JP2009297018A

JP2009297018A - 弱酸性域での解離特性を改良した抗体結合性タンパク質及び抗体捕捉剤

Info

Publication number: JP2009297018A
Application number: JP2009007538A
Authority: JP
Inventors: Masaya Honda; 真也本田; Hideki Watanabe; 秀樹渡邊; Hiroyuki Matsumaru; 裕之松丸; Yanwen Feng; 延文馮
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2008-05-16
Filing date: 2009-01-16
Publication date: 2009-12-24
Anticipated expiration: 2029-01-16
Also published as: JP5858394B2

Abstract

【課題】中性域での高い抗体結合活性を損なうことなしに、野生型のプロテインＧの細胞膜外ドメインに比べて、弱酸性域における免疫グロブリンのFc領域との結合性及び／または同Fab領域との結合性が低下した、プロテインＧの細胞膜外ドメインの改良型タンパク質を提供する。
【解決手段】プロテインＧ細胞膜外ドメインと免疫グロブリンＧのＦｃ領域が結合した複合体の立体構造座標データにおいて、Ｆｃ領域から６．５Ａの距離内にあって、露出表面積比４０％以上であるアミノ酸残基を変異対象部位とするか、あるいはプロテインＧ細胞膜外ドメイン−免疫グロブリンＧのＦａｂ領域が結合した複合体の立体構造座標データにおいて、Ｆａｂ領域か４Ａの距離内にあって、露出表面積比４０％以上であるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基を置換して上記改良型タンパク質とする。これらの置換は組み合わされていても良い。
【選択図】なし

Description

本発明は、抗体結合性タンパク質であるプロテインＧの細胞膜外ドメインの新規改良型タンパク質、該タンパク質をコードする核酸、及び該タンパク質の抗体結合性を利用した抗体の捕捉剤に関する。

連鎖球菌由来のタンパク質であるプロテインＧは、抗体の一種である免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する特異的結合活性を有することが知られている（非特許文献１、特許文献１）。プロテインＧは、複数のドメインからなるマルチドメイン型膜タンパク質で、免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質に対する結合活性（以下抗体結合活性と呼ぶ）を示すのは、このうちの一部の細胞膜外ドメインである（非特許文献２）。たとえば、図１および図３に示すG148株由来のプロテインＧの場合、抗体結合活性を示すのは、B1、B2、B3の３つのドメインである（文献によってC1、C2、C3ドメインとも表記される）。また、GX7805株のプロテインＧでは３つの、GX7809のプロテインＧでは２つの抗体結合ドメインが存在する。これらは、いずれも60アミノ酸弱の小型タンパク質で、そのアミノ酸配列の間には高い相同性が見られる（図２）。また、プロテインＧを切断して各々のドメイン単独を単離しても、抗体結合活性は保たれることが知られている（非特許文献３）。

プロテインＧの細胞膜外ドメインは、現在、その選択的な抗体結合活性を利用した多くのプロテインＧ細胞膜外ドメイン含有製品が上市されている（例えば、抗体精製のためのアフィニティークロマトグラフィー用担体（特許文献３、４）や抗体を検出するための検査試薬、研究試薬など）。プロテインＧの細胞膜外ドメインと抗体の結合力は、中性〜弱酸性域で高く、強酸性域で低いことが知られている（非特許文献４）。ゆえに、抗体の単離、回収、精製を目的とした場合、まず、血清等の抗体を含む試料溶液を中性状態にして、プロテインＧの細胞膜外ドメインを固定化したビーズ等の水不溶性の固相支持体に接触させ、抗体を選択的に吸着させる。この後、中性〜弱酸溶液(pH5〜8)で洗浄し抗体以外の成分を除去する。最後にpH2.4〜3.5の強酸性溶液を加え抗体を固定化したプロテインＧから脱着させ、強酸性溶液と共に溶出させることが一般的である（特許文献３）。これにより、高い純度で抗体を単離、回収、精製することができる。

しかし、抗体はpH2.4〜3.5の強酸性溶液におくと変性凝集等で劣化することがあり、抗体の種類によっては、本来の機能を失う場合もある（非特許文献４）。これを防ぐために、pH2.4〜3.5より高いpHの弱酸性域で処理することが試みられるが、プロテインＧの細胞膜外ドメインと抗体の結合力は強いので、弱酸性域では抗体はプロテインＧから溶出せず、十分な回収量が得られない。一方、プロテインG細胞膜外ドメインはFabとも結合することが知られており（非特許文献２）、一つの抗体分子はFc領域とFab領域の２つ領域で、プロテインＧ細胞膜外ドメインと結合可能である。このような結合状態になると、抗体とプロテインGの細胞膜外ドメインは容易に解離できず、抗体の回収は困難になる。

特表平03−501801公報特許第2764021号公報特開平03−128400号公報特開2003−088381号公報

Bjorck L, Kronvall G. (1984) Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent. J Immunol. 133, 969-974. Boyle M. D.P., Ed. (1990) Bacterial Immunoglobulin Binding Proteins. Academic Press, Inc., San Diego, CA, USA. Gallagher T, Alexander P, Bryan P, Gilliland GL. (1994) Two crystal structures of the B1 immunoglobulin-binding domain of streptococcal protein G and comparison with NMR. Biochemistry 19, 4721-4729. Gagnon P. (1996) Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Validated Biosystems Inc., Tucson, AZ, USA.

そこで、本発明は、上記従来技術における問題点を解消することにあり、より具体的には、中性域での高い抗体結合活性を損なうことなしに、野生型のプロテインＧの細胞膜外ドメインに比べて、弱酸性域における免疫グロブリンのFc領域との結合性及び／または同Fab領域との結合性が低下した改良型タンパク質を提供するとともに、この改良型タンパク質を用いて、抗体を変性させることなく容易に捕捉、回収可能にすることを目的とするものである。

本発明者は、プロテインＧの細胞膜外ドメインを固定化した固相支持体から抗体を酸溶出する際に、抗体が強酸によって劣化するのを防ぐには、弱酸性溶液で固相支持体から溶出できるようにプロテインＧの細胞膜外ドメインのアミノ酸配列を改変すれば良いと考え、鋭意研究の結果、プロテインＧの細胞膜外ドメインと抗体の立体構造座標データを用いて、中性域における改変タンパク質の免疫グロブリンFc領域との結合性が、野生型プロテインＧと同等以上であり、かつ弱酸性域における改変タンパク質の抗体結合性は、野生型プロテインＧに比べて大きく低下するプロテインＧ変異体の配列を設計するとともに、さらに、同Fab領域との結合性も大幅に低下した新規な変異体の設計を行った。そして、これら設計に基づき合成された変異体タンパク質が、意図通りの物性を有することを確認し、本発明を完成するに至ったものである。

即ち、本発明は、以下のとおりである。
（１）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインＧ・B1あるいは同B2ドメインタンパク質における、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44のうちのいずれか１個以上のアミノ酸残基を変異対象部位として他のアミノ酸残基に置換した変異体タンパク質であって、該変異対象部位の各アミノ酸残基が、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに示されるアミノ酸残基に置換されたものであることを特徴とする、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B1あるいB2ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質（ただし、Asn35がLysに及び／又は,Asp36がGluに置換されたものであって、該置換箇所以外のアミノ酸配列が野生型プロテインＧのＢ１又はＢ２ドメインタンパク質のアミノ酸配列と同じになるタンパク質を除く。）
（ｉ）変異対象部位のアミノ酸残基が非荷電性アミノ酸残基である場合における、荷電性アミノ酸残基への置換
（ｉｉ）変異対象部位のアミノ酸残基が荷電性アミノ酸残基である場合における、反対の電荷を示す荷電性アミノ酸残基への置換
（ｉｉｉ）変異対象部位のアミノ酸残基のヒスチジン残基への置換。

（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質における、Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44のうちのいずれか１個以上のアミノ酸残基を変異対象部位として他のアミノ酸残基に置換した変異体タンパク質であって、該変異対象部位の各アミノ酸残基が、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに示されるアミノ酸残基に置換されたものであることを特徴とする、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質（ただし、Asn35がLysに、及び／又は,Asp36がGluに置換されたものであって、該置換箇所以外のアミノ酸配列が野生型プロテインＧのＢ３ドメインタンパク質のアミノ酸配列と同じになるタンパク質を除く。）。
（ｉ）変異対象部位のアミノ酸残基が非荷電性アミノ酸残基である場合における、荷電性アミノ酸残基への置換
（ｉｉ）変異対象部位のアミノ酸残基が荷電性アミノ酸残基である場合における、反対の電荷を示す荷電性アミノ酸残基への置換
（ｉｉｉ）変異対象部位のアミノ酸残基のヒスチジン残基への置換。

（３）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインＧ・B1、Ｂ２、あるいはＢ３ドメインタンパク質における、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38のうちのいずれか１個以上のアミノ酸残基を変異対象部位として、システインを除く他の種類のアミノ酸残基に置換したものであることを特徴とする、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に結合活性を有し、かつ各対応する野生型プロテインG・B1、Ｂ２あるいはＢ３ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合性が低下した変異体タンパク質（ただし、Asn35がLysに及び／又は，Asp36がGluに置換されたものであって、該置換箇所以外のアミノ酸配列が野生型プロテインＧのＢ１、Ｂ２あるいはＢ３ドメインタンパク質のアミノ酸配列と同じになるタンパク質を除く。）

（４）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインＧ・B1あるい同B2ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、上記（1）に記載のアミノ酸残基の置換と上記（３）に記載の野生型プロテインＧ・Ｂ１、Ｂ２ドメインに対するアミノ酸残基の置換を共有していることを特徴とする、免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B1あるい同B2ドメインタンパク質に比べ、それぞれ免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及びＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。

（５）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、上記（２）に記載のアミノ酸残基の置換と上記（３）に記載の野生型プロテインＧ・Ｂ３ドメインに対するアミノ酸残基の置換を共有していることを特徴とする、免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質に比べ、それぞれ免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及びＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。

（６）野生型プロテインＧ・B１ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(a)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（a）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインＧ・B１ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(a)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGluを、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又はLys、X36がAsp又はGlu、X37がAsnまたはLeu、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）

（７）野生型プロテインＧ・B２ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(ｂ)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｂ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインＧ・B２ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(b)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGluを、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又はLys、X36が Asp又はGlu、X37がAsn又はHis、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）

（８）野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(ｃ)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｃ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(c)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGlu、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又は Lys、X36がAsp又はGlu、X37がAsn又はHis、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）

（９）野生型プロテインＧ・B１ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の（ｄ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｄ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B１メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(d)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）

（１０）野生型プロテインＧ・B２ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の（ｅ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｅ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B２メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(e)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）

（１１）野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の（f）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（f）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B３メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(f)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）

（１２）野生型プロテインＧ・B1ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の（ｇ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｇ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインＧ・B1ドメインタンパク質に比べ、Ｆｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(g)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAspであって、かつX42がGluになる場合を除く。）

（１３）野生型プロテインＧ・B2ドメインタンパク質の各変異体タンパク質であって、以下の（ｈ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｈ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・Ｂ２ドメインタンパク質に比べ、Ｆｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(h)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAspであって、かつX42がGluになる場合を除く。）

（１４）野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質の各変異体タンパク質であって、以下の（ｉ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｉ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質に比べ、Ｆｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(i)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGlnであって、かつX40がAspになる場合を除く。）

（１５）配列番号１３〜２０のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる、上記（６）に記載の変異体タンパク質。

（１６）上記（１）〜（１５）のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列とリンカーペプチドあるいはリンカータンパク質のアミノ酸配列が交互に並んだアミノ酸配列からなるタンパク質。

（１７）上記（１）〜（１６）のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列を連結したアミノ酸配列からなる融合タンパク質。

（１８）上記（１）〜（１７）のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。

（１９）配列番号２２〜２９のいずれかで示される塩基配列からなる核酸。

（２０）上記（１８）又は（１９）に記載の核酸の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B１ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質をコードする核酸。

（２１）上記（１８）〜（２０）のいずれかに記載の核酸を含有する組換えベクター。

（２２）上記（２１）に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。

（２３）上記（１）〜（１７）のいずれかに記載のタンパク質が、水不溶性の固相支持体に固定化されていることを特徴とする、固定化タンパク質。

（２４）上記（１）〜（１７）のいずれかに記載のタンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫グロブリンＧあるいは免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質の捕捉剤。

（２５）上記（２３）に記載の固定化タンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫グロブリンＧあるいは免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質の捕捉剤。

本発明によれば、中性域において本来の抗体結合活性を維持しつつ、[配列番号1]で表されるアミノ酸配列からなる野生型のプロテインＧ・B1ドメインに比べて、弱酸性域における免疫グロブリンGのFc領域との結合性が大きく低下させる変異体タンパク質が提供可能となり、また、免疫グロブリンGのFab領域の結合性も低下させた変異体タンパク質も提供することができる。さらにこれら変異体タンパク質における変異を組み合せた変異体タンパク質は、捕捉した抗体を弱酸性領域において、変性のない状態でより容易に溶出することが可能となる。
一方、現在、野生型のプロテインＧ細胞膜外ドメインは、抗体の精製用のアフィニティークロマトグラフィー担体や抗体検出のための検査試薬として市販され、ライフサイエンスの各分野で広範に利用されている。また、近年の抗体医薬をはじめとする抗体関連産業の発展をうけて、これらの製品の需要が飛躍的に拡大している。したがって、多くのプロテインＧ細胞膜外ドメイン含有製品において、本発明のような改良型タンパク質を野生型と代替することにより、酸溶出に伴う抗体の劣化を低減することを可能にし、抗体を扱う広範な技術分野において、その技術発展に大いに資するものである。

Streptococcus sp. G148由来のプロテインＧの遺伝子の構造を示す図である。プロテインＧの抗体結合ドメインのアミノ酸配列を示す図である（下線部はＢ１ドメインとの相違部分）。 Streptococcus sp. G148由来のプロテインＧの遺伝子の塩基配列（配列番号30）を示す図である（下線部が構造遺伝子、二重下線部が抗体結合ドメインに対応）。 oxaloacetate decarboxylase alpha-subunit c-terminal domain(OXADac)−プロテインＧ変異体融合タンパク質のN末配列（配列番号31）を示す図である（下線部がOXADacに対応するアミノ酸配列）。プロテインG・B2ドメインとヒト免疫グロブリンＧ₁のＦｃ領域の複合体の立体構造を示す図である。プロテインG・B3ドメインとマウス免疫グロブリンＧ₁のＦａｂ領域の複合体の立体構造を示す図である。固定化カラムを用いた改良型タンパク質の弱酸性域での抗体解離性評価(1)の結果を示すグラフである。固定化カラムを用いた改良型タンパク質の弱酸性域での抗体解離性評価(2)の結果を示すグラフである。改良型タンパク質の抗体結合解離活性を表面プラズモン共鳴(SPR)法により評価した結果である。上段より、それぞれM-PG01、M-PG07、M-PG19のセンサーグラムを示す。改良型タンパク質の濃度は、100, 200, 300, 400, 500 nMである。改良型タンパク質の抗体親和性（1/K_D）のpH依存性を示すグラフである。改良型タンパク質の抗体親和性の相対的変化を示すグラフである。各pHにおける解離定数（K_D）を、pH7.4のK_Dで規格化してある。改良型タンパク質M-PG19の立体構造（左）を示す図である。比較のため野生型プロテインG・B1ドメインの立体構造（右）をあわせて示す。

連鎖球菌由来のタンパク質であるプロテインＧは、抗体の一種である免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する特異的結合活性を有することが知られており（参照文献１）、この抗体結合性を利用した抗体の精製や除去、および抗体を利用した診断、治療、検査等に有用なタンパク質である。プロテインＧは、複数のドメインからなるマルチドメイン型膜タンパク質で、免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質に対する結合活性（以下抗体結合活性と呼ぶ）を示すのは、このうちの一部の細胞膜外ドメインである（参照文献２）。たとえば、図１、図３、および[配列番号30]に示すG148株由来のプロテインＧの場合、抗体結合活性を示すのは、B1、B2、B3の３つのドメインである（文献によってC1、C2、C3ドメインとも表記される）。また、GX7805株のプロテインＧでは３つの抗体結合ドメインが、GX7809のプロテインＧでは２つの抗体結合ドメインが存在する。これらは、いずれも60アミノ酸弱の小型タンパク質で、そのアミノ酸配列の間には高い相同性が見られる（図２）。また、プロテインＧを切断して各々のドメイン単独を単離しても、抗体結合活性は保たれることが知られている（参照文献３）。

本発明の改良型タンパク質は、上記プロテインＧのアミノ酸配列をもとに人為的に設計したアミノ酸配列からなるものであって、中性域での高い抗体結合活性を損なうことなしに、野生型のプロテインＧの細胞膜外ドメインに比べて、弱酸性域での抗体結合活性が弱く、弱酸性溶液での抗体の溶出を可能にする。

Ａ．本発明の改良型タンパク質の第１の態様は以下の（１）、（２）で示される。
（１）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインＧ・B1あるいは同B2ドメインタンパク質における、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44のうちのいずれか１個以上のアミノ酸残基を変異対象部位として他のアミノ酸残基に置換した変異体タンパク質であって、該変異対象部位の各アミノ酸残基が、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに示されるアミノ酸残基に置換されたものであることを特徴とする、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B1あるいB2ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
（ｉ）変異対象部位のアミノ酸残基が非荷電性アミノ酸残基である場合における、荷電性アミノ酸残基への置換
（ｉｉ）変異対象部位のアミノ酸残基が荷電性アミノ酸残基である場合における、反対の電荷を示す荷電性アミノ酸残基への置換
（ｉｉｉ）変異対象部位のアミノ酸残基のヒスチジン残基への置換。

（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質における、Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44のうちのいずれか１個以上のアミノ酸残基を変異対象部位として他のアミノ酸残基に置換した変異体タンパク質であって、該変異対象部位の各アミノ酸残基が、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに示されるアミノ酸残基に置換されたものであることを特徴とする、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
（ｉ）変異対象部位のアミノ酸残基が非荷電性アミノ酸残基である場合における、荷電性アミノ酸残基への置換
（ｉｉ）変異対象部位のアミノ酸残基が荷電性アミノ酸残基である場合における、反対の電荷を示す荷電性アミノ酸残基への置換
（ｉｉｉ）変異対象部位のアミノ酸残基のヒスチジン残基への置換。

上記（１）および（２）の変異体タンパク質は以下のように選定された変異対象部位及び該部位を置換するアミノ酸残基に基づき設計され、遺伝子工学的手法により得られる。

〔Ｆｃとの結合表面解析にもとづく変異対象部位の選定と置換するアミノ酸残基の特定〕
本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列を設計するための変異を導入する部位は、プロテインＧ・B2ドメインと免疫グログリンＧのＦｃ領域が結合した複合体の立体構造原子座標データ（参照文献４）を用いて選定したものである。
弱酸性域におけるプロテインＧの細胞膜外ドメインの抗体結合性を低下させるには、Ｆｃ領域との結合に直接関与しているプロテインＧの細胞膜外ドメインの結合表面のアミノ酸残基およびその周辺のアミノ酸残基を野生型から非野生型に置換すればよい。したがって、まず、プロテインＧ・B2ドメインと免疫グログリンＧのＦｃ領域が結合した複合体において、Ｆｃ領域から一定の距離の範囲内に存在するプロテインＧ・B2ドメインのアミノ酸残基を特定し、これを変異対象部位の候補とする。ついで、アミノ酸置換に伴うプロテインＧの細胞膜外ドメインの構造不安定化を最小限にするために、上記の候補のうち、プロテインＧ・B2ドメインの分子表面に露出しているアミノ酸残基のみを変異対象部位と決定した。

したがって、具体的には、後記実施例に示されるように、上記の距離範囲を6.5オングストローム以内と設定し、かつ露出表面積比を40%以上することで、プロテインG・B2ドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号２）のうちの、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44の１３個が変異対象部位として選定された。
また、上記したように、プロテインＧの各細胞膜外ドメインは配列相同性が極めて高く、B1、B2、B3ドメインの立体構造の差異もほとんどがないことから、Ｂ２ドメイン−Ｆｃ複合体の立体構造についての知見は、Ｂ１及びＢ３ドメイン−Ｆｃ複合体にも適用できる。したがって、Ｂ２ドメイン−Ｆｃ複合体の立体構造から導いた１３個が変異対象部位は、相当する位置に同じ種類のアミノ酸がある限りにおいて、B2ドメインのみならず、B1およびB2ドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。即ち、プロテインG・B1ドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号１）のうちの、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44の１３個が、また、プロテインG・B3ドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号３）のうちの、Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44の10個が変異対象部位として選定された。

一方、該変異対象部位の元のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基は、以下の（ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれかを特定した。
（ｉ）変異対象部位の野生型のアミノ酸残基が非荷電性の側鎖を有するアミノ酸（Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Pro）の場合は、荷電性の側鎖を有するアミノ酸（Asp、Glu、Lys、Arg、His）に置換する。荷電性アミノ酸は、ｐHに依存して化学的状態が大きく変化するので、プロテインＧ・B2ドメインの抗体結合性を中性域と弱酸性域で変化させることができる。
（ｉｉ）変異対象部位の野生型のアミノ酸残基が荷電性アミノ酸の場合は、反対の電荷を示す荷電性アミノ酸に置換する。上記と同様に、荷電性アミノ酸は、ｐHに依存して化学的状態が大きく変化するので、プロテインＧ・B2ドメインの抗体結合性を中性域と弱酸性域で変化させることができる。
（ｉｉｉ）変異対象部位の野生型のアミノ酸残基がヒスチジン以外の場合は、ヒスチジンに置換する。ヒスチジンは、中性域と弱酸性域で化学的状態が大きく変化するので、プロテインＧ・B2ドメインの抗体結合性を中性域と弱酸性域で変化させることができる。

具体的には、後記実施例に示されるように、置換位置のアミノ酸残基として、Asp22についてはLys、Arg、またはHisが、Ala24（Ｂ１，Ｂ２ドメインのみ）、についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Thr25についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys28についてはAsp、Glu、またはHisが、Val29（Ｂ１，Ｂ２ドメインのみ）についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys31についてはAsp、Glu、またはHisが、Gln32についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Asn35についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Asp36についてはLys、Arg、またはHisが、Gly38についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Asp40についてはLys、Arg、またはHisが、Glu42（Ｂ１，Ｂ２ドメインのみ）についてはLys、Arg、またはHisが、Thr44についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが特定された。ただし、これらのアミノ酸残基の特定によるアミノ酸配列が、Asn35がLys及び／又は,Asp36がGluに置換されたものであって、該置換箇所以外のアミノ酸配列が野生型プロテインＧの各細胞膜ドメインのアミノ酸配列と同じになる場合は除かれる。これにより、後記する本発明者の出願に係るプロテインＧ細胞膜ドメインの安定性を向上させた変異体タンパク質とは区別される。

Ｂ．本発明の改良型タンパク質の第２の態様は以下の（３）で示される。
（３）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインＧ・B1、Ｂ２あるいはＢ３ドメインタンパク質における、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38のうちのいずれか１個以上のアミノ酸残基を変異対象部位として、システインを除く他の種類のアミノ酸残基に置換したものであることを特徴とする、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に結合活性を有し、かつ各対応する野生型プロテインG・B1、Ｂ２あるいはＢ３ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合性が低下した変異体タンパク質。
上記（３）の変異体タンパク質は以下のように選定された変異対象部位及び該部位を置換するアミノ酸残基に基づき設計され、遺伝子工学的手法により得られる。

〔Ｆａｂとの結合表面解析にもとづく変異対象部位の選定と置換するアミノ酸残基の特定〕
本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列を設計するための変異を導入する部位は、プロテインＧ・B3ドメインと免疫グログリンＧのＦａｂ領域が結合した複合体の立体構造原子座標データ（参照文献５）を用いて選定したものである。プロテインＧの細胞膜外ドメインは、免疫グログリンＧのＦｃ領域に対しても、Ｆａｂ領域に対しても結合することが知られている（参照文献２）。したがって、１つの抗体分子は、同時に複数のプロテインＧの細胞膜外ドメインと結合することが可能で、このような状態になると抗体とプロテインＧの細胞膜外ドメインとの相互作用は多価となり容易に切断することができなくなる。よって、弱酸性域におけるプロテインＧの細胞膜外ドメインの抗体結合性を低下させるには、Ｆａｂ領域との結合に直接関与しているプロテインＧの細胞膜外ドメインの結合表面のアミノ酸残基を野生型から非野生型に置換すればよい。したがって、まず、プロテインＧ・B3ドメインと免疫グログリンＧのＦａｂ領域が結合した複合体において、Ｆａｂ領域から一定の距離の範囲内に存在するプロテインＧ・各細胞膜B3ドメインのアミノ酸残基を特定し、これを変異対象部位の候補とした。ついで、アミノ酸置換に伴うプロテインＧの細胞膜外ドメインの構造不安定化を最小限にするために、上記の候補のうち、プロテインＧ・B3ドメインの分子表面に露出しているアミノ酸残基のみを変異対象部位と決定した。

具体的には、後記実施例に示されるように、上記の距離範囲を4.0オングストローム以内と設定し、かつ露出表面積比を40%以上することで、[配列番号3]で示されるプロテインG・B3ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38の１０個が変異対象部位として選定された。また、上記したように、プロテインＧの各細胞膜外ドメインは前記したように相同性が極めて高く、これらの変異対象部位は、B1、B2、B3のどのドメインにおいても共通に存在する。よって、これらはB3ドメインのみならず、B1およびB2ドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。

一方、該変異対象部位の元のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基は、以下の方法で特定することができる。（ｉＶ）野生型のアミノ酸とシステイン以外の他の種類のアミノ酸残基に置換する。これにより、システインの導入に伴う架橋反応の危険性をなくしたうえで、野生型のアミノ酸の変異によるＦａｂ領域との結合性の低下を導くことができる。
具体的には、後記実施例に示されるように、野生型プロテインG各細胞外ドメインタンパク質を置換するアミノ酸残基として、Lys10についてはLysとCys以外が、Thr11についてはThrとCys以外が、Lys13についてはLysとCys以外が、Gly14についてはGlyとCys以外が、Glu15についてはGluとCys以外が、Thr16についてはThrとCys以外が、Thr17についてはThrとCys以外が、Asn35についてはAsnとCys以外が、Asp36についてはAspとCys以外が、Gly38についてはGlyとCys以外が特定された。ただし、これらのアミノ酸残基の選定によるアミノ酸配列が、Asn35がLys及び／又はAsp36がGluに置換されたものであって、該置換箇所以外のアミノ酸配列が野生型プロテインＧの各細胞膜ドメインのアミノ酸配列と同じになる場合は除かれる。これにより、後記する本発明者の出願に係るプロテインＧ細胞膜ドメインの安定性を向上させた変異体タンパク質とは区別される。

Ｃ．本発明の改良型タンパク質の第３の態様は、上記免疫グロブリンFc領域に対する結合性を改良するためのアミノ酸残基の置換とFab領域への結合性を改良するためのアミノ酸残基の置換を共有するものである。

〔ＦｃおよびＦａｂとの結合表面解析にもとづく変異対象部位の選定と置換するアミノ酸残基の特定〕
上記Ｆｃとの結合表面解析にもとづいて特定した変異対象部位と置換するアミノ酸残基と、上記Ｆａｂとの結合表面解析にもとづいて特定した変異対象部位と置換するアミノ酸残基と組み合わせて、変異対象部位の選定と置換するアミノ酸残基の特定を行う。
具体的には、変異対象部位として、プロテインG・B1、B2ドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号１，２）のうちの、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38の２０個が変異対象部位として選定される。このうちAsp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42 、Thr44はFc領域に対する結合性を改良するためのターゲット部位であり、また、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17は、Fab領域に対する結合性を改良するためのターゲット部位である。ここで、Asn35、Asp36、Gly38は、Fc領域に対する結合性の改良部位であるとともにFab領域に対する結合性の改良部位でもある。したがって、Asn35、Asp36、Gly38に対するFc領域に対する結合性の改良のための上記Ａに示すアミノ酸残基に置換は、同時にFab領域に対する結合性の改良のための、システイン残基を除く他のアミノ酸残基への置換でもある。

すなわち、本明細書にいうアミノ酸残基置換の「共有」とは、Ｆｃ領域に対する結合性の改良のための変異対象部位とＦａｂ領域に対する結合性の改良のための変異対象部位とが異なるように選定した場合において、アミノ酸残基の置換を組み合わせる場合の他に、これら両者の結合性の改良のための変異対象部位として同一の部位を選定し、上記Ａに示すアミノ酸残基の置換を行う場合をも意味するものと定義される。

置換するアミノ酸残基として、Asp22についてはLys、Arg、またはHisが、Ala24についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Thr25についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys28についてはAsp、Glu、またはHisが、Val29についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys31についてはAsp、Glu、またはHisが、Gln32についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Asp40についてはLys、Arg、またはHisが、Glu42についてはLys、Arg、またはHisが、Thr44についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys10についてはLysとCys以外が、Thr11についてはThrとCys以外が、Lys13についてはLysとCys以外が、Gly14についてはGlyとCys以外が、Glu15についてはGluとCys以外が、Thr16についてはThrとCys以外が、Thr17についてはThrとCys以外が、Asn35についてはAsnとCys以外が、Asp36についてはAspとCys以外が、Gly38についてはGlyとCys以外が選定される。

一方、プロテインG・Ｂ３ドメインについては、野生型アミノ酸配列（配列番号３）のうちの、Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asp40、Thr44、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38の１７個が変異対象部位として選定される。このうちAsp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asp40、Thr44はFc領域に対する結合性を改良するための変異対象部位であり、また、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17は、Fab領域に対する結合性を改良するための変異対象部位である。これにおいてもAsn35、Asp36、Gly38は、Fc領域に対する結合性の改良部位であるとともにFab領域に対する結合性の改良部位でもある点で共通しており、Asn35、Asp36、Gly38に対するFc領域に対する結合性の改良のための上記Ａに示すアミノ酸残基に置換は、同時にFab領域に対する結合性の改良のためのシステイン残基を除く他のアミノ酸残基への置換でもあることは、上記プロテインＧ・Ｂ１あるいはＢ２ドメインと同様である。

ただし、上記アミノ酸残基の選定に基づき設定されるアミノ酸配列が、Asn35がLys及び／又は,Asp36がGluに置換されたものであって、該置換箇所以外のアミノ酸配列が野生型プロテインＧの各細胞膜ドメインのアミノ酸配列と同じになる場合は除かれる。これにより、後記する本発明者の出願に係るプロテインＧ細胞膜ドメインの安定性を向上させた変異体タンパク質とは区別される。

本発明の改良型タンパク質の具体例を挙げれば、以下ａ）〜ｃ）に示される。
ａ）野生型プロテインＧ・B１ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(a)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（a）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインＧ・B１ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(a)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGluを、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又はLys、X36がAsp又はGlu、X37がAsnまたはLeu、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）

ｂ）野生型プロテインＧ・B２ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(ｂ)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｂ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインＧ・B２ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(b)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGluを、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又はLys、X36がAsp又はGlu、X37がAsnまたはLeu、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）

ｃ）野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(ｃ)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｃ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(c)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGlu、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又はLys、X36がAsp又はGlu、X37がAsnまたはLeu、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）
なお、上記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸残基の定義中、ただし書きは、野生型プロテインＧの各細胞膜ドメインタンパク質及び後記する本発明者の出願に係るプロテインＧ細胞膜ドメインの安定性を向上させた変異体タンパク質と区別するためのものである。

さらに具体的な本発明の改良型タンパク質は、以下のｄ）〜ｉ）に示される。
ｄ）野生型プロテインＧ・B１ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の（ｄ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｄ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B１メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(d)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）

ｅ）野生型プロテインＧ・B２ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の（ｅ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｅ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B２メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(e)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）

ｆ）野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の（f）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（f）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B３メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(f)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）

ｇ）野生型プロテインＧ・B1ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の（ｇ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｇ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインＧ・B1ドメインタンパク質に比べ、Ｆｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(g)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAspであって、かつX42がGluになる場合を除く。）

ｈ）野生型プロテインＧ・B2ドメインタンパク質の各変異体タンパク質であって、以下の（ｈ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｈ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・Ｂ２ドメインタンパク質に比べ、Ｆｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(h)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAspであって、かつX42がGluになる場合を除く。）

ｉ）野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質の各変異体タンパク質であって、以下の（ｉ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｉ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質に比べ、Ｆｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(i)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGlnであって、かつX40がAspになる場合を除く。）
なお、上記（ｄ）〜（ｉ）のアミノ酸残基の定義中、ただし書きは、野生型プロテインＧの各細胞膜ドメインタンパク質を区別するためのものである。

上記から明らかなように、本発明の改良型タンパク質の設計において、選定される変異対象部位及び該部位を置換するアミノ酸残基は、各一つに限られるものではないので、変異対象部位及び該部位を置換するアミノ酸残基の中から適宜選択して、改良型タンパク質のアミノ酸配列を設計することができる。
たとえば、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合性の改良のため、変異対象部位として、野生型プロテインＧ・Ｂ１あるいはＢ２ドメインのアミノ酸配列中のAsp22、Thr25、Gln32、Asp40、およびGlu42を選択し、これに対応する置換するアミノ酸残基として、Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、およびGlu42Hisを選択し、いずれか１のアミノ酸置換あるいはこれらアミノ酸置換を組み合わせた最大５変異箇所/5置換までの点変異あるいは多重変異をプロテインＧ・B1あるいはB2ドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号１、２）に対して行うことで、複数の改良型タンパク質のアミノ酸配列を設計することができる。
上記した、（ｇ）、（ｈ）のアミノ酸配列は、このような最大５変異箇所／５置換までの点変異及び多重変異を示したものであり、本発明の改良型タンパク質の一例である。

また、上記免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合性の改良に加え、さらにＦａｂ領域に対する結合性の改良をも加えた改良型タンパク質の例として、例えば、野生型プロテインＧ・Ｂ１あるいはＢ２ドメインのThr11およびThr17を選択し、これに対応する置換するアミノ酸残基として、Thr11ArgおよびThr17Ileを選択し、これらを上記最大5変異箇所/5置換までの変異に加えて導入した最大７変異箇所/７置換の変異をプロテインＧ・Ｂ１あるいはB2ドメインの野生型アミノ酸配列に対して行った変異体タンパクを挙げることができる。
上記した（ｄ）及び（ｅ）のアミノ酸配列は、このような最大7変異箇所/7置換までの点変異あるいは多重変異の例を示したものであり、これらアミノ酸配列のうち、Thr11Arg及び／またはThr17Ileの変異を有し、かつ上記Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、およびGlu42Hisで示される変異のうちいずれか一以上の変異を有するものは、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合性の改良に加え、さらにＦａｂ領域に対する結合性も改良されたものとなる。

一方、上記（ｉ）のアミノ酸配列は、野生型プロテインＧ・Ｂ３の改良型タンパク質のアミノ酸配列の例ではあるが、上記Ｆｃ領域に対する結合性改良のための変異であるAsp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40Hisのうちいずれか１以上、最大４変異箇所／４置換までの変異となっている他は（ｇ）、（ｈ）のアミノ酸配列と同様に設計されたものである。
また、上記（ｆ）のアミノ酸配列は、野生型プロテインＧ・Ｂ３の改良型タンパク質のアミノ酸配列の例ではあるが、上記Ｆｃ領域に対する結合性改良のための変異であるAsp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、上記Ｆａｂ領域に対する結合性の改良のための変異であるThr11Arg、Thr17Ileのうちいずれか１以上、最大６変異箇所/６置換までの変異となっている他は（ｄ）、（ｅ）のアミノ酸配列と同様に設計されたものである。

本発明においては、このような変異に加えて、さらに、プロテインＧの細胞膜外ドメインの性質を好ましいものに変化させることが既に知られている変異をさらに加えることができる。
例えば、プロテインＧの細胞膜外ドメインの熱安定性、変性剤に対する化学的安定性、および分解酵素に対する耐性を向上させる変異手法が、本発明者らの従前の研究により明らかにされている（特願2007-293726号）。
すなわち、Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys、およびAla48Gluのうち一以上の変異の導入は、プロテインＧ・Ｂ１、Ｂ２あるいはＢ３ドメインの上記安定性を向上させる。
これらの変異は、本発明における免疫グロブリンGのFｃ領域に対する結合特性及び／又はＦａｂ領域に対する結合特性の改良のための上記変異と組み合わせることにより、本発明の改良型タンパク質はより有用なものとなる。

例えば、これらの変異を上記したような最大7変異箇所/7置換に加えて導入した最大12変異箇所/14置換までの多重変異をプロテインＧ・Ｂ１あるいはB2ドメインの野生型アミノ酸配列(配列番号１，２)に対して行うことで、さらに安定化された、複数の改良型タンパク質のアミノ酸配列を設計することができる。
上記した、（ａ）、（ｂ）のアミノ酸配列は、このような最大12変異箇所/14置換の点変異及び多重変異を示したものであるが、野生型の配列に加え安定化のためだけの変異は除かれている。
これらの（ａ）、（ｂ）のアミノ酸配列中、Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys及び Ala48Gluのうち、いずれか一以上の変異の導入は、上記の最大7変異箇所/7置換の効果である免疫グロブリンGのFab領域に対する結合特性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合特性の改良に加え、プロテインＧ・Ｂ１あるいはB2ドメイン変異体タンパク質の安定性を向上させる。

一方、上記（ｃ）は、野生型プロテインＧ・Ｂ３の改良型タンパク質のアミノ酸配列の例を示し、最大１１変異箇所／１３置換の点変異及び多重置換を示しているが、上記Ｆｃ領域に対する結合性改良のための変異のための、Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40Hisのうちいずれか１以上、最大４変異箇所／４置換までの変異となっている他は（ａ）、（ｂ）のアミノ酸配列と同様に設計されたものである。したがって、（ｃ）のアミノ酸配列中、Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys及び Ala48Gluのうち、いずれか一以上の変異の導入は、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合特性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合特性の改良に加え、同様にプロテインＧ・Ｂ３ドメイン変異体タンパク質の安定性を向上させる。

本発明における変異対象部位は、上記したようにプロテインＧのＢ２ドメイン−Ｆｃ複合体及び同Ｂ３ドメイン−Ｆａｂ複合体の各立体構造原子座標データを用いて選定されたものであるが、B1ドメインは、アミノ酸配列のみならず（図２）、立体構造においてもB2、ドメインと差異はほとんどないから、上記選定された変異の効果は、それぞれのドメインに等しく有効である。また、B3ドメインは、アミノ酸配列のみならず（図２）、立体構造においてもB2ドメインと差異はほとんどないから、Ｂ２ドメインにおける上記選定された変異の効果は、各々のドメインに等しく有効である。

例えば、上記選定された12変異箇所の野生型アミノ酸残基は、上記B2ドメインと上記B1ドメインの間ですべて共通である。したがって、上記選定された5変異箇所/5置換、あるいは7変異箇所/7置換、あるいは12変異箇所/14置換を組み合わせた点変異および多重変異は、B2ドメインと相同性の高いB1アミノ酸配列に対して導入して、B1ドメインの改良型タンパク質のアミノ酸配列とすることができる。また、上記選定された12変異箇所の野生型アミノ酸は、42位を除けば上記B2ドメインと上記B3ドメインの間ですべて共通である（42位の野生型アミノ酸残基は、B2ドメインではGlu42、B3ドメインではVal42）。したがって、上記選定された5変異箇所/5置換、あるいは7変異箇所/7置換、あるいは12変異箇所/14置換から、42位の変異箇所のみを除いた4変異箇所/4置換、あるいは6変異箇所/6置換、あるいは11変異箇所/13置換を組み合わせた点変異および多重変異は、B2ドメインと相同性の高いB3ドメインのアミノ酸配列に対して導入して、B3ドメインの改良型タンパク質のアミノ酸配列とすることができる。このことは、後記実施例に示されるように、プロテインＧのＢ２ドメイン−Ｆｃ複合体及び同Ｂ３ドメイン−Ｆａｂ複合体の各立体構造原子座標データを用いて選定されたＢ１ドメインの変異体タンパク質が、意図どおりの性能を有していることからも明らかである。

以上、本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列は、一つに限定されず、複数存在するが、これらのうち、好ましい配列を具体的に示すと、例えば、[配列番号13]、[配列番号14]、[配列番号15]、[配列番号16]、[配列番号17]、[配列番号18]、[配列番号19]、または[配列番号20]で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
[配列番号13]で示される変異体タンパク質は、[配列番号1]で示されるプロテインＧ・B1ドメインの野生型アミノ酸配列に対して、プロテインＧの細胞膜外ドメインの熱安定性、変性剤に対する化学的安定性、および分解酵素に対する耐性を向上させることが発明者らの従前の研究により明らかにされている部位に変異を導入したものであり、
[配列番号14]、[配列番号15]、[配列番号19]、および[配列番号20]で示される変異体タンパク質は、さら加えて、Ｆｃとの結合表面解析にもとづき選定した部位に変異を導入したものである。

一方、[配列番号16]、[配列番号17]、および[配列番号18]で示される変異体タンパク質は、[配列番号1]で示されるプロテインＧ・B1ドメインの野生型アミノ酸配列に対して、プロテインＧの細胞膜外ドメインの熱安定性、変性剤に対する化学的安定性、および分解酵素に対する耐性を向上させることが発明者らの従前の研究により明らかにされている部位と、Ｆａｂとの結合表面解析にもとづき選定した部位とに変異を導入したものである。

本発明の改良型タンパク質は、抗体あるいは免疫グロブリンＧあるいは免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質に結合活性を有し、野生型のプロテインＧの各細胞膜外ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下する限り、上記本発明の改良型タンパク質のいずれかで示されるアミノ酸配列において、一個もしくは数個のアミノ酸残基に欠失、置換、挿入、付加などの変異が生じても良い。

例えば、本発明の改良型タンパク質をHisタグ付きあるいは他のタンパク質との融合タンパク質の形態で合成する場合、合成した後にタグと改良型タンパク質の間を、あるいは他のタンパク質と改良型タンパク質の間を配列特異的タンパク分解酵素で分解しても、上記改良型タンパク質のＮ末端側もしくはＣ末端側に１乃至数個のアミノ酸残基が残る場合もあり、また、大腸菌等を用いて本発明の改良型タンパク質を生産する際には、Ｎ末端側に開始コドン由来のメチオニン等が付加されることがあるが、これらのアミノ酸残基の付加により、抗体結合性は変わらない。また、これらのアミノ酸残基の付加により、設計された変異が及ぼす効果を失うこともない。したがって、本発明の改良型タンパク質は当然これらの変異も含む。なお、このようなアミノ酸残基の付加のない改良型タンパク質を作成するためには、たとえば、大腸菌等を用いて生産した改良型タンパク質を、さらにメチオニルアミノペプチダーゼ等の酵素を用いて、Ｎ末のアミノ酸残基を選択的に切断し（参照文献７）、反応混合物よりクロマトグラフィー等で分離精製することで、得ることができる。

また、本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列は、該アミノ酸配列と任意のリンカー配列とを交互に複数回繰り返したタンデム型アミノ酸配列としても良い。たとえば、[アミノ酸配列（ａ）]−リンカー配列Ａ−[アミノ酸配列（ａ）]−リンカー配列Ｂ−[アミノ酸配列（ａ）]としても良く、あるいは、[アミノ酸配列（ａ）]−リンカー配列Ｃ−[アミノ酸配列（ｂ）]−リンカー配列Ｄ−[アミノ酸配列（ｃ）]としても良い。このタンデム型アミノ酸配列の設定は、野生型のプロテインＧがリンカー配列を介した複数の抗体結合ドメインの繰り返し構造となっていること（図１および図３）、野生型のプロテインＧを切断して各々のドメイン単独を単離しても抗体結合活性は保たれること（参照文献３）から明らかなように、単独でも機能する抗体結合ドメインを野生型のプロテインＧは複数繰り返し、局所的な濃度を上げることで抗体結合性の効果を高めている点からみて、その設定は有効である。

また、本発明の改良型タンパク質は、任意の他タンパク質のアミノ酸配列を連結した融合型アミノ酸配列からなる融合タンパク質としても良い。たとえば、[アミノ酸配列（ａ）]−リンカー配列Ｅ−タンパク質Ａ、あるいは、タンパク質Ｂ−リンカー配列Ｆ−[アミノ酸配列（ａ）]−リンカー配列Ｇ−タンパク質Ｃ−リンカー配列Ｈ−[アミノ酸配列（ｃ）] としても良い。この融合型アミノ酸配列の設定は、野生型のプロテインＧが抗体結合ドメインと他のドメインが連結したマルチドメイン構造となっていること（図１および図３）、野生型のプロテインＧを切断して各々のドメイン単独を単離しても抗体結合活性は保たれること（参照文献３）、即ち、抗体結合ドメインと他の機能を担うタンパク質を連結することで抗体結合活性を含む複数の機能を担うことを可能にしているとから、その設定は有効である。
このような融合タンパク質に使用する他のアミノ酸配列としては、例えば、図４または［配列番号31］で示すoxaloacetate decarboxylase alpha-subunit c-terminal domain(OXADac)のアミノ酸配列が挙げられる。この場合のOXADac−プロテインＧ変異体融合タンパク質は、OXADac領域に由来するアビジン結合活性とプロテインＧ変異体領域に由来する抗体結合活性の複数の機能を単一分子で担うことが、後記実施例で示すように可能である。

１．改良型タンパク質の製造
（１）遺伝子工学的手法による改良型タンパク質の製造
ａ．改良型タンパク質をコードする遺伝子
本発明においては、上記設計された改良型タンパク質を製造するため、遺伝子工学的方法を使用することできる。
このような方法に使用する遺伝子は、上記Ａ〜Ｃに示されるタンパク質、より具体的には、上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするか、あるいは（ａ）〜（ｉ）のいずれかで示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつ抗体あるいは免疫グロブリンＧあるいは免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ中性域に比べて弱酸性域での結合活性が低下するタンパク質をコードする核酸からなるものであって、たとえば、より具体的には、［配列番号22］〜［配列番号29］で示されるいずれかの塩基配列からなる核酸である。

また、本発明において使用する遺伝子としては、以上の核酸の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ抗体あるいは免疫グロブリンＧあるいは免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ対応する各野生型プロテインＧ・細胞膜外ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質するタンパク質をコードする核酸もあげられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。たとえば、例えば、高い相同性（相同性が60％以上、好ましくは80％以上）を有する核酸がハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。例えばハイブリダイゼーション条件が65℃であり、洗浄の条件が0.1％SDSを含む0.1×SSC中で65℃、10分の場合に、慣例的な手法、例えばサザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーションなどによってハイブリダイズすることが確認された場合には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするといえる。

さらに、本発明において使用する遺伝子としては、以上の核酸と上記任意のリンカー配列をコードする核酸をそれぞれ交互に複数連結したものでもよく、または該核酸と任意のタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸とを連結し、融合型アミノ酸配列をコードするように設計してもよい。

ｂ．遺伝子、組み替えベクターおよび形質転換体
前記した本発明の遺伝子は、化学合成、ＰＣＲ、カセット変異法、部位特異的変異導入法などにより合成することができる。たとえば、末端に20塩基対程度の相補領域を有する100塩基程度までのオリゴヌクレオチドを複数化学合成し、これらを組み合わせてオーバーラップ伸長法（参照文献８）を行うことにより目的の遺伝子を全合成することができる。
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに上記の塩基配列を含む遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明で使用するベクターとしては、宿主中で複製可能なもの又は目的の遺伝子を宿主ゲノムに組み込み可能なものであれば特に限定されない。例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられる。

プラスミドＤＮＡとしては、放線菌由来のプラスミド（例えばpK4，pRK401，pRF31等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322，pBR325，pUC118，pUC119，pUC18等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110，pTP5等）、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13，YEp24，YCp50等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。遺伝子は、本発明の改良型タンパク質が発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、遺伝子の塩基配列のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）、開始コドン、終止コドンなどを連結することができる。また、製造するタンパク質の精製を容易にするためのタグ配列を連結することもできる。タグ配列としては、Hisタグ、GSTタグ、MBPタグ、BioEaseタグなどの公知のタグをコードする塩基配列を利用することができる。

遺伝子がベクターに挿入されたか否かの確認は、公知の遺伝子工学技術を利用して行うことができる。たとえば、プラスミドベクターなどの場合、コンピテントセルを用いてベクターをサブクローニングし、ＤＮＡを抽出後、ＤＮＡシーケンサーを用いてその塩基配列を特定することで確認できる。他のベクターについても細菌あるいは他の宿主を用いてサブクローニング可能なものは、同様の手法が利用できる。また、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを利用したベクター選別も有効である。
形質転換体は、本発明の組換えベクターを、本発明の改良型タンパク質が発現し得るように宿主細胞に導入することにより得ることができる。形質転換に使用する宿主としては、タンパク質又はポリペプチドを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、植物細胞、動物細胞（COS細胞、CHO細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。

細菌を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、開始コドン、本発明の改良型タンパク質をコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＢＬ２１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などが挙げられる。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばヒートショック法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。

動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。

遺伝子が宿主に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ついで、ＰＣＲの増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SyberGreen液等により染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。

ｃ．形質転換体培養による改良型タンパク質の取得
組替えタンパク質として製造する場合、本発明の改良型タンパク質は、上述の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。培養物とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。

大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２０〜３７℃で１２時間〜３日間行う。

培養後、本発明の改良型タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより該タンパク質を採取する。また、該タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明の改良型タンパク質を単離精製することができる。

また、タンパク質の生合成反応にかかわる因子（酵素、核酸、ＡＴＰ、アミノ酸など）のみを混合させた、いわゆる無細胞合成系を利用すると、生細胞を用いることなく、ベクターから本発明の改良型タンパク質を試験管内で合成することができる（参照文献９）。その後、前記と同様の精製法を用いて、反応後の混合溶液から本発明の改良型タンパク質を単離精製することができる。
単離精製した本発明の改良型タンパク質が、目的通りのアミノ酸配列からなるタンパク質であるかを確認するため、該タンパク質を含む試料を分析する。分析方法としては、SDS-PAGE、ウエスタンブロッティング、質量分析、アミノ酸分析、アミノ酸シーケンサーなどを利用することができる（参照文献１０）。

（２）他の手法による改良型タンパク質の製造
本発明の改良型タンパク質は、有機化学的手法、例えば固相ペプチド合成法などによっても製造することができる。このような手法を利用したタンパク質の生産方法は当技術分野で周知であり、以下に簡潔に説明する。
固相ペプチド合成法により化学的にタンパク質を製造する場合、好ましくは自動合成機を利用して、活性化されたアミノ酸誘導体の重縮合反応を繰り返すことにより、本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列を有する保護ポリペプチドを樹脂上で合成する。ついで、この保護ポリペプチドを樹脂上から切断すると共に側鎖の保護基も同時に切断する。この切断反応には、樹脂や保護基の種類、アミノ酸の組成に応じて適切なカクテルがあることが知られている（参照文献１１）。この後、有機溶媒層から粗精製タンパク質を水層に移し、目的の変異型タンパク質を精製する。精製法としては、逆相クロマトグラフィーなどを利用することができる（参照文献１１）。

２．改良型タンパク質の固定化
本発明の改良型タンパク質は、その抗体結合性を利用して、抗体捕捉剤として利用することができる。該抗体捕捉剤は、抗体の精製や除去、抗体を利用した診断、治療、検査等に用いることができる。
本発明の抗体捕捉剤は、本発明の改良型タンパク質を含む限りにおいて、どのような形態であってもよいが、好ましくは、本発明の改良型タンパク質を水不溶性の固相支持体に固定化した形態が適切である。用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機-有機、有機-無機などの複合担体などが挙げられるが、中でも親水性担体は非特異吸着が比較的少なく、抗体あるいは免疫グロブリンＧあるいは免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質の選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が60度以下の担体を示す。この様な担体としてはセルロース、キトサン、デキストラン等の多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン-酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスなどからなる担体が代表例として挙げられる。

市販品としては多孔質セルロースゲルであるGCL2000、GC700、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したSephacryl S-1000、アクリレート系の担体であるToyopearl、アガロース系の架橋担体であるSepharoseCL4B、エポキシ基で活性化されたポリメタクリルアミドであるオイパーギットC250L等を例示することができる。ただし、本発明においてはこれらの担体、活性化担体のみに限定されるものではない。上述の担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の2種類以上を混合してもよい。又、本発明に用いる水不溶性担体としては、本抗体捕捉剤の使用目的および方法からみて、表面積が大きことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち、多孔質であることが好ましい。

担体の形態としては、ビーズ状、線維状、膜状(中空糸も含む)など何れも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。特定の排除限界分子量を持つ担体作製の容易さからビーズ状が特に好ましく用いられる。ビーズ状の平均粒径は10〜2500μmのものが使いやすく、とりわけ、リガンド固定化反応のしやすさの点から25μmから800μmの範囲が好ましい。
さらに担体表面には、リガンドの固定化反応に用いうる官能基が存在しているとリガンドの固定化に好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、サクシニルイミド基、酸無水物基などが挙げられる。
上記担体への改良型タンパク質の固定化においては、改良型タンパク質の立体障害を小さくすることにより捕捉効率を向上させ、さらに非特異的な結合を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが、より好ましい。親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などで置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体を用いるのが好ましい。

上記の担体へ導入される改良型タンパク質およびスペーサーとして用いられる有機化合物の固定化方法は特に限定されるものではないが、一般にタンパク質やペプチドを担体に固定化する場合に採用される方法を例示する。担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンなどと反応させて担体を活性化し（担体が元々持っている官能基よりリガンドとして固定化する化合物が反応しやすい官能基に変え）、リガンドとして固定化する化合物と反応、固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられるが、捕捉剤の滅菌時または利用時に蛋白類が担体より容易に脱離しない固定化方法を適用することがより好ましい。

１．改良型タンパク質および抗体捕捉剤の性能確認試験
上記のようにして製造された改良型タンパク質および抗体捕捉剤は、以下の性能確認試
験を行い良好なものを選択することができるが、本発明の改良型タンパク質および抗体捕捉材はいずれも良好な性能を有していた。

（１）抗体結合性試験
本発明の改良型タンパク質の抗体結合性は、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、プルダウンアッセイ、ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)、表面プラズモン共鳴（SPR）法などを利用して確認・評価することができる。中でもSPR法は、生体間の相互作用をラベルなしでリアルタイムに経時的に観察することが可能であることから、改良型タンパク質の結合反応を速度論的観点から定量的に評価することができる。
また、水不溶性の固相支持体に固定化した改良型タンパク質の抗体結合性は、上記のSPR法や液体クロマトグラフィー法で確認・評価することができる。中でも液体クロマトグラフィー法は、抗体結合性に及ぼすｐＨ依存性を的確に評価することができる。
（２）改良型タンパク質の熱安定性試験
本発明の改良型タンパク質の熱安定性は、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル、蛍光スペクトル、赤外分光法、示差走査熱量測定法、加熱後の残留活性などを利用して評価することができる。中でもＣＤスペクトルは、タンパク質の二次構造の変化を鋭敏に反映する分光学的分析方法であることから、改良型タンパク質の温度に対する立体構造の変化を観測し、構造安定性を熱力学的に定量的に評価することができる。

〔参照文献〕
参照文献１；Bjorck L, Kronvall G. (1984) Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent. J Immunol. 133, 69-74.
参照文献２；Boyle M. D.P., Ed. (1990) Bacterial Immunoglobulin Binding Proteins. Academic Press, Inc., San Diego, CA.
参照文献３；Gallagher T, Alexander P, Bryan P, Gilliland GL. (1994) Two crystal structures of the B1 immunoglobulin-binding domain of streptococcal protein G and comparison with NMR. Biochemistry 19, 4721-4729.
参照文献４；Sauer-Eriksson AE, Kleywegt GJ, Uhlen M, Jones TA. (1995) Crystal structure of the C2 fragment of streptococcal protein G in complex with the Fc domain of human IgG. Structure 3, 265-278.
参照文献５；Derrick JP, Wigley DB. (1994) The third IgG-binding domain from streptococcal protein G. An analysis by X-ray crystallography of the structure alone and in a complex with Fab. J Mol Biol. 243, 906-918.
参照文献６；Alexander P, Fahnestock S, Lee T, Orban J, Bryan P. (1992) Thermodynamic analysis of the folding of the streptococcal protein G IgG-binding domains B1 and B2: why small proteins tend to have high denaturation temperatures. Biochemistry 14, 3597-3603.
参照文献７；D'souza VM, Holz RC. (1999) The methionyl aminopeptidase from Escherichia coli can function as an iron(II) enzyme. Biochemistry 38, 11079-11085.
参照文献８；Horton R. M., Hunt H. D., Ho S. N., Pullen J. M. and Pease L. R. (1989). Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77, 61-68.
参照文献９；岡田雅人、宮崎香(2004)タンパク質実験ノート(上)、羊土社
参照文献１０；大野茂男、西村善文監修(1997)タンパク質実験プロトコール１−機能解析編、秀潤社
参照文献１１；大野茂男、西村善文監修(1997)タンパク質実験プロトコール２−構造解析編、秀潤社

以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、本明細書においては、各種アミノ酸残基を次の略号で記載する。Ala;L-アラニン残基、Arg;L-アルギニン残基、Asp;L-アスパラギン酸残基、Asn;L-アスパラギン残基、Cys;L-システイン残基、Gln;L-グルタミン残基、Glu;L-グルタミン酸残基、Gly;L-グリシン残基、His;L-ヒスチジン残基、Ile;L-イソロイシン残基、Leu;L-ロイシン残基、Lys;L-リジン残基、Met;L-メチオニン残基、Phe;L-フェニルアラニン残基、Pro;L-プロリン残基、Ser;L-セリン残基、Thr;L-スレオニン残基、Trp;L-トリプトファン残基、Tyr;L-チロシン残基、Val;L-バリン残基。また本明細書においては、ペプチドのアミノ酸配列を、そのアミノ末端(以下N末端という)が左側に位置し、カルボキシル末端(以下C末端という)が右側に位置するように、常法に従って記述する。

実施例１
本実施例においては、プロテインGのB1、B2、あるいはB3ドメインに変異を導入した本発明の改良型タンパク質（以降、改良型プロテインGと呼ぶ）のアミノ酸配列を設計するための変異を導入する部位を選定し、置換するアミノ酸残基を特定する。
１．Ｆｃとの結合表面解析にもとづく変異対象部位の選定と置換するアミノ酸残基の特定
まず、プロテインG・B2ドメインとヒト免疫グロブリンＧ₁のＦｃ領域の複合体の立体構造座標データを、国際的なタンパク質立体構造データベースであるProtein Data Bank（PDB; http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）よりダウンロードした（PDBコード：1FCC）。ついで、Ｆｃ領域から6.5オングストロームの距離の範囲内に存在するプロテインＧ・B2ドメインのアミノ酸残基であって、かつ、プロテインＧ・B2ドメイン単独の場合で40%以上の露出表面積比をもつアミノ酸残基を該立体構造座標データを用いて計算し、変異対象部位として選定した。選定した部位のアミノ酸残基は、[配列番号2]で示されるプロテインG・B2ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44の13個である。図５に、これらの変異対象部位の位置を表示する。これらの変異対象部位は、B1ドメインにおいても共通に存在する。よって、これらはB2ドメインのみならず、B1ドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。即ち、[配列番号1]で示されるプロテインG・B1ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44の13個を変異対象部位として選定した。また、これらの変異対象部位の一部は、B3ドメインにおいても共通に存在する。よって、これらはB2ドメインのみならず、B3ドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。即ち、[配列番号3]で示されるプロテインG・B3ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44の10個を変異対象部位として選定した。

一方、選定した変異対象部位の元のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基は、（ｉ）元のアミノ酸残基が非荷電性の側鎖を有するアミノ酸（Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Pro）の場合は、荷電性の側鎖を有するアミノ酸（Asp、Glu、Lys、Arg、His）に、（ｉｉ）元のアミノ酸残基が荷電性アミノ酸の場合は、反対の電荷を示す荷電性アミノ酸に特定した。あるいは、（ｉｉｉ）元のアミノ酸残基がヒスチジン以外の場合は、ヒスチジンに特定した。即ち、Asp22についてはLys、Arg、またはHisが、Ala24についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Thr25についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys28についてはAsp、Glu、またはHisが、Val29についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys31についてはAsp、Glu、またはHisが、Gln32についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Asn35についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Asp36についてはLys、Arg、またはHisが、Gly38についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Asp40についてはLys、Arg、またはHisが、Glu42についてはLys、Arg、またはHisが、Thr44についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが置換するアミノ酸残基として特定された。

なお、本実施例の計算は、ccp4i 4.0 (Daresbury Laboratory, UK Science and Technology Facilities Council)、Surface Racer 3.0 for Linux（Dr. Oleg Tsodikov, The University of Michigan）、Red Hat Enterprise Linux WS release 3（レッドハット）（以上ソフトウエア）、Dell Precision Workstation370（デル）（以上ハードウエア）を用いて遂行した。

２．Ｆａｂとの結合表面解析にもとづく変異対象部位の選定と置換するアミノ酸残基の特定
まず、プロテインG・B3ドメインとマウス免疫グロブリンＧ₁のＦａｂ領域の複合体の立体構造座標データを、国際的なタンパク質立体構造データベースであるProtein Data Bank（PDB; http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）よりダウンロードした（PDBコード：1IGC）。ついで、Ｆａｂ領域から4.0オングストロームの距離の範囲内に存在するプロテインＧ・B3ドメインのアミノ酸残基であって、かつ、プロテインＧ・B3ドメイン単独の場合で40%以上の露出表面積比をもつアミノ酸残基を該立体構造座標データを用いて計算し、変異対象部位として選定した。選定した部位のアミノ酸残基は、[配列番号3]で示されるプロテインG・B3ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38の10個である。図６に、これらの変異対象部位の位置を表示する。これらの変異対象部位は、B1、B2、B3のどのドメインにおいても共通に存在する。よって、これらはB3ドメインのみならず、B1およびB2ドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。即ち、[配列番号1]および[配列番号2]で示されるプロテインG・B1ドメインおよびB2ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38の10個を変異対象部位として選定した。

一方、選定した変異対象部位の元のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基は、（ｉｖ）元のアミノ酸とシステイン以外の他の種類のアミノ酸残基に特定した。即ち、Lys10についてはLysとCys以外が、Thr11についてはThrとCys以外が、Lys13についてはLysとCys以外が、Gly14についてはGlyとCys以外が、Glu15についてはGluとCys以外が、Thr16についてはThrとCys以外が、Thr17についてはThrとCys以外が、Asn35についてはAsnとCys以外が、Asp36についてはAspとCys以外が、Gly38についてはGlyとCys以外が置換するアミノ酸残基として特定された。
なお、本実施例の計算は、ccp4i 4.0 (Daresbury Laboratory, UK Science and Technology Facilities Council)、Surface Racer 3.0 for Linux（Dr. Oleg Tsodikov, The University of Michigan）、Red Hat Enterprise Linux WS release 3（レッドハット）（以上ソフトウエア）、Dell Precision Workstation370（デル）（以上ハードウエア）を用いて遂行した。

３．ＦｃおよびＦａｂとの結合表面解析にもとづく変異対象部位の選定と置換するアミノ酸残基の特定
上記Ｆｃとの結合表面解析および上記Ｆａｂとの結合表面解析にもとづき選定した変異対象部位と特定した置換するアミノ酸残基を組み合わせた。
即ち、[配列番号1]で示されるプロテインG・B1ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38の20個を変異対象部位として選定した。元のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基は、Asp22についてはLys、Arg、またはHisが、Ala24についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Thr25についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys28についてはAsp、Glu、またはHisが、Val29についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys31についてはAsp、Glu、またはHisが、Gln32についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Asp40についてはLys、Arg、またはHisが、Glu42についてはLys、Arg、またはHisが、Thr44についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys10についてはLysとCys以外が、Thr11についてはThrとCys以外が、Lys13についてはLysとCys以外が、Gly14についてはGlyとCys以外が、Glu15についてはGluとCys以外が、Thr16についてはThrとCys以外が、Thr17についてはThrとCys以外が、Asn35についてはAsnとCys以外が、Asp36についてはAspとCys以外が、Gly38についてはGlyとCys以外が特定された。

また、[配列番号2]で示されるプロテインG・B2ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38の20個を変異対象部位として選定した。元のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基は、Asp22についてはLys、Arg、またはHisが、Ala24についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Thr25についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys28についてはAsp、Glu、またはHisが、Val29についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys31についてはAsp、Glu、またはHisが、Gln32についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Asp40についてはLys、Arg、またはHisが、Glu42についてはLys、Arg、またはHisが、Thr44についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys10についてはLysとCys以外が、Thr11についてはThrとCys以外が、Lys13についてはLysとCys以外が、Gly14についてはGlyとCys以外が、Glu15についてはGluとCys以外が、Thr16についてはThrとCys以外が、Thr17についてはThrとCys以外が、Asn35についてはAsnとCys以外が、Asp36についてはAspとCys以外が、Gly38についてはGlyとCys以外が特定された。

また、[配列番号3]で示されるプロテインG・B3ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asp40、Thr44、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38の17個を変異対象部位として選定した。
元のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基は、Asp22についてはLys、Arg、またはHisが、Thr25についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys28についてはAsp、Glu、またはHisが、Lys31についてはAsp、Glu、またはHisが、Gln32についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Asp40についてはLys、Arg、またはHisが、Thr44についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys10についてはLysとCys以外が、Thr11についてはThrとCys以外が、Lys13についてはLysとCys以外が、Gly14についてはGlyとCys以外が、Glu15についてはGluとCys以外が、Thr16についてはThrとCys以外が、Thr17についてはThrとCys以外が、Asn35についてはAsnとCys以外が、Asp36についてはAspとCys以外が、Gly38についてはGlyとCys以外が特定された。

実施例２
本実施例においては、上記選定した変異対象部位と上記特定した置換するアミノ酸残基の情報を利用して改良型プロテインGのアミノ酸配列を設計した。
上記から明らかなように、変異対象部位及び該部位を置換するアミノ酸残基は、各一つに限られるものではないので、変異対象部位及び該部位を置換するアミノ酸残基の中から適宜選択して、改良型タンパク質のアミノ酸配列を設計することができる。その選択は、無作為に行ってもよいし、構造活性相関等の他の公知の情報を加味してもよい。また、プロテインＧの細胞膜外ドメインの性質を好ましいものに変化させることが既に知られている変異と組みあわせてもよい。本実施例では、実施例１の「１．Ｆｃとの結合表面解析にもとづく変異対象部位の選定と置換するアミノ酸残基の特定」で選定した部位から、Asp22、Thr25、Gln32、Asp40、およびGlu42を選択し、これに対応する置換するアミノ酸残基として、Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、およびGlu42Hisを選択し、この5変異箇所/5置換を組み合わせた点変異あるいは多重変異を[配列番号1]で示されるプロテインＧ・B1ドメインの野生型アミノ酸配列に対して行うことで、[配列番号10]で示される複数の改良型プロテインGのアミノ酸配列を設計した。

また、実施例１の「２．Ｆａｂとの結合表面解析にもとづく変異対象部位の選定と置換するアミノ酸残基の特定」で選定した部位から、Thr11およびThr17を選択し、これに対応する置換するアミノ酸残基として、Thr11ArgおよびThr17Ileを選択し、これらを上記の5変異箇所/5置換に加えて得られる7変異箇所/7置換を組み合わせた点変異あるいは多重変異を[配列番号1]で示されるプロテインＧ・B1ドメインの野生型アミノ酸配列に対して行うことで、[配列番号7]で示される複数の改良型プロテインGのアミノ酸配列を設計した。
さらに、プロテインＧの細胞膜外ドメインの熱安定性、変性剤に対する化学的安定性、および分解酵素に対する耐性を向上させることが発明者らの従前の研究により明らかにされているAsn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys、およびAla48Gluを選択し、これらを上記の7変異箇所/7置換に加えて得られる12変異箇所/14置換を組み合わせた点変異あるいは多重変異を[配列番号1]で示されるプロテインＧ・B1ドメインの野生型アミノ酸配列に対して行うことで、[配列番号4]で示される複数の改良型プロテインGのアミノ酸配列を設計した。
本実施例では、上記12変異箇所/14置換に対応する具体的アミノ酸配列として[配列番号13]〜[配列番号20]を最終的に選別し、この配列を示す改良型プロテインGを実際に合成し、その分子特性を評価した。

実施例３
本実施例においては、改良型プロテインGのアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を設計した。
改良型プロテインGをコードする遺伝子の塩基配列については、設計した改良型プロテインGのアミノ酸配列を基に、Gene Designer (DNA2.0 Inc.) を利用して、大腸菌での発現効率が最適になるよう設計した。なお、改良型タンパク質は、タンパク質合成の実際的観点から以下の２系統に分けて製造されるため、遺伝子の塩基配列はベクターの塩基配列を勘案して系統ごとに微調整された。OXADac-PGタンパク質は、N末端側にOxaloacetate decarboxylase alpha-subunit c-terminal domain (OXADac)の、C末端側に改良型プロテインGの配列を有する融合タンパク質として製造される。即ち、[配列番号31]と[配列番号13]〜[配列番号20]が連結したアミノ酸配列となり合成される。M-PGタンパク質は、タグなし、融合なしの単純タンパク質として大腸菌を用いて製造される。このため設計したアミノ酸配列に開始コドン配列が付加される。即ち、M-PGタンパク質は[配列番号13]〜[配列番号20]のN末端にMetが付加したアミノ酸配列となり合成される。

実施例４
本実施例においては、改良型プロテインGをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを合成し、ついで大腸菌を用いて、表1に示すOxaloacetate decarboxylase alpha-subunit c-terminal domain (OXADac)と改良型タンパク質の融合タンパク質（OXADac-PG01、OXADac-PG07、OXADac-PG13、OXADac-PG14、OXADac-PG15、OXADac-PG16、OXADac-PG17、OXADac-PG19、OXADac-PG20）を製造した。

（１）OXADac-PG発現用プラスミドの合成
[配列番号21]〜[配列番号29]の塩基配列からなるPG遺伝子(pg01、pg07、pg13、pg14、pg15、pg16、pg17、pg19、またはpg20) を組み込んだエントリープラスミドpDONR221-PG (DNA2.0)と発現用プラスミドChampion pET104.1-DEST (Invitrogen) についてGateway LR Clonase Enzyme Mix (Invitrogen) を用いて相同組み換えを行った。反応液を用いて保存用大腸菌DH5a株 (東洋紡, Competent high）を形質転換した。得られた形質転換体をcolony PCR、DNA sequencing (GE Healthcare Bioscience, BigDye Terminator v1.1) により選別し、QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) を用いてOXADac-PG発現用プラスミドを抽出した。

（２）OXADac-PG融合タンパク質の発現と固定化
OXADac-PG発現用プラスミドを用いて、発現用大腸菌BL21(DE3) (Novagen) を形質転換した。前培養した形質転換体を、2.5ml / 500mlでLB培地に継代し、O.D.₆₀₀ = 0.8〜1.0になるまで振とう培養した。OXADac-PG融合タンパク質を発現させるためIPTG（0.5mM）を加え、さらに37℃で2時間振とう培養した。回収した菌体を10mlのPBSに懸濁し、超音波破砕を行った後濾過滅菌し、これを全タンパク質溶液とした。全タンパク質溶液の一部はIgG Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Bioscience) microspinを用いて精製を試み、SDS-PAGEによって発現および精製を確認した。残りはHiTrap streptavidin HPカラム(GE Healthcare Bioscience) をセットした液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GE Healthcare Bioscience) に注入し、0.3ml/minの条件（running buffer: 20mM Na phosphate(pH6.7), 150mM NaCl）で運転することで、OXADac-PG融合タンパク質をカラムに固定化した。OXADacは分子内にビオチン化リジンを1つ有するため、カラム内のストレプトアビジンに選択的かつ非可逆的に結合する。なお、固定化量を最大化するため、HiTrap streptavidin HPカラムの結合許容量に対し、大過剰(10倍以上)のOXADac-PG融合タンパク質を注入した。

実施例５
本実施例においては、改良型プロテインGをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを合成し、ついで大腸菌を用いて、表1に示すMet付加改良型プロテインG（M-PG01、M-PG07、M-PG19、M-PG20）を製造した。
（１）M-PG発現用プラスミドの合成
実施例４で作成したOXADac-PG発現用プラスミドを鋳型に、制限酵素認識配列を含むプライマーを加えPCRを行い（アニール45℃, 15秒 → 55℃, 5秒）、PG遺伝子領域を増幅した。使用したプライマーは、M-PG01およびM-PG07については、センスプライマー (ATAGCTCCATG GACACTTACAAATTAATCC(配列番号32))とアンチセンスプライマー(ATTGGATCC TTATTCAGTAACTGTAAAGGT(配列番号33))、M-PG19およびM-PG20についてはセンスプライマー(ATAGCTCCATG GATACCTACAAACTGATCC(配列番号34))とアンチセンスプライマー(ATTGGATCC TTATTCGGTAACGGTGAAGGT(配列番号35))を用いた。得られた増幅物は、アガロース電気泳動法(3%, 100V）で確認後、QIAquick PCR Purification kit (Qiagen) を用いて精製した。その後、制限酵素Nco IとBamH I (日本ジーン, 37℃, 一昼夜）で消化し脱リン酸化（宝酒造, CIAP, 50℃, 30分）させたプラスミドpET16b (Novagen) と、同じ制限酵素で消化したPG遺伝子(pg01、pg07、pg19、またはpg20)をライゲーション(東洋紡, Ligation High, 16℃, 1時間)し、得られたプラスミドベクターを用いて保存用大腸菌DH5α株（東洋紡, Competent high）を形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含むLBプレート培地で選択した。正しい挿入配列をもつ形質転換体をcolony PCR、DNA sequencing (AB, BigDye Terminator v1.1) により選別し、Qiaprep Spin Miniprep kit (Qiagen) を用いてM-PG発現用プラスミドを抽出した。これを用い、さらに発現用大腸菌BL21(DE3) 株（Novagen）を形質転換した。

（２）組換えタンパク質の発現と精製
LB培地で前培養した大腸菌BL21(DE3) 形質転換体を、2.5ml / 500mlでLB培地に継代し、O.D.₆₀₀ = 0.8〜1.0になるまで振とう培養した。最終濃度0.5mM でIPTGを加え、さらに37℃で2時間振とう培養した。回収した菌体を10mlのPBSに懸濁し、超音波破砕を行った。破砕液は濾過滅菌後、濾液をIgG Sepharose 6 Fast Flowカラム (GEヘルスケアバイオサイエンス)をセットした液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GEヘルスケアバイオサイエンス)に注入し、アフィニティークロマトグラフィー法（running buffer: 50mM Tris-HCl(pH7.6), 150mM NaCl, 0.05% Tween20; elution buffer: 0.5M 酢酸）および/またはRESOURCE Sカラム (GEヘルスケアバイオサイエンス)をセットした液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GEヘルスケアバイオサイエンス)に注入し、イオン交換クロマトグラフィー法（running buffer: 20mM クエン酸, pH3.5; elution buffer: 20mM クエン酸, 1M NaCl, pH3.5）によりM-PG組換えタンパク質を精製した。分画したフラクションはNaOHで中和後、遠心濃縮機（RABCONCO, CentriVap concentrator）で濃縮し、50mM リン酸緩衝液（pH6.8）で透析した。各溶液を凍結乾燥し、粉末状の組換えタンパク質（M-PG01、M-PG07、M-PG19、M-PG20）を-20℃で保存した。

実施例６
本実施例においては、改良型プロテインGの純度をポリアクリルアミドゲル電気泳動法で確認した。
精製前後の改良型プロテインGをそれぞれ75μM程度の濃度の水溶液に調製したのち、Tricine-SDS-PAGE（16%T, 2.6%C, 100V, 100min）を行いCBB (G-250) 染色によりバンドを検出し純度を確認した。その結果、改良型プロテインGは、測定したすべての試料のメジャーバンドとして検出され、改良型プロテインG（OXADac-PG19、OXADac-PG20、M-PG01、M-PG07）の合成収率は高く（>10mg/L-培地）、また精製度も充分であることが確認された。

実施例７
本実施例においては、改良型プロテインGの分子量をMALDI-TOF型質量分析計で計測することで、製造したタンパク質を同定した。
まず、単離精製した改良型タンパク質を15〜25μMの濃度の水溶液に調製した。次いで、質量分析用サンプルプレートにマトリックス溶液（50％(v/v)アセトニトリル-0.1％TFA水溶液にα-シアノ-４-ヒドロキシ桂皮酸を飽和させた溶液）1μlを滴下し、これに各試料溶液を1μl滴下してサンプルプレート上で混合、乾燥させた。その後、質量分析装置Voyager（Applied Biosystems）にて、強度2500-3000のLaserを照射し質量スペクトルを得た。質量スペクトルにより検出されたピークの分子量と製造した改良型タンパク質のアミノ酸配列より算出された理論分子量を比較した結果、両者は測定誤差内で一致し、目的のタンパク質(OXADac-PG19)が製造されていることが確認された。

実施例８
本実施例においては、OXADac-PG融合タンパク質を固定化したカラムを用いてpH勾配アフィニティークロマトグラフィーを行い、モノクローナル抗体の溶出するpHを調べることで、改良型プロテインGの弱酸性域での抗体解離性を評価した。
OXADac-PG融合タンパク質固定化カラムを液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GE Healthcare Bioscience) にセットし、TST buffer（50mM Tris-HCl(pH7.6), 150mM NaCl, 0.05% Tween20）を1ml/minの条件で流し平衡化させた後、100μg/200μlに調製したIgG1タイプのヒト化モノクローナル抗体を注入した。次いで、TST bufferを50mM Na₃citrate(pH7.0) に置換し、さらに0.5ml/minの流速で10minかけて連続的に0.5M acetate(pH2.5) へ置換することで、pH勾配(pH7.0→2.5/10min)を実現した。液体クロマトグラフィー装置に付属しているUVメータ(280nm)とpHメータの出力から、モノクローナル抗体が溶出するピークのpHを記録した。
その結果、測定したすべての改良型プロテインG（OXADac-PG13、OXADac-PG17、OXADac-PG19、OXADac-PG20）を固定化したカラムにおいて、野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質（OXADac-PG01）を固定化したカラムに比べて、高いpHでヒト化モノクローナル抗体が溶出することが明らかになった（図７）。たとえば、このうち最も優れた改良型プロテインG (OXADac-PG20)は野生型に比べて1.1ポイントも高いpHで溶出する。（表2）

実施例９
本実施例においては、OXADac-PG融合タンパク質を固定化したカラムを用いてステップワイズpHアフィニティークロマトグラフィーを行い、モノクローナル抗体の溶出を、いくつかのpHで調べることで、改良型プロテインGの弱酸性域での抗体解離性を評価した。
OXADac-PG融合タンパク質固定化カラムを液体クロマトグラフィー装置 AKTA prime plus (GE Healthcare Bioscience)にセットし、リン酸バッファ（50μm Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (pH7.0)）を0.4ml/minの条件で流し平衡化させた後、100μLの1mg/mlのサンプル（ChromPure Human IgG, Fc Fragment）を添加した。12mlのリン酸バッファで洗浄、10mlの溶出バッファ（100mM CH₃COOH/CH₃COONa, pH 4）で溶出を行った。その後、pH2.5、500mMのCH₃COOHでカラムを洗浄し、最後に12mlのリン酸バッファでカラムを再平衡した。液体クロマトグラフィー装置に付属しているUVメータ（280nm）の出力から、ヒトポリクローナルFc領域のステップワイズpHの溶出するパターンを得られた。
その結果、測定した改良型プロテインG（OXADac-PG19、OXADac-PG20）を固定化したカラムにおいて、野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質（OXADac-PG1）を固定化したカラムにくらべ、高いpHでヒトポリクローナル抗体Fc領域が溶出することが明らかになった（図８）。pH 4領域でのPG1、PG19、PG20の溶出率は各々10％、88％、71％で、改良型プロテインG（OXADac-PG19、OXADac-PG20）が野生型に比べて７倍以上高くなったことが確認された（表2）。

実施例１０
本実施例においては、改良型タンパク質（プロテインG変異体）の結合解離性を表面プラズモン共鳴(SPR)法により評価した。SPR法は、生体高分子間の特異的相互作用を経時的に測定し、反応を速度論的観点から定量的に解釈できる優れた方法であることが認識されている。
まず、センサーチップSA (Biacore)の測定セルに、ビオチンを介してOXADac-PG融合タンパク質を固定化した。次いで、ヒト免疫グロブリンIgGを、ランニング緩衝液であるHBS-P (10mM HEPES pH7.4, 150mM NaCl, 0.05% v/v Surfactant P20)に溶解し、1μMの試料溶液を調製した。SPRの測定は、Biacore T100 (Biacore)を用い、反応温度25℃で行った。試料溶液の添加後、解離溶液(10mM 酢酸ナトリウム pH4.0)によるIgGの解離挙動を測定した。観測結果の解析にはBIAevaluation version 4.1を用いた。解離前後のRU変化をIgGの結合RU値で除することでIgGの残存量比を算出し、また、その解離曲線を1:1のラングミュアモデルにフィッティングさせることで解離速度定数k_offを決定した。
実験に用いた解離条件下の下、野生型のアミノ酸配列を有するOXADac-PG01は有意な解離を示さなかったのに対し、改良型タンパク質(OXADac-PG13, OXADac-PG14, OXADac-PG19, OXADac-PG20)は顕著な解離挙動を示した (表2)。たとえば、OXADac-PG19は本条件下において吸着IgGの60%以上を解離しており、その解離速度定数は野生型のそれに比較して3オーダー以上の上昇を示した。

実施例１１
本実施例では、中性領域、およびヒスチジン残基の95%以上がプロトン化する弱酸性領域において、改良型タンパク質の抗体結合性を表面プラズモン共鳴(SPR)法により評価した。
まず、センサーチップの測定セルにヒト免疫グロブリンのFc領域をアミンカップリング法により固定化した。測定のコントロールとして、カルボキシメチル基をエタノールアミンでブロッキングした対照セルを用いた。センサーチップとして、中性領域の測定にはCM5 (Biacore)、弱酸性領域下での測定にはCM4 (Biacore) を用いた。次いで、単離精製した改良型タンパク質を、中性領域のランニング緩衝液であるHBS-P (10mM HEPES pH7.4, 150mM NaCl, 0.05% v/v Surfactant P20)、または弱酸性領域のランニング緩衝液 (10mM 酢酸ナトリウム pH4.5, 150mM NaCl, 0.05% v/v Surfactant P20)に溶解し、それぞれ500, 400, 300, 200, 100 nM、および1000, 800, 600, 400, 200 nMの5種の濃度の試料溶液を調製した。SPRの測定は、Biacore T100 (Biacore)を用い、反応温度25℃で行った。収集したデータは、Biacore T100 Evaluation Softwareを用いて解析し、1:1のラングミュアモデルにフィッティングさせ、解離平衡定数K_Dを算出した（図9）。
その結果、改良型タンパク質M-PG19は野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質M-PG01に比較し、中性領域では11倍以上の親和性を示した一方、酸性領域での親和性は0.6倍程度にまで減少していることが明らかとなった（表３、図10）。また、各々のタンパク質において、pH4.0のK_DとpH7.0のK_Dの比を計算すると、改良型タンパク質M-PG19は際立ってのその値が大きい（図11）。これは、pHのシフトによって溶出される抗体の量が大きいことを意味し、即ち、改良型タンパク質M-PG19を用いることでアフィニティクロマトグラフィーにおける抗体の回収率を大きく向上させることが可能であることを示す。

実施例１２
本実施例においては、改良型タンパク質の熱安定性を評価した。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、タンパク質の二次構造の変化を鋭敏に反映する分光学的分析方法であることが知られている。ＣＤスペクトルの強度に相当するモル楕円率を試料の温度を変化させながら観測することで、どの程度の温度で各々の改良型プロテインGが変性するのかを明らかにすることができる。
単離精製した改良型タンパク質をそれぞれ15〜25μMの濃度で含む水溶液（50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.8）に調製した。この試料溶液を円筒型セル（セル長0.1cm）に注入し、J805型円偏光二色性分光光度計（日本分光）を用いて、20℃の温度で測定波長を260nmから195nmに移動させＣＤスペクトルを得た。同じ試料を98℃に加熱、さらに98℃から20℃に冷却し260nmから195nmの円二色性スペクトルを得た。加熱後再冷却したスペクトルのモル楕円率は60％以上回復し、改良型プロテインGの立体構造が熱変性に対し、ある程度可逆であることが確認された。

次いで、測定波長を222nmに固定し20℃から100℃に1℃/minの速度で昇温させてモル楕円率の経時変化を測定した。得られた熱融解曲線について二状態相転移モデルの理論式（非特許文献：有坂、バイオサイエンスのための蛋白質科学入門）を用いて解析し、変性温度T_m、およびT_mにおける変性のエンタルピー変化ΔH_mを決定した。その結果、測定した改良型プロテインGのうちM-PG07とM-PG19の熱安定性については、野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質（M-PG01）に比べて、向上していることが明らかになった（表3）。

実施例１３
本実施例においては、改良型タンパク質の単結晶を作成し、立体構造をＸ線回折解析により決定した。
まず、単離精製した改良型タンパク質M-PG19を、以下に示すハンギングドロップ法を用いて結晶化した。空間群Ｐ４３２１２に属する結晶を得るには、このタンパク質試料を1０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４に５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解したタンパク試料溶液1μｌと、等量の結晶化剤溶液（７０％ＭＰＤ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４)とをピペットマンを用いてカバーガラス（Ｈａｍｐｔｏｎ社製）上で滴下・混合して結晶化溶液とした。上述の結晶化剤溶液をＨａｍｐｔｏｎ社製２４穴プレートに注入し、結晶化溶液を滴下したカバーガラスで蓋をして高真空グリースを用いて密封した。このプレートを２０℃に保たれたインキュベーター中で保管した。およそ１〜２週間後に良質の単結晶が結晶化溶液中に得られた。
続いて、得られた単結晶を微量の母液とともに結晶解析用ループですくい、液体窒素ガスを用いて急速凍結させ、Ｘ線回折実験に供した。回折測定は、高エネルギー加速器研究機構の放射光科学研究施設のビームラインＢＬ−６Ａにて定法に従い行い、分解能1.6Åまでの回折データを収集した。得られた回折像は、プログラムHKL-2000（HKL Research社）を用いて回折点の指数付けおよび積分強度の測定・数値化をおこない68935個の強度データを得た。この段階で、使用した単結晶の結晶パラメータが決定された。すなわち、結晶の空間群は正方晶系Ｐ４３２１２、格子定数はa＝b＝23.26 Å、およびc＝178.7Åであった。さらにHKL-2000を用いてマージとスケーリングを行い、8862個のユニークな強度データを得た。これらのR_sym値は6.8%であった。
構造決定は、野生型プロテインG B1ドメインの立体構造座標データとプログラムMolrep（Vagin, A., and Teplyakov, A. (1997) Journal of Applied Crystallography 30, 1022-1025）を用いた分子置換法によって行い、引き続きプログラムCNS（Brunger, A. et al.(1998) Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 54, 905-921）、REFMAC5(Murshudov, G. N., et al. (1997) Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53, 240-255)、Coot(Emsley, P., and Cowtan, K. (2004) Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 2126-2132)を用いて構造精密化をおこなった。その結果、当業者においてパラメータ精度の指標とされているR値は、全強度データに対し23％となった。
このようにして得られた改良型タンパク質M-PG19の３次元構造は野生型プロテインG B1ドメインと極めて相似であった。即ち、決定したM-PG19の主鎖の座標と、Protein Data Bankに登録されている野生型の主鎖の座標（PDBコード：１PGA）を比較すると、その二乗平均平方根残差（ＲＭＳＤ）は0.71Åである。これより、本発明で改良型タンパク質に施したアミノ酸置換が、野生型プロテインG B1ドメインの立体構造をほとんど変化させないことが証明された（図12）。

Claims

配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインＧ・B1あるいは同B2ドメインタンパク質における、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44のうちのいずれか１個以上のアミノ酸残基を変異対象部位として他のアミノ酸残基に置換した変異体タンパク質であって、該変異対象部位の各アミノ酸残基が、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに示されるアミノ酸残基に置換されたものであることを特徴とする、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B1あるいB2ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質（ただし、Asn35がLysに及び／又は,Asp36がGluに置換されたものであって、該置換箇所以外のアミノ酸配列が野生型プロテインＧのＢ１又はＢ２ドメインタンパク質のアミノ酸配列と同じになるタンパク質を除く。）
（ｉ）変異対象部位のアミノ酸残基が非荷電性アミノ酸残基である場合における、荷電性アミノ酸残基への置換
（ｉｉ）変異対象部位のアミノ酸残基が荷電性アミノ酸残基である場合における、反対の電荷を示す荷電性アミノ酸残基への置換
（ｉｉｉ）変異対象部位のアミノ酸残基のヒスチジン残基への置換。
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質における、Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44のうちのいずれか１個以上のアミノ酸残基を変異対象部位として他のアミノ酸残基に置換した変異体タンパク質であって、該変異対象部位の各アミノ酸残基が、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに示されるアミノ酸残基に置換されたものであることを特徴とする、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質（ただし、Asn35がLysに、及び／又は,Asp36がGluに置換されたものであって、該置換箇所以外のアミノ酸配列が野生型プロテインＧのＢ３ドメインタンパク質のアミノ酸配列と同じになるタンパク質を除く。）。
（ｉ）変異対象部位のアミノ酸残基が非荷電性アミノ酸残基である場合における、荷電性アミノ酸残基への置換
（ｉｉ）変異対象部位のアミノ酸残基が荷電性アミノ酸残基である場合における、反対の電荷を示す荷電性アミノ酸残基への置換
（ｉｉｉ）変異対象部位のアミノ酸残基のヒスチジン残基への置換。
配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインＧ・B1、Ｂ２、あるいはＢ３ドメインタンパク質における、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38のうちのいずれか１個以上のアミノ酸残基を変異対象部位として、システインを除く他の種類のアミノ酸残基に置換したものであることを特徴とする、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に結合活性を有し、かつ各対応する野生型プロテインG・B1、Ｂ２あるいはＢ３ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合性が低下した変異体タンパク質（ただし、Asn35がLysに及び／又は,Asp36がGluに置換されたものであって、該置換箇所以外のアミノ酸配列が野生型プロテインＧのＢ１、Ｂ２あるいはＢ３ドメインタンパク質のアミノ酸配列と同じになるタンパク質を除く。）
配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインＧ・B1あるい同B2ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、請求項1に記載のアミノ酸残基の置換と請求項３に記載の野生型プロテインＧ・Ｂ１、Ｂ２ドメインに対するアミノ酸残基の置換を共有していることを特徴とする、免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B1あるい同B2ドメインタンパク質に比べ、それぞれ免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及びＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、請求項２に記載のアミノ酸残基の置換と請求項３に記載の野生型プロテインＧ・Ｂ３ドメインに対するアミノ酸残基の置換を共有していることを特徴とする、免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質に比べ、それぞれ免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及びＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
野生型プロテインＧ・B１ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(a)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（a）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインＧ・B１ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(a)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGluを、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又はLys、X36がAsp又はGlu、X37がAsnまたはLeu、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）
野生型プロテインＧ・B２ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(ｂ)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｂ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインＧ・B２ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(b)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGluを、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又はLys、X36が Asp又はGlu、X37がAsn又はHis、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）
野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(ｃ)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｃ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(c)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGlu、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又は Lys、X36がAsp又はGlu、X37がAsn又はHis、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）
野生型プロテインＧ・B１ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の（ｄ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｄ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B１メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(d)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）
野生型プロテインＧ・B２ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の（ｅ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｅ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B２メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(e)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）
野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の（f）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（f）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B３メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(f)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。）
野生型プロテインＧ・B1ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の（ｇ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｇ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインＧ・B1ドメインタンパク質に比べ、Ｆｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(g)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAspであって、かつX42がGluになる場合を除く。）
野生型プロテインＧ・B2ドメインタンパク質の各変異体タンパク質であって、以下の（ｈ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｈ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・Ｂ２ドメインタンパク質に比べ、Ｆｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(h)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAspであって、かつX42がGluになる場合を除く。）
野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質の各変異体タンパク質であって、以下の（ｉ）で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは（ｉ）で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B３ドメインタンパク質に比べ、Ｆｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(i)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
（上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGlnであって、かつX40がAspになる場合を除く。）
配列番号１３〜２０のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる、請求項６に記載の変異体タンパク質。
請求項１〜１５のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列とリンカーペプチドあるいはリンカータンパク質のアミノ酸配列が交互に並んだアミノ酸配列からなるタンパク質。
請求項１〜１６のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列を連結したアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
請求項１〜１７のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
配列番号２２〜２９のいずれかで示される塩基配列からなる核酸。
請求項１８又は１９に記載の核酸の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、免疫グロブリンＧのＦｃ領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインＧ・B１ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び／又はＦｃ領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質をコードする核酸。
請求項１８〜２０のいずれかに記載の核酸を含有する組換えベクター。
請求項２１に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
請求項１〜１７のいずれかに記載のタンパク質が、水不溶性の固相支持体に固定化されていることを特徴とする、固定化タンパク質。
請求項１〜１７のいずれかに記載のタンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫グロブリンＧあるいは免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質の捕捉剤。
請求項２３に記載の固定化タンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫グロブリンＧあるいは免疫グロブリンＧのＦｃ領域を有するタンパク質の捕捉剤。