JPWO2005045005A1 - 新規ブレビバチルス・チョウシネンシス及び該微生物を宿主とするタンパク質の製造方法 - Google Patents

Abstract

ブレビバチルス・チョウシネンシス（ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）は、細胞外へのタンパク質分解活性が著しく低く、なおかつタンパク質の分泌生産性にもすぐれた特性を有しているが、細胞外のタンパク質分解活性を更に低減することが希求されているだけでなく、細胞内のタンパク質分解活性の低減も希求されている。また、一方タンパク質医薬品等の宿主として本菌を利用する場合、胞子を形成せず、殺菌処理が容易に実施されることも希求されている。胞子形成関連遺伝子の不活化、並びに、細胞外及び細胞内のタンパク質分解酵素遺伝子のクローニング及び不活化により上記課題を解決した。

Description

本発明は、新規なブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）に関する。より具体的には、本発明は、細胞外及び細胞内のタンパク質分解活性が格段に低減し、また、胞子を形成しないブレビバチルス・チョウシネンシスに関する。また該ブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主に用いた遺伝子組換えによるタンパク質製造方法に関する。

遺伝子組換え技術は、生体内に微量しか存在せず単離が難しいために従来は利用が著しく困難であったタンパク質、または、任意のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、細菌または動物細胞などを宿主に用いて大量に生産することを可能にした。遺伝子組換えによるタンパク質生産の宿主には様々な細菌が用いられているが、最も広く用いられている細菌は大腸菌である。しかしながら、大腸菌を宿主とする組換えタンパク質生産系では、生産されたタンパク質が菌体内に蓄積されるため、細胞の容積が生産されたタンパク質の量の上限となってしまい、タンパク質の大量生産が難しい。また更に、細胞内に蓄積されたタンパク質を回収するために大腸菌菌体を破砕する必要があることや、大腸菌菌体の破砕物に含まれる菌体由来の成分である核酸、目的以外のタンパク質及び菌体の細胞壁に由来するエンドトキシン等から目的とするタンパク質を分離回収する操作が煩雑になるなどの問題がある。
大腸菌の系が持つこれらの問題を回避するため、タンパク質を分泌生産する能力を有する代表的な細菌である枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を宿主に用いた組換えタンパク質の生産系の開発が行われた。この枯草菌を宿主に用いた生産系では、生産された組換えタンパク質は培地中に分泌生産される。そのため、この枯草菌の系には、タンパク質を回収するための菌体破砕が不要であることやエンドトキシンがほとんど生じないことなどの大腸菌の系にはない優れた性質がある。
ところが、一方で、枯草菌にはタンパク質分解酵素を大量に細胞外に分泌するという性質があるため、分泌生産された組換えタンパク質が、タンパク質分解酵素により分解されてしまい、組換えタンパク質の収量が極めて少なくなるという大きな問題があった。そのため、枯草菌のタンパク質分解酵素の産生を低減するための様々な努力が行われてきた。しかし、それにもかかわらず、枯草菌を宿主とする組換えタンパク質生産系が異種タンパク質の産業的な生産に用いられた例は、これまでほとんど知られていない。
一方で、枯草菌の系が持つこの問題を回避するために、組換えタンパク質を細胞外に分泌生産するが、細胞外にタンパク質分解酵素を分泌しない細菌を宿主に用いた新たな組換えタンパク質生産系の開発が行われた。そして、その結果、枯草菌よりタンパク質分解酵素活性が弱く、なおかつ、枯草菌より優れたタンパク質の分泌生産性を示すバチルス・ブレビス４７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ４７）（特許文献１）を初めとするバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）を宿主とする組換えタンパク質の生産系の開発に成功した。
なお、現在、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく系統解析の結果、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）などからなるブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌に再分類されている（非特許文献１）。
しかしながら、バチルス・ブレビス４７にも細胞外に微弱なタンパク質分解活性が存在していることがわかった。バチルス・ブレビスを宿主とする組換えタンパク質生産においては比較的長時間（通常３日間程度）の培養が必要とされている。そのため、たとえバチルス・ブレビス菌体の細胞外のタンパク質分解活性が微弱なものであっても、生産された組換えタンパク質が細胞外のタンパク質分解活性により分解されてしまい組換えタンパク質の収量が減少する場合があった。この問題の解決のために、これまでにもバチルス・ブレビスの細胞外のタンパク質分解活性を更に低減させるための努力が行われてきた。
例えば、バチルス・ブレビス菌株のスクリーニングが広い範囲で行われ、細胞外のタンパク質分解活性が著しく低く、なおかつ、タンパク質の分泌生産性にも優れた菌株としてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６３：バチルス・ブレビスＨ１０２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ Ｈ１０２）（特許文献２）と同一株）や、その変異株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１−Ｓ５）（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３：本菌株はＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１−Ｓ５の表示で寄託された。）が分離された。そして、これらの菌株はヒト上皮細胞増殖因子（ｈＥＧＦ）を初めとする様々な組換えタンパク質の生産において宿主として利用されている。例えば、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１によるｈＥＧＦの生産に関しては、非特許文献２（同文献においてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１はＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１と記載されている。）他に示されている。
ところが、このブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及びＨＰＤ３１−３５においても、鋭敏なタンパク質分解活性の検出法を用いた場合には細胞外のタンパク質分解活性が検出されている。たとえば、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ−３１の培養上清に対してゼラチン−ＰＡＧＥ（ザイモグラフ）法によるタンパク質分解活性の検出を行った結果では、図２に示されているようにゼラチンの分解によるバンドが確認されている。
一方、タンパク質分解酵素活性（タンパク質分解活性）を実質的に示さない変異バチルス・ブレビス菌株と称されるバチルス・ブレビス３１−ＯＫ株も開示されている（特許文献３）。しかしながら、このバチルス・ブレビス３１−ＯＫにおいても、ゼラチン−ＰＡＧＥ法によるタンパク質分解活性の評価試験の結果では、タンパク質分解活性が残存していることを示すバンドが確認でき、完全に細胞外のタンパク質分解活性が失われているわけではなかった。しかも、この細胞外のタンパク質分解活性についての遺伝子レベルでの解明は全くなされていなかった。すなわち、タンパク質分解酵素の単離は行われておらず、ましてや、その遺伝子の配列決定はおろか、クローニングさえ行われていなかった。
したがって、これらの細胞外のタンパク質分解活性が低減されたとされる菌株を用いた場合においても、菌株に残存する細胞外タンパク質分解活性により分泌生産されたタンパク質が分解され、その収量が減少する可能性があった。
また、これらのブレビバチルス・チョウシネンシス（もしくはバチルス・ブレビス）は、スクリーニングもしくは変異剤処理等による突然変異により得られたものであり、そのゲノム上のタンパク質分解酵素遺伝子を同定し、更に、該遺伝子の不活化を行うことにより得られたものではなかった。したがって、そのゲノム上のタンパク質分解酵素遺伝子を同定し、更に、該遺伝子の不活化を行うことによりタンパク質分解活性の低減を行ったブレビバチルス・チョウシネンシスはこれまで知られていなかった。
また、上記のブレビバチルス・チョウシネンシスのタンパク質分解活性の低減は、全て細胞外タンパク質分解活性の低減を目的としており、細胞内のタンパク質分解活性の低減には注意が払われていなかった。ところが、ブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主とする組換えタンパク質生産において、目的とするタンパク質の種類によっては、分泌生産はできないが細胞内への蓄積生産であれば可能である場合がある。その場合、生産されたタンパク質によっては細胞内のタンパク質分解酵素の作用により分解されてしまい、組換えタンパク質がほとんど得られない場合があった。
また、ブレビバチルス・チョウシネンシスは、培養中に一部の菌体の溶菌が起こり、その結果、培地中に細胞内タンパク質分解酵素を含むその細胞内のタンパク質が溶出することが知られている。そのため、細胞外に分泌生産された組換えタンパク質であっても、その溶出した細胞内タンパク質分解酵素により分解されてしまう可能性があった。
したがって、細胞内のタンパク質分解活性を低減することもまた、遺伝子組換え宿主としてのブレビバチルス・チョウシネンシスの有用性をより高めるために解決すべき課題のひとつであった。
なお、これまで、ブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞内のタンパク質分解活性の低減化を行った例は、全く知られていない。
また、ブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞内のタンパク質分解活性に関する遺伝子レベルでの解明も、これまで全く行われていない。すなわち、これまでブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞内タンパク質分解酵素の単離を行った例は、全く知られていない。また、細胞内タンパク質分解酵素遺伝子のクローニング及び配列決定を行った例についても全く知られていない。
更に、ブレビバチルス・チョウシネンシスを遺伝子組換え宿主として、より広範な産業上の用途に利用可能にするためには、上記のタンパク質分解活性の低減とは別の問題を解決する必要があった。
ブレビバチルス・チョウシネンシスは、枯草菌などのバチルス属細菌と同様に胞子体を形成する場合がある。胞子体は生細胞（非胞子菌体）に比べて耐熱性が高く、かなり厳しい殺菌条件が要求される。そのため、特に、培養終了後に製造ライン内の胞子体を含めた菌体の完全な滅菌・除去の保証が求められる組換えタンパク質医薬品の製造において、ブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主に用いて、その製造を行うためには、かなり難しい技術が要求された。
したがって、組換えタンパク質医薬品の製造を初めとする広範な産業上の用途においてブレビバチルス・チョウシネンシスを組換え宿主として利用可能にするために、胞子体を形成せず、おだやかな殺菌条件（６０℃から１００℃）でも完全に死滅するブレビバチルス・チョウシネンシス菌株が要望されていた。
なお、ブレビバチルス・チョウシネンシスの胞子体の殺菌に必要とされる条件は、枯草菌の胞子体の殺菌に求められる条件よりはるかに弱い。たとえば、１００℃での枯草菌の胞子体のＤ値（生細胞（非胞子菌体）及び胞子体を含むすべての菌数を１／１０に減少させる、各温度域での時間）は菌株によって差があるものの１１分程度とされている。一方、ブレビバチルス・チョウシネンシスの胞子体では１分以下である。しかしながら、それでも、ブレビバチルス・チョウシネンシスの胞子体の殺菌には、その生細胞（非胞子菌体）の殺菌に比べてかなり厳しい条件が必要になる。たとえば、後述の実施例に示すように、８０℃でのブレビバチルス・チョウシネンシスの生細胞（非胞子菌体）のＤ値は１分未満であるが、胞子体のＤ値は６７分程度である。
枯草菌においては無胞子性菌株としてバシラス・サチリスＳＭＳ２７５（特許文献４：特開平４−２８７６８６）などが開示されている。しかしながらブレビバチルス・チョウシネンシスにおいては、これまで胞子形成能を有しない菌株、すなわち、おだやかな殺菌条件でも完全に死滅する菌株は知られていなかった。
特開昭６０−５８０７４号公報 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４６，９３９−９４６（１９９６） 特開昭６３−５６２７７号公報 Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８２，１１５−１２２（１９９６） 特開平６−２９６４８５号公報 特開平４−２８７６８６号公報

前記のように、ブレビバチルス・チョウシネンシスは、遺伝子組換えの宿主として極めて優れた特性を有しているが、遺伝子組換えの宿主として、より一層、その産業上の有用性を高めるためには解決すべき課題がいくつかあった。
それは、細胞外のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減したブレビバチルス・チョウシネンシスを得ること。また、細胞内のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減したブレビバチルス・チョウシネンシスを得ること。また更には、胞子体を形成せず、したがって、おだやかな殺菌条件で完全に死滅するブレビバチルス・チョウシネンシスを得ることである。
したがって、本発明は、細胞外のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減したことにより、組換えタンパク質の分泌生産効率が向上したブレビバチルス・チョウシネンシス。また、細胞内のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減したことにより、組換えタンパク質の細胞内への蓄積生産効率が向上したブレビバチルス・チョウシネンシス。胞子形成能を有しないことにより、おだやかな殺菌条件で完全に死滅するブレビバチルス・チョウシネンシス。また更には、細胞外及び細胞内のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減したことにより、組換えタンパク質の生産効率が向上し、なおかつ、胞子形成能を有しないことにより、おだやかな殺菌条件で完全に死滅するブレビバチルス・チョウシネンシスを提供することを目的とする。なお本発明において「細胞外及び細胞内のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減する」には該活性が完全に消失することも包含する。
また更に、本発明は、該ブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主として利用した遺伝子組換えによるタンパク質製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、まず胞子形成能を有しないブレビバチルス・チョウシネンシスを得るために、組換えタンパク質生産の宿主として実績のあるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を親株に、変異剤処理による突然変異株の取得を試みた。
まず、コロニーの形態の変化を指標にして変異が起きた株を選択することとし、通常のブレビバチルス・チョウシネンシスのコロニーの形態と異なりシワを有しないコロニーを形成した菌株を選択した。更に、これらの菌株の内から顕微鏡観察で胞子が確認できないものを、胞子形成能を有しない可能性がある菌株として選択した。更に、これらの胞子形成能を有しない可能性がある菌株に対して胞子形成能の評価試験を行い、胞子形成能を有しない菌株を選択した。そして、更に、この菌株を宿主に用いた組換えタンパク質の生産性の評価試験を行い、遺伝子組換えの宿主に利用されていろ公知の菌株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１と同等の組換えタンパク質の生産性を有している変異株を選択した。以上により、本発明者らは、胞子形成能を有しないブレビバチルス・チョウシネンシスを得た。
本発明者らは、更に、細胞外及び細胞内のタンパク質分解酵素活性が、公知の菌株より格段に低減されたブレビバチルス・チョウシネンシス菌株を得るために、前記の胞子形成能を有しないブレビバチルス・チョウシネンシス菌株を親株に用いて、更に、細胞外及び細胞内の主要タンパク質分解酵素遺伝子の不活化を行った。本発明者らは、まず、不活化の対象となるタンパク質分解酵素遺伝子を同定するために、タンパク質分解酵素遺伝子のクローニングを試みた。その結果、本発明者らは２種類の新規のタンパク質分解酵素、すなわち、細胞内主要タンパク質分解酵素であるＩＭＰと細胞外主要タンパク質分解酵素であるＥＭＰの遺伝子のクローニングに成功し、更に、これらの遺伝子を不活化したブレビバチルス・チョウシネンシスを作製した。
なお、本発明者らは、ブレビバチルス・チョウシネンシスのゲノム上の特定のタンパク質分解酵素遺伝子の不活化を、公知の相同組換えに準じた方法により行ったが、その際、後述のとおり、各遺伝子の不活化毎に薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子がゲノム上に残されることになる。そのため多重の遺伝子不活化を行うには、遺伝子不活化の都度、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子をゲノム上から削除する必要がある。本発明者らは、そのマーカー遺伝子の削除に、ＦＲＴ配列と酵母由来のＦｌｐリコンビナーゼ遺伝子からなる系を利用した。更に、その際、後述の実施例に示すように、Ｆｌｐリコンビナーゼ遺伝子を有し、かつ、ネオマイシンを含まない培地を用いて培養を行った場合にはブレビバチルス・チョウシネンシスの菌体から容易に脱落するプラスミドＤＮＡを新規に構築し、これを用いた。このプラスミドは、菌体内に導入しゲノム上に残されたマーカー遺伝子を削除した後、ネオマイシンを含まない培地で培養を行うことにより菌体から容易に脱落させることができる。このプラスミドを用いることにより多重遺伝子不活化が可能になった。
更に、本発明者らは、このようにして得た細胞外及び細胞内の主要タンパク質分解酵素遺伝子を不活化したブレビバチルス・チョウシネンシス菌株について胞子形成能及びタンパク質分解活性の評価を行った。その結果、該菌株が胞子形成能を有していないこと、また、細胞外及び細胞内のタンパク質分解活性が公知の菌株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１より格段に低減したことを確認した。
また更に、このブレビバチルス・チョウシネンシス菌株を遺伝子組換えによるタンパク質生産の宿主に用いて、他の公知のブレビバチルス・チョウシネンシス菌株を宿主に用いた場合には分泌生産後に分解を受けることが確認されているタンパク質の生産を行った。その結果、タンパク質の蓄積量が、公知の菌株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合に比べて増加していることを確認し、本発明を完成させた。
以上により、本発明は、細胞外タンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減したことにより、組換えタンパク質の分泌生産効率が向上したブレビバチルス・チョウシネンシス、細胞内のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減したことにより、組換えタンパク質の細胞内への蓄積生産効率が向上したブレビバチルス・チョウシネンシス、及び胞子形成能を有しないことにより、おだやかな殺菌条件で完全に死滅するブレビバチルス・チョウシネンシスを提供する。また更には、細胞外及び細胞内のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減されたことにより、組換えタンパク質の生産効率が向上し、なおかつ、胞子形成能を有しないことにより、おだやかな殺菌条件で完全に死滅するブレビバチルス・チョウシネンシスを提供する。
また更に、本発明は、該ブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主として利用した遺伝子組換えによるタンパク質製造方法を提供する。

図１
本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスの作製に用いた相同組み換えによる遺伝子不活化法の概略を示す図である。
図２
ゼラチン−ＰＡＧＥ（ザイモグラフ）により、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（レーン１）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３（レーン２）の培養上清画分のタンパク質分解酵素活性を測定した結果を示す図面である。なお、白枠内は、タンパク質分解酵素活性によってゼラチンが分解したために生じたクリアバンドを示す。
図３
未変性条件下でのゼラチン−ＰＡＧＥ（ザイモグラフ）により、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（レーン１）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３（レーン２）の細胞内画分のタンパク質分解酵素活性を測定した結果を示す図面である。なお、白枠内は、タンパク質分解酵素活性によってゼラチンが分解したために生じたクリアバンドを示す。
図４
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主として用いた遺伝子組換えにより分泌生産されたブタＩＬ−１βに対するＣＢＢ染色の結果を示す図面であって、ブタＩＬ−１βの分泌生産および分解を示す図面である。なお、レーン１は遺伝子組換え体ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１−ｐＩＬ−１βを示し、レーン２は遺伝子組換え体ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３／ｐＮＹ３０１−ｐＩＬ−１βを示す。
図５
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主として用いた遺伝子組換えにより分泌生産されたブタＩＬ−１βに対する抗ブタＩＬ−１β抗体によるウエスタンブロットの結果を示す図面であって、ブタＩＬ−１βの分泌生産および分解を示す図面である。なお、レーン１は遺伝子組換え体ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１−ｐＩＬ−１βを示し、レーン２は遺伝子組換え体ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３／ｐＮＹ３０１−ｐＩＬ−１βを示す。
図６
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主として用いた遺伝子組換えにより、細胞内に蓄積生産されたブタＩＦＮ−γに対する抗ブタＩＦＮ−γ抗体によるウエスタンブロットの結果を示す図面であって、ブタＩＬ−１γの細胞内への蓄積生産と分解を示す図面である。なお、レーン１は遺伝子組換え体ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１を示し、レーン２は遺伝子組換え体ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１−ｐＩＮＦ−γを示し、レーン３は遺伝子組換え体ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３／ｐＮＹ３０１−ｐＩＦＮ−γを示す。
図７
胞子形成関連遺伝子ｈｏｓのＤＮＡ塩基配列（上段）及びそれに対応するアミノ酸配列（下段）を示す。
図８
同上続きを示す。
図９
細胞外タンパク質分解酵素ＥＭＰのアミノ酸配列（下段）及びそれをコードする遺伝子ｅｍｐのＤＮＡ配列（上段）を示す。
図１０
同上続きを示す。
図１１
同上続きを示す。
図１２
細胞内タンパク質分解酵素ＩＭＰのアミノ酸配列（下段）及びそれをコードする遺伝子ｉｍｐのＤＮＡ配列（上段）を示す。
図１３
同上続きを示す。
図１４
プライマーＨｏｓ Ｐ１、Ｈｏｓ Ｐ２、Ｈｏｓ Ｐ３、Ｈｏｓ Ｐ４を示す。
図１５
プライマーｉｍｐ Ｐ１、ｉｍｐ Ｐ２を示す。
図１６
プライマーｆｌｐ Ｐ１を示す。
図１７
プライマーｆｌｐ Ｐ２を示す。
図１８
プライマーｆｌｐ Ｐ３を示す。
図１９
プライマーｆｌｐ Ｐ４を示す。
図２０
プライマーｆｌｐ Ｐ５を示す。
図２１
プライマーｆｌｐ Ｐ６を示す。
図２２
プライマーｆｌｐ Ｐ７を示す。
図２３
プライマーｆｌｐ Ｐ８を示す。
図２４
プライマーｅｍｐ Ｐ１、ｅｍｐ Ｐ２の塩基配列及びアミノ酸配列データを示す。
図２５
プライマーｅｍｐ Ｐ３、ｅｍｐ Ｐ４、アダプタープライマーを示す。
図２６
実施例１９におけるセンスプライマーを示す。
図２７
同アンチセンスプライマーを示す。
図２８
実施例２０におけるセンスプライマーを示す。
図２９
同アンチプライマーを示す。
図３０
実施例２１におけるセンスプライマーを示す。
図３１
同アンチセンスプライマーを示す。
図３２
実施例２３におけるセンスプライマーを示す。
図３３
同アンチセンスプライマーを示す。
図３４
実施例２４におけるセンスプライマーを示す。
図３５
同アンチセンスプライマーを示す。
図３６
実施例２５におけるセンスプライマーを示す。
図３７
同アンチセンスプライマーを示す。
以下、本発明について詳述する。
本発明は、下記の（１）〜（１６）を実施態様の例として包含するものである。
（１） 胞子を形成しないブレビバチルス・チョウシネンシス。
（２） 下記の菌学的性質を有し、胞子を形成しないブレビバチルス・チョウシネンシス。
（ａ）形態
細胞の大きさ
液体培地：０．４〜０．６×１．５〜４μｍ
細胞の形 桿菌
胞子の有無 無
（ｂ）生理学的性質
硝酸塩の還元 −
ＶＰテスト −
クエン酸の利用 ＋
ウレアーゼ −
オキシダーゼ ＋
カタラーゼ ＋
（ｃ）他の性質
温度抵抗性 ６０℃で死滅する。
（３） 胞子形成関連遺伝子ｈｏｓが不活性化されたこと、を特徴とする胞子を形成しないブレビバメチルス・チョウシネンシス。
（４） 胞子形成関連遺伝子ｈｏｓの塩基配列が配列番号１に示す配列であること、を特徴とする請求項３に記載のブレビバチルス・チョウシネンシス。
（５） 胞子を形成せず、且つ、細胞外及び／又は細胞内のタンパク質分解酵素活性が低減ないし消失したブレビバチルス・チョウシネンシス。
（６） 下記の菌学的性質を有し、胞子を形成しないブレビバチルス・チョウシネンシス。
（ａ）形態
細胞の大きさ
液体培地：０．４〜０．６×１．５〜４μｍ
細胞の形 桿菌
胞子の有無 無
（ｂ）生理学的性質
硝酸塩の還元 −
ＶＰテスト −
クエン酸の利用 ＋
ウレアーゼ −
オキシダーゼ ＋
カタラーゼ ＋
（ｃ）他の性質
温度抵抗性 ６０℃で死滅する。
細胞外のタンパク質分解酵素活性 低いないしなし
細胞内のタンパク質分解酵素活性 低いないしなし
（７） 細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子ｅｍｐが不活性化されたこと、を特徴とするブレビバチルス・チョウシネンシス。
（８） 細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子ｅｍｐの塩基配列が配列番号３に示す配列であること、を特徴とする請求項７に記載のブレビバチルス・チョウシネンシス。
（９） 細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐが不活性化されたこと、を特徴とするブレビバチルス・チョウシネンシス。
（１０） 細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐの塩基配列が配列番号５に示す配列であること、を特徴とする上記（９）に記載のブレビバチルス・チョウシネンシス。
（１１） 細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子ｅｍｐ及び細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐが不活性化されたこと、を特徴とするブレビバチルス・チョウシネンシス。
（１２） 胞子を形成しないこと、を特徴とする上記（１１）に記載のブレビバチルス・チョウシネンシス。
（１３） ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４７９）。
（１４） 上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のブレビバチルス・チョウシネンシスを、タンパク質をコードする遺伝子を組込んだ発現ベクターにより形質転換してなるブレビバチルス・チョウシネンシス。
（１５） 上記（１４）に記載のブレビバチルス・チョウシネンシス形質転換体を培養する工程を含むこと、を特徴とするタンパク質の製造方法。
（１６） 上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のブレビバチルス・チョウシネンシスを組換えタンパク質生産の宿主として使用すること、を特徴とする組換えタンパク質を製造する方法。
本発明の胞子形成能を有しないブレビバチルス・チョウシネンシスは、親株であるブレビバチルス・チョウシネンシスに対して変異剤による薬剤処理を行い、薬剤処理の結果、得られた変異株の中から胞子形成能を有しない菌株を選択することにより取得した。実施例では、変異剤にニトロソグアニジンを使用したが、変異剤として亜硝酸、メタンスルホン酸エチルなども利用可能である。或いは、紫外線、γ線なども利用することができる。また、本発明の胞子形成能を有しない変異株を取得するための親株は、ブレビバチルス・チョウシネンシスに属する菌株であれば特に限定されないが、遺伝子組換えによるタンパク質生産の宿主として実績のあるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）、または、その変異株のブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）が特に好ましい。なお、得られた変異株の胞子形成能の有無は、耐熱性試験、或いは、Ｄ値の測定などにより行うことが可能である。また、Ｄ値（Ｄ−ｖａｌｕｅ）は生細胞（非胞子細胞）及び胞子体を含むすべての菌数を１／１０に減少させる各温度域での時間を意味し、菌体の死滅率の指標として用いられている。
また、本発明が提供する胞子形成能を有しないブレビバチルス・チョウシネンシス菌株に対してゲノム・ライブラリーを用いた解析を行い、胞子形成に関連していると推定される遺伝子が不活化されている事を確認した。この不活化された遺伝子をｈｏｓと命名した。胞子形成関連遺伝子ｈｏｓのＤＮＡ配列の例としてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のｈｏｓのＤＮＡ塩基配列を配列表の配列番号１（図７、図８の上段）に示し、そのＤＮＡ塩基配列に対応するアミノ酸配列を配列番号２（図７、図８の下段）に示した。
また、本発明の細胞外及び細胞内のタンパク質分解活性が、格段に低減したブレビバチルス・チョウシネンシスは、ブレビバチルス・チョウシネンシスゲノム上の細胞外及び細胞内の主要タンパク質分解酵素遺伝子の不活化を行うことにより得ることができる。本発明のタンパク質分解活性が格段に低減したブレビバチルス・チョウシネンシスを得るために、不活化の対象とするブレビバチルス・チョウシネンシスのゲノム上のタンパク質分解酵素遺伝子は特に限定されないが、特に好ましいものとして細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐ及び細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子ｅｍｐをあげることができる。
細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子ｅｍｐのＤＮＡ配列の例として、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のｅｍｐ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の配列番号３（図９〜１１の上段）に示し、そのＤＮＡ配列に対応するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１の細胞外主要タンパク質分解酵素ＥＭＰのアミノ酸配列を配列番号４（図９〜１１の下段）に示す。
また、細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐのＤＮＡ配列の例として、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のｉｍｐ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を配列番号５（図１２〜１３の上段）に示し、そのＤＮＡ配列に対応するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１の細胞内主要タンパク質分解酵素ＩＭＰのアミノ酸配列を配列番号６（図１２〜１３の下段）に示す。ＥＭＰ及びＩＭＰは、いずれも、公知のタンパク質とアミノ酸配列に４０％以上の相同性がない新規なタンパク質である。
また、配列番号４に記載のアミノ酸配列の一部のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもタンパク質分解活性を有する限り、全てタンパク質分解酵素ＥＭＰに包含される。ここで「一部のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、アミノ酸残基の種類やタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置によっても異なるが、前記配列番号４のアミノ酸配列全体に対し、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を意味する。
更に、配列番号６に記載のアミノ酸配列の一部のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもタンパク質分解活性を有する限り、全てタンパク質分解酵素ＩＭＰに包含される。ここで「一部のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、アミノ酸残基の種類やタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置によっても異なるが、前記配列番号６のアミノ酸配列全体に対し、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を意味する。
また、配列番号４に記載のアミノ酸配列の一部のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であっても、そのコードしているタンパク質がタンパク質分解活性を有する限り、全てタンパク質分解酵素遺伝子ｅｍｐ（配列番号３）に包含される。ここで「一部のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」の意味は、上記したＥＭＰについての場合と同様である。
また更に、配列番号６に記載のアミノ酸配列の一部のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であっても、そのコードしているタンパク質がタンパク質分解活性を有する限り、全てタンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐ（配列番号５）に包含される。ここで「一部のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」の意味は、上記したＩＭＰについての場合と同様である。ｅｍｐ遺伝子及びｉｍｐ遺伝子も、従来単離されたこともなければ、ＤＮＡ配列の決定もされておらず、従来未知の新規遺伝子である。
このブレビバチルス・チョウシネンシスのゲノム上の細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐ及び細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子ｅｍｐのクローニングは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）等に記載の当業者に公知の標準的な遺伝子組換え技術を適宜、選択し、組み合わせて用いることにより行うことができる。たとえば、ブレビバチルス・チョウシネンシスのゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、このゲノムＤＮＡライブラリーに対して、不活化対象となる遺伝子をコードするＤＮＡ配列の一部を有するＤＮＡ断片をプローブに用いたハイブリダイゼーション法により、もしくは、このＤＮＡ断片をプライマーとして用いるＰＣＲ法により行うことができる。
また、ブレビバチルス・チョウシネンシスのゲノム上のｉｍｐ遺伝子またはｅｍｐ遺伝子の不活化は、公知の相同組換えに準じた方法により行うことができる。例えば、ｉｍｐ遺伝子の不活化は、以下に示す手順により行うことができる。
まず、ｉｍｐ遺伝子を含むＤＮＡ断片をブレビバチルス・チョウシネンシスで複製不可能なベクター、例えば大腸菌で複製可能なベクターにクローニングし、ｉｍｐ遺伝子内部の一部領域をＦＲＴ配列（Ｇｅｎｅ，２１２，７７−８６（１９９８））を両側に持つ薬剤耐性遺伝子（例えばネオマイシン耐性遺伝子）からなるＤＮＡ断片に置きかえｉｍｐ遺伝子を分断する。その結果、その一部がネオマイシン耐性遺伝子に置きかわったことにより不活化されたｉｍｐ遺伝子を含むベクターを得る。更に、このベクターに上記の不活化されたｉｍｐ遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれたブレビバチルス・チョウシネンシス菌株を選択するための第二の薬剤耐性遺伝子（例えばエリスロマイシン耐性遺伝子）を挿入することにより、ｉｍｐ遺伝子不活化用ベクターを構築する。
次いで、このｉｍｐ遺伝子不活化用ベクターをブレビバチルス・チョウシネンシスに導入し、ネオマイシン耐性を示す菌株を選抜する。このｉｍｐ遺伝子不活化用ベクターの導入により、一部のブレビバチルス・チョウシネンシス菌体において、ゲノム上のｉｍｐ遺伝子と、ｉｍｐ遺伝子不活化用ベクター上の不活化されたｉｍｐ遺伝子との間で相同組換え反応が誘発される。その結果、ネオマイシン耐性を示す菌株には、ネオマイシン耐性遺伝子−ＦＲＴカセットの上流側のｉｍｐ部のみで相同組換え反応が起こっている株、下流側のｉｍｐ部のみで相同組換え反応が起こっている株、上流側及び下流側の２箇所のｉｍｐ部で相同組換え反応が起こっている株（ダブルクロスオーバー株）が含まれることになる。
目的とするゲノム上のｉｍｐ遺伝子が不活化された菌株はダブルクロスオーバー株であり、また、ダブルクロスオーバー株はエリスロマイシンに対して感受性を示す。そのため、これらのネオマイシン耐性を示す菌株を、更に、エリスロマイシンを含むＴＭ寒天培地で培養し、エリスロマイシンに対する感受性を示す菌株を選抜する。以上により、ゲノム上のｉｍｐ遺伝子が不活化されたブレビバチルス・チョウシネンシス菌株を得ることができる。
上記で得たブレビバチルス・チョウシネンシス菌株のｉｍｐ遺伝子の不活化の確認は、ＰＣＲとゲノミックサザン解析などにより行うことができる。
更に、上記で得たｉｍｐ遺伝子不活化株のゲノム上からネオマイシン耐性遺伝子の削除を行う。上記のｉｍｐ遺伝子不活化株に導入されたネオマイシン耐性遺伝子は、その上流域と下流域にＦＲＴ配列を有しているため、ＦＲＴ配列を特異的に認識するＦｌｐリコンビナーゼを用いたＦＲＴ配列間の組換え反応により上記で得たｉｍｐ遺伝子不活化株からネオマイシン耐性遺伝子を削除することが可能である。
具体的には、まず、ネオマイシンを含まない培地を用いて培養を行った場合には、ブレビバチルス・チョウシネンシス菌体から容易に脱落するプラスミドベクターを調製する。更に、このプラスミドベクターに酵母由来のＦｌｐリコンビナーゼ遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ，２８６，８６０−８６４（１９８０））とブレオマイシン耐性遺伝子を組み込んだネオマイシン耐性遺伝子削除用ベクターを作製する。
次いで、上記で得たｉｍｐ遺伝子不活化株に、このネオマイシン耐性遺伝子削除用ベクターを導入し、更に、ブレオマイシンを含むＴＭ寒天培地上で培養することにより、このベクターにより形質転換された菌株を選別する。次いで、この形質転換された菌株を、ブレオマイシンを含まないＴＭ液体培地で振とう培養後、更に、ＴＭ寒天培地で培養する。
目的とするネオマイシン耐性遺伝子が削除されたｉｍｐ遺伝子不活化株は、ネオマイシン耐性遺伝子の両側のＦＲＴ配列間の組換え反応によりゲノム上のネオマイシン耐性遺伝子が削除され、なおかつ、ネオマイシン耐性遺伝子削除用ベクターが脱落している菌株である。この菌株は、ネオマイシンとブレオマイシンに対して感受性を示す。そこで、ＴＭ寒天培地上にコロニーが得られた菌株からネオマイシンとブレオマイシンに対して感受性を示す菌株を選抜することにより、目的とするネオマイシン耐性遺伝子が削除されたｉｍｐ遺伝子不活化株を得た。
以上により、目的とするブレビバチルス・チョウシネンシスのｉｍｐ遺伝子不活化株を得ることができる。以上の手順の概略を図１に示した。
また更に、タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐ及びｅｍｐの双方とも不活化されたブレビバチルス・チョウシネンシス菌株は、上記により構築したｉｍｐ遺伝子不活化株を親株に用いて、更に、そのゲノム上のｅｍｐ遺伝子を不活化することにより得ることができる。ｅｍｐ遺伝子の不活化は、ｉｍｐ遺伝子の不活化と同様の手順を繰り返すことにより可能である。
なお、上記の方法においてマーカー遺伝子として用いられるネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子は例示であって、上記の方法に用いられるマーカー遺伝子の種類は特に限定されない。任意の複数のマーカー遺伝子を用い、上記の手順に従うことにより相同組換えによる遺伝子の不活化を行うことができる。
以上に記したブレビバチルス・チョウシネンシスゲノム上の細胞外及び細胞内の主要タンパク質分解酵素遺伝子の不活化により、本発明の細胞外及び細胞内のタンパク質分解活性が、公知の菌株より格段に低減したブレビバチルス・チョウシネンシス菌株を得ることができる。
ブレビバチルス・チョウシネンシス菌株のタンパク質分解活性は、ゼラチン−ＰＡＧＥ（ザイモグラム）法またはアゾカゼインやアゾコール等のタンパク質をアゾ化した基質を用いた方法などにより測定することができる。
以上に記載の方法により得られた、本発明の胞子形成能を有しないブレビバチルス・チョウシネンシスの例としては、実施例に示すブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ１（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１−ＳＰ１）を挙げることができる。また、公知の菌株より格段に細胞内のタンパク質分解活性が低減し、なおかつ、胞子形成能を有しないブレビバチルス・チョウシネンシスの例としては、実施例に示すブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ２（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１−ＳＰ２）を挙げることができる。また更に、公知の菌株より格段に細胞外及び細胞内のタンパク質分解活性が低減し、なおかつ、胞子形成能を有しないブレビバチルス・チョウシネンシスの例としては、実施例に示すブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１−ＳＰ３）を挙げることができる。
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１−ＳＰ３）は、平成１５年９月１１日付で特許生物寄託センター（茨城県つくば市東一丁目１の１）にブダペスト条約下に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４７９が与えられた。
本発明に係るブレビバチルス・チョウシネンシスは、（イ）胞子を形成しない、（ロ）細胞外主要タンパク質分解酵素活性が低いないしはない、（ハ）細胞内主要タンパク質分解酵素活性が低いないしはない、の３要件の内の少なくともひとつを有する点で特徴的であり、他の性質は、通常のブレビバチルス・チョウシネンシスと格段に相違するものではない。その菌学的性質は次のとおりである。
（ａ）形態
細胞の大きさ
液体培地： ０．４〜０．６×１．５〜４μｍ
胞子の形 桿菌
胞子の有無 無
細胞の多形性の有無 無
運動性の有無 有（周毛）
（ｂ）生理学的性質
硝酸塩の還元 −
ＶＰテスト（アセトインの生成） −
インドールの生成 −
硫化水素の生成（ＴＳＩ寒天培地） ＋
クエン酸の利用 ＋
無機窒素源の利用
硝酸塩 −
アンモニウム塩 ＋
色素の生成（キング培地） −
ウレアーゼ −
オキシダーゼ ＋
カタラーゼ ＋
Ｏ−Ｆテスト 分解せず
ゼラチンの分解 −
グルコースから酸の生成 −
キシロースから酸の生成 −
ラクトースから酸の生成 −
マルトースから酸の生成 −
生育できるｐＨ ６〜８．５
（ｃ）他の性質
温度抵抗性 ６０℃で死滅する
細胞外のタンパク質分解酵素活性 低いないしなし（注１）
細胞内のタンパク質分解酵素活性 低いないしなし（注２）
（注１）
以下のいずれの方法においても培養上清中にタンパク質分解活性が検出されない。
（１）ゼラチン−ＰＡＧＥによるゼラチンの分解活性測定法。
（２）培養上清とアゾカゼインを反応させ、反応液の吸光度変化を計測するアゾカゼインの分解活性測定法。
（３）培養上清とアゾコールを反応させ、反応液の吸光度変化を計測するアゾコールの分解活性測定法。
（注２）
ゼラチン−ＰＡＧＥによろゼラチン分解活性の測定によっても、細胞内画分にゼラチン分解活性が検出されない。
なお本発明において、「細胞外のタンパク質分解酵素活性が公知菌より格段に低減された」とは、アゾカゼイン法又はアゾコール法にて測定した場合の培養上清中の該酵素活性が、ブレビバチルス・チョウシネンシス公知菌株の該酵素活性の１／１０以下、好ましくは１／３０以下、更に好ましくは１／１００以下にまで低下することをいい、後記する実施例では、１／１２０以下、１／３３０以下のデータも示されている。
同じく「細胞内のタンパク質分解酵素活性が公知菌株より格段に低減された」とは、アゾカゼイン法により測定した場合の細胞内画分中の該酵素活性が、ブレビバチルス・チョウシネンシス公知菌株の該酵素活性の１／２以下、好ましくは１／５以下、更に好ましくは１／８〜１／１０以下をいう。
これらの低減値は、アゾカゼイン法やアゾコール法で測定した場合のものであるので、他の方法で測定した場合には、これらの低減値に基づいてそれぞれの低減値を規定すればよいことはいうまでもない。
更に、本発明は、上記のブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主菌として用いる遺伝子組換えによるタンパク質生産方法を提供する。
本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主菌として用いたタンパク質生産に用いられる発現ベクターは、ブレビバチルス・チョウシネンシス中で複製可能であるものならば特に限定されないが、好ましいものとしてバチルス・ブレビス４７の主要菌体外タンパク質遺伝子（ＭＷＰ遺伝子）のプロモーター領域、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１の主要菌体外タンパク質遺伝子（ＨＷＰ遺伝子）のプロモーター領域を有する発現ベクターを挙げることができる。また、通常、ブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主とする組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質は、宿主細胞内に蓄積せずに、細胞外への分泌を行うため、プロモーター領域をコードするＤＮＡ配列の３′末端側に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むものが望ましい。分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列として好ましいものとして、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１の主要菌体外タンパク質の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列などを挙げることができる。
具体的には、本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主に用いた組換えタンパク質生産に用いられる発現ベクターとして好ましいものとして、ｐＨＴ１１０（特開平６−１３３７８２）、ｐＮＹ３０１（特開平１０−２９５３７８）等を挙げることができる。
本発明において発現ベクターに組み込まれるタンパク質をコードするＤＮＡは、本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主に用いた組換えタンパク質生産において、その発現が可能であるものであれば特に限定されない。例えば、サイトカイン、ケモカイン、酵素、ホルモンなどの遺伝子、もしくは、その他の任意のペプチドをコードするＤＮＡ断片などのいずれであってもよい。また、遺伝子組換えにより生産されるタンパク質の用途も特に限定されない。その用途は医薬品、生化学試薬、産業用酵素などのいずれであってもよい。
発現ベクターへのタンパク質をコードするＤＮＡの挿入は、精製された当該タンパク質をコードするＤＮＡを適当な制限酵素で処理することにより得たＤＮＡ断片を発現用ベクターの適当な制限酵素切断部位またはマルチクローニングサイトに挿入し、連結するなどの当業者に公知の一般的な方法により行うことができる。
更に上記のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを、本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスに導入することによりブレビバチルス・チョウシネンシスの形質転換を行うことができる。本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスへの発現ベクターの導入の方法も特に限定されず、当業者に公知の方法を適宜選択して行えばよいが、特に好ましい方法として、ブレビバチルス・チョウシネンシスへの発現ベクターの導入に通常用いられるエレクトロポレーション法を例示することができる。
更に、この形質転換体を用いたタンパク質の生産は、この形質転換体を適切な培地に接種、培養し、培養終了後、タンパク質を回収・精製することにより行う。
本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスの形質転換体の培養条件も、形質転換体の培養及び組換えタンパク質遺伝子の発現が可能なものであるならば、特に限定されないが、特に好ましい条件として、本明細書の実施例で用いたＴＭ培地（ペプトン１％、肉エキス０．５％、酵母エキス０．２％、グルコース１％、ｐＨ７．０）または２ＳＬ培地（ペプトン ４％、酵母エキス ０．５％、グルコース ２％、ｐＨ７．２）で３０℃、２〜４日間の培養条件を例示することができる。
また、必要に応じて、硫酸鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛などの無機塩類を適宜加えてもよい。
更に、組換えタンパク質が分泌生産される場合には、培養終了後、遠心分離、ろ過などの一般的な方法でブレビバチルス・チョウシネンシスの培養細胞と分泌生産されたタンパク質を含む上清を分離することにより生産された組換えタンパク質を回収することができる。
また、生産されたタンパク質が分泌生産されず、ブレビバチルス・チョウシネンシスの細胞内に蓄積される場合にも、当業者に公知の方法を適宜用いることにより、細胞内に蓄積生産されたタンパク質を回収することができる。例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、また必要に応じて界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたタンパク質を回収することができる。
更に、生産されたタンパク質の精製を行う場合には、当業者に公知の方法、たとえば溶媒抽出、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、電気泳動、等電点沈殿などの方法を適宜、単独または組み合わせて用いることにより行うことができる。

発明の効果

本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスは、遺伝子組換えによるタンパク質生産における宿主として利用することができる。
本発明は、細胞外のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減したブレビバチルス・チョウシネンシスを提供する。該ブレビバチルス・チョウシネンシスは、分泌生産される組換えタンパク質生産の宿主に用いられた場合、細胞外のタンパク質分解活性による組換えタンパク質の分解を顕著に抑制する。そして、このことにより、該ブレビバチルス・チョウシネンシスは公知のブレビバチルス・チョウシネンシスより効率的な組換えタンパク質の分泌生産を可能にする。
また、本発明は、細胞内のタンパク質分解活性が公知の菌株より格段に低減したブレビバチルス・チョウシネンシスを提供する。該ブレビバチルス・チョウシネンシスは、細胞内に蓄積生産される組換えタンパク質生産の宿主に用いられた場合、細胞内のタンパク質分解活性による組換えタンパク質の分解を顕著に抑制する。そして、このことにより、該ブレビバチルス・チョウシネンシスは公知のブレビバチルス・チョウシネンシスより効率的な組換えタンパク質の細胞内への蓄積生産を可能にする。
また更に、本発明は、胞子体を形成しないブレビバチルス・チョウシネンシスを提供する。該ブレビバチルス・チョウシネンシスは、おだやかな殺菌条件で完全に死滅するため、組換えタンパク質医薬品の製造を初めとする産業上の広範な用途において組換えタンパク質生産の宿主として利用することが可能である。
したがって、本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスは遺伝子組換えによるタンパク質生産の宿主として極めて有用である。本菌のひとつＨＰＤ３１−ＳＰ３株を国際寄託したが（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４７９）、この菌株は上記３条件をいずれも満足する新規３重欠損株である。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明をこれらの実施例のいずれかに限定することを意図するものでない。

［実施例１］
（胞子形成能を有しないブレビバチルス・チョウシネンシス変異株の取得）
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６３）に対してニトロソグアニジンによる変異剤処理を行い、胞子形成能を有しないブレビバチルス・チョウシネンシス変異株の取得を試みた。
まず、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１をＴＭ液体培地（ペプトン １％、肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．２％、グルコース １％、ｐＨ７．０）で一晩、３０℃で培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、更に、回収した菌体を滅菌水でＯＤが０．１になるように洗浄希釈した。次いで、この菌体に１００ｍｇ／ＬとなるようにＮメチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを添加し、生存率が１〜１０％となるように振とうすることで、変異剤処理を行った。
次いで、変異剤処理を行った菌体を滅菌水で適宜希釈した後、ＴＭ平板培地に塗抹し、３日間３０℃で培養を行い、ＴＭ平板培地上に菌株のコロニーを形成させた。通常のブレビバチルス・チョウシネンシスのコロニーと異なり、表面にシワがない平滑なコロニーを形成した菌株を選択し、更に、これらの選択した菌株の内から顕微鏡観察により胞子が確認できないものを胞子形成能を有しない可能性がある菌株として選択した。以上の変異処理及びコロニー形成を繰り返すことにより胞子形成能を有しない可能性がある変異株を５株得た。
［実施例２］
（変異株の耐熱性試験による胞子形成能の評価）
実施例１で得た５株の変異株について耐熱性試験による胞子形成能の評価を行った。試験の対照にはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を用いた。
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及び変異株５株（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５）をそれぞれＴＭ寒天培地に塗布し、３０℃で７日間静置培養した。なお、胞子体を形成させるために通常の培養期間より長い７日間の培養を行った。培養終了後、６６０ｎｍにおける吸光度が１．０になるように菌体を０．８％ＮａＣｌを含む滅菌蒸留水に懸濁し、菌体懸濁液１００μｌを８０℃で１０分間保温した後、ＴＭ寒天培地に塗布した。更に３０℃の恒温で２４時間培養し、生育したコロニー数から生菌数を計測した。
また、８０℃加熱処理前の菌体懸濁液を段階的に滅菌蒸留水にて希釈後、ＴＭ寒天培地に塗布し、３０℃の恒温で２４時間培養した。培養終了後、生育したコロニー数から生菌数を計測した。以上の結果を表１に示す。

上記の表１が示すように、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１は、８０℃、１０分間の加温によって全菌数の約１／２程度しか死滅しないのに対し、ブレビバチルス・チョウシネンシス変異株Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５は同条件によって完全に死滅する。つまり耐熱性胞子を形成しないことが強く示唆された。
［実施例３］
（変異株のＤ値の測定）
次いで、ブレビバチルス・チョウシネンシス変異株Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５について菌体のＤ値の測定試験を行った。試験の対照にはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を用いた。
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及びブレビバチルス・チョウシネンシス変異株Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５のそれぞれをＴＭ寒天培地に塗布し、３０℃で７日間静置培養した。培養終了後、６６０ｎｍにおける吸光度が１．０になるように菌体を０．８％滅菌食塩水に懸濁後、６０℃、７０℃及び８０℃の各温度で保温し、保温開始から１分後、２分後、３分後、５分後、１０分後、２０分後、３０分後、６０分後の各々の時点で懸濁液を分取した。次いで分取した各々の懸濁液を冷却した後、ＴＭ寒天培地に塗布し３０℃で２４時間培養した。培養終了後、生育したコロニー数から菌数を計測した。更に、計測した菌数から胞子体の数を１／１０に減少させる時間として菌体のＤ値を求めた。
なお、通常、ブレビバチルス・チョウシネンシスの生細胞（非胞子菌体）は、６０℃以上の温度域において直ちに死滅するため、試験開始後１分において残存している菌体は、すべて胞子体であると仮定して計算を行った。以上の結果を表２に示す。

表２に示すとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１については、各温度域での菌体のＤ値を求めることができた。しかしながら、ブレビバチルス・チョウシネンシス変異株Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５については、各温度域での試験開始後、１分間以内に全ての菌株が死滅したため、いずれの温度域でも菌体のＤ値を求めることができなかった。この結果は、ブレビバチルス・チョウシネンシス変異株Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５は、いずれも、胞子体を形成しなかったためであると考えられる。
以上に示した８０℃、１０分間の恒温試験及びＤ値の測定試験の結果により、ブレビバチルス・チョウシネンシス変異株Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５は、胞子形成能を有さず、また、６０℃に１分間置くことで完全に死滅することが確認された。
［実施例４］
（変異株Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５を宿主に用いた組換えタンパク質（ｈＥＧＦ）の生産）
更に、ブレビバチルス・チョウシネンシス変異株Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５について組換えｈＥＧＦの生産を行うことにより組換えタンパク質の生産性の評価を行った。その手順と結果を以下に示す。対照にはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を用いた。
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及び変異株Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５のそれぞれを、ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）を発現するプラスミドベクターｐＨＴ１１０・ＥＧＦ（特開平６−１３３７８２）をエレクトロポレーション法により導入することで形質転換した。次いで、それぞれの菌株の形質転換体を２ＳＬ液体培地（ペプトン ４％、酵母エキス ０．５％、グルコース ２％、ｐＨ７．２）３ｍｌを用いて３０℃で６０時間振とう培養した。変異株Ｎｏ．４とＮｏ．５については形質転換体を得ることができなかった。
培養終了後、培養液を遠心分離し、上清画分を蒸留水によって１０倍に希釈した後、ＨＰＬＣ分析に供した。得られたピーク面積から培養液中に分泌生産された組換えｈＥＧＦの量を算出した。その結果を表３に示す。なお、表３では、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１でのｈＥＧＦの生産量を１００％として換算した値を示した。

上記の表３が示すように、ブレビバチルス・チョウシネンシス変異株Ｎｏ．１を宿主に用いた場合のｈＥＧＦの生産量は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を多少上回っていた。また、その生育や形質転換効率もＨＰＤ３１と同等であった。
上記変異株Ｎｏ．１をブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ１（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１−ＳＰ１）と命名した。
［実施例５］
（ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ１の変異遺伝子の同定）
また、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ１のゲノム上で変異を受けた遺伝子の同定を行った。変異を受けた遺伝子の同定は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のゲノムライブラリーを作製し、このライブラリーの各々をＳＰ１に導入し胞子形成能が復活した菌株を選抜することにより行った。
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のゲノムライブラリーは以下の手順により作製した。まず、ＴＭ培地で１５時間培養したブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１からグノムＤＮＡを調製し、次いで、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩによってゲノムＤＮＡを部分的に処理し、ゲノムＤＮＡの断片を得た。得られたゲノムＤＮＡの断片と制限酵素ＢａｍＨＩで処理したプラスミドベクターｐＮＹ３０１とでライゲーション反応を行い、ゲノムライブラリープラスミドＤＮＡを作製した。更に、これらのゲノムライブラリープラスミドＤＮＡをエレクトロポレーション法によりブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ１に導入した。
次いで、このゲノ厶ライブラリープラスミドＤＮＡを導入したブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ１の形質転換体を（抗生物質を含まない）ＴＭ液体培地で３０℃で１時間培養し、更に、ネオマイシンを含むＴＭ液体培地で３０℃で３日間培養した。培養終了後、８０℃で１０分間加熱処理を行い、更に、ＴＭ寒天培地に塗抹し３０℃で３日間培養した。この培養によりコロニーを形成した菌株を胞子形成能が復活した菌株として選択した。
その結果、胞子形成能が復活した菌株が８株得られた。次いで、これらの８株から先に導入したプラスミドＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡ配列を決定した。その結果、８株の内、３株において新規な遺伝子がコードされた共通の翻訳枠が存在することが明らかになった。この結果から、変異株ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ１は、変異剤処理によってこの遺伝子が不活化されて胞子形成能が失われたと推定した。この共通の翻訳枠にコードされた新規な遺伝子をｈｏｓと命名した。また、そのＤＮＡ配列を配列番号１（図７、図８の上段）に示した。
更に、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を親株にｈｏｓ遺伝子の不活化株を作製し、ｈｏｓ遺伝子の不活化によりブレビバチルス・チョウシネンシスの胞子形成能が失われることを確認した。
ｈｏｓ遺伝子不活化株の作製は、公知の相同組換えに準じた方法により行った。以下に、その具体的手順を示す。
まずｈｏｓ遺伝子不活化用ベクターの構築を行った。プライマーＨｏｓ Ｐ１及びＨｏｓ Ｐ２を用いたＰＣＲによりｈｏｓ遺伝子の上流部分のＤＮＡ断片（１．５ｋｂｐ：上流側にＫｐｎＩ，下流側にＢａｍＨＩ認識配列を導入）を増幅し、更に、このＰＣＲで増幅した１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで処理しＤＮＡ断片を回収した。また、プライマーＨｏｓ Ｐ３及びＨｏｓ Ｐ４を用いたＰＣＲによりｈｏｓ遺伝子の下流部分の約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片（上流側にＰｓｔＩ，下流側にＸｂａＩ認識配列を導入）を増幅した後、この約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩ及びＸｂａＩで処理しＤＮＡ断片を回収した。また更に、ネオマイシン耐性遺伝子を含みＦＲＴ配列（Ｇｅｎｅ，２１２，７７−８６（１９９８））を両側に持つＤＮＡ断片（１．４ｋｂｐ）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで処理しＤＮＡ断片を回収した。
また、ブレビバチルス・チョウシネンシスで複製不可能なベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^Ｒ ＩＩ ＳＫ＋（東洋紡績株式会社）のＳａｃＩ認識配列に同制限酵素により切り出されたエリスロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入した。次いで、このプラスミドＤＮＡのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ制限酵素切断部位に、上述の３つのＤＮＡ断片を同時に導入することにより、ｈｏｓ遺伝子不活化用ベクターを構築した。以上により構築したｈｏｓ遺伝子不活化用ベクターをｐＢｌｕｅ−ｈｏｓ：：Ｎｍ^ｒとした。また、上記で使用したプライマーＨｏｓ Ｐ１、Ｈｏｓ Ｐ２、Ｈｏｓ Ｐ３及びＨｏｓ Ｐ４の塩基配列を、それぞれ、配列番号７、８、９、１０に示し、これらをまとめて図１４に示した。
次いで、このｈｏｓ遺伝子不活化用ベクターｐＢｌｕｅ−ｈｏｓ：：Ｎｍ^ｒをエレクトロポレーション法によりブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１に導入し、ネオマイシン耐性を指標に形質転換体を選抜した。更に、得られたネオマイシン耐性を示す株を、エリスロマイシンを含むＴＭ寒天培地に塗抹し、３０℃で２日間培養し、エリスロマイシンに対する感受性を指標に菌株を選抜した。選抜した菌株のｈｏｓ遺伝子不活化の確認は、ＰＣＲとゲノミックサザン解析より行った。更に、下記の実施例７に記載の手順に従ってｈｏｓ遺伝子不活化株からネオマイシン耐性遺伝子の削除を行い、ブレビバチルス・チョウシネンシスのｈｏｓ遺伝子不活化株を得た。
次いで、このｈｏｓ遺伝子不活化株について実施例２、３の手順に従って胞子形成能の評価試験を行い、胞子形成能を有していないことを確認した。
また更に、このｈｏｓ遺伝子不活化株について実施例４の手順に従って組換えタンパク質の生産性評価試験を行い、ｈＥＧＦの生産性がブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ１と同等であることを確認した。
以上の試験結果により、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ１は、変異剤処理によりｈｏｓ遺伝子に変異が生じたためｈｏｓ遺伝子が不活化しており、その結果、胞子形成能が失われたと結論した。
細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子が不活化されたブレビバチルス・チョウシネンシスの作製
［実施例６］
（細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐのクローニング）
（６−１）ｉｍｐのクローニング
不活化対象となるタンパク質分解酵素を特定するため、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）の細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子のクローニングを行った。
実施例５に記載の手順に従って構築したブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のゲノムライブラリープラスミドＤＮＡによって、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を形質転換し、更に、これらの形質転換体を１％スキムミルクと終濃度５０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含むＴＭ寒天培地に塗抹し、３０℃で４日間培養した。培養終了後、スキムミルクの分解を示すハローを形成した株を選抜した。
更に、上記で得た株からプラスミドＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ配列分析を行った。その結果、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１ゲノム由来の３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片中に約１．４ｋｂｐの翻訳枠（ＯＲＦ）、また、そのＤＮＡ断片の相補配列に約０．７ｋｂｐのＯＲＦが存在していた。この約３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が含まれるプラスミドをｐＮＹ−ｉｍｐと命名した。
上記の３．６ｋｂｐのＤＮＡ断片中に含まれるふたつのＯＲＦの内、約１．４ｋｂｐのＯＲＦのみを含むプラスミドと約０．７ｋｂｐのＯＲＦのみを含むプラスミドを作製し、それぞれのプラスミドにより、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１の形質転換を行った。
更に、それぞれの形質転換体を、１％スキムミルクを含むＴＭ寒天培地で培養したところ、約１．４ｋｂｐのＯＲＦのみを有するプラスミドを含む形質転換体のみがＴＭ寒天培地上でハローを形成したため、この約１．４ｋｂｐのＯＲＦにタンパク質分解酵素がコードされていることが明らかになった。この約１．４ｋｂｐのＯＲＦにコードされたタンパク質分解酵素を細胞内主要タンパク質分解酵素（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｊｏｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ）、略してＩＭＰと命名した。ＩＭＰと他の公知のタンパク質との間でアミノ酸配列の相同性検索を行ったが、有意な相同性を有するタンパク質は発見されなかった。
このブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株由来の細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐのＤＮＡ塩基配列を配列番号５（図１２〜１３の上段）に示し、そのＤＮＡ配列に対応する細胞内主要タンパク質分解酵素ＩＭＰのアミノ酸配列を配列番号６（図１２〜１３の下段）に示す。
（６−２）ｉｍｐ遺伝子の発現及びＩＭＰタンパク質の精製
次いで、ＩＭＰの性質の詳細を明らかにするためにｉｍｐ遺伝子の発現及びＩＭＰタンパク質の精製を行った。
まず、生産されたＩＭＰタンパク質の精製を容易にする目的でＩＭＰのＣ末端に８つのヒスチジンからなるペプチドタグ（ヒスチジンタグ）を付加したポリペプチドを発現するプラスミドベクターｐＮＹ−ｉｍｐ−Ｈｉｓを構築した。プラスミドベクターｐＮＹ−ｉｍｐ−Ｈｉｓの構築は以下の手順により行った。
まず、センスプライマーｉｍｐ Ｐ１とアンチセンスプライマーｉｍｐ Ｐ２を用いてｐＮＹ−ｉｍｐプラスミドＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った。なお、センスプライマーｉｍｐ Ｐ１は、ＩＭＰのＮ末端と推定されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と相同なプライマーである。また、アンチセンスプライマーｉｍｐ Ｐ２は、ヒスチジンタグをコードするためｇｔｇを８回繰り返したＤＮＡ配列を付加し、更に、ストップコドンと制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列を導入したプライマーである。このセンスプライマーｉｍｐ Ｐ１の塩基配列を配列番号１１に示し、アンチセンスプライマーｉｍｐ Ｐ２の塩基配列を配列番号１２に示し、そして更に、これらをまとめて図１５に示した。
このＰＣＲにより増幅されたヒスチジンタグをコードする配列とｉｍｐ遺伝子を含むＤＮＡ断片を精製後、制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで処理し約５００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。次いで、このＤＮＡ断片をプラスミドｐＮＹ−ｉｍｐのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位に挿入し、プラスミドベクターｐＮＹ−ｉｍｐ−Ｈｉｓを得た。
次いで、上記で得たプラスミドベクターｐＮＹ−ｉｍｐ−Ｈｉｓによりブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を形質転換し、得られた形質転換体を６００ｍｌのＴＭ液体培地で３０℃、４８時間振とう培養した。培養終了後、６０００×ｇの遠心分離によって菌体を回収し、３０ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４、２Ｍ ＫＣｌ）に懸濁し、再度６０００×ｇの遠心分離によって菌体を回収した。この洗浄操作を２回繰り返した後、０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチームと１０単位のＤＮａｓｅを含む３０ｍＭの溶菌緩衝液（２０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４）に菌体を懸濁し、３７℃の恒温に２０分間置いた。次いで、超音波処理によって菌体を破砕し、３４０００×ｇで３０分間遠心し、上清を細胞内画分として回収した。細胞内画分３０ｍｌを０．２２μｍのフィルターによって濾過した後、終濃度０．５ＭのＮａＣｌと１０ｍＭイミダゾールを添加し、１ｍｌのニッケルキレートカラム（アマシャムファルマシア社）に供した。１０−５００ｍＭイミダゾールの直線濃度勾配によってニッケルキレートカラムに吸着したＩＭＰタンパク質を溶出し分取した。ＱｕａｎｔｉＣｌｅａｖｅ（登録商標）ＰｒｏｔｅａｓｅＡｓｓａｙＫｉｔ（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）によって分画された溶出液のプロテアーゼ活性を測定しＩＭＰ活性画分を同定した。更に、活性画分５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＩＭＰタンパク質が電気泳動上で単一にまで精製されていることを確認した。
（６−３）ＩＭＰの性質
ＩＭＰ １０μｇを含むＩＭＰの精製酵素標品をアクリルアミド１０％濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、セミドライ式タンパク質転写装置によってタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、０．０１％ ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）と４０％メタノールからなる染色液でＩＭＰのタンパク質バンドを検出した。次いで、ＣＢＢを含まない４０％メタノール液でＰＶＤＦ膜を脱色した後、膜を乾燥させた。次いで、膜からＩＭＰのタンパク質バンドを切り出し、そのＮ末端アミノ酸配列分析を行い、そのＮ末端配列がＭｅｔＡｓｎＨｉｓＰｒｏＡｓｐであることを確認した。以上により、ＩＭＰは４５３アミノ酸残基からなる推定分子量４９，８１１Ｄａの細胞内タンパク質分解酵素であることが判明した。
次いで、ＱｕａｎｔｉＣｌｅａｖｅ（登録商標）ＰｒｏｔｅａｓｅＡｓｓａｙＫｉｔ（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を用いて、精製ＩＭＰの酵素化学的性質を詳細に検討した。基質であるスクシニル化カゼイン ２ｍｇを１００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）６５μｌに溶解した酵素反応溶液に、ＩＭＰを１．５μｇ含む精製酵素標品１０μｌを加え３７℃の恒温に２０分間置いた。次いで、発色液２５μｌを添加し、２０分間、室温で放置した。発色後、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＩＭＰのタンパク質分解活性を定量した。このタンパク質分解活性の定量において３０℃、６０分間の反応により４５０ｎｍの吸光度を０．１上昇させる酵素量を１単位とし、反応に用いた酵素タンパク質量はＢＳＡを標準としてＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。
以上の結果により、ＩＭＰの至適温度は３０℃、至適ｐＨは８．０、比活性は４４．７ ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであり、またＩＭＰは１ｍＭ以上のＥＤＴＡにより活性が阻害されることが明らかになった。
［実施例７］
（細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐが不活化されたブレビバチルス・チョウシネンシスの作製）
次いで、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ１を親株にｉｍｐ遺伝子が不活化されたブレビバチルス・チョウシネンシスの作製を行った。ｉｍｐ遺伝子が不活化されたブレビバチルス・チョウシネンシスの作製は相同組み換えによる遺伝子の不活化法に準じた方法を用いた。具体的には、以下の手順により行った。
まず、ｉｍｐ遺伝子不活化用ベクターの構築を行った。制限酵素ＥｃｏＲＶによってｉｍｐ遺伝子の内部領域である１ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^ＲＩＩ ＳＫ＋（東洋紡績株式会社）のＳｍａＩ／ＥｃｏＲＶ制限酵素切断部位に挿入した。次いで、制限酵素ＰｓｔＩで処理することによってｉｍｐ遺伝子内部の１２０ｂｐの領域を除去し、ネオマイシン耐性遺伝子を含みＦＲＴ配列を両端に持つＤＮＡ断片をＰｓｔＩ制限酵素切断部位に挿入することにより、ｉｍｐ遺伝子を分断した。更に、このプラスミドのＢａｍＨＩ制限酵素切断部位に同制限酵素によって切り出されたエリスロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入することにより、ｉｍｐ遺伝子不活化用ベクターを構築した。以上により構築したｉｍｐ遺伝子不活化用ベクターをｐＢｌｕｅ−ｉｍｐ：：Ｎｍ^ｒとした。
次いで、このｉｍｐ遺伝子不活化用ベクターｐＢｌｕｅ−ｉｍｐ：：Ｎｍ^ｒ１μｇをエレクトロポレーション法によりブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ１に導入し、ネオマイシン耐性を指標に形質転換体を選抜した。得られたネオマイシン耐性を示す菌株を終濃度１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＴＭ寒天培地（ペプトン １％、肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．２％、グルコース １％、寒天 １．５％、ｐＨ７．０）に塗抹し、３０℃、２日間培養し、ｉｍｐ遺伝子の上流域と下流域の２箇所の遺伝子座で相同組み換え反応を起こした株（ダブルクロスオーバー株）をエリスロマイシンに対する感受性を指標に選抜した。更に、選抜した菌株に対してＰＣＲとゲノミックサザン解析を行いｉｍｐ遺伝子が不活化されている事を確認した。
次いで、上記で構築したｉｍｐ遺伝子不活化株のゲノムからネオマイシン耐性遺伝子の削除を行った。ｉｍｐ遺伝子不活化株からネオマイシン耐性遺伝子を削除するために、まず、酵母由来のＦｌｐ リコンビナーゼ遺伝子とブレオマイシン耐性遺伝子を有するネオマイシン耐性遺伝子削除用プラスミドベクターを以下の方法により構築した。
まず、ネオマイシンを含まない培地を用いて培養を行った場合には、ブレビバチルス・チョウシネンシスの菌体から容易に脱落するプラスミドベクターを得るために、ｐＮＹ３０１プラスミドベクター（特開平１０−２９５３７８）に対してヒドロキシルアミンによる薬剤処理を行い、その変異体を得ることにした。具体的には、以下のようにして行った。
ｐＮＹ３０１プラスミドベクターＤＮＡ １．５μｇを、ヒドロキシルアミン３５０ｍｇとＮａＯＨ９０ｍｇを氷冷した滅菌蒸留水５ｍｌに溶解した溶液（１００μｌ）に溶解し、７０℃の恒温に１２０分間おいた後、プラスミドＤＮＡをエタノール沈澱により濃縮、乾燥させた。更に、このプラスミドＤＮＡを滅菌蒸留水に溶解し、１００ｎｇ相当の該プラスミドＤＮＡにより、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を形質転換し、ネオマイシン耐性を指標に形質転換体を選抜した。生育速度が遅くコロニーサイズが小さい形質転換体から得られたプラスミドＤＮＡは、元のｐＮＹ３０１プラスミドベクターＤＮＡに比べ１細胞あたりのコピー数が数十分の１に低下しており、かつ、ネオマイシンを含まない培地を用いて培養を行った場合には、菌体から容易に脱落した。
このプラスミドＤＮＡを鋳型にＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ認識配列を付加したセンスプライマーｆｌｐ Ｐ１（配列番号１３：図１６）とＢａｍＨＩ認識配列を付加したアンチセンスプライマーｆｌｐ Ｐ２（配列番号１４：図１７）を用いてＰＣＲを行い、ｒｅｐ遺伝子を含む約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。更に、約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで処理した。
また、ブレオマイシン耐性遺伝子を有するｐＮＨ３００プラスミド（Ｙａｓｕｈｉｒｏ，Ｓｈｉｇａ ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５８，５２５−５３１（１９９２））を鋳型にＢｇｌＩＩ認識配列を付加したセンスプライマーｆｌｐ Ｐ３（配列番号１５、図１８）とＥｃｏＲＩとＸｂａＩ認識配列を付加したアンチセンスプライマーｆｌｐ Ｐ４（配列番号１６、図１９）によってＰＣＲを行いブレオマイシン耐性遺伝子とプラスミドＯｒｉを含む約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。更に、１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで処理し、上記で得た約１．６ｋｂｐと約１．１ｋｂｐの両ＤＮＡ断片を結合させることにより新たなプラスミドを作製した。このプラスミドをｐＮＹ−Ｍｕｔ−Ｂｌｅとした。
また、酵母由来の２−μｍプラスミドを鋳型に、ＮｃｏＩ認識配列を付加したセンスプライマーｆｌｐ Ｐ５（配列番号１７：図２０）とＸｈｏＩ認識配列を付加したアンチセンスプライマーｆｌｐ Ｐ６（配列番号１８：図２１）を用いてＰＣＲを行い、Ｆｌｐリコンビナーゼ遺伝子を含む領域を増幅した。次いで、このＰＣＲにより得たＦｌｐリコンビナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＮｃｏＩとＸｈｏＩで処理した後、ｐＮＹ３０１ベクターのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ制限酵素切断部位に挿入することによりＦｌｐリコンビナーゼ遺伝子を含むベクターを得た。このベクターをＰＮＹ３０１−Ｆｌｐとした。
次いで、このｐＮＹ３０１−Ｆｌｐを鋳型にＸｂａＩ認識配列を付加したセンスプライマーｆｌｐ Ｐ７（配列番号１９：図２２）とＰｓｔＩ認識配列を付加したアンチセンスプライマーｆｌｐ Ｐ８（配列番号２０：図２３）を用いてＰＣＲを行い、Ｆｌｐリコンビナーゼ遺伝子及びｐＮＹ３０１由来のプロモーター領域を含む約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。更に、この約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩとＰｓｔＩで処理した後、上記で得たｐＮＹ−Ｍｕｔ−ＢｌｅのＸｂａＩ／ＰｓｔＩ制限酵素切断部位に挿入することによりネオマイシン耐性遺伝子削除用ベクターを構築した。このネオマイシン耐性遺伝子削除用ベクターをｐＮＹ−Ｍｕｔ−Ｂｌｅ−Ｆｌｐとした。このｐＮＹ−Ｍｕｔ−Ｂｌｅ−Ｆｌｐは、Ｆｌｐリコンビナーゼ遺伝子を発現し、かつ、ネオマイシンを含まない培地を用いて培養を行った場合には、ブレビバチルス・チョウシネンシスの菌体から容易に脱落するプラスミドベクターである。
次いで、このネオマイシン耐性遺伝子削除用ベクターｐＮＹ−Ｍｕｔ−Ｂｌｅ−Ｆｌｐをエレクトロポレーション法によりｉｍｐ遺伝子不活化株に導入し、ブレオマイシン耐性を指標に形質転換体を選抜した。次いで、この形質転換体を、ブレオマイシンを含まないＴＭ液体培地で振とう培養し、更に、ＴＭ寒天培地で培養した。ＴＭ寒天培地上にコロニーが得られた菌株からネオマイシンとブレオマイシンに対して感受性を示す菌株を選抜した。
以上により、ネオマイシン耐性遺伝子が削除され、かつ、ネオマイシン耐性遺伝子削除用ベクターｐＮＹ−Ｍｕｔ−Ｂｌｅ−Ｆｌｐが脱落した、目的とするブレビバチルス・チョウシネンシスのｉｍｐ遺伝子不活化株を得た。このゲノム上の細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐが不活化されたブレビバチルス・チョウシネンシスをブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ２（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１−ＳＰ２）と命名した。
（細胞内と細胞外の主要タンパク質分解酵素遺伝子が不活化されたブレビバチルス・チョウシネンシスの作製）
次いで、上記で得たｉｍｐ遺伝子が不活化されたブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ２に対して細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子の不活化を行った。そのために、まず、細胞外主要タンパク質分解酵素の単離、及び、同遺伝子のクローニングを行った。
［実施例８］
（細胞外主要タンパク質分解酵素（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｊｏｒ Ｐｒｏｔｅａｓｅ，ＥＭＰと略記）遺伝子のクローニング）
（８−１）細胞外主要タンパク質分解酵素（ＥＭＰ）の精製
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）を５ＬのＴＭ液体培地で２４時間培養し、培養終了後、培養上清液を遠心分離により分画し、終濃度５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）を添加した後、ＤＥＡＥ陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに供し、０−０．６Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配によりＥＭＰを溶出した。
ＥＭＰ含有画分を５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）の緩衝液に対して透析した後、ヘパリンカラムに供し、０−０．５ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配により溶出し、ＥＭＰ精製酵素標品とした。また、各溶出画分の酵素活性測定は、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０２，１９６−２０２（１９８０）の方法に準じたゼラチンーＰＡＧＥにより行った。
（８−２）ＥＭＰのアミノ酸配列分析
８−２−１ Ｎ末端アミノ酸配列分析
ＥＭＰ精製酵素標品１０μｇをアクリルアミド１０％濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、セミドライ式タンパク質転写装置によってタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、０．０１％ ＣＢＢと４０％メタノールからなる染色液でＥＭＰのタンパク質バンドを検出した。ＣＢＢを含まない４０％メタノール液で脱色した後、膜を乾燥させ、タンパク質バンドを含む膜を切り出し、ＡＢＩプロテインシーケンサーｍｏｄｅｌ ４９２によりＮ末端アミノ酸配列分析を行った。このアミノ酸配列分析により、ＡｌａＳｅｒＬｙｓＡｒｇＶａｌＨｉｓＴｈｒＡｓｐＡｓｎＬｅｕＶａｌＩｌｅＡｌａＬｅｕＶａｌＧｌｕＰｈｅＡｓｎＡｓｐＬｅｕＧｌｕＧｌｙＡｓｎＧｌｎの２４アミノ酸残基からなるＮ末端のアミノ酸配列を決定した。
８−２−２ 内部部分アミノ酸配列分析
ＥＭＰ精製酵素標品５０μｇをアクリルアミド１０％濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ＥＭＰのタンパク質バンドを含むゲル片を切り出し、更に、ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅ，１１．３ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｇｅｌ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５の方法に従い、ＥＭＰをトリプシン１μｇによりゲル内酵素処理を行いゲル内で限定分解した。次いで、トリプシン処理をしたＥＭＰのペプチド断片をアセトニトリル溶液で回収した後、マイティシルアクアＰＲ１８逆相カラムクロマトグラフィー（関東化学株式会社）に供し、０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリル０−６０％の直線濃度勾配によってＥＭＰのペプチド断片を溶出分離した。更に溶出分離したＥＭＰのペプチド断片を乾固した後、ＡＢＩプロテインシーケンサーｍｏｄｅｌ ４９２によりペプチド断片のひとつについてアミノ酸配列分析を行った。このアミノ酸配列分析により、ＩｌｅＰｈｅＧｌｎＴｈｒＧｌｎＰｒｏＴｈｒＧｌｙＰｈｅＡｓｐの１０アミノ酸残基からなる内部部分アミノ酸配列を決定した。
（８−３）ｅｍｐ遺伝子のクローニング及び同定
次いで、上記で得たＥＭＰの内部部分アミノ酸配列データを基に、２種のオリゴヌクレオチドプライマーｅｍｐ Ｐ１及びｅｍｐ Ｐ２を設計、合成した。ｅｍｐ Ｐ１の塩基配列を配列番号２１に、ｅｍｐ Ｐ２の塩基配列を配列番号２２にそれぞれ示す。また、ｅｍｐ Ｐ１及びｅｍｐ Ｐ２の塩基配列、並びに、ｅｍｐ Ｐ１及びｅｍｐ Ｐ２の塩基配列に対応するアミノ酸配列を図２４にまとめて示す。なお、配列番号２１の配列における左から６番目のｎ及び配列番号２２の配列における左から６番目のｎは、イノシンである。
これらのプライマーｅｍｐ Ｐ１及びｅｍｐ Ｐ２を用いて、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。更に、この約７００ｂｐのＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８ベクター（東洋紡績株式会社）のＨｉｎｃＩＩ認識配列にサブクローニングしＤＮＡ配列分析を行い、この約７００ｂｐのＤＮＡ断片がｅｍｐ遺伝子の一部を含んでいることを確認した。
更に、この約７００ｂｐのＤＮＡ断片の上流域及び下流域のＤＮＡ断片をクローニングするために、上記で得た約７００ｂｐのＤＮＡ断片のＤＮＡ配列データを基に下に示す２種類の特異的プライマー、上流域の増幅用にアンチセンスプライマーｅｍｐ Ｐ３、下流域の増幅用にセンスプライマーｅｍｐ Ｐ４を設計、合成した。
また、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＶ等の制限酵素によって断片化し、更に、これらのＤＮＡ断片の末端にアダプターＤＮＡを付加することによりブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のアダプターゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
アンチセンスプライマーｅｍｐ Ｐ３、センスプライマーｅｍｐ Ｐ４、アダプターＤＮＡの塩基配列を、それぞれ、配列番号２３、２４、２５に示す。また、これらをまとめて図２５に示す。
次いで、このブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１ゲノムのアダプターＤＮＡライブラリーを鋳型に用いてＰＣＲを行い、ｅｍｐ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片を増幅した。更に、得られたＰＣＲ増幅産物のダイレクトシーケンスによりｅｍｐ遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。
このブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株由来の細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子ｅｍｐのＤＮＡ配列を配列番号３（図９〜１１の上段）に示す。また、そのＤＮＡ配列に対応する細胞外主要タンパク質分解酵素ＥＭＰのアミノ酸配列を配列番号４（図９〜１１の下段）に示す。
（８−４）ＥＭＰの性状
細胞外主要タンパク質分解酵素ＥＭＰは、プレプロ構造として７５４アミノ酸残基からなる分子量約８４ｋＤａの酸性タンパク質であり、細胞外に分泌される際にＮ末端１２４アミノ酸残基が切断され、６３０アミノ酸残基からなる分子量約７１ｋＤａの構造体へと成熟すると推定した。成熟体のＮ末端から２０７番目にはＺｉｎｃメタロタンパク質分解酵素の亜鉛イオンの配位に関与するとされるＨＥＸＸＨ配列が存在することから、ＥＭＰはＺｉｎｃメタロタンパク質分解酵素であると推定した。
ＥＭＰはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのメタロタンパク質分解酵素とアミノ酸レベルで３７％の相同性を有していた。
［実施例９］
（ｉｍｐ遺伝子とｅｍｐ遺伝子が不活化されたブレビバチルス・チョウシネンシス菌株の作製）
次いで、実施例７で得たブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ２を親株にｅｍｐ遺伝子の不活化を行い、２種のタンパク質分解酵素ｉｍｐとｅｍｐ遺伝子が不活化されたブレビバチルス・チョウシネンシス菌株を作製した。ｅｍｐ遺伝子が不活化されたブレビバチルス・チョウシネンシス菌株の作製は、相同組み換えによる遺伝子の不活化法に準じて行った。
まず、ｅｍｐ遺伝子不活化用ベクターの構築を行った。上記の実施例８−３に記載のｅｍｐ Ｐ４プライマー（配列番号２４）とアダプタープライマー（配列番号２５）をプライマーに、そして、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１のアダプターゲノムＤＮＡライブラリーを鋳型に用いてＰＣＲを行い、ｅｍｐ遺伝子を部分的に含む約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
次いで、このＰＣＲにより増幅された約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩ制限酵素切断部位に挿入した。次いで、挿入したＤＮＡ断片の近傍にあるＢａｍＨＩ認識配列に同制限酵素により切り出されたエリスロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入した。更に、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩでｅｍｐ遺伝子内部の２２０ｂｐを除去後、このプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ制限酵素切断部位にネオマイシン耐性遺伝子を含みＦＲＴ配列を両側に持つＤＮＡ断片を挿入することによりｅｍｐ遺伝子不活化用ベクターを構築した。このｅｍｐ遺伝子不活化用ベクターをｐＢｌｕｅ−ｅｍｐ：：Ｎｍ^ｒとした。
次いで、このｅｍｐ遺伝子不活化用ベクターｐＢｌｕｅ−ｅｍｐ：：Ｎｍ^ｒを用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ２のｅｍｐ遺伝子の不活化を行った。ｐＢｌｕｅ−ｅｍｐ：：Ｎｍ^ｒを用いたｅｍｐ遺伝子の不活化、及び、ｅｍｐ遺伝子不活化株ゲノム上のネオマイシン耐性遺伝子の除去は、上記実施例７に記載のｉｍｐ遺伝子不活化株の構築と同様の手順により行った。
上記により得たｉｍｐ遺伝子及びｅｍｐ遺伝子が不活化されたブレビバチルス・チョウシネンシス菌株をブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１−ＳＰ３）と命名し、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４７９として国際寄託した。
（ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３が胞子形成能を有しないことの確認）
［実施例１０］
（耐熱性試験）
以上により得たブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３が胞子形成能を有していないことを確認するため、実施例２と同様の方法により菌体の耐熱性試験を行った。試験の対照にはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を用いた。その結果を表４に示す。

ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１は、８０℃、１０分間の加温により全菌数の約３／４が死滅するのに対し、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３は同条件によって完全に死滅する。つまり耐熱性胞子を形成しないことが示された。
［実施例１１］
（Ｄ値の測定）
更に、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の胞子形成能を解析するため実施例３と同様の方法により菌体のＤ値の測定を行った。試験の対照にはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を用いた。その結果を表５に示す。

表５に示すとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１については、各温度域での菌体のＤ値を求めることができた。しかしながら、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３については、各温度域での試験開始後、１分間以内にすべての菌体が死滅したため、いずれの温度域でも菌体のＤ値を求めることができなかった。この結果は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３が胞子体を形成しなかったためであると考えられる。
以上の８０℃、１０分間の恒温試験及びＤ値の測定試験の結果により、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３は、胞子形成能を有しないことが示された。
（ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞外のタンパク質分解酵素活性の評価）
更に、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞外のタンパク質分解活性の評価を行った。
まず、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）（バチルス・ブレビスＨ１０２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ Ｈ１０２）（特開昭６３−５６２７７））では分解が観察されないミルクカゼイン及びＢＳＡに対して、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３が分解性を示さないことを確認した。
［実施例１２］
（ミルクカゼインの分解試験によるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞外のタンパク質分解酵素活性の評価）
５％、２％、１％のスキムミルクを含むＴＭ寒天平板培地のそれぞれにブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を植菌した後、３７℃で３日間培養を行い、ミルクカゼインの分解によるコロニーの周囲のハロー形成の有無を観察した。その結果、５％、２％、１％のスキムミルクを含む、それぞれのＴＭ寒天培地のすべてにおいてハローは全く形成されなかった。
この結果により、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３は、ミルクカゼインの分解性を有しないことが確認された。
［実施例１３］
（ＢＳＡの分解試験によるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞外のタンパク質分解酵素活性の評価）
無菌濾過したＢＳＡ（ＳｉｇｍａＡ４５０３）溶液を終濃度３．２ｍｇ／ｍｌになるように添加したＴＭ液体培地１０ｍｌにブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を接種し、３７℃、２００ｒｐｍで振とう培養した。
培養濾液を、培養開始後２４時間、４８時間、７２時間の各々の時点で採取し、採取した各々の培養濾液に対して１００００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。次いで、遠心分離により得られた培養上清画分６２５μｌに０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ６．８）１２５μｌ、１０％ ＳＤＳ ２００μｌ、β−メルカプトエタノール ５０μｌを添加し、撹拌後沸騰水中で３分間熱処理を行った。更に熱処理後、０．０５％ＢＰＢと７０％グリセロールを含む０．０６２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ６．８）０．１ｍｌを加えＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１０％のアクリルアミド濃度で行なった。タンパク質の検出は、ＣＢＢ（クーマシブリリアントブルー）による染色により行った。その結果、培養開始後２４時間、４８時間、７２時間の全てにおいてＢＳＡの分解によるバンドは観察されなかった。
この結果により、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３はＢＳＡの分解性を有しないことが確認された。
更に、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞外のタンパク質分解酵素活性をゼラチン−ＰＡＧＥ法及びアゾカゼイン、アゾコールを用いた方法により測定した。対照にはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）を用いた。
［実施例１４］
（ゼラチン−ＰＡＧＥによるＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞外のタンパク質分解酵素活性の評価）
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３のそれぞれをＴＭ液体培地で４８時間培養した後、培養上清画分１０μｌをゼラチン−ＰＡＧＥに供した。ゼラチン−ＰＡＧＥは、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０２，１９６−２０２（１９８０）の方法に従い行った。電気泳動後のゲルを１０ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）緩衝液中に、３７℃の恒温に１６時間置くことによりゲル内のゼラチンを分解させた。恒温に置いた後、０．１％アミドブラックと３０％メタノールと１０％酢酸からなる染色液で３０分間染色し、アミドブラックを含まない同液で脱色した。その結果を図２に示す。
図２に示されているとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１の培養上清画分では、約４０ｋＤａの移動度にタンパク質分解活性によりゼラチンが分解されたことを示すクリアバンドが確認されたが、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の培養上清画分においては、ゼラチンの分解を示すクリアバンドは全く認められなかった。
［実施例１５］
（アゾカゼインを使用したＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞外のタンパク質分解酵素活性の測定）
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３をＴ２培地（ペプトン１％、肉エキス０．５％、酵母エキス０．２％、グルコース１％）で、３０℃、６日間振盪培養した。培養液を１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、得られた上清を活性測定用の試料とした。５ｇのアゾカゼインを０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１Ｌに溶かし、基質溶夜とした。次いで、０．１ｍｌの上記基質溶液にこれと等量の試料を加え、３７℃で５時間反応させた後、０．２ｍｌの１０％トリクロロ酢酸溶液を加えて反応を止めた。次いで、室温で２０分間静置した後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清画分をとり、０．４ｍｌの０．５Ｎ ＮａＯＨを加え、４４０ｎｍの吸光度を測定した。以上の実験の結果を表６に示す。なお、表６では５時間の反応で吸光度を１０変化させる酵素活性を１ｕｎｉｔとした。

上記の表６に示されているとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３では、アゾカゼイン試薬を用いた活性測定でもタンパク質分解酵素活性を検出できなかった。ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の培養上清画分のタンパク質分解酵素活性はブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１に比べて１／１２０以下であった。
［実施例１６］
（アゾコールを使用したＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞外のタンパク質分解酵素活性の測定）
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３のそれぞれをＴＭ液体培地で４８時間培養し、培養終了後、培養液を遠心、分画して得たそれぞれの培養上清画分をＣｅｎｔｒｉｃ ｏｎ ｐｌｕｓ−２０（Ｂｉｏｍａｘ−５）により１０倍に濃縮した。次いで、濃縮上清液３００μｌと等量の１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＣａＣｌ_２、１％アゾコール溶液を混合し、３７℃の恒温で３時間、撹拌した。反応終了後、反応液を直ちに遠心分離し、培養上清液の５２０ｎｍの吸光度を測定することにより、酵素活性を測定した。その結果を表７に示す。なお、３７℃、１時間の反応で５２０ｎｍの吸光度を０．０１上昇させる酵素量を１ｕｎｉｔとした。

上記の表７に示されているとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３では、アゾコール試薬を用いた活性測定でもタンパク質分解酵素活性を検出できなかった。ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の培養上清画分のタンパク質分解酵素活性はブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１に比べて１／３３０以下であった。
以上の実施例１４から実施例１６により、本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞外のタンパク質分解酵素活性が、公知の菌株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１より格段に低減していることが示された。
（ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞内タンパク質分解酵素活性の評価）
次いで、本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞内のタンパク質分解酵素活性をゼラチン−ＰＡＧＥ法及びアゾカゼインを用いた方法により評価を行った。なお、対照にはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を用いた。
［実施例１７］
（未変性条件下でのゼラチン−ＰＡＧＥによるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞内タンパク質分解酵素活性の評価）
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３のそれぞれをＴＭ液体培地で、３０℃で４８時間培養した。培養終了後、遠心分離により培養液から菌体を回収した後、超音波により菌体を破砕し、更に、遠心分離を行うことで細胞内画分を得た。そして、この細胞内画分を未変性条件下で電気泳動に供した。未変性条件下の電気泳動は、細胞内画分１０μｌに終濃度５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、１０％グリセロールを加え、０．１％のゼラチンを含む１０％アクリルアミドゲルに供し、ＳＤＳを含まないトリスーグリシン緩衝液で４℃、１０ｍＡの定電流で１０時間泳動することにより行った。
電気泳動終了後、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＣａＣｌ_２緩衝液中でアクリルアミドゲルを３７℃の恒温に２４時間置いた後、０．１％アミドブラックと３０％メタノールと１０％酢酸からなる染色液で３０分間染色し、アミドブラックを含まない同液で脱色した。その結果を図３に示す。
図３に示されているとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１の細胞内画分では、タンパク質分解活性によりゼラチンが分解されたことを示すクリアバンドが確認されたが、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞内画分においては、ゼラチンの分解を示すクリアバンドは全く認められなかった。
［実施例１８］
（アゾカゼインを使用したブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞内のタンパク質分解酵素活性の測定）
実施例１７と同様の方法で得たブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３、それぞれの細胞内画分２００μｌと酵素反応液（１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５），０．２％アゾカゼイン，１０ｍＭ ＣａＣｌ_２）４００μｌを混和し、３７℃の恒温に１．５時間置いた後、終濃度２．５％のＴＣＡを添加することにより反応を停止させた。次いで、反応液を遠心分離後、上清液の４４０ｎｍの吸光度を測定した。反応に用いた粗酵素液の総タンパク質量は、ＢＳＡを標準とするＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。以上の結果を表８に示す。なお、３７℃、１時間の反応において４４０ｎｍの吸光度を０．０１上昇させる酵素量を１ｕｎｉｔとした。

上記の表８が示すとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３では、細胞内のタンパク質分解酵素活性が、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１に比べ約１／８に低下していた。
以上の実施例１７及び実施例１８により、本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３の細胞内のタンパク質分解酵素活性は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１より格段に低減していることが示された。（ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３による組換えタンパク質の分泌生産）
更に、本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いた組換えタンパク質の生産性及び分解性の評価試験を、まず、組換えタンパク質が分泌生産される場合について行った。
この組換えタンパク質が分泌生産される場合の生産性及び分解性の評価試験は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主として分泌生産を行った場合には、その一部が分解されていたタンパク質の生産を行うことにより行った。
ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主として分泌生産を行った場合にその一部分が分解されていたタンパク質としては、ブタ由来ＩＬ−１β成熟体（ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｘ７４５６８）、大腸菌Ｋ１２株由来マルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）成熟体（ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＢ５９０５６）、ウシ由来マクロファージコロニー刺激因子成熟体（ＧｅｎＢＡＮＫ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＭ＿１７４０２６．１）、豚丹毒抗原タンパク質の一部分で豚丹毒抗原性を有するＥＮ２（特開２０００−２７９１７９）、及び、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株由来のインチミン（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｐ４３２６１）の一部分でインチミン抗原性を有するポリペプチド（Ｉｎｔｉｍｉｎ（３３９−５７５））を用いた。なお対照にはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を用いた。
［実施例１９］
（ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３によるブタＩＬ−１βタンパク質の分泌生産）
ブタ由来ＩＬ−１β成熟体（ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｘ７４５６８）（以下ブタＩＬ−１β）のＮ末端アミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列にＮｃｏＩ認識配列とシグナルペプチドの一部をコードする配列を付加したセンスプライマー（配列番号２６：図２６）とＣ末端アミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加したアンチセンスプライマー（配列番号２７：図２７）を用いてブタ由来ＩＬ−１βｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。更に、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐＮＹ３０１ベクターのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位に挿入することによりブタＩＬ−１β分泌生産用ベクターを構築した。このブタＩＬ−１β分泌生産用ベクターをｐＮＹ３０１−ｐＩＬ−１βとした。
次いで、このｐＮＹ３０１−ｐＩＬ−１βをエレクトロポレーション法によりブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３のそれぞれに導入することにより形質転換体を構築した。次いで、これらの形質転換体を、それぞれＴＭ液体培地で３０℃、９０時間培養した。培養終了後、培養液を遠心、分画して得たそれぞれの培養上清画分を１０−２５％濃度勾配のアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動終了後、セミドライ式タンパク質転写装置によってタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。次いで、定法に従い、転写膜を抗ｐｉｇ ＩＬ−１β抗体を用いたウエスタンブロット解析に供しブタＩＬ−１βの検出を行った。
その結果、図５に示されているとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合には、ブタＩＬ−１βの分解を示す顕著なバンドが確認されたが、本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いた場合には、ブタＩＬ−１βの分解を示すバンドは認められなかった。
また、電気泳動後のゲルに対してＣＢＢ染色を行い、タンパク質バンドの検出を行った後、ブタＩＬ−１βに相当するバンドのデンシトメトリーを測定することにより、培養液中に蓄積されたブタＩＬ−１βの定量を行った。この測定の結果を図４及び表９に示す。

表９に示されているとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いて生産された培養液中のブタＩＬ−１βの蓄積量は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５を宿主に用いた場合に比べ約２．５倍以上に増加していた。
［実施例２０］
（ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３による大腸菌ＭＢＰの分泌生産）
大腸菌Ｋ１２株由来マルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ））成熟体（ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＢ５９０５６）（以下大腸菌ＭＢＰ）のＮ末端アミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列にＰｓｔＩ認識配列を付加したセンスプライマー（配列番号２８：図２８）とＣ末端アミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加したアンチセンスプライマー（配列番号２９：図２９）を用いて大腸菌Ｋ１２株ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。更に、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐＮＹ３０１ベクターのＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位に挿入することにより大腸菌ＭＢＰ分泌生産用ベクターを構築した。この大腸菌ＭＢＰ分泌生産用ベクターをｐＮＹ３０１−ＭＢＰとした。
次いで、このｐＮＹ３０１−ＭＢＰをエレクトロポレーション法により、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３のそれぞれに導入することにより形質転換体を構築した。次いで、これらの形質転換体を、それぞれＴＭ液体培地で３０℃、７２時間培養した。培養終了後、培養液を遠心、分画して得た培養上清画分を実施例１９と同様の手順によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析に供した。その結果、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合には、大腸菌ＭＢＰの分解を示す顕著なバンドが確認されたが、本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いた場合には、大腸菌ＭＢＰの分解を示すバンドは認められなかった。
また、電気泳動後のゲルに対してＣＢＢ染色を行い、タンパク質バンドの検出を行った後、大腸菌ＭＢＰに相当するバンドのデンシトメトリーを測定することにより、培養液中に蓄積された大腸菌ＭＢＰの定量を行った。この測定の結果を表１０に示す。

表１０に示されているとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いて生産された培養液中の大腸菌ＭＢＰの蓄積量は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合に比べ約２倍に増加していた。
［実施例２１］
（ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３によるウシＭ−ＣＳＦの分泌生産）
ウシ由来マクロファージコロニー刺激因子成熟体（ＧｅｎＢＡＮＫ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＭ＿１７４０２６．１）（以下ウシＭ−ＣＳＦ）のＮ末端アミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列にＢａｍＨＩ認識配列を付加したセンスプライマー（配列番号３０：図３０）とＣ末端アミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加したアンチセンスプライマー（配列番号３１：図３１）を用いてウシＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。更に、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐＮＹ３０１ベクターのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位に挿入することによりウシＭ−ＣＳＦ分泌生産用ベクター構築をした。このウシＭ−ＣＳＦ分泌生産用ベクターをｐＮＹ３０１−Ｍ−ＣＳＦとした。
次いで、このｐＮＹ３０１−Ｍ−ＣＳＦをエレクトロポレーション法によりブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３のそれぞれに導入することにより形質転換体を構築した。次いで、これらの形質転換体を、それぞれＴＭ液体培地で３０℃、７２時間培養した。培養終了後、培養液を遠心、分画して得た培養上清画分を実施例１９と同様の手順によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析に供した。その結果、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合には、ウシＭ−ＣＳＦの分解を示すバンドが確認されたが、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いた場合には、ウシＭ−ＣＳＦの分解を示すバンドは認められなかった。
また、電気泳動後のゲルに対してＣＢＢ染色を行い、タンパク質バンドの検出を行った後、ウシＭ−ＣＳＦに相当するバンドのデンシトメトリーを測定することにより、培養液中に蓄積されたタンパク質の定量を行った。この測定の結果を表１１に示す。

表１１に示されているとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いて生産された培養液中のウシＭ−ＣＳＦの蓄積量は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合に比べ約３倍に増加していた。
［実施例２２］
（ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３によるＥＮ２の分泌生産）
豚外毒抗原タンパク質の一部分であるＥＮ２を発現するプラスミドベクターｐＮＨ３００ ｅｎ２（特開２０００−２７９１７９）をエレクトロポレーション法に上り、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３のそれぞれに導入することにより形質転換体を溝築し、更に、これらの形質転換体を、それぞれＴＭ液体培地で３０℃、９０時間培養した。
培養終了後、培養液を遠心、分画して得た培養上清画分を実施例１９と同様の手順によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析に供した。その結果、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合には、ＥＮ２の分解を示す顕著なバンドが確認されたが、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いた場合には、ＥＮ２の分解を示すバンドは認められなかった。
また、電気泳動後のゲルに対してＣＢＢ染色を行い、タンパク質バンドの検出を行った後、ＥＮ２に相当するバンドのデンシトメトリーを測定することにより、培養液中に蓄積されたタンパク質の定量を行った。この測定の結果を表１２に示す。

表１２に示されているとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いて生産された培養液中のＥＮ２の蓄積量は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合に比べ約２倍に増加していた。
［実施例２３］
（ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３によるＩｎｔｉｍｉｎ（３３９−５７５）の生産）
成熟型インチミンの３３９番目のアミノ酸配列に相当するＤＮＡ配列にＢａｍＨＩの認識配列を付加したセンスプライマー（配列番号３２：図３２）と５７５番目近傍のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列にＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を付加したアンチセンスプライマー（配列番号３３：図３３）を用いてインチミン遺伝子を鋳型にＰＣＲを行った。更に、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで処理した後、ｐＮＹ３０１のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位に挿入することにより大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株由来のインチミン（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｐ４３２６１）のアミノ酸配列の３３９番目から５７５番目に相当する部分のポリペプチド（以下Ｉｎｔｉｍｉｎ（３３９−５７５））を発現するプラスミドベクターを構築した。このＩｎｔｉｍｉｎ（３３９−５７５）分泌生産用ベクターをｐＮＹ３０１−Ｉｎｔｉｍｉｎとした。
次いで、このｐＮＹ３０１−Ｉｎｔｉｍｉｎをエレクトロポレーション法により、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３のそれぞれに導入することにより形質転換体を構築した。更に、これらの形質転換体を、それぞれＴＭ液体培地で３０℃、９０時間培養した。培養終了後、培養液を遠心、分画して得た培養上清画分を実施例１９と同様の手順によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析に供した。その結果、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合には、Ｉｎｔｉｍｉｎ（３３９−５７５）の分解を示す複数の顕著なバンドが確認されたが、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いた場合には、Ｉｎｔｉｍｉｎ（３３９−５７５）の分解を示す顕著なバンドは認められなかった。
また、電気泳動後のゲルに対してＣＢＢ染色を行い、タンパク質バンドの検出を行った後、Ｉｎｔｉｍｉｎ（３３９−５７５）に相当するバンドのデンシトメトリーを測定することにより、培養液中に蓄積されたＩｎｔｉｍｉｎ（３３９−５７５）の定量を行った。この測定の結果を表１３に示す。

表１３に示されているとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いて生産された培養液中のＩｎｔｉｍｉｎ（３３９−５７５）の蓄積量は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合に比べ約２倍に増加していた。
以上の実施例１９から実施例２３により、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合には、その生産された一部が分解されていた組換えタンパク質の分泌生産をブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いて行った場合、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合より該タンパク質の畜積量が増加することが示された。
これらの結果は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いた場合には、分泌生産されたタンパク質の分解が顕著に抑制されたためと考えられる。
（ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３による組換えタンパク質の細胞内への蓄積生産）
更に、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いた組換えタンパク質の生産性及び分解性の評価試験を、組換えタンパク質が分泌生産される場合ではなく、生産された組換えタンパク質が菌体内に蓄積される場合について行った。この評価試験は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いて菌体内への蓄積生産を行った場合に、その一部が菌体内で分解されていたタンパク質であるブタ由来インターフェロン−γ（ＰＩＲ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｓ１０５１３）及びイヌ由来インターフェロン−β（ＧｅｎＢＡＮＫ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｅ１１２２９）の生産を行うことにより行った。
なお、対照にはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を用いた。
［実施例２４］
（ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３による組換えブタ由来インターフェロン−γの細胞内への蓄積生産）
ブタ由来インターフェロン−γ成熟体（ＰＩＲ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｓ１０５１３）（以下ブタＩＦＮ−γ）のＮ末端アミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列にＮｃｏＩ認識配列とＭｅｔＡｌａをコードする配列からなるｃｃａｔｇｇｃｔ配列を付加したセンスプライマー（配列番号３４：図３４）とＣ末端アミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加したアンチセンスプライマー（配列番号３５：図３５）を用いてブタ由来インターフェロン−γ ｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。更に、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理した後、ｐＮＹ３０１ベクターの翻訳開始メチオニン上に存在するＢｓｐＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位に挿入することによりブタＩＦＮ−γ発現用ベクターを構築した。このブタＩＦＮ−γ発現用ベクターをｐＮＹ３０１−ｐＩＦＮ−γとした。このｐＮＹ３０１−ｐＩＦＮ−γは分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を有していないため生産されたブタＩＦＮ−γは細胞内に蓄積される。
次いで、このｐＮＹ３０１−ｐＩＦＮ−γをエレクトロポレーション法によりブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３のそれぞれに導入することにより形質転換体を構築した。また、対照として用いるためブタＩＦＮ−γ遺伝子が組み込まれていないｐＮＹ３０１を導入したブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１も構築した。
更に、これらの形質転換体及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１／ｐＮＹ３０１を、それぞれＴＭ液体培地で３０℃、７２時間培養した。培養終了後、遠心分離により培養液から菌体を回収した後、超音波により菌体を破砕し、更に、遠心分離を行い細胞内画分を得た。次いで、この細胞内画分を実施例１９と同様の手順によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析に供した。
その結果、図６に示されているように、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合には、ブタＩＦＮ−γの分解を示す顕著なバンドが確認されたが、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いた場合には、ブタＩＦＮ−γの分解を示すバンドは認められなかった。
また、電気泳動後のゲルに対してＣＢＢ染色を行い、タンパク質バンドの検出を行った後、ブタＩＦＮ−γに相当するバンドのデンシトメトリーを測定することにより細胞内に蓄積されたタンパク質の定量を行った。この測定の結果を表１４に示す。

表１４に示されているとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いて生産されたブタＩＦＮ−γの細胞内の蓄積量は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合に比べ約２倍に増加していた。
［実施例２５］
（ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３によるイヌ由来インターフェロン−βの細胞内への蓄積生産）
イヌ由来インターフェロン−β成熟体（ＧｅｎＢＡＮＫａｃｃｅｓｓｉｏｎＥ１１２２９）（以下イヌＩＦＮ−β）のＮ末端アミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列にＢｓｐＨＩ認識配列を付加したセンスプライマー（配列番号３６：図３６）とＣ末端アミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加したアンチセンスプライマー（配列番号３７：図３７）を用いてイヌＩＦＮ−βｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。更に、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理した後、ｐＮＹ３０１ベクターの翻訳開始メチオニン上に存在するＢｓｐＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位に挿入することによりイヌＩＦＮ−β発現用ベクターを構築した。このイヌＩＦＮ−β発現用ベクターをｐＮＹ３０１−ｃＩＦＮ−βとした。このｐＮＹ３０１−ｃＩＦＮ−βは分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を有していないため生産されたイヌＩＦＮ−βは細胞内に蓄積される。
次いで、このｐＮＹ３０１−ｃＩＦＮ−βをエレクトロポレーション法によりブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３のそれぞれに導入することにより形質転換体を構築した。次いで、これらの形質転換体を、それぞれＴＭ液体培地で３０℃、７２時間培養した。培養終了後、遠心分離により培養液から菌体を回収した後、超音波により菌体を破砕し、更に、遠心分離を行うことで細胞内画分を得た。次いで、この細胞内画分を実施例２１と同様の手順によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析に供した。その結果、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合には、イヌＩＦＮ−βの分解を示す顕著なバンドが確認されたが、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いた場合には、イヌＩＦＮ−βの分解を示すバンドは認められなかった。
また、電気泳動後のゲルに対してＣＢＢ染色を行い、タンパク質バンドの検出を行った後、イヌＩＦＮ−βに相当するバンドのデンシトメトリーを測定することにより、細胞内に蓄積されたタンパク質の定量を行った。この測定の結果を表１５に示す。

表１５に示されているとおり、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いて生産されたイヌＩＦＮ−βの細胞内の蓄積量は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合に比べ約１．６倍に増加していた。
上記の実施例２４及び実施例２５により、本発明のブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３を宿主に用いて組換えタンパク質の生産を行った場合、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１を宿主に用いた場合に比べ、該タンパク質の蓄積量が増加することが示された。これらの結果は、細胞内タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐの不活化により細胞内に蓄積された組換えタンパク質が顕著に抑制されたためであると考えられる。
寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４９７
寄託の表示：Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１−ＳＰ３
寄託機関の名称：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
寄託機関のあて名：〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市
東１丁目１番地１ 中央第６
寄託の日付：平成１５年（２００３）９月１１日
寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６３
寄託の表示：Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）
寄託機関の名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
寄託機関のあて名：〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市
東１丁目１番３号
寄託の日付：平成１１年（１９９９）８月３１日
寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３
寄託の表示：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１−Ｓ５
寄託機関の名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
寄託機関のあて名：〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市
東１丁目１番３号
寄託の日付：平成１１年（１９９９）１月１９日

Claims (16)

1. 胞子を形成しないブレビバチルス・チョウシネンシス。
2. 下記の菌学的性質を有し、胞子を形成しないブレビバチルス・チョウシネンシス。
   （ａ）形態
   細胞の大きさ
   液体培地：０．４〜０．６×１．５〜４μｍ
   細胞の形 桿菌
   胞子の有無 無
   （ｂ）生理学的性質
   硝酸塩の還元 −
   ＶＰテスト −
   クエン酸の利用 ＋
   ウレアーゼ −
   オキシダーゼ ＋
   カタラーゼ ＋
   （ｃ）他の性質
   温度抵抗性 ６０℃で死滅する。
3. 胞子形成関連遺伝子ｈｏｓが不活性化されたこと、を特徴とする胞子を形成しないブレビバチルス・チョウシネンシス。
4. 胞子形成関連遺伝子ｈｏｓの塩基配列が配列番号１に示す配列であること、を特徴とする請求項３に記載のブレビバチルス・チョウシネンシス。
5. 胞子を形成せず、且つ、細胞外及び／又は細胞内のタンパク質分解酵素活性が低減ないし消失したブレビバチルス・チョウシネンシス。
6. 下記の菌学的性質を有し、胞子を形成しないブレビバチルス・チョウシネンンシス。
   （ａ）形態
   細胞の大きさ
   液体培地：０．４〜０．６×１．５〜４μｍ
   細胞の形 桿菌
   胞子の有無 無
   （ｂ）生理学的性質
   硝酸塩の還元 −
   ＶＰテスト −
   クエン酸の利用 ＋
   ウレアーゼ −
   オキシダーゼ ＋
   カタラーゼ ＋
   （ｃ）他の性質
   温度抵抗性 ６０℃で死滅する。
   細胞外のタンパク質分解酵素活性 低いないしなし
   細胞内のタンパク質分解酵素活性 低いないしなし
7. 細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子ｅｍｐが不活性化されたこと、を特徴とするブレビバチルス・チョウシネンシス。
8. 細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子ｅｍｐの塩基配列が配列番号３に示す配列であること、を特徴とする請求項７に記載のブレビバチルス・チョウシネンシス。
9. 細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐが不活性化されたこと、を特徴とするブレビバチルス・チョウシネンシス。
10. 細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐの塩基配列が配列番号５に示す配列であること、を特徴とする請求項９に記載のブレビバチルス・チョウシネンシス。
11. 細胞外主要タンパク質分解酵素遺伝子ｅｍｐ及び細胞内主要タンパク質分解酵素遺伝子ｉｍｐが不活性化されたこと、を特徴とするブレビバチルス・チョウシネンシス。
12. 胞子を形成しないこと、を特徴とする請求項１１に記載のブレビバチルス・チョウシネンシス。
13. ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３（ＦＥＲＭＢＰ−０８４７９）。
14. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のブレビバチルス・チョウシネンシスを、タンパク質をコードする遺伝子を組込んだ発現ベクターにより形質転換してなるブレビバチルス・チョウシネンシス。
15. 請求項１４に記載のブレビバチルス・チョウシネンシス形質転換体を培養する工程を含むこと、を特徴とするタンパク質の製造方法。
16. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のブレビバチルス・チョウシネンシスを組換えタンパク質生産の宿主として使用すること、を特徴とする組換えタンパク質を製造する方法。

Images