JP2021103942A - イムノグロブリン結合性ポリペプチド、及びそれを用いたアフィニティー担体 - Google Patents

イムノグロブリン結合性ポリペプチド、及びそれを用いたアフィニティー担体 Download PDF

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智亮 芳賀
貴一 吉村
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貴一 吉村
潤一 安岡
Junichi Yasuoka
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Abstract

【課題】酸性条件下での抗体解離率が向上したアフィニティーリガンドの提供。【解決手段】イムノグロブリン結合性ポリペプチド。該ポリペプチドは、イムノグロブリン結合ドメインの２つの断片と、ｐＨ応答性ペプチドとを含み、該イムノグロブリン結合ドメインの２つの断片は、該イムノグロブリン結合ドメインのＮ末端を含む断片（断片Ａ）及び該イムノグロブリン結合ドメインのＣ末端を含む断片（断片Ｂ）であり、該イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合性を有するものである。【選択図】なし

Description

本発明は、イムノグロブリン結合性ポリペプチド、それを用いたアフィニティー担体、ならびに該アフィニティー担体を用いた目的物質の単離方法に関する。
抗体医薬のほとんどは、イムノグロブリンＧサブクラスに分類されるモノクローナル抗体であり、一般的に組換え動物細胞を用いて生産される。抗体医薬の製造過程では、医薬品としての安全性及び有効性を確保するため、抗体を含む動物細胞培養物から宿主細胞由来のタンパク質やＤＮＡ等の不純物を除く精製工程が不可欠である。医薬用抗体の初期精製工程には、一般に、抗体に特異的に結合するタンパク質リガンドが固定化されたカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが利用される。
アフィニティークロマトグラフィー用カラムの抗体結合性リガンドとしては、プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬなどを由来とする改変タンパク質が用いられる。プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬはいずれも、複数のドメインからなるマルチドメイン型タンパク質である。抗体結合活性を示すのは一部のドメインであり、その抗体結合活性は、他のドメインを切り離しても保たれる。プロテインＡ等由来の抗体結合性ドメインに点変異や欠失等の変異を加えたり、抗体結合性ドメインどうしを連結して、アルカリ耐性や抗体吸着容量などを向上させた改変リガンドが開発されている（特許文献１〜３）。
アフィニティークロマトグラフィーによる抗体の精製工程は、リガンドに対する抗体の結合が、中性条件で強く強酸性条件で弱い性質を利用して行われる。すなわち、はじめに抗体を含んだ中性溶液をアフィニティークロマトグラフィー用カラムに通し、抗体をカラムのリガンドに吸着させる。次に中性洗浄液をカラムに通して不純物を除去した後、強酸性溶液をカラムに通し、抗体をカラムから溶出させる。以上の吸着、洗浄、溶出の工程を経て、高純度の抗体が得られる。しかし、強酸性条件での溶出は、抗体の変性や凝集を引き起こして、抗体を不活性化させたり免疫原性にする恐れがある。そのため、本来抗体が溶出する酸性条件よりも弱い酸性域で抗体を溶出できるタンパク質リガンドの開発が求められている（特許文献４〜６）。
特許第５９３３５２６号公報 国際公開公報第２０１２／０７４４６３号 国際公開公報第２０１２／１３３３４９号 特許第５８１２３０３号公報 特許第５９５２１８５号公報 国際公開公報第２０１６／１２１７０３号
本発明は、酸性条件下での抗体解離率が向上したイムノグロブリン結合性ポリペプチド、及びそれを用いたアフィニティー担体を提供する。また本発明は、該アフィニティー担体を用いたイムノグロブリン又は抗体の単離方法を提供する。
本発明は、以下を提供する。
〔１〕イムノグロブリン結合ドメインの２つの断片と、ｐＨ応答性ペプチドとを含み、
該イムノグロブリン結合ドメインの２つの断片が、
断片Ａ：該イムノグロブリン結合ドメインのＮ末端を含む断片、及び
断片Ｂ：該イムノグロブリン結合ドメインのＣ末端を含む断片
であり、
該イムノグロブリン結合ドメインが、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合性を有するものである、
ポリペプチド。
〔２〕イムノグロブリン結合性を有する、〔１〕記載のポリペプチド。
〔３〕前記ｐＨ応答性ペプチドが前記ポリペプチドの末端に位置しない、〔１〕又は〔２〕記載のポリペプチド。
〔４〕前記ｐＨ応答性ペプチドが前記断片ＡのＮ末端と、前記断片ＢのＣ末端とに連結されている、〔３〕記載のポリペプチド。
〔５〕前記ポリペプチドが、前記ｐＨ応答性ペプチドを挿入された前記イムノグロブリン結合ドメインの円順列変異体である、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載のポリペプチド。
〔６〕前記ｐＨ応答性ペプチドが、前記円順列変異体における、前記イムノグロブリン結合ドメインの元来のＮ末端とＣ末端との間に挿入されている、〔５〕記載のポリペプチド。
〔７〕前記円順列変異体が、前記イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端のアミノ酸とモチーフ間領域の末端のアミノ酸との間を切断するか、又はモチーフ間領域のアミノ酸配列が切断もしくは切除されている変異体である、〔５〕又は〔６〕記載のポリペプチド。
〔８〕前記ポリペプチドの両末端が、それぞれ前記断片Ａと断片Ｂに含まれる、前記イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端又はモチーフ間領域に位置する、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載のポリペプチド。
〔９〕前記イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端又はモチーフ間領域が、
配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号１のアミノ酸配列の９〜１５位、２２〜２４位、３８〜４５位又は５３〜５５位に相当する領域であるか、
配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号２のアミノ酸配列の１８〜２４位、又は３６〜３８位に相当する領域であるか、
配列番号３のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号３のアミノ酸配列の７〜１２位、１７〜２２位、３５〜４２位、又は４５〜５０位に相当する領域であるか、
配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号４のアミノ酸配列の１０〜１８位、３４〜４８位、５３〜６３位、７１〜７７位、８２〜１１０位、１１３〜１２４位、１２５〜１２９位、１３３〜１３７位、１４５〜１５２位、１５５〜１６４位、１７３〜１７８位、１８４〜１８８位、１９６〜１９９位、２０３〜２１２位、２１９〜２２１位、２２２〜２３４位、２３９〜２４７位、２４８〜２５０位、２５２〜２５８位、２５９〜２７１位、２７３〜２８９位、３００〜３０７位、３０９〜３２０位、３２４〜３３０位、３４２〜３４７位、３５３〜３５７位、３６３〜３７２位、又は３８０〜３８２位に相当する領域である、
〔７〕又は〔８〕記載のポリペプチド。
〔１０〕前記ｐＨ応答性ペプチドが、ｐＨの変化に伴って構造が変化するペプチドである、〔１〕〜〔９〕のいずれか１項記載のポリペプチド。
〔１１〕前記ｐＨ応答性ペプチドが、配列番号５〜１１のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項記載のポリペプチド。
〔１２〕〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項記載のポリペプチドを１個以上含む、イムノグロブリン結合タンパク質。
〔１３〕〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項記載のポリペプチド又は〔１２〕に記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１４〕〔１３〕記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔１５〕〔１３〕記載のポリヌクレオチド又は〔１４〕記載のベクターを含む形質転換体。
〔１６〕〔１５〕記載の形質転換体を培養することを含む、〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項記載のポリペプチド又は〔１２〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質の製造方法。
〔１７〕固相担体と、該担体に結合した〔１２〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質とを含む、アフィニティー担体。
〔１８〕〔１７〕記載のアフィニティー担体を用いる、抗体の単離方法。
〔１９〕イムノグロブリン結合性融合ポリペプチドの製造方法であって、
イムノグロブリン結合ドメインの断片とｐＨ応答性ペプチドとを含む融合ポリペプチドを調製することを含み、
該融合ポリペプチドの調製が、
該イムノグロブリン結合ドメインのＮ末端とＣ末端とを該ｐＨ応答性ペプチドを介して連結することと、
該イムノグロブリン結合ドメインに新たな末端を作製することと、
を含み、
該イムノグロブリン結合ドメインが、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合性を有するものである、
方法。
〔２０〕前記イムノグロブリン結合性融合ポリペプチドが、前記ｐＨ応答性ペプチドを挿入された前記イムノグロブリン結合ドメインの円順列変異体である、〔１９〕記載の方法。
〔２１〕前記イムノグロブリン結合ドメインの新たな末端の作製が、該イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端のアミノ酸とモチーフ間領域の末端のアミノ酸との間を切断するか、又はモチーフ間領域のアミノ酸配列を切断もしくは切除することを含む、〔１９〕又は〔２０〕記載の方法。
〔２２〕前記イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端又はモチーフ間領域が、
配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号１のアミノ酸配列の９〜１５位、２２〜２４位、３８〜４５位又は５３〜５５位に相当する領域であるか、
配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号２のアミノ酸配列の１８〜２４位、又は３６〜３８位に相当する領域であるか、
配列番号３のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号３のアミノ酸配列の７〜１２位、１７〜２２位、３５〜４２位、又は４５〜５０位に相当する領域であるか、
配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号４のアミノ酸配列の１０〜１８位、３４〜４８位、５３〜６３位、７１〜７７位、８２〜１１０位、１１３〜１２４位、１２５〜１２９位、１３３〜１３７位、１４５〜１５２位、１５５〜１６４位、１７３〜１７８位、１８４〜１８８位、１９６〜１９９位、２０３〜２１２位、２１９〜２２１位、２２２〜２３４位、２３９〜２４７位、２４８〜２５０位、２５２〜２５８位、２５９〜２７１位、２７３〜２８９位、３００〜３０７位、３０９〜３２０位、３２４〜３３０位、３４２〜３４７位、３５３〜３５７位、３６３〜３７２位、又は３８０〜３８２位に相当する領域である、
〔２１〕記載の方法。
〔２３〕前記ｐＨ応答性ペプチドが、ｐＨの変化に伴って構造が変化するペプチドである、〔１９〕〜〔２２〕のいずれか１項記載の方法。
〔２４〕前記ｐＨ応答性ペプチドが、配列番号５〜１１のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、〔１９〕〜〔２３〕のいずれか１項記載の方法。
〔２５〕イムノグロブリン結合領域とｐＨ応答性ペプチドとを有するポリペプチドを含むイムノグロブリン結合タンパク質と、前記イムノグロブリン結合タンパク質が結合した固相担体とを含む、アフィニティー担体。
〔２６〕前記ｐＨ応答性ペプチドが、ｐＨの変化に伴って構造が変化するペプチドである、〔２５〕記載のアフィニティー担体。
〔２７〕前記イムノグロブリン結合領域が、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、又は該ドメインの一部である断片からなるイムノグロブリン結合性を有するペプチドである、〔２５〕又は〔２６〕記載のアフィニティー担体。
〔２８〕前記ｐＨ応答性ペプチドが前記ポリペプチドの末端に位置しない、〔２５〕〜〔２７〕のいずれか１項記載のアフィニティー担体。
〔２９〕前記ポリペプチドが、前記ｐＨ応答性ペプチドを挿入された前記イムノグロブリン結合ドメインの円順列変異体である、〔２７〕又は〔２８〕記載のアフィニティー担体。
〔３０〕前記円順列変異体が、前記イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端のアミノ酸とモチーフ間領域の末端のアミノ酸との間を切断するか、又はモチーフ間領域のアミノ酸配列が切断もしくは切除されている変異体である、〔２９〕記載のアフィニティー担体。
〔３１〕前記イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端又はモチーフ間領域が、
配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号１のアミノ酸配列の９〜１５位、２２〜２４位、３８〜４５位又は５３〜５５位に相当する領域であるか、
配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号２のアミノ酸配列の１８〜２４位、又は３６〜３８位に相当する領域であるか、
配列番号３のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号３のアミノ酸配列の７〜１２位、１７〜２２位、３５〜４２位、又は４５〜５０位に相当する領域であるか、
配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号４のアミノ酸配列の１０〜１８位、３４〜４８位、５３〜６３位、７１〜７７位、８２〜１１０位、１１３〜１２４位、１２５〜１２９位、１３３〜１３７位、１４５〜１５２位、１５５〜１６４位、１７３〜１７８位、１８４〜１８８位、１９６〜１９９位、２０３〜２１２位、２１９〜２２１位、２２２〜２３４位、２３９〜２４７位、２４８〜２５０位、２５２〜２５８位、２５９〜２７１位、２７３〜２８９位、３００〜３０７位、３０９〜３２０位、３２４〜３３０位、３４２〜３４７位、３５３〜３５７位、３６３〜３７２位、又は３８０〜３８２位に相当する領域である、
〔３０〕記載のアフィニティー担体。
〔３２〕前記ｐＨ応答性ペプチドが、配列番号５〜１１のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、〔２５〕〜〔３１〕のいずれか１項記載のアフィニティー担体。
〔３３〕〔２５〕〜〔３２〕のいずれか１項記載のアフィニティー担体を用いる、抗体の単離方法。
本発明のイムノグロブリン結合性ポリペプチドは、中性条件下での抗体吸着性を維持したまま、酸性条件下での抗体解離率が向上しているため、アフィニティーリガンドとして有用である。
実施例の円順列変異の概念図である。
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、およびその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
本明細書において、アミノ酸配列やヌクレオチド配列の同一性は、カーリンとアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877）、又はＦＡＳＴＡ（Methods Enzymol., 1990, 183:63-98）を用いて決定することができる。このＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、ＴＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（J. Mol. Biol., 1990, 215:403-410）。ＢＬＡＳＴＮによってヌクレオチド配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とすることができる。また、ＢＬＡＳＴＰによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（www.ncbi.nlm.nih.gov参照）。
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも８５％の同一性」とは、８５％以上の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列上の「相当する位置」及び「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列又はヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基又はヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
本明細書において、アミノ酸残基は次の略号でも記載される：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）；及び任意のアミノ酸残基（Ｘａａ又はＸ）。また本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列は、常法に従って、アミノ末端（以下Ｎ末端という）が左側、カルボキシル末端（以下Ｃ末端という）が右側に位置するように記載される。
本明細書において、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリン（又は抗体）に対する結合能を有するタンパク質をいう。本明細書において、「イムノグロブリン」（Ｉｇ）とは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びこれらのサブクラス等の任意のクラスのイムノグロブリンを含む。本明細書における「抗体」は、イムノグロブリン又は抗原認識部位を含むその断片をいい、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びこれらのサブクラス等の任意のクラスのイムノグロブリン、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｒＩｇＧ等）、１本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、重鎖抗体、ＶＨＨ（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）抗体、これらの変異体などを含み得る。また本明細書における「抗体」は、ヒト化抗体等のキメラ抗体、抗体複合体、および抗原認識部位を含む他のイムノグロブリン修飾体などであってもよい。
本明細書において「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる、単独でイムノグロブリン（又は抗体）結合活性を有するポリペプチドの機能単位をいう。該「イムノグロブリン結合ドメイン」の好ましい例としては、プロテインＬ、プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＭのイムノグロブリン結合ドメイン、ならびにイムノグロブリン結合活性を有するそれらの変異体が挙げられる。
本明細書において、プロテインＬとは、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａによって生産されるタンパク質の１種であるプロテインＬをいう。プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメインの例としては、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ ３１２株が産生するプロテインＬのＢ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ４ドメイン、及びＢ５ドメインや、Ｆ．ｍａｇｎａ ３３１６株が産生するプロテインＬのＣ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ３ドメイン、及びＣ４ドメインが挙げられる。好ましい例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、プロテインＬのＣ４ドメインが挙げられる。
本明細書において、プロテインＡとは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁成分であるプロテインＡをいう。プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインの例としては、プロテインＡのＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、及びＢドメインの改変型ドメインであるＺドメインが挙げられる。好ましい例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、プロテインＡのＣドメインが挙げられる。
本明細書において、プロテインＧとは、Ｇグループの連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の細胞壁成分であるプロテインＧをいう。プロテインＧのイムノグロブリン結合ドメインの例としては、β１ドメイン、β２ドメイン、及びβ３ドメインが挙げられる。好ましい例としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、プロテインＧのβ１ドメインが挙げられる。
本明細書において、プロテインＭとは、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）の細胞壁成分であるプロテインＭをいう。プロテインＭのイムノグロブリン結合ドメインの例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるドメインが挙げられる。
上述したプロテインＬ、プロテインＡ、プロテインＧのイムノグロブリン結合ドメインの情報及びアミノ酸配列は、公開されたデータベースであるＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ：［ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／］）から入手することができる。
イムノグロブリン結合活性を有する上述したイムノグロブリン結合ドメインの変異体としては、配列番号１〜４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合性を有するポリペプチドが挙げられる。
本明細書において、「ｐＨ応答性ペプチド」とは、ｐＨの変化に伴って構造が変化するペプチド、好ましくは、ｐＨの低下によりランダム構造から高次構造に変化するペプチドが挙げられる。ｐＨ応答性ペプチドの好ましい例としては、配列番号５〜９のアミノ酸配列からなるペプチド、（ＩＥＫＫＩＥＡ）ｎ（配列番号１０）又は（ＥＡＱＡ）ｎ（配列番号１１）（いずれもｎは１〜４の整数）のアミノ酸配列からなるペプチド、ならびにこれらのペプチドと少なくとも８５％の配列同一性を有し、かつｐＨの低下によりランダム構造から高次構造に変化するペプチド、が挙げられる。該ｐＨ応答性ペプチドのより好ましい例としては、配列番号５又は６のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
本明細書において、「円順列変異体（circular permutation variant）」とは、変異前のポリペプチド（親ポリペプチド）を円順列変異させた変異体である。すなわち、円順列変異体とは、親ポリペプチドの一次アミノ酸配列の途中が切断されているとともに、親ポリペプチドのアミノ酸配列のＣ末端とＮ末端が連結された構造を有する変異体である。
本明細書において、イムノグロブリン結合ドメインの「モチーフ」とは、該ドメインにおける、へリックス又はシート構造などの二次構造を取ることが推定される構造単位をいう。タンパク質のモチーフ、及びその領域（該タンパク質のアミノ酸配列上での位置）は、該タンパク質の構造情報に基づいて、カブシュとサンダー（Biopolymers, 1983, 22:2577-2637）によるＤＳＳＰアルゴリズムなどの当該分野で公知のアルゴリズムによって推定することができる。タンパク質の構造情報は、前述したＰＤＢデータベース等から入手可能である。
本発明は、イムノグロブリン結合性を有するポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、イムノグロブリン結合ドメインの２つの断片とｐＨ応答性ペプチドとを含む。本発明のポリペプチドに含まれる該イムノグロブリン結合ドメインの２つの断片とは、該イムノグロブリン結合ドメインのＮ末端を含む断片（断片Ａと呼ぶ）、及び該イムノグロブリン結合ドメインのＣ末端を含む断片（断片Ｂと呼ぶ）である。
本発明のポリペプチドに含まれる、該イムノグロブリン結合ドメインの２つの断片（断片Ａ及びＢ）の元となるイムノグロブリン結合ドメイン（元のイムノグロブリン結合ドメインともいう）は、上記に定義したものであればよいが、好ましくは、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１〜４のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合性を有するポリペプチドであり、より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合性を有するポリペプチドである。
好ましくは、本発明のポリペプチドに含まれる該断片Ａ及び断片Ｂにおいて、片方の末端は、それぞれ、元のイムノグロブリン結合ドメインのＮ末端及びＣ末端であり、もう片方の末端は、該元のイムノグロブリン結合ドメイン中のモチーフの末端又はモチーフ間領域に作製される。イムノグロブリン結合ドメインのモチーフ及びモチーフ間領域の情報は、上述したデータベースＰＤＢから入手したドメインの構造情報を基に、公知のアルゴリズムを用いて推定することができる。タンパク質の構造情報に基づくモチーフ領域の推定の手順は、当該分野で公知である。例えば、ＤＳＳＰアルゴリズム（Biopolymers, 1983, 22:2577-2637）を用いることにより、モチーフ領域の推定を行うことができる。また、該元のイムノグロブリン結合ドメインの構造情報が公知でない場合であっても、その相同タンパク質（ホモログ）の構造情報を基に該ドメインのモチーフ及びモチーフ間領域を推定することは可能である。
例えば、元のイムノグロブリン結合ドメインが配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドである場合、配列番号１の２〜９位、１５〜２２位、２４〜３８位、４５〜５３位、及び５５〜６１位がモチーフ領域である。したがって、そのモチーフの末端又はモチーフ間領域とは、配列番号１の９〜１５位、２２〜２４位、３８〜４５位及び５３〜５５位からなる群より選択される領域である。
また例えば、元のイムノグロブリン結合ドメインが配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合性を有するポリペプチドである場合、そのモチーフの末端又はモチーフ間領域は、該ドメイン中のへリックス又はシートなどの二次構造領域の末端又はそれ以外の領域であればよく、例えば、配列番号１の９〜１５位に相当する領域、２２〜２４位に相当する領域、３８〜４５位に相当する領域及び５３〜５５位に相当する領域からなる群より選択される領域であり得る。
また例えば、元のイムノグロブリン結合ドメインが配列番号２のアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合性を有するポリペプチドである場合、そのモチーフの末端又はモチーフ間領域とは、配列番号２の１８〜２４位、及び３６〜３８位からなる群より選択される領域である。また例えば、元のイムノグロブリン結合ドメインが配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合性を有するポリペプチドである場合、そのモチーフの末端又はモチーフ間領域としては、例えば、配列番号２の１８〜２４位に相当する領域、及び３６〜３８位に相当する領域からなる群より選択される領域が挙げられる。
また例えば、元のイムノグロブリン結合ドメインが配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドである場合、そのモチーフの末端又はモチーフ間領域とは、配列番号３の７〜１２位、１７〜２２位、３５〜４２位及び４５〜５０位からなる群より選択される領域である。また例えば、元のイムノグロブリン結合ドメインが配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合性を有するポリペプチドである場合、そのモチーフの末端又はモチーフ間領域としては、例えば、配列番号３の７〜１２位に相当する領域、１７〜２２位に相当する領域、３５〜４２位に相当する領域及び４５〜５０位に相当する領域からなる群より選択される領域が挙げられる。
また例えば、元のイムノグロブリン結合ドメインが配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドである場合、そのモチーフの末端又はモチーフ間領域とは、配列番号４の１０〜１８位、３４〜４８位、５３〜６３位、７１〜７７位、８２〜１１０位、１１３〜１２４位、１２５〜１２９位、１３３〜１３７位、１４５〜１５２位、１５５〜１６４位、１７３〜１７８位、１８４〜１８８位、１９６〜１９９位、２０３〜２１２位、２１９〜２２１位、２２２〜２３４位、２３９〜２４７位、２４８〜２５０位、２５２〜２５８位、２５９〜２７１位、２７３〜２８９位、３００〜３０７位、３０９〜３２０位、３２４〜３３０位、３４２〜３４７位、３５３〜３５７位、３６３〜３７２位および３８０〜３８２位からなる群より選択される領域である。また例えば、元のイムノグロブリン結合ドメインが配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合性を有するポリペプチドである場合、そのモチーフの末端又はモチーフ間領域としては、例えば、配列番号４の１０〜１８位に相当する領域、３４〜４８位に相当する領域、５３〜６３位に相当する領域、７１〜７７位に相当する領域、８２〜１１０位に相当する領域、１１３〜１２４位に相当する領域、１２５〜１２９位に相当する領域、１３３〜１３７位に相当する領域、１４５〜１５２位に相当する領域、１５５〜１６４位に相当する領域、１７３〜１７８位に相当する領域、１８４〜１８８位に相当する領域、１９６〜１９９位に相当する領域、２０３〜２１２位に相当する領域、２１９〜２２１位に相当する領域、２２２〜２３４位に相当する領域、２３９〜２４７位に相当する領域、２４８〜２５０位に相当する領域、２５２〜２５８位に相当する領域、２５９〜２７１位に相当する領域、２７３〜２８９位に相当する領域、３００〜３０７位に相当する領域、３０９〜３２０位に相当する領域、３２４〜３３０位に相当する領域、３４２〜３４７位に相当する領域、３５３〜３５７位に相当する領域、３６３〜３７２位に相当する領域および３８０〜３８２位に相当する領域からなる群より選択される領域が挙げられる。
断片ＡのＣ末端の残基と、断片ＢのＮ末端の残基とは、元のイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列上で互いに隣接する残基であってもよく、あるいは、元のイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列上で１つ以上のモチーフ又はモチーフ間領域の分だけ互いに離れた位置にある残基であってもよい。例えば、断片ＡのＣ末端は、元のイムノグロブリン結合ドメインの任意のモチーフのＣ末端であり、断片ＢのＮ末端は、その隣（３’側）のモチーフのＮ末端であり、それらのモチーフ間の領域は、本発明のポリペプチドからは失われていてもよい。
本発明のポリペプチドの好ましい実施形態において、断片Ａ及び断片Ｂは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなりイムノグロブリン結合性を有するポリペプチドの断片であり、かつ断片ＡのＣ末端及び断片ＢのＮ末端は、それぞれ配列番号１の１０位及び１４位に相当する位置、それぞれ配列番号１の２２位と２４位に相当する位置、それぞれ配列番号１の３８位と４５位に相当する位置、又は、それぞれ配列番号１の５３位及び５４位に相当する位置である、該ポリペプチドのモチーフの末端又はモチーフ間領域に作製される。
本発明のポリペプチドに含まれるｐＨ応答性ペプチドとしては、上記に定義したものであればよいが、好ましくは、配列番号５〜９のアミノ酸配列からなるペプチド、（ＩＥＫＫＩＥＡ）ｎ（配列番号１０）又は（ＥＡＱＡ）ｎ（配列番号１１）（いずれもｎは１〜４の整数）のアミノ酸配列からなるペプチド、ならびにこれらのペプチドと少なくとも８５％の配列同一性を有し、かつｐＨの低下によりランダム構造から高次構造に変化するペプチド、が挙げられ、好ましくは配列番号５又は６のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
好ましい実施形態において、該ｐＨ応答性ペプチドは、本発明のポリペプチドの末端に位置しない。より好ましい実施形態において、該ｐＨ応答性ペプチドの両端は、断片ＡのＮ末端と、断片ＢのＣ末端とに連結されている、すなわち、断片ＢのＣ末端と断片ＡのＮ末端との間に位置する。
本発明のポリペプチドは、イムノグロブリン結合ドメインの断片とｐＨ応答性ペプチドとを含む融合ポリペプチドを調製することにより製造することができる。本発明のポリペプチドは、イムノグロブリン結合ドメインの断片とｐＨ応答性ペプチドとを含む、イムノグロブリン結合性融合ポリペプチドである。
本発明のポリペプチドの製造方法の一実施形態においては、イムノグロブリン結合ドメインの断片（上述した断片Ａ及びＢ）を調製し、該断片ＡのＮ末端と、該断片ＢのＣ末端とにｐＨ応答性ペプチドを連結することにより、イムノグロブリン結合ドメインの断片とｐＨ応答性ペプチドとを含む融合ポリペプチドを調製することができる。
本発明のポリペプチドの製造方法の別の一実施形態においては、イムノグロブリン結合ドメインのＮ末端とＣ末端とをｐＨ応答性ペプチドを介して連結することと、該イムノグロブリン結合ドメインに新たな末端を作製することにより、該融合ポリペプチドを調製することができる。この際、該ｐＨ応答性ペプチドを介した末端の連結と、該新たな末端の作製との順序には限定はなく、いずれを先に行ってもよい。好ましくは、該新たな末端の作製は、該イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端のアミノ酸とモチーフ間領域の末端のアミノ酸との間を切断するか、又はモチーフ間領域のアミノ酸配列を切断もしくは切除することを含む。
したがって、本発明のポリペプチドは、好ましくは、ｐＨ応答性ペプチドを挿入されたイムノグロブリン結合ドメインの円順列変異体である。該円順列変異体においては、該ｐＨ応答性ペプチドは、該イムノグロブリン結合ドメインの元来のＮ末端とＣ末端との間に挿入されている。好ましくは、該円順列変異体においては、該イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端のアミノ酸とモチーフ間領域の末端のアミノ酸との間が切断されるか、又はモチーフ間領域のアミノ酸配列が切断もしくは切除されて、新たな末端が作製されている。
本発明のポリペプチドの製造方法に用いられるイムノグロブリン結合ドメイン、及びそれらのモチーフの末端又はモチーフ間領域、ならびにｐＨ応答性ペプチドの好ましい例については、上述したとおりである。
したがって、本発明のポリペプチドの好ましい例としては、Ｎ末端側から順に、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列（以下、親アミノ酸配列という）における配列番号１の１４位に相当する位置から該アミノ酸配列のＣ末端までの領域からなるポリペプチドと、ｐＨ応答性ペプチドと、該親アミノ酸配列における配列番号１の１位〜１０位に相当する領域からなるポリペプチドと、を含むポリペプチドが挙げられる。より好ましい例としては、Ｎ末端側から順に、親アミノ酸配列における配列番号１の１４位に相当する位置から該アミノ酸配列のＣ末端までの領域からなるポリペプチドと、ｐＨ応答性ペプチドと、該親アミノ酸配列における配列番号１の１位〜１０位に相当する領域からなるポリペプチドと、からなるポリペプチドが挙げられる。
本発明のポリペプチドの別の好ましい例としては、Ｎ末端側から順に、親アミノ酸配列における配列番号１の２４位に相当する位置から該アミノ酸配列のＣ末端までの領域からなるポリペプチドと、ｐＨ応答性ペプチドと、該親アミノ酸配列における配列番号１の１位〜２２位に相当する領域からなるポリペプチドと、を含むポリペプチドが挙げられる。より好ましい例としては、Ｎ末端側から順に、親アミノ酸配列における配列番号１の２４位に相当する位置から該アミノ酸配列のＣ末端までの領域からなるポリペプチドと、ｐＨ応答性ペプチドと、該親アミノ酸配列における配列番号１の１位〜２２位に相当する領域からなるポリペプチドと、からなるポリペプチドが挙げられる。
本発明のポリペプチドの別の好ましい例としては、Ｎ末端側から順に、親アミノ酸配列における配列番号１の４５位に相当する位置から該アミノ酸配列のＣ末端までの領域からなるポリペプチドと、ｐＨ応答性ペプチドと、該親アミノ酸配列における配列番号１の１位〜３８位に相当する領域からなるポリペプチドと、を含むポリペプチドが挙げられる。より好ましい例としては、Ｎ末端側から順に、親アミノ酸配列における配列番号１の４５位に相当する位置から該アミノ酸配列のＣ末端までの領域からなるポリペプチドと、ｐＨ応答性ペプチドと、該親アミノ酸配列における配列番号１の１位〜３８位に相当する領域からなるポリペプチドと、からなるポリペプチドが挙げられる。
本発明のポリペプチドの別の好ましい例としては、Ｎ末端側から順に、親アミノ酸配列における配列番号１の５５位に相当する位置から該アミノ酸配列のＣ末端までの領域からなるポリペプチドと、ｐＨ応答性ペプチドと、該親アミノ酸配列における配列番号１の１位〜５３位に相当する領域からなるポリペプチドと、を含むポリペプチドが挙げられる。より好ましい例としては、Ｎ末端側から順に、親アミノ酸配列における配列番号１の５５位に相当する位置から該アミノ酸配列のＣ末端までの領域からなるポリペプチドと、ｐＨ応答性ペプチドと、該親アミノ酸配列における配列番号１の１位〜５３位に相当する領域からなるポリペプチドと、からなるポリペプチドが挙げられる。
本発明のポリペプチドのより好ましい例としては、配列番号１２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの４９位と５０位との間にｐＨ応答性ペプチドが挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。該ｐＨ応答性ペプチドとしては、配列番号５〜１１のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられ、好ましくは配列番号５又は６のアミノ酸配列からなるペプチドである。本発明のポリペプチドのさらに好ましい例としては、配列番号１３又は１４のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
上記に例示した本発明のポリペプチドは、末端にリンカーもしくはスペーサーペプチドや、タグ配列などをさらに含んでいてもよい。これらの本発明のポリペプチドは、イムノグロブリン結合性を有する。
さらに、イムノグロブリン結合性を有する限りにおいて、該本発明のポリペプチドを複数個組み合わせてもよい。したがって本発明は、上述した本発明のポリペプチドを１個以上含むイムノグロブリン結合タンパク質を提供する。本発明のイムノグロブリン結合タンパク質に含まれる該本発明のポリペプチドの数は、１個以上であればよいが、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上である。また本発明のイムノグロブリン結合タンパク質に含まれる該本発明のポリペプチドの数は、好ましくは６個以下、より好ましくは５個以下である。例えば、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、本発明のポリペプチドを、好ましくは２〜６個、より好ましくは３〜５個有し得る。さらに、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、該本発明のポリペプチドの間のリンカーもしくはスペーサーペプチド、末端にタグ配列やリンカーもしくはスペーサーペプチド、などを有していてもよい。本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の好ましい例としては、配列番号１５又は１６のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
本発明のポリペプチド又はイムノグロブリン結合タンパク質は、当該分野で公知の手法、例えばアミノ酸配列に基づく化学合成法、リコンビナント法などにより製造することができる。例えば、該本発明のポリペプチドは、それをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ等）をアミノ酸配列に基づいて設計し、得られたポリヌクレオチドをベクターに組み込み、このベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培地中で培養し、発現したポリペプチドを回収することにより得ることができる。
形質転換に用いられる宿主としては、大腸菌などの細菌、酵母、真菌などの微生物が挙げられ、大腸菌が好ましい。形質転換に用いられるベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクター（プラスミド等）のいずれをも用いることができ、発現ベクターが好ましい。好ましい発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１）などに記載されているプラスミドが挙げられる。形質転換の手段としては、各宿主に応じて当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の方法を利用することができる。得られた形質転換体（例えば微生物細胞）を培養して発現されたポリペプチドを回収する方法は、当業者によく知られている。あるいは、該本発明のポリペプチドは、無細胞タンパク質合成系を用いて発現させてもよい。
本発明のポリペプチドを２個以上含む本発明のイムノグロブリン結合タンパク質を製造する場合、該本発明のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製し、これを前述した手順でベクターに組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養して、発現した目的タンパク質を回収すればよい。
したがって、本発明はまた、上述した本発明のポリペプチド又はイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、それを含むベクター、及び該ポリヌクレオチド又はベクターを含む形質転換体を提供する。
上述した本発明のポリペプチド又はイムノグロブリン結合タンパク質は、アフィニティーリガンドとして使用することができる。本発明のポリペプチド又はイムノグロブリン結合タンパク質を固相担体に固定化することによって、本発明のアフィニティー担体を製造することができる。
あるいは、本発明は、イムノグロブリン結合領域とｐＨ応答性ペプチドとを有するポリペプチドを含むイムノグロブリン結合タンパク質と、該イムノグロブリン結合タンパク質が結合した固相担体とを含むアフィニティー担体を提供する。当該アフィニティー担体において、該イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる該イムノグロブリン結合領域とｐＨ応答性ペプチドとを有するポリペプチドの数は、１つ以上であればよく、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上、かつ好ましくは６個以下、より好ましくは５個以下であり、例えば、２〜６個、好ましくは３〜５個である。また、当該ｐＨ応答性ペプチドの好ましい例については、上述したとおりである。
該イムノグロブリン結合領域とｐＨ応答性ペプチドとを有するポリペプチドに含まれる該イムノグロブリン結合領域は、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインであるか、又は該ドメインの一部である断片からなるイムノグロブリン結合性を有するペプチドである。より好ましくは、該イムノグロブリン結合領域とｐＨ応答性ペプチドとを有するポリペプチドは、上述した本発明により提供されるイムノグロブリン結合性を有するポリペプチドである。さらに好ましくは、該イムノグロブリン結合領域とｐＨ応答性ペプチドとを有するポリペプチドは、該ｐＨ応答性ペプチドを挿入された、該配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの円順列変異体である。該円順列変異体においては、該ｐＨ応答性ペプチドは、該イムノグロブリン結合ドメインの元来のＮ末端とＣ末端との間に挿入されている。好ましくは、該円順列変異体においては、該イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端のアミノ酸とモチーフ間領域の末端のアミノ酸との間が切断されるか、又はモチーフ間領域のアミノ酸配列が切断もしくは切除されて、新たな末端が作製されている。配列番号１〜４のアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端又はモチーフ間領域については、上述したとおりである。
本発明のアフィニティー担体に用いられる固相担体は、好ましくは不溶性担体である。好ましくは、本発明のアフィニティー担体は、アフィニティークロマトグラフィー用担体である。
当該固相担体としては、合成高分子系支持体、天然高分子系支持体等の有機系支持体；無機系支持体；これらを組み合わせた有機−有機複合系支持体や有機−無機複合系支持体等が挙げられる。合成高分子系支持体としては、例えば、ポリビニルアルコール類、ポリ（メタ）アクリレート類、ポリ（メタ）アクリルアミド類、ポリスチレン類、エチレン−無水マレイン酸共重合物等で構成されるものが挙げられる。天然高分子系支持体としては、例えば、アガロース、デキストラン、マンナン、セルロース等の多糖類で構成されるものが挙げられる。また、これを物理架橋や化学架橋したものでもよい。無機系支持体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、金属、金属酸化物等で構成されるものが挙げられる。これらの中でも、流速特性の観点から、合成高分子系支持体が好ましい。本発明のアフィニティー担体は、支持体として合成高分子系支持体を使用した場合でも、防汚性を充分に備える。合成高分子系支持体としては、単官能不飽和モノマーと多官能不飽和モノマーとの共重合体が好ましく、単官能不飽和モノマーとしては、エポキシ基又は開環エポキシ基をもつ単官能不飽和モノマーが好ましい。該共重合体における多官能不飽和モノマーの使用量は、単官能不飽和モノマー１００質量部に対して、通常１質量部以上であり、一方、通常１００質量部以下、好ましくは５０質量部以下である。
支持体は、非多孔質でも多孔質でもよいが、多孔質であることが好ましい。また、支持体の形態は、粒子状、モノリス状、板状、チップ状、繊維状、膜状（中空糸を含む）等のいずれでもよいが、標的物質捕捉特性の観点から、粒子状、モノリス状、板状、繊維状、膜状が好ましく、粒子状がより好ましい。
支持体が粒子である場合、その粒径は、流速特性の観点から、好ましくは３０μｍ以上であり、また、標的物質捕捉特性の観点から、好ましくは３００μｍ以下である。斯かる粒径は、重合する際の条件や分級等により調整できる。なお、本発明における「粒径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置により得られる体積平均粒子径を意味する。
支持体が多孔質粒子である場合、その比表面積は、孔径１０〜５０００ｎｍの範囲に相当するポアを測定したときに、ポアサイズ１０ｎｍ〜５０００ｎｍにおける比表面積で、好ましくは７０ｍ2／ｇ以上であり、より好ましくは９０ｍ2／ｇ以上である。なお、本発明における「比表面積」とは、水銀ポロシメータにより得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の有する表面積を粒子の乾燥質量で除した値である。
支持体は、市販品を用いても、常法に従い合成したものを用いてもよい。例えば、合成高分子系支持体は、特公昭５８−０５８０２６号公報、特開昭５３−０９０９９１号公報等に記載の公知の方法に従って得ることができる。
当該固相担体へのリガンド（本発明のポリペプチド又はイムノグロブリン結合タンパク質）の結合方法としては、タンパク質を担体に固定化する一般的方法を用いて行うことができる。例えば、カルボキシ基を有する担体を用い、このカルボキシ基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドにより活性化させリガンドのアミノ基と反応させる方法；アミノ基又はカルボキシ基を有する担体を用い、水溶性カルボジイミド等の脱水縮合剤存在下でリガンドのカルボキシ基又はアミノ基と反応させアミド結合を形成する方法；水酸基を有する担体を用い、臭化シアン等のハロゲン化シアンで活性化させてリガンドのアミノ基と反応させる方法；担体の水酸基をトシル化又はトレシル化しリガンドのアミノ基と反応させる方法；ビスエポキシド、エピクロロヒドリン等によりエポキシ基を担体に導入し、リガンドのアミノ基、水酸基又はチオール基と反応させる方法；エポキシ基を有する担体を用い、リガンドのアミノ基又、水酸基又はチオール基と反応させる方法、などが挙げられる。上記のうち、反応を実施する水溶液中での安定性の観点からは、エポキシ基を介してリガンドを結合させる方法が望ましい。
エポキシ基が開環して生成する開環エポキシ基であるアルコール性水酸基は、担体表面を親水化し、タンパク質などの非特異吸着を防止すると共に、水中で担体の靱性を向上させ、高流速下の担体の破壊を防止する役割を果たす。したがって、リガンドを固定化させた後の担体中にリガンドと結合していない残余のエポキシ基が存在している場合、当該残余のエポキシ基を開環させることが好ましい。担体中のエポキシ基の開環方法としては、例えば、水溶媒中で、酸又はアルカリにより、加熱又は室温で該担体を撹拌する方法を挙げることができる。また、メルカプトエタノール、チオグリセロール等のメルカプト基を有するブロッキング剤やモノエタノールアミン等のアミノ基を有するブロッキング剤で、エポキシ基を開環させても良い。より好ましい開環エポキシ基は、担体に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得られる開環エポキシ基である。チオグリセロールは、原料としてメルカプトエタノール等よりも毒性が低く、またチオグリセロールが付加したエポキシ開環基は、アミノ基を有するブロッキング剤による開環基よりも非特異吸着が低い上に、動的結合量が高くなる、といった利点を有する。
必要に応じて、固相担体とリガンドの間に任意の長さの分子（スペーサー）を導入してもよい。スペーサーの例としては、ポリメチレン鎖、ポリエチレングリコール鎖、糖類などが挙げられる。
本発明のアフィニティー担体は、イムノグロブリン又は抗体の単離に使用することができる。したがって、本発明はさらに、本発明のアフィニティー担体を用いる、イムノグロブリン又は抗体の単離方法を提供する。本発明で単離されるイムノグロブリン又は抗体の例としては、上記に定義したとおりである。
本発明の一実施形態に係るイムノグロブリン又は抗体の単離方法を説明する。本実施形態に係るイムノグロブリン又は抗体の単離方法は、好適には、リガンド（上述した本発明のポリペプチド又はイムノグロブリン結合タンパク質）を固定化したアフィニティー担体に、目的物質（イムノグロブリン又は抗体）を含有する試料を通液し、該担体に該目的物質を吸着させる工程（第一の工程）、及び、該担体から該目的物質を溶出させる工程（第二の工程）を含む。
当該第一の工程では、本発明のアフィニティー担体を充填したカラム等に、目的物質を含有する試料を、該目的物質がリガンドに吸着する条件にて流す。この第一の工程では、試料中の目的物質以外の物質のほとんどは、リガンドに吸着されずカラムを通過する。この後、必要に応じて、リガンドに弱く保持された一部の物質を除去するため、担体をＮａＣｌなどの塩を含む中性の緩衝液で洗浄してもよい。
当該第二の工程では、酸性の溶離液を流し、リガンドに吸着された目的物質を溶出させる。この溶出液を回収することで、試料から目的とするイムノグロブリン又は抗体を単離することができる。該溶離液のｐＨは、好ましくは２以上、より好ましくは２．５以上、さらに好ましくは３以上であり、一方、好ましくは５以下、より好ましくは４以下、さらに好ましくは３．５以下である。例えば、該溶離液のｐＨは、好ましくは２〜５、より好ましくは２．５〜４、さらに好ましくは３〜３．５である。
本発明によるイムノグロブリン又は抗体の単離方法の一実施形態において、単離されたイムノグロブリン又は抗体は、抗体医薬等として使用される。したがって、一実施形態において、本発明は、本発明のアフィニティー担体を用いる抗体医薬等の製造方法を提供する。当該方法の手順は、抗体医薬等に使用すべき目的のイムノグロブリン又は抗体を含有する試料を用いる以外は、基本的に上述したイムノグロブリン又は抗体の単離方法の手順と同様である。
以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。
〔製造例〕
ＰｒＬ円順列変異体を含むイムノグロブリン結合タンパク質の調製
プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメイン（ＰｒＬ）の円順列変異体とｐＨ応答性ペプチドとの融合タンパク質を含むイムノグロブリン結合タンパク質ｃｐＰｒＬｔ−１（配列番号１５）及びｃｐＰｒＬｔ−２（配列番号１６）を調製した。
イムノグロブリン結合タンパク質ｃｐＰｒＬｔ−１及びｃｐＰｒＬｔ−２は、リンカーペプチド（配列番号１７）を介して連結された４個の融合タンパク質ｃｐＰｒＬ−１及びｃｐＰｒＬ−２をそれぞれ有し、かつＮ末端に挿入された精製タグ配列（配列番号１８）を有するホモテトラマーである。融合タンパク質ｃｐＰｒＬ−１（配列番号１３）及びｃｐＰｒＬ−２（配列番号１４）は、ＰｒＬ（配列番号１）の１０位アミノ酸に新たなＣ末端、１４位アミノ酸に新たなＮ末端を有し、かつＰｒＬの元のＣ末端（１位）とＮ末端（６２位）とがｐＨ応答性ペプチド（配列番号５又は６）を介して連結されている、ＰｒＬの円順列変異体とｐＨ応答性ペプチドとの融合タンパク質である（図１）。
ｃｐＰｒＬｔ−１及びｃｐＰｒＬｔ−２の発現と精製は以下のように行った。ｃｐＰｒＬｔ−１又はｃｐＰｒＬｔ−２をコードするプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）を形質転換し、得られた形質転換体を富栄養培地中３７℃で対数増殖期まで培養した。その後、終濃度１ｍＭイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を添加して、さらに３７℃で４時間培養することにより、融合タンパク質を発現させた。続いて培養液を遠心して上清を除き、得られた菌体に卵白由来リゾチーム（和光純薬工業社製）及びポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業社製）を含むｐＨ９．５の３０ｍＭトリス緩衝液を添加することで菌体を破砕した。破砕液を遠心して不溶性画分を除き、さらにＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）を装着したアミコンプロ精製システム（メルクミリポア社製）を用いて融合タンパク質の精製、濃縮及び脱塩を行った。
同様の手順で、ＰｒＬのテトラマーであるイムノグロブリン結合タンパク質（ＰｒＬｔ、配列番号１９）の発現と精製を行った。
〔試験例〕
酸溶出効率の測定
製造例で調製したイムノグロブリン結合タンパク質からのヒトＩｇＧ−Ｆａｂの酸溶出効率を測定した。測定は、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ３８４システム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いて、以下の手順で行った。
１）ＩｇＧ−Ｆａｂ結合バイオセンサーの調製
ＡＲ２Ｇバイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を、２０ｍＭ１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（東京化成工業社製）／１０ｍＭＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）水溶液を用いて活性化した後、ｐＨ６．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純薬工業社製）で希釈したヒトＩｇＧ−Ｆａｂを反応させ、センサー上にヒトＩｇＧ−Ｆａｂを固定化した。センサー上の未反応の活性基は、ｐＨ８．５の１Ｍエタノールアミンを用いてクエンチした。
２）試薬調製
以下の試薬溶液を調製した。
洗浄バッファ：ｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）／１５０ｍＭ塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）／０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（和光純薬工業社製）水溶液
ｐＨ３．０バッファ及びｐＨ２．５バッファ：それぞれｐＨ３．０及びｐＨ２．５の、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム／０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート水溶液
試料溶液：ｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム／０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート水溶液中に希釈した１０μｇ/ｍＬイムノグロブリン結合タンパク質（ＰｒＬｔ、ｃｐＰｒＬｔ−１、又はｃｐＰｒＬｔ−２）
３）測定
１）で調製したＩｇＧ−Ｆａｂ結合バイオセンサーを洗浄バッファに接触させ、次いで試料溶液に接触させて、センサー上のヒトＩｇＧ−Ｆａｂに製造例で調製したイムノグロブリン結合タンパク質を結合させた。このバイオセンサーを再び洗浄バッファに接触させた後、ｐＨ３．０バッファ又はｐＨ２．５バッファに接触させて、イムノグロブリン結合タンパク質をヒトＩｇＧ−Ｆａｂから解離させた。該バイオセンサーにおけるイムノグロブリン結合タンパク質の結合前後及び解離前後でのＯｃｔｅｔ ＲＥＤ ３８４によるセンサグラムを測定した（サンプル）。ブランクとして、試料溶液の代わりに洗浄バッファを接触させたバイオセンサーからのセンサグラムを測定した。サンプルのセンサグラムからブランクのセンサグラムを差し引いた。
４）酸溶出効率の算出
Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ３８４では、バイオセンサーから反射される干渉波のセンサグラムを測定する。測定された干渉波の波長シフトの大きさにより、センサーへのイムノグロブリン結合タンパク質の結合動態を評価することができる。イムノグロブリン結合タンパク質の酸溶出効率は、以下の式により計算した。
ｐＨ３．０での酸溶出効率
＝（ｐＨ３．０バッファ接触後のセンサグラム値−ｐＨ３．０バッファ接触前のセンサグラム値）／（イムノグロブリン結合タンパク質溶液接触後のセンサグラム値−イムノグロブリン結合タンパク質溶液接触前のセンサグラム値）
ｐＨ２．５での酸溶出効率
＝（ｐＨ２．５バッファ接触後のセンサグラム値−ｐＨ２．５バッファ接触前のセンサグラム値）／（イムノグロブリン結合タンパク質溶液接触後のセンサグラム値−イムノグロブリン結合タンパク質溶液接触前のセンサグラム値）
結果を表１に示す。ｐＨ応答性ペプチドを挿入したＰｒＬ変異体を含むｃｐＰｒＬｔ−１及びｃｐＰｒＬｔ−２では、ｐＨ応答性ペプチドを含まないＰｒＬｔと比較して、ｐＨ３．０及びｐＨ２．５いずれの条件でも酸溶出効率が改善された。
Figure 2021103942

Claims (33)

  1. イムノグロブリン結合ドメインの２つの断片と、ｐＨ応答性ペプチドとを含み、
    該イムノグロブリン結合ドメインの２つの断片が、
    断片Ａ：該イムノグロブリン結合ドメインのＮ末端を含む断片、及び
    断片Ｂ：該イムノグロブリン結合ドメインのＣ末端を含む断片
    であり、
    該イムノグロブリン結合ドメインが、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合性を有するものである、
    ポリペプチド。
  2. イムノグロブリン結合性を有する、請求項１記載のポリペプチド。
  3. 前記ｐＨ応答性ペプチドが前記ポリペプチドの末端に位置しない、請求項１又は２記載のポリペプチド。
  4. 前記ｐＨ応答性ペプチドが前記断片ＡのＮ末端と、前記断片ＢのＣ末端とに連結されている、請求項３記載のポリペプチド。
  5. 前記ポリペプチドが、前記ｐＨ応答性ペプチドを挿入された前記イムノグロブリン結合ドメインの円順列変異体である、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリペプチド。
  6. 前記ｐＨ応答性ペプチドが、前記円順列変異体における、前記イムノグロブリン結合ドメインの元来のＮ末端とＣ末端との間に挿入されている、請求項５記載のポリペプチド。
  7. 前記円順列変異体が、前記イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端のアミノ酸とモチーフ間領域の末端のアミノ酸との間を切断するか、又はモチーフ間領域のアミノ酸配列が切断もしくは切除されている変異体である、請求項５又は６記載のポリペプチド。
  8. 前記ポリペプチドの両末端が、それぞれ前記断片Ａと断片Ｂに含まれる、前記イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端又はモチーフ間領域に位置する、請求項１〜７のいずれか１項記載のポリペプチド。
  9. 前記イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端又はモチーフ間領域が、
    配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号１のアミノ酸配列の９〜１５位、２２〜２４位、３８〜４５位又は５３〜５５位に相当する領域であるか、
    配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号２のアミノ酸配列の１８〜２４位、又は３６〜３８位に相当する領域であるか、
    配列番号３のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号３のアミノ酸配列の７〜１２位、１７〜２２位、３５〜４２位、又は４５〜５０位に相当する領域であるか、
    配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号４のアミノ酸配列の１０〜１８位、３４〜４８位、５３〜６３位、７１〜７７位、８２〜１１０位、１１３〜１２４位、１２５〜１２９位、１３３〜１３７位、１４５〜１５２位、１５５〜１６４位、１７３〜１７８位、１８４〜１８８位、１９６〜１９９位、２０３〜２１２位、２１９〜２２１位、２２２〜２３４位、２３９〜２４７位、２４８〜２５０位、２５２〜２５８位、２５９〜２７１位、２７３〜２８９位、３００〜３０７位、３０９〜３２０位、３２４〜３３０位、３４２〜３４７位、３５３〜３５７位、３６３〜３７２位、又は３８０〜３８２位に相当する領域である、
    請求項７又は８記載のポリペプチド。
  10. 前記ｐＨ応答性ペプチドが、ｐＨの変化に伴って構造が変化するペプチドである、請求項１〜９のいずれか１項記載のポリペプチド。
  11. 前記ｐＨ応答性ペプチドが、配列番号５〜１１のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリペプチド。
  12. 請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリペプチドを１個以上含む、イムノグロブリン結合タンパク質。
  13. 請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリペプチド又は請求項１２に記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  14. 請求項１３記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  15. 請求項１３記載のポリヌクレオチド又は請求項１４記載のベクターを含む形質転換体。
  16. 請求項１５記載の形質転換体を培養することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリペプチド又は請求項１２記載のイムノグロブリン結合タンパク質の製造方法。
  17. 固相担体と、該担体に結合した請求項１２記載のイムノグロブリン結合タンパク質とを含む、アフィニティー担体。
  18. 請求項１７記載のアフィニティー担体を用いる、抗体の単離方法。
  19. イムノグロブリン結合性融合ポリペプチドの製造方法であって、
    イムノグロブリン結合ドメインの断片とｐＨ応答性ペプチドとを含む融合ポリペプチドを調製することを含み、
    該融合ポリペプチドの調製が、
    該イムノグロブリン結合ドメインのＮ末端とＣ末端とを該ｐＨ応答性ペプチドを介して連結することと、
    該イムノグロブリン結合ドメインに新たな末端を作製することと、
    を含み、
    該イムノグロブリン結合ドメインが、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合性を有するものである、
    方法。
  20. 前記イムノグロブリン結合性融合ポリペプチドが、前記ｐＨ応答性ペプチドを挿入された前記イムノグロブリン結合ドメインの円順列変異体である、請求項１９記載の方法。
  21. 前記イムノグロブリン結合ドメインの新たな末端の作製が、該イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端のアミノ酸とモチーフ間領域の末端のアミノ酸との間を切断するか、又はモチーフ間領域のアミノ酸配列を切断もしくは切除することを含む、請求項１９又は２０記載の方法。
  22. 前記イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端又はモチーフ間領域が、
    配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号１のアミノ酸配列の９〜１５位、２２〜２４位、３８〜４５位又は５３〜５５位に相当する領域であるか、
    配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号２のアミノ酸配列の１８〜２４位、又は３６〜３８位に相当する領域であるか、
    配列番号３のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号３のアミノ酸配列の７〜１２位、１７〜２２位、３５〜４２位、又は４５〜５０位に相当する領域であるか、
    配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号４のアミノ酸配列の１０〜１８位、３４〜４８位、５３〜６３位、７１〜７７位、８２〜１１０位、１１３〜１２４位、１２５〜１２９位、１３３〜１３７位、１４５〜１５２位、１５５〜１６４位、１７３〜１７８位、１８４〜１８８位、１９６〜１９９位、２０３〜２１２位、２１９〜２２１位、２２２〜２３４位、２３９〜２４７位、２４８〜２５０位、２５２〜２５８位、２５９〜２７１位、２７３〜２８９位、３００〜３０７位、３０９〜３２０位、３２４〜３３０位、３４２〜３４７位、３５３〜３５７位、３６３〜３７２位、又は３８０〜３８２位に相当する領域である、
    請求項２１記載の方法。
  23. 前記ｐＨ応答性ペプチドが、ｐＨの変化に伴って構造が変化するペプチドである、請求項１９〜２２のいずれか１項記載の方法。
  24. 前記ｐＨ応答性ペプチドが、配列番号５〜１１のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１９〜２３のいずれか１項記載の方法。
  25. イムノグロブリン結合領域とｐＨ応答性ペプチドとを有するポリペプチドを含むイムノグロブリン結合タンパク質と、前記イムノグロブリン結合タンパク質が結合した固相担体とを含む、アフィニティー担体。
  26. 前記ｐＨ応答性ペプチドが、ｐＨの変化に伴って構造が変化するペプチドである、請求項２５記載のアフィニティー担体。
  27. 前記イムノグロブリン結合領域が、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、又は該ドメインの一部である断片からなるイムノグロブリン結合性を有するペプチドである、請求項２５又は２６記載のアフィニティー担体。
  28. 前記ｐＨ応答性ペプチドが前記ポリペプチドの末端に位置しない、請求項２５〜２７のいずれか１項記載のアフィニティー担体。
  29. 前記ポリペプチドが、前記ｐＨ応答性ペプチドを挿入された前記イムノグロブリン結合ドメインの円順列変異体である、請求項２７又は２８記載のアフィニティー担体。
  30. 前記円順列変異体が、前記イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端のアミノ酸とモチーフ間領域の末端のアミノ酸との間を切断するか、又はモチーフ間領域のアミノ酸配列が切断もしくは切除されている変異体である、請求項２９記載のアフィニティー担体。
  31. 前記イムノグロブリン結合ドメインのモチーフの末端又はモチーフ間領域が、
    配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号１のアミノ酸配列の９〜１５位、２２〜２４位、３８〜４５位又は５３〜５５位に相当する領域であるか、
    配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号２のアミノ酸配列の１８〜２４位、又は３６〜３８位に相当する領域であるか、
    配列番号３のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号３のアミノ酸配列の７〜１２位、１７〜２２位、３５〜４２位、又は４５〜５０位に相当する領域であるか、
    配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列における、配列番号４のアミノ酸配列の１０〜１８位、３４〜４８位、５３〜６３位、７１〜７７位、８２〜１１０位、１１３〜１２４位、１２５〜１２９位、１３３〜１３７位、１４５〜１５２位、１５５〜１６４位、１７３〜１７８位、１８４〜１８８位、１９６〜１９９位、２０３〜２１２位、２１９〜２２１位、２２２〜２３４位、２３９〜２４７位、２４８〜２５０位、２５２〜２５８位、２５９〜２７１位、２７３〜２８９位、３００〜３０７位、３０９〜３２０位、３２４〜３３０位、３４２〜３４７位、３５３〜３５７位、３６３〜３７２位、又は３８０〜３８２位に相当する領域である、
    請求項３０記載のアフィニティー担体。
  32. 前記ｐＨ応答性ペプチドが、配列番号５〜１１のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項２５〜３１のいずれか１項記載のアフィニティー担体。
  33. 請求項２５〜３２のいずれか１項記載のアフィニティー担体を用いる、抗体の単離方法。
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ATE250628T1 (de) * 1993-10-14 2003-10-15 Scripps Research Inst Rohr bestehend aus zyklischen peptiden
WO2015050153A1 (ja) * 2013-10-04 2015-04-09 独立行政法人産業技術総合研究所 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ部分を有するタンパク質に対するアフィニティを有する複数のドメイン間をリンカーで結合させて成るタンパク質
EP3099320A4 (en) * 2014-01-31 2018-04-18 The Scripps Research Institute Protein m related immunoglobulin-binding polypeptides
US10435732B2 (en) * 2014-06-09 2019-10-08 Kaneka Corporation Method for producing recombinant proteins using recombinant brevibacillus
WO2016049761A1 (en) * 2014-09-30 2016-04-07 Bioastra Technologies Inc. Stimuli-responsive protein-polymer conjugates for bioseparation

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