CN106459953A - 使用重组短芽孢杆菌属细菌的重组蛋白质制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种重组蛋白质的制造方法，该方法能够使以在菌体内稳定地保持有质粒的状态进行培养时的菌体的增殖速度增加，使重组蛋白质的生产量得到提高。本发明提供的重组蛋白质的制造方法包括：在32℃以上对具有编码重组蛋白质的基因的短芽孢杆菌属细菌进行培养的高温培养工序、以及在上述高温培养工序之后在低于32℃下对上述短芽孢杆菌属细菌进行培养的低温培养工序。

Description

使用重组短芽孢杆菌属细菌的重组蛋白质制造方法
技术领域
本发明涉及使用重组微生物的重组蛋白质制造方法。
背景技术
使用重组微生物的重组蛋白质生产工艺可以用于各种异源蛋白质的制造(非专利文献1)。为了提高重组蛋白质的生产率，对各种培养条件进行了研究，为了提高每单位时间的生产率，增加菌体增殖速度是有效的方法。已知通常只要在能够繁殖微生物的范围内，则培养温度越高，菌体的增殖速度越大。但是对于重组微生物而言，如果培养温度较高，则用于表达异源蛋白质而导入的质粒难以稳定地保持在菌体内，容易从菌体脱落，即使菌体快速增殖，重组蛋白质的生产量也会降低。另一方面，如果培养温度低，则可以稳定地保持质粒，但该情况下菌体增殖速度降低，生产率下降。
然而，在使用基因重组技术生产的蛋白质医药品当中，对抗体医药品的需求在迅速扩大。
抗体医药品的制造中通常使用具有抗体结合能力的亲和层析法，最常使用利用了抗体纯化用载体的层析法，所述抗体纯化用载体是将蛋白A、蛋白G及蛋白L等蛋白质固定于适当的树脂而得到的。作为具有抗体结合能力的配体，特别多使用蛋白A。
作为医药品制造用物资，对以蛋白质作为配体的亲和载体要求较高的品质。对由蛋白质制成的配体自身也要求与蛋白质医药品相同水平的品质，生产成本高，因此处于无法廉价地提供亲和载体的情况。在抗体医药品的制造成本中，亲和载体的生产成本所占的比例较大，成为对降低抗体医药品制造成本的较大限制。因此，希望以高品质廉价地供应由蛋白质制成的配体的方法。
本发明人等到目前为止发现了如下方法：为了稳定且大量地生产蛋白A的部分序列，发现使用短芽孢杆菌属细菌可在宿主中高效大量地分泌蛋白A的部分序列，使其稳定地积蓄在培养液中，能够容易地以高纯度分离回收(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第06/004067号
非专利文献
非专利文献1：Kay Terpe.Appl Microbaiol Biotechnol 72：211-222(2006)
发明内容
发明所要解决的课题
本发明提供一种重组蛋白质的制造方法，该方法在使用短芽孢杆菌属细菌制造重组蛋白质时，能够使在菌体内稳定地保持有质粒的状态下培养时的菌体增殖速度加快，可以使重组蛋白质的生产量得到提高。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果令人惊讶地发现，通过组合在培养前半阶段以高温进行培养的高温培养工序和在培养后半阶段以更低温度进行培养的低温培养工序，能够以使质粒稳定地保持于菌体内的状态使短芽孢杆菌属细菌的菌体增殖速度加快，使重组蛋白质的生产量提高，从而完成了本发明。
即，本发明涉及重组蛋白质的制造方法，该方法包括：在32℃以上对具有编码重组蛋白质的基因的短芽孢杆菌属细菌进行培养的高温培养工序、以及在所述高温培养工序之后在低于32℃下对所述短芽孢杆菌属细菌进行培养的低温培养工序。
从高温培养工序向低温培养工序的转换优选在短芽孢杆菌属细菌繁殖过程中的对数生长期初期至中期之间进行。
重组蛋白质优选为抗体结合性蛋白质。
抗体结合性蛋白质优选为蛋白A的E结构域、D结构域、A结构域、B结构域或C结构域、蛋白G的C结构域或D结构域、蛋白L的B结构域、或者它们的连接体或功能突变体。
重组蛋白质优选为生理活性蛋白质。
生理活性蛋白质优选为肽类激素或其前体。
重组蛋白质优选为抗体或抗体样分子。
发明的效果
根据本发明，在使用短芽孢杆菌属细菌的重组蛋白质制造中，能够以将质粒稳定地保持于菌体内的状态使菌体的增殖速度加快，可以抑制成本且使重组蛋白质的生产量提高。本发明的方法能够扩大至工业规模。
附图说明
图1是表达质粒Spa’-pNK3260的示意图。
图2是编码Spa’-pNK3260所包含的启动子、夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)(SD)序列、信号肽及蛋白A(SPA’)的DNA碱基序列。
具体实施方式
本发明涉及重组蛋白质的制造方法，该方法包括：在32℃以上对具有编码重组蛋白质的基因的短芽孢杆菌属细菌进行培养的高温培养工序、以及在所述高温培养工序之后在低于32℃下对所述短芽孢杆菌属细菌进行培养的低温培养工序。
作为重组蛋白质，可以列举例如：抗体结合性蛋白质、抗体、抗体样分子、酶、其它有用生理活性蛋白质。
抗体结合性蛋白质是能够与抗体的抗原识别部位以外的部分(例如，Fc部分)结合的蛋白质。只要是能够与抗体的抗原识别部位以外的部分结合的蛋白质即可，对其结构没有特别限定。作为这样的蛋白质，可以列举例如：蛋白A的E结构域、D结构域、A结构域、B结构域或C结构域、蛋白G的C结构域或D结构域、蛋白L的B结构域、或者它们的连接体或功能突变体。
蛋白A是由革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生产的细胞壁蛋白质中的1种，是具有约42,000分子量的蛋白质。其结构由7个功能结构域(从氨基末端起：信号序列S、免疫球蛋白结合结构域E、免疫球蛋白结合结构域D、免疫球蛋白结合结构域A、免疫球蛋白结合结构域B、免疫球蛋白结合结构域C、金黄色葡萄球菌细菌细胞壁结合结构域X)构成(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1983,80：697-701、Gene,1987,58：283-295、J.Bio.Chem.,1984,259：1695-1702)。
已知对蛋白A的免疫球蛋白结合结构域的相对亲和性取决于pH、金黄色葡萄球菌菌株种类(Infec.Immun.,1987,55：843-847)、免疫球蛋白的类型(IgG、IgM、IgA、IgD、IgE)及亚型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)等多种因素，在免疫球蛋白的类型中，特别显示出与人IgG1、人IgG2、人IgG4及小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3的Fc部分的强结合性。
作为蛋白A的E结构域、D结构域、A结构域、B结构域、C结构域，可以列举分别具有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5所示的氨基酸序列的蛋白质。
蛋白G是由C群和G群链球菌属(Streptococcus)细菌生产的细胞壁蛋白质中的1种，是具有约59,000分子量的蛋白质。其结构由5个功能结构域(从氨基末端起：信号序列SS、由序列A和B的重复而形成的白蛋白结合结构域、由序列C和D的重复而形成的免疫球蛋白结合结构域、跨细胞壁结构域W、跨细胞膜结构域M)构成。
与蛋白A的免疫球蛋白结合结构域相比，蛋白G的免疫球蛋白结合结构域显示出广泛地与哺乳动物IgG的Fc部分结合性(J.Immunol.,1984,133：969-974、J.Biol.Chem.,1991,266：399-405)。
作为蛋白G的C结构域或D结构域，可以列举分别具有序列号6、序列号7、序列号8所示的氨基酸序列的蛋白质。
蛋白L是由大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)生产的蛋白质中的1种，是具有约79,000分子量的蛋白质。其结构由6个功能结构域(从氨基末端起：信号序列SS、氨基末端结构域A、5次重复免疫球蛋白结合结构域B、2次重复功能不明确的结构域C、跨细胞壁结构域W、跨细胞膜结构域M)构成。
该蛋白L的免疫球蛋白结合结构域显示与免疫球蛋白的κ轻链结合性。(J.Biol.Chem.,1989,264：19740-19746、J.Biol.Chem.,1992,267：12820-12825)。
作为蛋白L的B结构域，可以列举分别具有序列号9、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14、序列号15、序列号16、序列号17所示的氨基酸序列的蛋白质。
抗体结合性蛋白质的功能突变体是抗体结合性蛋白质的突变体中具有与抗体结合的活性的蛋白质。抗体结合性蛋白质的功能突变体与序列号5所示的蛋白A的C结构域的序列同源性(同一性)优选为60％以上，更优选为65％以上，进一步优选为70％以上，更进一步优选为75％以上，更进一步优选为80％以上，更进一步优选为85％以上，特别进一步优选为90％以上，最优选为95％以上。
抗体结合性蛋白质的连接体是将抗体结合性蛋白质串联连接而得到的蛋白质。可以将不同的抗体结合性蛋白质进行连接，也可以将相同的抗体结合性蛋白质进行连接。作为连接的抗体结合性蛋白质的数量，可以列举例如：2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个。作为连接体，可以举出包含5个蛋白A的C结构域的功能突变体且具有序列号18所示的氨基酸序列的蛋白质。
作为抗体或抗体样分子，可以列举：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等全长抗体、以及由这些抗原结合部位形成的部分片段化抗体等。
作为酶，可以列举例如：淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、胆固醇氧化酶、醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、转氨酶、酯酶、酰基转移酶、酰胺酶、乙内酰脲酶、乙内酰脲消旋酶、去氨甲酰酶(decarbamylase)、腈水解酶、腈水合酶、N-酰基氨基酸消旋酶、D-琥珀酰酶(succinylase)、L-琥珀酰酶、氨甲酰氨基酸消旋酶、氨基酸酰胺消旋酶、氨肽酶、加氧酶等。
其它有用生理活性蛋白质是指能够用作医药活性成分的蛋白质，可以列举例如：胰岛素、干扰素、白细胞介素、红细胞生成素、生长激素、肽类激素、细胞因子、生长因子、造血因子(hematopoietic factor)及它们的前体、以及它们的受体蛋白质等。
编码重组蛋白质的基因只要具有编码重组蛋白质的碱基序列即可，没有特别限定。含有上述基因的DNA可以通过通常使用的公知方法、例如聚合酶链式反应(以下简称为PCR)法获得。另外，也可以用公知的化学合成法来合成(Nucleic acids Res.1984.12：4359)，还可以从DNA文库获得。在该DNA中，密码子可以由简并密码子取代。
为了使重组蛋白质在短芽孢杆菌属细菌中表达，可以使用表达载体。表达载体包含编码重组蛋白质的基因。作为使该基因表达的启动子，可以使用能在短芽孢杆菌属细菌中发挥功能的启动子。
该启动子只要在短芽孢杆菌属细菌内能够发挥功能即可，没有任何限制，优选源自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、棒杆菌属(Corynebacterium)物种等细菌、且在短芽孢杆菌属细菌内能够发挥作用的启动子。更优选编码短芽孢杆菌属细菌细胞壁蛋白质中间壁蛋白质(middlewall protein)(MWP)、短芽孢杆菌属细菌细胞壁蛋白质外壁蛋白质(outer wall protein)(OWP)或铫子短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)HPD31细胞壁蛋白质HWP(Ebisu.S等.J.Bacteriol.1990.172：1312-1320)的基因的启动子。作为具体例子，可以列举：短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)细胞壁蛋白质MWP的P5启动子区域、短短芽孢杆菌细胞壁蛋白质MWP的P2启动子区域。
表达载体优选在上述启动子的下游还含有能够在短芽孢杆菌属细菌中发挥功能的夏因-达尔加诺序列及信号序列。夏因-达尔加诺序列优选为源自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、棒杆菌属(Corynebacterium)物种等细菌、且能够在短芽孢杆菌属细菌内发挥作用的夏因-达尔加诺序列，更优选为存在于编码短芽孢杆菌属细菌细胞壁蛋白质中间壁蛋白质(MWP)、短芽孢杆菌属细菌细胞壁蛋白质外壁蛋白质(OWP)或铫子短芽孢杆菌HPD31细胞壁蛋白质HWP的基因的上游的夏因-达尔加诺序列。表达载体可以根据希望含有标记物序列。
表达载体还可以在夏因-达尔加诺序列的下游包含编码分泌信号肽的DNA序列。编码分泌信号肽的DNA序列在短短芽孢杆菌内进行翻译时只要编码相同的氨基酸即可，不必与原本的DNA序列相同。作为分泌信号肽，优选例如源自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、棒杆菌属(Corynebacterium)物种等细菌、且在短芽孢杆菌属细菌内能够发挥作用的分泌信号肽，更优选短芽孢杆菌属细菌细胞壁蛋白质中间壁蛋白质(MWP)、短芽孢杆菌属细菌细胞壁蛋白质外壁蛋白质(OWP)或铫子短芽孢杆菌HPD31细胞壁蛋白质HWP的分泌信号肽。另外，还可以使用将现有的分泌信号肽的氨基酸序列进行改进而得到的分泌信号肽。
作为分泌信号肽的具体例子，也可以使用中间壁蛋白质(MWP)的分泌信号肽、如Met-Lys-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Asn-Asn-Ser-Val-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu-Thr-Val-Ala-Pro-Met-Ala-Phe-Ala(序列号20)的下划线部分一样使Met-Lys-Lys-Val-Val-Asn-Ser-Val-Leu-Ala-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu-Thr-Val-Ala-Pro-Met-Ala-Phe-Ala(序列号19)添加或缺失碱性、疏水性氨基酸残基等而得到的分泌信号肽。而且也可以使用一直以来在短芽孢杆菌属的分泌蛋白质中使用的分泌信号肽。
另外，还可以使用该蛋白A原本具有的信号肽，即Met-Lys-Lys-Lys-Asn-Ile-Tyr-Ser-Ile-Arg-Lys-Leu-Gly-Val-Gly-Ile-Ala-Ser-Val-Thr-Leu-Gly-Thr-Leu-Leu-Ile-Ser-Gly-Gly-Val-Thr-Pro-Ala-Ala-Asn-Ala(序列号21)。
编码上述启动子、夏因-达尔加诺序列及分泌信号肽的DNA例如可以由短芽孢杆菌属细菌获得。优选以短短芽孢杆菌47株(JCM6285)、短短芽孢杆菌47K株(FERM BP-2308)、短短芽孢杆菌47-5株(FERM BP-1664)、铫子短芽孢杆菌HPD31株(FERM BP-1087)、铫子短芽孢杆菌HPD31-S株(FERM BP-6623)、或铫子短芽孢杆菌HPD31-OK株(FERM BP-4573)的染色体DNA作为模板，用公知的PCR法进行特异性扩增而获得。
在表达载体中，编码上述启动子、上述夏因-达尔加诺序列、上述信号肽序列及重组蛋白质的基因优选以在短芽孢杆菌属细菌内能够发挥作用的方式进行连接。
表达载体优选为质粒载体。作为对短芽孢杆菌属细菌的基因表达有用的质粒载体，具体而言可以列举例如：作为枯草芽孢杆菌载体而公知的pUB110、或pHY500(日本特开平2-31682号公报)、pNY700(日本特开平4-278091号公报)、pHY4831(J.Bacteriol.1987.1239-1245)、pNU200(鹈高重三、日本农艺化学会志(日本農芸化学会誌)1987.61：669-676)、pNU100(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1989,30：75-80)、pNU211(J.Biochem.,1992,112：488-491)、pNU211R2L5(日本特开平7-170984号公报)、pNH301(Shiga.Y.等.Appl.Environ.Microbiol.1992.58：525-531.)、pNH326、pNH400(Ishihara.T等、1995.J.Bacteriol,177：745-749)、pHT210(日本特开平6-133782号公报)、pHT110R2L5(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1994,42：358-363)、或者作为大肠杆菌与短芽孢杆菌属细菌的穿梭载体的pNCMO2(日本特开2002-238569号公报)。另外，还可以使用包含在短芽孢杆菌属细菌中能够发挥功能的启动子、夏因-达尔加诺序列及编码目的蛋白质的DNA序列的表达载体，或者使用将包含上述各序列的基因片段直接插入染色体中并使其表达的方法(日本特开平9-135693号公报)。
重组蛋白质可以用在短芽孢杆菌属细菌中分泌的方法或不在短芽孢杆菌属细菌中分泌的方法中任一种来生产，从分离纯化容易的观点出发，优选分泌于培养液中的方法。
为了使重组蛋白质分泌于培养液中，优选在编码重组蛋白质的基因的上游添加或连接编码在短芽孢杆菌属细菌内发挥功能的信号肽的DNA。
作为用于得到转化体的宿主细胞，可以使用任意短芽孢杆菌属细菌。短芽孢杆菌属细菌没有特别限定，包括：土壤短芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、中孢短芽孢杆菌、铫子短芽孢杆菌、美丽短芽孢杆菌、污染短芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、嗜湖短芽孢杆菌、副短短芽孢杆菌、茹氏短芽孢杆菌、热红短芽孢杆菌等。
短芽孢杆菌属细菌优选选自短短芽孢杆菌47株(JCM6285)、短短芽孢杆菌47K株(FERM BP-2308)、短短芽孢杆菌47-5株(FERM BP-1664)、短短芽孢杆菌47-5Q株(JCM8970)、铫子短芽孢杆菌HPD31株(FERM BP-1087)、铫子短芽孢杆菌HPD31-S株(FERM BP-6623)、铫子短芽孢杆菌HPD31-OK株(FERM BP-4573)及铫子短芽孢杆菌SP3株(Takara公司制)。上述短短芽孢杆菌47株、短短芽孢杆菌47-5Q株、铫子短芽孢杆菌HPD31株、铫子短芽孢杆菌SP3株、铫子短芽孢杆菌HPD31-OK株、铫子短芽孢杆菌HPD31-S株特别适合。
还可以使用上述短芽孢杆菌属细菌的蛋白酶缺失株、高表达株这样的突变株。作为突变株，可以列举例如：作为源自铫子短芽孢杆菌HPD31株的蛋白酶突变株的铫子短芽孢杆菌HPD31-OK株(日本特开平6-296485号公报)、作为人唾液淀粉酶高生产株的短短芽孢杆菌47K株(Konishi,H.等.Appl Microbiol.Biotechnol.1990.34：297-302)。另外，还可以使用上述短芽孢杆菌属细菌群所包含的任一株的突变体。
在上述微生物当中，短短芽孢杆菌47K株(FERM BP-2308)、短短芽孢杆菌47-5株(FERM BP-1664)、铫子短芽孢杆菌HPD31株(FERM BP-1087)、铫子短芽孢杆菌HPD31-S株(FERM BP-6623)及铫子短芽孢杆菌HPD31-OK株(FERM BP-4573)分别以上述保藏编号保藏于独立行政法人产业技术总合研究所专利生物保藏中心(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)(IPOD；305-8566茨城县筑波市东1丁目1-1中央第6(〒305－8566茨城県つくば市東1丁目1－1中央第6))。另外，短短芽孢杆菌47株(JCM6285)和短短芽孢杆菌47-5Q株(JCM8970)可以由独立行政法人理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室(独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室)(JCM；305-0074茨城县筑波市高野台3-1-1(〒305－0074茨城県つくば市高野台3－1－1))获得。上述短芽孢杆菌属细菌可以不进行突变等而直接使用，另外，可以由上述短芽孢杆菌属细菌进一步获得重组蛋白质的生产量、品质优异的短芽孢杆菌属细菌，用于重组蛋白质的生产。
在包含短芽孢杆菌属细菌的微生物中使异源蛋白质高表达的情况下，未正确折叠而形成非活性型蛋白质的情况较多，特别是在使二硫键多的蛋白质高表达的情况下，在细胞内外发生不溶性化的情况较多。另一方面，已知在使目标蛋白质表达时，通过使伴侣蛋白、二硫键异构酶和/或脯氨酸异构酶等发挥作用而抑制目标蛋白质的不溶性化、分泌效率的降低。广泛尝试了的方法是使PDI(蛋白质二硫键异构酶)和/或DsbA等具有二硫键氧化还原活性的蛋白质发挥作用的方法(日本特开昭63-294796号公报、日本特开平5-336986号公报)。
另外，还已知将编码具有二硫键氧化还原活性的蛋白质的基因导入宿主生物，使目表蛋白质和具有二硫键氧化还原活性的蛋白质同时表达而生成具有正确二硫键的蛋白质的方法(日本特开2000-83670号公报、日本特表2001-514490号公报等)。
在本发明的重组蛋白质进行表达的情况下，为了减轻过度进行蛋白质合成而对宿主细胞造成负担，使蛋白质分泌顺利进行，可以在该蛋白质表达时使多种伴侣蛋白、二硫键氧化还原酶和/或二硫键异构酶这样的促进折叠的酶同时表达。具体而言可以列举：在短芽孢杆菌属细菌中，该蛋白质表达时，可以使与蛋白质的二硫键相关、且被认为是蛋白质二硫键异构酶的类似物的大肠杆菌的DsbA(Bardwell,J.C.A.等.Cell.1991.67：582-589、Kamitani.S等.EMBO.J.1992.11：57-62.)和/或DnaK、DnaJ、GrpE(日本特开平9-180558号公报)等伴侣蛋白同时表达。另外，可以使与多肽的正确的二硫键相关的酶PDI(日本特愿2001-567367号公报)、二硫键氧化还原酶(日本特开2003-169675号公报)(Kontinen,V,P.等Molecular Microbiology.1993.8：727-737)和/或二硫键异构酶这样的促进折叠的酶与该蛋白质同时表达，进一步使分泌效率得到提高。
通过编码重组蛋白质的基因进行的短芽孢杆菌属细菌的宿主细胞转化可以利用公知的Takahashi等的方法(Takahashi.W等.J.Bacteriol.1983.156：1130-1134)、Takagi等的方法(Takagi.H.等.1989.Agric.Biol.Chem,53：3099-3100)或Okamoto等的方法(Okamoto.A.等1997.Biosci.Biotechnol.Biochem.61：202-203)来进行。
短芽孢杆菌属细菌的培养所使用的培养基只要能够以高效率、高产量生产重组蛋白质即可，没有特别限定。具体而言，可以使用葡萄糖、蔗糖、甘油、多蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白氨基酸等碳源、氮源。另外，还可以添加钾盐、钠盐、磷酸盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐等无机盐类。另外，可以根据需要添加大豆油、猪油、表面活性剂等具有消泡效果的化合物，或者添加使细胞膜的物质通透性改变，可期待提高单位菌体的重组蛋白质分泌生产量的化合物。使用表面活性剂有时会增强本发明的效果，因此优选。作为表面活性剂，只要不对重组短芽孢杆菌属细菌的繁殖和/或重组蛋白质生产造成不良影响即可，没有特别限制，优选为聚氧亚烷基二醇类表面活性剂。在使用营养缺陷性宿主细胞时，可以添加繁殖所需要的营养物质。可以添加青霉素、红霉素、氯霉素、新霉素等抗生素。为了抑制由于存在于菌体内外且源自宿主的蛋白酶所引起的该目标蛋白质的分解、低分子化，可以添加公知的蛋白酶抑制剂。作为蛋白酶抑制剂，可以列举例如：二苯甲烷磺酰氯(Phenylmethanesulfonyl fluoride)(PMSF)、苄脒(Benzamidine)、4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氯(4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride)(AEBSF)、抗蛋白酶素(Antipain)、胰凝乳蛋白酶抑制剂(Chymostatin)、亮抑蛋白酶肽(Leupeptin)、胃酶抑素A(Pepstatin A)、磷酸阿米酮(Phosphoramidon)、抑肽酶(Aprotinin)、乙二胺四乙酸(EDTA)等。
培养开始时培养基中含有的碳源的浓度优选为1％以上或10％以下，初始更优选为1～10％。培养过程中进一步优选适当追加碳源，使得碳源的浓度为10％以下、5％以下、3％以下、特别是1％以下。作为碳源的追加方法，可以举出分批添加或连续添加。
培养可以列举在通气搅拌条件下进行的好氧培养、或阻隔了通气的厌氧培养，优选好氧培养。另外，可以在pH为4～9的条件下培养，优选为5～8。另外，可以是分批式、连续式中任一种培养方法。
本发明的制造方法包括：在32℃以上对短芽孢杆菌属细菌进行培养的高温培养工序、以及在上述高温培养工序之后在低于32℃下进行培养的低温培养工序。在高温培养工序和低温培养工序中，用液体培养基或固体培养基对短芽孢杆菌属细菌进行培养。
在32℃以上对短芽孢杆菌属细菌进行培养的高温培养工序中，从培养开始起以32℃以上的温度培养短芽孢杆菌属细菌。高温培养工序中的培养温度优选为32～60℃，更优选为32～50℃，进一步优选为32～40℃。超过60℃时存在菌体增殖变差的倾向，低于32℃时存在菌体增殖速度变慢的倾向。
在高温培养工序之后在低于32℃下进行培养的低温培养工序中，以低于32℃的温度培养短芽孢杆菌属细菌进行。低温培养工序中的培养温度优选为10℃以上且低于32℃，更优选为15℃以上且低于32℃，进一步优选为20℃以上且低于32℃，更进一步优选为25℃以上且低于32℃。在32℃以上时存在菌体内的质粒保持变得不稳定的倾向，在低于10℃时存在菌体增殖变差的倾向。
从高温培养工序向低温培养工序的转换优选在短芽孢杆菌属细菌繁殖过程中的对数生长期初期至中期之间进行。通过在对数生长期初期至中期之间从高温培养工序转换至低温培养工序，能够起到在使质粒稳定地保持于菌体内的状态下使培养时的菌体增殖速度增加而提高重组蛋白质的生产量的效果。
需要说明的是，通常，对数生长期是指培养体系所含有的全部细胞以恒定间隔进行细胞分裂而增殖，由于培养体系整体中含有的细胞总数每次增长为2倍而使细胞数量的对数相对于时间轴为直线的期间。由于根据待使用的培养基种类不同，短芽孢杆菌属细菌的最终菌体密度也不同，因此无法用培养基的浊度的绝对值定义对数生长期。这里，将在待使用的培养基中菌体密度达到最大的培养基浊度设为100％时的培养基相对浊度(％)作为指标来定义对数生长期。在使用该指标时，短芽孢杆菌属细菌繁殖过程中对数生长期的初期是指培养基的相对浊度为1～35％的期间，短芽孢杆菌属细菌繁殖过程中对数生长期的中期是指培养基的相对浊度大于35％且70％以下的期间。
在使用上述指标的情况下，从高温培养工序向低温培养工序的转换优选在相对浊度为1～70％时进行，更优选在5～60％时进行，进一步优选在10～50％时进行，更进一步优选在15～40％时进行。
从高温培养工序向低温培养工序的转换可以通过改变培养装置的设定温度，使高温培养工序中使用的液体培养基温度降低来进行。通常，从高温培养工序向低温培养工序转换时不需要更换培养基，但也可以更换培养基。
需要说明的是，培养基的浊度是用分光光度计在600nm波长下测定的培养基的吸光度。
生产的重组蛋白质大量积蓄于菌体外、即培养上清液中，可以从培养上清液中回收纯化重组蛋白质。另外，存在于菌体内及菌体表层的重组蛋白质也可以通过例如超音波、弗氏细胞压碎器、碱处理、SDS处理等公知的方法对菌进行破碎来回收。从培养上清液、菌体中回收的蛋白质可以通过使用硫酸铵、硫酸钠等的盐析、使用乙醇、丙酮等的浓缩、凝胶过滤、离子交换、羟基磷灰石、利用重组蛋白质所具有的亲和性的层析法等进行纯化。
实施例
以下，基于实施例对本发明具体地进行说明，但本发明并不限定于此。在本实施例中，重组DNA的制作、操作等在没有特别说明的情况下，按照下述实验书籍来实施。(1)T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook著、“分子克隆/实验室手册(Molecular Cloning/ALaboratory Manual)”、第2版(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory出版(美国)。(2)村松正实编著“实验手册基因工学(ラボマニュアル遺伝子工学)”、第3版(1996)、丸善株式会社出版。另外，本实施例中使用的试剂、限制酶等在没有特别说明的情况下使用市售品。
(制造例1)表达蛋白A中C结构域功能突变体的5连接体的转化体的制备
将蛋白A在C结构域的第29号Gly取代为Ala并连接5个C结构域变体而形成蛋白质的氨基酸序列(序列号18，以下称为C-G29A)，由该氨基酸序列进行逆翻译，设计了编码该蛋白质的DNA序列。考虑到使该蛋白质的密码子使用频率与在铫子短芽孢杆菌HPD31株中大量表达的细胞表层蛋白质HWP(J.Bacteriol.,172,p.1312-1320,1990)的密码子使用频率接近、且使5个编码各结构域的碱基序列的序列同源性较低，对密码子进行分配。另外，在编码5连接结构域的序列的5’侧制作了PstI限制酶，并且在3’侧制作了XbaI的限制酶识别部位。将制作的DNA片段的序列记为序列号22。用PstI和XbaI(均为Takara公司制)消化制作的DNA片段，通过琼脂糖电泳进行区分、纯化。另一方面，用PstI和XbaI对作为短芽孢杆菌属细菌用质粒载体的pNCMO2(Takara公司制)进行消化后，进行纯化回收。将两者混合后使用Ligation High(TOYOBO公司制)连接，构建了质粒载体pNCMO2-C-G29A。使用该质粒载体进行铫子短芽孢杆菌SP3株(Takara公司制)的转化，制作了铫子短芽孢杆菌SP3(pNCMO2-C-G29A)。
(参考例1)由铫子短芽孢杆菌SP3(pNCMO2-C-G29A)的培养温度不同引起的重组蛋白质C-G29A生产量与质粒保持率的比较
向A培养基(蛋白胨1.5％、酵母提取物0.4％、葡萄糖2％、磷酸盐0.38％、MgSO4·7H2O 0.02％、MnSO4·4H2O 0.002％、FeSO4·7H2O 0.002％、ZnSO4·7H2O 0.0002％pH7.2、从培养开始后第6小时至第48小时连续添加葡萄糖3.8％)添加750ppm的DISFOAM CC-118，在28、30、32、34、36℃各培养温度、好氧条件下将pH控制为7.0～7.2，并对制造例1中得到的铫子短芽孢杆菌SP3(pNCMO2-C-G29A)进行培养。
自培养开始起46小时后采集培养液，按照以下所示的方法对培养液中的铫子短芽孢杆菌的质粒保持率进行测定。首先，用0.9％的生理盐水适当稀释采集的培养液，将稀释液100μl涂布于标准琼脂培养基(日水制药株式会社制)板，然后在30℃下静置培养20小时。将板上得到的菌落影印于含有新霉素60ppm的标准琼脂培养基板上，根据在30℃下静置培养24小时后的菌落是否繁殖来判断是否保持质粒。
另外，自培养开始起67小时后采集培养液，通过离心分离(15,000rpm、25℃、5分钟)除去菌体，然后用高效液相色谱法对培养上清液中的重组蛋白质C-G29A浓度进行了测定。将各培养温度下的重组蛋白质C-G29A浓度和质粒保持率的结果示于表1。
表1
如表1所示，在培养温度为28℃和30℃时，能100％稳定地保持质粒，相比之下，在培养温度为32℃以上时，质粒保持率降低，培养上清液中的重组蛋白质C-G29A浓度也降低。
(实施例1)铫子短芽孢杆菌SP3(pNCMO2-C-G29A)的温度变化培养方法1
向A培养基(其中，葡萄糖的连续添加以从培养开始6小时后至30小时后添加4.8％的方式进行)添加750ppm的DISFOAM CC-118，将pH控制为7.0～7.2，在好氧条件下对制造例1中得到的铫子短芽孢杆菌SP3(pNCMO2-C-G29A)进行培养。培养按照以下条件进行，从培养开始至第13.5小时以36℃的培养温度进行培养，在培养基的相对浊度达到33％之后，将温度更改为30℃，培养至培养结束。
自培养开始起41小时后采集培养液，与参考例1同样地对培养上清液中的重组蛋白质C-G29A浓度进行了测定。另外，自培养开始起41小时后采集培养液，使用分光光度计分析了600nm下的浊度。另外，自培养开始起46小时后采集培养液，与参考例1同样地测定了质粒保持率。将结果示于表2。
(比较例1)铫子短芽孢杆菌SP3(pNCMO2-C-G29A)的培养方法1
从培养开始至结束在30℃恒定温度的条件下进行培养，除此以外，与实施例1进行了相同的操作。将结果示于表2。
表2
培养温度(℃) C-G29A浓度(g/L) 浊度 质粒保持率(％)
实施例1 36→30 5.6 64.0 100
比较例1 30 4.5 59.0 100
如表2所示，对于改变了培养温度的实施例1而言，与30℃恒定培养温度的比较例1相比，培养上清液中的重组蛋白质C-G29A浓度大幅增加。另外，对于实施例1而言，与比较例1相比，作为菌体量的指标的浊度也有所增加。而且，如表1所示，在36℃恒定培养中，培养开始46小时后的质粒保持率极低，为25％，相比之下，在温度从36℃改变为30℃的情况下，即使在培养开始46小时后也能100％稳定地保持质粒。
(实施例2)铫子短芽孢杆菌SP3(pNCMO2-C-G29A)的温度变化培养方法2
向A培养基添加750ppm的DISFOAM CC-118，将pH控制为7.0～7.2，在好氧条件下对制造例1中得到的铫子短芽孢杆菌SP3(pNCMO2-C-G29A)进行培养。培养按照以下条件进行，从培养开始至第13.5小时在34℃的培养温度下进行培养，培养基的相对浊度达到22％之后，将温度改变为30℃，培养至培养结束。
自培养开始37小时后采集培养液，与参考例1同样地对培养上清液中的重组蛋白质C-G29A浓度进行了测定。另外，自培养开始37小时后采集培养液，使用分光光度计分析了600nm下的浊度。另外，自培养开始41小时后采集培养液，与参考例1同样地测定了质粒保持率。将结果示于表3。
(比较例2)铫子短芽孢杆菌SP3(pNCMO2-C-G29A)的培养方法2
从培养开始至结束在30℃恒定温度的条件下进行培养，除此以外，与实施例2进行了相同的操作。将结果示于表3。
表3
培养温度(℃) C-G29A浓度(g/L) 浊度 质粒保持率(％)
实施例2 34→30 4.6 57 100
比较例2 30 4.0 50 100
如表3所示，对于改变了培养温度的实施例2而言，与30℃恒定培养温度的比较例2相比，培养上清液中的重组蛋白质C-G29A浓度明显增加。另外，对于实施例2而言，与比较例2相比，作为菌体量的指标的浊度也有所增加。而且，如表1所示，在34℃恒定培养中，培养开始46小时后的质粒保持率极低，为44％，相比之下，在温度从34℃改变为30℃的情况下，即使在培养开始41小时后也能100％稳定地保持质粒。
(制造例2)短芽孢杆菌表达载体pNK3260的构建
将pNH326(J.Bacteriol.,1995,177：745-749)中含有的MWP的P5启动子改变为MWP的P2启动子，如下所述构建了短芽孢杆菌表达载体pNK3260。首先，以pNH326作为模板，使用具有序列号23和24所示的碱基序列的2个寡核苷酸引物Primer-1及Primer-2进行PCR，对pNH326中除了MWP的P5启动子以外的部分进行扩增，并将其末端用限制酶EcoRI和HindIII(均为Takara公司制)消化。接下来，按照通用方法制备包含MWP的P2启动子的双链DNA片段，所述MWP的P2启动子具有序列号25所示的碱基序列，并将其末端用限制酶MunI和HindIII(均为Takara公司制)进行消化。使用T4DNA连接酶(Takara公司制)连接上述2个DNA片段，构建了pNK3260。
(制造例3)源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cowan I株(JCM2179)的编码蛋白A的DNA序列的克隆
用T2液体培养基(多蛋白胨1％、酵母提取物0.2％、葡萄糖1％、鱼肉提取物0.5％、pH7.0)在37℃下将金黄色葡萄球菌Cowan I株(JCM2179)振荡过夜并进行培养。从得到的培养液中通过离心分离回收菌体，然后用10mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(pH8.0)清洗2次。将菌体悬浮于该缓冲液，然后用1％SDS进行溶菌，在60℃下加热30分钟之后，通过苯酚提取及乙醇沉淀等通常方法提取出全部基因组DNA。需要说明的是，金黄色葡萄球菌Cowan I株(JCM2179)可以由独立行政法人理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室(JCM)(305-0074茨城县筑波市高野台3-1-1)获得。
接着，以蛋白A基因的DNA序列信息(Shuttleworth,H.L等.Gene,1987,58：283-295.)为基础制备了具有序列号26和27所示的碱基序列的2个寡核苷酸引物Primer-3及Primer-4。以上述金黄色葡萄球菌Cowan I株(JCM2179)的基因组DNA作为模板，使用上述2个寡核苷酸引物Primer-3及Primer-4进行PCR，对编码蛋白A中除了信号序列(S结构域)及细胞壁结合结构域(X结构域)以外的部分(以下称为SPA’)的DNA片段(约0.9kbp)进行扩增。得到的DNA片段用限制酶NcoI和BamHI进行消化，然后通过琼脂糖凝胶进行分离回收。
另一方面，也同样地用限制酶NcoI和BamHI对制造例2中构建的短芽孢杆菌表达载体pNK3260进行消化，然后纯化回收，通过碱性磷酸酶处理进行脱磷酸化处理。
将限制酶处理后的编码SPA’的上述DNA片段与上述表达载体pNK3260用T4DNA连接酶进行连接，构建了如图1所示的SPA’表达质粒Spa’-pNK3260。图2示出了Spa’-pNK3260所含有的启动子、SD序列、编码信号肽及蛋白A(SPA’)的DNA。序列号28所示的碱基序列示出了Spa’-pNK3260所含有的启动子、SD序列、编码信号肽及蛋白A(SPA’)的DNA，序列号29示出了编码信号肽及蛋白A(SPA’)的DNA所编码的氨基酸序列。
在图1和图2中，“MWP-P2”表示短短芽孢杆菌细胞壁蛋白质MWP的P2启动子区域，“SDM”表示短短芽孢杆菌细胞壁蛋白质MWP的SD序列，“SP’”表示部分改变了短短芽孢杆菌细胞壁蛋白质MWP的信号肽序列而得到的改变型信号肽序列，“spa’”表示编码SPA’的DNA序列，“Nm”表示新霉素耐受性基因编码区域，“Rep/pUB110”表示载体pNK3260的复制起点。另外，在图2中，“P2-35”和“P2-10”分别表示短短芽孢杆菌细胞壁蛋白质MWP的P2启动子的-35区域和-10区域。
通过将Spa’-pNK3260电导入铫子短芽孢杆菌HPD31-OK株(FERM BP-4573)，制作了转化体铫子短芽孢杆菌HPD31-OK(Spa’-pNK3260)。
(实施例3)铫子短芽孢杆菌HPD31-OK(Spa’-pNK3260)的温度变化培养方法
向A培养基(其中，葡萄糖的连续添加以从培养开始6小时后至48小时后添加5.0％的方式进行)添加750ppm的DISFOAM CC-118，将pH控制为7.0～7.2，在好氧条件下对制造例3中得到的铫子短芽孢杆菌HPD31-OK(Spa’-pNK3260)进行培养。培养按照以下条件进行，从培养开始至第13.5小时以34℃的培养温度进行培养，在培养基的相对浊度达到21％之后，将温度更改为30℃，培养至培养结束。自培养开始起48小时后采集培养液，与参考例1同样地对培养上清液中的重组蛋白质SPA’浓度进行了测定。另外，自培养开始起48小时后采集培养液，使用分光光度计分析了600nm下的浊度。将结果示于表4。
(比较例3)铫子短芽孢杆菌HPD31-OK(Spa’-pNK3260)的培养
从培养开始至结束在30℃恒定温度的条件下进行培养，除此以外，与实施例3进行了相同的操作。将结果示于表4。
表4
培养温度(℃) SPA’浓度(g/L) 浊度
实施例3 34→30 4.8 60
比较例3 30 3.0 40
如表4所示，对于改变了培养温度的实施例3而言，与30℃恒定培养的比较例3相比，培养上清液中的重组蛋白质SPA’浓度大幅增加。另外，实施例3与比较例3相比，作为菌体量的指标的浊度也大幅增加。
序列表
<110> 株式会社钟化（KANEKA CORPORATION）
<120> 使用重组短芽孢杆菌属细菌的重组蛋白质制造方法
<130> B140045WO01
<150> JP 2014-118817
<151> 2014-6-9
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 56
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 1
Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn
1 5 10 15
Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
20 25 30
Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys
35 40 45
Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 2
<211> 61
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 2
Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu
35 40 45
Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55 60
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 3
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 4
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
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Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 5
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
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Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 6
<211> 55
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 链球菌属细菌
<400> 6
Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr
20 25 30
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<210> 7
<211> 55
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 链球菌属细菌
<400> 7
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1 5 10 15
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<210> 8
<211> 55
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 链球菌属细菌
<400> 8
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Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
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<210> 9
<211> 76
<212> PRT
<213> 大消化链球菌
<400> 9
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Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln Thr Ala
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Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly
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<210> 10
<211> 72
<212> PRT
<213> 大消化链球菌
<400> 10
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Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly
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<210> 11
<211> 72
<212> PRT
<213> 大消化链球菌
<400> 11
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20 25 30
Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu
35 40 45
Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr
50 55 60
Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly
65 70
<210> 12
<211> 72
<212> PRT
<213> 大消化链球菌
<400> 12
Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala
1 5 10 15
Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly
20 25 30
Thr Phe Ala Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu
35 40 45
Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Leu Glu Asp Gly Gly Tyr
50 55 60
Thr Ile Asn Ile Arg Phe Ala Gly
65 70
<210> 13
<211> 73
<212> PRT
<213> 大消化链球菌
<400> 13
Lys Lys Val Asp Glu Lys Pro Glu Glu Lys Glu Gln Val Thr Ile Lys
1 5 10 15
Glu Asn Ile Tyr Phe Glu Asp Gly Thr Val Gln Thr Ala Thr Phe Lys
20 25 30
Gly Thr Phe Ala Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu
35 40 45
Leu Ser Lys Glu His Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Leu Glu Asp Gly Gly
50 55 60
Tyr Thr Ile Asn Ile Arg Phe Ala Gly
65 70
<210> 14
<211> 71
<212> PRT
<213> 大消化链球菌
<400> 14
Lys Glu Thr Pro Glu Pro Glu Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu
1 5 10 15
Ile Phe Ala Asp Gly Ser Thr Gln Asn Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe
20 25 30
Ala Lys Ala Val Ser Asp Ala Tyr Ala Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Lys
35 40 45
Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Leu Thr Leu
50 55 60
Asn Ile Lys Phe Ala Gly Lys
65 70
<210> 15
<211> 71
<212> PRT
<213> 大消化链球菌
<400> 15
Lys Glu Lys Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Val Asn
1 5 10 15
Leu Ile Phe Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr
20 25 30
Phe Glu Glu Ala Thr Ala Lys Ala Tyr Ala Tyr Ala Asp Leu Leu Ala
35 40 45
Lys Glu Asn Gly Glu Tyr Thr Ala Asp Leu Glu Asp Gly Gly Asn Thr
50 55 60
Ile Asn Ile Lys Phe Ala Gly
65 70
<210> 16
<211> 74
<212> PRT
<213> 大消化链球菌
<400> 16
Lys Glu Thr Pro Glu Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile
1 5 10 15
Lys Val Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly Lys Ile Gln Thr Ala Glu Phe
20 25 30
Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Lys Ala Tyr Ala Tyr Ala Asn
35 40 45
Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Glu Tyr Thr Ala Asp Leu Glu Asp Gly
50 55 60
Gly Asn Thr Ile Asn Ile Lys Phe Ala Gly
65 70
<210> 17
<211> 75
<212> PRT
<213> 大消化链球菌
<400> 17
Lys Glu Thr Pro Glu Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile
1 5 10 15
Lys Val Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe
20 25 30
Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp
35 40 45
Leu Leu Ala Lys Val Asn Gly Glu Tyr Thr Ala Asp Leu Glu Asp Gly
50 55 60
Gly Tyr Thr Ile Asn Ile Lys Phe Ala Gly Lys
65 70 75
<210> 18
<211> 290
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 18
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn
50 55 60
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile
145 150 155 160
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp
165 170 175
Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
180 185 190
Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu
195 200 205
Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys
210 215 220
Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
225 230 235 240
Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
245 250 255
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val
260 265 270
Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala
275 280 285
Pro Lys
290
<210> 19
<211> 23
<212> PRT
<213> 短短芽孢杆菌
<400> 19
Met Lys Lys Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr
1 5 10 15
Val Ala Pro Met Ala Phe Ala
20
<210> 20
<211> 31
<212> PRT
<213> 短短芽孢杆菌
<400> 20
Met Lys Lys Arg Arg Val Val Asn Asn Ser Val Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro Met Ala Phe Ala
20 25 30
<210> 21
<211> 36
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 21
Met Lys Lys Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Arg Lys Leu Gly Val Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Val Thr Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser Gly Gly Val Thr Pro
20 25 30
Ala Ala Asn Ala
35
<210> 22
<211> 881
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 22
ctgcagataa caaatttaac aaagaacaac aaaacgcttt ctacgaaatc ctgcacttgc 60
caaaccttac tgaagaacaa cgtaatgctt tcatccaatc cctgaaagat gatccatctg 120
tatccaaaga aattttggca gaggctaaaa aacttaacga cgctcaggcg cctaaggctg 180
ataacaaatt caacaaagaa caacaaaacg ctttttatga aatccttcac ctgccaaatc 240
ttacagaaga acaacgcaac gcattcattc aaagcttgaa ggatgaccct tccgttagca 300
aagagatcct ggctgaagca aaaaagttga atgatgcgca agcaccaaaa gctgataata 360
aattcaacaa agaacaacaa aatgcattct acgaaatctt gcaccttcct aacctgactg 420
aagagcagcg taacgctttt atccagagct tgaaagacga tccatctgtc tccaaagaaa 480
ttctcgcaga agcgaagaaa ctgaacgatg ctcaagctcc gaaagcagac aacaaattca 540
ataaggaaca gcaaaacgcg ttttatgaaa ttctgcatct tccaaacttg acagaggaac 600
aacgcaatgc tttcatccaa tccctgaaag atgatccgag cgtttctaag gaaatcttgg 660
ctgaagcaaa aaaactgaac gacgctcaag ctccaaaagc ggataacaag tttaacaaag 720
aacaacaaaa tgctttctac gagatcttgc accttccgaa cctgactgaa gaacaacgta 780
acgcatttat tcagtctttg aaggatgacc catccgtaag caaagagatc ctggcagaag 840
ctaaaaaatt gaatgatgca caagctccaa aataatctag a 881
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
ggaattctga tttcactttt tgcattctac a 31
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
agtgcactcg cacttactgt 20
<210> 25
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 25
ggtaccaatt ggcgccgcaa cttttgattc gctcaggcgt ttaataggat gtaattgtga 60
gcggataaca attattctgc atggctttcc tgcgaaagga ggtgcaccgc gcttgcagga 120
ttcgggcttt aaaaagaaag atagattaac aacaaatatt ccccaagaac aatttgttta 180
tactggagga ggagaacaca aggtcatgaa aaaaagaagg gtcgttaaca gtgtattgct 240
tctgctactg ctagctagtg cactcgcact tactgttgct cccatggctt tcgctgcagg 300
atccgtcgac tctagactcg aggaattcgg taccccgggt tcgaaatcga taagcttctg 360
t 361
<210> 26
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
ttgctcccat ggctttcgct gcgcaacacg atgaagctca acaa 44
<210> 27
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
cgggatccct attttggtgc ttgagcatcg tttagctttt tagcttctgc taaaattttc 60
<210> 28
<211> 1230
<212> DNA
<213> 短短芽孢杆菌
<220>
<221> -35_信号
<222> (17)..(23)
<220>
<221> -10_信号
<222> (41)..(45)
<220>
<221> RBS
<222> (94)..(103)
<220>
<221> RBS
<222> (186)..(196)
<220>
<221> CDS
<222> (206)..(1171)
<220>
<221> 信号肽
<222> (206)..(295)
<400> 28
cgtaccaatt ggcgccgcaa cttttgattc gctcaggcgt ttaataggat gtaattgtga 60
gcggataaca attattctgc atggctttcc tgcgaaagga ggtgcaccgc gcttgcagga 120
ttcgggcttt aaaaagaaag atagattaac aacaaatatt ccccaagaac aatttgttta 180
tactagagga ggagaacaca aggtc atg aaa aaa aga agg gtc gtt aac agt 232
Met Lys Lys Arg Arg Val Val Asn Ser
1 5
gta ttg ctt ctg cta ctg cta gct agt gca ctc gca ctt act gtt gct 280
Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala
10 15 20 25
ccc atg gct ttc gct gcg caa cac gat gaa gct caa caa aat gct ttt 328
Pro Met Ala Phe Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe
30 35 40
tat caa gtg tta aat atg cct aac tta aac gct gat caa cgt aat ggt 376
Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly
45 50 55
ttt atc caa agc ctt aaa gat gat cca agc caa agt gct aac gtt tta 424
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu
60 65 70
ggt gaa gct caa aaa ctt aat gac tct caa gct cca aaa gct gat gcg 472
Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala
75 80 85
caa caa aat aag ttc aac aaa gat caa caa agc gcc ttc tat gaa atc 520
Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
90 95 100 105
ttg aac atg cct aac tta aac gaa gag caa cgc aat ggt ttc att caa 568
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
110 115 120
agt ctt aaa gac gat cca agc caa agc act aac gtt tta ggt gaa gct 616
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala
125 130 135
aaa aaa tta aac gaa tct caa gca ccg aaa gct gac aac aat ttc aac 664
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn
140 145 150
aaa gaa caa caa aat gct ttc tat gaa atc ttg aac atg cct aac ttg 712
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu
155 160 165
aac gaa gaa caa cgc aat ggt ttc atc caa agc tta aaa gat gac cca 760
Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
170 175 180 185
agt caa agt gct aac ctt tta gca gaa gct aaa aag tta aat gaa tct 808
Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser
190 195 200
caa gca ccg aaa gct gat aac aaa ttc aac aaa gaa caa caa aat gct 856
Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
205 210 215
ttc tat gaa atc tta cat tta cct aac tta aat gaa gaa caa cgc aat 904
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn
220 225 230
ggt ttc atc caa agc tta aaa gat gac cca agc caa agc gct aac ctt 952
Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu
235 240 245
tta gca gaa gct aaa aag cta aat gat gca caa gca cca aaa gct gac 1000
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp
250 255 260 265
aac aaa ttc aac aaa gaa caa caa aat gct ttc tat gaa att tta cat 1048
Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
270 275 280
tta cct aac tta act gaa gaa caa cgt aac ggc ttc atc caa agc ctt 1096
Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
285 290 295
aaa gac gat cct tca gtg agc aaa gaa att tta gca gaa gct aaa aag 1144
Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys
300 305 310
cta aac gat gct caa gca cca aaa tag ggatccgtcg actctagact 1191
Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
315 320
cgaggaattc ggtaccccgg gttcgaaatc gataagctt 1230
<210> 29
<211> 321
<212> PRT
<213> 短短芽孢杆菌
<400> 29
Met Lys Lys Arg Arg Val Val Asn Ser Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro Met Ala Phe Ala Ala Gln
20 25 30
His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro
35 40 45
Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp
50 55 60
Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn
65 70 75 80
Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys
85 90 95
Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
100 105 110
Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
115 120 125
Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln
130 135 140
Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe
145 150 155 160
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
165 170 175
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu
180 185 190
Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn
195 200 205
Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu
210 215 220
Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys
225 230 235 240
Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu
245 250 255
Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln
260 265 270
Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu
275 280 285
Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser
290 295 300
Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro
305 310 315 320
Lys

Claims (7)

1.一种重组蛋白质的制造方法，该方法包括：
在32℃以上对具有编码重组蛋白质的基因的短芽孢杆菌属细菌进行培养的高温培养工序、以及
在所述高温培养工序之后在低于32℃下对所述短芽孢杆菌属细菌进行培养的低温培养工序。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白质的制造方法，其中，从高温培养工序向低温培养工序的转换在短芽孢杆菌属细菌繁殖过程中的对数生长期初期至中期之间进行。
3.根据权利要求1或2所述的重组蛋白质的制造方法，其中，重组蛋白质为抗体结合性蛋白质。
4.根据权利要求3所述的重组蛋白质的制造方法，其中，抗体结合性蛋白质为蛋白A的E结构域、D结构域、A结构域、B结构域或C结构域、蛋白G的C结构域或D结构域、蛋白L的B结构域、或者它们的连接体或功能突变体。
5.根据权利要求1或2所述的重组蛋白质的制造方法，其中，重组蛋白质为生理活性蛋白质。
6.根据权利要求5所述的重组蛋白质的制造方法，其中，生理活性蛋白质为肽类激素或其前体。
7.根据权利要求1或2所述的重组蛋白质的制造方法，其中，重组蛋白质为抗体或抗体样分子。
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