CN1878859A

CN1878859A - 新型桥石短小芽孢杆菌和使用该微生物作为宿主生产蛋白的方法

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Publication number: CN1878859A
Application number: CNA200480032747XA
Authority: CN
Inventors: 花方宽; 西条孝幸
Original assignee: Higeta Shoyu Co Ltd
Current assignee: Higeta Shoyu Co Ltd
Priority date: 2003-11-11
Filing date: 2004-11-08
Publication date: 2006-12-13
Anticipated expiration: 2024-11-08
Also published as: EP1686170A1; JPWO2005045005A1; EP1686170B1; JP4504314B2; AU2004288078B2; AU2004288078A1; HK1100850A1; CA2546083C; CN1878859B; EP1686170A4; CA2546083A1; US7655452B1; DE602004025838D1; DK1686170T3; KR101176399B1; WO2005045005A1; ATE459703T1; KR20060123133A

Abstract

桥石短小芽孢杆菌表现出其胞外蛋白水解活性极低且其蛋白分泌生产能力极好，但希望不仅菌株的胞外蛋白水解活性进一步降低，而且其胞内蛋白水解活性也降低。另一方面，当桥石短小芽孢杆菌用作蛋白药物等的宿主时，还希望其不形成孢子而易于灭菌。通过失活其与孢子形成相关的基因，并通过克隆和失活其胞外和胞内蛋白酶基因，解决了以上问题。

Description

新型桥石短小芽孢杆菌和使用该微生物作为宿主生产蛋白的方法

技术领域

本发明涉及新型桥石短小芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)。更具体地说，本发明涉及其胞外和胞内蛋白水解活性已极度降低且不形成孢子的桥石短小芽孢杆菌。本发明还涉及使用桥石短小芽孢杆菌作为宿主通过基因重组生产蛋白的方法。

背景技术

基因重组使得能够使用细菌或动物细胞作为宿主，大量生产迄今为止由于在活体内仅以少量存在而非常难以利用并因此难以分离的蛋白，以及具有任何所需氨基酸序列的多肽。各种细菌都可用作供通过基因重组进行的蛋白生产用的宿主，最广泛使用的是大肠杆菌。但是，在使用大肠杆菌作为宿主的重组蛋白生产系统中，由于生产的蛋白积聚在细胞中，所以细胞体积是所生产蛋白的最高限度，因此难以大量生产蛋白。而且，存在的其它问题是：为了收集积聚在细胞中的蛋白，必须破碎大肠杆菌细胞，由破碎的大肠杆菌细胞所含有的细胞来源组分、核酸、目标蛋白以外的其它蛋白以及细胞壁来源的内毒素中分离和回收目标蛋白的操作很繁复。

为解决大肠杆菌系统的问题，业已开发了其中使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为宿主的重组蛋白生产系统，枯草芽孢杆菌是能够分泌和生产蛋白的典型细菌。在枯草芽孢杆菌用作宿主的生产系统中，所产生的重组蛋白被分泌和生产在培养基中。因此，枯草芽孢杆菌系统具有大肠杆菌系统不具备的某些优良特性，即前者不需要为了蛋白回收而破碎细胞，且前者几乎不产生内毒素。

但是，另一方面，枯草芽孢杆菌具有胞外分泌大量蛋白酶的特性，因此，其存在的严重问题是所分泌和生产的重组蛋白被蛋白酶降解，重组蛋白的产量极低。因此，迄今已进行了各种努力来减少枯草芽孢杆菌中蛋白酶的产生。但是，尽管如此，迄今为止已知使用以枯草芽孢杆菌作为宿主的重组蛋白生产系统工业化生产外源蛋白的实例很少。

另一方面，为解决枯草芽孢杆菌系统的问题，业已开发了其中使用能够胞外分泌和生产重组蛋白但胞外不分泌蛋白酶的细菌作为宿主的新重组蛋白生产系统。结果，成功开发了使用短芽孢杆菌(Bacillus brevis)如短芽孢杆菌47(专利文献1)作为宿主的重组蛋白生产系统，其中所述短芽孢杆菌表现出的蛋白分泌生产能力优于枯草芽孢杆菌。

目前，基于16SrRNA基因的碱基序列对短芽孢杆菌进行系统分析，结果将其重新分类为短小芽孢杆菌属(Brevibacillus)细菌，包括桥石短小芽孢杆菌、短短小芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)(非专利文献1)。

但是，已经发现，短芽孢杆菌47具有弱胞外蛋白水解活性。一般认为用短短小芽孢杆菌作为宿主生产重组蛋白所耗费的时间周期较长(一般约3天)。因此，即使短芽孢杆菌细胞的胞外蛋白水解活性弱，所生产的重组蛋白也可能遭到胞外蛋白水解活性的降解，重组蛋白的产量可能下降。为解决此问题，迄今已进行了各种努力，以进一步降低短芽孢杆菌的胞外蛋白水解活性。

例如，大范围筛选短芽孢杆菌菌株，作为具有极低胞外蛋白水解活性并具有优良蛋白分泌生产能力的菌株，已分离出桥石短小芽孢杆菌HPD31(FERM BP-1087)(与FERM BP-6863：短芽孢杆菌H102为相同菌株)(专利文献2)及其突变菌株桥石短小芽孢杆菌HPD31-S5(FERM BP-6623，该菌株以短小芽孢杆菌HPD31-S5的名称保藏)。这些菌株业已作为宿主用于生产各种重组蛋白，例如人表皮生长因子(hEGF)。例如，非专利文献2(其中，桥石短小芽孢杆菌HPD31描述为短芽孢杆菌HPD31)等披露了用桥石短小芽孢杆菌HPD31生产hEGF。

但是，即使是这些桥石短小芽孢杆菌HPD31和HPD31-S5，在以高灵敏蛋白水解活性检测法分析时，也表现出胞外蛋白水解活性。例如，通过检测其蛋白水解活性的明胶-PAGE(酶图)分析桥石短小芽孢杆菌HPD-31的培养物上清液，产生图2的明胶分解条带。

另一方面，公开了基本不表现出蛋白酶活性(蛋白水解活性)的短芽孢杆菌31-OK，其被称为短芽孢杆菌突变株(专利文献3)。但是，即便是短芽孢杆菌31-OK，在按照明胶PAGE法评价其蛋白水解活性的实验中，也产生了表明其蛋白水解活性的条带，其并没有完全失去胞外蛋白水解活性。而且，根本没有完成该菌株胞外蛋白水解活性的基因水平分析。具体地说，未分离出蛋白酶，更不必说，不仅没有对其基因进行测序，而且甚至没有进行其克隆。

因此，即便是对于使用据说已降低其胞外蛋白水解活性的菌株的情况，分泌和生产的蛋白被菌株仍具有的胞外蛋白水解活性降解并因此降低蛋白产量的可能性依然存在。

这些桥石短小芽孢杆菌(或短芽孢杆菌)菌株通过筛选或用诱变剂处理而突变或其它方法获得，而非通过鉴别基因组上的蛋白酶基因接着使基因失活而获得。因此，迄今无人知晓其蛋白水解活性已通过鉴别基因组上的蛋白酶基因进而使基因失活而被降低的桥石短小芽孢杆菌。

前述桥石短小芽孢杆菌蛋白水解活性的降低全部是针对其胞外蛋白水解活性的降低，尚未关注菌株胞内蛋白水解活性的降低。但是，在使用桥石短小芽孢杆菌作为宿主的重组蛋白生产中，存在的一种情况是：根据目标蛋白的类型，不可能分泌生产，但可胞内积聚生产。在这种情况下，由于胞内蛋白酶的作用，所生产的蛋白可能被降解，结果几乎未获得重组蛋白。

已知桥石短小芽孢杆菌细胞在培养过程中可部分地经历溶菌作用，结果，含胞内蛋白酶的胞内蛋白可能溶出到培养基中。因此，存在一种可能性：即使是胞外分泌和生产的重组蛋白，也可能被溶解的胞内蛋白酶降解。

因此，降低胞内蛋白水解活性也是要解决的另外一个问题，以进一步增加桥石短小芽孢杆菌作为宿主在基因重组中的实用性。

迄今为止，已知没有降低桥石短小芽孢杆菌胞内蛋白水解活性的实例。

另外，根本没有在基因水平上对桥石短小芽孢杆菌的胞内蛋白水解活性进行分析。具体地说，已知没有分离桥石短小芽孢杆菌胞内蛋白酶的实例。另外，还已知没有克隆胞内蛋白酶基因的实例和没有测定其序列的实例。

而且，为进一步扩展桥石短小芽孢杆菌作为宿主在基因重组中的工业应用性，除降低菌株的蛋白水解活性以外，还要解决另一个问题。

同芽孢杆菌属细菌如枯草芽孢杆菌一样，桥石短小芽孢杆菌可形成孢子。与活细胞(无孢子细胞)相比，孢子具有高抗热性，因此需要极为严格的灭菌条件。因此，在需要培养结束后保证彻底灭菌并去除生产管路中的含孢子细胞的重组蛋白药物生产中，必需难度极大的技术来使用桥石短小芽孢杆菌作为宿主生产重组蛋白。

因此，为了使在广泛范围的工业应用如重组蛋白药物生产中使用桥石短小芽孢杆菌作为重组宿主成为可能，需要不形成孢子并可在甚至温和灭菌条件(60℃-100℃)下被完全杀灭的桥石短小芽孢杆菌菌株。

灭菌桥石短小芽孢杆菌孢子所需的条件比灭菌枯草芽孢杆菌孢子所需的条件温和得多。例如，一般认为枯草芽孢杆菌孢子于100℃的D值(在不同的温度范围内将包括活细胞(无孢子细胞)和孢子在内的全部细胞数减少至1/10所花费的时间)约为11分钟，但根据菌株类型有所变化。另一方面，桥石短小芽孢杆菌孢子的D值至多为1分钟。但是，与灭菌其活细胞(无孢子细胞)相比，灭菌桥石短小芽孢杆菌孢子需要极为严格的条件。例如，如下文给出的实施例所证实，桥石短小芽孢杆菌活细胞(无孢子细胞)于80℃的D值少于1分钟，但其孢子的D值约为67分钟。

枯草芽孢杆菌SMS275被披露为枯草芽孢杆菌无孢子菌株(专利文献4：JP-A 4-287686(1992))。但是，迄今为止尚不知晓任何不具备孢子形成能力的桥石短小芽孢杆菌菌株，或换句话说，还不知道任何能够在温和灭菌条件下被完全杀灭的桥石短小芽孢杆菌菌株。

专利文献1：JP-A 60-58074(1985)

非专利文献1：Int.J.Syst.Bacteriol.，46，939-946(1996)

专利文献2：JP-A 63-56277(1988)

非专利文献2：Ann.NY Acad.Sci.，782，115-122(1996)

专利文献3：JP-A 6-296845(1994)

专利文献4：JP-A 4-287686(1992)

本发明所要解决的课题：

如上所述，桥石短小芽孢杆菌作为基因重组宿主具有极佳的特性，但为了进一步增加该菌株作为基因重组宿主的工业应用性，有一些问题有待解决。

一个课题是获得其胞外蛋白水解活性比已知菌株显著降低的桥石短小芽孢杆菌。另一个课题是获得其胞内蛋白水解活性比已知菌株显著降低的桥石短小芽孢杆菌。再另一个课题是获得不形成孢子且可在温和灭菌条件下被完全杀灭的桥石短小芽孢杆菌。

因此，本发明提供其胞外蛋白水解活性比已知菌株显著降低并因此提升了其重组蛋白分泌生产效率的桥石短小芽孢杆菌；其胞内蛋白水解活性比已知菌株显著降低并因此提升了其重组蛋白胞内积聚生产效率的桥石短小芽孢杆菌；不能形成孢子并因此在温和灭菌条件下被完全杀灭的桥石短小芽孢杆菌；以及其胞外和胞内蛋白水解活性比已知菌株显著降低并因此提升了其重组蛋白生产效率、不能形成孢子并因此在温和灭菌条件下被完全杀灭的桥石短小芽孢杆菌。本文提到的用语“胞外和胞内蛋白水解活性比已知菌株显著降低”意指包括活性完全丧失的情况。

此外，本发明的另一个目标是提供使用桥石短小芽孢杆菌作为宿主通过基因重组生产蛋白的方法。

解决问题的方法：

我们，本发明的发明人，尝试通过用诱变剂处理亲代菌株桥石短小芽孢杆菌HPD31(此前其作为宿主在重组蛋白生产中产生了一些成效)获得突变体，以获得不具备孢子形成能力的桥石短小芽孢杆菌。

首先，在菌落形态学改变作为其指标的基础上选择突变菌株，具体地说，选择那些就其菌落形态学而言形成与普通桥石短小芽孢杆菌不同的无皱菌落的桥石短小芽孢杆菌。再通过显微镜观察由这些菌株中选择无孢子形成的菌株，作为可能不能形成孢子的菌株。再进一步，测试可能不具备孢子形成能力的菌株的孢子形成的情况，选择不具备孢子形成能力的菌株。接着，再测试菌株用作宿主的重组蛋白生产能力，选择那些重组蛋白生产能力和已知在基因重组中用作宿主的菌株桥石短小芽孢杆菌HPD31水平相同的菌株。按照该方法，我们，本发明的发明人，获得了不具备孢子形成能力的桥石短小芽孢杆菌。

为了获得其胞外和胞内蛋白酶活性比已知菌株大为降低的桥石短小芽孢杆菌菌株，我们，本发明的发明人，使用上述不具备孢子形成能力的桥石短小芽孢杆菌作为亲代菌株，并失活了胞外和胞内主蛋白酶基因。首先，具体地说，为了鉴别所要失活的蛋白酶基因，我们尝试克隆蛋白酶基因。结果，我们成功克隆了两种新蛋白酶的基因，或更确切地说，是胞内主蛋白酶IMP和胞外主蛋白酶EMP的基因，并进一步构建了其中所述基因失活的桥石短小芽孢杆菌。

我们，本发明的发明人，按照类似于已知的同源重组的方法对桥石短小芽孢杆菌基因组上的特定蛋白酶基因进行失活，但在该方法中，在每个基因失活中标记基因如药物抗性基因都保留基因组上，这将在下文提及。因此，为使多个基因失活，每个基因失活时基因组中的标记基因如药物抗性基因必须缺失。为去除标记基因，我们利用含FRT序列和酵母源Flp重组酶基因的系统。此外，在该方法中，我们新构建了具有Flp重组酶基因并能够容易地由在不含新霉素的培养基中培养的桥石短小芽孢杆菌细胞中去除的质粒DNA，并使用该质粒DNA，如下文给出的实施例所述。通过去除已导入细胞中并留在基因组上的标记基因，接着在无新霉素的培养基中培养细胞，可容易地去除细胞中的质粒。使用该质粒使多个基因失活成为可能。

此外，我们，本发明的发明人，测试了由此获得的其胞外和胞内主蛋白酶基因已失活的桥石短小芽孢杆菌菌株的孢子形成能力和蛋白水解活性。结果，我们证实该菌株不具备孢子形成能力，菌株的胞外和胞内蛋白水解活性与已知菌株桥石短小芽孢杆菌HPD31相比显著降低。

此外，我们在通过同源重组进行的蛋白生产中使用该桥石短小芽孢杆菌菌株作为宿主，生产了在任何其它已知桥石短小芽孢杆菌用作宿主的情况下其分泌和生产后被证实降解的蛋白。结果，我们证实，蛋白的积聚量与已知菌株桥石短小芽孢杆菌HPD31用作宿主的情况相比增加，并完成了本发明。

如上所述，本发明提供其胞外蛋白水解活性比已知菌株显著降低并因此提升了其重组蛋白分泌生产效率的桥石短小芽孢杆菌；其胞内蛋白水解活性比已知菌株显著降低并因此提升了其重组蛋白胞内积聚生产效率的桥石短小芽孢杆菌；以及不能形成孢子并因此在温和灭菌条件下被完全杀灭的桥石短小芽孢杆菌。本发明进一步提供其胞外和胞内蛋白水解活性比已知菌株显著降低并因此提升了其重组蛋白生产效率、不能形成孢子并因此在温和灭菌条件下被完全杀灭的桥石短小芽孢杆菌。

再进一步，本发明提供使用所述桥石短小芽孢杆菌作为宿主通过基因重组生产蛋白的方法。

附图简述

图1：

其图示了通过同源重组失活基因的概述，用于构建本发明的桥石短小芽孢杆菌。

图2：

其图示了通过明胶-PAGE(酶图)检测桥石短小芽孢杆菌HPD31(泳道1)和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3(泳道2)的每种培养上清液组分的蛋白酶活性的结果。在空白框中显示了蛋白酶活性分解明胶产生的清晰条带。

图3：

其图示了在非变性条件下通过明胶-PAGE(酶图)检测桥石短小芽孢杆菌HPD31(泳道1)和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3(泳道2)的每种胞内组分的蛋白酶活性的结果。在空白框中显示了蛋白酶活性分解明胶产生的清晰条带。

图4：

其图示了使用桥石短小芽孢杆菌HPD31和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主通过基因重组分泌和生产的猪IL-1β的CBB染色结果，并图示了猪IL-1β的分泌生产和降解。泳道1表示基因重组体桥石短小芽孢杆菌HPD31/pNY301-pIL-1β，泳道2表示基因重组体桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3/pNY301-pIL-1β。

图5：

其图示了用抗猪IL-1β抗体对使用桥石短小芽孢杆菌HPD31和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主通过基因重组分泌和生产的猪IL-1β的蛋白质印迹结果，并图示了猪IL-1β的分泌生产和降解。泳道1表示基因重组体桥石短小芽孢杆菌HPD31/pNY301-pIL-1β，泳道2表示基因重组体桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3/pNY301-pIL-1β。

图6：

其图示了用抗猪IFN-γ抗体对使用桥石短小芽孢杆菌HPD31和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主通过基因重组胞内积聚和生产的猪IFN-γ的蛋白质印迹结果，并图示了猪IL-1γ的胞内积聚生产和降解。泳道1表示基因重组体桥石短小芽孢杆菌HPD31/pNY301；泳道2表示基因重组体桥石短小芽孢杆菌HPD31/pNY301-pINF-γ；泳道3表示基因重组体桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3/pNY301-pIFN-γ。

图7：

其显示了与孢子形成相关的基因hos的DNA碱基序列(上行)，以及其对应的氨基酸序列(下行)。

图8：

其为图7的延续。

图9：

其显示了胞外蛋白酶EMP的氨基酸序列(下行)以及编码其的基因emp的DNA序列(上行)。

图10：

其是图9的延续。

图11：

其是图10的延续。

图12：

其显示了胞内蛋白酶IMP的氨基酸序列(下行)以及编码其的基因imp的DNA序列(上行)。

图13：

其是图12的延续。

图14：

其显示了引物Hos P1、Hos P2、Hos P3和Hos P4。

图15：

其显示了引物imp P1和imp P2。

图16：

其显示了引物flp P1。

图17：

其显示了引物flp P2。

图18：

其显示了引物flp P3。

图19：

其显示了引物flp P4。

图20：

其显示了引物flp P5。

图21：

其显示了引物flp P6。

图22：

其显示了引物flp P7。

图23：

其显示了引物flp P8。

图24：

其显示了引物emp P1和emp P2的碱基序列和氨基酸序列数据。

图25：

其显示了引物emp P3和emp P4，以及接头引物。

图26：

其显示了实施例19中的有义引物。

图27：

其显示了实施例19中的反义引物。

图28：

其显示了实施例20中的有义引物。

图29：

其显示了实施例20中的反义引物。

图30：

其显示了实施例21中的有义引物。

图31：

其显示了实施例21中的反义引物。

图32：

其显示了实施例23中的有义引物。

图33：

其显示了实施例23中的反义引物。

图34：

其显示了实施例24中的有义引物。

图35：

其显示了实施例24中的反义引物。

图36：

其显示了实施例25中的有义引物。

图37：

其显示了实施例25中的反义引物。

下文详述本发明。

本发明包括以下的(1)-(16)作为其实施方案。

(1)不形成孢子的桥石短小芽孢杆菌。

(2)具有以下菌学特征且不形成孢子的桥石短小芽孢杆菌：

(a)形态学：

细胞大小：

液体培养基：0.4-0.6×1.5-4μm，

细胞类型：芽孢杆菌

有无孢子：无

(b)生理学特性：

硝酸盐还原： -，

VP实验： -，

柠檬酸利用： +，

脲酶： -，

氧化酶： +，

过氧化氢酶： +，

(c)其它特性：

耐温性：于60℃死亡。

(3)不形成孢子的桥石短小芽孢杆菌，其特征在于其与孢子形成相关的基因hos失活。

(4)权利要求3的桥石短小芽孢杆菌，其中与孢子形成相关的基因hos具有SEQ ID NO：1的碱基序列。

(5)不形成孢子的桥石短小芽孢杆菌，其胞外和/或胞内蛋白酶活性已降低或消失。

(6)具有以下菌学特性且不形成孢子的桥石短小芽孢杆菌：

(a)形态学：

细胞大小：

液体培养基：0.4-0.6×1.5-4μm，

细胞类型：芽孢杆菌

有无孢子：无

(b)生理学特性：

硝酸盐还原： -，

VP实验： -，

柠檬酸利用： +，

脲酶： -，

氧化酶： +，

过氧化氢酶： +，

(c)其它特性：

耐温性：于60℃死亡。

胞外蛋白酶活性：低或没有，

胞内蛋白酶活性：低或没有。

(7)特征在于其胞外主蛋白酶基因emp失活的桥石短小芽孢杆菌。

(8)权利要求7的桥石短小芽孢杆菌，其中胞外主蛋白酶基因emp具有SEQ ID NO：3的碱基序列。

(9)特征在于其胞内主蛋白酶基因imp失活的桥石短小芽孢杆菌。

(10)以上(9)的桥石短小芽孢杆菌，其中胞内主蛋白酶基因imp具有SEQ ID NO：5的碱基序列。

(11)特征在于其胞外主蛋白酶基因emp和胞内主蛋白酶基因imp失活的桥石短小芽孢杆菌。

(12)以上(11)的桥石短小芽孢杆菌，其不形成孢子。

(13)桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3(FERM BP-08479)。

(14)通过用其中插入蛋白编码基因的表达载体转化以上(1)-(13)任一项的桥石短小芽孢杆菌而构建的桥石短小芽孢杆菌。

(15)一种生产蛋白的方法，其特征在于包括培养以上(14)的桥石短小芽孢杆菌转化子的步骤。

(16)一种生产重组蛋白的方法，其特征在于在重组蛋白生产中使用以上(1)-(13)任一项的桥石短小芽孢杆菌作为宿主。

通过用诱变剂使亲代菌株桥石短小芽孢杆菌突变，接着由突变所获得的突变体中选择不具备孢子形成能力的菌株，获得了本发明的不具备孢子形成能力的桥石短小芽孢杆菌。在以下给出的实施例中，使用亚硝基胍作为诱变剂，但亚硝酸或甲磺酸乙酯也可用作诱变剂。另外，也可用UV射线和γ射线。用于获得本发明的不具备孢子形成能力的突变体的亲代菌株没有特别限定，只要其是属于桥石短小芽孢杆菌属的菌株，但特别优选在通过基因重组进行的蛋白生产中用作宿主已产生某些成效的桥石短小芽孢杆菌HPD31(FERMBP-1087)或其突变体桥石短小芽孢杆菌HPD31-S5(FERM BP-6623)。可通过耐热性实验或检测突变体的D值，证实通过突变获得的突变体有无孢子形成能力。D值指在每个温度范围内将包括活细胞(无孢子细胞)和孢子在内的所有细胞的数量降低至1/10所花费的时间，其可用作细胞死亡率的指标。

使用基因组文库分析本发明提供的不具备孢子形成能力的桥石短小芽孢杆菌菌株，结果证实了该菌株中推定与孢子形成相关的基因失活。失活的基因命名为hos。作为与孢子形成相关的基因hos的DNA序列的实例，桥石短小芽孢杆菌HPD31的DNA碱基序列如SEQID NO：1(图7和图8中的上行)所示，对应于该DNA碱基序列的氨基酸序列如SEQ ID NO：2(图7和图8中的下行)所示。

可通过使桥石短小芽孢杆菌基因组上的胞外和胞内主蛋白酶基因失活，获得其胞外和胞内蛋白水解活性已显著降低的本发明桥石短小芽孢杆菌。为获得其蛋白水解活性已显著降低的本发明桥石短小芽孢杆菌，桥石短小芽孢杆菌基因组上的蛋白酶基因没有特别限定，但优选胞内主蛋白酶基因imp和胞外主蛋白酶基因emp中的任一种。

作为胞外主蛋白酶基因emp的DNA序列的实例，桥石短小芽孢杆菌HPD31的emp基因的DNA碱基序列如SEQ IDNO：3(图9-11中的上行)所示；而对应于该DNA序列的桥石短小芽孢杆菌HPD31胞外主蛋白酶EMP的氨基酸序列如SEQ ID NO：4(图9-11中的下行)所示。

作为胞内主蛋白酶基因imp的DNA序列的实例，桥石短小芽孢杆菌HPD31的imp基因的DNA碱基序列如SEQ ID NO：5(图12-13中的上行)所示；而对应于该DNA序列的桥石短小芽孢杆菌HPD31胞内主蛋白酶IMP的氨基酸序列如SEQ ID NO：6(图12-13中的下行)所示。EMP和IMP都是新蛋白，其与任一种已知蛋白的氢基酸序列至少缺少40％的同源性。

通过部分置换、缺失、插入或添加某些氨基酸由SEQ ID NO：4的氨基酸序列修饰获得其氨基酸序列的所有蛋白都落入蛋白酶EMP的范围内，只要其具有蛋白水解活性。本文提到的“通过部分置换、缺失、插入或添加某些氨基酸修饰的氨基酸序列”意指与SEQ IDNO：4全长氨基酸序列的同源性至少为60％，优选至少70％，更优选至少80％的修饰氨基酸序列，尽管根据氨基酸残基的类型和氨基酸残基在蛋白立体结构中的位置而有所变化。

同样，通过部分置换、缺失、插入或添加某些氨基酸由SEQ IDNO：6的氨基酸序列修饰获得其氨基酸序列的所有蛋白都落入蛋白酶IMP的范围内，只要其具有蛋白水解活性。本文提到的“通过部分置换、缺失、插入或添加某些氨基酸修饰的氨基酸序列”意指与SEQID NO：6全长氨基酸序列的同源性至少为50％，优选至少60％，更优选至少70％的修饰氨基酸序列，尽管根据氨基酸残基的类型和氨基酸残基在蛋白立体结构中的位置而有所变化。

再同样，通过部分置换、缺失、插入或添加某些氨基酸由SEQ IDNO：4的氨基酸序列修饰获得其氨基酸序列的蛋白的所有编码基因都落入蛋白酶基因emp(SEQ ID NO：3)的范围内，只要其编码的蛋白具有蛋白水解活性。本文提到的“通过部分置换、缺失、插入或添加某些氨基酸修饰的氨基酸序列”和上文针对EMP提及的内容具有相同含义。

再同样，通过部分置换、缺失、插入或添加某些氨基酸由SEQ IDNO：6的氨基酸序列修饰获得其氨基酸序列的蛋白的所有编码基因都落入蛋白酶基因imp(SEQ ID NO：5)的范围内，只要其编码的蛋白具有蛋白水解活性。本文提到的“通过部分置换、缺失、插入或添加某些氨基酸修饰的氢基酸序列”和上文针对IMP提及的内容具有相同含义。迄今为止emp基因和imp基因都没有分离出来，其DNA序列还没有确定，两个基因都是本领域迄今未知的新基因。

可通过适当选择和组合本领域技术人员已知和描述于MolecularCloning，2nd Ed.，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York(1989)的标准基因重组技术，对桥石短小芽孢杆菌基因组上的胞内主蛋白酶基因imp和胞外主蛋白酶基因emp进行克隆。例如，制备桥石短小芽孢杆菌的基因组DNA文库，用基因组DNA文库，以具有部分待失活基因之编码DNA序列的DNA片段作为探针进行杂交，或用该DNA片段作为引物进行PCR。

可按照类似于已知的同源重组的方法对桥石短小芽孢杆菌基因组上的imp基因或emp基因进行失活。例如，可按照下文述及的方法实施imp基因失活。

首先，用在桥石短小芽孢杆菌中不可复制的载体，例如用在大肠杆菌中可复制的载体，克隆含imp基因的DNA片段，籍此用含在其两侧具有FRT序列(Gene，212，77-86(1998))的药物抗性基因(例如新霉素抗性基因)的DNA片段置换imp基因的部分区域，由此切割imp基因。结果，获得含失活imp基因的载体，其中imp基因部分地由新霉素抗性基因置换，并因此被失活。此外，将第二个药物抗性基因(例如红霉素抗性基因)插入到载体中，以便选择上述失活imp基因插入到其基因组DNA中的桥石短小芽孢杆菌，由此构建imp基因失活用的载体。

接着，将imp基因失活载体导入到桥石短小芽孢杆菌中，并选择显示新霉素抗性的菌株。imp基因失活载体的导入在某些桥石短小芽孢杆菌细胞中诱导基因组上的imp基因和imp基因失活载体上的失活imp基因之间的同源重组。结果，新霉素抗性菌株包括仅在新霉素抗性基因-FRT盒上游的imp部分发生同源重组的菌株；仅在其下游的imp部分发生同源重组的菌株；以及在其上游和下游两个部分发生同源重组的菌株(双杂交菌株)。

其中基因组上的imp基因已失活的目标菌株是双杂交菌株，其对红霉素敏感。因此，将这些新霉素抗性菌株再在含红霉素的TM-琼脂培养基上培养，选择红霉素敏感菌株。该方法获得了其中基因组上的imp基因已失活的目标桥石短小芽孢杆菌菌株。

在以上获得的桥石短小芽孢杆菌菌株中的imp基因失活可通过PCR和基因组DNA印迹分析证实。

此外，从以上获得的imp基因失活菌株的基因组中去除新霉素抗性基因。导入到imp基因失活菌株中的新霉素抗性基因在其上游区域和下游区域都具有FRT序列，因此，使用能特异性识别FRT序列的Flp重组酶，通过FRT序列重组，有可能从以上获得的imp基因失活菌株中去除新霉素抗性基因。

具体地说，在无新霉素培养基中培养的情况下，首先制备能够容易地脱离桥石短小芽孢杆菌菌株的质粒载体。此外，通过将酵母源Flp重组酶基因(Nature，286，860-864(1980))和博来霉素抗性基因插入到质粒载体中，构建缺失新霉素抗性基因用的载体。

接着，将新霉素抗性基因缺失载体导入到以上获得的imp基因失活菌株中，然后在含博来霉素的TM-琼脂培养基上培养菌株，并由此选择载体转化的菌株。接着，在无博来霉素的液体TM培养基中培养获得的转化菌株，然后在TM-琼脂培养基中进一步培养。

新霉素抗性基因缺失的目标imp基因失活菌株，其基因组上的新霉素抗性基因已通过新霉素抗性基因两侧的FRT序列重组而缺失，并失去了新霉素抗性基因缺失载体。该菌株对新霉素和博来霉素均敏感。因此，由在TM-琼脂培养基上形成菌落的菌株中选择对新霉素和博来霉素均敏感的菌株，由此获得新霉素抗性基因缺失、imp基因失活的目标菌株。

该方法产生了imp基因失活的目标桥石短小芽孢杆菌菌株。其概述示于图1。

可使用以上构建的imp基因失活的菌株作为亲代菌株，并通过失活该菌株基因组上的emp基因，获得其中蛋白酶基因imp和emp都失活的桥石短小芽孢杆菌菌株。可通过重复和imp基因失活相同的方法进行emp基因失活。

在上述方法中用作标记基因的药物抗性基因的实例例如为新霉素抗性基因、红霉素抗性基因和博来霉素抗性基因，用于该方法的标记基因的类型没有特别限定。使用任何所需的多个标记基因，可按照如上所述的方法通过同源重组失活基因。

上述对桥石短小芽孢杆菌基因组上的胞外和胞内主蛋白酶基因失活获得了其胞外和胞内蛋白酶活性比已知菌株大为降低的本发明桥石短小芽孢杆菌菌株。

可按照明胶-PAGE(酶图)法或使用偶氮蛋白如偶氮酪蛋白或Azocoll作为底物的方法，测定桥石短小芽孢杆菌菌株的蛋白水解活性。

按照上述方法获得的不具备孢子形成能力的本发明桥石短小芽孢杆菌的实例是示于实施例中的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP1。其胞内蛋白水解活性比已知菌株大为降低且不具备孢子形成能力的桥石短小芽孢杆菌的实例是也示于实施例中的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP2。其胞外和胞内蛋白水解活性比已知菌株大为降低且不具备孢子形成能力的桥石短小芽孢杆菌的实例是也示于实施例中的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3。

桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3按照布达佩斯条约于2003年9月11日在国际专利生物保藏单位(1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken)国际保藏，分配的保藏号为FERM BP-08479。

本发明的桥石短小芽孢杆菌的特征在于其满足了以下三种要求中的至少一种：(a)其不形成孢子，(b)其胞外主蛋白酶活性低或没有，(c)其胞内主蛋白酶活性低或没有；就其其它特性而言，其与普通桥石短小芽孢杆菌没有显著差异。其菌学特性如下：

(a)形态学：

细胞大小：

液体培养基：0.4-0.6×1.5-4μm，

孢子类型：芽孢杆菌

有无孢子：无

有无细胞多态性：无

有无运动性：有(外周鞭毛)

(b)生理学特性：

硝酸盐还原： -，

VP实验(形成3羟基丁酮)： -，

吲哚形成： -，

硫化氢形成(TSI琼脂培养基)： +，

柠檬酸利用： +，

无机氮源利用：

硝酸盐： -，

铵盐： +，

染料形成(King培养基)： -，

脲酶： -，

氧化酶： +，

过氧化氢酶： +，

O-F实验：未分解，

明胶分解： -，

由葡萄糖形成酸： -，

由木糖形成酸： -，

由乳糖形成酸： -，

由麦芽糖形成酸： -，

生长pH：6-8.5

(c)其它特性：

耐温性：于60℃死亡，

胞外蛋白酶活性：低或没有(注释1)，

胞内蛋白酶活性：低或没有(注释2)。

(注释1)

以以下任一种方法都未在培养上清液中检测到蛋白水解活性：

(1)通过明胶-PAGE检测明胶分解活性的方法。

(2)通过使培养上清液和偶氮酪蛋白反应，接着检测反应液吸光度的变化，来检测偶氮酪蛋白分解活性的方法。

(3)通过使培养上清液和Azocoll反应，接着检测反应液吸光度的变化，来检测Azocoll分解活性的方法。

(注释2)

即使是通过明胶-PAGE检测明胶分解活性，都没有在胞内组分中检测到明胶分解活性。

本文提及的用语“胞外蛋白酶活性比已知菌株大为降低”意指当按照偶氮酪蛋白法或Azocoll法检测时，培养上清液中的酶活性降低至已知桥石短小芽孢杆菌菌株酶活性的最多1/10，优选最多1/30，更优选最多1/100。在下文给出的实施例中，数据表明至多1/120和至多1/330。

同样，用语“胞内蛋白酶活性比已知菌株大为降低”意指当按照偶氮酪蛋白法检测时，胞内组分中的酶活性降低至已知桥石短小芽孢杆菌菌株酶活性的最多1/2，优选最多1/5，更优选最多1/8至1/10。

这些降低值在按照偶氮酪蛋白法或Azocoll法进行的检测中获得，更不必说，以任何其它方法检测数据时获得，然后根据这些降低值限定每个方法中的降低值。

此外，本发明提供使用上述桥石短小芽孢杆菌作为宿主菌株通过基因重组生产蛋白的方法。

在使用本发明的桥石短小芽孢杆菌作为宿主菌株的蛋白生产中使用的表达载体，可为在桥石短小芽孢杆菌中可复制的任何载体，没有特别限定，但优选具有短芽孢杆菌47的主胞外蛋白基因(MWP基因)启动子区或桥石短小芽孢杆菌HPD31的主胞外蛋白基因(HWP基因)启动子区的表达载体。一般来说，在使用桥石短小芽孢杆菌作为宿主的重组蛋白生产系统中所生产的蛋白并不积聚在宿主细胞内，而是被分泌到细胞外，因此，理想的是表达载体在启动子区编码DNA序列的3′-末端侧具有编码分泌信号肽的DNA序列。编码分泌信号肽的DNA序列的优选实例包括编码桥石短小芽孢杆菌HPD31主胞外蛋白的分泌信号肽的DNA序列。

具体地说，使用本发明的桥石短小芽孢杆菌作为宿主的重组蛋白生产中使用的表达载体的优选实例包括pHT110(JP-A 6-133782(1994))和pNY301(JP-A 10-295378(1998))。

将要插入到本发明表达载体中的蛋白的编码DNA可为在使用本发明的桥石短小芽孢杆菌作为宿主的重组蛋白生产中能使其表达的任何DNA，没有特别限定。例如，其可为编码细胞因子、趋化因子、酶或激素或任何其它肽的任一种基因的任意DNA片段。通过基因重组产生的蛋白的用途也没有特别限定。用途可为药物、生化试剂、工业用酶等中的任一种。

可以本领域技术人员已知的任何普通方法，将蛋白编码DNA插入到表达载体中。例如，通过用合适的限制性内切核酸酶处理编码目标蛋白的纯化DNA获得DNA片段，将该片段插入到表达载体中合适的限制性内切核酸酶切割位点或多克隆位点，并在该处连接。

再将其中插入蛋白编码DNA的表达载体导入本发明的桥石短小芽孢杆菌中，由此转化桥石短小芽孢杆菌。将表达载体导入本发明的桥石短小芽孢杆菌中的方法没有特别限定，可适当地选择本领域技术人员已知的任何方法。一个优选方法是通常用于将表达载体导入桥石短小芽孢杆菌中的电穿孔法。

可通过将转化子接种入合适的培养基中，在其中培养，并在培养后回收和纯化所生产的蛋白，实现用所获得的转化子生产蛋白。

用于本发明的桥石短小芽孢杆菌转化子的培养条件可为能够培养该转化子和表达该重组蛋白基因的任何条件，没有特别限定。作为一个特别优选的实例，将转化子在如本说明书给出的实施例中使用的TM培养基(蛋白胨1％、肉膏0.5％、酵母提取物0.2％、葡萄糖1％，pH 7.0)或2SL培养基(蛋白胨4％、酵母提取物0.5％、葡萄糖2％，pH 7.2)中于30℃培养2-4天。

如果有需要，可将无机盐如硫酸铁、硫酸镁和硫酸锌适当地添加到培养基中。

当分泌和生产重组蛋白时，则可通过在培养后以离心、过滤等的任何普通方法分离含所分泌和生产的蛋白的培养上清液和培养的桥石短小芽孢杆菌细胞，回收生产的重组蛋白。

当生产的蛋白不是分泌的而是积聚在桥石短小芽孢杆菌细胞中时，则可以本领域技术人员已知的任何方法回收在细胞中积聚和生产的蛋白。例如，按照离心、过滤等方法由培养液中收集细胞，然后按照超声破碎法或弗氏压碎器法破碎细胞，如果有需要，则用加入到其中的表面活性剂溶解破碎的细胞，由此回收在细胞中积聚和生产的蛋白。

为纯化所生产的蛋白，可使用本领域技术人员已知的任何方法。例如，可适宜地单独或组合使用溶剂提取、超滤、硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、疏水层析、电泳、等电点沉淀等。

本发明的作用：

本发明的桥石短小芽孢杆菌可在通过基因重组进行的蛋白生产中用作宿主。

本发明提供其胞外蛋白水解活性比已知菌株大为降低的桥石短小芽孢杆菌。当该桥石短小芽孢杆菌在分泌和生产的重组蛋白生产中用作宿主时，则其显著抑制由于胞外蛋白水解活性引起的重组蛋白降解。因此，桥石短小芽孢杆菌使得能够比已知桥石短小芽孢杆菌更有效地分泌生产重组蛋白。

本发明还提供其胞内蛋白水解活性比已知菌株大为降低的桥石短小芽孢杆菌。当该桥石短小芽孢杆菌在于细胞内积聚和生产的重组蛋白生产中用作宿主时，则其显著抑制由于胞内蛋白水解活性引起的重组蛋白降解。因此，桥石短小芽孢杆菌能够比已知桥石短小芽孢杆菌更有效地胞内积聚和生产重组蛋白。

另外，本发明提供不形成孢子的桥石短小芽孢杆菌。因为该桥石短小芽孢杆菌在温和灭菌条件下被完全杀灭，所以其在用于大范围工业应用的重组蛋白生产(如重组蛋白药物生产)中可用作宿主。

因此，本发明的桥石短小芽孢杆菌在通过基因重组进行的蛋白生产中作为宿主非常有用。本发明的其中一种菌株HPD31-SP3已进行了国际保藏(FERM BP-08479)，该菌株是一种新型三重缺陷型菌株，满足上述全部三种要求。

参照以下实施例更具体地描述本发明，但以下的实施例无意限制本发明的范围。

实施例

实施例1：

制备不具备孢子形成能力的桥石短小芽孢杆菌突变体：

用诱变剂亚硝基胍使桥石短小芽孢杆菌HPD31(FERM BP-1087)(FERM BP-6863)突变，以获得不具备孢子形成能力的桥石短小芽孢杆菌突变体。

首先，在TM液体培养基(蛋白胨1％、肉膏0.5％、酵母提取物0.2％、葡萄糖1％，pH 7.0)中于30℃过夜培养桥石短小芽孢杆菌HPD31。培养后，通过离心回收细胞，用无菌水漂洗和稀释所回收的细胞，以使OD为0.1。接着，以100mg/L的量向细胞中加入N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍，由此在振荡下使细胞突变，存活率为1-10％。

接着，用无菌水适宜地稀释突变细胞，然后涂布在TM平板培养基上，在其上于30℃培养3天，由此在TM平板培养基上形成其菌落。选择形成与普通桥石短小芽孢杆菌菌落不同的表面无皱菌落的菌株，并从由此选择的菌株中选择显微镜观察无孢子的那些菌株作为不具备孢子形成能力的菌株。重复突变处理和菌落形成的过程，其中获得5个可能不形成孢子的突变体。

实施例2：

以耐热性实验评价突变体的孢子形成能力：

以耐热性实验评价实施例1获得的5个突变体的孢子形成能力。桥石短小芽孢杆菌HPD31用作实验对照。

分别将桥石短小芽孢杆菌HPD31和5个突变体(1-5号)涂布在TM-琼脂培养基上，并以固定培养方式于30℃培养7天。培养期是7天，比普通桥石短小芽孢杆菌孢子形成的时间长。培养后，将细胞悬浮在含0.8％NaCl的无菌蒸馏水中，以使660nm的吸光度为1.0，将100μl的细胞悬浮液保持于80℃的温热状态10分钟，然后涂布在TM-琼脂培养基上。再将其以30℃恒温培养24小时，由生长菌落数计数活细胞数。

在80℃热处理前，用无菌蒸馏水分步稀释细胞悬浮液，并涂布在TM-琼脂培养基上，以30℃恒温培养24小时。培养后，由生长菌落数计数活细胞数。结果示于表1。

表1

菌株	活细胞数
	活细胞数		80℃加热前	80℃加热后
	桥石短小芽孢杆菌HPD31	3.3×10⁷	80℃加热前	80℃加热后	1.9×10⁷
桥石短小芽孢杆菌突变体1号	桥石短小芽孢杆菌HPD31	3.3×10⁷	4.3×10⁶	0	1.9×10⁷
桥石短小芽孢杆菌突变体1号	桥石短小芽孢杆菌突变体2号	1.7×10⁷	4.3×10⁶	0	0
桥石短小芽孢杆菌突变体3号	桥石短小芽孢杆菌突变体2号	1.7×10⁷	2.6×10⁶	0	0
桥石短小芽孢杆菌突变体3号	桥石短小芽孢杆菌突变体4号	6.5×10⁶	2.6×10⁶	0	0
桥石短小芽孢杆菌突变体5号	桥石短小芽孢杆菌突变体4号	6.5×10⁶	8.1×10⁶	0	0

表1表明，当80℃加热10分钟时，桥石短小芽孢杆菌HPD31全部活细胞仅有约1/2死亡，而1-5号桥石短小芽孢杆菌突变体在相同条件下完全死亡。换句话说，这明显提示，突变体不形成耐热性孢子。

实施例3：

测定突变体的D值：

接着，测试1-5号桥石短小芽孢杆菌突变体细胞，以确定其D值。桥石短小芽孢杆菌HPD31用作实验对照。

分别将桥石短小芽孢杆菌HPD31和1-5号桥石短小芽孢杆菌突变体涂布在TM-琼脂培养基上，并以固定培养方式于30℃培养7天。培养后，将细胞悬浮在0.8％无菌生理盐水中，以使660nm的吸光度为1.0。保持细胞悬浮液于60℃、70℃和80℃的不同温度的温热状态，温热开始后以1分钟、2分钟、3分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟和60分钟的不同时间点对悬浮液取样。冷却每种悬浮液的样品，然后分别涂布在TM-琼脂培养基上，于30℃培养24小时。培养后，由生长菌落数计数活细胞数。根据由此测定的细胞数进一步获得D值，其代表将孢子数降低至1/10所花费的时间。

一般来说，桥石短小芽孢杆菌的活细胞(无孢子细胞)在60℃或更高的温度范围内立即死亡，假定在实验开始后1分钟仍保持存活的细胞全是孢子，并基于此假设计算此处的数据。结果示于表2。

表2

菌株	D值(分钟)
	D值(分钟)			60℃	70℃	80℃
	桥石短小芽孢杆菌HPD31	330	94	60℃	70℃	80℃	67
桥石短小芽孢杆菌突变体1号	桥石短小芽孢杆菌HPD31	330	94	ND	ND	ND	67
桥石短小芽孢杆菌突变体1号	桥石短小芽孢杆菌突变体2号	ND	ND	ND	ND	ND	ND
桥石短小芽孢杆菌突变体3号	桥石短小芽孢杆菌突变体2号	ND	ND	ND	ND	ND	ND
桥石短小芽孢杆菌突变体3号	桥石短小芽孢杆菌突变体4号	ND	ND	ND	ND	ND	ND
桥石短小芽孢杆菌突变体5号	桥石短小芽孢杆菌突变体4号	ND	ND	ND	ND	ND	ND

ND：未检测到(少于1分钟)

桥石短小芽孢杆菌HPD31细胞在不同温度的D值如表2所示。但是，因为在实验开始后1分钟内1-5号桥石短小芽孢杆菌突变体细胞在这些温度下全部死亡，所以在这些温度不能测定其D值。显然，这些结果是由于全部1-5号桥石短小芽孢杆菌突变体的任一种都不形成孢子而产生的。

80℃恒温10分钟的实验和上述检测D值的实验证实了1-5号桥石短小芽孢杆菌突变体都不具备孢子形成能力，当于60℃保持1分钟时完全死亡。

实施例4：

使用1-5号突变体作为宿主生产重组蛋白(hEGF)：

测试1-5号桥石短小芽孢杆菌突变体在生产重组hEGF时的重组蛋白生产能力。方法和结果示于下文。桥石短小芽孢杆菌HPD31用作对照。

按照电穿孔法将人表皮生长因子(hEGF)表达质粒载体pHT110·EGF(JP-A 6-133782(1994))导入其中，转化桥石短小芽孢杆菌HPD31及其1-5号突变体。接着，分别将获得的转化子在3ml 2SL液体培养基(蛋白胨4％、酵母提取物0.5％、葡萄糖2％，pH 7.2)中于30℃振荡培养60小时。4-5号突变体不形成转化子。

培养后，离心培养液，用蒸馏水稀释上清液组分10倍，然后进行HPLC分析。根据由此获得的峰面积计算在培养液中分泌和生产的重组hEGF的量。结果示于表3。在表3中，桥石短小芽孢杆菌HPD31生产的hEGF的量为100％，其它宿主的数据为其相对值。

表3

宿主菌株	hEGF的相对产量(％)
宿主菌株	hEGF的相对产量(％)	桥石短小芽孢杆菌HPD31	100
1号桥石短小芽孢杆菌突变体	119	桥石短小芽孢杆菌HPD31	100
1号桥石短小芽孢杆菌突变体	119	2号桥石短小芽孢杆菌突变体	40
3号桥石短小芽孢杆菌突变体	20	2号桥石短小芽孢杆菌突变体	40

如表3所示，在1号桥石短小芽孢杆菌突变体用作宿主时的hEGF产量略高于桥石短小芽孢杆菌HPD31用作宿主的情况。该突变体的生长和转化效率与HPD31水平相同。

1号突变体命名为桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP1。

实施例5：

鉴别桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP1的突变基因：

鉴别在桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP1基因组上突变的基因。如下鉴别突变基因：制备桥石短小芽孢杆菌HPD31的基因组文库，将基因组文库的每个片段导入SP1中，选择恢复其孢子形成能力的菌株。

按照以下方法制备桥石短小芽孢杆菌HPD31的基因组文库。首先，由在TM培养基中培养15小时的桥石短小芽孢杆菌HPD31制备基因组DNA，然后用限制性内切核酸酶Sau3AI部分处理基因组DNA，获得基因组DNA片段。将获得的基因组DNA片段与已用限制性内切核酸酶BamHI处理过的质粒载体pNY301连接，由此形成基因组文库质粒DNA。再按照电穿孔法将基因组文库质粒DNA导入桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP1中。

接着，在TM液体培养基(不含抗生素)中于30℃培养其中导入了基因组文库质粒DNA的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP1转化子1小时，再在含新霉素的TM液体培养基中于30℃培养3天。培养后，将其在80℃加热10分钟，然后涂布至TM-琼脂培养基，在其上于30℃培养3天。通过培养，选择形成菌落的菌株作为恢复其孢子形成能力的菌株。

结果，获得8个恢复孢子形成能力的菌株。接着，由这8个菌株提取先前导入其中的质粒DNA，测定其DNA序列。结果证实这8个菌株中有3个具有编码新基因的共同翻译读框。由该结果推测，诱变剂处理使突变体桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP1中的基因失活，突变体已失去其孢子形成能力。由该共同翻译读框编码的新基因命名为hos。其DNA序列示于SEQ ID NO：1(图7和图8中的上行)。

接着，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为亲代菌株，构建hos基因失活菌株，证实桥石短小芽孢杆菌通过失活hos基因失去其孢子形成能力。

按照类似于已知的同源重组的方法构建hos基因失活菌株。其具体过程示于下文。

首先，构建hos基因失活用载体。按照PCR，使用引物Hos P1和Hos P2，扩增hos基因上游部分的DNA片段(1.5kbp，识别序列KpnI导入到上游侧，识别序列BamHI导入到下游侧)，然后用限制性内切核酸酶KpnI和BamHI处理已通过PCR扩增的1.5kbp DNA片段，并回收获得的DNA片段。另一方面，按照PCR，使用引物HosP3和Hos P4，扩增hos基因下游部分的约1.5kbp DNA片段(识别序列PstI导入到上游侧，识别序列XbaI导入到下游侧)，然后用限制性内切核酸酶PstI和XbaI处理约1.5kbp的该DNA片段，并回收获得的DNA片段。用限制性内切核酸酶BamHI和PstI处理具有新霉素抗性基因并在两侧具有FRT序列(Gene，212，77-86(1998))的DNA片段(1.4kbp)，回收所获得的DNA片段。

用限制性内切核酸酶SacI切出含红霉素抗性基因的DNA片段，将其插入到在桥石短小芽孢杆菌中不能复制的载体pBluescrip^II SK+(Toyobo Co.，Ltd.)中的SacI识别序列中。接着，将上述三种DNA片段全部同时导入所述质粒DNA的KpnI/XbaI限制性内切核酸酶切割位点中，由此构建hos基因失活用载体。由此构建的hos基因失活载体称为pBlue-hos::Nm^r。以上使用的引物Hos P1、Hos P2、Hos P3和Hos P4的碱基序列如SEQ ID NO：7、8、9和10所示，这些序列均示于图14。

接着，按照电穿孔法将hos基因失活载体pBlue-hos::Nm^r导入桥石短小芽孢杆菌HPD31中，根据其新霉素抗性作为指标选择产生的转化子。再将新霉素抗性菌株涂布至含红霉素的TM-琼脂培养基，并在其上于30℃培养2天，根据其对红霉素的敏感性作为指标选择菌株。通过PCR和基因组DNA分析证实，如此选择的菌株中的hos基因失活。再按照下文实施例7描述的方法，去除hos基因失活菌株中的新霉素抗性基因，由此获得hos基因失活的桥石短小芽孢杆菌菌株。

接着，按照实施例2和3的方法测试hos基因失活菌株的孢子形成能力，证实了该菌株不具备孢子形成能力。

此外，按照实施例4的方法测试hos基因失活菌株的重组蛋白生产能力，证实了其hEGF生产能力和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP1水平相同。

由这些测试结果得出结论：在桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP1中，通过用诱变剂处理使hos基因突变，并因此使其失活，结果突变体失去了其孢子形成能力。

构建其胞内主蛋白酶基因失活的桥石短小芽孢杆菌：

实施例6：

克隆胞内主蛋白酶基因imp：

(6-1)克隆imp：

为鉴别所要失活的蛋白酶，克隆桥石短小芽孢杆菌HPD31(FERM BP-1087)的胞内主蛋白酶基因。

用已按照实施例5的方法构建的桥石短小芽孢杆菌HPD31的基因组文库DNA转化桥石短小芽孢杆菌HPD31，将获得的转化子涂布到含1％脱脂奶和50μg/ml(为终浓度)新霉素的TM-琼脂培养基上，在其上于30℃培养4天。培养后，选择形成晕轮的菌株，晕轮代表脱脂奶分解。

再由以上获得的菌株中提取出质粒DNA，并测定DNA序列。结果，约1.4kbp的翻译读框(ORF)存在于桥石短小芽孢杆菌HPD31基因组来源的3.6kbp DNA片段中，约0.7kbp的ORF存在于该DNA片段的互补序列中。含约3.6kbp DNA片段的质粒命名为pNY-imp。

在3.6kbp DNA片段中含有的两个ORF中，构建仅含约1.4kbp的ORF的质粒和仅含约0.7kbp的ORF的质粒，并使用这些质粒中的每一种，转化桥石短小芽孢杆菌HPD31。

获得的转化子再分别在含1％脱脂奶的TM-琼脂培养基上培养，于是，含仅具约1.4kbp ORF的质粒的转化子在TM-琼脂培养基上形成晕轮。由此明显看出约1.4kbp的ORF编码蛋白酶。由约1.4kbp的ORF编码的蛋白酶命名为胞内主蛋白酶，缩写为IMP。在IMP和其它已知蛋白之间进行氨基酸序列同源性检索，但未发现与IMP显著同源的蛋白。

桥石短小芽孢杆菌HPD31菌株来源的胞内主蛋白酶基因(intracelluar major protease)imp的DNA碱基序列如SEQ ID NO：5所示(图12和图13中的上行)；对应于该DNA序列的胞内主蛋白酶IMP的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示(图12和图13中的下行)。

(6-2)Imp基因的表达和IMP蛋白的纯化

接着，为阐明IMP特性的细节，进行了imp基因的表达和IMP蛋白的纯化。

首先，为利于纯化所生产的IMP蛋白，构建质粒载体pNY-imp-His，其表达的多肽带有8个组氨酸的肽标记(组氨酸尾)，该标记加入到IMP的C端。按照以下方法构建质粒载体pNY-imp-His。

首先，使用有义引物imp P1和反义引物imp P2，用pNY-imp质粒DNA作为模板进行PCR。有义引物imp P1是与编码推定为IMP N端的氨基酸序列的DNA序列同源的引物。反义引物imp P2通过以下方法构建：加入编码组氨酸尾的8重重复gtg的DNA序列，再将终止密码子和限制性内切核酸酶EcoRI识别序列导入其中。有义引物imp P1的碱基序列如SEQ ID NO：11所示；反义引物imp P2的碱基序列如SEQ ID NO：12所示；这些序列都示于图15。

纯化含PCR扩增的、组氨酸尾编码序列和imp基因的DNA片段，然后用限制性内切核酸酶XhoI和EcoRI处理，获得约500bp的DNA片段。接着，将该DNA片段插入质粒pNY-imp的XhoI/EcoRI限制性内切核酸酶切割位点中，以获得质粒载体pNY-imp-His。

接着，用以上获得的质粒载体pNY-imp-His转化桥石短小芽孢杆菌HPD31，获得的转化子在600ml TM液体培养基中于30℃振荡培养48小时。培养后，以6000×g离心回收细胞，并悬浮在30ml清洗缓冲液(20mM磷酸盐，pH 7.4，2M KCl)中，然后再以6000×g离心回收细胞。该清洗操作重复两次，然后将细胞悬浮在30mM含0.2mg/ml溶菌酶和10单位DNA酶的裂解缓冲溶液(20mM磷酸盐，pH 7.4)中，并保持于37℃恒温20分钟。接着，超声破碎细胞，并以34000×g离心30分钟，回收上清液作为胞内组分。将30ml胞内组分通过0.22μm滤器过滤，向其中加入终浓度为0.5M的NaCl和10mM咪唑。然后，将其上1ml镍螯合柱(Amersham Pharmacia Co.)。以10-50mM咪唑的线性浓度梯度洗脱和收集吸附至镍螯合柱的IMP蛋白。用蛋白酶检测试剂盒QuantiCleave^(Pierce Biotechnology，Inc.)测定分级分离的洗脱液的蛋白酶活性，由此鉴别IMP活性组分。此外，对5μl活性组分进行SDS-PAGE，结果证实IMP蛋白在电泳中纯化至单一物质水平。

(6-3)IMP的特性：

使用10％丙烯酰胺浓度对含10μg IMP的纯酶制品进行SDS-PAGE，用半干蛋白转移装置将分离的蛋白转移到PVDF膜上，其中用含0.01％ CBB(考马斯亮蓝)和40％甲醇的染色溶液检测IMP蛋白条带。接着，用无CBB的40％甲醇溶液对PVDF膜进行脱色，然后干燥膜。接着，切出膜中的IMP蛋白条带，分析其N端氨基酸序列。这证实了该蛋白的N端序列是MetAsnHisProAsp。由以上结果发现，IMP是含453个氨基酸残基的胞内蛋白酶，估测分子量为49,811Da。

接着，使用蛋白酶检测试剂盒QuantiCleave^(PierceBiotechnology，Inc.)详细分析纯IMP的酶化学活性。将2mg底物琥珀酰化酪蛋白溶解在65μl的100mM硼酸缓冲溶液(pH 8.0)中，以制备酶底物溶液，向其中加入10μl含1.5μg IMP的纯酶制品，将其保持于37℃恒温20分钟。接着，向其中加入25μl显色溶液，并保持于室温20分钟。在显色后，检测450nm的液体吸光度，借此测定IMP蛋白水解活性。在IMP蛋白水解活性测定中，经30℃反应60分钟使450nm吸光度增加0.1的酶量为1单位。使用BSA作为标准品，按照Bradford法测定用于反应的酶蛋白的量。

由该结果可清楚看出，IMP的最适温度为30℃，其最适pH为8.0，其相对活性为44.7单位/mg蛋白，至少1mM EDTA抑制IMP活性。

实施例7：

构建其中胞内主蛋白酶基因imp失活的桥石短小芽孢杆菌：

接着，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP1作为亲代菌株，构建其中imp基因失活的桥石短小芽孢杆菌。为构建其中imp基因失活的桥石短小芽孢杆菌，使用类似于通过同源重组失活基因的方法。具体地说，方法如下：

首先，构建imp基因失活用载体。用限制性内切核酸酶EcoRV由imp基因中切出1kbp的DNA片段，其为imp基因的内部区域，将其插入到质粒载体pBluescript^II SK+(Toyobo Co.，Ltd.)的SmaI/EcoRI限制性内切核酸酶切割位点中。接着，对其用限制性内切核酸酶PstI处理，以去除imp基因内部的120bp区域。然后，将含新霉素抗性基因并在两端具有FRT序列的DNA片段插入到PstI限制性内切核酸酶切割位点中，由此切除imp基因。再将已用限制性内切核酸酶BamHI切出的含红霉素抗性基因的DNA片段插入到该质粒的BamHI限制性内切核酸酶切割位点中，由此构建imp基因失活载体。由此构建的imp基因失活载体称为pBlue-imp::Nm^r。

接着，按照电穿孔法将1μg imp基因失活载体pBlue-imp::Nm^r插入到桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP1中，并基于新霉素抗性作为指标选择转化子。将获得的新霉素抗性菌株涂布在含1μg/ml(为终浓度)红霉素的TM-琼脂培养基(蛋白胨1％、肉膏0.5％、酵母提取物0.2％、葡萄糖1％、琼脂1.5％，pH 7.0)上，并在其上于30℃培养2天，基于对红霉素的敏感性作为指标选择在imp基因的上游和下游区域中的两个基因位点进行了同源重组的菌株(双杂交菌株)。再对如此选出的菌株进行PCR和基因组DNA分析，结果证实该菌株中的imp基因失活。

接着，从以上构建的imp基因失活菌株基因组去除新霉素抗性基因。为去除imp基因失活菌株的新霉素抗性基因，首先按照下文提及的方法构建新霉素抗性基因缺失用的质粒载体，其具有酵母源Flp重组酶基因和博来霉素抗性基因。

首先，为了获得可容易地由桥石短小芽孢杆菌菌株细胞中去除的质粒载体，用化学品羟胺处理质粒载体pNY301(JP-A 10-295378(1998))，产生菌株突变体，然后在无新霉素的培养基中培养菌株。

具体地说，方法如下：

通过将350mg羟胺和90mg NaOH溶解在5ml冰冷的无菌蒸馏水中制备溶液，将1.5μg pNY301的质粒载体DNA溶解在该溶液(100μl)中，并保持在70℃恒温120分钟，然后通过乙醇沉淀浓缩质粒DNA，并干燥。接着，将质粒DNA溶解在无菌蒸馏水中，用其转化桥石短小芽孢杆菌HPD31。用于转化的质粒DNA的量是100ng。根据其新霉素抗性选择目标转化子。对于由生长缓慢并形成小菌落的转化子获得的质粒DNA，其拷贝/细胞数降低至使用原始pNY301质粒载体DNA获得的转化子的几十分之一；当转化子在无新霉素培养基中培养时，则质粒DNA容易由转化子细胞中去除。

使用质粒DNA作为模板，并使用其中加入EcoRI识别序列和PstI识别序列的有义引物flp P1(SEQ ID NO：3，图16)和其中加入BamHI识别序列的反义引物flp P2(SEQ ID NO：14，图17)进行PCR，由此扩增含rep基因的约1.6kbp DNA片段。接着，用限制性内切核酸酶EcoRI和BamHI处理约1.6kbp的DNA片段。

使用具有博来霉素抗性基因的质粒pNH300(Yasuhiro Shiga等，Applied and Environmental Microbiology，58，525-531(1992))作为模板，使用其中加入BglII识别序列的有义引物flp P3(SEQ ID NO：15，图18)和其中加入EcoRI识别序列和XbaI识别序列的反义引物flp P4(SEQ ID NO：16，图19)进行PCR，由此扩增同时含有博来霉素抗性基因和质粒Ori的约1.1kbp DNA片段。接着，用限制性内切核酸酶EcoRI和BalII处理约1.1kbp的DNA片段，连接以上获得的两个约1.6kbp的DNA片段和约1.1kbp的DNA片段，构建新质粒。该质粒称为pNY-Mut-Ble。

另一方面，使用酵母源质粒2-μm作为模板，使用其中加入NcoI识别序列的有义引物flp P5(SEQ ID NO：17，图20)和其中加入XhoI识别序列的反义引物flp P6(SEQ ID NO：18，图21)进行PCR，由此扩增含Flp重组酶基因的区域。接着，用NcoI和XhoI处理在此PCR中获得的含Flp重组酶基因的DNA片段，然后将其插入到载体pNY301的NcoI/XhoI限制性内切核酸酶切割位点中，获得含Flp重组酶基因的载体。该载体称为pNY301-Flp。

接着，使用该pNY301-Flp作为模板，使用其中加入XbaI识别序列的有义引物flp P7(SEQ ID NO：19，图22)和其中加入PstI识别序列的反义引物flp P8(SEQ ID NO：20，图23)进行PCR，由此扩增含F1p重组酶基因和pNY301来源的启动子区域的约1.6kbp DNA片段。接着，用限制性内切核酸酶XbaI和PstI处理该约1.6kbp的DNA片段，然后将其插入到以上获得的质粒pNY-Mut-Ble的XbaI/PstI限制性内切核酸酶切割位点中，由此构建新霉素抗性基因缺失用的载体。该新霉素抗性基因缺失载体称为pNY-Mut-Ble-Flp。此pNY-Mut-Ble-Flp是表达Flp重组酶基因的质粒载体，当其在无新霉素的培养基中培养时，其容易由桥石短小芽孢杆菌菌株细胞中去除。

接着，按照电穿孔法将新霉素抗性基因缺失载体pNY-Mut-Ble-Flp导入到imp基因失活菌株中，根据博来霉素抗性作为指标选择获得的转化子。接着，在无博来霉素的TM液体培养基中振荡培养转化子，然后在TM-琼脂培养基中培养转化子。由在TM-琼脂培养基上形成菌落的菌株中选择对新霉素和博来霉素都敏感的菌株。

按照以上的方法，获得imp基因失活的目标桥石短小芽孢杆菌菌株，该菌株缺失新霉素抗性基因，并去除了新霉素抗性基因缺失载体pNY-Mut-Ble-Flp。其中基因组上的胞内主蛋白酶基因imp失活的桥石短小芽孢杆菌菌株命名为桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP2。构建其中胞内和胞外主蛋白酶基因都失活的桥石短小芽孢杆菌：

接着，处理以上获得的imp基因失活的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP2，以失活其中的胞外主蛋白酶基因。其第一步是分离胞外主蛋白酶并克隆其基因。

实施例8：

克隆胞外主蛋白酶(extracellular major protease)(缩写为EMP)基因：

(8-1)纯化胞外主蛋白酶(EMP)：

在5升TM液体培养基中培养桥石短小芽孢杆菌HPD31(FERMBP-1087)24小时。在培养后，通过离心分离培养上清液，向其中加入50mM(终浓度)Tris-HCl(pH 7.5)，然后对其进行DEAE阴离子交换柱层析，用0-0.6M线性浓度梯度的NaCl洗脱EMP。

使含EMP的组分对50mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液透析，然后上肝素柱，用0-0.5M线性浓度梯度的NaCl洗脱，获得纯EMP制品。按照Analytical Biochemistry，102，196-202(1980)中的方法，通过明胶-PAGE测定每种洗出液组分的酶活性。

(8-2)EMP氨基酸序列分析：

8-2-1：N-端氨基酸序列分析：

使用10％丙烯酰胺浓度，对10μg纯EMP制品进行SDS-PAGE，以半干蛋白转移装置将分离的蛋白转移至PVDF膜上，其中用含0.01％CBB和40％甲醇的染色溶液检测EMP蛋白条带。接着，用无CBB的40％甲醇溶液对PVDF膜进行脱色，然后干燥膜。接着，切下膜上含蛋白条带的部分，用ABI蛋白测序仪492型分析其N端氨基酸序列。该氨基酸序列分析证实该蛋白的N端氨基酸序列含24个氨基酸残基：

AlaSerLysArgValHisThrAspAsnLeuValIleAlaLeuValGluPheAsnAspLeuGluGlyAsnGln。

8-2-2：内部氨基酸序列分析：

使用10％丙烯酰胺浓度，对50μg纯EMP制品进行SDS-PAGE，并切出含EMP蛋白条带的凝胶组分。接着，按照Current Protocols inProtein Science，11.3 Digestion of Proteins in Gel for Sequence Analysis，John Wiley & Sons，1995中的方法，用1μg胰蛋白酶对EMP进行凝胶内酶处理，以进行凝胶内EMP的有限消化。接着，以乙腈溶液回收胰蛋白酶处理的EMP的肽片段，然后用Mightysil Aqua PR18(KantoKagaku Co.)对其进行反相柱层析，其中用含0.05％TFA的0-60％线性浓度梯度的乙腈洗脱和分离EMP肽片段。然后，将由此洗脱和分离的EMP肽片段干燥至固体，用ABI蛋白测序仪492型对一个肽片段进行氨基酸序列分析。氨基酸序列分析证实内部部分氨基酸序列含10个氨基酸残基：IlePheGlnThrGlnProThrGlyPheAsp。

(8-3)克隆和鉴别emp基因

接着，根据以上获得的EMP的内部部分氨基酸序列数据，设计和合成两个寡核苷酸引物emp P1和emp P2。emp P1的碱基序列如SEQ ID NO：21所示；emp P2的碱基序列如SEQ ID NO：22所示。emp P1和emp P2的碱基序列和对应于emp P1和emp P2的碱基序列的氨基酸序列都示于图24。在SEQ ID NO：21序列中左数第6个“n”和SEQ ID NO：22序列中左数第6个“n”是肌苷。

使用这些引物emp P1和emp P2，用桥石短小芽孢杆菌HPD31的基因组DNA作为模板进行PCR，由此扩增约700bp的DNA片段。接着，在载体pUC118(Toyobo Co.，Ltd.)的HincII识别序列中亚克隆该约700bp的DNA片段，用于其DNA序列分析，结果证实该约700bp的DNA片段含部分emp基因。

接着，为了克隆在约700bp的DNA片段上游区域的DNA片段和在其下游区域的DNA片段，根据以上获得的约700bp的DNA片段的DNA序列数据，设计和合成下文提及的两个特异性引物，一个是用于扩增上游区域的反义引物emp P3，一个是用于扩增下游区域的有义引物emp P4。

用限制性内切核酸酶如EcoRV使桥石短小芽孢杆菌HPD31的基因组DNA片段化，并将接头DNA加入到DNA片段末端，以制备桥石短小芽孢杆菌HPD31的接头基因组DNA文库。

反义引物emp P3、有义引物emp P4和接头DNA的碱基序列分别如SEQ ID NO：23、24和25所示。它们全部示于图25。

接着，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31基因组的接头DNA文库作为模板进行PCR，由此扩增含全长emp基因的DNA片段。再通过对所获得的PCR扩增产物进行直接测序，测定emp基因的DNA序列。

来源于桥石短小芽孢杆菌HPD31菌株的胞外主蛋白酶基因emp的DNA序列如SEQ ID NO：3(图9-11中的上行)所示。对应于该DNA序列的胞外主蛋白酶EMP的氨基酸序列如SEQ ID NO：4(图9-11中的下行)所示。

(8-4)EMP的特性：

胞外主蛋白酶EMP是酸性蛋白，含754个氨基酸残基作为前原结构，分子量约84kDa，推测其胞外分泌时其N端的124个氨基酸可能被切除，其成熟为含630个氨基酸残基的结构，分子量约71kDa。在成熟蛋白N端的207位上存在HEXXH序列，该序列可能参与锌金属蛋白酶的锌离子的配位。因此，推测EMP为锌金属蛋白酶。

EMP与丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的金属蛋白酶在氨基酸水平上具有37％的同源性。

实施例9：

构建其中imp基因和emp基因失活的桥石短小芽孢杆菌菌株：

接着，失活在实施例7中获得的作为亲代菌株的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP2中的emp基因，由此产生其中两个蛋白酶基因imp和emp失活的桥石短小芽孢杆菌菌株。为产生其中emp基因失活的桥石短小芽孢杆菌菌株，使用类似于通过同源重组进行的基因失活万法的方法。

首先，构建emp基因失活用的载体。使用实施例8-3中描述的empP4引物(SEQ ID NO：24)和接头引物(SEQ ID NO：24)，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31的接头基因组DNA文库作为模板进行PCR，由此扩增含部分emp基因的约2.2kbp DNA片段。

接着，将通过PCR扩增的约2.2kbp DNA片段插入到pUC118的HincII限制性内切核酸酶切割位点中。接着，将已用限制性内切核酸酶BamHI切出的含红霉素抗性基因的DNA片段插入到所插入DNA片段附近的BamHI识别序列中。接着，用限制性内切核酸酶HindIII和PstI去除emp基因内部的220bp部分，然后将含新霉素抗性基因并在两侧具有FRT序列的DNA片段插入到质粒的HindIII/PstI限制性内切核酸酶切割位点中，由此构建emp基因失活用的载体。emp基因失活载体称为pBlue-emp::Nm^r。

接着，使用emp基因失活载体pBlue-emp::Nm^r，失活桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP2的emp基因。按照和实施例7中的imp基因失活菌株构建相同的方法，实现用pBlue-emp::Nm^r失活emp基因，以及由emp基因失活菌株基因组中去除新霉素抗性基因。

以上获得的其中imp基因和emp基因失活的桥石短小芽孢杆菌菌株命名为桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3，其以FERM BP-08479进行了国际保藏。

证实桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3没有孢子形成能力：

实施例10：

耐热性测试：

为证实以上获得的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3不具备孢子形成能力的事实，以和实施例2相同的方式测试菌株的耐热性。桥石短小芽孢杆菌HPD31用作实验对照。结果示于表4。

表4

菌株	活细胞数
	活细胞数		80℃加热前	80℃加热后
	桥石短小芽孢杆菌HPD31	7.6×10⁷	80℃加热前	80℃加热后	1.9×10⁷
桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3	桥石短小芽孢杆菌HPD31	7.6×10⁷	2.1×10⁷	0	1.9×10⁷

当于80℃加热10分钟时，桥石短小芽孢杆菌HPD31全部活细胞约有3/4死亡，而在相同条件下桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的所有活细胞完全死亡。换句话说，这表明后者不形成耐热性孢子。

实施例11：

测定D值：

接着，为分析桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的孢子形成能力，以和实施例3相同的方式测定菌株的D值。桥石短小芽孢杆菌HPD31用作实验对照。结果示于表5。

表5

菌株	D值(分钟)
	D值(分钟)			60℃	70℃	80℃
	桥石短小芽孢杆菌HPD31	330	94	60℃	70℃	80℃	67
桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3	桥石短小芽孢杆菌HPD31	330	94	ND	ND	ND	67

ND：未检测到(小于1分钟)

桥石短小芽孢杆菌HPD31细胞在不同温度时的D值如表5所示。但是，因为在实验开始后的1分钟内桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的所有细胞在这些温度下都死亡，所以在这些温度不能测定其D值。显然，这些结果是由于桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3不形成孢子而产生的。

上述80℃恒温10分钟的实验和检测D值的实验证实了桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3不具备孢子形成能力。

评价桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性：

评价了桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性。

首先证实了以下事实：桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3不分解乳酪蛋白和BSA，它们也不能被桥石短小芽孢杆菌HPD31(FERM BP-1087)(短芽孢杆菌H102)(JP-1 63-56277(1988))分解。

实施例12：

以乳酪蛋白分解实验评价桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的胞外蛋白

酶活性：

将桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3细胞接种在含5％、2％或1％脱脂奶的TM-琼脂平板培养基上，然后在其上于37℃培养3天，以观察在菌落周围是否由于乳酪蛋白分解而形成晕轮。结果，在任一种含5％、2％或1％脱脂奶的TM-琼脂培养基上都根本没有形成晕轮。

此结果证实桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3不具有分解乳酪蛋白的能力。

实施例13：

以BSA分解实验评价桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性：

将桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3细胞接种在10ml TM液体培养基上，向其中加入通过过滤除菌获得的3.2mg/ml(为终浓度)BSA(Sigma A4503)溶液，并在其中于37℃以200rpm振荡培养。

在培养开始后24、48和72小时，对培养物滤液取样，每个培养物样品以10000rpm离心5分钟。接着，将125μl的0.5M Tris-HCl(pH 6.8)、200μl 10％SDS和50μl β-巯基乙醇加入到通过离心获得的625μl培养上清液组分中，然后搅拌，在沸水中加热3分钟。在所述加热后，接着向其中加入0.1ml含0.05％ BPB和70％甘油的0.0625MTris-HCl(pH 6.8)，并进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。以10％的丙烯酰胺浓度进行SDS-PAGE。通过用CBB(考马斯亮蓝)染色完成蛋白检测。结果，在培养开始后的24、48和72小时的任一时间，都未发现代表BSA分解的条带。

结果证实桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3不具有BSA分解能力。

再按照明胶-PAGE法和使用偶氮酪蛋白或Azocoll的方法评价桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性。桥石短小芽孢杆菌HPD31(FERM BP-1087)用作实验对照。

实施例14：

以明胶-PAGE评价HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性：

在TM液体培养基中分别培养桥石短小芽孢杆菌HPD31细胞和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3细胞48小时，对10μl培养上清液组分进行明胶-PAGE。按照Analytical Biochemistry 102，196-202(1980)中的方法进行明胶-PAGE。将电泳后的凝胶放入含10mM CaCl₂的50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)中，37℃恒温16小时，由此分解凝胶中的明胶。在所述恒温放置后，用含0.1％酰胺黑、30％甲醇和10％乙酸的染色溶液对其染色30分钟，然后用不含酰胺黑的相同溶液脱色。结果如图2所示。

如图2所示，桥石短小芽孢杆菌HPD31的培养上清液组分由于其蛋白水解活性而产生代表明胶分解的约40kDa迁移率的清晰条带，但桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的培养上清液组分未产生代表明胶分解的清晰条带。

实施例15：

使用偶氮酪蛋白测定HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性：

在T2培养基(蛋白胨1％、肉膏0.5％、酵母提取物0.2％、葡萄糖1％)中于30℃分别振荡培养桥石短小芽孢杆菌HPD31细胞和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3细胞6天。培养物以10,000rpm离心10分钟，获得的上清液用作活性测定的样品。将5g偶氮酪蛋白溶解在1L 0.1M Tris-HCl(pH 8.0)中，以制备底物溶液。接着，向0.1ml底物溶液中加入相同量的样品，二者于37℃反应5小时。然后，通过向其中加入0.2ml 10％三氯乙酸溶液终止反应。接着，将其静止保持于室温20分钟，然后以15,000rpm离心10分钟，以收集上清液组分。向其中加入0.4ml 0.5N NaOH，检测其440nm的吸光度。检测结果示于表6。在表6中，在5小时的反应中使吸光度改变10的酶活性定义为1单位。

表6

菌株	酶活性(单位/ml培养上清液)
菌株	酶活性(单位/ml培养上清液)	桥石短小芽孢杆菌HPD31	0.12
桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3	ND	桥石短小芽孢杆菌HPD31	0.12

ND：未检测到(至多0.001)。

如以上表6所示，在使用偶氮酪蛋白试剂的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3实验中未检测到蛋白酶活性。桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的培养上清液组分的蛋白酶活性至多是桥石短小芽孢杆菌HPD31的培养上清液组分的1/120。

实施例16：

使用Azocoll测定HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性：

在TM液体培养基中分别培养桥石短小芽孢杆菌HPD31细胞和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3细胞48小时。培养后，离心并分离培养液，用Centricon plus-20(Biomax-5)将每种培养上清液组分浓缩10倍。接着，将300μl浓缩的上清液与相同量的含10mM CaCl₂和1％Azocoll的100mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)混合，并于37℃恒温搅拌3小时。在反应后，立即离心反应溶液，检测培养上清液520nm的吸光度，由此测定酶活性。结果示于表7。在37℃、1小时的反应中使520nm吸光度增加0.01的酶活性定义为1单位。

表7

菌株	酶活性(单位/ml培养上清液)
菌株	酶活性(单位/ml培养上清液)	桥石短小芽孢杆菌HPD31	33.2
桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3	ND	桥石短小芽孢杆菌HPD31	33.2

ND：未检测到(至多0.1)。

如以上表7所示，在使用Azocoll试剂的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3实验中未检测到蛋白酶活性。桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的培养上清液组分的蛋白酶活性至多是桥石短小芽孢杆菌HPD31的培养上清液组分的1/330。

以上的实施例14至实施例16表明，与已知菌株桥石短小芽孢杆菌HPD31相比，本发明的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的胞外蛋白酶活性显著降低。

评价桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的胞内蛋白酶活性

接着，按照明胶-PAGE法和使用偶氮酪蛋白的方法评价本发明的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的胞内蛋白酶活性。桥石短小芽孢杆菌HPD31用作实验对照。

实施例17：

在非变性条件下以明胶-PAGE评价桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的胞内蛋白酶活性

在TM液体培养基中于30℃分别培养桥石短小芽孢杆菌HPD31细胞和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3细胞48小时。培养后，通过离心收集培养液中的细胞，然后通过超声破碎，再离心获得胞内组分。在非变性条件下对胞内组分进行电泳。非变性条件下的电泳如下进行：向10μl胞内组分中加入50mM(为终浓度)Tris-HCl(pH 6.8)和10％甘油，然后加至含0.1％明胶的10％丙烯酰胺凝胶，用无SDS的Tris-甘氨酸缓冲溶液于4℃以10mA恒定电流进行10小时电泳。

在电泳后，将丙烯酰胺凝胶在含10mM CaCl₂的50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)中于37℃恒温放置24小时，然后用含0.1％酰胺黑、30％甲醇和10％乙酸的染色溶液染色30分钟，用不含酰胺黑的相同溶液脱色。结果如图3所示。

如图3所示，桥石短小芽孢杆菌HPD31的胞内组分由于其蛋白水解活性而产生代表明胶分解的清晰条带，但桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的胞内组分未产生代表明胶分解的清晰条带。

实施例18：

使用偶氮酪蛋白测定桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的胞内蛋白酶活性：

将200μl以和实施例17相同的方式制备的桥石短小芽孢杆菌HPD31胞内组分或桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3胞内组分与400μl酶反应溶液(100mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.2％偶氮酪蛋白、10mM CaCl₂)混合，并放置于37℃恒温1.5小时，然后通过向其中加入2.5％(为终浓度)TCA终止反应。接着，离心反应溶液，并检测上清液440nm的吸光度。使用BSA作为标准品，按照Bradford法定量测定用于反应的粗酶溶液中的蛋白总量。结果示于表8。在37℃、1小时的反应中使440nm吸光度增加0.01的酶活性定义为1单位。

表8

菌株	相对活性(单位/mg蛋白)
菌株	相对活性(单位/mg蛋白)	桥石短小芽孢杆菌HPD31	41.5(±1)
桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP33	5.2(±1.4)	桥石短小芽孢杆菌HPD31	41.5(±1)

如以上表8所示，桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的胞内蛋白酶活性降低至桥石短小芽孢杆菌HPD31的约1/8。

以上的实施例17和实施例18表明，与桥石短小芽孢杆菌HPD31相比，本发明的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3的胞内蛋白酶活性显著降低。

用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3分泌和生产重组蛋白：

接着，进行实验来评价使用本发明的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主的重组蛋白的生产和降解。首先，测试用该菌株分泌生产重组蛋白的情况。

所进行的测试涉及对应地在使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主分泌生产的情况下已被部分降解的重组蛋白。

所述在使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主分泌生产时被部分降解的蛋白是猪源IL-1β成熟形式(EMBL登录号X74568)；大肠杆菌K12菌株来源的麦芽糖结合蛋白成熟形式(EMBL登录号AAB59056)；牛源巨噬细胞集落刺激因子成熟形式(GenBANK登录号NM_174026.1)；具有猪丹毒抗原性的猪丹毒抗原蛋白的一部分EN2(JP-A 2000-279179)；以及作为具有亲密素抗原性的大肠杆菌O157:H7菌株来源的亲密素(SWISS-PROT登录号P43261)的一部分的多肽(Intimin(339-575))。桥石短小芽孢杆菌HPD31用作对照。

实施例19：

使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3分泌生产猪IL-1β蛋白：

使用有义引物(SEQ ID NO：26，图26，其中NcoI识别序列和编码部分信号肽的序列加入到编码猪源IL-1β成熟形式(EMBL登录号X74568)(下文称为猪IL-1β)的N端氨基酸残基的DNA序列中)和反义引物(SEQ ID NO：27，图27，其中HindIII识别序列加入到编码其C端氨基酸残基的DNA序列中)，使用猪源IL-1βcDNA作为模板进行PCR。接着，用限制性内切核酸酶NcoI和HindIII处理通过PCR扩增的DNA片段，并将其插入到pNY301载体的NcoI/HindIII限制性内切核酸酶切割位点中，由此构建猪IL-1β分泌生产载体。猪IL-1β分泌生产载体称为pNY301-pIL-1β。

接着，按照电穿孔法将pNY301-pIL-1β导入桥石短小芽孢杆菌HPD31和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3中，由此构建其转化子。接着，在TM液体培养基中于30℃分别培养转化子90小时。培养后，离心和分离培养液，获得的培养上清液进行10-25％浓度梯度丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳后，使用半干蛋白转移装置将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。接着，按照普通方法，使用抗猪IL-1β抗体对转移膜进行蛋白质印迹分析，由此检测猪IL-1β。

结果，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主的样品产生清晰条带，表明猪IL-1β降解，但使用本发明的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主的样品不产生表明猪IL-1β降解的条带，如图5所示。

在电泳后，用CBB染色凝胶，以检测蛋白条带，并通过测定对应于猪IL-1β的条带的光密度，测定培养液中积聚的猪IL-1β的量。

表9

宿主菌株	培养液中积聚的猪IL-1β的量(mg/L)
宿主菌株	培养液中积聚的猪IL-1β的量(mg/L)	桥石短小芽孢杆菌HPD31	30
桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3	80	桥石短小芽孢杆菌HPD31	30

如表9所示，与使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-S5作为宿主生产的培养液中的情况相比，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主生产的培养液中的猪IL-1β的量增至至少约2.5倍。

实施例20：

使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3分泌生产大肠杆菌MBP：

使用有义引物(SEQ ID NO：28，图28，其中PstI识别序列加入到编码大肠杆菌K12菌株来源的麦芽糖结合蛋白(MBP)成熟形式(EMBL登录号AAB59056)(下文称为大肠杆菌MBP)的N端氨基酸残基的DNA序列中)和反义引物(SEQ ID NO：29，图29，其中HindIII识别序列加入到编码其C端氨基酸残基的DNA序列中)，使用大肠杆菌K12菌株基因组DNA作为模板进行PCR。接着，用限制性内切核酸酶PstI和HindIII处理通过PCR扩增的DNA片段，并将其插入到pNY301载体的PstI/HindIII限制性内切核酸酶切割位点中，由此构建大肠杆菌MBP分泌生产载体。大肠杆菌MBP分泌生产载体称为pNY301-MBP。

接着，按照电穿孔法将pNY301-MBP导入桥石短小芽孢杆菌HPD31和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3中，由此构建其转化子。接着，在TM液体培养基中于30℃分别培养转化子72小时。培养后，离心和分离培养液，获得的培养上清液以和实施例19相同的方式进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。结果，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主的样品产生清晰条带，表明大肠杆菌MBP降解，但使用本发明的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主的样品不产生表明大肠杆菌MBP降解的条带。

在电泳后，用CBB染色凝胶，以检测蛋白条带，并通过测定对应于大肠杆菌MBP的条带的光密度，测定培养液中积聚的大肠杆菌MBP的量。结果示于表10。

表10

宿主菌株	培养液中积聚的大肠杆菌MBP的量(mg/L)
宿主菌株	培养液中积聚的大肠杆菌MBP的量(mg/L)	桥石短小芽孢杆菌HPD31	500
桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3	900	桥石短小芽孢杆菌HPD31	500

如表10所示，与使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主生产的培养液中的情况相比，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主生产的培养液中的大肠杆菌MBP的量增至约2倍。

实施例21：

使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3分泌生产牛M-CSF：

使用有义引物(SEQ ID NO：30，图30，其中BamHI识别序列加入到编码牛源巨噬细胞集落刺激因子成熟形式(GenBANK登录号NM_174026.1)(下文称为牛M-CSF)的N端氨基酸残基的DNA序列中)和反义引物(SEQ ID NO：31，图31，其中HindIII识别序列加入到编码其C端氨基酸残基的DNA序列中)，使用牛M-CSF cDNA作为模板进行PCR。接着，用限制性内切核酸酶BamHI和HindIII处理通过PCR扩增的DNA片段，并将其插入到pNY301载体的BamHI/HindIII限制性内切核酸酶切割位点中，由此构建牛M-CSF分泌生产载体。牛M-CSF分泌生产载体称为pNY301-M-CSF。

接着，按照电穿孔法将pNY301-M-CSF导入桥石短小芽孢杆菌HPD31和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3中，由此构建其转化子。接着，在TM液体培养基中于30℃分别培养转化子72小时。培养后，离心和分离培养液，获得的培养上清液组分以和实施例19相同的方式进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。结果，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主的样品产生清晰条带，表明牛M-CSF降解，但使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主的样品不产生表明牛M-CSF降解的条带。

在电泳后，用CBB染色凝胶，以检测蛋白条带，并通过测定对应于牛M-CSF的条带的光密度，测定培养液中积聚的蛋白量。结果示于表11。

表11

宿主菌株	培养液中积聚的牛M-CSF的量(mg/L)
宿主菌株	培养液中积聚的牛M-CSF的量(mg/L)	桥石短小芽孢杆菌HPD31	50
桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3	150	桥石短小芽孢杆菌HPD31	50

如表11所示，与使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主生产的培养液中的情况相比，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主生产的培养液中积聚的牛M-CSF的量增加至约3倍。

实施例22：

使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3分泌生产EN2：

按照电穿孔法将表达猪丹毒抗原蛋白的一部分-EN2(JP-A2000-279179)的质粒载体pNH300 en2导入桥石短小芽孢杆菌HPD31和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3中，由此构建其转化子，在TM液体培养基中于30℃分别培养转化子90小时。

培养后，离心和分离培养液，获得的培养上清液组分以和实施例19相同的方式进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。结果，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主的样品产生清晰条带，表明EN2降解，但使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主的样品不产生表明EN2降解的条带。

在电泳后，用CBB染色凝胶，以检测蛋白条带，并通过测定对应于EN2的条带的光密度，测定培养液中积聚的蛋白量。结果示于表12。

表12

宿主菌株	培养液中积聚的EN2的量(mg/L)
宿主菌株	培养液中积聚的EN2的量(mg/L)	桥石短小芽孢杆菌HPD31	400
桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3	750	桥石短小芽孢杆菌HPD31	400

如表12所示，与使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主生产的培养液中的情况相比，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主生产的培养液中积聚的EN2的量增加至约2倍。

实施例23：

使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3生产亲密素(339-575)：

使用有义引物(SEQ ID NO：32，图32，其中BamHI识别序列加入到对应于成熟亲密素的第339个氨基酸序列的DNA序列中)和反义引物(SEQ ID NO：33，图33，其中HindIII识别序列加入到对应于其第575个氨基酸附近的氨基酸序列的DNA序列中)，使用亲密素基因作为模板进行PCR。接着，用限制性内切核酸酶HindIII和BamHI处理通过PCR扩增的DNA片段，并将其插入到pNY301的BamHI/HindIII限制性内切核酸酶切割位点中，由此构建表达多肽部分的质粒载体，该多肽部分对应于大肠杆菌O157:H7菌株来源的亲密素的第339-575位氨基酸残基的氨基酸序列(SWISS-PORT登录号P43261)(下文称为亲密素(339-575))。亲密素(339-575)分泌生产载体称为pNY301-Intimin。

接着，按照电穿孔法将pNY301-Intimin导入桥石短小芽孢杆菌HPD31和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3中，由此构建其转化子。接着，在TM液体培养基中于30℃分别培养转化子90小时。培养后，离心和分离培养液，获得的培养上清液组分以和实施例19相同的方式进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。结果，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主的样品产生清晰条带，表明亲密素(339-575)降解，但使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主的样品不产生表明亲密素(339-575)降解的条带。

在电泳后，用CBB染色凝胶，以检测蛋白条带，并通过测定对应于亲密素(339-575)的条带的光密度，测定培养液中积聚的亲密素(339-575)的量。结果示于表13。

表13

宿主菌株	培养液中积聚的亲密素(339-575)的量(mg/L)
宿主菌株	培养液中积聚的亲密素(339-575)的量(mg/L)	桥石短小芽孢杆菌HPD31	100
桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3	200	桥石短小芽孢杆菌HPD31	100

如表13所示，与使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主生产的培养液中的情况相比，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主生产的培养液中积聚的亲密素(339-575)的量增加至约2倍。

实施例19至实施例23表明：当桥石短小芽孢杆菌HPD31用作宿主时，分泌和生产的部分重组蛋白降解。但是，当使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主时，蛋白的积聚量比使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主的情况增加。

显然，这些结果是由于桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3用作宿主而产生的，所分泌和生产的蛋白的降解被显著抑制。

桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3胞内积聚和生产重组蛋白：

接着，再进行实验，以评价并非在分泌生产中、而是在胞内积聚生产中使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主时重组蛋白的生产和降解。猪源干扰素-γ(PIR登录号S10513)和犬源干扰素-β(GenBANK登录号E11229)用作所述重组蛋白。当将这些蛋白中的每一种用于使用桥石短小芽孢杆菌HPD31进行胞内积聚生产时，所生产的蛋白在细胞中被部分降解。

桥石短小芽孢杆菌HPD31用作对照。

实施例24：

使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3胞内积聚生产重组猪源干扰素γ：

使用有义引物(SEQ ID NO：34，图34，其中含NcoI识别序列的ccatggct序列和编码MetAla的序列加入到编码猪源干扰素-γ成熟形式(PIR登录号S10513)(下文称为猪IFN-γ)的N端氨基酸残基的DNA序列中)和反义引物(SEQ ID NO：35，图35，其中HindIII识别序列加入到编码其C端氨基酸残基的DNA序列中)，使用猪源干扰素-γcDNA作为模板进行PCR。接着，用限制性内切核酸酶NcoI和HindIII处理通过PCR扩增的DNA片段，并将其插入到在pNY301载体的翻译起始甲硫氨酸上存在的BspHI/HindIII限制性内切核酸酶切割位点中，由此构建猪IFN-γ表达载体。猪IFN-γ表达载体称为pNY301-pIFN-γ。因为此pNY301-pIFN-γ不具有编码分泌信号肽的DNA序列，所以所生产的猪IFN-γ在胞内积聚。

接着，按照电穿孔法将pNY301-pIFN-γ导入桥石短小芽孢杆菌HPD31和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3中，由此构建其转化子。作为对照，构建其中导入未插入猪IFN-γ基因的pNY301的桥石短小芽孢杆菌HPD31/pNY301。

接着，在TM液体培养基中于30℃分别培养转化子和桥石短小芽孢杆菌HPD31/pNY301 72小时。培养后，通过离心由培养液中回收细胞，并超声破碎，通过离心收集胞内组分。接着，以和实施例19相同的方式对胞内组分进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。

结果，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主的样品产生清晰条带，表明猪IFN-γ降解，但使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主的样品不产生表明猪IFN-γ降解的条带，如图6所示。

在电泳后，用CBB染色凝胶，以检测蛋白条带，并通过测定对应于猪IFN-γ的条带的光密度，测定细胞中积聚的蛋白的量。结果示于表14。

表14

宿主菌株	细胞中积聚的猪IFN-γ的量(mg/L)
宿主菌株	细胞中积聚的猪IFN-γ的量(mg/L)	桥石短小芽孢杆菌HPD31	30
桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3	60	桥石短小芽孢杆菌HPD31	30

如表14所示，与使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主生产的细胞中的情况相比，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主生产的猪IFN-γ的胞内积聚量增加至约2倍。

实施例25：

使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3胞内积聚生产犬源干扰素-β：

使用有义引物(SEQ ID NO：36，图36，其中BspHI识别序列加入到编码犬源干扰素-β成熟形式(GenBANK登录号E11229)(下文称为犬IFN-β)的N端氨基酸残基的DNA序列中)和反义引物(SEQ IDNO：37，图37，其中HindIII识别序列加入到编码其C端氨基酸残基的DNA序列中)，使用犬源干扰素-βcDNA作为模板进行PCR。接着，用限制性内切核酸酶BspHI和HindIII处理通过PCR扩增的DNA片段，并将其插入到在pNY301载体的翻译起始甲硫氨酸上存在的BspHI/HindIII限制性内切核酸酶切割位点中，由此构建犬IFN-β表达载体。犬IFN-β表达载体称为pNY301-cIFN-β。因为此pNY301-cIFN-β不具有编码分泌信号肽的DNA序列，所以所生产的犬IFN-β在胞内积聚。

接着，按照电穿孔法将pNY301-cIFN-β导入桥石短小芽孢杆菌HPD31和桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3中，由此构建其转化子。接着，在TM液体培养基中于30℃分别培养转化子72小时。培养后，通过离心由培养液中回收细胞，并超声破碎，通过离心收集胞内组分。接着，以和实施例21相同的方式对胞内组分进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。结果，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主的样品产生清晰条带，表明犬IFN-β降解，但使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主的样品不产生表明犬IFN-β降解的条带。

在电泳后，用CBB染色凝胶，以检测蛋白条带，并通过测定对应于犬IFN-β的条带的光密度，测定细胞中积聚的蛋白量。结果示于表15。

表15

宿主菌株	细胞中积聚的犬IFN-β的量(mg/L)
宿主菌株	细胞中积聚的犬IFN-β的量(mg/L)	桥石短小芽孢杆菌HPD31	50
桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3	80	桥石短小芽孢杆菌HPD31	50

如表15所示，与使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主生产的细胞中的情况相比，使用桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主生产的犬IFN-β的胞内积聚量增加至约1.6倍。

实施例24和实施例25表明：当在重组蛋白生产中使用本发明的桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3作为宿主时，则蛋白的积聚量比使用桥石短小芽孢杆菌HPD31作为宿主的情况增加。显然，这些结果是由于胞内蛋白酶基因imp基因失活而使胞内积聚的重组蛋白受到显著抑制而产生的。

保藏号：FERM BP-08497

保藏名称：桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3

保藏单位名称：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心

保藏单位地址：日本茨城县筑波市东1丁1番1中央第6，邮编305-8566

保藏日：2003年9月11日

保藏号：FERM BP-6863

保藏名称：桥石短小芽孢杆菌HPD31(FERM BP-1087)

保藏单位名称：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所

保藏单位地址：

日本茨城县筑波市东1丁1番3号，邮编305-8566

保藏日：1999年8月31日

保藏号：FERM BP-6623

保藏名称：短芽孢杆菌HPD31-S5

保藏单位地址：

日本茨城县筑波市东1丁1番3号，邮编305-8566

保藏日：1999年1月19日

序列表

<110>日下田酱油股份有限公司

<120>新型桥石短小芽孢杆菌和使用该微生物作为宿主生产蛋白的方法

<130>6826

<141>2004-11-08

<160>37

<210>1

<211>756

<212>DNA

<213>桥石短小芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)

<400>1

atgggtgccg atatcaaaaa tgcgagtcaa ccatttctga ccaatgacca agtgaaagat 60

ttgatagcca agagccaagc tggcgatacg gatgcacgtg agcttctcgt gaatagcaat 120

atcagactgg tctggtccgt cgtccagcgc tttatcaacc gcgggtatga agcggatgat 180

ttgtttcaga tcggttgcat tggcttgctc aaggccgttg acaagttcga tctttcgtac 240

gatgtgagat tttcgaccta tgcggtgcca atgatcatcg gagaaattca acgctttttg 300

cgcgatgacg gtacggtlaa ggtcagtcga tcgttaaaag aaacagcgaa taaggtgcgg 360

cgatcaaagg atgaattgta caagcaattc ggccgtgccc ccacgatcgc agaagtggca 420

gaagcagtgg gaatcacgcc ggaggaagta gtctttgcgc aagaggcaag cagagcgcct 480

tcctccatcc atgagaccgt ttttgaaaat gacggcgatc ccatcacact gatcgatcag 540

atagcggatg aaggtgtgaa caagtggttt gagaaaattg ccttgaagga cgccatcagc 600

aggctgagcg agcgtgagca gctcatcgtc tacctgcgct attacaagga tcagacacag 660

tctgaggtag cagagcgtct agggatttcg caggtccagg tctcgcgtct ggaaaagcgt 720

atcctgctaa cgatcaagga gcaaattgaa cattag 756

<210>2

<211>251

<212>PRT

<213>桥石短小芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)

<400>2

Met Gly Ala Asp Ile Lys Asn Ala Ser Gln Pro Phe Leu Thr Asn Asp

5 10 15

Gln Val Lys Asp Leu Ile Ala Lys Ser Gln Ala Gly Asp Thr Asp Ala

20 25 30

Arg Glu Leu Leu Val Asn Ser Asn Ile Arg Leu Val Trp Ser Val Val

35 40 45

Gln Arg Phe Ile Asn Arg Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Leu Phe Gln Ile

50 55 60

Gly Cys Ile Gly Leu Leu Lys Ala Val Asp Lys Phe Asp Leu Ser Tyr

65 70 75 80

Asp Val Arg Phe Ser Thr Tyr Ala Val Pro Met Ile Ile Gly Glu Ile

85 90 95

Gln Arg Phe Leu Arg Asp Asp Gly Thr Val Lys Val Ser Arg Ser Leu

100 105 110

Lys Glu Thr Ala Asn Lys Val Arg Arg Ser Lys Asp Glu Leu Tyr Lys

115 120 125

Gln Phe Gly Arg Ala Pro Thr Ile Ala Glu Val Ala Glu Ala Val Gly

130 135 140

Ile Thr Pro Glu Glu Val Val Phe Ala Gln Glu Ala Ser Arg Ala Pro

145 150 155 160

Ser Ser Ile His Glu Thr Val Phe Glu Asn Asp Gly Asp Pro Ile Thr

165 170 175

Leu Ile Asp Gln Ile Ala Asp Glu Gly Val Asn Lys Trp Phe Glu Lys

180 185 190

Ile Ala Leu Lys Asp Ala Ile Ser Arg Leu Ser Glu Arg Glu Gln Leu

195 200 205

Ile Val Tyr Leu Arg Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gln Ser Glu Val Ala

210 215 220

Glu Arg Leu Gly Ile Ser Gln Val Gln Val Ser Arg Leu Glu Lys Arg

225 230 235 240

Ile Leu Leu Thr Ile Lys Glu Gln Ile Glu His

245 250

<210>3

<211>2265

<212>DNA

<213>桥石短小芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)

<400>3

gtgaacgcag tgaagaaagg caagaagcta ttatccatcc tattttcttc ctcactggtc 60

ctgagcggca ttgcggcggt tccagcgaca gggatggcca agtcaaagga caagccgccg 120

cttgaagtgg atttgtccac agtgaacatg gatcgtttgg ttaaagcctt gatcgaccaa 180

ggtgaaatcg acgaggacgc cgaccaggaa gagatcaaca aagctgtgga gaagtttttg 240

agagacaaga aagttcccca cggcattgat gactccagct ccttcgggaa aaaagcaagc 300

aaaacccagc tttcggcagt atcaaaggca gcaagcaaag tatccaagct caaagatgac 360

aagcaagtgc gcgcttccaa gcgggtacat acggataatc tggtgattgc cctggtcgag 420

ttcaatgatc tggagcacaa ccaggtgcca aaacaaagcg attccttgtg gacggcagac 480

ttcgaccaaa agcactacga ggaaatgctg ttcgatcgta aaggctatac gactcctgaa 540

gggataagca tgaccacgat ggccaagtac tactacgagc aatcgggtga gacatggacc 600

gtggatgggg ttgtcactcc gtggttgact gccgaaaaag ataagaaatt ctacggtgga 660

aacgatgaaa acggcaacga tgccaaccca cgcgatctgg tcgtcgagac actggaatct 720

gtaggggatg ccatcaaggg tcatgaagaa gaatacgacc aacgcgaccc gtatgacttg 780

gatggagaca gcgatctgat ggagccggat ggcatgctgg acaacctgat gctggttcac 840

tccggtattg gtgaagagac tggggaagat gcggatgcga tctggtctca ccgctggact 900

ctgaaaaagc cgacagaaat tccaggcacc agcctgaaag cttacgacta catgattcag 960

cctgaagatg gcgcacccgg cgtattcgca catgaatacg gacacaacct gggactgcca 1020

gatctgtatg acacgacaag actgggacat gattcgccgg ttggcgcatg gtcgctgatg 1080

tcttccggaa gccatacagg taagatcttc caaacccaac caaccggatt tgatccttgg 1140

tccaaaatga tgctgcagga aatgtatggg ggcaagtgga ttgagccgca agtcatcaat 1200

tacgaagacc tgaaaaaacg gaaaaagcag gcttcgctct acgatggcag cagcctcgat 1260

gaagatggca aagtcatcaa gctgaatatg ccgcaagtag agaagacacc gccggttcaa 1320

ccgaaagacg gcgattattc ttacttctcc gatgagggcg acaatctgaa cacgaagatg 1380

acttcggaag tgatcgacct gacaggcgcc agctccgcat cgatgagctt cgactcctgg 1440

agagcgatcg agaccgggta cgactacctg tacgtgaacg tgattgatgt cgactcaggt 1500

gagagcacaa cagtaaaaga gtacgatgac gaaaccaaag gctgggataa ggaagaaatc 1560

agcctgaacg atttcgctgg caaaaagatt caagtcgagt tcaactacgt gacggatggc 1620

ggcttggcga tgtccggctt ctatctggat aattttgcag tcacagcaga cggcgaagta 1680

gtcttctcgg atgatgcaga aggcgaccag aagtttgatc tggatggatt catccatttc 1740

gacggcgaag gcaaaatgta cgacgcgtac tacctggtag agctgcgctc ccatgaaggc 1800

gtggacgagg gtctgaaata cttccgccgc aatgacacat tcttcacgta tgatccaggt 1860

ctggtgatct ggtactacga tggacgcttt ggcaaaacgc aagacaacaa caccagcaac 1920

catccaggct acggcatgct gggcgtagtc gatgcgcatc aggaagttcg ttactggaat 1980

aacgatgagg gcaacgagga ggccattgcc gactcccgtt accaagtgaa cgatgcggca 2040

ttcagcccga acaaaacctc cggcatggat ctcgactaca ttctcggcac gatggattac 2100

gagccgctga aaggcattac cgtattcaaa gacagtgatg attacacgat gccggaagtt 2160

ccggaaatcg gaaaaatcct gccgaagatc ggtctgcaaa tcaaattaat tcgtgtgtcc 2220

aagaaattca cgaacgcaca ggtcgagttc tccatcaaaa aataa 2265

<210>4

<211>754

<212>PRT

<213>桥石短小芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)

<400>4

Val Asn Ala Val Lys Lys Gly Lys Lys Leu Leu Ser Ile Leu Phe Ser

5 10 15

Ser Ser Leu Val Leu Ser Gly Ile Ala Ala Val Pro Ala Thr Gly Met

20 25 30

Ala Lys Ser Lys Asp Lys Pro Pro Leu Glu Val Asp Leu Ser Thr Val

35 40 45

Asn Met Asp Arg Leu Val Lys Ala Leu Ile Asp Gln Gly Glu Ile Asp

50 55 60

Glu Asp Ala Asp Gln Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Glu Lys Phe Leu

65 70 75 80

Arg Asp Lys Lys Val Pro His Gly Ile Asp Asp Ser Ser Ser Phe Gly

85 90 95

Lys Lys Ala Ser Lys Thr Gln Leu Ser Ala Val Ser Lys Ala Ala Ser

100 105 110

Lys Val Ser Lys Leu Lys Asp Asp Lys Gln Val Arg Ala Ser Lys Arg

115 120 125

Val His Thr Asp Asn Leu Val Ile Ala Leu Val Glu Phe Asn Asp Leu

130 135 140

Glu His Asn Gln Val Pro Lys Gln Ser Asp Ser Leu Trp Thr Ala Asp

145 150 155 160

Phe Asp Gln Lys His Tyr Glu Glu Met Leu Phe Asp Arg Lys Gly Tyr

165 170 175

Thr Thr Pro Glu Gly Ile Ser Met Thr Thr Met Ala Lys Tyr Tyr Tyr

180 185 190

Glu Gln Ser Gly Glu Thr Trp Thr Val Asp Gly Val Val Thr Pro Trp

195 200 205

Leu Thr Ala Glu Lys Asp Lys Lys Phe Tyr Gly Gly Asn Asp Glu Asn

210 215 220

Gly Asn Asp Ala Asn Pro Arg Asp Leu Val Val Glu Thr Leu Glu Ser

225 230 235 240

Val Gly Asp Ala Ile Lys Gly His Glu Glu Glu Tyr Asp Gln Arg Asp

245 250 255

Pro Tyr Asp Leu Asp Gly Asp Ser Asp Leu Met Glu Pro Asp Gly Met

260 265 270

Leu Asp Asn Leu Met Leu Val His Ser Gly Ile Gly Glu Glu Thr Gly

275 280 285

Glu Asp Ala Asp Ala Ile Trp Ser His Arg Trp Thr Leu Lys Lys Pro

290 295 300

Thr Glu Ile Pro Gly Thr Ser Leu Lys Ala Tyr Asp Tyr Met Ile Gln

305 310 315 320

Pro Glu Asp Gly Ala Pro Gly Val Phe Ala His Glu Tyr Gly His Asn

325 330 335

Leu Gly Leu Pro Asp Leu Tyr Asp Thr Thr Arg Leu Gly His Asp Ser

340 345 350

Pro Val Gly Ala Trp Ser Leu Met Ser Ser Gly Ser His Thr Gly Lys

355 360 365

Ile Phe Gln Thr Gln Pro Thr Gly Phe Asp Pro Trp Ser Lys Met Met

370 375 380

Leu Gln Glu Met Tyr Gly Gly Lys Trp Ile Glu Pro Gln Val Ile Asn

385 390 395 400

Tyr Glu Asp Leu Lys Lys Arg Lys Lys Gln Ala Ser Leu Tyr Asp Gly

405 410 415

Ser Ser Leu Asp Glu Asp Gly Lys Val Ile Lys Leu Asn Met Pro Gln

420 425 430

Val Glu Lys Thr Pro Pro Val Gln Pro Lys Asp Gly Asp Tyr Ser Tyr

435 440 445

Phe Ser Asp Glu Gly Asp Asn Leu Asn Thr Lys Met Thr Ser Glu Val

450 455 460

Ile Asp Leu Thr Gly Ala Ser Ser Ala Ser Met Ser Phe Asp Ser Trp

465 470 475 480

Arg Ala Ile Glu Thr Gly Tyr Asp Tyr Leu Tyr Val Asn Val Ile Asp

485 490 495

Val Asp Ser Gly Glu Ser Thr Thr Val Lys Glu Tyr Asp Asp Glu Thr

500 505 510

Lys Gly Trp Asp Lys Glu Glu Ile Ser Leu Asn Asp Phe Ala Gly Lys

515 520 525

Lys Ile Gln Val Glu Phe Asn Tyr Val Thr Asp Gly Gly Leu Ala Met

530 535 540

Ser Gly Phe Tyr Leu Asp Asn Phe Ala Val Thr Ala Asp Gly Glu Val

545 550 555 560

Val Phe Ser Asp Asp Ala Glu Gly Asp Gln Lys Phe Asp Leu Asp Gly

565 570 575

Phe Ile His Phe Asp Gly Glu Gly Lys Met Tyr Asp Ala Tyr Tyr Leu

580 585 590

Val Glu Leu Arg Ser His Glu Gly Val Asp Glu Gly Leu Lys Tyr Phe

595 600 605

Arg Arg Asn Asp Thr Phe Phe Thr Tyr Asp Pro Gly Leu Val Ile Trp

610 615 620

Tyr Tyr Asp Gly Arg Phe Gly Lys Thr Gln Asp Asn Asn Thr Ser Asn

625 630 635 640

His Pro Gly Tyr Gly Met Leu Gly Val Val Asp Ala His Gln Glu Val

645 650 655

Arg Tyr Trp Asn Ash Asp Glu Gly Asn Glu Glu Ala Ile Ala Asp Ser

660 665 670

Arg Tyr Gln Val Asn Asp Ala Ala Phe Ser Pro Asn Lys Thr Ser Gly

675 680 685

Met Asp Leu Asp Tyr Ile Leu Gly Thr Met Asp Tyr Glu Pro Leu Lys

690 695 700

Gly Ile Thr Val Phe Lys Asp Ser Asp Asp Tyr Thr Met Pro Glu Val

705 710 715 720

Pro Glu Ile Gly Lys Ile Leu Pro Lys Ile Gly Leu Gln Ile Lys Leu

725 730 735

Ile Arg Val Ser Lys Lys Phe Thr Asn Ala Gln Val Glu Phe Ser Ile

740 745 750

Lys Lys

754

<210>5

<211>1362

<212>DNA

<213>桥石短小芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)

<400>5

atgaaccatc ctgattttcg cgatctaccc gcctgcatgg aagacgtaac cctcgctgcc 60

ctggacgagt acactggtcc accagatccg accgaatacc aatcattgta tggacgcttg 120

caagaggttg ccgaaactct ccctccgctc tatcgggagc atgtgtatca cccttttctt 180

caagcgatgg acaagttgtc tgagtcagga tttgcgcaga tgctccgtcg agatcctcaa 240

aaagagcgag aagccggtct gttttgcgat atcgcacagg ccattctgca aaacggcgaa 300

gcgtatgaac gcgatgccac ggatgccttt caggaagtag tcagcgattt gtacgacggt 360

tttttaagcg aggaagacag gagtggcatc aaaccgcctg atgaaagctt gattgctcct 420

ctggtcaaat ggggacgccc gcaattcgga ccttatacgt ggacagctga agccgctgcc 480

cattttggca tcaagacggg cattgtcaat ttgcccccgg caaacgcccg cctgggtctg 540

ctcgcgtggt ctgcattagg tcacgaaacg gctggacacg acattctcca cgccgacacc 600

ggtttgcttg gagaactgca gcaaaccgtc tatgacgctt tgtttgatga gcttcacaat 660

cggacgctgg cggactactg gtcgctccga atcgacgaga ctgcctccga cgttttggga 720

atcctgaaca ccggccccgc tgcagggatt ggactgattg gatatttccg cggccttaat 780

aaggcgtaca ccggacaagc aacactgcgg aatacagggc cacagaatga cccacatcca 840

gcagacatct tgcgcggtta tcttgctgct gagactgctc gtctgctgca ttttgacaac 900

gcatccgact gggcacaggc acttctcgag gaaaccaggc gtgatcttaa aggcatcaca 960

ataggcagag cctctttgga tgcagaaacc gctcaaaaat ctgctgccat tgtcgctcgc 1020

acaattatgg aagcacgcct gctcagtctg gaaggtcatg ccctcgggca aattcaaaac 1080

tggcacaacg aggatgaacg aatcgttcag gaaattcgct cccattttac aggttccctg 1140

accgtgcaag acggcattgt ttcgggtatg tatgctgcgc atgtcgtggc agcagccgtc 1200

caagcagccg tttcaggaga gatggatacc tccgctgcct tcacagggat gaaaaccttg 1260

ctgaagagca tgcacgacgc caatccttcc tggggacctc tctatgtacg atatcgcggt 1320

gatctcactc cgcatcgcat ttactcccgt tctgcgagct ag 1362

<210>6

<211>453

<212>PRT

<213>桥石短小芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)

<400>6

Met Asn His Pro Asp Phe Arg Asp Leu Pro Ala Cys Met Glu Asp Val

5 10 15

Thr Leu Ala Ala Leu Asp Glu Tyr Thr Gly Pro Pro Asp Pro Thr Glu

20 25 30

Tyr Gln Ser Leu Tyr Gly Arg Leu Gln Glu Val Ala Glu Thr Leu Pro

35 40 45

Pro Leu Tyr Arg Glu His Val Tyr His Pro Phe Leu Gln Ala Met Asp

50 55 60

Lys Leu Ser Glu Ser Gly Phe Ala Gln Met Leu Arg Arg Asp Pro Gln

65 70 75 80

Lys Glu Arg Glu Ala Gly Leu Phe Cys Asp Ile Ala Gln Ala Ile Leu

85 90 95

Gln Asn Gly Glu Ala Tyr Glu Arg Asp Ala Thr Asp Ala Phe Gln Glu

100 105 110

Val Val Ser Asp Leu Tyr Asp Gly Phe Leu Ser Glu Glu Asp Arg Ser

115 120 125

Gly Ile Lys Pro Pro Asp Glu Ser Leu Ile Ala Pro Leu Val Lys Trp

130 135 140

Gly Arg Pro Gln Phe Gly Pro Tyr Thr Trp Thr Ala Glu Ala Ala Ala

145 150 155 160

His Phe Gly Ile Lys Thr Gly Ile Val Asn Leu Pro Pro Ala Asn Ala

165 170 175

Arg Leu Gly Leu Leu Ala Trp Ser Ala Leu Gly His Glu Thr Ala Gly

180 185 190

His Asp Ile Leu His Ala Asp Thr Gly Leu Leu Gly Glu Leu Gln Gln

195 200 205

Thr Val Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Glu Leu His Asn Arg Thr Leu Ala

210 215 220

Asp Tyr Trp Ser Leu Arg Ile Asp Glu Thr Ala Ser Asp Val Leu Gly

225 230 235 240

Ile Leu Asn Thr Gly Pro Ala Ala Gly Ile Gly Leu Ile Gly Tyr Phe

245 250 255

Arg Gly Leu Asn Lys Ala Tyr Thr Gly Gln Ala Thr Leu Arg Asn Thr

260 265 270

Gly Pro Gln Asn Asp Pro His Pro Ala Asp Ile Leu Arg Gly Tyr Leu

275 280 285

Ala Ala Glu Thr Ala Arg Leu Leu His Phe Asp Asn Ala Ser Asp Trp

290 295 300

Ala Gln Ala Leu Leu Glu Glu Thr Arg Arg Asp Leu Lys Gly Ile Thr

305 310 315 320

Ile Gly Arg Ala Ser Leu Asp Ala Glu Thr Ala Gln Lys Ser Ala Ala

325 330 335

Ile Val Ala Arg Thr Ile Met Glu Ala Arg Leu Leu Ser Leu Glu Gly

340 345 350

His Ala Leu Gly Gln Ile Gln Asn Trp His Asn Glu Asp Glu Arg Ile

355 360 365

Val Gln Glu Ile Arg Ser His Phe Thr Gly Ser Leu Thr Val Gln Asp

370 375 380

Gly Ile Val Ser Gly Met Tyr Ala Ala His Val Val Ala Ala Ala Val

385 390 395 400

Gln Ala Ala Val Ser Gly Glu Met Asp Thr Ser Ala Ala Phe Thr Gly

405 410 415

Met Lys Thr Leu Leu Lys Ser Met His Asp Ala Asn Pro Ser Trp Gly

420 425 430

Pro Leu Tyr Val Arg Tyr Arg Gly Asp Leu Thr Pro His Arg Ile Tyr

435 440 445

Ser Arg Ser Ala Ser

450 452

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gggggtacct cactctgtca gcatgctg 28

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gggggatccc ggcgtgattc ccactgc 27

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gggctgcaga tagcggatga aggtgtg 27

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gggtctagac ctgcttatac atctgtttcg 30

<210>11

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gagagaccat ggaccatcct gattttcgcg atctacccg 39

<210>12

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

agaattcagt ggtggtggtg gtggtggtgg tggctcgcag aacgggagta aatgcgatgc 60

<210>13

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

aaaagaattc tttctgcaga acaggatgcg ggggagccgc cgct 44

<210>14

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

aaaaaggatc cttatagcat ctaatcttca acaaact 37

<210>15

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

aaaaaaagat cttgaacgat gacctctaat aattgttaa 39

<210>16

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

aaaagaattc aaatctagaa agtgtgtgct ctgcgaggct gtc 43

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

tccatggcac aatttggtat attatgtaaa 30

<210>18

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

actcgagtta tatgcgtcta tttatgtagg at 32

<210>19

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

ttttttctag actttatgaa tataaagtat agtgtgt 37

<210>20

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

gggggctgca gttatatgcg tctatttatg taggatg 37

<210>21

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

aarcgngtnc ayacngayaa yct 23

<210>22

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

aanccngtng gytgngtytg gaa 23

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

cctcgtagtg cttttggtcg aag 23

<210>24

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

accaataccg gagtgaacca gca 23

<210>25

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

actatagggc acgcgtggt 19

<210>26

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

ctcccatggc tttcgctacc cccgtgcagt ccgtggactg c 41

<210>27

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

atataagctt ttagggagag aggacttcca tggt 34

<210>28

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

tttctgcagg taaaatcgaa gaaggtaaac tggta 35

<210>29

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

aaaaagcttt tacttggtga tacgagtctg cgcg 34

<210>30

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

ttttggatcc gaggaggtgt cggagaactg tagccac 37

<210>31

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

aaaaagcttc tacactggca gctcctcctg tctg 34

<210>32

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

aaggatcccc gtcatatccg gca 23

<210>33

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

aaaagcttta ggcgttatcc gctttagc 28

<210>34

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

tatatccatg gcttcttact gccaggcgcc cttttttaa 39

<210>35

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

atataagctt ttattttgat gctctctggc cttggaa 37

<210>36

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>36

atattcatga gcaacgactt gcttcgatcc ca 32

<210>37

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>37

atataagctt tcagttctgg agataatctg taagta 36

Claims

1.桥石短小芽孢杆菌，其不形成孢子。

2.桥石短小芽孢杆菌，其具有以下菌学特征且不形成孢子：

(a)形态学：

细胞大小：

液体培养基：0.4-0.6×1.5-4μm，

细胞类型：芽孢杆菌

有无孢子：无

(b)生理学特性：

硝酸盐还原： -，

VP实验： -，

柠檬酸利用： +，

脲酶： -，

氧化酶： +，

过氧化氢酶： +，

(c)其它特性：

耐温性：于60℃死亡。

3.不形成孢子的桥石短小芽孢杆菌，其特征在于其与孢子形成相关的基因hos失活。

4.权利要求3要求保护的桥石短小芽孢杆菌，其中所述与孢子形成相关的基因hos具有SEQ ID NO：1的碱基序列。

5.不形成孢子的桥石短小芽孢杆菌，其胞外和/或胞内蛋白酶活性已降低或消失。

6.具有以下菌学特性且不形成孢子的桥石短小芽孢杆菌：

(a)形态学：

细胞大小：

液体培养基：0.4-0.6×1.5-4μm，

细胞类型：芽孢杆菌

有无孢子：无

(b)生理学特性：

硝酸盐还原： -，

VP实验： -，

柠檬酸利用： +，

脲酶： -，

氧化酶： +，

过氧化氢酶： +，

(c)其它特性：

耐温性：于60℃死亡，

胞外蛋白酶活性：低或没有，

胞内蛋白酶活性：低或没有。

7.桥石短小芽孢杆菌，其特征在于其胞外主蛋白酶基因emp失活。

8.权利要求7要求保护的桥石短小芽孢杆菌，其中胞外主蛋白酶基因emp具有SEQ ID NO：3的碱基序列。

9.桥石短小芽孢杆菌，其特征在于其胞内主蛋白酶基因imp失活。

10.权利要求9要求保护的桥石短小芽孢杆菌，其中胞内主蛋白酶基因imp具有SEQ ID NO：5的碱基序列。

11.桥石短小芽孢杆菌，其特征在于其胞外主蛋白酶基因emp和其胞内主蛋白酶基因imp失活。

12.权利要求11要求保护的桥石短小芽孢杆菌，其不形成孢子。

13.桥石短小芽孢杆菌HPD31-SP3(FERM BP-08479)。

14.桥石短小芽孢杆菌，其通过用其中插入蛋白编码基因的表达载体转化权利要求1-13中任一项要求保护的桥石短小芽孢杆菌构建。

15.一种生产蛋白的方法，其特征在于包括培养权利要求14的桥石短小芽孢杆菌转化子的步骤。

16.一种生产重组蛋白的方法，其特征在于在重组蛋白生产中，使用权利要求1-13中任一项要求保护的桥石短小芽孢杆菌作为宿主。