WO2017022672A1 - 免疫グロブリン結合性改変型タンパク質 - Google Patents

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WO2017022672A1
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正克 西八條
史憲 鴻池
中野　喜之
昌行 高野
敬太 山下
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株式会社カネカ
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Definitions

  • the present invention relates to a protein that specifically binds to a target substance, a ligand affinity separation matrix on which the protein is immobilized, and a separation and purification method using the matrix.
  • One of the important functions of a protein is a function of specifically binding to a specific molecule. This function plays an important role in immune responses and signal transduction in vivo. On the other hand, technology development that uses this function for separation and purification of useful substances has been actively conducted.
  • One example that is actually used industrially is a protein A affinity separation matrix that is used to purify (capturing) antibody drugs from animal cell cultures with high purity at once.
  • the antibody drugs that have been developed are basically monoclonal antibodies, and are produced in large quantities using recombinant cultured cell technology.
  • “Monoclonal antibody” refers to an antibody obtained from a clone derived from a single antibody-producing cell.
  • Most antibody drugs currently on the market are immunoglobulin G (IgG) subclass in terms of molecular structure.
  • Protein A is one of the cell wall proteins produced by the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus.
  • Signal sequence S five immunoglobulin binding domains (E domain, D domain, A domain, B) Domain, C domain) and an XM region which is a cell wall binding domain (Non-patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 In the initial purification step (capture step) in the antibody drug manufacturing process, an affinity chromatography column obtained by immobilizing protein A as a ligand on a water-insoluble carrier is generally used (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 1). Document 2, Non-Patent Document 3).
  • Recombinant protein A in which one Cys (cysteine residue) is mutated to protein A has protein A immobilized on a carrier in a position-specific manner via Cys
  • Patent Document 1 Recombinant protein A, in which the ratio of the number of Lys (lysine residues) on the antibody binding surface and non-binding surface of protein A is changed, is immobilized on the carrier at multiple points while gently controlling the ligand orientation during immobilization.
  • Patent Document 2 Recombinant protein A in which Lys and Cys in the amino acid sequence are completely eliminated is immobilized on a carrier via its N-terminus ( ⁇ -amino group) and C-terminus (special tag)
  • Patent Documents 3 to 4 Recombinant protein A in which Lys and Cys in the amino acid sequence are completely eliminated is immobilized on a carrier via its N-terminus ( ⁇ -amino group) and C-terminus (special tag)
  • the present inventors designed many modified recombinants for protein A, obtained mutants using protein engineering techniques and genetic engineering techniques, and cultured the mutants. Productivity was evaluated.
  • the number of Lys contained in the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain is determined according to the number of Lys contained in the amino acid sequence derived from the other domain.
  • the number of Lys contained in the 39th and subsequent positions in the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain is set so as not to exceed the number of Lys contained in the 1st to 38th positions.
  • the antibody binding capacity of the affinity separation matrix obtained by immobilizing as a ligand can be improved, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides an amino acid derived from the most N-terminal domain in a protein having two or more amino acid sequences derived from the E, D, A, B, or C domain of protein A described in SEQ ID NOs: 1 to 5.
  • the number of Lys contained in the sequence is larger than the number of Lys contained in the amino acid sequence derived from the other domain, and the number of Lys contained in the 39th position or later in the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain is It relates to a protein that does not exceed the number of Lys contained in positions 1 to 38.
  • Lys is included only at positions 1-8 and / or 51-58, and the number of Lys included at positions 51-58 is included at positions 1-8. It is preferable not to exceed the number of Lys.
  • Lys is included only at positions 1 to 8 of the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain and at position 58 of each domain.
  • amino acid sequence derived from the other domain preferably does not contain Lys.
  • Lys is contained only at positions 1 to 8 of the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain.
  • Lys is contained only at positions 4 and / or 7 of the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain.
  • the present invention also relates to DNA encoding the protein.
  • the present invention also relates to a vector containing the DNA.
  • the present invention also relates to a transformant obtained by transforming a host cell with the vector.
  • the present invention also relates to a cell-free protein synthesis system using the DNA or a method for producing the protein using the transformant.
  • the present invention also relates to an affinity separation matrix obtained by immobilizing the protein as an affinity ligand on a carrier comprising a water-insoluble substrate.
  • An affinity separation matrix that binds to a protein containing the Fc region of an immunoglobulin is preferred.
  • the protein containing the Fc region of immunoglobulin is immunoglobulin G or an immunoglobulin G derivative.
  • the present invention also relates to a method for producing the affinity separation matrix, comprising a step of immobilizing the protein as an affinity ligand on a carrier made of a water-insoluble substrate.
  • the present invention also relates to a method for purifying a protein containing an immunoglobulin Fc region, comprising the step of adsorbing a polypeptide containing an immunoglobulin Fc region to the affinity separation matrix.
  • the protein of the present invention realizes the production of an affinity separation matrix having a high antibody binding capacity.
  • the protein of the present invention is an amino acid derived from the most N-terminal domain in a protein having two or more amino acid sequences derived from the E, D, A, B, or C domain of protein A described in SEQ ID NOs: 1 to 5
  • the number of Lys contained in the sequence is larger than the number of Lys contained in the amino acid sequence derived from the other domain, and the number of Lys contained in the 39th position or later in the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain is It is a protein that does not exceed the number of Lys contained in positions 1 to 38.
  • the mutation for substituting an amino acid residue is described as a wild-type or non-mutated amino acid residue before the substitution position number, and the mutated amino acid residue after the substitution position number. Notation.
  • a mutation that replaces Gly at position 29 with Ala is referred to as G29A.
  • protein includes any molecule having a polypeptide structure, and a polypeptide chain that is fragmented or linked by peptide bonds is also encompassed by the term “protein”.
  • a “domain” is a higher-order structural unit of a protein, composed of several tens to several hundreds of amino acid sequences, and sufficient to express any physicochemical or biochemical function.
  • a domain particularly refers to a domain that binds to a protein containing an Fc region of an immunoglobulin.
  • the amino acid sequence derived from the domain refers to the amino acid sequence before substitution of amino acids.
  • the amino acid sequence derived from the domain is not limited to the wild-type amino acid sequence of the E, D, A, B, or C domain of protein A, but partially by amino acid substitution, insertion, deletion, and chemical modification. Even a modified amino acid sequence is included in the protein as long as it has a binding ability to the Fc region.
  • Examples of the amino acid sequence derived from the domain include amino acid sequences constituting E, D, A, B, and C domains of protein A of Staphylococcus described in SEQ ID NOs: 1 to 5, and protein A
  • Examples of the E, D, A, B, and C domains are proteins having an amino acid sequence in which a mutation that replaces Gly corresponding to position 29 of the C domain with Ala is introduced.
  • the Z domain in which the mutations A1V and G29A are introduced into the B domain also has an ability to bind to the Fc region, and therefore corresponds to the amino acid sequence derived from the domain.
  • the amino acid sequence derived from the domain is preferably a domain with high chemical stability or a variant thereof. Each domain can be aligned as shown in FIG. For example, the residue corresponding to position 31 of the C domain is the same position 31 in the A and B domains, and corresponds to position 29 in the E domain and position 34 in the D domain.
  • the amino acid sequence derived from each domain is preferably an amino acid sequence that meets at least one of the following conditions (1) to (4).
  • the amino acid residue corresponding to position 29 of the C domain in each domain is Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Thr, Ser, Asp, Glu, Arg, His, or Met
  • the amino acid residue corresponding to position 33 of the C domain in each domain is Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Thr, Asp, Glu, Asn, Gln, Arg, His, or Met
  • the amino acid residue corresponding to position 36 of the C domain in each domain is Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Glu, Arg, His, or Met
  • the amino acid residue corresponding to position 37 of the C domain in each domain is One of Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Glu, Arg, His, or Met.
  • the amino acid sequence derived from each domain is more preferably an amino acid sequence meeting at least one of the following conditions (1) to (4).
  • the amino acid residue corresponding to position 29 of the C domain in each domain is One of Ala, Glu or Arg
  • the amino acid residue corresponding to position 33 of the C domain in each domain is Leu, Thr, Glu, Gln, Arg, or His
  • the amino acid residue corresponding to position 36 of the C domain in each domain is Either Ile or Arg
  • the amino acid residue corresponding to position 37 of the C domain in each domain is One of Leu, Ile, Glu, Arg, or His.
  • sequence identity between the amino acid sequence derived from the domain and the E, D, A, B, or C domain of protein A described in SEQ ID NOS: 1 to 5 is preferably 85% or more, and 90% or more More preferably, it is more preferably 95% or more.
  • the protein of the present invention has two or more amino acid sequences derived from the E, D, A, B, or C domain of protein A described in SEQ ID NOs: 1 to 5.
  • the number of domains contained in the protein of the present invention is 2 or more, preferably 3 or more, more preferably 4 or more, still more preferably 5 or more, and even more preferably 6 or more.
  • the number of domains contained in the protein of the present invention is 20 or less, preferably 10 or less, more preferably 8 or less, and even more preferably 6 or less.
  • the amino acid sequence of the most N-terminal domain and other domains may be different.
  • the other domains excluding the most N-terminal domain are homodimers and homotrimers that are linked to a single immunoglobulin-binding domain.
  • It may be a protein with Lys attached to the end of a homopolymer such as, and Lys is attached to the end of a heteropolymer such as a heterodimer or heterotrimer that is a linked body of multiple types of immunoglobulin binding domains. It may be a protein.
  • Examples of the monomer protein linking method include a method of linking without intervening amino acid residues as a linker, or a method of linking with one or a plurality of amino acid residues, but is not limited to these methods.
  • the number of amino acid residues serving as a linker is not particularly limited, and is preferably one that does not destabilize the three-dimensional structure of the monomeric protein.
  • the “linker” in the present specification means a linker between domains, and is a linking part of linked monomeric proteins (single domains), that is, a C-terminal region and a C-terminal side of the N-terminal domain sequence. Refers to the region between the N-terminal regions of the domain sequence. In a protein in which N domains are linked in tandem, there are N-1 linkers. That is, the “linker” in the present specification is a region consisting of at least two amino acid residues of the C-terminal amino acid of the N-terminal domain to be linked and the N-terminal amino acid of the C-terminal domain.
  • the N-terminal / C-terminal sequence of the domain that does not take a specific secondary structure or is located at the boundary of the domain can be a linker.
  • the linker is, for example, about the N-terminal side of the immunoglobulin G binding domain of protein A, from the 1st to 6th position, preferably from the 1st to 5th position, more preferably from the 1st to 4th position, more preferably from the 1st position of the C domain. It is an amino acid residue corresponding to the -3 position, more preferably the 1-2 position, and at least the N-terminal amino acid residue is included in the linker.
  • the amino acid residue corresponding to the said amino acid in C domain corresponds to a linker.
  • the linker is an amino acid corresponding to positions 55 to 58, preferably 56 to 58, more preferably 57 to 58, of the C domain, for example, on the C-terminal side of the immunoglobulin G binding domain of protein A.
  • the amino acid residue at position 58 which is a residue and at least the C-terminus, is included in the linker.
  • the number of Lys contained in the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain is greater than the number of Lys contained in the amino acid sequence derived from other domains. It is characterized by. For example, when the protein of the present invention consists of five domains and the number of Lys contained in the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain is 2, the Lys contained in the amino acid sequence derived from the other four domains The numbers are both less than two. In order to avoid becoming an immobilization point when immobilizing a protein as an affinity ligand on a carrier, it is preferable that Lys contained in an amino acid sequence derived from another domain is not exposed on the surface of the protein.
  • the number of Lys contained in the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain is preferably one or more than the number of Lys contained in the amino acid sequence derived from the other domain. Further, the number of Lys contained in the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain is preferably 6, more preferably 5, and even more preferably 4, Even more preferably, it is particularly preferably 2, and most preferably 1.
  • the number of Lys contained in the 39th and subsequent positions is the number of Lys contained in the 1st to 38th positions. It is characterized by not exceeding.
  • the amino acid sequence after the 39th position is the amino acid sequence after the 39th position of the C domain of protein A, or when the E, D, A, B, and C domains of protein A are aligned as shown in FIG. It refers to the amino acid sequences of the E, D, A, and B domains that are in the same position as the amino acid sequence in the C domain after the 39th position.
  • the amino acid sequence at positions 1 to 38 is aligned with the amino acid sequence at positions 1 to 38 of the C domain of protein A, or the E, D, A, B, and C domains of protein A as shown in FIG. It refers to the amino acid sequences of the E, D, A, and B domains that are sometimes in the same position in tandem as the amino acid sequence at positions 1-38 of the C domain.
  • the number of Lys contained in the amino acid sequence after the 39th position is the same as the number of Lys contained in the amino acid sequence at the 1st to 38th positions. It is preferable that the number is 1 or more less than the number of Lys contained in the amino acid sequence at positions 1 to 38.
  • the number of Lys contained in the amino acid sequence at positions 1 to 38 is preferably 3, more preferably 2, and most preferably 1.
  • the Lys of the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain The number of Lys is greater than the number of Lys contained in the amino acid sequence derived from other domains, and the number of Lys contained in the 39th and subsequent positions in the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain is contained in the 1st to 38th positions.
  • other amino acid sequences are not particularly limited, and may be natural amino acid residues, non-protein constituent amino acid residues, or non-natural amino acid residues.
  • amino acid residues can be preferably used.
  • an amino acid residue having a functional group having a high reactivity in the coupling reaction at the time of immobilization for example, cysteine (Cys) having a thiol group (-SH) in the side chain is an amino acid residue to be substituted As inappropriate.
  • the amino acid sequences derived from the most N-terminal domain and amino acid sequences derived from other domains may contain amino acid substitutions that improve various functions. Examples of such amino acid substitution include one or more Gly in the amino acid sequence derived from any one of the E, D, A, B, and C domains of protein A described in WO2010 / 110288.
  • amino acid substitution in which is substituted with an amino acid other than Ala is substituted with an amino acid other than Ala.
  • amino acid sequence derived from at least one domain selected from the E, D, A, B, and C domains of protein A described in International Publication No. 2011/118699 examples include amino acid substitutions that introduce at least one amino acid substitution mutation into amino acid residues at positions 37 to 29, amino acid residues 29 to 35 of the E domain, or amino acid residues 34 to 40 of the D domain. These are amino acid substitutions that can improve antibody elution properties by reducing affinity for the Fab region.
  • Lys is included only at positions 1-8 and / or 51-58, and the number of Lys included at positions 51-58 is included at positions 1-8. It is preferable not to exceed the number of Lys. In the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain, it is more preferable that Lys is contained only at positions 1 to 8 and 51 to 58.
  • the protein of the present invention may be a protein in which the amino acid sequence derived from the second and subsequent domains from the N-terminal side does not contain Lys, and Lys is 1 to 8 of the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain. And a protein contained only at position 58 of each domain including the most N-terminal domain and the second and subsequent domains from the N-terminal side.
  • the protein of the present invention may be a protein containing Lys only at positions 1 to 8 of the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain. In this case, it is preferable that Lys is included only at positions 4 and / or 7 of the amino acid sequence derived from the most N-terminal domain.
  • the number of Lys can be controlled by substituting Lys with an amino acid residue other than Lys in the amino acid sequence derived from the domain.
  • an amino acid sequence obtained by substituting Lys with an amino acid residue other than Lys for example, the following amino acid sequence described in International Publication No.
  • amino acid substitution is performed on all Lys (lysine residues) derived from any domain selected from E, D, A, B, and C domains of protein A described in International Publication No. 2014/046278 Examples include amino acid sequences that include two or more amino acid sequences into which mutations are introduced, the amino acid sequences are linked to each other by a linker, and at least one linker includes Lys (lysine residue) or Cys (cysteine residue). .
  • Lys substitution mutations are substitution mutations to arginine (Arg). This is because Arg is a basic amino acid having similar physical properties to Lys, and when Lys is substituted with Arg, the effect on the physical properties of the entire protein is relatively small.
  • the following 20 amino acid residues are preferably retained 90% or more, more preferably 95% or more.
  • the identity of the amino acid sequence as a whole protein is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and more preferably 95% or more, compared to the amino acid sequence before mutation introduction.
  • the sequence identity of amino acid sequences can be analyzed by those skilled in the art by direct comparison of sequences, and specifically can be analyzed using commercially available sequence analysis software or the like.
  • the protein of the present invention may be a fusion protein obtained by fusing other proteins having different functions.
  • the fusion protein include, but are not limited to, a protein in which albumin or GST (glutathione S-transferase) is fused.
  • the protein of the present invention may be obtained by fusing a nucleic acid such as a DNA aptamer, a drug such as an antibiotic, and a polymer such as PEG (polyethylene glycol).
  • the present invention also relates to a DNA comprising a base sequence encoding a protein obtained by the above method.
  • the DNA may be any amino acid sequence obtained by translating the base sequence as long as it constitutes the above-mentioned protein.
  • Such DNA can be obtained by using a commonly used known method, for example, a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) method. It can also be synthesized by a known chemical synthesis method, and can also be obtained from a DNA library.
  • the base sequence constituting the DNA may not be the same as the original base sequence as long as the codon may be replaced with a degenerate codon and it encodes the same amino acid when translated.
  • Introduction of site-specific mutations for modifying the base sequence of DNA can be performed using recombinant DNA technology, PCR method or the like as follows.
  • the introduction of mutations by recombinant DNA technology can be performed when, for example, appropriate restriction enzyme recognition sequences exist on both sides of the target site where mutations are desired in the gene encoding the protein of the present invention. It can be performed by a cassette mutation method in which the enzyme recognition sequence is cleaved with the restriction enzyme, the region including the site where mutation is desired is removed, and then the DNA fragment mutated only to the target site is inserted by chemical synthesis or the like. .
  • site-specific mutation by PCR is, for example, a double double-stranded plasmid in which PCR is performed using a double-stranded plasmid encoding a protein as a template and two kinds of synthetic oligo primers containing mutations complementary to the + and ⁇ strands. This can be done by the primer method.
  • DNA encoding a protein having two or more amino acid sequences derived from the E, D, A, B, or C domain of protein A described in SEQ ID NOs: 1 to 5 is obtained by ligating DNA encoding one domain. can get.
  • DNA is ligated by introducing an appropriate restriction enzyme recognition sequence into the base sequence and ligating double-stranded DNA fragmented with the restriction enzyme with DNA ligase.
  • restriction enzyme recognition sequence may be used, but a plurality of different types of restriction enzyme recognition sequences may be introduced.
  • the method for producing DNA encoding a protein having two or more amino acid sequences derived from the E, D, A, B, or C domain of protein A described in SEQ ID NOs: 1 to 5 is not limited to the above method.
  • it can be prepared by applying the above-described mutation introduction method to DNA encoding protein A (for example, International Publication No. 2006/004067).
  • the sequence identity between the nucleotide sequences of DNAs encoding linked monomeric proteins is preferably 90% or less, more preferably 85% or less.
  • the vector of the present invention comprises the aforementioned protein, or a base sequence encoding a partial amino acid sequence thereof, and a promoter that can function in a host operably linked to the base sequence. Usually, it can be obtained by linking or inserting a gene encoding the above-described protein into an appropriate vector.
  • the vector for inserting the gene is not particularly limited as long as it can replicate autonomously in the host, and plasmid DNA or phage DNA can be used as the vector.
  • vectors such as pQE vectors (Qiagen), pET vectors (Merck), and pGEX vectors (GE Healthcare Japan) may be used.
  • plasmid vectors useful for expression of genes of the genus Brevibacillus include pUB110, which is known as a Bacillus subtilis vector, or pHY500 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-31682), pNY700 (Japanese Patent Laid-Open No. 4-278091). , PNU211R2L5 (Japanese Patent Laid-Open No. 7-170984), pHT210 (Japanese Patent Laid-Open No. 6-133782), or pNCMO2 (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-238569) which is a shuttle vector of Escherichia coli and Brevibacillus bacteria. It is done.
  • the protein of the present invention can be obtained as a fusion protein with a known protein having an effect of assisting protein expression or an effect of facilitating purification.
  • the protein include maltose binding protein (MBP) and glutathione-S-transferase (GST), but are not limited to these proteins.
  • a fusion protein can be produced using a vector comprising the DNA of the present invention and a DNA encoding MBP or GST linked together.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell.
  • methods for introducing recombinant DNA into a host include a method using calcium ions, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, an Agrobacterium infection method, a particle gun method, or a polyethylene glycol method.
  • examples of a method for expressing the function of the obtained gene in a host include a method for incorporating the gene obtained in the present invention into a genome (chromosome).
  • the host cell is not particularly limited, but for mass production at low cost, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Coryne Bacteria (eubacteria) such as Corynebacterium can be preferably used.
  • the protein of the present invention is produced by culturing the above-described transformed cells in a medium, and producing and accumulating the protein of the present invention in the cultured cells (including the cell periplasm region) or in the culture solution (outside the cells). And the desired protein can be collected from the culture.
  • the protein of the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cell in a medium, and in the cultured cell (including the cell periplasm region) or in the culture solution (outside the cell). It is also possible to produce and accumulate a fusion protein containing, collect the fusion protein from the culture, cleave the fusion protein with an appropriate protease, and collect the desired protein.
  • the method of culturing the transformant of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the medium used for culturing the obtained transformant is not particularly limited as long as the protein can be produced with high efficiency and high yield.
  • carbon sources and nitrogen sources such as glucose, sucrose, glycerol, polypeptone, meat extract, yeast extract, and casamino acid can be used.
  • inorganic salts such as potassium salt, sodium salt, phosphate, magnesium salt, manganese salt, zinc salt, iron salt and the like are added as necessary.
  • an auxotrophic host cell a nutrient substance required for growth may be added. If necessary, antibiotics such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol and neomycin may be added.
  • protease inhibitors ie, phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), benzamideline, 4- (2-aminoethyl) ) -Benzenesulfonyl fluoride (AEBSF), Antipain, Chymostatin, Leupeptin, Pepstatin A, Phosphoramidon, Aprotinin, Ethylenediamine etidium (TA), and other inhibitors.
  • PMSF phenylmethanesulfonyl fluoride
  • AEBSF 4- (2-aminoethyl) ) -Benzenesulfonyl fluoride
  • Antipain Chymostatin, Leupeptin, Pepstatin A, Phosphoramidon, Aprotinin, Ethylenediamine etidium (TA), and other inhibitors.
  • molecular chaperones such as GroEL / ES, Hsp70 / DnaK, Hsp90, Hsp104 / ClpB may be used (for example, co-expression or fusion proteinization). And coexisting with the protein of the present invention).
  • there are techniques such as adding an additive that promotes correct folding to the medium, and culturing at a low temperature. is not.
  • LB medium tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%
  • 2 ⁇ YT medium tryptone 1.6%, yeast Extract 1.0%, NaCl 0.5%) and the like.
  • TM medium peptone 1%, meat extract 0.5%, yeast extract 0.2%, glucose 1%, pH 7.0
  • 2SL medium peptone 4%, yeast extract 0.5%, glucose 2%, pH 7.2
  • the culture temperature is 15 to 42 ° C., preferably 20 to 37 ° C.
  • the protein of the present invention is cultured in the cultured cells (in the periplasm region) by aerobically culturing for several hours to several days under aeration and stirring conditions. Or accumulated in a culture solution (extracellular) and collected. In some cases, the culture may be performed anaerobically by blocking aeration.
  • the assembly produced by separating the cultured cells and the supernatant containing the secreted protein by a general separation method such as centrifugation or filtration after the completion of the culture.
  • the replacement protein can be recovered.
  • the cells when accumulated in cultured cells (including in the periplasm region), for example, the cells are collected from the culture solution by a method such as centrifugation or filtration, and then the cells are sonicated.
  • the protein accumulated and produced in the cells can be recovered by crushing by a French press method and / or solubilizing by adding a surfactant or the like.
  • the protein of the present invention can be purified by affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration chromatography or the like alone or in appropriate combination.
  • Confirmation that the obtained purified substance is the target protein can be performed by usual methods such as SDS polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequence analysis, Western blotting and the like.
  • the protein of the present invention can also be produced using a cell-free protein synthesis system using the DNA.
  • cell-free protein synthesis systems include those derived from prokaryotic cells, plant cells, and higher animal cells.
  • the protein of the present invention is characterized in that the culture productivity in the transformant is improved as compared with the aforementioned amino acid substitution.
  • “Cultivation productivity” can be rephrased as “protein expression level” and indicates the amount of the target recombinant protein per unit volume or per cell produced by culturing the transformant by the above-described method. For example, in the case of secretory production, it is the target protein concentration in the culture supernatant, and when the target recombinant protein is produced in the cell, it can be expressed by the number of cells or the target protein weight per cell weight.
  • the culture productivity in the transformant is improved compared to the protein before the introduction of the amino acid substitution mutation.
  • the transformant producing the protein before the mutation introduction and the amino acid substitution mutation When the transformant producing the introduced protein is cultured under the same conditions and then evaluated by the “culture productivity evaluation method” described later, the relative value is 5% or more higher, preferably 10% or more, more preferably Is more than 20% higher.
  • the culture productivity can be evaluated, for example, by the following method.
  • a transformant (control) that produces a protein before mutagenesis by the same host and the same transformation method and a transformant (evaluation sample) that produces a protein introduced with an amino acid substitution mutation are prepared and cultured under the same conditions. For example, by selecting a medium suitable for the host from the above-mentioned medium and culturing aerobically for several hours to several days at an appropriate culture temperature (for example, 20 to 37 ° C.) under aeration and stirring conditions, The protein of the invention is collected and collected in cultured cells (including in the periplasmic region) or in a culture solution (secretory production outside the cells).
  • the amount of protein contained in the obtained cultured cells or culture solution is quantified.
  • the quantification method include a method using high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC analysis an appropriate pretreatment is performed on the cultured cells or culture medium. For example, when accumulating in a cell, after crushing a cell with an ultrasonic crusher etc., after removing a cell residue by centrifugation, it filters with a filter. In the case of extracellular production, the cells are separated from the culture solution by centrifugation and filtered. Analyze the control, evaluation sample, and standard (highly purified, concentration-determined protein) by HPLC, and determine the protein concentration in the control and evaluation sample from the concentration of the standard and the analytical value (area value in the chromatogram). Further, the relative value is calculated by the following (formula 1).
  • the improvement of the culture productivity means that the relative value of the evaluation sample is 5% or more higher than that of the control, preferably 10% or more, more preferably 20% or more.
  • the protein of the present invention can be used as an affinity ligand having affinity for immunoglobulin.
  • An affinity separation matrix can be produced by a method comprising the step of immobilizing the protein of the present invention as an affinity ligand on a carrier comprising a water-insoluble substrate.
  • an affinity ligand is a substance (functional) that selectively collects (binds) a target molecule from a set of molecules based on specific affinity between molecules represented by binding of an antigen and an antibody. Group) and, in the present invention, a protein that specifically binds to an immunoglobulin.
  • the expression “ligand” is also synonymous with “affinity ligand”.
  • Immunoglobulin binding can be tested by a biosensor such as a Biacore system (manufactured by GE Healthcare Japan, Inc.) using the surface plasmon resonance principle, but is not limited thereto. As the measurement conditions, it is only necessary to detect a binding signal when protein A binds to the Fc region of an immunoglobulin. By measuring at a temperature of 20 to 40 ° C. (constant temperature) and under a neutral condition of pH 6 to 8. Can be easily evaluated.
  • an affinity constant (KA) or a dissociation constant (KD) can be used as the binding parameter.
  • the affinity constant for Fc of the protein of the present invention is determined by immobilizing human IgG on the sensor chip using the Biacore system and adding each domain variant to the channel under conditions of temperature 25 ° C. and pH 7.4. It can be obtained in an experimental system.
  • the affinity constant (KA) for human IgG is 1 ⁇ 10 5 (M ⁇ 1 ) or more, more preferably 1 ⁇ 10 6 (M ⁇ 1 ) or more, and even more preferably 1 ⁇ 10 7 ( A protein having M ⁇ 1 ) or more can be preferably used.
  • the amino acid sequence before the mutation is preferably an amino acid sequence derived from the C domain of SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence before introducing the mutation is an amino acid sequence derived from the C domain of SEQ ID NO: 5, and the amino acid residue corresponding to position 29 is Ala, Arg, Glu, Ile, Leu, Met, More preferably, it is any one selected from Phe, Trp, and Tyr.
  • it is preferable that more than half of amino acid residues introduced into all Lys are substitution mutations to Arg, and it is more preferable that all substitution mutations to Arg.
  • chemical stability under alkaline conditions can be improved as compared to before mutation introduction.
  • the chemical stability under alkaline conditions can be determined using the binding activity to immunoglobulin as an index, or the stability of the polypeptide itself as a substance can also be determined as an index.
  • the chemical stability under alkaline conditions can be evaluated by, for example, comparing electrophoresis bands of the polypeptide before and after alkali treatment by electrophoresis. Is possible.
  • chemical stability can be compared by performing very general SDS-PAGE and analyzing band intensity by densitometry. Based on the band intensity analyzed by densitometry, the polypeptide of the present invention was allowed to stand in a 0.5 M aqueous sodium hydroxide solution at 25 ° C. for 24 hours, and then compared to before treatment. It is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 70% or more, and most preferably 80% or more.
  • Examples of the carrier composed of a water-insoluble substrate used in the present invention include inorganic carriers such as glass beads and silica gel, crosslinked polymers such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene, crystalline cellulose, crosslinked Examples thereof include organic carriers composed of polysaccharides such as cellulose, crosslinked agarose and crosslinked dextran, and organic-organic, organic-inorganic and other composite carriers obtained by a combination thereof.
  • GCL2000 which is a porous cellulose gel
  • Sephacryl S-1000 in which allyl dextran and methylene bisacrylamide are covalently crosslinked
  • Toyopearl which is a methacrylate-based carrier
  • Sepharose CL4B which is an agarose-based crosslinked carrier
  • Cellufine which is a cellulosic crosslinking carrier.
  • the water-insoluble carrier in the present invention is not limited to these exemplified carriers.
  • the water-insoluble carrier used in the present invention desirably has a large surface area in view of the purpose and method of use of the affinity separation matrix, and is preferably a porous material having a large number of pores of an appropriate size.
  • the form of the carrier can be any of beads, monoliths, fibers, membranes (including hollow fibers), and any form can be selected.
  • the method for immobilizing the ligand is not particularly limited as long as it is a method of covalently binding to the carrier by the conventional coupling method via the ⁇ -amino group of lysine present in the ligand. As a result, even if a part of the ligand is immobilized on the carrier via the N-terminal ⁇ -amino group, the ligand is immobilized at the end of the protein, so that the effect of the present invention is not reduced.
  • the support is activated by reacting the support with cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine, sodium periodate, or the like (or on the support surface).
  • introducing a reactive functional group a method of immobilizing by performing a coupling reaction with a compound to be immobilized as a ligand, a condensation reagent such as carbodiimide in a system in which a compound to be immobilized as a carrier and a ligand exists, or
  • the immobilization method include addition of a reagent having a plurality of functional groups in the molecule such as glutaraldehyde, condensation, and crosslinking.
  • a spacer molecule composed of a plurality of atoms may be introduced between the ligand and the carrier, or the ligand may be directly immobilized on the carrier.
  • the affinity separation matrix of the present invention By using the affinity separation matrix of the present invention, it is possible to separate and purify proteins containing immunoglobulin Fc regions by affinity column chromatography purification methods.
  • the region to which the immunoglobulin binding domain binds has been broadly defined as Fab region (particularly Fv region) and Fc region, the three-dimensional structure of the antibody is already known.
  • the Fab region and the Fc region can be further modified (fragmentation, etc.) while retaining the three-dimensional structure of the binding region, and the present invention provides an immunoglobulin containing the Fab region and the Fc region without deficiency. It is not limited to molecules and derivatives thereof.
  • the “protein containing the Fc region of an immunoglobulin” is a protein containing a site on the Fc region side to which protein A binds, and if protein A can bind, it needs to be a protein that completely contains the Fc region. Absent.
  • a typical immunoglobulin-containing protein containing an Fc region includes, but is not limited to, immunoglobulin G or an immunoglobulin G derivative.
  • the “immunoglobulin G derivative” means, for example, a chimeric immunoglobulin G in which a part of a domain of human immunoglobulin G is replaced with a domain of immunoglobulin G of another species and fused, or human immunoglobulin G
  • the humanized immunoglobulin G in which the CDR (Complementarity Determining Regions) part of the antibody is replaced with the CDR part of another species antibody, the immunoglobulin G obtained by molecular modification of the sugar chain of the Fc region, and the Fv of the human immunoglobulin G It is a generic name for modified artificial proteins to which protein A can bind, such as artificial immunoglobulin G in which a region and an Fc region are fused.
  • the purification method of the protein containing the Fc region of these immunoglobulins can be achieved by a procedure according to an affinity column / chromatography purification method using a protein A column already present as a commercial product (Non-patent Document 3). That is, after adjusting a buffer containing a protein containing an immunoglobulin Fc region to be neutral, the solution is passed through an affinity column packed with the affinity separation matrix of the present invention, and the immunoglobulin Fc region is passed through. Adsorb protein containing. Next, an appropriate amount of pure buffer is passed through the affinity column, and the inside of the column is washed. At this point, the protein containing the Fc region of the desired immunoglobulin is adsorbed to the affinity separation matrix of the present invention in the column. Next, an acidic buffer adjusted to an appropriate pH (which may contain a substance that promotes dissociation from the matrix) is passed through the column, and the protein containing the Fc region of the desired immunoglobulin is eluted, High purity purification is achieved.
  • the affinity separation matrix of the present invention contains an appropriate strong acid or strong alkaline pure buffer (appropriate denaturing agent or organic solvent) that does not completely impair the function of the ligand compound or the carrier substrate. It may be reused by passing it through and washing it.
  • the present invention also relates to a protein obtained by the separation method using the affinity separation matrix.
  • This protein is preferably a protein containing the Fc region of an immunoglobulin.
  • the protein obtained using the above affinity separation matrix is obtained as a high-purity and high-concentration solution, and has the property that it retains the inherent activity such as the binding ability to the antigen without impairing it.
  • Various proteins obtained in the examples are expressed in the form of “alphabet showing domain-introduced mutation (Wild in wild type)”.
  • the wild-type C domain of protein A is referred to as “C-wild”
  • the C domain mutant into which mutation G29E has been introduced is referred to as “C-G29E”.
  • the notation of the mutant in which two kinds of mutations are introduced at the same time is written together using a slash.
  • the mutation G29E and the C domain mutant into which the mutation S13L is introduced are referred to as “C-G29E / S13L”.
  • a protein in which a plurality of single domains are linked is expressed by adding “d” to the linked number after a period.
  • a protein in which 5 mutations of a C domain mutant introduced with mutation G29E and mutation S13L are represented as “C-G29E / S13L.5d”.
  • the mutations in the second and subsequent domains are described as described above, and the most Add the domain mutation after the number of linkages.
  • a protein in which the mutation K04Q is introduced into the most N-terminal domain and the mutation K04R is introduced into the second to fifth domains and the C domain mutant is linked in five is referred to as “C-K04R.5d-K04Q”.
  • Example 1 Preparation of C domain mutant Two types of protein A C domain mutants C- (5d-58K) having only one residue of Lys in the sequence (SEQ ID NO: 6), C Expression plasmids of-(1d-7K) (SEQ ID NO: 7) and C- (1d-4K) (SEQ ID NO: 15) were prepared by the following procedure. Each mutant was C-K04R / K07R / G29A / S33R / K35R / K42R / K49Q / K50R / K58R.
  • C- (NonK) is a basic sequence
  • C- (5d-58K) has Lys at position 58 of the C-terminal domain
  • C- (1d-7K) is N Lys is at position 7 of the terminal domain
  • C- (1d-4K) has Lys at position 4 of the N-terminal domain.
  • DNA (SEQ ID NO: 9) encoding C- (NonK) (SEQ ID NO: 8) and having a PstI recognition site at the 5 ′ end and an XbaI recognition site at the 3 ′ end was totally synthesized by outsourcing (manufactured by Eurofin Genomics) ).
  • PCR was performed by using the primer 1: 5′-TTCGctgcagataacCGTtttaacCGTgaacaa-3 ′ (SEQ ID NO: 10) and primer 2: 5′-ACTATCTAGATTAttttTGGAGCTTTGTGCAT-3 ′ (SEQ ID NO: 11) by PCR.
  • a DNA fragment encoding (5d-58K) was amplified.
  • the primer 3 5′-TTCGctgcagataacCGTTttataacAAAAgaacaa-3 ′ (SEQ ID NO: 12) and the primer 4: 5′-ACTATCTAGATTAacggTGGAGCTGTGTGCAT-3 ′ (SEQ ID NO: 13) by PCR, C- (1d- A DNA fragment encoding 7K) was amplified.
  • the obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes PstI and XbaI (manufactured by Takara Bio Inc.), ligated to the Brevibacillus expression vector pNCMO2 (manufactured by Takara Bio Inc.) digested with the same restriction enzyme, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 was An expression plasmid in which the encoding DNA was inserted into the Brevibacillus expression vector pNCMO2 was prepared. In addition, Escherichia coli JM109 strain was used for the preparation of the plasmid. Plasmids were similarly prepared for DNA encoding C- (NonK), C- (1d-7K) (SEQ ID NO: 7), and C- (1d-4K) (SEQ ID NO: 15).
  • Brevibacillus choshinensis strain SP3 (manufactured by Takara Bio Inc.) is transformed with the obtained plasmid, and C- (NonK), C- (5d-58K) and C- (1d-7K) are secreted and produced. Recombinants were bred. 30 mL of A medium containing 30 ⁇ g / mL neomycin (polypeptone 3.0%, yeast extract 0.5%, glucose 3%, magnesium sulfate 0.01%, iron sulfate 0.001%, Manganese chloride (0.001%, zinc chloride (0.0001%)) was subjected to shaking culture at 30 ° C. for 3 days.
  • the culture solution was collected and analyzed for turbidity at 600 nm using a spectrophotometer.
  • concentration of the C domain mutant in the culture supernatant was measured by high performance liquid chromatography.
  • acetic acid was added to the obtained culture supernatant to adjust the pH to 4.5, and then allowed to stand for 1 hour to precipitate the target protein.
  • the precipitate was collected by centrifugation and dissolved in a buffer solution (50 mM Tris-HCl, pH 8.5).
  • the target protein was purified by anion exchange chromatography using a HiTrap Q column (manufactured by GE Healthcare Bioscience). Specifically, the target protein solution was added to a HiTrap Q column equilibrated with anion exchange buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8.0), washed with anion exchange buffer A, The target protein eluted in the middle was fractionated with a salt concentration gradient using anion exchange buffer A and anion exchange buffer B (50 mM Tris-HCl, 1M NaCl, pH 8.0). The collected target protein solution was dialyzed with ultrapure water, and the aqueous solution after dialysis was used as a final purified sample. In addition, all the protein purification by the chromatography using a column was implemented using the AKTA york system (made by GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.).
  • Example 2 Evaluation of C domain mutant-immobilized affinity separation matrix Crystalline highly crosslinked cellulose (manufactured by JNC, JP2009-242770, US Patent Application Publication No. 2009/2009) as a water-insoluble substrate Gel obtained by the method described in the specification of No. 0062118 was used. Approximately 3.5 mL of the base material was placed on a glass filter (17G-2 manufactured by TOP), 0.01M citrate buffer (pH 3), trisodium citrate dihydrate, citric acid monohydrate manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. After replacement with RO water, the liquid volume was adjusted to 6 mL in a centrifuge tube (50 mL manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.).
  • Solution preparation The following A to E solutions and neutralizing solution were prepared and defoamed before use.
  • Solution A A PBS buffer solution having a pH of 7.4 was prepared using “Phosphor buffered saline” manufactured by Sigma and RO water (reverse osmosis membrane purified water).
  • B liquid 35 mM sodium acetate aqueous solution of pH 3.5 was prepared using acetic acid, sodium acetate, and RO water.
  • C liquid 1M acetic acid aqueous solution was prepared using acetic acid and RO water.
  • Solution D An aqueous IgG solution having a concentration of 3 mg / mL was prepared using Gamma Guard (polyclonal antibody) manufactured by Baxter and the solution A.
  • Solution E 0.1M NaOH, 1M NaCl aqueous solution was prepared with sodium hydroxide, sodium chloride and RO water.
  • Neutralizing solution 2M tris (hydroxymethyl) aminomethane was prepared with tris (hydroxymethyl) aminomethane and RO water.
  • AKTA explorer 100 manufactured by GE Healthcare
  • 3 mL was added and filled with a 0.2 M NaCl aqueous solution (using RO water) at a linear speed of 230 cm / h for 15 minutes.
  • a 15 mL collection tube was set in the fraction collector, and the eluate collection tube was preliminarily filled with a neutralizing solution.
  • the dynamic binding capacity of IgG was determined from the amount of IgG adsorbed on the affinity separation matrix and the volume of the affinity separation matrix until the IgG broke through 5%.
  • C- (5d-58K) immobilized with C-terminal Lys C- (1d-7K) immobilized with Lys at position 7 of the N-terminal domain, and Lys at position 4 of the N-terminal domain
  • the immobilization yield of C- (1d-4K) was not significantly different.
  • DBC was higher in the C- (1d-7K) and C- (1d-4K) affinity separation matrices than in C- (5d-58K). This indicates that an affinity separation matrix having a higher binding capacity can be obtained by immobilizing Lys on the N-terminal side than by immobilizing with C-terminal Lys.
  • Example 3 Evaluation of immobilization yield of C domain mutant Example 2 using the final purified samples of C- (NonK) and C- (1d-7K) obtained in Example 1
  • an affinity separation matrix was prepared.
  • 0.25 M citrate buffer (pH 12) was used instead of 0.6 M citrate buffer (pH 12) mixed with the formyl group-containing carrier, and the amount of the final purified sample added was also changed.
  • the immobilization yield of C- (1d-7K) immobilized with Lys at position 7 of the N-terminal domain was significantly higher than C- (NonK) not containing Lys. It was shown that the immobilization yield can be increased by placing Lys in the vicinity of the N-terminal of the protein and immobilizing it rather than immobilizing with the N-terminal ⁇ -amino group of the protein.

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Abstract

本発明は、高い抗体結合容量を有するアフィニティー分離マトリックスの製造を実現するための、免疫グロブリン結合性改変型タンパク質を提供することを目的とする。 本発明は、配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有するタンパク質において、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数が、他のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数より多く、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において、３９位以降に含まれるＬｙｓの数が、１～３８位に含まれるＬｙｓの数を上回らないタンパク質を提供する。

Description

免疫グロブリン結合性改変型タンパク質
本発明は、目的物質に特異的に結合するタンパク質、タンパク質を固定化したリガンドアフィニティー分離マトリックス、および、該マトリックスを用いた分離精製方法に関する。
タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。一方、この機能を、有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度で精製（キャプチャリング）するために利用される、プロテインＡアフィニティー分離マトリックスが挙げられる。
抗体医薬として開発されているのは、基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。プロテインＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、シグナル配列Ｓ、５つの免疫グロブリン結合性ドメイン（Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン）、および、細胞壁結合ドメインであるＸＭ領域から構成されている（非特許文献１）。抗体医薬製造工程における初期精製工程（キャプチャー工程）には、プロテインＡをリガンドとして水不溶性担体に固定化して得られるアフィニティークロマトグラフィー用カラムが一般的に利用されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
プロテインＡカラムの性能を改良するために、様々な技術開発がなされてきた。リガンドの側面からの技術開発も進んでいる。最初は天然型のプロテインＡがリガンドとして利用されてきたが、タンパク質工学的に改変を加えた組換えプロテインＡをリガンドとして、カラムの性能を改良する技術も多数見られるようになった。特に、プロテインＡリガンドの水不溶性担体に対する固定化の態様に焦点を当てたプロテインＡ改変技術も開発されてきた。
プロテインＡに１個のＣｙｓ（システイン残基）を変異導入した組換えプロテインＡは、Ｃｙｓを介して、プロテインＡを位置特異的に担体へ固定化されている（特許文献１）。プロテインＡの抗体結合面と非結合面のＬｙｓ（リジン残基）の数の割合を変えた組換えプロテインＡは、固定化時のリガンド配向をゆるやかに制御しながら、多点で担体へ固定化されている（特許文献２）。また、アミノ酸配列中のＬｙｓやＣｙｓを完全に無くした組換えプロテインＡは、そのＮ末端（αアミノ基）やＣ末端（特殊タグ）を介して担体へ固定化されている（特許文献３～８）。このように、タンパク質リガンドをアフィニティー分離マトリックスに固定化する上での技術進展は、産業的な利用価値が高いゆえに高い性能が要求される、プロテインＡカラムに関連する技術を中心に発展してきた。
特開２００７－２５２３６８号公報 国際公開第１９９７／０１７３６１号 特開２００８－１１５１５１号公報 特開２００８－２６６２１９号公報 国際公開第２０１２／１３３３４２号 国際公開第２０１２／１３３３４９号 国際公開第２０１４／０４６２７８号 国際公開第２０１５／０３４０００号
Ｈｏｂｅｒ　Ｓ．他　著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ」２００７年、８４８巻、４０－４７頁 Ｌｏｗ　Ｄ．他　著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ」、２００７年、８４８巻、４８－６３頁 Ｒｏｑｕｅ　Ａ．Ｃ．Ａ．他　著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ」、２００７年、１１６０巻、４４－５５頁
高い抗体結合容量を有するアフィニティー分離マトリックスの製造を実現するための、免疫グロブリン結合性改変型タンパク質を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、プロテインＡについて数多くの改変型組換体を設計し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて変異体を取得し、その変異体の培養生産性を評価した。その結果、プロテインＡのドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有するタンパク質において、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数を、他のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数より大きい数にし、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において３９位以降に含まれるＬｙｓの数を１～３８位に含まれるＬｙｓの数を上回らない数とすることにより、当該タンパク質をリガンドとして固定化して得られるアフィニティー分離マトリックスの抗体結合容量を向上できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有するタンパク質において、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数が、他のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数より多く、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において、３９位以降に含まれるＬｙｓの数が、１～３８位に含まれるＬｙｓの数を上回らないタンパク質に関する。
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｌｙｓが１～８位、および／または５１～５８位にのみ含まれ、５１～５８位に含まれるＬｙｓの数が１～８位に含まれるＬｙｓの数を上回らないことが好ましい。
Ｌｙｓが最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の１～８位、および各ドメインの５８位にのみ含まれることが好ましい。
前記他のドメインに由来するアミノ酸配列がＬｙｓを含まないことが好ましい。
Ｌｙｓが最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の１～８位にのみ含まれることが好ましい。
Ｌｙｓが最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の４位および／または７位にのみ含まれることが好ましい。
以下に示すアミノ酸残基：Ｇｌｎ－９、Ｇｌｎ－１０、Ｐｈｅ－１３、Ｔｙｒ－１４、Ｌｅｕ－１７、Ｐｒｏ－２０、Ａｓｎ－２１、Ｌｅｕ－２２、Ｇｌｎ－２６、Ａｒｇ－２７、Ｐｈｅ－３０、Ｉｌｅ－３１、Ｌｅｕ－３４、Ｐｒｏ－３８、Ｓｅｒ－３９、Ｌｅｕ－４５、Ｌｅｕ－５１、Ａｓｎ－５２、Ｇｌｎ－５５、およびＰｒｏ－５７（残基番号はＣドメインに対応する）のうち、９０％以上が保持されていることが好ましい。
また、本発明は、前記タンパク質をコードするＤＮＡに関する。
また、本発明は、前記ＤＮＡを含むベクターに関する。
また、本発明は、前記ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体に関する。
また、本発明は、前記ＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成系、または前記形質転換体を用いる、前記タンパク質の製造方法に関する。
また、本発明は、前記タンパク質をアフィニティーリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化して得られる、アフィニティー分離マトリックスに関する。
免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合するアフィニティー分離マトリックスであることが好ましい。
免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質が免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体であることが好ましい。
また、本発明は、前記タンパク質をアフィニティーリガンドとして水不溶性の基材からなる担体に固定する工程を含む、前記アフィニティー分離マトリックスの製造方法に関する。
また、本発明は、前記アフィニティー分離マトリックスに免疫グロブリンのＦｃ領域を含むポリペプチドを吸着させる工程を含む、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質の精製方法に関する。
本発明のタンパク質は、高い抗体結合容量を有するアフィニティー分離マトリックスの製造を実現する。
スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインの配列比較表である。
本発明のタンパク質は、配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有するタンパク質において、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数が、他のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数より多く、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において、３９位以降に含まれるＬｙｓの数が、１～３８位に含まれるＬｙｓの数を上回らないタンパク質である。
本明細書において、アミノ酸残基を置換する変異は、置換位置の番号の前に野生型または非変異型のアミノ酸残基を記載し、置換位置の番号の後に変異したアミノ酸残基を記載することにより表記する。例えば、２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異はＧ２９Ａと記載する。
「タンパク質」という用語は、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、断片化された、または、ペプチド結合によって連結されたポリペプチド鎖も、「タンパク質」という用語に包含される。
一般的に、「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するのに十分なタンパク質の単位をいう。本発明においてドメインとは、特に、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合するドメインのことを示す。
ドメインに由来するアミノ酸配列は、アミノ酸を置換する前のアミノ酸配列を指す。ドメインに由来するアミノ酸配列は、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインの野生型アミノ酸配列のみに限定されず、アミノ酸の置換、挿入、欠失、および、化学修飾により部分的に改変されたアミノ酸配列であっても、Ｆｃ領域への結合能を有しているタンパク質である限りこれに含まれる。ドメインに由来するアミノ酸配列として、例えば、配列番号１～５に記載のスタフィロコッカスのプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインを構成するアミノ酸配列が挙げられ、また、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインに対して、Ｃドメインの２９位に対応するＧｌｙをＡｌａに置換する変異を導入したアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、ＢドメインにＡ１ＶとＧ２９Ａという変異を導入したＺドメインもＦｃ領域への結合能を有しているので、ドメインに由来するアミノ酸配列に該当する。ドメインに由来するアミノ酸配列は、化学安定性が高いドメイン、または、その変異体であることが好ましい。各々のドメインは、図１に示すような形でアラインメントすることができる。例えば、Ｃドメインの３１位に対応する残基は、Ａ、Ｂドメインでは、同じ３１位であり、Ｅドメインでは２９位、Ｄドメインでは３４位に対応する。
各ドメインに由来するアミノ酸配列は、以下の（１）～（４）の少なくとも１つの条件に合致するアミノ酸配列であることが好ましい。
（１）各ドメインにおけるＣドメインの２９位に対応するアミノ酸残基が、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（２）各ドメインにおけるＣドメインの３３位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（３）各ドメインにおけるＣドメインの３６位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（４）各ドメインにおけるＣドメインの３７位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである。
各ドメインに由来するアミノ酸配列は、以下の（１）～（４）の少なくとも１つの条件に合致するアミノ酸配列であることがより好ましい。
（１）各ドメインにおけるＣドメインの２９位に対応するアミノ酸残基が、
Ａｌａ、Ｇｌｕ、または、Ａｒｇのいずれかである、
（２）各ドメインにおけるＣドメインの３３位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、または、Ｈｉｓのいずれかである、
（３）各ドメインにおけるＣドメインの３６位に対応するアミノ酸残基が、
Ｉｌｅ、または、Ａｒｇのいずれかである、
（４）各ドメインにおけるＣドメインの３７位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、または、Ｈｉｓのいずれかである。
ドメインに由来するアミノ酸配列と、配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインとの配列同一性は８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
本発明のタンパク質は、配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有する。本発明のタンパク質に含まれるドメインの数は２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、さらに好ましくは５個以上、さらにより好ましくは６個以上である。本発明のタンパク質に含まれるドメインの数は２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは８個以下、さらに好ましくは６個以下である。
本発明においては、最もＮ末端側のドメインと、その他のドメインのアミノ酸配列が異なっていてもよい。最もＮ末端側のドメインのＣ末端側に複数のドメインが連結される場合は、最もＮ末端側ドメインを除く他のドメインは、単一の免疫グロブリン結合性ドメインの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーの末端にＬｙｓが付与されたタンパク質であっても良いし、複数種類の免疫グロブリン結合性ドメインの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーの末端にＬｙｓが付与されたタンパク質であってもよい。
単量体タンパク質の連結方法としては、リンカーとなるアミノ酸残基を介さず連結する方法、または、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されない。リンカーとなるアミノ酸残基数に特に限定されず、単量体タンパク質の３次元立体構造を不安定化しないものであることが好ましい。
本明細書中における「リンカー」は、ドメイン間のリンカーを意味し、連結された単量体タンパク質（単ドメイン）の連結部、すなわち、Ｎ末端側のドメイン配列のＣ末端領域とＣ末端側のドメイン配列のＮ末端領域の間の領域を指す。ドメインがタンデムにＮ個連結されたタンパク質において、リンカーはＮ－１個存在する。つまり、本明細書中における「リンカー」は、連結するＮ末端側のドメインのＣ末端アミノ酸と、Ｃ末端側のドメインのＮ末端アミノ酸の、少なくとも２個以上のアミノ酸残基からなる領域である。
特定の二次構造をとらない、または、ドメインの境界に位置する、ドメインのＮ末端側／Ｃ末端側の配列を、リンカーとすることが可能である。この場合、リンカーは、例えばプロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインのＮ末端側については、Ｃドメインの１位～６位、好ましくは１～５位、より好ましくは１～４位、さらに好ましくは１～３位、さらにより好ましくは１～２位に対応するアミノ酸残基であり、少なくともＮ末端のアミノ酸残基はリンカーに含まれる。なお、ＥドメインとＤドメインは、Ｃドメインと全長が異なるが、Ｃドメインにおける上記アミノ酸と対応するアミノ酸残基がリンカーに該当する。同様に、リンカーは、例えばプロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインのＣ末端側については、Ｃドメインの５５位～５８位、好ましくは５６～５８位、より好ましくは５７位～５８位に対応するアミノ酸残基であり、少なくともＣ末端である５８位のアミノ酸残基はリンカーに含まれる。
本発明のタンパク質は、２以上のドメインのうち、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数が、他の各ドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数より多いことを特徴とする。例えば、本発明のタンパク質が５つのドメインからなり、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数が２の場合、他の４つのドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数は、いずれも２より少ない。タンパク質をアフィニティーリガンドとして担体に固定化する際の固定化点になることを避けるために、他のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓはタンパク質の表面に露出していないことが好ましい。
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数は、他のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数よりも１個以上多いことが好ましい。また、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数は６個であることが好ましく、５個であることがより好ましく、４個であることがさらに好ましく、３個であることがさらにより好ましく、２個であることが特に好ましく、１個であることが最も好ましい。
また、本発明のタンパク質は、２以上のドメインのうち、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において、３９位以降に含まれるＬｙｓの数が、１～３８位に含まれるＬｙｓの数を上回らないことを特徴とする。ここで、３９位以降のアミノ酸配列は、プロテインＡのＣドメインの３９位以降のアミノ酸配列、または、図１に示すようにプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインをアラインした時にＣドメインの３９位以降のアミノ酸配列と縦列に同じ位置となるＥ、Ｄ、Ａ、およびＢドメインのアミノ酸配列を指す。また、１～３８位のアミノ酸配列は、プロテインＡのＣドメインの１～３８位のアミノ酸配列、または、図１に示すようにプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインをアラインした時にＣドメインの１～３８位のアミノ酸配列と縦列に同じ位置となるＥ、Ｄ、Ａ、およびＢドメインのアミノ酸配列を指す。
２以上のドメインのうち最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において、３９位以降のアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数は、１～３８位のアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数と同じであることが好ましく、１～３８位のアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数より１個以上少ないことが好ましい。１～３８位のアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数は３個であることが好ましく、２個であることがより好ましく、１個であることが最も好ましい。
配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有するタンパク質において、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数が、他のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数より多く、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において３９位以降に含まれるＬｙｓの数が１～３８位に含まれるＬｙｓの数を上回らない限り、その他のアミノ酸配列は特に限定されず、天然型アミノ酸残基、非タンパク質構成アミノ酸残基や非天然アミノ酸残基であってもよい。遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸残基を好適に用いることができる。ただし、固定化時のカップリング反応での反応性が高い官能基を側鎖に有するアミノ酸残基、例えば、チオール基（－ＳＨ）を側鎖に有するシステイン（Ｃｙｓ）は、置換するアミノ酸残基としては不適である。最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列、および他のドメインに由来するアミノ酸配列は、各種機能を改良するアミノ酸置換を含んでいてもよい。このようなアミノ酸置換としては、例えば、国際公開第２０１０／１１０２８８号に記載の、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインのいずれかのドメインに由来するアミノ酸配列において１以上のＧｌｙをＡｌａ以外のアミノ酸に置換するアミノ酸置換が挙げられる。また、国際公開第２０１１／１１８６９９号に記載の、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメインから選ばれる少なくとも１つのドメインに由来するアミノ酸配列において、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインの３１～３７位のアミノ酸残基、Ｅドメインの２９～３５位のアミノ酸残基、又はＤドメインの３４～４０位のアミノ酸残基に少なくとも１つのアミノ酸置換変異を導入するアミノ酸置換が挙げられる。これらは、Ｆａｂ領域への親和性を低下して抗体溶出特性を改善できるアミノ酸置換である。
最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｌｙｓが１～８位、および／または５１～５８位にのみ含まれ、５１～５８位に含まれるＬｙｓの数が１～８位に含まれるＬｙｓの数を上回らないことが好ましい。最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｌｙｓが１～８位、および５１～５８位にのみ含まれることがより好ましい。
本発明のタンパク質は、Ｎ末端側から２番目以降のドメインに由来するアミノ酸配列がＬｙｓを含まないタンパク質であってもよく、Ｌｙｓが、最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の１～８位、および、最もＮ末端側のドメインとＮ末端側から２番目以降のドメインを含む各ドメインの５８位にのみ含まれるタンパク質であってもよい。
また、本発明のタンパク質は、Ｌｙｓが最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の１～８位にのみ含まれるタンパク質であってもよい。この場合において、Ｌｙｓが最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の４位および／または７位にのみ含まれることが好ましい。
Ｌｙｓの数は、ドメインに由来するアミノ酸配列において、ＬｙｓをＬｙｓ以外のアミノ酸残基に置換することにより制御できる。ＬｙｓをＬｙｓ以外のアミノ酸残基に置換して得られるアミノ酸配列としては、例えば、国際公開第２０１２／１３３３４２号に記載の、以下のアミノ酸配列：ＲＦＸ１Ｘ２ＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＸ３ＰＮＬＴＥＥＱＲＮＸ４ＦＩＱＸ５ＬＸ６Ｘ７Ｘ８ＰＳＶＳＲＥＸ９ＬＡＥＡＸ１０Ｘ１１ＬＮＤＡＱＡＰＸ１２（前記アミノ酸配列中、Ｘ１＝Ｄ，Ｅ，Ｎ，又はＱ；Ｘ２＝Ｅ，又はＲ；Ｘ３＝Ｌ，Ｍ，又はＩ；Ｘ４＝Ａ，Ｅ，Ｆ，Ｒ，Ｙ，又はＷ；Ｘ５＝Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，又はＶ；Ｘ６＝Ｈ，Ｉ，又はＲ；Ｘ７＝Ｄ，Ｉ，又はＲ；Ｘ８＝Ｄ，又はＥ；Ｘ９＝Ｉ，Ｌ，又はＶ；Ｘ１０＝Ｒ，又はＱ；Ｘ１１＝Ｈ，又はＲ；Ｘ１２＝Ｒ，Ｇ，又はＫである）が挙げられる。また、国際公開第２０１２／１３３３４９号に記載の、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインのいずれかのドメインに由来したアミノ酸配列の全てのＬｙｓ（リジン残基）にアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有し、かつ、末端にＬｙｓを付与したアミノ酸配列が挙げられる。また、国際公開第２０１４／０４６２７８号に記載の、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインから選択されるいずれかのドメインに由来し、全てのＬｙｓ（リジン残基）にアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を２以上含み、前記アミノ酸配列同士がリンカーによって連結されており、かつ、少なくとも１つのリンカーがＬｙｓ（リジン残基）またはＣｙｓ（システイン残基）を含むアミノ酸配列が挙げられる。また、Ｌｙｓの置換変異のうち、半数以以上がアルギニン（Ａｒｇ）への置換変異であることが好ましい。これは、ＡｒｇはＬｙｓと物性が似た塩基性アミノ酸であり、ＬｙｓをＡｒｇに置換する場合には、タンパク質全体の物性に与える影響が比較的小さいからである。
本発明のタンパク質において、次に示す２０個のアミノ酸残基が、９０％以上保持されていることが好ましく、９５％以上保持されていることがより好ましい。Ｇｌｎ－９、Ｇｌｎ－１０、Ｐｈｅ－１３、Ｔｙｒ－１４、Ｌｅｕ－１７、Ｐｒｏ－２０、Ａｓｎ－２１、Ｌｅｕ－２２、Ｇｌｎ－２６、Ａｒｇ－２７、Ｐｈｅ－３０、Ｉｌｅ－３１、Ｌｅｕ－３４、Ｐｒｏ－３８、Ｓｅｒ－３９、Ｌｅｕ－４５、Ｌｅｕ－５１、Ａｓｎ－５２、Ｇｌｎ－５５、Ｐｒｏ－５７（残基番号はＣドメインに対応する）。
さらに、タンパク質全体としてのアミノ酸配列の同一性が、変異導入前のアミノ酸配列と比較して８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。なお、アミノ酸配列の配列同一性は、当業者であれば配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
本発明のタンパク質は、機能の異なる他のタンパク質とを融合して得られる融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）が融合したタンパク質を挙げることができるが、これらに限定されない。また、本発明のタンパク質は、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子とを融合して得られるものであってもよい。
本発明は、上記方法により得られたタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡにも関する。ＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、上述のタンパク質を構成するものであればいずれでも良い。そのようなＤＮＡは、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該ＤＮＡを構成する塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていても良く、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。
ＤＮＡの塩基配列を改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、タンパク質をコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋および－鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により、行うことができる。
配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有するタンパク質をコードするＤＮＡは、１つのドメインをコードするＤＮＡを連結することにより得られる。例えば、ＤＮＡの連結は、塩基配列に適当な制限酵素認識配列を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することにより行われる。制限酵素認識配列は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素認識配列を導入することもできる。
配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有するタンパク質をコードするＤＮＡを作製する方法は、上記の方法に限らない。例えば、プロテインＡをコードするＤＮＡ（例えば、国際公開第２００６／００４０６７号）に上記の変異導入法を適用することで作製することも可能である。なお、多量体タンパク質をコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体タンパク質をコードする塩基配列が同一の場合には、形質転換した際に宿主細胞内でＤＮＡの相同組換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下であることが好ましく、８５％以下であることがより好ましい。
本発明のベクターは、前述したタンパク質、または、その部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、前述したタンパク質をコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができる。遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社製）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社製）、および、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）のベクターなどが挙げられる。ブレビバチルス属細菌の遺伝子の発現に有用なプラスミドベクターとしては、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、または、ｐＨＹ５００（特開平２－３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４－２７８０９１号公報）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７－１７０９８４号公報）、ｐＨＴ２１０（特開平６－１３３７８２号公報）、または、大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＭＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）などが挙げられる。
本発明のタンパク質は、タンパク質発現を補助する作用、または、精製を容易にする作用がある公知の蛋白質との融合タンパク質として取得することができる。該タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。本発明のＤＮＡとＭＢＰ或いはＧＳＴ等をコードするＤＮＡとを連結した状態で含むベクターを使用して、融合タンパク質を生産することができる。
本発明の形質転換体は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、または、ポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。
宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
本発明のタンパク質は、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物から所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。
また、本発明のタンパク質は、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明のタンパク質を含む融合タンパク質を生成蓄積させ、該培養物から該融合タンパク質を採取し、該融合タンパク質を適切なプロテアーゼによって切断し、所望のタンパク質を採取することによっても製造することができる。
本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、該タンパク質を高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されても良い。
さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的蛋白質の分解、低分子化を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわちＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）、および／または、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加しても良い。
さらに、本発明のタンパク質を正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用しても良い（例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のタンパク質と共存させる）。なお、本発明のタンパク質の正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス　０．５％、ＮａＣｌ　１％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン　１．６％、酵母エキス　１．０％、ＮａＣｌ　０．５％）等が挙げられる。
ブレビバチルス属細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、ＴＭ培地（ペプトン　１％、肉エキス　０．５％、酵母エキス　０．２％、グルコース　１％、ｐＨ７．０）、または、２ＳＬ培地（ペプトン　４％、酵母エキス　０．５％　、グルコース　２％、ｐＨ７．２）等が挙げられる。
また、培養温度は、１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより本発明のタンパク質を、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。
組換えタンパク質が分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたタンパク質を含む上清を分離することにより生産された組換えタンパク質を回収することができる。
また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたタンパク質を回収することができる。
本発明のタンパク質の精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。
得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
本発明のタンパク質は、前記ＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成系を用いて製造することもできる。このような無細胞タンパク質合成系の例として、原核細胞由来、植物細胞由来、高等動物細胞由来の合成系が挙げられる。
本発明のタンパク質は、前述のアミノ酸置換前と比較して形質転換体での培養生産性が向上していることを特徴とする。「培養生産性」とは、「タンパク質発現量」と言い換えることができ、形質転換体を上述の方法で培養して生産される単位体積あたり、もしくは細胞あたりの目的組換えタンパク質の量を示す。例えば、分泌生産であれば、培養上清中の目的タンパク質濃度であり、細胞内に目的組換えタンパク質が生産され場合は、細胞数当たり、もしくは細胞重量当たりの目的タンパク質重量で示すことができる。「アミノ酸置換変異導入前のタンパク質と比較して形質転換体での培養生産性が向上している」とは、具体的には、変異導入前のタンパク質を生産する形質転換体とアミノ酸置換変異を導入したタンパク質を生産する形質転換体を同条件で培養後、後述の「培養生産性の評価方法」で評価した場合、相対値が５％以上高いことであり、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上高いことである。
培養生産性は、例えば以下の方法で評価できる。
［培養生産性の評価方法］
同じ宿主及び同じ形質転換方法で変異導入前のタンパク質を生産する形質転換体（対照）とアミノ酸置換変異を導入したタンパク質を生産する形質転換体（評価サンプル）を準備し、同じ条件で培養する。例えば、上述した培地の中から宿主に適した培地を選択し、適当な培養温度（例えば、２０～３７℃）で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより、本発明のタンパク質を、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養液（細胞外への分泌生産）に蓄積させて回収する。得られた培養細胞もしくは培養液に含まれるタンパク質量を定量する。定量方法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法が挙げられる。ＨＰＬＣ分析をする場合は、培養細胞もしくは培養液に適切な前処理を実施する。例えば、細胞内に蓄積する場合は、超音波破砕機などで細胞破砕を実施した後、遠心分離により、細胞残渣を除去した後、フィルターろ過する。細胞外への分泌生産の場合は、培養液から遠心分離により菌体を分離し、フィルターろ過する。対照と評価サンプルと標準品（高度に精製され、濃度決定されたタンパク質）をＨＰＬＣ分析し、標準品の濃度と分析値（クロマトグラムのエリア値）から、対照と評価サンプルに含まれるタンパク質濃度を算出し、さらに、下記（式１）で相対値を算出する。培養生産性が向上しているとは、対照と比較して、評価サンプルの相対値が５％以上高いことであり、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上高いことである。
（式１）相対値（％）＝［対照のタンパク質濃度］÷「評価サンプルのタンパク質濃度」
本発明のタンパク質は、免疫グロブリンに対して親和性を有するアフィニティーリガンドとして利用できる。本発明のタンパク質をアフィニティーリガンドとして水不溶性の基材からなる担体に固定化する工程を含む方法により、アフィニティー分離マトリックスを製造できる。
ここで、アフィニティーリガンドとは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集（結合）する物質（官能基）を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するタンパク質を指す。本明細書においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同意である。
「免疫グロブリン結合性」は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。測定条件としては、プロテインＡが免疫グロブリンのＦｃ領域に結合した時の結合シグナルが検出できれば良く、温度２０～４０℃（一定温度）にて、ｐＨ６～８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。
結合パラメータとしては、例えば、親和定数（ＫＡ）や解離定数（ＫＤ）を用いることができる（永田他著、「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」、シュプリンガー・フェアラーク東京、１９９８年、４１頁）。本発明のタンパク質のＦｃに対する親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにヒトＩｇＧを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、各ドメイン変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係るタンパク質について、ヒトＩｇＧへの親和定数（ＫＡ）が１×１０５（Ｍ－１）以上、より好ましくは１×１０６（Ｍ－１）以上、さらに好ましくは１×１０７（Ｍ－１）以上であるタンパク質を好適に用いることができる。
アルカリ条件下での化学的安定性の高いアフィニティーリガンドとするためには、変異を導入する前のアミノ酸配列が、配列番号５のＣドメインに由来するアミノ酸配列であることが好ましい。さらには、変異を導入する前のアミノ酸配列が、配列番号５のＣドメインに由来するアミノ酸配列であり、かつ、２９位に対応するアミノ酸残基がＡｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒから選択されるいずれかであることが、より好ましい。また、全てのＬｙｓに対して導入されるアミノ酸残基のうち半数以上がＡｒｇへの置換変異であることが好ましく、全てがＡｒｇへの置換変異であることがより好ましい。全てがＡｒｇへの置換変異である場合に、アルカリ条件下での化学的安定性が、変異導入前と比較して向上し得る。
ここで、アルカリ性条件下における化学的安定性は、免疫グロブリンに対する結合活性を指標として決定することもできるし、ポリペプチド自体の物質としての安定性を指標として決定することもできる。ポリペプチド自体の物質としての安定性を指標とする場合、例えば、電気泳動法によって、アルカリ処理前後のポリペプチドの泳動バンドを比較することで、アルカリ性条件下における化学的安定性を評価することが可能である。具体的には、ごく一般的なＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、デンシトメトリーによるバンド強度を解析することによって化学的安定性を比較可能である。デンシトメトリーによって分析したバンド強度を基準にすると、本発明のポリペプチドは、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中で、２５℃で２４時間静置した後、当該処理をする前と比較して、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることが最も好ましい。
本発明に用いる水不溶性の基材からなる担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機－有機、有機－無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１０００、メタクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
リガンドの固定化方法については、リガンドに存在するリジンのεアミノ基を介して、従来のカップリング法で担体に共有結合する方法であれば、特に限定されない。また、結果的に、一部のリガンドがＮ末端のαアミノ基を介して担体に固定化されても、タンパク質の末端で固定化されるので、本発明の効果が低下することはない。カップリング法としては、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、および、過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化し（あるいは担体表面に反応性官能基を導入し）、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入しても良いし、担体にリガンドを直接固定化しても良い。
本発明のアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質をアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。免疫グロブリン結合性ドメインが結合する領域をＦａｂ領域（特にＦｖ領域）、および、Ｆｃ領域、というように広く定義したが、抗体の立体構造はすでに既知であるので、タンパク質工学的に、プロテインＡが結合する領域の立体構造を保持しつつＦａｂ領域やＦｃ領域にさらなる改変（断片化など）を施すことは可能であり、本発明は、Ｆａｂ領域、および、Ｆｃ領域を、不足なく含有する免疫グロブリン分子、および、その誘導体に限定されるものでもない。したがって、「免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質」とは、プロテインＡが結合するＦｃ領域側の部位を含むタンパク質のことであり、プロテインＡが結合できれば、Ｆｃ領域を完全に含むタンパク質である必要はない。
代表的な免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質としては、免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ここで、「免疫グロブリンＧ誘導体」とは、例えば、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧや、ヒト免疫グロブリンＧのＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　Ｒｅｇｉｏｎｓ）部分を他生物種抗体のＣＤＲ部分に置き換えて融合させたヒト型化免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、ヒト免疫グロブリンＧのＦｖ領域とＦｃ領域とを融合させた人工免疫グロブリンＧなどの、プロテインＡが結合し得る改変型人工タンパク質を総称する名称である。
これらの免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質の精製法は、すでに市販品として存在するプロテインＡカラムを用いたアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献３）。すなわち、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質はカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液（該マトリックスからの解離を促進する物質を含む場合もある）をカラムに通液し、所望の免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。
本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液（適当な変性剤、または、有機溶剤を含む溶液の場合もある）を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。
また、本発明は、上記のアフィニティー分離マトリックスを使用した分離方法により得られる、タンパク質に関する。このタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質であることが好ましい。上記のアフィニティー分離マトリックスを使用して得られるタンパク質は、高純度かつ高濃度の溶液として得られ、抗原に対する結合力などの本来有する活性を損なうことなく保持しているという性質を有する。
以下に実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。本実施例では、組換えＤＮＡの作製や操作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。（１）Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ著、「モレキュラー・クローニング／ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国）。（２）村松正實編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第３版（１９９６）、丸善株式会社刊。また、本実施例で用いる試薬、制限酵素等については特に明記しない限り、市販品を用いた。
実施例で取得した各種タンパク質を「ドメインを示すアルファベット－導入した変異（野生型ではＷｉｌｄ）」の形で表記する。例えば、プロテインＡの野生型Ｃドメインは「Ｃ－ｗｉｌｄ」、変異Ｇ２９Ｅを導入したＣドメイン変異体は「Ｃ－Ｇ２９Ｅ」と表記する。２種類の変異を同時に導入した変異体の表記は、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｇ２９Ｅ、および、変異Ｓ１３Ｌを導入したＣドメイン変異体は、「Ｃ－Ｇ２９Ｅ／Ｓ１３Ｌ」と表記する。また、単ドメインを複数連結したタンパク質は、ピリオドの後に、連結した数に「ｄ」をつけて表記する。例えば、変異Ｇ２９Ｅ、および変異Ｓ１３Ｌを導入したＣドメイン変異体を５連結したタンパク質は「Ｃ－Ｇ２９Ｅ／Ｓ１３Ｌ．５ｄ」と表記する。また、Ｎ末端側から２個目以降のドメインと、最もＮ末端側のドメインに別の変異が入っている場合は２個目以降のドメインの変異は前述の通り表記し、最もＮ末端側のドメインの変異を連結数の後ろに付け加えて表記する。例えば、最もＮ末端側ドメインに変異Ｋ０４Ｑ、２～５個目のドメインに変異Ｋ０４Ｒを導入した、Ｃドメイン変異体を５連結したタンパク質は、「Ｃ－Ｋ０４Ｒ．５ｄ－Ｋ０４Ｑ」と表記する。
（実施例１）Ｃドメイン変異体の調製
配列中にＬｙｓを１残基のみを有する２種類のプロテインＡのＣドメイン変異体Ｃ－（５ｄ－５８Ｋ）（配列番号６）、Ｃ－（１ｄ－７Ｋ）（配列番号７）、及びＣ－（１ｄ－４Ｋ）（配列番号１５）の発現プラスミドを以下の手順で調製した。なお、それぞれの変異体はＣ－Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．５ｄ（配列番号８、以下、Ｃ－（ＮｏｎＫ））を基本配列としており、Ｃ－（５ｄ－５８Ｋ）はＣ末端側ドメインの５８位にＬｙｓを有し、Ｃ－（１ｄ－７Ｋ）はＮ末端側ドメインの７位にＬｙｓを有し、Ｃ－（１ｄ－４Ｋ）はＮ末端側ドメインの４位にＬｙｓを有している。
Ｃ－（ＮｏｎＫ）（配列番号８）をコードし、５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号９）を外注によって全合成した（ユーロフィンジェノミクス社製）。この合成ＤＮＡを鋳型として、プライマー１：５’－ＴＴＣＧｃｔｇｃａｇａｔａａｃＣＧＴｔｔｔａａｃＣＧＴｇａａｃａａ－３’（配列番号１０）と、プライマー２：５’－ＡＣＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡｔｔｔＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＴ－３’（配列番号１１）を用いて、ＰＣＲ法にて、Ｃ－（５ｄ－５８Ｋ）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。また、同様にプライマー３：５’－ＴＴＣＧｃｔｇｃａｇａｔａａｃＣＧＴｔｔｔａａｃＡＡＡｇａａｃａａ－３’（配列番号１２）と、プライマー４：５’－ＡＣＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡａｃｇＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＴ－３’（配列番号１３）を用いて、ＰＣＲ法にて、Ｃ－（１ｄ－７Ｋ）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。また、同様にプライマー５：５’－ＴＴＣＧｃｔｇｃａｇａｔａａｃＡＡＡｔｔｔａａｃＣＧＴｇａａｃａａ－３’（配列番号１４）と、プライマー４：５’－ＡＣＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡａｃｇＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＣＡＴ－３’（配列番号１３）を用いて、ＰＣＲ法にて、Ｃ－（１ｄ－７Ｋ）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩ（タカラバイオ社製）で消化し、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社製）へライゲーションし、配列番号６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡがブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２に挿入された発現プラスミドを調製した。なお、プラスミドの調製にはエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を用いた。Ｃ－（ＮｏｎＫ）、Ｃ－（１ｄ－７Ｋ）（配列番号７）、Ｃ－（１ｄ－４Ｋ）（配列番号１５）をコードするＤＮＡについても同様にプラスミドを調製した。
ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（タカラバイオ社製）を得られたプラスミドで形質転換し、Ｃ－（ＮｏｎＫ）、Ｃ－（５ｄ－５８Ｋ）及びＣ－（１ｄ－７Ｋ）をそれぞれ分泌生産する遺伝子組換え体を育種した。これらの遺伝子組換え体を６０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む３０ｍＬのＡ培地（ポリペプトン　３．０％、酵母エキス　０．５％、グルコース　３％、硫酸マグネシウム　０．０１％、硫酸鉄　０．００１％、塩化マンガン　０．００１％、塩化亜鉛　０．０００１％）にて、３０℃で３日間の振盪培養を行った。
培養後、培養液を採取し、分光光度計を用いて６００ｎｍにおける濁度を分析した。また、培養液から遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２５℃、５分間）により菌体を除去した後、高速液体クロマトグラフィーで培養上清中のＣドメイン変異体の濃度を測定した。次に、得られた培養上清に酢酸を添加してｐＨを４．５に調整後、一時間静置し、目的のタンパク質を沈殿させた。遠心分離で沈殿を回収し、緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．５）にて溶解した。次に、ＨｉＴｒａｐ　Ｑカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を利用した陰イオン交換クロマトグラフィーにて目的タンパク質を精製した。具体的には、目的タンパク質溶液を、陰イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０）にて平衡化したＨｉＴｒａｐ　Ｑカラムに添加し、陰イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陰イオン交換緩衝液Ａと陰イオン交換緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出される目的タンパク質を分取した。分取した目的タンパク質溶液を超純水で透析し、透析後の水溶液を最終精製サンプルとした。なお、カラムを用いたクロマトグラフィーによるタンパク質精製は、全てＡＫＴＡ　ａｖａｎｔシステム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を利用して実施した。
（実施例２）Ｃドメイン変異体固定化アフィニティー分離マトリックスの評価
水不溶性基材として、結晶性高架橋セルロース（ＪＮＣ社製、特開２００９－２４２７７０号公報、米国特許出願公開第２００９／００６２１１８号明細書に記載の方法により得られるゲル）を使用した。概基材３．５ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ－２）上、ｐＨ３の０．０１Ｍクエン酸バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物、ＲＯ水を用いて調製）で置換後、遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）内で液量を６ｍＬとした。これに２２．５ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を２ｍＬのＲＯ水に溶解させた水溶液を加え、ミックスローター（ＡＺＯＮＥ社製ミックスローターＭＲ－３　１－３３６－０５）にて、６℃で約３０分間振とうした。グラスフィルター上で、十分量のＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有担体を得た。
このホルミル基含有担体３．５ｍＬをグラスフィルター上で、０．６Ｍ　クエン酸　バッファー（ｐＨ１２）（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）で置換後、遠沈管内で全量を７．５ｍＬとした。これに実施例１で調製した精製サンプルを加え、ミックスローターにて、６℃で２３時間振とうした。
その後、２．４Ｍクエン酸水溶液（和光純薬工業社製クエン酸１水和物とＲＯ水で調整）でｐＨ８とし、６℃で４時間振とうを継続した。続けて、５．５重量％濃度のジメチルアミンボラン水溶液（和光純薬工業社製ジメチルアミンボランとＲＯ水で調製）を１．９３ｍＬ加えて、２５℃、１８時間振とうした。反応後、反応液の２７５ｎｍの吸収極大の吸光度（ＡＢＳ２７６）を測定した。
この担体をグラスフィルター上、ＲＯ水を用いて、洗浄濾液の電気伝導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、更に、０．１Ｍクエン酸水溶液（クエン酸１水和物）、水酸化ナトリウム・硫酸ナトリウム混合水溶液（０．０５Ｍ　水酸化ナトリウム、０．５Ｍ硫酸ナトリウム）、クエン酸緩衝液（０．５Ｍクエン酸三ナトリウム２水和物―クエン酸１水和物、ｐＨ＝６）にて順次洗浄した。最終的にＲＯ水を用いて、洗浄濾液の電気伝導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、実施例１で調製サンプルをリガンドとして固定化したアフィニティー分離マトリックスを得た。これらのアフィニティー分離マトリックスを用いて、下記条件で動的結合容量を測定した。固定化収率及び動的結合容量（ＤＢＣ）の結果を表１に示す。
＜動的結合容量の測定＞
（１）溶液調製
下記Ａ～Ｅ液及び中和液を調製し、使用前に脱泡した。
Ａ液：シグマ社製「Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ」とＲＯ水（逆浸透膜精製水）で調製）を用いてｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を調製した。
Ｂ液：酢酸、酢酸ナトリウム、およびＲＯ水を用いてｐＨ３．５の３５ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を調製した。
Ｃ液：酢酸とＲＯ水を用いて１Ｍ酢酸水溶液を調製した。
Ｄ液：バクスター社製ガンマガード（ポリクロナール抗体）と前記Ａ液を用いて濃度３ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ水溶液を調製した。
Ｅ液：水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム及びＲＯ水で０．１Ｍ　ＮａＯＨ、１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液を調製した。
中和液：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとＲＯ水で２Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを調製した。
（２）充填、準備
カラムクロマトグラフィー用装置として、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥヘルスケア社製）を用い、Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥヘルスケア社製）、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに、アフィニティー分離マトリックスを３ｍＬ入れ、線速２３０ｃｍ／ｈで０．２ＭのＮａＣｌ水溶液（ＲＯ水使用）を１５分通液して充填した。フラクションコレクターに１５ｍＬの採取用チューブをセットし、溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れておいた。
（３）ＩｇＧ精製
前記カラムにＡ液を１５ｍＬ通液し、次いでＤ液を必要量通液した。次いで、Ａ液を２１ｍＬ通液後、Ｂ液を１２ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させた。次にＣ液を６ｍＬ、Ｅ液を６ｍＬ、Ａ液を１５ｍＬ通液した。なお各液の流速は０．５ｍＬ／分または１ｍＬ／分とし、吸着体との接触時間が６分または３分となるようにした。
（４）動的結合容量
ＩｇＧが５％破過するまでにアフィニティー分離マトリックスに吸着したＩｇＧ量とアフィニティー分離マトリックス体積からＩｇＧの動的結合容量を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Ｃ末端Ｌｙｓで固定化したＣ－（５ｄ－５８Ｋ）と、Ｎ末端側ドメインの７位のＬｙｓで固定化した　Ｃ－（１ｄ－７Ｋ）、Ｎ末端側ドメインの４位のＬｙｓで固定化したＣ－（１ｄ－４Ｋ）の固定化収率は大差がなかった。一方、ＤＢＣは　Ｃ－（１ｄ－７Ｋ）とＣ－（１ｄ－４Ｋ）のアフィニティー分離マトリックスの方がＣ－（５ｄ－５８Ｋ）よりも高かった。このことから、Ｃ末端Ｌｙｓで固定化するよりも、Ｎ末端側にＬｙｓを配置して固定化する方が、結合容量の高いアフィニティー分離マトリックスを得られることが示された。
（実施例３）Ｃドメイン変異体の固定化収率の評価
実施例１で得たＣ－（ＮｏｎＫ）及びＣ－（１ｄ－７Ｋ）の最終精製サンプルを用いて、実施例２と同様にして、アフィニティー分離マトリックスを調製した。ただし、ホルミル基含有担体と混合する、０．６Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ１２）の代わりに０．２５Ｍ　クエン酸バッファー（ｐＨ１２）を用い、添加した最終精製サンプルの量も変更した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Ｌｙｓを含まないＣ－（ＮｏｎＫ）と比較して、Ｎ末端側ドメインの７位のＬｙｓで固定化したＣ－（１ｄ－７Ｋ）の固定化収率は顕著に高かった。タンパク質のＮ末端αアミノ基で固定化するよりも、タンパク質のＮ末端付近にＬｙｓを配置して固定化する方が固定化収率を高められることが示された。

Claims (16)

  1. 配列番号１～５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列を２以上有するタンパク質において、
    最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数が、他のドメインに由来するアミノ酸配列に含まれるＬｙｓの数より多く、
    最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において、３９位以降に含まれるＬｙｓの数が、１～３８位に含まれるＬｙｓの数を上回らないタンパク質。
  2. 最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｌｙｓが１～８位、および／または５１～５８位にのみ含まれ、５１～５８位に含まれるＬｙｓの数が１～８位に含まれるＬｙｓの数を上回らない、請求項１に記載のタンパク質。
  3. Ｌｙｓが最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の１～８位、および各ドメインの５８位にのみ含まれる、請求項１または２に記載のタンパク質。
  4. 前記他のドメインに由来するアミノ酸配列がＬｙｓを含まない、請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  5. Ｌｙｓが最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の１～８位にのみ含まれる、請求項１または２に記載のタンパク質。
  6. Ｌｙｓが最もＮ末端側のドメインに由来するアミノ酸配列の４位および／または７位にのみ含まれる、請求項５に記載のタンパク質。
  7. 以下に示すアミノ酸残基：
    Ｇｌｎ－９、Ｇｌｎ－１０、Ｐｈｅ－１３、Ｔｙｒ－１４、Ｌｅｕ－１７、Ｐｒｏ－２０、Ａｓｎ－２１、Ｌｅｕ－２２、Ｇｌｎ－２６、Ａｒｇ－２７、Ｐｈｅ－３０、Ｉｌｅ－３１、Ｌｅｕ－３４、Ｐｒｏ－３８、Ｓｅｒ－３９、Ｌｅｕ－４５、Ｌｅｕ－５１、Ａｓｎ－５２、Ｇｌｎ－５５、およびＰｒｏ－５７（残基番号はＣドメインに対応する）のうち、９０％以上が保持されている、
    請求項１～６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  8. 請求項１～７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
  9. 請求項８に記載のＤＮＡを含むベクター。
  10. 請求項９に記載のベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
  11. 請求項８に記載のＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成系、または請求項１０に記載の形質転換体を用いる、請求項１～７のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法。
  12. 請求項１～７のいずれか１項に記載のタンパク質をアフィニティーリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化して得られる、アフィニティー分離マトリックス。
  13. 免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合することを特徴とする、請求項１２に記載のアフィニティー分離マトリックス。
  14. 免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質が免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体である、請求項１３に記載のアフィニティー分離マトリックス。
  15. 請求項１～７のいずれか１項に記載のタンパク質をアフィニティーリガンドとして水不溶性の基材からなる担体に固定する工程を含む、請求項１２～１４のいずれか１項に記載のアフィニティー分離マトリックスの製造方法。
  16. 請求項１２～１４のいずれか１項に記載のアフィニティー分離マトリックスに免疫グロブリンのＦｃ領域を含むポリペプチドを吸着させる工程を含む、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質の精製方法。
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