解活性是利用一方案确定,包括下列步骤:
(i)以细菌发酵200毫升的食材一整夜;
(ii)抽取(extract)产生的肽;以及
(iii)测量此些抽取出肽的抗高血压特性,其是利用一基因检测法来测量需要抑制50%血管收缩素转化酶(ACE)活性的肽浓度。
所述ACE抑制活性检测法在此也称之为DL50,较低的DL50值即表示包含在本发酵食材中的肽的抗高血压效果较佳。
在该方案的步骤(i)中,优选的食材为新鲜牛奶;再者,细菌最好以1%v/v整夜的贮存培养菌方式灌注至食材中并维持于一适当的温度,这一适当温度为适合细菌生长的温度,针对特定的细菌,熟悉本领域的技术人员应知道如何确定。对于乳酸杆菌种,其适当温度为37℃,而对乳酸球菌种的适当温度则为30℃。
在实施例2提供了一详细的优选方案,以说明发酵及抽取步骤,并详细说明此DL50的ACE活性检测。
优选的,此乳酸菌具有蛋白质水解活性的能力的获知,这一方案包括下列步骤:
(i)以细菌发酵200毫升的食材一整夜;
(ii)抽取产生的肽;以及
(iii)测量此些抽取出肽的抗高血压特性,其是利用一基因检测法来测量需要抑制50%ACE活性(DL50)的肽浓度。
产生的肽的ACE抑制活性(DL50)为0.25至5.0(毫克/毫升)之间。
优选的,此乳酸菌为具有产生肽的ACE抑制活性(DL50)0.25至4.0(毫克/毫升)间的能力;更优选的,此蛋白质水解乳酸菌为具有产生肽或其它活性成分的ACE抑制活性(DL50)0.25至3.5(毫克/毫升)间的能力。
较低的DL50范围可以0.25毫克/毫升及1.0毫克/毫升代替。
发酵
在本发明的制作过程中,所述食材是藉由乳酸菌在操作条件下进行发酵,其可依据食材的种类及/或乳酸菌的结合而予以变化。优选的,若食材并非为一水性溶液,则需将食材先溶解于一适当的水性溶液中,然后再与乳酸菌相混合,并以发酵方式培养。
乳酸菌的培养可藉由将预培养乳酸菌的菌原(starter)加入食材培养基(medium)来完成,其可先经过高温消毒(heat-sterilized)并冷却至一预设温度进行孵化。此乳酸菌菌原的最佳培养数量为105至107个乳酸菌/每毫升培养基;孵化的温度通常为20至50℃,优选的为30至45℃;孵化时间通常为3至48小时,且优选的为6至24小时。特别的是,此过程最好是在pH值3.5至7范围的培养基中进行孵化,且为了有效率地进行乳酸菌孵化,其pH值最好是在5至6之间。再者,为进行pH-饱和的孵化,其pH值最好维持在4至7的范围内。没有严格的限制,当乳酸菌的数量超过108个/毫升之时,此培养即可终止。
有关一制作过程的优选实施例,此食材的发酵是在每100毫升的食材中生产出0.5至25毫克具有抗高血压特性的肽或其它活性成分的情况下完成,更好的,是在每100毫升的食材中生产出1至5毫克具有抗高血压特性的肽。
自发酵食材取得的抗高血压特性的后续纯化(purification)
呈上所述,在此描述的乳酸菌的使用,是直接提供进行发酵,以便于发酵后得到有用量的具有很好抗高血压特性的肽。
然而,在一些环境下,最好对自发酵食材取得的抗高血压肽进行一后续纯化步骤,例如,当肽被制作成一药片剂,其需要很高浓度的抗高血压肽。
因此,本发明的一实施例是与在此描述的使用有关,即发酵食材需经更进一步处理,以纯化或向上浓缩(up-concentrate)该具有抗高血压特性的肽。
举例而言,具有抗高血压特性的肽的发酵食材进行离心,并可对分离后的上层液(supernatant)以一反相树脂进行纯化处理以获得最后悬浮物,用以增加获得包含具有抗高血压特性的肽。
此离心分离法最好使用,例如,转速在2,000rpm至20,000rpm并持续1至20分钟,此离心分离法也可在一离心机中进行。
此取得的上层液更可进一步利用反相树脂(reverse-phase resin)进行纯化处理,以反相树脂对肽进行吸附及洗脱(elution),及/或利用反相色层分析法(chromatography),使得肽的纯度增加。
有关此反相树脂理论文献的更多的技术说明请参阅EP 821968。
选择性地,此发酵食材更可进行进一步处理,其方式为在发酵食材上进行纳米过滤(nanofiltration),为了从发酵食材中去除乳酸或单价离子可以采用这种做法。
有关此纳米过滤理论文献的更多的技术说明请参阅WO 01/32905。
包含具有抗高血压特性的肽的功能性食品
如上所述,是使用所述的包含prtH200蛋白酶的乳酸菌直接进行发酵,以得到大量有用且具有很好的抗高血压特性的肽。因此,并不一定要从发酵食材中更进一步的纯化或向上浓缩该肽,且发酵食材可以直接包装并如食品般于市场上供应,最好是以冷冻干燥形式存在的功能性食品或食品添加物等。
在实施例6中该说法将获得验证。简言之,实施例6的结果显示,无需任何其它处理,发酵牛奶本身即具有良好的降低血压功效。另外,经冷冻干燥的发酵牛奶可悬浮于中性牛奶中,进而可产生一适当的功能食品,此经冷冻干燥的发酵牛奶可因而被视为一适当的食物添加剂产品。
因此,本发明的实施例是有关一功能性食品的制作过程,其包含具有抗高血压特性的肽,此食品的制作方法包括下列步骤:
(i)根据所述制造具有抗高血压特性的肽的方法准备一发酵食材;
(ia)将此发酵食材进行干燥;以及
(ii)以适当方式包装此发酵食材,以得到一功能性食品。
其中,步骤(ia)最好使用冷冻干燥法。
换而言之,对于最终的功能性食品不需要再做任何处理,其也可以有一特性为包含一重要部分即发酵过程中所存在的乳酸菌,实施例6清楚的表示这样的产品具有良好的功能和在功能性食品中存在有乳酸菌具有实质的优点。
因此,本发明的实施例是有关一种功能性食品的制作过程,该功能性食品包含具有抗高血压特性的肽,制作方法包括下列步骤:
(i)根据所述制造具有抗高血压特性的肽的方法准备一发酵食材;
(ia)保留小部分的乳酸菌于发酵食材的发酵过程中;以及
(ii)以适当方式包装此发酵食材,以得到一食品或食品添加物。
“保留小部分的乳酸菌于发酵食材的发酵过程中”如上所述可以解释为不需要考虑移除乳酸菌。一些细菌可能需要移除。数量上,在发酵食材的发酵过程中可能至少需要保留5%的乳酸菌存在;或是在发酵食材的发酵过程中保留至少20%的乳酸菌存在。
如实施例6所示,保留在功能性食品中的乳酸菌可能为死掉或有活性的,由于热处理的发酵食材也可以有良好的降血压特性,所以更优选的为来自于发酵食材的抗高血压肽可经过适当的纯化作用。
因此,本发明的实施例是有关一功能性食品的制作过程,此食品包含具有抗高血压特性的肽,制作方法包括下列步骤:
(i)根据所述制造具有抗高血压特性的肽的方法准备一发酵食材;
(ia)步骤(i)的发酵食材更进一步的经过如上所描述的方式纯化或向上浓缩具抗高血压特性的肽;
(ib)然后在食材中加入经步骤(ia)纯化或向上浓缩的肽;以及
(iv)以适当方式包装此发酵食材,以得到一功能性食品。
更优选的,步骤(ib)的食材是如所述的制造过程的发酵食材,这相关于哪一种功能性食品需要具有相对较高浓度的具有抗高血压特性的肽的情形。
具有抗高血压特性的肽的使用与优选剂量
利用本发明方法获得具有抗高血压特性的肽,其通常为肽混合物,且可能包含有其它肽。使用于食物或饮料中,可以直接使用包含有肽及/或纯化产品的发酵食材,选择性地,使用前药剂可以藉由冷冻干燥,喷雾干燥或鼓风机干燥而成为粉末形式。
本发明的抗高血压肽的优选有效用量与人的年龄与状态有关,剂量为0.05到10毫克/千克体重/日,优选的则为0.3到3.0毫克/千克体重/日。如果剂量没有低于0.05毫克/千克体重/日,可以预期有足够的效用;如果剂量没有大于10毫克/千克体重/日,此效用可能有效地显现作用。
使用于胆固醇降低疗法
(Teo,K.等,Circulation(2000)102:1748-1754)的论文描述ACE抑制药物(Emalapril)可能具有对降低胆固醇的治疗有正面效用,特别是降低冠状动脉粥样硬化性(coronary atherosclerotic)疾病。
因此,本发明的一独立观点是有关使用含有抗高血压特性的肽,其是由本发明的制程所制造出的药剂或功能性食品,用于胆固醇降低疗法,特别是关于降低冠状动脉粥样硬化性(coronary atherosclerotic)疾病。
发明内容与实施方案所呈现的专利范围
本发明的实施例及观点可以显示于所谓的权利要求格式中,本发明的一些内容与实施例以下述的权利要求形式呈现。
1.一种获得乳酸菌的方法,包括:
(i)研究任一种乳酸菌,此乳酸菌是包含有一基因序列编码成为一细胞壁蛋白酶(称为prtH200),其中该基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因组DNA的PCR扩增方法来进行识别鉴定,该PCR引物选自由下列组成的群组[有义序列(sense sequence)称为S;反义序列(antisense sequence)称为A]:
PrtH200:(a):(S):5’CGATGATAATCCTAGCGAGC3’,
(A):5’TGGCAGAACCTGTGCCTA 3’;
(b):(S):5’GCCAAGACGCCTCTGGTA 3’,
(A):5’TAGGTATAGTTTCCATCAGGA 3’;及
(c):(S):5’AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA 3’,
(A):5’GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK 3’;及
(ii)假如乳酸菌符合步骤(i)的标准,则获得了该乳酸菌;或
(iii)假如乳酸菌不符合步骤(i)标准,则重复步骤(i)研究其它乳酸菌。
2.权利要求1所述的获得乳酸菌的方法,其中在步骤(i)中也包含研究任一乳酸菌包含有基因序列(称为orfF3)编码成一开放读码框,其中该基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因组DNA的PCR扩增方法来进行识别鉴定,且该PCR引物选自由下列组成的群组[有义序列(sense sequence)称为S;反义序列(antisense sequence)称为A]:
orfF3:(a):(S):5’CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC 3’,
(A):5’CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG 3’;及
(b):(S):5’ASTCWRRYTTYGATRATGCW 3’,
(A):5’BHKYAMSAWARTTTGGATCR 3’。
3.一种获得乳酸菌的方法,包括:
(i)研究任一种乳酸菌,该乳酸菌是包含有一基因序列编码成为一细胞壁蛋白酶(称为prtH200),其中该基因序列定义为prtH200为一去氧核糖核酸(DNA)序列编码成一酶释出细胞壁蛋白酶活性,且该DNA序列选自由下列组成的群组:
(a)SEQ ID NO 1的1-5550的位置所示的DNA序列;
(b)一DNA序列,包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment),其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有50%的同一性。
(c)一DNA序列,编码成一多肽,包含至少200氨基酸(aa)的片段,其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的多肽序列的对应片段至少有30%的同一性;
(d)一DNA序列,与包含SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize);以及
(e)一DNA序列,其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段;以及
(ii)假如乳酸菌符合步骤(i)标准,则可获得该乳酸菌;或
(iii)假如乳酸菌不符合步骤(i)标准,则重复步骤(i)于其它乳酸菌中。
4.权利要求3所述的获得乳酸菌的方法,其中在该步骤(i)中也包含研究任一乳酸菌包含有基因序列(称为orfF3)编码成一开放读码框,其中该基因序列定义该orfF3为一去氧核糖核酸(DNA)序列编码成一开放读码框,且该DNA序列选自下列组成的群组:
(a)SEQ ID NO 3的1-2679的位置所示的DNA序列;
(b)一DNA序列,包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment),其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有40%的同一性。
(c)一DNA序列,编码成一多肽,包含至少200氨基酸(aa)的片段,其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示的多肽序列的对应片段至少有30%的同一性;
(d)一DNA序列,与包含SEQ ID NO 3的1-2679位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize);以及
(e)一DNA序列,其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
5.权利要求1到4中任一获得乳酸菌的方法,其中该乳酸菌具有蛋白质水解的能力,其方法包含下列步骤:
(i)以细菌发酵200毫升的食材一整夜;
(ii)抽取产生的肽;以及
(iii)测量这些抽取出肽的抗高血压特性,其是利用一基因检测法来测量需要抑制50%ACE活性的肽浓度;
产生的肽具有的ACE抑制活性(DL50)为0.25至5.0(毫克/毫升)之间。
6.前述任一项权利要求所述的获得乳酸菌的方法,其中该乳酸菌为杆菌门的细菌,优选为杆菌纲,最优选为乳酸杆菌目。
7.权利要求6所述的获得乳酸菌的方法,其中该乳酸杆菌目的细菌为乳酸杆菌科,优选为乳酸杆菌属,最优选为纤维二糖乳酸杆菌。
8.权利要求7所述的获得乳酸菌的方法,其中该细菌为具有登记号为DSM14998的纤维二糖乳酸杆菌或其突变体。
9.一种制备具有抗高血压特性的肽的方法,该方法包括使用乳酸菌发酵包含动物性牛奶蛋白或植物性蛋白的食材,以获得含有抗高血压特性的肽的发酵食材,其特征在于:该乳酸菌是包含有一基因序列编码成一细胞壁蛋白酶(称为prtH200),其中该基因序列是使用PCR引物组的乳酸菌的基因组DNA的PCR扩增方法来进行识别鉴定,该PCR引物选自下列组成的群组[有义序列(sensesequence)称为S;反义序列(antisense sequence)称为A]:
PrtH200:(a):(S):5’CGATGATAATCCTAGCGAGC3’,
(A):5’TGGCAGAACCTGTGCCTA 3’;
(b):(S):5’GCCAAGACGCCTCTGGTA 3’,
(A):5’TAGGTATAGTTTCCATCAGGA 3’;及
(c):(S):5’AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA 3’,
(A):5’GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK 3’。
10.权利要求10所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法,其中该乳酸菌更包含有一基因序列(称为orfF3)编码成一开放读码框,其中该基因序列是使用PCR引物组的乳酸菌的基因组DNA的PCR扩增方法来进行识别鉴定,该PCR引物选自下列组成的群组[有义序列(sense sequence)称为S;反义序列(antisense sequence)称为A]:
orfF3:(a):(S):5’CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC 3’,
(A):5’CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG 3’;及
(b):(S):5’ASTCWRRYTTYGATRATGCW 3’,
(A):5’BHKYAMSAWARTTTGGATCR 3’。
11.一种制备具有抗高血压特性的肽的方法,该方法包括使用乳酸菌发酵包含动物性奶蛋白或植物性蛋白的食材,以获得具有抗高血压特性的肽的发酵食材,其特征在于:该乳酸菌包含有一基因序列编码成细胞壁蛋白酶(称为prtH200),其中该基因序列定义为prtH200为一去氧核糖核酸(DNA)序列编码成一酶释出细胞壁蛋白酶活性,该DNA序列选自下列组成的群组:
(a)SEQ ID NO 1的1-5550的位置所示的DNA序列;
(b)一DNA序列,包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment),其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有50%的同一性;
(c)一DNA序列,编码成一多肽,包含至少200氨基酸(aa)的片段,其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的多肽序列的对应片段至少有30%的同一性;
(d)一DNA序列,与包含SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize);以及
(e)一DNA序列,其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
12.权利要求11所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法,其中该乳酸菌更包含一基因序列编码成一开放读码框(称为orfF3),其中该基因序列定义为orfF3的DNA序列为一去氧核糖核酸(DNA)序列编码成一开放读码框,且该DNA序列选自下列组成的群组:
(a)SEQ ID NO 3的1-2679的位置所示的DNA序列;
(b)一DNA序列,包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment),其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有40%的同一性;
(c)一DNA序列,编码成一多肽,包含至少200氨基酸的片段,其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示多肽序列的对应片段至少有30%的同一性;
(d)一DNA序列,与包含SEQ ID NO 3的1-2679位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize);以及
(e)一DNA序列,其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
13.一种制备肽的方法,包括:
(i)根据权利要求1到8任一项的获得乳酸菌的方法获得一乳酸菌;以及
(ii)使用在步骤(i)获得的乳酸菌发酵含蛋白质的材料,以获得含肽的发酵材料。
14.权利要求13所述的制备肽的方法,其中该方法为一制造具有抗高血压肽的工艺,包括:
(i)根据权利要求1到8的获得乳酸菌的方法,以获得一乳酸菌;以及
(ii)使用在步骤(i)获得的乳酸菌发酵包含动物性牛奶蛋白或植物性蛋白的发酵食材,以获得具有抗高血压特性的肽的发酵食材。
15.权利要求9到14任一项所述的制备肽的方法,其中该食材包含动物性牛奶蛋白。
16.权利要求15所述的制备肽的方法,其中该动物性牛奶蛋白为酪蛋白。
17.权利要求15所述的制备肽的方法,其中该食材为牛奶或牛奶制品。
18.权利要求9到17任一项所述的制备肽的方法,其中该乳酸菌具有蛋白质水解活性的能力,在一方案包括下列步骤:
(i)以细菌发酵200毫升的食材一整夜;
(ii)抽取产生的肽;以及
(iii)测量这些抽取出肽的抗高血压特性,其是利用一基因检测法来测量需要抑制50%ACE活性(DL50)的肽浓度;
产生的肽的ACE抑制活性(DL50)为0.25至5.0(毫克/毫升)之间。
19.权利要求9到18任一项所述的制备肽的方法,其中该乳酸菌为杆菌门的细菌,优选为杆菌纲,更优选为乳酸杆菌目。
20.权利要求19所述的制备肽的方法,其中该乳酸杆菌目的细菌为乳酸杆菌科,优选是乳酸杆菌属,更优选是纤维二糖乳酸杆菌。
21.权利要求20所述的制备肽的方法,其中该细菌为登记编号为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌或其突变种。
22.权利要求9到21任一项所述的制备肽的方法,其中该发酵食材完成时的情形是,每100毫升的食材含有0.5到25毫克的具有抗高血压特性的肽。
23.权利要求9到22任一项所述的制备肽的方法,其中该食材的发酵需要在摄氏20到50度中发酵3到48小时。
24.权利要求9到23任一项所述的制备肽的方法,其中该发酵食材是在酸碱值在pH3.5到7间的情况下进行。
25.权利要求9到24任一项所述的制备肽的方法,其中该发酵食材更可进行一纯化或向上浓缩该具有抗高血压特性的肽。
26.权利要求25所述的制备肽的方法,其中该发酵食材经离心并获得分离出的包含具有抗高血压的肽的上层液。
27.权利要求26所述的制备肽的方法,其中该肽是藉由反相树脂纯化该上层液。
28.权利要求25所述的制备肽的方法,其中该发酵食材可进行一纳米过滤处理。
29.一种制备含有抗高血压特性的肽的功能性食品的方法,该方法包括下列步骤:
(i)根据权利要求9到24任一项所述的方法来制备一发酵食材;以及
(ii)以适当方式包装该发酵食材,以得到一功能性食品。
30.权利要求29所述的制备功能性食品的方法,更进一步的包含下列中间步骤[介于步骤(i)和(ii)之间]:
(ia)权利要求20的步骤(i)的发酵食材进一步地按照权利要求25到28任一项所述纯化或向上浓缩该具有抗高血压特性肽的过程;以及
(ib)然后将经步骤(ia)的纯化或向上浓缩的肽添加于一食材上。
31.权利要求30所述的制备功能性食品的方法,其中该权利要求21的步骤(ib)的食材为根据权利要求9到24任一项的制造发酵食材的方法制备的发酵食材。
32.一种具有抗高血压特性的肽是藉由权利要求25到28任一项所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法而获得的。
33.一种包含具抗高血压特性的肽的功能性食品是藉由权利要求29到31任一项所述的制备功能性食品的方法而获得的。
34.使用权利要求32所述的具有抗高血压特性的肽制造一药剂用以治疗高血压。
35.使用权利要求33所述的包含具抗高血压特性的肽的功能性食品制一药剂用以治疗高血压。
36.一种具有登记编号为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌或其突变种。
实施例:
假如没有另外说明,每一个步骤皆可使用标准方法来进行,此标准方法例如是描述在一般教科书中的(Maniatis,T.,Fritsch,E.F.,Sambrook,J.″Molecular Cloning.A laboratory manual″.Cold Spring HarborLaboratories,2nd Edition/3 Volume,1989;Ausubel,F.M.,等(eds.)″Current Protocols in Molecular Biology″.John Wiley和Sons,1995.)。
实施例1:PCR扩增反应
模板DNA(template DNA)是藉由苯酚-氯仿(phenol-chloroform)反应取得,如前面所述述(Marmur(1961,Journal of Molecular Biology,3,208-218)。此最终制备是在TE缓冲液+RNAse中的基因组模板DNA。
此PCR反应的制备如下所述:
(i)1.0μl的模板DNA
1.0μl的前置引物(forward primer)(5pmol/μl)
1.0μl的反置引物(reverse primer)(5pmol/μl)
1.0μl 2.5mM的dNTD(dATP、dCTP、dGTP及dTTP的混合物)
5.0μl Mg缓冲液(20mM MgSO4)
0.5μl DNA聚合酶(Pwo,100U)
10.5μl水(H2O)
(ii)PCR扩增的热程序是在94℃下1分钟30个循环,在50℃下90秒(当引物Tm在55℃左右),55℃下90秒(当引物Tm在62℃左右),45℃下90秒(当引物Tm在50℃左右)以及在72℃下1分钟。在30个循环完成后,这些样品在4℃下进行冷却。
(iii)此PCR产品在60V、1.5%琼脂糖凝胶(agarose gel)上跑电泳,在紫外光下自琼脂糖凝胶中分离,并根据制造商操作指南(Qiagen,Cat.No.28704)来使用器材QIAquick Gel Extraction Kit进行纯化。
实施例2:蛋白水解(ACE)活性分析
贮存培养菌(stock culture)的制备
乳酸杆菌(Lactobacillus)种是形成在耐甲氧西林葡萄球菌琼脂(MRS agar)上,并在厌氧性(anaerobically)、37℃的环境下培养48小时,选择单一菌落(colony),再接种至MRS培养液中,并于37℃下成长整晚。乳酸杆菌种是形成在M17琼脂上,并在好氧性(aerobically)、30℃的环境下培养48小时,选择单一菌落,再接种至M17培养液中,并于30℃下过夜培养。准备来自隔夜的贮存培养菌,将其贮存在-80℃的20%甘油中。
发酵牛奶的制备与肽的抽取
将实施例1的隔夜贮存培养菌(1%v/v)接种至200毫升新鲜牛奶中进行发酵,并依据使用的菌种保持温度整夜在37℃或30℃。
在该新鲜牛奶中,肽的抽取可藉由使用下列方案来达成:
-在室温下进行10分钟、3000g的离心。
-分离出上层液,并以NaOH调pH值至8.3(ACE活性试验的最佳pH值)。
-在室温下对取得的上层液进行10分钟、3000g的离心。
-分离出上层液(乳浆),其包含肽。
-利用Lowry试验(Lowry等,1951.J.Biol.Chem.,193:265-275),测定在乳浆中的肽浓度(每毫升乳浆中含有的肽毫克数)。
此乳浆直接以ACE分析并在-20℃下冷冻,且此乳浆浆包含肽成分,其在实施例3中称为“肽溶液”。
ACE活性分析
发酵牛奶中的肽进行体外(in vitro)ACE活性试验。肽浓度为DL50(mg/ml),其抑制50%的ACE活性,较低的此值是具有较佳的发酵牛奶的抗高血压功效。抽取出的肽是以下列的方案来进行量测:
此试验分析主要是ACE退化一HHL(hippuryl-L-histidyl-L-leucine)基质,并加入染色剂(color reagent)进行染色。若存在有肽,此肽抑制ACE,并有较少的HHL基质退化,也就是在加入染色剂之后,形成有较少的颜色。
溶液制备:
培养缓冲液(Incubation buffer):188mmol/l硼酸,pH值8.3,及1.375mmol/l的氯化钾。(将2.91克硼酸与25.63克氯化钾溶解在200ml的蒸馏水中,以1mol/l的氢氧化钾(potassium hydroxide)将pH值调整为8.3,并以蒸馏水稀释至250毫升;贮存在室温下)。
基质溶液(Substrate solution):5.8mmol/l的HHL(hippuryl-L-histidyl-L-leucine)。(将250毫克的HHL溶解在约90毫升的培养缓冲液中,并以相同缓冲液填充成100毫升,40℃贮存,此基质溶液可使用至少2星期)。
停止溶液(Stop solution):100mmol/l的HEPES,pH值为9,2.5mmol的EDTA。(将23.83克的HEPES与0.93克的EDTA溶解在800毫升的蒸馏水中,以1mol/l的氢氧化钠将pH值调整为9,并以蒸馏水稀释至1升。室温贮存。)
染色剂:136mmol/l的三聚氯氰(cyanuric chloride)在1,4-二氧杂环乙烷(1,4-dioxane)中。(将12.50毫克的三聚氯氰溶解在400毫升的1,4-二氧杂环乙烷中,并以1,4-二氧杂环乙烷填充至500毫升,贮存在室温下及暗棕色玻璃瓶内)。
分析:(所有溶液先平衡至室温)
-制造一经由培养缓冲液连续稀释的肽溶液,连续6次稀释将未稀释的肽溶液稀释至完全(只有培养缓冲液)。
-对每次稀释而言,于一玻璃管中放置10μl的肽溶液、40μl的基质(HHL)溶液(2.5g/l)以及2.5μl的ACE(0.25单位/毫升)。
-阳性对照包括2.5μl的ACE、10μl的培养缓冲液以及40μl的基质(HHL)溶液。
-阴性对照包括12μl的培养缓冲液以及40μl的基质(HHL)溶液。
-在37℃下培养1小时。
-加入300μl的停止溶液停止反应,随后以150μl的染色剂混合。
-容许其沉积5分钟,并在室温下以3300g离心30分钟,以去除变质的蛋白质和过量的三聚氯氰。
-搬移每一样品的300μl上层液至微量滴定盘(microtiter plate)的孔洞中。
-在405nm下对照水进行读取。
ACE抑制百分比是以下列公式表示:
每次稀释具有其所属的ACE抑制百分比值,其是提供一曲线表示ACE抑制百分比与乳浆的肽浓度的函数。DL50(具50%抑制活性的肽浓度)的获得是藉由读取位在该曲线与轴上对应的50%ACE抑制点的交叉点的肽浓度而得到。
实施例3:分析prtH200,orfF3与orfF4基因序列在不同细菌中的存在
研究不同乳酸菌种中prtH200、orfF3与orfF4基因序列的存在。进行在实施例1所描述的PCR反应,表1a显示利用PCR引物组用来研究prtH200基因编码成一蛋白酶的存在。表1b显示利用PCR引物组用来研究orfF3基因存在。表1c显示利用PCR引物组用来研究orfF4基因存在。
在这些表中也提供扩增PCR片段的预计长度,且该预计长度是基于prtH200 SEQ ID NO 1,orfF3 SEQ ID NO 3以及orfF4 SEQ ID NO 5来决定。
表1a(prtH200蛋白酶)
引物组编号 | 序列 | PCR片段的预计长度 |
(a) | (S):5’CGATGATAATCCTAGCGAGC3’,(A):5’TGGCAGAACCTGTGCCTA3’ | 620bp |
(b) | (S):5’GCCAAGACGCCTCTGGTA3’,(A):5’TAGGTATAGTTTCCATCAGGA3’ | 313bp |
(c) | (S):5’AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA3’,(A):5’GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK3’ | 624bp |
表1b(orfF3蛋白酶)
引物组编号 | 序列 | PCR片段的预计长度 |
(a) | (S):5’CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC3’,(A):5’CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG3’ | 1605bp |
(b) | (S):5’ASTCWRRYTTYGATRATGCW3’,(A):5’BHKYAMSAWARTTTGGATCR3’ | 1587bp |
有义序列(S),反义序列(A)
表1c(orfF4蛋白酶)
引物组编号 | 序列 | PCR片段的预计长度 |
(a) | (S):5’GGTGTTGCTCCTGAAGC3’(A):5’ACTCTAGCACCAGCTAATTGAACATCATG3 | 950 |
有义序列(S),反义序列(A)
表2是显示PCR研究的所有结果。
表2:
种 | Ref(CHCC) | p:(a) | p:(b) | p:(c) | o3:(a) | o3:(b) | o4(a) |
Lb.helveticus | 5951 | + | + | + | + | + | + |
Lb.helveticus | 4080 | - | - | - | - | - | - |
Lb.helveticus | 3610 | + | + | + | - | - | ? |
Lb.helveticus | 637 | - | - | - | + | ? | + |
Lb.helveticus | 3552 | - | - | - | - | ? | + |
Lb.helveticus | DSM13137 | - | - | ? | + | ? | + |
“p:”为prtH200引物组;“o3:”为orfF3引物组;“o4:”为orfF4引物组;
“+”代表一正PCR片段;“-”代表无PCR片段或一负PCR片段;“?”代表无测试。
“Lb.helveticus DSM 13137”描述在WO01/32836(Valio Ltd)。
表2的正片段是在表1所给予的预期大小内,其皆为DNA序列,且确定包含一个与一预期的DNA序列一致的DNA序列。
根据本发明,具有参考编号5951的特殊菌包含有prtH200、orfF3与orfF4基因序列。
实施例4:ACE活性
在实施例3介绍的菌种培养菌按照实施例2中所述进行ACE活性试验,其试验结果如表3所示。
表3.
使用培养菌 | 具DL50(mg/ml)抗高血压效用三次测定平均 |
Lb.helveticus 5951 | 2.99 |
Lb.helveticus 4080 | 2.34 |
Lb.helveticus 637 | 3.32 |
实施例5:抗高血压特性的体内(in vivo)试验
材料与方法
菌种与培养(Strains and cultivation)
将菌种涂布在耐甲氧西林葡萄球菌琼脂(MBS agar)上,并在厌氧性、37℃的环境下培养48小时,选择一菌落(colony),再接种至MRS培养液中,并于37℃下过夜培养。准备来自隔夜的贮存培养菌,将其贮存在-80℃的20%甘油中;再将这一菌种1%(v/v)置于新鲜牛奶中作为发酵之用,并放置于牛奶中培养一整夜。
样品的制备
浓缩发酵牛奶:
将含有单一或混合菌落菌种的牛奶利用一1%(v/v)接种层级发酵16小时,全部发酵产物经冷冻干燥。第二次发酵,在与第一次发酵的相同条件下进行发酵,经离心后取得乳浆部分,其颗粒状物已去除,并将乳浆通过0.45mm滤膜进行过滤并冷冻。在喂食大鼠之前,此乳浆是用来溶解冷冻干燥乳浆粉末并利用因素5(factor 5)使之浓缩。
自发性高血压大鼠(Spontaneous Hypertensive Rats):
自发性高血压大鼠(SHR)来自于IFFA CRED0(a Charles River company),里昂,法国。
每一次治疗在9:00至9:15之间以胃管灌食法实施,且每一只动物接受总体积为2毫升的剂量。
实验设计:
共分成三组别:
第1组(n=16):接受治疗1(牛奶;n=16)
第2组(n=12):接受连续治疗2-7,每一次实施间隔3天的空窗期
第3组(n=12):接受连续治疗8-12,每一次实施间隔3天的空窗期
研究参数(Investiga ted parameters):
在喂食5及24小时后,利用体积变化描记器(plethysmography)测定清醒的SHR在不同时间点的心脏收缩压。
在所有SHR进行实验之前,先使其适应动物场合9星期,此外,在进行第一次灌食之前,所有动物需先习惯胃管灌食法,并测量3天的心脏收缩压。
第1组的心脏收缩压的测定与第2组及第3组相平行,作为对照组。
在喂食前6小时及喂食后24小时之间,定期测定其心脏收缩压。
结果
在表4显示在服用不同物质用量后,5及24小时的心脏收缩压的变动情形。
表4:
牛奶 | 水 | ACE抑制药物Enalapril | Calpis商业产品 | CHCC4080 | CHCC5951 | CHCC637 | |
5小时 | -4 | -4 | -30 | -13 | -14 | -18 | -8 |
24小时 | -4 | -2 | -17 | +2 | -1 | -19 | -8 |
牛奶:样品为未发酵的牛奶,9.5%再生脱脂乳。
Enalapril:通常用于治疗高血压患者的药物。以20mg/kg的高浓度添加到牛奶中,以测试大鼠对抗高血压组合物反应的能力。
Calpis商业产品:Calpis食品公司(Calpis Food Industry)的商业产品,该产品名称为Calpis,其是Lb.Helveticus和Saccharomyces cerevisiae菌种混合物的液态发酵牛奶。
CHCC 4080:CHCC 4080发酵的浓缩牛奶
CHCC 5951:CHCC 5951发酵的浓缩牛奶
CHCC 637:CHCC 637发酵的浓缩牛奶
上述结果证明,
CHCC 5951为乳酸菌种,其具有制造最好的高血压特性 的肽的能力。表2(上述)显示此菌种包含在此描述的prtH200、orfF3与orfF4,在24小时,使用CHCC 5951菌种产生的肽具有的效用可与药剂Enalapril相比。
CHCC 4080没有包含任何基因。CHCC 637包含有orfF3与orfF4基因而没有prtH200基因。
如上所述,Calpis Food Industry的商业产品是藉由使用CP790乳酸菌制造的,且此菌种并不包含有prtH200[Yamamoto等(2000)]。
实施例6:使用CHCC5951菌种的体内试验
菌种与培养与SHR大鼠:与实施例5相同
样品的制备
发酵牛奶:
将含有单一或混合菌落菌种的牛奶利用一1%(v/v)接种层级发酵16小时,全部发酵产品经冷冻干燥。第二次发酵,在与第一次发酵的相同条件下进行发酵,经离心后取得乳浆部分,其颗粒状物已去除,并将乳浆通过0.45mm滤膜进行过滤并冷冻。在喂食大鼠之前,此乳浆是用来溶解冷冻干燥乳浆粉末并利用不同因素使之浓缩。
实验设计:
动物:自发性高血压大鼠(22周大)
组别:(1)安慰剂(牛奶)
(2)样品1(在3不同乳浆浓缩3剂量的发酵牛奶;剂量1:因素1,剂量2:因素2.5,剂量3:因素5)
(3)样品2(悬浮在中性pH值牛奶中的冷冻干燥发酵牛奶)
(4)样品3(只是发酵牛奶产品)
(5)样品4(在发酵后经过加热处理的发酵牛奶)
(5)样品5(未经过发酵,但具有活乳酸菌的牛奶)
所有大鼠均在10:00h与10:05h之间给予喂食,喂食剂量为2ml产品。
研究参数(Investigated parameters):在喂食24小时后,利用自动测量仪(Data Sciences Int.)检测清醒的SHR在不同时间点的心脏收缩压。在施药前24小时和施药后48小时每15分钟记录心脏收缩、心脏舒张压的平均值(1分钟内)。
藉由这些追踪记录,计算每一组别的心脏收缩压与心脏舒张压的24小时平均值。再者,心脏收缩压与心脏舒张压的变动是由本体相较于未经治疗数值经计算产生,其是计算喂食24小时,且在喂食后的时间3至6、12至15及21至24小时周期。
在所有SHR进行实验之前,先使其适应动物场合9星期,此外,在进行第一次灌食之前,所有动物需先习惯胃管灌食法,并测量3天的心脏收缩压。
统计资料(Statistics)
所有结果皆以平均值±平均标准误差来表示。
结果表
表1.经胃管喂食后的心脏收缩压
组别 | 周期 | 变动vs.未经治疗1 | ||||||
0-24 | 3-6 | 12-15 | 21-24 | 0-24 | 3-6 | 12-15 | 21-24 | |
安慰剂1样品1剂量1剂量2剂量3 | 184±6178±178±178± | 184±6172±175±174± | 183±5176±172±175± | 190±8184±184±186± | --- | --9.6±2.7- | --- | --- |
安慰剂2样品2样品3样品4样品5 | 176±9169±170±170±180± | 169±9163±168±167±180± | 179±9172±169±172±181± | 161±9166±165±168±178± | 变动vs.未经治疗2 | |||
---5.2±1. | -5.9±2.7-0.6±3.1-1.3±4.411.4±6. | ---2.6±2.2 | ---7.1±2.8 |
*:p<0.05vs.安慰剂(placebo)
安慰剂1及安慰剂2分别作为研究编号1与研究编号2的对照组。
表2.胃管喂食后的心脏舒张压
组别 | 周期 | 变动vs.安慰剂 | ||||||
0-24 | 3-6 | 12-15 | 21-24 | 0-24 | 3-6 | 12-15 | 21-24 | |
未经治疗1样品1剂量1剂量2剂量3 | 126±120±122±123± | 127±118±120±120± | 124±118±120±121± | 129±124±129±128± | --- | --- | --- | -5.3±2.4-0.3±2.3-1.4±1.6 |
未经治疗2样品2样品3样品4样品5 | 131±5123±126±127±133± | 125±5119±127±126±135± | 134±5125±125±128±133± | 125±5119±121±123±130± | ---3.2±2.3 | -2.7±2.61.2±3.59.7±5.5 | ---- | -5.7±3.3-4.1±2.3-2.5±2.64.8±3.3 |
*:p<0.05vs.未经治疗
未经治疗1及未经治疗2分别作为研究编号1与研究编号2的对照组
结果显示没有必要向上浓缩(up-concentrate)发酵牛奶产品。样品3只是发酵牛奶产品,其与冷冻干燥浓缩发酵样品1(剂量1,2,3)和样品2具有相当的降血压作用。
样品2为悬浮在中性pH值牛奶中的冷冻干燥发酵牛奶,其可降低血压。证明在此描述的发酵产品具有广泛的应用,这是由于其可溶解在不同液体中,以得到一必须最终的适当使用。不同pH值的特性不一定影响产品的血压还原活性。
经发酵后加热处理的样品4也可降低血压,大体上,所有在此样品内的细菌皆被杀死,因此,即证明在最终产品中并不需要活的细菌。
样品5没有经过发酵,但其含有活的细菌,其无法降低血压,故证明发酵步骤为必要的。
实施例7:脉冲式凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分析鉴定
纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)种CHCC5951(寄存编号为DSM 14998)在37℃标准MRS培养基中过夜培养,并使用Qiagen试剂盒来分离出染色体DNA。此分离出的染色体DNA使用限制酶SmaI做完全消化(根据操作说明进行)。
消化DNA的电泳条件为:CHEF Mapper XA系统,在5.3V/cm下,脉冲时间2至30秒线性跳跃超过24小时,1.1%琼脂糖,1/2×TBE,14℃。
用来跑凝胶的程序为:
参数 PFGE程序标号
1 2 3 4 5 6
起始打开时间/秒 2 3 2 2 3 1
最终关闭时间/秒 30 80 60 40 18 10
跳跃因素 线性 -1.53 -1.24 线性 线性 线性
跑时间/小时 24 24 24 24 24 21
使用Gel Compar II程序在计算机上比较这些频带。
频带大小是藉由测量在三个独立PFGE上的频带移动距离,以及与这些距离相关联的具已知频带大小的标准移动来决定。此频带大小为三个量测值的平均值±5kbp。
琼脂的实验结果如图1所示,所示的12个频带的大小为:
频带编号1:283kbp
频带编号2:259kbp
频带编号3:219kbp
频带编号4:138kbp
频带编号5:127kbp
频带编号6:119kbp
频带编号7:106kbp
频带编号8:88kbp
频带编号9:71kbp
频带编号10:59kbp
频带编号11:54kbp
频带编号12:46kbp
参考文献:
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atg agg aga aac aaa tat gca ggc tta tta gtt tgt gcc act act cta 48
Met Arg Arg Asn Lys Tyr Ala Gly Leu Leu Val Cys Ala Thr Thr Leu
1 5 10 15
tcc gtc gta tct gtg ttc tct act gcc gaa caa caa gtt aag gct agt 96
Ser Val Val Ser Val Phe Ser Thr Ala Glu Gln Gln Val Lys Ala Ser
20 25 30
gtt gac agc caa aca aaa act gtt gaa aaa agt act aaa gca gca gaa 144
Val Asp Ser Gln Thr Lys Thr Val Glu Lys Ser Thr Lys Ala Ala Glu
35 40 45
tct act aca gca aat tta act aac aaa gca gtt gaa gcg caa tta gcc 192
Ser Thr Thr Ala Asn Leu Thr Asn Lys Ala Val Glu Ala Gln Leu Ala
50 55 60
gca aaa ggt gtt aat ttt aaa cac tta act gtt aat caa aaa caa gat 240
Ala Lys Gly Val Asn Phe Lys His Leu Thr Val Asn Gln Lys Gln Asp
65 70 75 80
gta tat gtt gat gta att gtt cag tta tcg gct acc cca gct gct act 288
Val Tyr Val Asp Val Ile Val Gln Leu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Thr
85 90 95
aat ggc tca gta agt gct aat tca agt agc gca gaa att gaa caa gct 336
Asn Gly Ser Val Ser Ala Asn Ser Ser Ser Ala Glu Ile Glu Gln Ala
100 105 110
tct aaa aaa gta att gcc aat caa gct tct att aag gaa aaa gtt aag 384
Ser Lys Lys Val Ile Ala Asn Gln Ala Ser Ile Lys Glu Lys Val Lys
115 120 125
gca att act aac caa gca att ggt aaa agt tat ggt tat gta gtt aac 432
Ala Ile Thr Asn Gln Ala Ile Gly Lys Ser Tyr Gly Tyr Val Val Asn
130 135 140
gga ttt gca acc aaa gca aaa gta aag gat att caa aaa cta aga aat 480
Gly Phe Ala Thr Lys Ala Lys Val Lys Asp Ile Gln Lys Leu Arg Asn
145 150 155 160
atc cct ggg gtt aaa tca gta act tta gct aaa gtt tat tac gca aat 528
Ile Pro Gly Val Lys Ser Val Thr Leu Ala Lys Val Tyr Tyr Ala Asn
165 170 175
gat tct tca gct gac aat atg gct aac gtt tca acc gtt tgg aac aat 576
Asp Ser Ser Ala Asp Asn Met Ala Asn Val Ser Thr Val Trp Asn Asn
180 185 190
tat aaa tac aaa ggg gaa ggt acc gtc gtt tct atc atc gat act ggt 624
Tyr Lys Tyr Lys Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Ile Ile Asp Thr Gly
195 200 205
att gat ccc aat cac aaa gat ttg cgc tta agc gat gat tcc aag gtc 672
Ile Asp Pro Asn His Lys Asp Leu Arg Leu Ser Asp Asp Ser Lys Val
210 215 220
aaa tta acc aaa gat aag gtt aat gct ttt act aaa gaa tct ggt tat 720
Lys Leu Thr Lys Asp Lys Val Asn Ala Phe Thr Lys Glu Ser Gly Tyr
225 230 235 240
ggt cgt tac ttt act gat aaa gtg cca tac ggt cac aat tat tca gac 768
Gly Arg Tyr Phe Thr Asp Lys Val Pro Tyr Gly His Asn Tyr Ser Asp
245 250 255
aat aat gat aat att acc gat gat aat cct agc gag caa cat ggt atg 816
Asn Asn Asp Asn Ile Thr Asp Asp Asn Pro Ser Glu Gln His Gly Met
260 265 270
cac gtt gct ggt atc gta gct gcc aat ggt act gcc gat tct gtt aac 864
His Val Ala Gly Ile Val Ala Ala Asn Gly Thr Ala Asp Ser Val Asn
275 280 285
tct gtt gtt ggt gtt gcc cca gaa gct caa tta cta gct atg aag gct 912
Ser Val Val Gly Val Ala Pro Glu Ala Gln Leu Leu Ala Met Lys Ala
290 295 300
ttc tct aat tca gat agt tca gcc tct act gat tct act agc att atc 960
Phe Ser Asn Ser Asp Ser Ser Ala Ser Thr Asp Ser Thr Ser Ile Ile
305 310 315 320
ggt gca atc gat gat tct gcc aag ctt ggg gct gac gtt cta aac atg 1008
Gly Ala Ile Asp Asp Ser Ala Lys Leu Gly Ala Asp Val Leu Asn Met
325 330 335
tca tta ggt tca gtt tct ggt gaa caa act gaa gac gat cca gaa gtt 1056
Ser Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Gln Thr Glu Asp Asp Pro Glu Val
340 345 350
gcc gct gtt gaa cgt gcc act aag aaa ggt act gca gct gta att tct 1104
Ala Ala Val Glu Arg Ala Thr Lys Lys Gly Thr Ala Ala Val Ile Ser
355 360 365
gcc ggt aac tcc ggc act tca aat tca gaa att gaa ggt gtt aat aaa 1152
Ala Gly Asn Ser Gly Thr Ser Asn Ser Glu Ile Glu Gly Val Asn Lys
370 375 380
gct tat tac ggg aat cct gat atg gaa act tta ggt aat cca ggc act 1200
Ala Tyr Tyr Gly Asn Pro Asp Met Glu Thr Leu Gly Asn Pro Gly Thr
385 390 395 400
gca aga agt gca aca act gtt gcc tct gct gaa aac act aag gct act 1248
Ala Arg Ser Ala Thr Thr Val Ala Ser Ala Glu Asn Thr Lys Ala Thr
405 410 415
aca gat gga gta act att aca tct gct gat gga aaa act act atc gca 1296
Thr Asp Gly Val Thr Ile Thr Ser Ala Asp Gly Lys Thr Thr Ile Ala
420 425 430
ggt cca gaa gct act cag ctt tca gaa ggt act gac cgt gct ttc ttt 1344
Gly Pro Glu Ala Thr Gln Leu Ser Glu Gly Thr Asp Arg Ala Phe Phe
435 440 445
aat gat aaa aaa ttc tac gtc gta aaa gat aag aat ggc aat tta ggc 1392
Asn Asp Lys Lys Phe Tyr Val Val Lys Asp Lys Asn Gly Asn Leu Gly
450 455 460
aca ggt tct gcc aag caa tat act tct gct gta aaa ggt aaa att gca 1440
Thr Gly Ser Ala Lys Gln Tyr Thr Ser Ala Val Lys Gly Lys Ile Ala
465 470 475 480
att gtc aag cgt ggt gaa ctt act ttc act gat aaa caa aaa tat gcc 1488
Ile Val Lys Arg Gly Glu Leu Thr Phe Thr Asp Lys Gln Lys Tyr Ala
485 490 495
caa gaa gct ggt gcc gct ggt tta atc att gtt aac aac aaa gcc ggc 1536
Gln Glu Ala Gly Ala Ala Gly Leu Ile Ile Val Asn Asn Lys Ala Gly
500 505 510
gat ata act ggc atg tta ctt aac gct ggc ttc cct act gct ggt tta 1584
Asp Ile Thr Gly Met Leu Leu Asn Ala Gly Phe Pro Thr Ala Gly Leu
515 520 525
tca gct aca tca gga gaa aaa tta gta aaa tat gtt gaa gcc cat cct 1632
Ser Ala Thr Ser Gly Glu Lys Leu Val Lys Tyr Val Glu Ala His Pro
530 535 540
gat gaa gca ttg aag gta agt att gtt gtc caa gcc tta aat aat tct 1680
Asp Glu Ala Leu Lys Val Ser Ile Val Val Gln Ala Leu Asn Asn Ser
545 550 555 560
gct cgt caa aca gac tta atg tct gat ttc acc tca tac ggt ccc act 1728
Ala Arg Gln Thr Asp Leu Met Ser Asp Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Thr
565 570 575
tct agc ttg gca ttt aag cca gat atc tca gca cca ggt gga cat att 1776
Ser Ser Leu Ala Phe Lys Pro Asp Ile Ser Ala Pro Gly Gly His Ile
580 585 590
tgg tca act caa aat aac aat ggc tat act aac atg tct ggt act tca 1824
Trp Ser Thr Gln Asn Asn Asn Gly Tyr Thr Asn Met Ser Gly Thr Ser
595 600 605
atg gct tct cca ttt att gct ggt acc caa gca ctt gtt agt caa aca 1872
Met Ala Ser Pro Phe Ile Ala Gly Thr Gln Ala Leu Val Ser Gln Thr
610 615 620
atg aac gac aag aat ggt gct ttc tac gca act tat caa aag atg agc 1920
Met Asn Asp Lys Asn Gly Ala Phe Tyr Ala Thr Tyr Gln Lys Met Ser
625 630 635 640
gca gaa gaa aga acg cca ttt att aag act cta gaa atg aat act gca 1968
Ala Glu Glu Arg Thr Pro Phe Ile Lys Thr Leu Glu Met Asn Thr Ala
645 650 655
agt att caa cct gat att agc cat gat aat gtc atc gtt tca cca cgt 2016
Ser Ile Gln Pro Asp Ile Ser His Asp Asn Val Ile Val Ser Pro Arg
660 665 670
aga caa ggt gct gga ttt att aac gct aac gct act atc caa gct tta 2064
Arg Gln Gly Ala Gly Phe Ile Asn Ala Asn Ala Thr Ile Gln Ala Leu
675 680 685
gct aaa aat cct tca act gta gtc agc agc aat ggc tat cct ggt gta 2112
Ala Lys Asn Pro Ser Thr Val Val Ser Ser Asn Gly Tyr Pro Gly Val
690 695 700
gaa ctc aaa agt ttt aaa gat aga act ctt aat ttc caa gtt aaa ttt 2160
Glu Leu Lys Ser Phe Lys Asp Arg Thr Leu Asn Phe Gln Val Lys Phe
705 710 715 720
act aac cgt acc aac aag gcc tta act tat aaa tta gca aac aat ggt 2208
Thr Asn Arg Thr Asn Lys Ala Leu Thr Tyr Lys Leu Ala Asn Asn Gly
725 730 735
aaa aat tct gac gtt tac act tct gct act gat agt tct gca gtt tta 2256
Lys Asn Ser Asp Val Tyr Thr Ser Ala Thr Asp Ser Ser Ala Val Leu
740 745 750
tat gat aag aag att gat ggc gca tca gtt aag gct agt ggt gac att 2304
Tyr Asp Lys Lys Ile Asp Gly Ala Ser Val Lys Ala Ser Gly Asp Ile
755 760 765
ttt gtc ccg gca aat tct act aaa gaa cta act tta acc ttg acc tta 2352
Phe Val Pro Ala Asn Ser Thr Lys Glu Leu Thr Leu Thr Leu Thr Leu
770 775 780
cct agt gac ttt aaa gaa aat caa tat gtt gaa ggc ttc tta aca ttt 2400
Pro Ser Asp Phe Lys Glu Asn Gln Tyr Val Glu Gly Phe Leu Thr Phe
785 790 795 800
aat agt tca gat tct tca caa ttg cgt ctt cca tat atg ggc ttc ttt 2448
Asn Ser Ser Asp Ser Ser Gln Leu Arg Leu Pro Tyr Met Gly Phe Phe
805 810 815
ggc gat tgg gca agt tca gat ctt cca atc ttt gct agt ctt aat gat 2496
Gly Asp Trp Ala Ser Ser Asp Leu Pro Ile Phe Ala Ser Leu Asn Asp
820 825 830
cca aat gta ttt cag cct gac aac aat atg ttt ggt aca ttg gta act 2544
Pro Asn Val Phe Gln Pro Asp Asn Asn Met Phe Gly Thr Leu Val Thr
835 840 845
gta ggt aat agt tca gac aat act aat cct ggt tta agc caa gac gcc 2592
Val Gly Asn Ser Ser Asp Asn Thr Asn Pro Gly Leu Ser Gln Asp Ala
850 855 860
tct ggt aac tta agt ttt gat tct tcg aaa ttt gca att tct aat gct 2640
Ser Gly Asn Leu Ser Phe Asp Ser Ser Lys Phe Ala Ile Ser Asn Ala
865 870 875 880
aaa aat gca caa ttt aag tgg ttt aaa cct act tac tac tta tac aga 2688
Lys Asn Ala Gln Phe Lys Trp Phe Lys Pro Thr Tyr Tyr Leu Tyr Arg
885 890 895
aac gca aac aac gtt aaa atc caa att tta gat aag aat ggt aaa gta 2736
Asn Ala Asn Asn Val Lys Ile Gln Ile Leu Asp Lys Asn Gly Lys Val
900 905 910
atc aat act tta gcc tct ttg agt aac gca acc aag act tac tat aac 2784
Ile Asn Thr Leu Ala Ser Leu Ser Asn Ala Thr Lys Thr Tyr Tyr Asn
915 920 925
tct caa gct caa agc tat act tat ttt gac gat gct cct tct tgg gac 2832
Ser Gln Ala Gln Ser Tyr Thr Tyr Phe Asp Asp Ala Pro Ser Trp Asp
930 935 940
ggc aca tac ttc gat caa caa gct aat aaa act gtt aat gct cct gat 2880
Gly Thr Tyr Phe Asp Gln Gln Ala Asn Lys Thr Val Asn Ala Pro Asp
945 950 955 960
gga aac tat acc tac aga att tct gca act atc gat gga act aat act 2928
Gly Asn Tyr Thr Tyr Arg Ile Ser Ala Thr Ile Asp Gly Thr Asn Thr
965 970 975
gaa caa cat tac gat atc cct gtt aaa gtt gac agt gtt gca cct gta 2976
Glu Gln His Tyr Asp Ile Pro Val Lys Val Asp Ser Val Ala Pro Val
980 985 990
gta aag aac ctt aaa tta gaa tca agc aag gtt gaa gat gct aaa ggt 3024
Val Lys Asn Leu Lys Leu Glu Ser Ser Lys Val Glu Asp Ala Lys Gly
995 1000 1005
caa gag caa aca cgt tac tac tta tct gca gaa gca aaa gat gaa 3069
Gln Glu Gln Thr Arg Tyr Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Lys Asp Glu
1010 1015 1020
ctc agt ggt tta agt gga gac gca aat gtt tct gtc aat ggc gtt 3114
Leu Ser Gly Leu Ser Gly Asp Ala Asn Val Ser Val Asn Gly Val
1025 1030 1035
tca gct caa tta gaa tac gat cct act gct aag gct gat aag gat 3159
Ser Ala Gln Leu Glu Tyr Asp Pro Thr Ala Lys Ala Asp Lys Asp
1040 1045 1050
ggt ttc caa aaa gtg gaa atc gat tta tcc cca gct caa gca aag 3204
Gly Phe Gln Lys Val Glu Ile Asp Leu Ser Pro Ala Gln Ala Lys
1055 1060 1065
gct ctt caa gca ggt aca aac acc ttt tct gtt gcc tta ttc gat 3249
Ala Leu Gln Ala Gly Thr Asn Thr Phe Ser Val Ala Leu Phe Asp
1070 1075 1080
aat gct gca aat gca ggt aca gct tca ggt gaa ggc aat aaa cca 3294
Asn Ala Ala Asn Ala Gly Thr Ala Ser Gly Glu Gly Asn Lys Pro
1085 1090 1095
ggt gaa act aac ttc ggt tta gtt ctt aga aac ggt ggc tta cca 3339
Gly Glu Thr Asn Phe Gly Leu Val Leu Arg Asn Gly Gly Leu Pro
1100 1105 1110
gac aaa atc tca tct caa act aag ggc tac gat gcc aaa aat ggt 3384
Asp Lys Ile Ser Ser Gln Thr Lys Gly Tyr Asp Ala Lys Asn Gly
1115 1120 1125
act tat gta ttc tct ggt act tac cca agc aaa ctc tat gga act 3429
Thr Tyr Val Phe Ser Gly Thr Tyr Pro Ser Lys Leu Tyr Gly Thr
1130 1135 1140
tac act gat aaa gat ggt caa acc cat gac tta aat gta gaa agt 3474
Tyr Thr Asp Lys Asp Gly Gln Thr His Asp Leu Asn Val Glu Ser
1145 1150 1155
gat ggc aac aag tta ttc gtt gca aag ctt cca ctt tct aaa gat 3519
Asp Gly Asn Lys Leu Phe Val Ala Lys Leu Pro Leu Ser Lys Asp
1160 1165 1170
gac tat aag act act gtt acc ctt tac gct gat tct gac cat aag 3564
Asp Tyr Lys Thr Thr Val Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Asp His Lys
1175 1180 1185
acc ttg ctt aag aaa caa gac att acc gta agc tta gtc cca gct 3609
Thr Leu Leu Lys Lys Gln Asp Ile Thr Val Ser Leu Val Pro Ala
1190 1195 1200
aag gtc gaa agt ttg tct gta gat aag aat gat act tat gat gag 3654
Lys Val Glu Ser Leu Ser Val Asp Lys Asn Asp Thr Tyr Asp Glu
1205 1210 1215
act aaa gat tcg tcg gct gca tta gct caa act tct gaa aac act 3699
Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Ala Gln Thr Ser Glu Asn Thr
1220 1225 1230
gta aaa ctt tct ggt aaa gta agt ggt gat act aag act tta gtg 3744
Val Lys Leu Ser Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Lys Thr Leu Val
1235 1240 1245
gtt aaa caa aaa ggt cag aaa gac atc tca gtt aaa ctt aat gct 3789
Val Lys Gln Lys Gly Gln Lys Asp Ile Ser Val Lys Leu Asn Ala
1250 1255 1260
gat cac aca ttt agt act gaa ctg cca gta agc ttt ggt gaa aat 3834
Asp His Thr Phe Ser Thr Glu Leu Pro Val Ser Phe Gly Glu Asn
1265 1270 1275
gac ttt act att gta gca acc gac tct aat ggt aat tca tct agt 3879
Asp Phe Thr Ile Val Ala Thr Asp Ser Asn Gly Asn Ser Ser Ser
1280 1285 1290
gta gaa caa aaa gtt aaa tct agt gat cgt ggt aaa act act gtt 3924
Val Glu Gln Lys Val Lys Ser Ser Asp Arg Gly Lys Thr Thr Val
1295 1300 1305
tca agt agt gat gtt acc ttc gat aac ggt atc aag tgg ggt act 3969
Ser Ser Ser Asp Val Thr Phe Asp Asn Gly Ile Lys Trp Gly Thr
1310 1315 1320
cgt aac gtt aac ggt att cgt aac gtt aac gcc aag act aag aac 4014
Arg Asn Val Asn Gly Ile Arg Asn Val Asn Ala Lys Thr Lys Asn
1325 1330 1335
tac aat cct aag act ggt gag tta acc ctt act ggt aaa gta aaa 4059
Tyr Asn Pro Lys Thr Gly Glu Leu Thr Leu Thr Gly Lys Val Lys
1340 1345 1350
aga cca act act act ttg caa att ggc ggt aaa aac gta aaa att 4104
Arg Pro Thr Thr Thr Leu Gln Ile Gly Gly Lys Asn Val Lys Ile
1355 1360 1365
aat tca gat cag aca ttt aaa gta gta tta aat att ggt act cat 4149
Asn Ser Asp Gln Thr Phe Lys Val Val Leu Asn Ile Gly Thr His
1370 1375 1380
ggt gct aag att ttc cct gcg ttg atc ggt gat tca act gtt aga 4194
Gly Ala Lys Ile Phe Pro Ala Leu Ile Gly Asp Ser Thr Val Arg
1385 1390 1395
gaa act act caa gaa aga tta agt ttc tat gta gat gca gaa gct 4239
Glu Thr Thr Gln Glu Arg Leu Ser Phe Tyr Val Asp Ala Glu Ala
1400 1405 1410
cct act ttg aac tta gat agt gaa aac act gtc tac acc aac aag 4284
Pro Thr Leu Asn Leu Asp Ser Glu Asn Thr Val Tyr Thr Asn Lys
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gat aag ttt act atc tca ggc act ata agt gat gat tac aag ttc 4329
Asp Lys Phe Thr Ile Ser Gly Thr Ile Ser Asp Asp Tyr Lys Phe
1430 1435 1440
tac gac tta tca ata aat ggt aac gat gtt gaa act agc tgg agc 4374
Tyr Asp Leu Ser Ile Asn Gly Asn Asp Val Glu Thr Ser Trp Ser
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gcc gta gac tac cac agc aaa gaa ggt atc aag aag aac ttt aag 4419
Ala Val Asp Tyr His Ser Lys Glu Gly Ile Lys Lys Asn Phe Lys
1460 1465 1470
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His Glu Val Asp Leu Lys Lys Gly Lys Asn Thr Phe Asn Val Lys
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Val Thr Asp Ile Gln Gly Asn Ser Ser Ser Gln Ala Leu Val Val
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tac tat gaa cct gct aag act tta gct gag cct agt gta gac aag 4554
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ttg tta aca aag acg gca aat ttg caa ctt ctt aaa gct act act 4599
Leu Leu Thr Lys Thr Ala Asn Leu Gln Leu Leu Lys Ala Thr Thr
1520 1525 1530
gat gaa tct gaa gct aaa gtt gtt tac agc ctt gat aat ggc aag 4644
Asp Glu Ser Glu Ala Lys Val Val Tyr Ser Leu Asp Asn Gly Lys
1535 1540 1545
aca ttc aac gat gta cca gct gat ggt ttc aag gtt act gaa aac 4689
Thr Phe Asn Asp Val Pro Ala Asp Gly Phe Lys Val Thr Glu Asn
1550 1555 1560
gga act gta caa ttt aaa gca gtt gat aaa tac ggc aac gaa tcc 4734
Gly Thr Val Gln Phe Lys Ala Val Asp Lys Tyr Gly Asn Glu Ser
1565 1570 1575
aaa gtc aag tct gta gaa att aag gga ctt aac aag gaa aac caa 4779
Lys Val Lys Ser Val Glu Ile Lys Gly Leu Asn Lys Glu Asn Gln
1580 1585 1590
cct agc gaa gat aag gaa tta gct aag gct aag gaa aat ctt cag 4824
Pro Ser Glu Asp Lys Glu Leu Ala Lys Ala Lys Glu Asn Leu Gln
1595 1600 1605
gct aag gtt gat gcc ggt gaa aag aag gat ctt gat aag tac act 4869
Ala Lys Val Asp Ala Gly Glu Lys Lys Asp Leu Asp Lys Tyr Thr
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gct gac tcc aag aag gac ttc aat gat gcc ttg aag aag gct aag 4914
Ala Asp Ser Lys Lys Asp Phe Asn Asp Ala Leu Lys Lys Ala Lys
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Asp Val Leu Ala Asp Lys Asn Ala Lys Leu Ala Asp Leu Gln Asp
1640 1645 1650
gct gct aag gct ctt gat aag gca gag caa gct tta act gaa aag 5004
Ala Ala Lys Ala Leu Asp Lys Ala Glu Gln Ala Leu Thr Glu Lys
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cct gct gaa cca act atc cca ctg cta caa ggg aac aat aat gct 5049
Pro Ala Glu Pro Thr Ile Pro Leu Leu Gln Gly Asn Asn Asn Ala
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act aaa gac ctt aaa aag aca agg agc act gcc caa gcc tac agt 5229
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1730 1735 1740
tca ctc aaa ctt gta acc gaa aaa gga aag ctt aag gtt tac aca 5274
Ser Leu Lys Leu Val Thr Glu Lys Gly Lys Leu Lys Val Tyr Thr
1745 1750 1755
ttc aaa ggt cac tac ttc tac aag gtt gtt gat cgg aat gca tat 5319
Phe Lys Gly His Tyr Phe Tyr Lys Val Val Asp Arg Asn Ala Tyr
1760 1765 1770
gtt cgt gta aga aat gtg act ggt act aag gca acg tta aag aga 5364
Val Arg Val Arg Asn Val Thr Gly Thr Lys Ala Thr Leu Lys Arg
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aat tca ttt gtc tac caa tca aat ggt aag aaa gca tca cgt aaa 5409
Asn Ser Phe Val Tyr Gln Ser Asn Gly Lys Lys Ala Ser Arg Lys
1790 1795 1800
ctt ctc aag aaa ggt act acc att acc gtc tac ggc gat caa tac 5454
Leu Leu Lys Lys Gly Thr Thr Ile Thr Val Tyr Gly Asp Gln Tyr
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aaa gct ctt aag cat tac aag aag tat gct tac aga atc ggt gaa 5499
Lys Ala Leu Lys His Tyr Lys Lys Tyr Ala Tyr Arg Ile Gly Glu
1820 1825 1830
ggt aga tac ata aag agt gtc aat gtt aac aga gtt gat ctt gta 5544
Gly Arg Tyr Ile Lys Ser Val Asn Val Asn Arg Val Asp Leu Val
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aaa taa 5550
Lys
<210>2
<211>1849
<212>PRT
<213>纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)
<400>2
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1 5 10 15
Ser Val Val Ser Val Phe Ser Thr Ala Glu Gln Gln Val Lys Ala Ser
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Ser Thr Thr Ala Asn Leu Thr Asn Lys Ala Val Glu Ala Gln Leu Ala
50 55 60
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Val Tyr Val Asp Val Ile Val Gln Leu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Thr
85 90 95
Asn Gly Ser Val Ser Ala Asn Ser Ser Ser Ala Glu Ile Glu Gln Ala
100 105 110
Ser Lys Lys Val Ile Ala Asn Gln Ala Ser Ile Lys Glu Lys Val Lys
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Ala Ile Thr Asn Gln Ala Ile Gly Lys Ser Tyr Gly Tyr Val Val Asn
130 135 140
Gly Phe Ala Thr Lys Ala Lys Val Lys Asp Ile Gln Lys Leu Arg Asn
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Tyr Lys Tyr Lys Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Ile Ile Asp Thr Gly
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225 230 235 240
Gly Arg Tyr Phe Thr Asp Lys Val Pro Tyr Gly His Asn Tyr Ser Asp
245 250 255
Asn Asn Asp Asn Ile Thr Asp Asp Asn Pro Ser Glu Gln His Gly Met
260 265 270
His Val Ala Gly Ile Val Ala Ala Asn Gly Thr Ala Asp Ser Val Asn
275 280 285
Ser Val Val Gly Val Ala Pro Glu Ala Gln Leu Leu Ala Met Lys Ala
290 295 300
Phe Ser Asn Ser Asp Ser Ser Ala Ser Thr Asp Ser Thr Ser Ile Ile
305 310 315 320
Gly Ala Ile Asp Asp Ser Ala Lys Leu Gly Ala Asp Val Leu Asn Met
325 330 335
Ser Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Gln Thr Glu Asp Asp Pro Glu Val
340 345 350
Ala Ala Val Glu Arg Ala Thr Lys Lys Gly Thr Ala Ala Val Ile Ser
355 360 365
Ala Gly Asn Ser Gly Thr Ser Asn Ser Glu Ile Glu Gly Val Asn Lys
370 375 380
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Ala Arg Ser Ala Thr Thr Val Ala Ser Ala Glu Asn Thr Lys Ala Thr
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420 425 430
Gly Pro Glu Ala Thr Gln Leu Ser Glu Gly Thr Asp Arg Ala Phe Phe
435 440 445
Asn Asp Lys Lys Phe Tyr Val Val Lys Asp Lys Asn Gly Asn Leu Gly
450 455 460
Thr Gly Ser Ala Lys Gln Tyr Thr Ser Ala Val Lys Gly Lys Ile Ala
465 470 475 480
Ile Val Lys Arg Gly Glu Leu Thr Phe Thr Asp Lys Gln Lys Tyr Ala
485 490 495
Gln Glu Ala Gly Ala Ala Gly Leu Ile Ile Val Asn Asn Lys Ala Gly
500 505 510
Asp Ile Thr Gly Met Leu Leu Asn Ala Gly Phe Pro Thr Ala Gly Leu
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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1145 1150 1155
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Val Lys Gln Lys Gly Gln Lys Asp Ile Ser Val Lys Leu Asn Ala
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Asp Val Leu Ala Asp Lys Asn Ala Lys Leu Ala Asp Leu Gln Asp
1640 1645 1650
Ala Ala Lys Ala Leu Asp Lys Ala Glu Gln Ala Leu Thr Glu Lys
1655 1660 1665
Pro Ala Glu Pro Thr Ile Pro Leu Leu Gln Gly Asn Asn Asn Ala
1670 1675 1680
Val Ser Asn Ile Asn Thr Ser Ser Asp Asn Gln Val Ala Ala Pro
1685 1690 1695
Val His Ala Glu Lys Asp Thr Lys Asn Asp Asn Lys Asn Thr Thr
1700 1705 1710
Glu Glu Gly Lys Asp Thr Lys Val Met Phe Lys Ser Val Leu Tyr
1715 1720 1725
Thr Lys Asp Leu Lys Lys Thr Arg Ser Thr Ala Gln Ala Tyr Ser
1730 1735 1740
Ser Leu Lys Leu Val Thr Glu Lys Gly Lys Leu Lys Val Tyr Thr
1745 1750 1755
Phe Lys Gly His Tyr Phe Tyr Lys Val Val Asp Arg Asn Ala Tyr
1760 1765 1770
Val Arg Val Arg Asn Val Thr Gly Thr Lys Ala Thr Leu Lys Arg
1775 1780 1785
Asn Ser Phe Val Tyr Gln Ser Asn Gly Lys Lys Ala Ser Arg Lys
1790 1795 1800
Leu Leu Lys Lys Gly Thr Thr Ile Thr Val Tyr Gly Asp Gln Tyr
1805 1810 1815
Lys Ala Leu Lys His Tyr Lys Lys Tyr Ala Tyr Arg Ile Gly Glu
1820 1825 1830
Gly Arg Tyr Ile Lys Ser Val Asn Val Asn Arg Val Asp Leu Val
1835 1840 1845
Lys
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<212>DNA
<213>纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(2679)
<223>
<400>3
atg ata aga cta ctg gga aga tgg ttg tgc tcc aga tgg tca ata cac 48
Met Ile Arg Leu Leu Gly Arg Trp Leu Cys Ser Arg Trp Ser Ile His
1 5 10 15
tta ccg ctt tgt tgc ccc ttg tac aac aat ggt gaa aac aaa gtt caa 96
Leu Pro Leu Cys Cys Pro Leu Tyr Asn Asn Gly Glu Asn Lys Val Gln
20 25 30
act aat gac act cca gtt atc att gat act act gct cct gtt ttg aac 144
Thr Asn Asp Thr Pro Val Ile Ile Asp Thr Thr Ala Pro Val Leu Asn
35 40 45
aat gtg aaa tat gat aca tct tct ttc aca ttg tca ggt gat tac gct 192
Asn Val Lys Tyr Asp Thr Ser Ser Phe Thr Leu Ser Gly Asp Tyr Ala
50 55 60
gat gca ggt gca ggc ttt act gac tac tca tat gca act gta act gtt 240
Asp Ala Gly Ala Gly Phe Thr Asp Tyr Ser Tyr Ala Thr Val Thr Val
65 70 75 80
aac gat cat gtc ttt ggc ttt aag tta aac gaa ggc gat aag tca aac 288
Asn Asp His Val Phe Gly Phe Lys Leu Asn Glu Gly Asp Lys Ser Asn
85 90 95
ttt gat aat gct aat aaa acc aag gga cac ttt gtc ttt gtt ttg act 336
Phe Asp Asn Ala Asn Lys Thr Lys Gly His Phe Val Phe Val Leu Thr
100 105 110
ccg gaa gaa caa gct gct tta act agc gct gct aac aag gtt acc gtt 384
Pro Glu Glu Gln Ala Ala Leu Thr Ser Ala Ala Asn Lys Val Thr Val
115 120 125
gcc ttt agt gat gtc gca gat aac act gca acg caa aca ttt aat gtt 432
Ala Phe Ser Asp Val Ala Asp Asn Thr Ala Thr Gln Thr Phe Asn Val
130 135 140
gca cct gta gca ggt cat aaa aag att gca gtt tgg aat gca att aat 480
Ala Pro Val Ala Gly His Lys Lys Ile Ala Val Trp Asn Ala Ile Asn
145 150 155 160
ggg tta cca ttc aat gaa aat tcc gat gat tat aat gtt ggt cgc aaa 528
Gly Leu Pro Phe Asn Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Asn Val Gly Arg Lys
165 170 175
gta ttt atg ctt cgt ggt ggt gct gaa cat gat ttc tat gtc aat ggt 576
Val Phe Met Leu Arg Gly Gly Ala Glu His Asp Phe Tyr Val Asn Gly
180 185 190
aag tgg gtt cag gtt gat caa ggt caa ttt gta ttg cca gtt agt gtt 624
Lys Trp Val Gln Val Asp Gln Gly Gln Phe Val Leu Pro Val Ser Val
195 200 205
gat gaa cag aat ttt gtt ttc agt tca gat caa gcg ggt aaa aat att 672
Asp Glu Gln Asn Phe Val Phe Ser Ser Asp Gln Ala Gly Lys Asn Ile
210 215 220
tta ggt aag ttc act act ttt act cct aaa gct caa ttc gca tgg caa 720
Leu Gly Lys Phe Thr Thr Phe Thr Pro Lys Ala Gln Phe Ala Trp Gln
225 230 235 240
cat gtt gat ggt gaa gaa aga tca ttt ggt gtc agt gtt tac tca gta 768
His Val Asp Gly Glu Glu Arg Ser Phe Gly Val Ser Val Tyr Ser Val
245 250 255
gaa ggc aag gat cca caa gat att gtt gtt caa gca tca gta ccc aag 816
Glu Gly Lys Asp Pro Gln Asp Ile Val Val Gln Ala Ser Val Pro Lys
260 265 270
ggt gac aat gtt aaa gct ttt gcg aag gac tac ttc act cat gaa gtt 864
Gly Asp Asn Val Lys Ala Phe Ala Lys Asp Tyr Phe Thr His Glu Val
275 280 285
tat acc ggt gag gtt cat gac ggt gta gct act ttc cac att cat acc 912
Tyr Thr Gly Glu Val His Asp Gly Val Ala Thr Phe His Ile His Thr
290 295 300
agt gtc aat aaa gac gct gca act ggc att aat tta aga gcc ctt ctt 960
Ser Val Asn Lys Asp Ala Ala Thr Gly Ile Asn Leu Arg Ala Leu Leu
305 310 315 320
caa ggt tgg gtt gaa att gat gga cca aca ttt aat gct aaa caa gta 1008
Gln Gly Trp Val Glu Ile Asp Gly Pro Thr Phe Asn Ala Lys Gln Val
325 330 335
acg gat cca tcg cca att aat gat gct aac tac ttg ggt gtg tac tac 1056
Thr Asp Pro Ser Pro Ile Asn Asp Ala Asn Tyr Leu Gly Val Tyr Tyr
340 345 350
aat cca aat gct gaa gag aga aag aat tat gat aat cgc gat gat ctt 1104
Asn Pro Asn Ala Glu Glu Arg Lys Asn Tyr Asp Asn Arg Asp Asp Leu
355 360 365
ggc gta gac ttt gaa gat gaa gca gct gac aca aac aca ttt ggc cca 1152
Gly Val Asp Phe Glu Asp Glu Ala Ala Asp Thr Asn Thr Phe Gly Pro
370 375 380
ggg aat tat tca agt gcg aaa gat gac gct aaa att cat ttc gac tac 1200
Gly Asn Tyr Ser Ser Ala Lys Asp Asp Ala Lys Ile His Phe Asp Tyr
385 390 395 400
ttg aat aat aat ggt att tct act ttg ggt aat aaa gca gta gaa aag 1248
Leu Asn Asn Asn Gly Ile Ser Thr Leu Gly Asn Lys Ala Val Glu Lys
405 410 415
ggt tat tac aat cca gca act cat aaa ttt act ttg act ggt cgg gtt 1296
Gly Tyr Tyr Asn Pro Ala Thr His Lys Phe Thr Leu Thr Gly Arg Val
420 425 430
aat cca gaa gtt att agc tta aca ttc tta gct gat agt ccg tat gaa 1344
Asn Pro Glu Val Ile Ser Leu Thr Phe Leu Ala Asp Ser Pro Tyr Glu
435 440 445
gtc gat cca gaa aat caa gct gat att cat gat aat ggt aaa ttc tct 1392
Val Asp Pro Glu Asn Gln Ala Asp Ile His Asp Asn Gly Lys Phe Ser
450 455 460
gta aca ttc aca att gat aat cca gca aca cgt caa tta tca tat ttc 1440
Val Thr Phe Thr Ile Asp Asn Pro Ala Thr Arg Gln Leu Ser Tyr Phe
465 470 475 480
ttt aag acg aat gat ggc aaa aca aca aga ggc tct ttg act tta att 1488
Phe Lys Thr Asn Asp Gly Lys Thr Thr Arg Gly Ser Leu Thr Leu Ile
485 490 495
ctt gac act gtt gat cca act ctt act gta gat caa tta ggc gac aag 1536
Leu Asp Thr Val Asp Pro Thr Leu Thr Val Asp Gln Leu Gly Asp Lys
500 505 510
gat gag gct gaa att act act aat aag cca acc ttt aag tta tcc ggt 1584
Asp Glu Ala Glu Ile Thr Thr Asn Lys Pro Thr Phe Lys Leu Ser Gly
515 520 525
gag gcc aac gat aac att gat ggt tac aat gta ttt atc aat ggt gat 1632
Glu Ala Asn Asp Asn Ile Asp Gly Tyr Asn Val Phe Ile Asn Gly Asp
530 535 540
aat gtt ttt ggg caa ttt ggt aat tcg ggt tat gat ttt ctg cca gga 1680
Asn Val Phe Gly Gln Phe Gly Asn Ser Gly Tyr Asp Phe Leu Pro Gly
545 550 555 560
atc tac aat gat tta aat caa aat act cca aat ttg tac gga tct tac 1728
Ile Tyr Asn Asp Leu Asn Gln Asn Thr Pro Asn Leu Tyr Gly Ser Tyr
565 570 575
aag ttt gat caa gaa gag caa ttg gat gat cag aat ggg caa cca aca 1776
Lys Phe Asp Gln Glu Glu Gln Leu Asp Asp Gln Asn Gly Gln Pro Thr
580 585 590
acc cat gtc ttt act att gca gta gag gac caa gct ggt aac aga gtt 1824
Thr His Val Phe Thr Ile Ala Val Glu Asp Gln Ala Gly Asn Arg Val
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gaa aag aag gtt act gtt cat tac gat cca aat tat ctt aca gaa ccg 1872
Glu Lys Lys Val Thr Val His Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Glu Pro
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ggt aat aca gga aaa aaa gat gat caa gca gat gta aaa ccg gca gaa 1920
Gly Asn Thr Gly Lys Lys Asp Asp Gln Ala Asp Val Lys Pro Ala Glu
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ggt caa aag caa gat aaa aat gac aac caa act gtt aac aat tca aaa 1968
Gly Gln Lys Gln Asp Lys Asn Asp Asn Gln Thr Val Asn Asn Ser Lys
645 650 655
gaa gat cca gag agt ggt caa act act gaa aat gct caa tct aca gaa 2016
Glu Asp Pro Glu Ser Gly Gln Thr Thr Glu Asn Ala Gln Ser Thr Glu
660 665 670
agt caa gag caa aat aag act gat gta act aaa cca gca gca aag cca 2064
Ser Gln Glu Gln Asn Lys Thr Asp Val Thr Lys Pro Ala Ala Lys Pro
675 680 685
agt aac gat gat caa aaa gaa aat cac aga gct ggt gaa tcg acc att 2112
Ser Asn Asp Asp Gln Lys Glu Asn His Arg Ala Gly Glu Ser Thr Ile
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gag tta aat caa gag aaa caa cta ggt caa agt aat gtc caa gcc caa 2160
Glu Leu Asn Gln Glu Lys Gln Leu Gly Gln Ser Asn Val Gln Ala Gln
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gat act aaa cca gat aaa aca gta gtt caa ggt aat gtt caa aat act 2208
Asp Thr Lys Pro Asp Lys Thr Val Val Gln Gly Asn Val Gln Asn Thr
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Ala Pro Thr Thr Gly His Leu Thr Asn Ser Ser Val Asn Val Gln Gln
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ttt aag act aag aaa gaa aca cta caa tta aag aag ttt aag tta tta 2304
Phe Lys Thr Lys Lys Glu Thr Leu Gln Leu Lys Lys Phe Lys Leu Leu
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Lys Asn Thr Tyr Gly Tyr Thr Leu Asn Gly Lys Ile Ala Lys Lys His
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ggt aaa aag tta ctc ttt aag aaa gga aaa acc gtc ctt gtt tgg aac 2400
Gly Lys Lys Leu Leu Phe Lys Lys Gly Lys Thr Val Leu Val Trp Asn
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aac agt aga gtt gtg act atc aag gga caa aag tac tac cgt gct act 2448
Asn Ser Arg Val Val Thr Ile Lys Gly Gln Lys Tyr Tyr Arg Ala Thr
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aag aat gta ttt gtt aaa gtt tca act atc aag cag gtt aaa gac ttg 2496
Lys Asn Val Phe Val Lys Val Ser Thr Ile Lys Gln Val Lys Asp Leu
820 825 830
aaa tta gtt tta acg aag aac tcc tac gtt tac aat aaa ttg ggc aaa 2544
Lys Leu Val Leu Thr Lys Asn Ser Tyr Val Tyr Asn Lys Leu Gly Lys
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cgc gtt aag tat aag agt caa agt ttg ctt aag gaa ggt aaa cat ctt 2592
Arg Val Lys Tyr Lys Ser Gln Ser Leu Leu Lys Glu Gly Lys His Leu
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Pro Glu Glu Gln Ala Ala Leu Thr Ser Ala Ala Asn Lys Val Thr Val
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Ala Pro Val Ala Gly His Lys Lys Ile Ala Val Trp Asn Ala Ile Asn
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Gly Leu Pro Phe Asn Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Asn Val Gly Arg Lys
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Asp Glu Gln Asn Phe Val Phe Ser Ser Asp Gln Ala Gly Lys Asn Ile
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Leu Gly Lys Phe Thr Thr Phe Thr Pro Lys Ala Gln Phe Ala Trp Gln
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His Val Asp Gly Glu Glu Arg Ser Phe Gly Val Ser Val Tyr Ser Val
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Glu Gly Lys Asp Pro Gln Asp Ile Val Val Gln Ala Ser Val Pro Lys
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Gly Asp Asn Val Lys Ala Phe Ala Lys Asp Tyr Phe Thr His Glu Val
275 280 285
Tyr Thr Gly Glu Val His Asp Gly Val Ala Thr Phe His Ile His Thr
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Gln Gly Trp Val Glu Ile Asp Gly Pro Thr Phe Asn Ala Lys Gln Val
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Thr Asp Pro Ser Pro Ile Asn Asp Ala Asn Tyr Leu Gly Val Tyr Tyr
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Gly Val Asp Phe Glu Asp Glu Ala Ala Asp Thr Asn Thr Phe Gly Pro
370 375 380
Gly Asn Tyr Ser Ser Ala Lys Asp Asp Ala Lys Ile His Phe Asp Tyr
385 390 395 400
Leu Asn Asn Asn Gly Ile Ser Thr Leu Gly Asn Lys Ala Val Glu Lys
405 410 415
Gly Tyr Tyr Asn Pro Ala Thr His Lys Phe Thr Leu Thr Gly Arg Val
420 425 430
Asn Pro Glu Val Ile Ser Leu Thr Phe Leu Ala Asp Ser Pro Tyr Glu
435 440 445
Val Asp Pro Glu Asn Gln Ala Asp Ile His Asp Asn Gly Lys Phe Ser
450 455 460
Val Thr Phe Thr Ile Asp Asn Pro Ala Thr Arg Gln Leu Ser Tyr Phe
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Phe Lys Thr Asn Asp Gly Lys Thr Thr Arg Gly Ser Leu Thr Leu Ile
485 490 495
Leu Asp Thr Val Asp Pro Thr Leu Thr Val Asp Gln Leu Gly Asp Lys
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515 520 525
Glu Ala Asn Asp Asn Ile Asp Gly Tyr Asn Val Phe Ile Asn Gly Asp
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Glu Ala Ala Thr Asn Asp Pro Gly Ala Ser Asp Val Gln Val Lys Val
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gta caa caa gat caa aaa caa gac caa aac agt act gct aac gca gct 192
Val Gln Gln Asp Gln Lys Gln Asp Gln Asn Ser Thr Ala Asn Ala Ala
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aca caa aat tca act gtg gtt tct ggt gat tcc acg act gcg aat tct 288
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Lys Thr Ser Gln Thr Ser Asn Ala Gln Thr Thr Ser Thr Thr Thr Asn
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Ser Val Asp Pro Asn Gln Glu Gln Gln Pro Ala Asn Gln Ala Asp His
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gtt aaa gga aat gtg cag tct gca tgg gat caa gga tat agg gga caa 432
Val Lys Gly Asn Val Gln Ser Ala Trp Asp Gln Gly Tyr Arg Gly Gln
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Gly Thr Val Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ala Asp Pro Thr His Lys
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Asp Phe Lys Thr Met Pro Glu Asp Pro Lys Leu Ser Glu Asp Asp Met
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Gln Ala Lys Ile Ala Lys Gln Gly Tyr Gly Lys Tyr Val Asn Glu Lys
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tcg gat gac acc aat gct aat gat tct cca cac ggt caa cac gtt tca 672
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gga atc att gca gct gat ggt aag cca gat gga aat aaa gaa tat gtc 720
Gly Ile Ile Ala Ala Asp Gly Lys Pro Asp Gly Asn Lys Glu Tyr Val
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gtt ggt gtt gct cct gaa gct caa ttg atg cag ctg aga gtt ttt gga 768
Val Gly Val Ala Pro Glu Ala Gln Leu Met Gln Leu Arg Val Phe Gly
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caa ttt tca gat gaa aaa act gat gat gtg gca aaa gca atc tac gat 816
Gln Phe Ser Asp Glu Lys Thr Asp Asp Val Ala Lys Ala Ile Tyr Asp
260 265 270
gct acc aat tta ggt gcg gat gtc atc caa atg tca tta gga caa ggt 864
Ala Thr Asn Leu Gly Ala Asp Val Ile Gln Met Ser Leu Gly Gln Gly
275 280 285
gtt gcc gat caa caa ttg acc aat att gag caa aaa gct gtt caa tat 912
Val Ala Asp Gln Gln Leu Thr Asn Ile Glu Gln Lys Ala Val Gln Tyr
290 295 300
gca att gat cac ggt gta ttt gta tca att tca gca tct aat aac ggt 960
Ala Ile Asp His Gly Val Phe Val Ser Ile Ser Ala Ser Asn Asn Gly
305 310 315 320
aat tca gct tca gtt gat aat cca agt aaa gtt aaa gat caa gga tat 1008
Asn Ser Ala Ser Val Asp Asn Pro Ser Lys Val Lys Asp Gln Gly Tyr
325 330 335
caa tct ggt agc caa gct ggt aac tat gaa cct ctt aat tta agt act 1056
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Gly Pro Ala Gln Asp Tyr Thr Leu Lys Pro AsP Leu Ser Ala Pro Gly
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gat gac ggc act agt tca gta tca ctt cat caa gtt ggt gaa agt act 1536
Asp Asp Gly Thr Ser Ser Val Ser Leu His Gln Val Gly Glu Ser Thr
500 505 510
aaa ttt acg tta acc ttc cat aat tta act gac caa agc cga act tat 1584
Lys Phe Thr Leu Thr Phe His Asn Leu Thr Asp Gln Ser Arg Thr Tyr
515 520 525
act ttc gat gat tat ggt gga ggt tac act gaa caa aga gat aca acc 1632
Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Gly Gly Tyr Thr Glu Gln Arg Asp Thr Thr
530 535 540
acc ggc gtt ttt cat gat gtt caa tta gct ggt gct aga gta aat ggt 1680
Thr Gly Val Phe His Asp Val Gln Leu Ala Gly Ala Arg Val Asn Gly
545 550 555 560
gaa cat agt ttt act tta gct cct aaa gaa gaa cgt caa gtt agc tat 1728
Glu His Ser Phe Thr Leu Ala Pro Lys Glu Glu Arg Gln Val Ser Tyr
565 570 575
tca tta gac ttg acc ggc tta aag aag aac caa tta gtt gaa gga ttt 1776
Ser Leu Asp Leu Thr Gly Leu Lys Lys Asn Gln Leu Val Glu Gly Phe
580 585 590
tta cgc ttt act aat gcc aat aat gca tct acg gtt tct gtt cct tac 1824
Leu Arg Phe Thr Asn Ala Asn Asn Ala Ser Thr Val Ser Val Pro Tyr
595 600 605
tta gct tat tat ggg gac tta act agt gaa aac gtc ttt gat caa aat 1872
Leu Ala Tyr Tyr Gly Asp Leu Thr Ser Glu Asn Val Phe Asp Gln Asn
610 615 620
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Ala Asn Glu Glu His Leu Asp Ile Gln Gly Asn Arg Leu Val Asn Glu
625 630 635 640
caa aac tat cct cgt ggt att gca gat caa gaa tca ttg aag gaa ctt 1968
Gln Asn Tyr Pro Arg Gly Ile Ala Asp Gln Glu Ser Leu Lys Glu Leu
645 650 655
gta aat gtt gat gga aac tat aat tgg caa gaa gta gcc aaa tta tat 2016
Val Asn Val Asp Gly Asn Tyr Asn Trp Gln Glu Val Ala Lys Leu Tyr
660 665 670
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Glu Ser Gly Lys Val Ala Phe Ser Pro Asn Asp Asn Gln Lys Ser Asp
675 680 685
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Leu Leu Lys Pro Tyr Val Tyr Leu Lys Gln Asn Val Lys Asp Leu Lys
690 695 700
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Val Glu Ile Leu Asp Ala Gln Gly Asn Val Val Arg Val Val Ser Asp
705 710 715 720
gtt caa ggc gta gat aaa tct tac gat gaa aat ggt gta act aaa gat 2208
Val Gln Gly Val Asp Lys Ser Tyr Asp Glu Asn Gly Val Thr Lys Asp
725 730 735
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Thr Ser Leu Ser Val Ser Met Arg Asp Asn Pro Asp Ala Leu Glu Trp
740 745 750
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Asp Gly Lys Val Tyr Asn Ser Lys Thr Gly Lys Met Glu Thr Ala Lys
755 760 765
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Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Arg Leu Val Ala Thr Leu Trp Asn Lys Gly
770 775 780
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785 790 795 800
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Ala Pro Thr Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asp Ala Ala Ser His Thr Leu
805 810 815
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820 825 830
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Ala Thr Val Thr Val Asn Asp Lys Val Phe Gly Tyr Lys Leu Ser Asp
835 840 845
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Gly Gly Ser Gly Phe Asp Asn Ala Glu Lys Thr Lys Gly His Phe Ser
850 855 860
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Phe Val Leu Gly Gln Asp Ala Leu Ser Ala Leu Thr Ala Ala Ala Asn
865 870 875 880
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Lys Val Thr Val Ala Leu Ser Asp Val Ala Asp Asn Thr Ser Leu Ala
885 890 895
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Thr Val Asn Val Ala Gly Asp His Asp Ser Glu Thr Gly Val Ser Val
900 905 910
tgg aat gct gtc aat ggt tta gcc ttt gat caa aaa tca cca aac tat 2784
Trp Asn Ala Val Asn Gly Leu Ala Phe Asp Gln Lys Ser Pro Asn Tyr
915 920 925
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Asp Ala Ala Thr Lys Thr Tyr Thr Leu Val Gly Gly Ala Asn His Asp
930 935 940
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Phe Tyr Leu Asn Gly Lys Leu Val Gln Val Gln Asp Gly Lys Tyr Gln
945 950 955 960
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Val Pro Val Ser Val Asn Thr Thr Lys Phe Val Phe Ser Thr Asp Pro
965 970 975
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Glu Gly Gln His Val Leu Lys Asp Leu Ser Thr Val Thr Ala Lys Ala
980 985 990
ttc ttt aat tgg caa aag act gat aca ttt gat gga aac ttt ggt gta 3024
Phe Phe Asn Trp Gln Lys Thr Asp Thr Phe Asp Gly Asn Phe Gly Val
995 1000 1005
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Thr Ile Ser Ser Val Lys Thr Asn Asn Pro Asn Asp Thr Val Val
1010 1015 1020
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Gln Ala Val Val Thr Lys Gly Lys Asn Val Lys Ala Tyr Ala Met
1025 1030 1035
gat tac ttt act ggg gaa gtt tat acc ggt gaa gta aaa gac gga 3159
Asp Tyr Phe Thr Gly Glu Val Tyr Thr Gly Glu Val Lys Asp Gly
1040 1045 1050
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Ile Ala Thr Phe His Val His Thr Ser Ile Asn Lys Asp Ala Thr
1055 1060 1065
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Thr Gly Val Tyr Arg Arg Ala Leu Leu Thr Gly Trp Thr Glu Val
1070 1075 1080
gat gga cca tcc ttt aat gat aaa caa gaa aca tct aga gat ggt 3294
Asp Gly Pro Ser Phe Asn Asp Lys Gln Glu Thr Ser Arg Asp Gly
1085 1090 1095
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Val Ser Ser Ser Asn His Leu Gly Val Phe Tyr Phe Ala Asp Ala
1100 1105 1110
gct aat cgc cca gtt tat aca gat aga aat gcc ttg gga gta gaa 3384
Ala Asn Arg Pro Val Tyr Thr Asp Arg Asn Ala Leu Gly Val Glu
1115 1120 1125
gct aaa gat gaa gct gca aag tta gat tca ttt tgc cca ggt gca 3429
Ala Lys Asp Glu Ala Ala Lys Leu Asp Ser Phe Cys Pro Gly Ala
1130 1135 1140
tac cca gga cac gca cca tca gct ctg aca acc aga acg gat cct 3474
Tyr Pro Gly His Ala Pro Ser Ala Leu Thr Thr Arg Thr Asp Pro
1145 1150 1155
aat cca gat att cat ttt gat tat atg aat gac aac gat act act 3519
Asn Pro Asp Ile His Phe Asp Tyr Met Asn Asp Asn Asp Thr Thr
1160 1165 1170
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Arg Phe Gly Gln Asn Ala Val Thr His Gly Tyr Tyr Asp Pro Ser
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Thr Gln Lys Phe Thr Val Thr Gly Lys Val Asp Asp Asn Val Val
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tct cta act gtg tta ggc gat aac tca aat gaa aat gct cct gaa 3654
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aca gct aac aga aca ggg caa cgt cca att gca tat att tac aaa 3744
Thr Ala Asn Arg Thr Gly Gln Arg Pro Ile Ala Tyr Ile Tyr Lys
1235 1240 1245
gct aaa gat gga caa aga gtt cgt ggt acc ttg aat ctt att ctt 3789
Ala Lys Asp Gly Gln Arg Val Arg Gly Thr Leu Asn Leu Ile Leu
1250 1255 1260
gat act gtt gct cct agc ttg gaa gta aat cag gtt aat ggg gat 3834
Asp Thr Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Asn Gln Val Asn Gly Asp
1265 1270 1275
gaa tta gag ctt tgg act aat aat cca aaa ttc act ctg tcc gga 3879
Glu Leu Glu Leu Trp Thr Asn Asn Pro Lys Phe Thr Leu Ser Gly
1280 1285 1290
aag gta aat gat aat ctt gat gga tat agg tta ttc gtt aat ggt 3924
Lys Val Asn Asp Asn Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Phe Val Asn Gly
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aat aat att tat cga gaa ttc cta aac tct ggt tat aat cag gtt 3969
Asn Asn Ile Tyr Arg Glu Phe Leu Asn Ser Gly Tyr Asn Gln Val
1310 1315 1320
gca gga ttg aat acg gat act gag ttt act aat cca tat gga gct 4014
Ala Gly Leu Asn Thr Asp Thr Glu Phe Thr Asn Pro Tyr Gly Ala
1325 1330 1335
cat gat ttt gaa gag gtt gaa aac tta aat gac aat aat gat caa 4059
His Asp Phe Glu Glu Val Glu Asn Leu Asn Asp Asn Asn Asp Gln
1340 1345 1350
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Pro Thr Thr His Val Phe Thr Val Tyr Val Val Asp Gln Val Gly
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Asn Lys Val Glu Lys Lys Leu Thr Val His Phe Asp Pro Asn Tyr
1370 1375 1380
gtt gct cca gaa gaa gta cca aat act gat act tca tat act tta 4194
Val Ala Pro Glu Glu Val Pro Asn Thr Asp Thr Ser Tyr Thr Leu
1385 1390 1395
gag aat cca tta agt act aca act gta gaa aac cca gtt act gat 4239
Glu Asn Pro Leu Ser Thr Thr Thr yal Glu Asn Pro Val Thr Asp
1400 1405 1410
gtt tct acg gtt caa cct aag ggt gaa act tta act ggt aag tca 4284
Val Ser Thr Val Gln Pro Lys Gly Glu Thr Leu Thr Gly Lys Ser
1415 1420 1425
ttc aac tta tta cac gat gct tat atc tac aac aaa gat ggt caa 4329
Phe Asn Leu Leu His Asp Ala Tyr Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Gln
1430 1435 1440
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Val Val Leu Ser Thr Asp Thr Asn Lys Ser Ser Leu Leu Lys Lys
1445 1450 1455
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Gly Gln Arg Ile Thr Ala Leu Asp Asn Gly Lys Thr Val Val Ile
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Asn Gly Val Gln Tyr Tyr Arg Val Gly Asp Asn Gln Phe Val Lys
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Val Thr Asn Thr Ile Leu Gln Ala Gly Lys Arg Leu Gln Leu Lys
1490 1495 1500
cat aat gca cac ctt tat gat aag aac ggt aaa gtt gtt aaa aga 4554
His Asn Ala His Leu Tyr Asp Lys Asn Gly Lys Val Val Lys Arg
1505 1510 1515
aat ggc aaa cct gtc ttg tta aga aag ggt aga tgg atc agt gct 4599
Asn Gly Lys Pro Val Leu Leu Arg Lys Gly Arg Trp Ile Ser Ala
1520 1525 1530
ttg aac aac gcc gat aag tat gta atc aat ggc aag acc ttc tac 4644
Leu Asn Asn Ala Asp Lys Tyr Val Ile Asn Gly Lys Thr Phe Tyr
1535 1540 1545
aag tta gct aat ggt gaa ttt gtg aag gtg gca aac act aaa ctt 4689
Lys Leu Ala Asn Gly Glu Phe Val Lys Val Ala Asn Thr Lys Leu
1550 1555 1560
caa aag cct aaa gct ttg aag ctt aca cac aat gca ttt gtt tac 4734
Gln Lys Pro Lys Ala Leu Lys Leu Thr His Asn Ala Phe Val Tyr
1565 1570 1575
gat gaa aat ggt aag cgt gta aag aag agt aaa gtt tta aag aaa 4779
Asp Glu Asn Gly Lys Arg Val Lys Lys Ser Lys Val Leu Lys Lys
1580 1585 1590
ggc caa acg att tta gca gaa aat aat gca gaa aaa ttc cat atc 4824
Gly Gln Thr Ile Leu Ala Glu Asn Asn Ala Glu Lys Phe His Ile
1595 1600 1605
aaa ggt aag gct tac tat aaa gtt aat ggt cat ttt gta aaa gtt 4869
Lys Gly Lys Ala Tyr Tyr Lys Val Asn Gly His Phe Val Lys Val
1610 1615 1620
gca aat act ttg 4881
Ala Asn Thr Leu
1625
<210>6
<211>1627
<212>PRT
<213>纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)
<400>6
Met Leu Leu Val Phe Gln Lys Leu Gln Leu Trp Val Ala Ala Ala Ile
1 5 10 15
Ile Ala Leu Ala Ser Gly Ser Thr Val Phe Leu Ser Gln Asn Thr Ala
20 25 30
Glu Ala Ala Thr Asn Asp Pro Gly Ala Ser Asp Val Gln Val Lys Val
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Val Gln Gln Asp Gln Lys Gln Asp Gln Asn Ser Thr Ala Asn Ala Ala
50 55 60
Val Ser Asn Ser Asp Ser Ala Lys Thr Gln Thr Asn Ala Thr Asp Gln
65 70 75 80
Thr Gln Asn Ser Thr Val Val Ser Gly Asp Ser Thr Thr Ala Asn Ser
85 90 95
Lys Thr Ser Gln Thr Ser Asn Ala Gln Thr Thr Ser Thr Thr Thr Asn
100 105 110
Ser Val Asp Pro Asn Gln Glu Gln Gln Pro Ala Asn Gln Ala Asp His
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Val Lys Gly Asn Val Gln Ser Ala Trp Asp Gln Gly Tyr Arg Gly Gln
130 135 140
Gly Thr Val Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ala Asp Pro Thr His Lys
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Asp Phe Lys Thr Met Pro Glu Asp Pro Lys Leu Ser Glu Asp Asp Met
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Gly Ile Ile Ala Ala Asp Gly Lys Pro Asp Gly Asn Lys Glu Tyr Val
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260 265 270
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275 280 285
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325 330 335
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385 390 395 400
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435 440 445
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Gly Gly Tyr Thr Glu Gln Arg Asp Thr Thr
530 535 540
Thr Gly Val Phe His Asp Val Gln Leu Ala Gly Ala Arg Val Asn Gly
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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705 710 715 720
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980 985 990
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1550 1555 1560
Gln Lys Pro Lys Ala Leu Lys Leu Thr His Asn Ala Phe Val Tyr
1565 1570 1575
Asp Glu Asn Gly Lys Arg Val Lys Lys Ser Lys Val Leu Lys Lys
1580 1585 1590
Gly Gln Thr Ile Leu Ala Glu Asn Asn Ala Glu Lys Phe His Ile
1595 1600 1605
Lys Gly Lys Ala Tyr Tyr Lys Val Asn Gly His Phe Val Lys Val
1610 1615 1620
Ala Asn Thr Leu
1625
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<220>
<221>CDS
<222>(1)...(5358)
<223>
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atg aat aaa tct gat tta aaa gaa gcg aat cag ttt aaa tat gtc tac 48
Met Asn Lys Ser Asp Leu Lys Glu Ala Asn Gln Phe Lys Tyr Val Tyr
1 5 10 15
caa agt gga caa aag ctg aac gca gtc cac aat caa aaa agt tca cgc 96
Gln Ser Gly Gln Lys Leu Asn Ala Val His Asn Gln Lys Ser Ser Arg
20 25 30
ttt tta agt aag tta cat aag aaa tgg gct gga gca aca att gtt gcc 144
Phe Leu Ser Lys Leu His Lys Lys Trp Ala Gly Ala Thr Ile Val Ala
35 40 45
tta gct tca agt acc gtt ctc ttg ttc tca agt cat aat gtt aaa gct 192
Leu Ala Ser Ser Thr Val Leu Leu Phe Ser Ser His Asn Val Lys Ala
50 55 60
gat gct caa gca cca agc gat gat aag caa cca gat cct gtt gta caa 240
Asp Ala Gln Ala Pro Ser Asp Asp Lys Gln Pro Asp Pro Val Val Gln
65 70 75 80
aag agt gaa caa agt caa ggt caa act ttg caa gct gtt caa cgt aaa 288
Lys Ser Glu Gln Ser Gln Gly Gln Thr Leu Gln Ala Val Gln Arg Lys
85 90 95
gac gat gca gta cca tct gat gca tac caa caa tct gca gct gta caa 336
Asp Asp Ala yal Pro Ser Asp Ala Tyr Gln Gln Ser Ala Ala Val Gln
100 105 110
gct aat aac aat aat gat caa caa gct caa gac aat aaa caa gct agt 384
Ala Asn Asn Asn Asn Asp Gln Gln Ala Gln Asp Asn Lys Gln Ala Ser
115 120 125
caa cca act agt cca gtg gca caa gct caa ccg gct caa caa caa aaa 432
Gln Pro Thr Ser Pro Val Ala Gln Ala Gln Pro Ala Gln Gln Gln Lys
130 135 140
gca aag gat gtt gtt cca agt aag cca caa cct caa cca caa ccg gct 480
Ala Lys Asp Val Val Pro Ser Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Ala
145 150 155 160
aag caa act act aat ggt caa act gaa gat gaa gat ggt caa aag gat 528
Lys Gln Thr Thr Asn Gly Gln Thr Glu Asp Glu Asp Gly Gln Lys Asp
165 170 175
aag aat ggt gtt caa tta cca gct aat aat caa gac cat gta aaa ggt 576
Lys Asn Gly Val Gln Leu Pro Ala Asn Asn Gln Asp His Val Lys Gly
180 185 190
aat gtt caa tcc gct tgg gat caa ggc tac cgc ggt gaa cat act gtt 624
Asn Val Gln Ser Ala Trp Asp Gln Gly Tyr Arg Gly Glu His Thr Val
195 200 205
gta gca gtt att gac tct ggg gta gat gtt cat cat aaa gat ttc tta 672
Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Val Asp Val His His Lys Asp Phe Leu
210 215 220
acc atg cct aag aat cct aaa tta act gct gat caa atg aaa cgt ttg 720
Thr Met Pro Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Asp Gln Met Lys Arg Leu
225 230 235 240
att aag aga tta ggt tat ggt cgt tat gta aat gaa aaa ttc cca ttt 768
Ile Lys Arg Leu Gly Tyr Gly Arg Tyr Val Asn Glu Lys Phe Pro Phe
245 250 255
gct tat aat tat gtt gat aat gaa aat gat cat tta aag gct cca aat 816
Ala Tyr Asn Tyr Val Asp Asn Glu Asn Asp His Leu Lys Ala Pro Asn
260 265 270
ggt gag cct cac gga caa cac gtt tcc ggt att att gct gct gat ggt 864
Gly Glu Pro His Gly Gln His Val Ser Gly Ile Ile Ala Ala Asp Gly
275 280 285
cat cca gat ggt gat aat act tat gtt gtg ggt gtt gct cct gaa gca 912
His Pro Asp Gly Asp Asn Thr Tyr Val Val Gly Val Ala Pro Glu Ala
290 295 300
caa tta atg caa ttg aaa gta ttt ggc gat aac tca act tct ctt gat 960
Gln Leu Met Gln Leu Lys Val Phe Gly Asp Asn Ser Thr Ser Leu Asp
305 310 315 320
atg gcc aaa gaa att tgc gat gct gtt aac ttg ggt gcc gat gtt atc 1008
Met Ala Lys Glu Ile Cys Asp Ala Val Asn Leu Gly Ala Asp Val Ile
325 330 335
aat atg tca tta ggt ggt ggt gtt tct gct gct gac ctc aac att cag 1056
Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Val Ser Ala Ala Asp Leu Asn Ile Gln
340 345 350
gat caa aga gca gtt caa tat gct gtt gat cat ggg gtt gtc gtt gtc 1104
Asp Gln Arg Ala Val Gln Tyr Ala Val Asp His Gly Val Val Val Val
355 360 365
att tca gct gct aat aat ggt aat gca gct tct gtt gat aat cca act 1152
Ile Ser Ala Ala Asn Asn Gly Asn Ala Ala Ser Val Asp Asn Pro Thr
370 375 380
cac tta aca gat tta gat aac tac caa gca ggt ggt aac gct ggt aac 1200
His Leu Thr Asp Leu Asp Asn Tyr Gln Ala Gly Gly Asn Ala Gly Asn
385 390 395 400
tat aat cca ttt agt tca agt act gta gct aac cca ggt gct gcc aga 1248
Tyr Asn Pro Phe Ser Ser Ser Thr Val Ala Asn Pro Gly Ala Ala Arg
405 410 415
agt gcg atc aca gta gca gct gaa act tct ggt act ggt aaa gat agc 1296
Ser Ala Ile Thr Val Ala Ala Glu Thr Ser Gly Thr Gly Lys Asp Ser
420 425 430
gat atg gcc ttc ttt agt tct tgg ggt cca tta cct gat ttc act tta 1344
Asp Met Ala Phe Phe Ser Ser Trp Gly Pro Leu Pro Asp Phe Thr Leu
435 440 445
aag cca gat gtt tcg gcc cca ggt tat gat gtc att tca acc gct aac 1392
Lys Pro Asp Val Ser Ala Pro Gly Tyr Asp Val Ile Ser Thr Ala Asn
450 455 460
ggc aat tca tac acg caa atg agc ggt act tca atg gct agt cca ttc 1440
Gly Asn Ser Tyr Thr Gln Met Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro Phe
465 470 475 480
gtg gct ggt gct gca gct ctt gtg aga gaa aga tta tta aag acc aat 1488
Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Val Arg Glu Arg Leu Leu Lys Thr Asn
485 490 495
cct aag tta aag ggt gct gct tta gtt gaa gcc atc aaa gct ttg tta 1536
Pro Lys Leu Lys Gly Ala Ala Leu Val Glu Ala Ile Lys Ala Leu Leu
500 505 510
act aat acg gct gat cca caa gtt caa aat ggc tac aac act ttg gtc 1584
Thr Asn Thr Ala Asp Pro Gln Val Gln Asn Gly Tyr Asn Thr Leu Val
515 520 525
tca cca aga aga caa ggt gct ggt caa att aat gtt ggt gcc gca act 1632
Ser Pro Arg Arg Gln Gly Ala Gly Gln Ile Asn Val Gly Ala Ala Thr
530 535 540
aaa tct ccg gtt tat gtt act act gct gac gga act ggt gcc tta agc 1680
Lys Ser Pro Val Tyr Val Thr Thr Ala Asp Gly Thr Gly Ala Leu Ser
545 550 555 560
tta cgc caa gtt ggc aat tcg acc act ttt gtc ttg aac ttg cat aac 1728
Leu Arg Gln Val Gly Asn Ser Thr Thr Phe Val Leu Asn Leu His Asn
565 570 575
tta tca aat gaa gaa caa gaa tat aat ttt gat gac ttc ggc ggt ggc 1776
Leu Ser Asn Glu Glu Gln Glu Tyr Asn Phe Asp Asp Phe Gly Gly Gly
580 585 590
ttt act gaa ctt agg aat aag gct aac ggt gtc ttc cat gat gtt caa 1824
Phe Thr Glu Leu Arg Asn Lys Ala Asn Gly Val Phe His Asp Val Gln
595 600 605
tta gct ggt gct aga gtt aac ggt gac aat gtt gtt gtc tta aag cca 1872
Leu Ala Gly Ala Arg Val Asn Gly Asp Asn Val Val Val Leu Lys Pro
610 615 620
aat gaa act aaa caa gtt acc tat act ttg aat tta act agc att aaa 1920
Asn Glu Thr Lys Gln Val Thr Tyr Thr Leu Asn Leu Thr Ser Ile Lys
625 630 635 640
aag aat caa tta gtt gaa ggt ttc ttg aga ttt act aac tcc aag gat 1968
Lys Asn Gln Leu Val Glu Gly Phe Leu Arg Phe Thr Asn Ser Lys Asp
645 650 655
aaa tca acc tta gtt gta cct tac ttg tca tac tat ggc gat atg act 2016
Lys Ser Thr Leu Val Val Pro Tyr Leu Ser Tyr Tyr Gly Asp Met Thr
660 665 670
aag gaa aat gtc ttt gac caa aat gct aat gat cct aag cct gat att 2064
Lys Glu Asn Val Phe Asp Gln Asn Ala Asn Asp Pro Lys Pro Asp Ile
675 680 685
caa ggt aat cgt tta gtt aac gaa gat aat tat cct cgt ggt att gct 2112
Gln Gly Asn Arg Leu Val Asn Glu Asp Asn Tyr Pro Arg Gly Ile Ala
690 695 700
gac gaa aat tca tta aaa gaa tta gtc aat gtt gac ggt aat tat aac 2160
Asp Glu Asn Ser Leu Lys Glu Leu Val Asn Val Asp Gly Asn Tyr Asn
705 710 715 720
tgg caa gaa gtt gct aag tta tat gag agt ggt aaa gtt gcc ttc tca 2208
Trp Gln Glu Val Ala Lys Leu Tyr Glu Ser Gly Lys Val Ala Phe Ser
725 730 735
cca aat ggt gat cat aag agt gac tta att aag cca tac gct tac ttg 2256
Pro Asn Gly Asp His Lys Ser Asp Leu Ile Lys Pro Tyr Ala Tyr Leu
740 745 750
aaa caa aat gtc aag gac ttg aag gtt gag att ctt gat ggt tca ggt 2304
Lys Gln Asn Val Lys Asp Leu Lys Val Glu Ile Leu Asp Gly Ser Gly
755 760 765
aaa gtt gtt cgt gtc ctt gct gat tct cgt ggc gtt gaa aag tca tac 2352
Lys Val Val Arg Val Leu Ala Asp Ser Arg Gly Val Glu Lys Ser Tyr
770 775 780
cat tca gac ggt gat ggt gca aca gtt gac ctt gat aat ggt gca act 2400
His Ser Asp Gly Asp Gly Ala Thr Val Asp Leu Asp Asn Gly Ala Thr
785 790 795 800
aac tct gat gtc ttc gac tgg gat ggt aaa tta tat gat gct aag act 2448
Asn Ser Asp Val Phe Asp Trp Asp Gly Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Thr
805 810 815
ggt aag atg gtt gcc gct cca gat ggc aat tac act tac cgc ttc atc 2496
Gly Lys Met Val Ala Ala Pro Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Arg Phe Ile
820 825 830
gca act ttg tat aac gat ggc cca caa aaa gtt caa act aat gat acc 2544
Ala Thr Leu Tyr Asn Asp Gly Pro Gln Lys Val Gln Thr Asn Asp Thr
835 840 845
cca gtt atc atc gat acc act gct cct gtt tta agc gat gtt cac tac 2592
Pro Val Ile Ile Asp Thr Thr Ala Pro Val Leu Ser Asp Val His Tyr
850 855 860
aac cgc aga agt aat aca att act ggt agt tac gct gat aag ggt gct 2640
Asn Arg Arg Ser Asn Thr Ile Thr Gly Ser Tyr Ala Asp Lys Gly Ala
865 870 875 880
ggc ttt act gac tac tca tac gct aca gta act att aat gat cat gca 2688
Gly Phe Thr Asp Tyr Ser Tyr Ala Thr Val Thr Ile Asn Asp His Ala
885 890 895
ttt ggt ttc aag ttg aat gat ggc aag aac tct ggt ttc gat gat gct 2736
Phe Gly Phe Lys Leu Asn Asp Gly Lys Asn Ser Gly Phe Asp Asp Ala
900 905 910
aac aag aca aaa ggt cac ttc agt ttc aag tta act ggg gat gaa ctt 2784
Asn Lys Thr Lys Gly His Phe Ser Phe Lys Leu Thr Gly Asp Glu Leu
915 920 925
aaa gca tta act agt gca gat aac cta gtt tca gta gct ttc agt gac 2832
Lys Ala Leu Thr Ser Ala Asp Asn Leu Val Ser Val Ala Phe Ser Asp
930 935 940
gtt gca gat aac aca gtt gta aag agc ttg aaa ctt gat ggt agt ttt 2880
Val Ala Asp Asn Thr Val Val Lys Ser Leu Lys Leu Asp Gly Ser Phe
945 950 955 960
gat caa cca ggc gtt tca att tgg aat gca act aat ggt tta cca ttt 2928
Asp Gln Pro Gly Val Ser Ile Trp Asn Ala Thr Asn Gly Leu Pro Phe
965 970 975
aat gaa aac tca gct gac tat gac aag gct gct aac acc ttc aac tta 2976
Asn Glu Asn Ser Ala Asp Tyr Asp Lys Ala Ala Asn Thr Phe Asn Leu
980 985 990
cgt ggt agt gct agt gat gac ttc tac ctt aat ggt aag tgg gtt caa 3024
Arg Gly Ser Ala Ser Asp Asp Phe Tyr Leu Asn Gly Lys Trp Val Gln
995 1000 1005
ctt gat gac aat ggt caa ttc gtt gtc cca gtt agt gcg caa gga 3069
Leu Asp Asp Asn Gly Gln Phe Val Val Pro Val Ser Ala Gln Gly
1010 1015 1020
gaa caa gat tta gtc ttc agt tct gat gat ggt ggt aaa gat gtc 3114
Glu Gln Asp Leu Val Phe Ser Ser Asp Asp Gly Gly Lys Asp Val
1025 1030 1035
ctt act acc ttt aga aat tac aca cca aag gct aaa ttt gca tgg 3159
Leu Thr Thr Phe Arg Asn Tyr Thr Pro Lys Ala Lys Phe Ala Trp
1040 1045 1050
caa cat gta gat ggt caa gat gaa cac ttt ggc cca gca att tac 3204
Gln His Val Asp Gly Gln Asp Glu His Phe Gly Pro Ala Ile Tyr
1055 1060 1065
tca atc ttt ggt agt aac cca gat gat att gtt gtt caa gct gca 3249
Ser Ile Phe Gly Ser Asn Pro Asp Asp Ile Val Val Gln Ala Ala
1070 1075 1080
gtt act aag ggt gat aac gtt aag gcc ttt gct aag gat tac ttc 3294
Val Thr Lys Gly Asp Asn Val Lys Ala Phe Ala Lys Asp Tyr Phe
1085 1090 1095
act ggt caa att tat act ggt gtt gta aaa gat ggg gtt gcc aca 3339
Thr Gly Gln Ile Tyr Thr Gly Val Val Lys Asp Gly Val Ala Thr
1100 1105 1110
ttc cac gtt aag aca agt att aac aaa gat cca aag act aat atc 3384
Phe His Val Lys Thr Ser Ile Asn Lys Asp Pro Lys Thr Asn Ile
1115 1120 1125
ttt gct cgt gcc tta tta caa ggt tgg act gaa gtt gat gga cca 3429
Phe Ala Arg Ala Leu Leu Gln Gly Trp Thr Glu Val Asp Gly Pro
1130 1135 1140
acc ttt aat gat aag caa aag act gat cca act gct att aag gat 3474
Thr Phe Asn Asp Lys Gln Lys Thr Asp Pro Thr Ala Ile Lys Asp
1145 1150 1155
gct aac tac atc ggt gtc tac tat gat aaa gat gct gta gct cat 3519
Ala Asn Tyr Ile Gly Val Tyr Tyr Asp Lys Asp Ala Val Ala His
1160 1165 1170
gta tac act aat cgt gat gat tta ggt gta gta atg acg gat gaa 3564
Val Tyr Thr Asn Arg Asp Asp Leu Gly Val Val Met Thr Asp Glu
1175 1180 1185
gtg gca gat cca aag gac ttc ggc cca ggt cta tat cca ggt cat 3609
Val Ala Asp Pro Lys Asp Phe Gly Pro Gly Leu Tyr Pro Gly His
1190 1195 1200
tct gct cca agt gca cat aat cca cat atc aag ttt gat tac ttg 3654
Ser Ala Pro Ser Ala His Asn Pro His Ile Lys Phe Asp Tyr Leu
1205 1210 1215
gat gat aat aat gta gct agt gtt ggt gca gaa gcc gtt aag aag 3699
Asp Asp Asn Asn Val Ala Ser Val Gly Ala Glu Ala Val Lys Lys
1220 1225 1230
ggc tac tac aac cca aga aca cat gag ttt acg cta act ggc caa 3744
Gly Tyr Tyr Asn Pro Arg Thr His Glu Phe Thr Leu Thr Gly Gln
1235 1240 1245
gtt gat gct aat gta atc agt tta acc ttc tta gca gct agt cca 3789
Val Asp Ala Asn Val Ile Ser Leu Thr Phe Leu Ala Ala Ser Pro
1250 1255 1260
tat gaa gaa gct gca gaa aat caa gct gat att agc caa aat ggt 3834
Tyr Glu Glu Ala Ala Glu Asn Gln Ala Asp Ile Ser Gln Asn Gly
1265 1270 1275
aag ttt aag ttt agc ttc aag att cca aat gct ggt aca aga gaa 3879
Lys Phe Lys Phe Ser Phe Lys Ile Pro Asn Ala Gly Thr Arg Glu
1280 1285 1290
tta tca tac ttg tac atg act tct gac ggt aaa gta aca cgt ggt 3924
Leu Ser Tyr Leu Tyr Met Thr Ser Asp Gly Lys Val Thr Arg Gly
1295 1300 1305
tct ttg aca ctt atc tta gat act gtt ttg cct act tta cat gtt 3969
Ser Leu Thr Leu Ile Leu Asp Thr Val Leu Pro Thr Leu His Val
1310 1315 1320
gat caa atg cca gca aat cgt gca gaa gtt gaa tac act acc agc 4014
Asp Gln Met Pro Ala Asn Arg Ala Glu Val Glu Tyr Thr Thr Ser
1325 1330 1335
aat cca acc ttt acc ctt tct ggt gta gct aat gat aac tta gat 4059
Asn Pro Thr Phe Thr Leu Ser Gly Val Ala Asn Asp Asn Leu Asp
1340 1345 1350
gct tac agt gtc tac atc aat ggt gat aac gtc ttt agt caa ttt 4104
Ala Tyr Ser Val Tyr Ile Asn Gly Asp Asn Val Phe Ser Gln Phe
1355 1360 1365
ggc aat tct ggc tac aac ttc att cca ggt ttg tac aat gat cca 4149
Gly Asn Ser Gly Tyr Asn Phe Ile Pro Gly Leu Tyr Asn Asp Pro
1370 1375 1380
aag caa aag aca cct aat act tat ggt cca tat aac ttt aat gtt 4194
Lys Gln Lys Thr Pro Asn Thr Tyr Gly Pro Tyr Asn Phe Asn Val
1385 1390 1395
aag gaa gct ttg gat gat gaa aat agt caa cca act act cac gtc 4239
Lys Glu Ala Leu Asp Asp Glu Asn Ser Gln Pro Thr Thr His Val
1400 1405 1410
ttt gtt gtt gca att gtt gat gct gta ggg aac cgc gtt gaa aag 4284
Phe Val Val Ala Ile Val Asp Ala Val Gly Asn Arg Val Glu Lys
1415 1420 1425
aga tta gtt gtt cac tat gat cca aac ttt ggt aag acc gca gct 4329
Arg Leu Val Val His Tyr Asp Pro Asn Phe Gly Lys Thr Ala Ala
1430 1435 1440
aaa cca gaa gat aat aaa ggc gag ggt aat aaa caa caa tct act 4374
Lys Pro Glu Asp Asn Lys Gly Glu Gly Asn Lys Gln Gln Ser Thr
1445 1450 1455
agt cct gct gaa cca gtg aag gta cca gct ggt caa tca agt cag 4419
Ser Pro Ala Glu Pro Val Lys Val Pro Ala Gly Gln Ser Ser Gln
1460 1465 1470
cca aaa caa cca act gct cca gtt caa tca tca act ggt aag aag 4464
Pro Lys Gln Pro Thr Ala Pro Val Gln Ser Ser Thr Gly Lys Lys
1475 1480 1485
gaa gag agt agc aag cca gct gca act cca act aag cca gaa gca 4509
Glu Glu Ser Ser Lys Pro Ala Ala Thr Pro Thr Lys Pro Glu Ala
1490 1495 1500
ggt aag gaa gta act cca gct aag cca agt aaa cca gaa aat gtt 4554
Gly Lys Glu Val Thr Pro Ala Lys Pro Ser Lys Pro Glu Asn Val
1505 1510 1515
gct caa cca aca act ggt aag aag gaa gag agt agc aag cca gct 4599
Ala Gln Pro Thr Thr Gly Lys Lys Glu Glu Ser Ser Lys Pro Ala
1520 1525 1530
gta act cca act aag cca gaa gga ggc aag gaa gta gcc cca gct 4644
Val Thr Pro Thr Lys Pro Glu Gly Gly Lys Glu Val Ala Pro Ala
1535 1540 1545
aag cca agt aaa cca gcc agt gcc act caa cca aca act ggt aag 4689
Lys Pro Ser Lys Pro Ala Ser Ala Thr Gln Pro Thr Thr Gly Lys
1550 1555 1560
aag gaa gaa agt ggc aag cca gcc gca act cca gct caa cca gct 4734
Lys Glu Glu Ser Gly Lys Pro Ala Ala Thr Pro Ala Gln Pro Ala
1565 1570 1575
aag cca gca agt gaa aac aat caa gct agt caa gca act caa cct 4779
Lys Pro Ala Ser Glu Asn Asn Gln Ala Ser Gln Ala Thr Gln Pro
1580 1585 1590
tca caa cct gca ggt caa ccg gtc gct gct aag aaa gat gaa agt 4824
Ser Gln Pro Ala Gly Gln Pro Val Ala Ala Lys Lys Asp Glu Ser
1595 1600 1605
aac aaa caa gat act cct ctg aca aaa cca gct aat ggt tca caa 4869
Asn Lys Gln Asp Thr Pro Leu Thr Lys Pro Ala Asn Gly Ser Gln
1610 1615 1620
tca gaa act tca aca tta tca act gct cca act gaa tca act aaa 4914
Ser Glu Thr Ser Thr Leu Ser Thr Ala Pro Thr Glu Ser Thr Lys
1625 1630 1635
tca agt tca gaa aat aat aat tta cct tca tct cct gca caa agt 4959
Ser Ser Ser Glu Asn Asn Asn Leu Pro Ser Ser Pro Ala Gln Ser
1640 1645 1650
aac gaa caa tca gtt gct ggt cct gtt aaa gct caa aag gtt gca 5004
Asn Glu Gln Ser Val Ala Gly Pro Val Lys Ala Gln Lys Val Ala
1655 1660 1665
aga aga gct aaa caa gtt aag tta acc cgt aat gca cgt gca tat 5049
Arg Arg Ala Lys Gln Val Lys Leu Thr Arg Asn Ala Arg Ala Tyr
1670 1675 1680
aat ctt aat ggg aaa tta gtc ctt aag aag ggt aaa gtt ctt act 5094
Asn Leu Asn Gly Lys Leu Val Leu Lys Lys Gly Lys Val Leu Thr
1685 1690 1695
ctt aga aat aat ggc cgt gta gta act att aaa tgt cat aaa tat 5139
Leu Arg Asn Asn Gly Arg Val Val Thr Ile Lys Cys His Lys Tyr
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tac cag gtt ggt aag aat gtt tac gtt gct gtt gcc aac act tta 5184
Tyr Gln Val Gly Lys Asn Val Tyr Val Ala Val Ala Asn Thr Leu
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aag caa aga aca ttt aaa cat aat gtt gct gtt tat aac cat aaa 5229
Lys Gln Arg Thr Phe Lys His Asn Val Ala Val Tyr Asn His Lys
1730 1735 1740
ggc aag aaa gtt ggt gtt ctt aaa gct ggc aga aaa gtt gtt tta 5274
Gly Lys Lys Val Gly Val Leu Lys Ala Gly Arg Lys Val Val Leu
1745 1750 1755
tta aac aat ggt aga acg aca act att cat ggt aag aag ttt tat 5319
Leu Asn Asn Gly Arg Thr Thr Thr Ile His Gly Lys Lys Phe Tyr
1760 1765 1770
caa gtt ggt aag gat caa ttt gtt aag gct agt gat ctt 5358
Gln Val Gly Lys Asp Gln Phe Val Lys Ala Ser Asp Leu
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<212>PRT
<213>纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)
<400>20
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Gln Ser Gly Gln Lys Leu Asn Ala Val His Asn Gln Lys Ser Ser Arg
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Leu Ala Ser Ser Thr Val Leu Leu Phe Ser Ser His Asn Val Lys Ala
50 55 60
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Lys Ser Glu Gln Ser Gln Gly Gln Thr Leu Gln Ala Val Gln Arg Lys
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Asp Asp Ala Val Pro Ser Asp Ala Tyr Gln Gln Ser Ala Ala Val Gln
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Ile Lys Arg Leu Gly Tyr Gly Arg Tyr Val Asn Glu Lys Phe Pro Phe
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260 265 270
Gly Glu Pro His Gly Gln His Val Ser Gly Ile Ile Ala Ala Asp Gly
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Met Ala Lys Glu Ile Cys Asp Ala Val Asn Leu Gly Ala Asp Val Ile
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Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Val Ser Ala Ala Asp Leu Asn Ile Gln
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Ile Ser Ala Ala Asn Asn Gly Asn Ala Ala Ser Val Asp Asn Pro Thr
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Ser Ala Ile Thr Val Ala Ala Glu Thr Ser Gly Thr Gly Lys Asp Ser
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Asp Met Ala Phe Phe Ser Ser Trp Gly Pro Leu Pro Asp Phe Thr Leu
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Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Val Arg Glu Arg Leu Leu Lys Thr Asn
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Pro Lys Leu Lys Gly Ala Ala Leu Val Glu Ala Ile Lys Ala Leu Leu
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Thr Asn Thr Ala Asp Pro Gln Val Gln Asn Gly Tyr Asn Thr Leu Val
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Ser Pro Arg Arg Gln Gly Ala Gly Gln Ile Asn Val Gly Ala Ala Thr
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1760 1765 1770
Gln Val Gly Lys Asp Gln Phe Val Lys Ala Ser Asp Leu
1775 1780 1785
Claims (13)
1.一种制备具有抗高血压特性的肽的方法,该方法包括使用乳酸菌发酵包含动物性牛奶蛋白或植物性蛋白的食材,以获得具有抗高血压特性的肽的发酵食材,其特征在于:该乳酸菌包含有一基因序列编码成一细胞壁蛋白酶(称为prtH200),其中该基因序列定义为:该prtH200为一DNA序列编码成一酶释出细胞壁蛋白酶活性,且该DNA序列选自下列群组:
(a)SEQ ID NO 1的1-5550的位置所示的DNA序列;
(b)一DNA序列,包含一至少75碱基对(bp)的片段,其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有50%的同一性;
(c)一DNA序列,编码成一多肽,包含至少200氨基酸(aa)的片段,其与SEQ ID NO 2的1-1849位置所示的多肽序列的对应片段至少有30%的同一性;
(d)一DNA序列,与包含SEQ ID NO 1的1-5550位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交;以及
(e)一DNA序列,其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
2.如权利要求1所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法,其中所述乳酸菌更包含一基因序列编码成一开放读码框(称为orfF3),其中该基因序列定义为:该orfF3为一DNA序列编码成一开放读码框,且该DNA序列选自下列群组:
(a)SEQ ID NO 3的1-2679的位置所示的DNA序列;
(b)一DNA序列,包含一至少75碱基对(bp)的片段,其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有40%的同一性;
(c)一DNA序列,编码成一多肽,包含至少200氨基酸(aa)的片段,其与SEQ ID NO 4的1-893位置所示的多肽序列的对应片段至少有30%的同一性;
(d)一DNA序列,与包含SEQ ID NO 3的1-2679位置所示的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交;以及
(e)一DNA序列,其为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
3.如权利要求1或2所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法,其中所述乳酸菌包含有一结合二种PFGE分析鉴定频带对应至283kbp频带和219kbp频带PFGE分析鉴定的登记号码为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌,其中该PFGE分析鉴定是藉由包含分离出的乳酸菌的独立染色体DNA的方案,并使用限制酶SmaI做完全消化染色体DNA和在琼脂上对消化过的DNA实施电泳。
4.如前述任一项权利要求所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法,其中所述食材包括动物性牛奶蛋白。
5.如权利要求4所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法,其中所述动物性牛奶蛋白为酪蛋白。
6.如权利要求4所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法,其中所述食材为牛奶或牛奶制品。
7.如前述任一项权利要求所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法,其中所述乳酸菌为杆菌门的细菌,优选为杆菌纲,最优选为乳酸杆菌目。
8.如权利要求7所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法,其中所述乳酸杆菌目中的细菌为乳酸杆菌科,优选为乳酸杆菌属,且最优选为纤维二糖乳酸杆菌。
9.如权利要求8所述的制备具有抗高血压特性的肽的方法,其中所述细菌是具有登记号为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌或其突变体。
10.一种制备含有抗高血压特性的肽的功能性食品的方法,该方法包括下列步骤:
(iii)根据权利要求1至9任一项所述的方法制备一发酵食材;以及
(iv)以适当方式包装该发酵食材,得到一功能性食品。
11.一种包含具抗高血压特性的肽的功能性食品,是通过权利要求10所述的制备功能性食品的方法而获得的。
12.权利要求11所述的包含具抗高血压特性的肽的功能性食品用于制造治疗高血压的药物。
13.一种具有登记编号为DSM 14998的纤维二糖乳酸杆菌或其突变种。
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