JP5858394B2 - 弱酸性域での解離特性を改良した抗体結合性タンパク質及び抗体捕捉剤 - Google Patents
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Description
(1)配列番号1または2で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B1あるいは同B2ドメインタンパク質における、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基を変異対象部位として他のアミノ酸残基に置換した変異体タンパク質であって、該変異対象部位の各アミノ酸残基が、以下(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸残基に置換されたものであることを特徴とする、免疫グロブリンGのFc領域に結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B1あるいB2ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFc領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質(ただし、Asn35がLysに及び/又は,Asp36がGluに置換されたものであって、該置換箇所以外のアミノ酸配列が野生型プロテインGのB1又はB2ドメインタンパク質のアミノ酸配列と同じになるタンパク質を除く。)
(i)変異対象部位のアミノ酸残基が非荷電性アミノ酸残基である場合における、荷電性アミノ酸残基への置換
(ii)変異対象部位のアミノ酸残基が荷電性アミノ酸残基である場合における、反対の電荷を示す荷電性アミノ酸残基への置換
(iii)変異対象部位のアミノ酸残基のヒスチジン残基への置換。
(2)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B3ドメインタンパク質における、Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基を変異対象部位として他のアミノ酸残基に置換した変異体タンパク質であって、該変異対象部位の各アミノ酸残基が、以下(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸残基に置換されたものであることを特徴とする、免疫グロブリンGのFc領域に結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B3ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFc領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質(ただし、Asn35がLysに、及び/又は,Asp36がGluに置換されたものであって、該置換箇所以外のアミノ酸配列が野生型プロテインGのB3ドメインタンパク質のアミノ酸配列と同じになるタンパク質を除く。)。
(i)変異対象部位のアミノ酸残基が非荷電性アミノ酸残基である場合における、荷電性アミノ酸残基への置換
(ii)変異対象部位のアミノ酸残基が荷電性アミノ酸残基である場合における、反対の電荷を示す荷電性アミノ酸残基への置換
(iii)変異対象部位のアミノ酸残基のヒスチジン残基への置換。
(3)配列番号1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B1、B2、あるいはB3ドメインタンパク質における、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基を変異対象部位として、システインを除く他の種類のアミノ酸残基に置換したものであることを特徴とする、免疫グロブリンGのFc領域に結合活性を有し、かつ各対応する野生型プロテインG・B1、B2あるいはB3ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合性が低下した変異体タンパク質(ただし、Asn35がLysに及び/又は,Asp36がGluに置換されたものであって、該置換箇所以外のアミノ酸配列が野生型プロテインGのB1、B2あるいはB3ドメインタンパク質のアミノ酸配列と同じになるタンパク質を除く。)
(4)配列番号1または2で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B1あるい同B2ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、上記(1)に記載のアミノ酸残基の置換と上記(3)に記載の野生型プロテインG・B1、B2ドメインに対するアミノ酸残基の置換を共有していることを特徴とする、免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B1あるい同B2ドメインタンパク質に比べ、それぞれ免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及びFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(5)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B3ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、上記(2)に記載のアミノ酸残基の置換と上記(3)に記載の野生型プロテインG・B3ドメインに対するアミノ酸残基の置換を共有していることを特徴とする、免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B3ドメインタンパク質に比べ、それぞれ免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及びFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(6)野生型プロテインG・B1ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(a)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(a)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・B1ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(a)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGluを、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又はLys、X36がAsp又はGlu、X37がAsnまたはLeu、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。)
(7)野生型プロテインG・B2ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(b)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(b)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・B2ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(b)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGluを、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又はLys、X36が Asp又はGlu、X37がAsn又はHis、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。)
(8)野生型プロテインG・B3ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(c)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(c)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・B3ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(c)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGlu、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又は Lys、X36がAsp又はGlu、X37がAsn又はHis、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。)
(9)野生型プロテインG・B1ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(d)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(d)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B1メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(d)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。)
(e)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。)
(11)野生型プロテインG・B3ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(f)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(f)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B3メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(f)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。)
(12)野生型プロテインG・B1ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(g)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(g)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・B1ドメインタンパク質に比べ、Fc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(g)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAspであって、かつX42がGluになる場合を除く。)
(13)野生型プロテインG・B2ドメインタンパク質の各変異体タンパク質であって、以下の(h)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(h)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B2ドメインタンパク質に比べ、Fc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(h)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAspであって、かつX42がGluになる場合を除く。)
(14)野生型プロテインG・B3ドメインタンパク質の各変異体タンパク質であって、以下の(i)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(i)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B3ドメインタンパク質に比べ、Fc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(i)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGlnであって、かつX40がAspになる場合を除く。)
(15)配列番号13〜20のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる、上記(6)に記載の変異体タンパク質。
(16)上記(1)〜(15)のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列とリンカーペプチドあるいはリンカータンパク質のアミノ酸配列が交互に並んだアミノ酸配列からなるタンパク質。
(17)上記(1)〜(16)のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列と他のタンパク質のアミノ酸配列を連結したアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
(18)上記(1)〜(17)のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
(19)配列番号22〜29のいずれかで示される塩基配列からなる核酸。
(20)上記(18)又は(19)に記載の核酸の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B1ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質をコードする核酸。
(21)上記(18)〜(20)のいずれかに記載の核酸を含有する組換えベクター。
(22)上記(21)に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
(23)上記(1)〜(17)のいずれかに記載のタンパク質が、水不溶性の固相支持体に固定化されていることを特徴とする、固定化タンパク質。
(24)上記(1)〜(17)のいずれかに記載のタンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質の捕捉剤。
(25)上記(23)に記載の固定化タンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質の捕捉剤。
一方、現在、野生型のプロテインG細胞膜外ドメインは、抗体の精製用のアフィニティークロマトグラフィー担体や抗体検出のための検査試薬として市販され、ライフサイエンスの各分野で広範に利用されている。また、近年の抗体医薬をはじめとする抗体関連産業の発展をうけて、これらの製品の需要が飛躍的に拡大している。したがって、多くのプロテインG細胞膜外ドメイン含有製品において、本発明のような改良型タンパク質を野生型と代替することにより、酸溶出に伴う抗体の劣化を低減することを可能にし、抗体を扱う広範な技術分野において、その技術発展に大いに資するものである。
(1)配列番号1または2で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B1あるいは同B2ドメインタンパク質における、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基を変異対象部位として他のアミノ酸残基に置換した変異体タンパク質であって、該変異対象部位の各アミノ酸残基が、以下(i)〜(iii)のいずれかに示されるアミノ酸残基に置換されたものであることを特徴とする、免疫グロブリンGのFc領域に結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B1あるいB2ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFc領域に対する弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(i)変異対象部位のアミノ酸残基が非荷電性アミノ酸残基である場合における、荷電性アミノ酸残基への置換
(ii)変異対象部位のアミノ酸残基が荷電性アミノ酸残基である場合における、反対の電荷を示す荷電性アミノ酸残基への置換
(iii)変異対象部位のアミノ酸残基のヒスチジン残基への置換。
(i)変異対象部位のアミノ酸残基が非荷電性アミノ酸残基である場合における、荷電性アミノ酸残基への置換
(ii)変異対象部位のアミノ酸残基が荷電性アミノ酸残基である場合における、反対の電荷を示す荷電性アミノ酸残基への置換
(iii)変異対象部位のアミノ酸残基のヒスチジン残基への置換。
上記(1)および(2)の変異体タンパク質は以下のように選定された変異対象部位及び該部位を置換するアミノ酸残基に基づき設計され、遺伝子工学的手法により得られる。
本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列を設計するための変異を導入する部位は、プロテインG・B2ドメインと免疫グログリンGのFc領域が結合した複合体の立体構造原子座標データ(参照文献4)を用いて選定したものである。
弱酸性域におけるプロテインGの細胞膜外ドメインの抗体結合性を低下させるには、Fc領域との結合に直接関与しているプロテインGの細胞膜外ドメインの結合表面のアミノ酸残基およびその周辺のアミノ酸残基を野生型から非野生型に置換すればよい。したがって、まず、プロテインG・B2ドメインと免疫グログリンGのFc領域が結合した複合体において、Fc領域から一定の距離の範囲内に存在するプロテインG・B2ドメインのアミノ酸残基を特定し、これを変異対象部位の候補とする。ついで、アミノ酸置換に伴うプロテインGの細胞膜外ドメインの構造不安定化を最小限にするために、上記の候補のうち、プロテインG・B2ドメインの分子表面に露出しているアミノ酸残基のみを変異対象部位と決定した。
また、上記したように、プロテインGの各細胞膜外ドメインは配列相同性が極めて高く、B1、B2、B3ドメインの立体構造の差異もほとんどがないことから、B2ドメイン−Fc複合体の立体構造についての知見は、B1及びB3ドメイン−Fc複合体にも適用できる。したがって、B2ドメイン−Fc複合体の立体構造から導いた13個が変異対象部位は、相当する位置に同じ種類のアミノ酸がある限りにおいて、B2ドメインのみならず、B1およびB2ドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。即ち、プロテインG・B1ドメインの野生型アミノ酸配列(配列番号1)のうちの、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44の13個が、また、プロテインG・B3ドメインの野生型アミノ酸配列(配列番号3)のうちの、Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44の10個が変異対象部位として選定された。
(i)変異対象部位の野生型のアミノ酸残基が非荷電性の側鎖を有するアミノ酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Pro)の場合は、荷電性の側鎖を有するアミノ酸(Asp、Glu、Lys、Arg、His)に置換する。荷電性アミノ酸は、pHに依存して化学的状態が大きく変化するので、プロテインG・B2ドメインの抗体結合性を中性域と弱酸性域で変化させることができる。
(ii)変異対象部位の野生型のアミノ酸残基が荷電性アミノ酸の場合は、反対の電荷を示す荷電性アミノ酸に置換する。上記と同様に、荷電性アミノ酸は、pHに依存して化学的状態が大きく変化するので、プロテインG・B2ドメインの抗体結合性を中性域と弱酸性域で変化させることができる。
(iii)変異対象部位の野生型のアミノ酸残基がヒスチジン以外の場合は、ヒスチジンに置換する。ヒスチジンは、中性域と弱酸性域で化学的状態が大きく変化するので、プロテインG・B2ドメインの抗体結合性を中性域と弱酸性域で変化させることができる。
(3)配列番号1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B1、B2あるいはB3ドメインタンパク質における、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38のうちのいずれか1個以上のアミノ酸残基を変異対象部位として、システインを除く他の種類のアミノ酸残基に置換したものであることを特徴とする、免疫グロブリンGのFc領域に結合活性を有し、かつ各対応する野生型プロテインG・B1、B2あるいはB3ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合性が低下した変異体タンパク質。
上記(3)の変異体タンパク質は以下のように選定された変異対象部位及び該部位を置換するアミノ酸残基に基づき設計され、遺伝子工学的手法により得られる。
本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列を設計するための変異を導入する部位は、プロテインG・B3ドメインと免疫グログリンGのFab領域が結合した複合体の立体構造原子座標データ(参照文献5)を用いて選定したものである。プロテインGの細胞膜外ドメインは、免疫グログリンGのFc領域に対しても、Fab領域に対しても結合することが知られている(参照文献2)。したがって、1つの抗体分子は、同時に複数のプロテインGの細胞膜外ドメインと結合することが可能で、このような状態になると抗体とプロテインGの細胞膜外ドメインとの相互作用は多価となり容易に切断することができなくなる。よって、弱酸性域におけるプロテインGの細胞膜外ドメインの抗体結合性を低下させるには、Fab領域との結合に直接関与しているプロテインGの細胞膜外ドメインの結合表面のアミノ酸残基を野生型から非野生型に置換すればよい。したがって、まず、プロテインG・B3ドメインと免疫グログリンGのFab領域が結合した複合体において、Fab領域から一定の距離の範囲内に存在するプロテインG・各細胞膜B3ドメインのアミノ酸残基を特定し、これを変異対象部位の候補とした。ついで、アミノ酸置換に伴うプロテインGの細胞膜外ドメインの構造不安定化を最小限にするために、上記の候補のうち、プロテインG・B3ドメインの分子表面に露出しているアミノ酸残基のみを変異対象部位と決定した。
具体的には、後記実施例に示されるように、野生型プロテインG各細胞外ドメインタンパク質を置換するアミノ酸残基として、Lys10についてはLysとCys以外が、Thr11についてはThrとCys以外が、Lys13についてはLysとCys以外が、Gly14についてはGlyとCys以外が、Glu15についてはGluとCys以外が、Thr16についてはThrとCys以外が、Thr17についてはThrとCys以外が、Asn35についてはAsnとCys以外が、Asp36についてはAspとCys以外が、Gly38についてはGlyとCys以外が特定された。ただし、これらのアミノ酸残基の選定によるアミノ酸配列が、Asn35がLys及び/又はAsp36がGluに置換されたものであって、該置換箇所以外のアミノ酸配列が野生型プロテインGの各細胞膜ドメインのアミノ酸配列と同じになる場合は除かれる。これにより、後記する本発明者の出願に係るプロテインG細胞膜ドメインの安定性を向上させた変異体タンパク質とは区別される。
上記Fcとの結合表面解析にもとづいて特定した変異対象部位と置換するアミノ酸残基と、上記Fabとの結合表面解析にもとづいて特定した変異対象部位と置換するアミノ酸残基と組み合わせて、変異対象部位の選定と置換するアミノ酸残基の特定を行う。
具体的には、変異対象部位として、プロテインG・B1、B2ドメインの野生型アミノ酸配列(配列番号1,2)のうちの、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38の20個が変異対象部位として選定される。このうちAsp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42 、Thr44はFc領域に対する結合性を改良するためのターゲット部位であり、また、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17は、Fab領域に対する結合性を改良するためのターゲット部位である。ここで、Asn35、Asp36、Gly38は、Fc領域に対する結合性の改良部位であるとともにFab領域に対する結合性の改良部位でもある。したがって、Asn35、Asp36、Gly38に対するFc領域に対する結合性の改良のための上記Aに示すアミノ酸残基に置換は、同時にFab領域に対する結合性の改良のための、システイン残基を除く他のアミノ酸残基への置換でもある。
a)野生型プロテインG・B1ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(a)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(a)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・B1ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(a)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGluを、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又はLys、X36がAsp又はGlu、X37がAsnまたはLeu、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。)
(b)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGluを、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又はLys、X36がAsp又はGlu、X37がAsnまたはLeu、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。)
(c)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaX35X36X37GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X35はAsn又はLysを、X36はAsp又はGluを、X37はAsn、His、又はLeuを、X47はAsp又はProを、X48はAla、Lys又はGlu、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX35がAsn又はLys、X36がAsp又はGlu、X37がAsnまたはLeu、X47がAsp又はPro、X48がAla、Lys又はGlu、X22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。)
なお、上記(a)〜(c)のアミノ酸残基の定義中、ただし書きは、野生型プロテインGの各細胞膜ドメインタンパク質及び後記する本発明者の出願に係るプロテインG細胞膜ドメインの安定性を向上させた変異体タンパク質と区別するためのものである。
d)野生型プロテインG・B1ドメインタンパク質の変異体タンパク質であって、以下の(d)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(d)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B1メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(d)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。)
(e)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X42がGlu、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。)
(f)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAsp、X11がThrであって、かつX17がThrになる場合を除く。)
(g)AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAspであって、かつX42がGluになる場合を除く。)
(h)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaX25AlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGln、X40がAspであって、かつX42がGluになる場合を除く。)
(i)ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrLysAlaValX22AlaGluX25AlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X25はThr又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisをそれぞれ表す。ただし、同時にX22がAsp、X25がThr、X32がGlnであって、かつX40がAspになる場合を除く。)
なお、上記(d)〜(i)のアミノ酸残基の定義中、ただし書きは、野生型プロテインGの各細胞膜ドメインタンパク質を区別するためのものである。
たとえば、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合性の改良のため、変異対象部位として、野生型プロテインG・B1あるいはB2ドメインのアミノ酸配列中のAsp22、Thr25、Gln32、Asp40、およびGlu42を選択し、これに対応する置換するアミノ酸残基として、Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、およびGlu42Hisを選択し、いずれか1のアミノ酸置換あるいはこれらアミノ酸置換を組み合わせた最大5変異箇所/5置換までの点変異あるいは多重変異をプロテインG・B1あるいはB2ドメインの野生型アミノ酸配列(配列番号1、2)に対して行うことで、複数の改良型タンパク質のアミノ酸配列を設計することができる。
上記した、(g)、(h)のアミノ酸配列は、このような最大5変異箇所/5置換までの点変異及び多重変異を示したものであり、本発明の改良型タンパク質の一例である。
上記した(d)及び(e)のアミノ酸配列は、このような最大7変異箇所/7置換までの点変異あるいは多重変異の例を示したものであり、これらアミノ酸配列のうち、Thr11Arg及び/またはThr17Ileの変異を有し、かつ上記Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、およびGlu42Hisで示される変異のうちいずれか一以上の変異を有するものは、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合性の改良に加え、さらにFab領域に対する結合性も改良されたものとなる。
また、上記(f)のアミノ酸配列は、野生型プロテインG・B3の改良型タンパク質のアミノ酸配列の例ではあるが、上記Fc領域に対する結合性改良のための変異であるAsp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、上記Fab領域に対する結合性の改良のための変異であるThr11Arg、Thr17Ileのうちいずれか1以上、最大6変異箇所/6置換までの変異となっている他は(d)、(e)のアミノ酸配列と同様に設計されたものである。
例えば、プロテインGの細胞膜外ドメインの熱安定性、変性剤に対する化学的安定性、および分解酵素に対する耐性を向上させる変異手法が、本発明者らの従前の研究により明らかにされている(特願2007-293726号)。
すなわち、Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys、およびAla48Gluのうち一以上の変異の導入は、プロテインG・B1、B2あるいはB3ドメインの上記安定性を向上させる。
これらの変異は、本発明における免疫グロブリンGのFc領域に対する結合特性及び/又はFab領域に対する結合特性の改良のための上記変異と組み合わせることにより、本発明の改良型タンパク質はより有用なものとなる。
上記した、(a)、(b)のアミノ酸配列は、このような最大12変異箇所/14置換の点変異及び多重変異を示したものであるが、野生型の配列に加え安定化のためだけの変異は除かれている。
これらの(a)、(b)のアミノ酸配列中、Asn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys及び Ala48Gluのうち、いずれか一以上の変異の導入は、上記の最大7変異箇所/7置換の効果である免疫グロブリンGのFab領域に対する結合特性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合特性の改良に加え、プロテインG・B1あるいはB2ドメイン変異体タンパク質の安定性を向上させる。
[配列番号13]で示される変異体タンパク質は、[配列番号1]で示されるプロテインG・B1ドメインの野生型アミノ酸配列に対して、プロテインGの細胞膜外ドメインの熱安定性、変性剤に対する化学的安定性、および分解酵素に対する耐性を向上させることが発明者らの従前の研究により明らかにされている部位に変異を導入したものであり、
[配列番号14]、[配列番号15]、[配列番号19]、および[配列番号20]で示される変異体タンパク質は、さら加えて、Fcとの結合表面解析にもとづき選定した部位に変異を導入したものである。
このような融合タンパク質に使用する他のアミノ酸配列としては、例えば、図4または[配列番号31]で示すoxaloacetate decarboxylase alpha-subunit c-terminal domain(OXADac)のアミノ酸配列が挙げられる。この場合のOXADac−プロテインG変異体融合タンパク質は、OXADac領域に由来するアビジン結合活性とプロテインG変異体領域に由来する抗体結合活性の複数の機能を単一分子で担うことが、後記実施例で示すように可能である。
(1)遺伝子工学的手法による改良型タンパク質の製造
a.改良型タンパク質をコードする遺伝子
本発明においては、上記設計された改良型タンパク質を製造するため、遺伝子工学的方法を使用することできる。
このような方法に使用する遺伝子は、上記A〜Cに示されるタンパク質、より具体的には、上記(a)〜(i)のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするか、あるいは(a)〜(i)のいずれかで示されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつ抗体あるいは免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質に結合活性を有し、かつ中性域に比べて弱酸性域での結合活性が低下するタンパク質をコードする核酸からなるものであって、たとえば、より具体的には、[配列番号22]〜[配列番号29]で示されるいずれかの塩基配列からなる核酸である。
前記した本発明の遺伝子は、化学合成、PCR、カセット変異法、部位特異的変異導入法などにより合成することができる。たとえば、末端に20塩基対程度の相補領域を有する100塩基程度までのオリゴヌクレオチドを複数化学合成し、これらを組み合わせてオーバーラップ伸長法(参照文献8)を行うことにより目的の遺伝子を全合成することができる。
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに上記の塩基配列を含む遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。本発明で使用するベクターとしては、宿主中で複製可能なもの又は目的の遺伝子を宿主ゲノムに組み込み可能なものであれば特に限定されない。例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられる。
ベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。遺伝子は、本発明の改良型タンパク質が発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、遺伝子の塩基配列のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列(SD配列)、開始コドン、終止コドンなどを連結することができる。 また、製造するタンパク質の精製を容易にするためのタグ配列を連結することもできる。タグ配列としては、Hisタグ、GSTタグ、MBPタグ、BioEaseタグなどの公知のタグをコードする塩基配列を利用することができる。
形質転換体は、本発明の組換えベクターを、本発明の改良型タンパク質が発現し得るように宿主細胞に導入することにより得ることができる。形質転換に使用する宿主としては、タンパク質又はポリペプチドを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌(大腸菌、枯草菌等)、酵母、植物細胞、動物細胞(COS細胞、CHO細胞等)、昆虫細胞が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
組替えタンパク質として製造する場合、本発明の改良型タンパク質は、上述の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。培養物とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
単離精製した本発明の改良型タンパク質が、目的通りのアミノ酸配列からなるタンパク質であるかを確認するため、該タンパク質を含む試料を分析する。分析方法としては、SDS-PAGE、ウエスタンブロッティング、質量分析、アミノ酸分析、アミノ酸シーケンサーなどを利用することができる(参照文献10)。
本発明の改良型タンパク質は、有機化学的手法、例えば固相ペプチド合成法などによっても製造することができる。このような手法を利用したタンパク質の生産方法は当技術分野で周知であり、以下に簡潔に説明する。
固相ペプチド合成法により化学的にタンパク質を製造する場合、好ましくは自動合成機を利用して、活性化されたアミノ酸誘導体の重縮合反応を繰り返すことにより、本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列を有する保護ポリペプチドを樹脂上で合成する。ついで、この保護ポリペプチドを樹脂上から切断すると共に側鎖の保護基も同時に切断する。この切断反応には、樹脂や保護基の種類、アミノ酸の組成に応じて適切なカクテルがあることが知られている(参照文献11)。この後、有機溶媒層から粗精製タンパク質を水層に移し、目的の変異型タンパク質を精製する。精製法としては、逆相クロマトグラフィーなどを利用することができる(参照文献11)。
本発明の改良型タンパク質は、その抗体結合性を利用して、抗体捕捉剤として利用することができる。該抗体捕捉剤は、抗体の精製や除去、抗体を利用した診断、治療、検査等に用いることができる。
本発明の抗体捕捉剤は、本発明の改良型タンパク質を含む限りにおいて、どのような形態であってもよいが、好ましくは、本発明の改良型タンパク質を水不溶性の固相支持体に固定化した形態が適切である。用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機-有機、有機-無機などの複合担体などが挙げられるが、中でも親水性担体は非特異吸着が比較的少なく、抗体あるいは免疫グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質の選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が60度以下の担体を示す。この様な担体としてはセルロース、キトサン、デキストラン等の多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン-酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスなどからなる担体が代表例として挙げられる。
さらに担体表面には、リガンドの固定化反応に用いうる官能基が存在しているとリガンドの固定化に好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、サクシニルイミド基、酸無水物基などが挙げられる。
上記担体への改良型タンパク質の固定化においては、改良型タンパク質の立体障害を小さくすることにより捕捉効率を向上させ、さらに非特異的な結合を抑えるために、親水性スペーサーを介して固定化することが、より好ましい。親水性スペーサーとしては、例えば、両末端をカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などで置換したポリアルキレンオキサイドの誘導体を用いるのが好ましい。
上記のようにして製造された改良型タンパク質および抗体捕捉剤は、以下の性能確認試
験を行い良好なものを選択することができるが、本発明の改良型タンパク質および抗体捕捉材はいずれも良好な性能を有していた。
本発明の改良型タンパク質の抗体結合性は、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、プルダウンアッセイ、ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)、表面プラズモン共鳴(SPR)法などを利用して確認・評価することができる。中でもSPR法は、生体間の相互作用をラベルなしでリアルタイムに経時的に観察することが可能であることから、改良型タンパク質の結合反応を速度論的観点から定量的に評価することができる。
また、水不溶性の固相支持体に固定化した改良型タンパク質の抗体結合性は、上記のSPR法や液体クロマトグラフィー法で確認・評価することができる。中でも液体クロマトグラフィー法は、抗体結合性に及ぼすpH依存性を的確に評価することができる。
(2)改良型タンパク質の熱安定性試験
本発明の改良型タンパク質の熱安定性は、円偏光二色性(CD)スペクトル、蛍光スペクトル、赤外分光法、示差走査熱量測定法、加熱後の残留活性などを利用して評価することができる。中でもCDスペクトルは、タンパク質の二次構造の変化を鋭敏に反映する分光学的分析方法であることから、改良型タンパク質の温度に対する立体構造の変化を観測し、構造安定性を熱力学的に定量的に評価することができる。
参照文献1;Bjorck L, Kronvall G. (1984) Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent. J Immunol. 133, 69-74.
参照文献2;Boyle M. D.P., Ed. (1990) Bacterial Immunoglobulin Binding Proteins. Academic Press, Inc., San Diego, CA.
参照文献3;Gallagher T, Alexander P, Bryan P, Gilliland GL. (1994) Two crystal structures of the B1 immunoglobulin-binding domain of streptococcal protein G and comparison with NMR. Biochemistry 19, 4721-4729.
参照文献4;Sauer-Eriksson AE, Kleywegt GJ, Uhlen M, Jones TA. (1995) Crystal structure of the C2 fragment of streptococcal protein G in complex with the Fc domain of human IgG. Structure 3, 265-278.
参照文献5;Derrick JP, Wigley DB. (1994) The third IgG-binding domain from streptococcal protein G. An analysis by X-ray crystallography of the structure alone and in a complex with Fab. J Mol Biol. 243, 906-918.
参照文献6;Alexander P, Fahnestock S, Lee T, Orban J, Bryan P. (1992) Thermodynamic analysis of the folding of the streptococcal protein G IgG-binding domains B1 and B2: why small proteins tend to have high denaturation temperatures. Biochemistry 14, 3597-3603.
参照文献7;D'souza VM, Holz RC. (1999) The methionyl aminopeptidase from Escherichia coli can function as an iron(II) enzyme. Biochemistry 38, 11079-11085.
参照文献8;Horton R. M., Hunt H. D., Ho S. N., Pullen J. M. and Pease L. R. (1989). Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77, 61-68.
参照文献9;岡田雅人、宮崎香(2004)タンパク質実験ノート(上)、羊土社
参照文献10;大野茂男、西村善文監修(1997)タンパク質実験プロトコール1−機能解析編、秀潤社
参照文献11;大野茂男、西村善文監修(1997)タンパク質実験プロトコール2−構造解析編、秀潤社
なお、本明細書においては、各種アミノ酸残基を次の略号で記載する。Ala;L-アラニン残基、Arg;L-アルギニン残基、Asp;L-アスパラギン酸残基、Asn;L-アスパラギン残基、Cys;L-システイン残基、Gln;L-グルタミン残基、Glu;L-グルタミン酸残基、Gly;L-グリシン残基、His;L-ヒスチジン残基、Ile;L-イソロイシン残基、Leu;L-ロイシン残基、Lys;L-リジン残基、Met;L-メチオニン残基、Phe;L-フェニルアラニン残基、Pro;L-プロリン残基、Ser;L-セリン残基、Thr;L-スレオニン残基、Trp;L-トリプトファン残基、Tyr;L-チロシン残基、Val;L-バリン残基。また本明細書においては、ペプチドのアミノ酸配列を、そのアミノ末端(以下N末端という)が左側に位置し、カルボキシル末端(以下C末端という)が右側に位置するように、常法に従って記述する。
本実施例においては、プロテインGのB1、B2、あるいはB3ドメインに変異を導入した本発明の改良型タンパク質(以降、改良型プロテインGと呼ぶ)のアミノ酸配列を設計するための変異を導入する部位を選定し、置換するアミノ酸残基を特定する。
1.Fcとの結合表面解析にもとづく変異対象部位の選定と置換するアミノ酸残基の特定
まず、プロテインG・B2ドメインとヒト免疫グロブリンG1のFc領域の複合体の立体構造座標データを、国際的なタンパク質立体構造データベースであるProtein Data Bank(PDB; http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)よりダウンロードした(PDBコード:1FCC)。ついで、Fc領域から6.5オングストロームの距離の範囲内に存在するプロテインG・B2ドメインのアミノ酸残基であって、かつ、プロテインG・B2ドメイン単独の場合で40%以上の露出表面積比をもつアミノ酸残基を該立体構造座標データを用いて計算し、変異対象部位として選定した。選定した部位のアミノ酸残基は、[配列番号2]で示されるプロテインG・B2ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44の13個である。図5に、これらの変異対象部位の位置を表示する。これらの変異対象部位は、B1ドメインにおいても共通に存在する。よって、これらはB2ドメインのみならず、B1ドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。即ち、[配列番号1]で示されるプロテインG・B1ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Glu42、Thr44の13個を変異対象部位として選定した。また、これらの変異対象部位の一部は、B3ドメインにおいても共通に存在する。よって、これらはB2ドメインのみならず、B3ドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。即ち、[配列番号3]で示されるプロテインG・B3ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Asp22、Thr25、Lys28、Lys31、Gln32、Asn35、Asp36、Gly38、Asp40、Thr44の10個を変異対象部位として選定した。
まず、プロテインG・B3ドメインとマウス免疫グロブリンG1のFab領域の複合体の立体構造座標データを、国際的なタンパク質立体構造データベースであるProtein Data Bank(PDB; http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)よりダウンロードした(PDBコード:1IGC)。ついで、Fab領域から4.0オングストロームの距離の範囲内に存在するプロテインG・B3ドメインのアミノ酸残基であって、かつ、プロテインG・B3ドメイン単独の場合で40%以上の露出表面積比をもつアミノ酸残基を該立体構造座標データを用いて計算し、変異対象部位として選定した。選定した部位のアミノ酸残基は、[配列番号3]で示されるプロテインG・B3ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38の10個である。図6に、これらの変異対象部位の位置を表示する。これらの変異対象部位は、B1、B2、B3のどのドメインにおいても共通に存在する。よって、これらはB3ドメインのみならず、B1およびB2ドメインにおいても変異対象部位として選定することができる。即ち、[配列番号1]および[配列番号2]で示されるプロテインG・B1ドメインおよびB2ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38の10個を変異対象部位として選定した。
なお、本実施例の計算は、ccp4i 4.0 (Daresbury Laboratory, UK Science and Technology Facilities Council)、Surface Racer 3.0 for Linux(Dr. Oleg Tsodikov, The University of Michigan)、Red Hat Enterprise Linux WS release 3(レッドハット)(以上ソフトウエア)、Dell Precision Workstation370(デル)(以上ハードウエア)を用いて遂行した。
上記Fcとの結合表面解析および上記Fabとの結合表面解析にもとづき選定した変異対象部位と特定した置換するアミノ酸残基を組み合わせた。
即ち、[配列番号1]で示されるプロテインG・B1ドメインの野生型アミノ酸配列のうちの、Asp22、Ala24、Thr25、Lys28、Val29、Lys31、Gln32、Asp40、Glu42、Thr44、Lys10、Thr11、Lys13、Gly14、Glu15、Thr16、Thr17、Asn35、Asp36、Gly38の20個を変異対象部位として選定した。元のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基は、Asp22についてはLys、Arg、またはHisが、Ala24についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Thr25についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys28についてはAsp、Glu、またはHisが、Val29についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys31についてはAsp、Glu、またはHisが、Gln32についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Asp40についてはLys、Arg、またはHisが、Glu42についてはLys、Arg、またはHisが、Thr44についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys10についてはLysとCys以外が、Thr11についてはThrとCys以外が、Lys13についてはLysとCys以外が、Gly14についてはGlyとCys以外が、Glu15についてはGluとCys以外が、Thr16についてはThrとCys以外が、Thr17についてはThrとCys以外が、Asn35についてはAsnとCys以外が、Asp36についてはAspとCys以外が、Gly38についてはGlyとCys以外が特定された。
元のアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基は、Asp22についてはLys、Arg、またはHisが、Thr25についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys28についてはAsp、Glu、またはHisが、Lys31についてはAsp、Glu、またはHisが、Gln32についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Asp40についてはLys、Arg、またはHisが、Thr44についてはAsp、Glu、Lys、Arg、またはHisが、Lys10についてはLysとCys以外が、Thr11についてはThrとCys以外が、Lys13についてはLysとCys以外が、Gly14についてはGlyとCys以外が、Glu15についてはGluとCys以外が、Thr16についてはThrとCys以外が、Thr17についてはThrとCys以外が、Asn35についてはAsnとCys以外が、Asp36についてはAspとCys以外が、Gly38についてはGlyとCys以外が特定された。
本実施例においては、上記選定した変異対象部位と上記特定した置換するアミノ酸残基の情報を利用して改良型プロテインGのアミノ酸配列を設計した。
上記から明らかなように、変異対象部位及び該部位を置換するアミノ酸残基は、各一つに限られるものではないので、変異対象部位及び該部位を置換するアミノ酸残基の中から適宜選択して、改良型タンパク質のアミノ酸配列を設計することができる。その選択は、無作為に行ってもよいし、構造活性相関等の他の公知の情報を加味してもよい。また、プロテインGの細胞膜外ドメインの性質を好ましいものに変化させることが既に知られている変異と組みあわせてもよい。本実施例では、実施例1の「1.Fcとの結合表面解析にもとづく変異対象部位の選定と置換するアミノ酸残基の特定」で選定した部位から、Asp22、Thr25、Gln32、Asp40、およびGlu42を選択し、これに対応する置換するアミノ酸残基として、Asp22His、Thr25His、Gln32His、Asp40His、およびGlu42Hisを選択し、この5変異箇所/5置換を組み合わせた点変異あるいは多重変異を[配列番号1]で示されるプロテインG・B1ドメインの野生型アミノ酸配列に対して行うことで、[配列番号10]で示される複数の改良型プロテインGのアミノ酸配列を設計した。
さらに、プロテインGの細胞膜外ドメインの熱安定性、変性剤に対する化学的安定性、および分解酵素に対する耐性を向上させることが発明者らの従前の研究により明らかにされているAsn35Lys、Asp36Glu、Asn37His、Asn37Leu、Asp47Pro、Ala48Lys、およびAla48Gluを選択し、これらを上記の7変異箇所/7置換に加えて得られる12変異箇所/14置換を組み合わせた点変異あるいは多重変異を[配列番号1]で示されるプロテインG・B1ドメインの野生型アミノ酸配列に対して行うことで、[配列番号4]で示される複数の改良型プロテインGのアミノ酸配列を設計した。
本実施例では、上記12変異箇所/14置換に対応する具体的アミノ酸配列として[配列番号13]〜[配列番号20]を最終的に選別し、この配列を示す改良型プロテインGを実際に合成し、その分子特性を評価した。
本実施例においては、改良型プロテインGのアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を設計した。
改良型プロテインGをコードする遺伝子の塩基配列については、設計した改良型プロテインGのアミノ酸配列を基に、Gene Designer (DNA2.0 Inc.) を利用して、大腸菌での発現効率が最適になるよう設計した。なお、改良型タンパク質は、タンパク質合成の実際的観点から以下の2系統に分けて製造されるため、遺伝子の塩基配列はベクターの塩基配列を勘案して系統ごとに微調整された。OXADac-PGタンパク質は、N末端側にOxaloacetate decarboxylase alpha-subunit c-terminal domain (OXADac)の、C末端側に改良型プロテインGの配列を有する融合タンパク質として製造される。即ち、[配列番号31]と[配列番号13]〜[配列番号20]が連結したアミノ酸配列となり合成される。M-PGタンパク質は、タグなし、融合なしの単純タンパク質として大腸菌を用いて製造される。このため設計したアミノ酸配列に開始コドン配列が付加される。即ち、M-PGタンパク質は[配列番号13]〜[配列番号20]のN末端にMetが付加したアミノ酸配列となり合成される。
本実施例においては、改良型プロテインGをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを合成し、ついで大腸菌を用いて、表1に示すOxaloacetate decarboxylase alpha-subunit c-terminal domain (OXADac)と改良型タンパク質の融合タンパク質(OXADac-PG01、OXADac-PG07、OXADac-PG13、OXADac-PG14、OXADac-PG15、OXADac-PG16、OXADac-PG17、OXADac-PG19、OXADac-PG20)を製造した。
[配列番号21]〜[配列番号29]の塩基配列からなるPG遺伝子(pg01、pg07、pg13、pg14、pg15、pg16、pg17、pg19、またはpg20) を組み込んだエントリープラスミドpDONR221-PG (DNA2.0)と発現用プラスミドChampion pET104.1-DEST (Invitrogen) についてGateway LR Clonase Enzyme Mix (Invitrogen) を用いて相同組み換えを行った。反応液を用いて保存用大腸菌DH5a株 (東洋紡, Competent high)を形質転換した。得られた形質転換体をcolony PCR、DNA sequencing (GE Healthcare Bioscience, BigDye Terminator v1.1) により選別し、QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) を用いてOXADac-PG発現用プラスミドを抽出した。
OXADac-PG発現用プラスミドを用いて、発現用大腸菌BL21(DE3) (Novagen) を形質転換した。前培養した形質転換体を、2.5ml / 500mlでLB培地に継代し、O.D.600 = 0.8〜1.0になるまで振とう培養した。OXADac-PG融合タンパク質を発現させるためIPTG(0.5mM)を加え、さらに37℃で2時間振とう培養した。回収した菌体を10mlのPBSに懸濁し、超音波破砕を行った後濾過滅菌し、これを全タンパク質溶液とした。全タンパク質溶液の一部はIgG Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Bioscience) microspinを用いて精製を試み、SDS-PAGEによって発現および精製を確認した。残りはHiTrap streptavidin HPカラム(GE Healthcare Bioscience) をセットした液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GE Healthcare Bioscience) に注入し、0.3ml/minの条件(running buffer: 20mM Na phosphate(pH6.7), 150mM NaCl)で運転することで、OXADac-PG融合タンパク質をカラムに固定化した。OXADacは分子内にビオチン化リジンを1つ有するため、カラム内のストレプトアビジンに選択的かつ非可逆的に結合する。なお、固定化量を最大化するため、HiTrap streptavidin HPカラムの結合許容量に対し、大過剰(10倍以上)のOXADac-PG融合タンパク質を注入した。
本実施例においては、改良型プロテインGをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを合成し、ついで大腸菌を用いて、表1に示すMet付加改良型プロテインG(M-PG01、M-PG07、M-PG19、M-PG20)を製造した。
(1)M-PG発現用プラスミドの合成
実施例4で作成したOXADac-PG発現用プラスミドを鋳型に、制限酵素認識配列を含むプライマーを加えPCRを行い(アニール45℃, 15秒 → 55℃, 5秒)、PG遺伝子領域を増幅した。使用したプライマーは、M-PG01およびM-PG07については、センスプライマー (ATAGCTCCATG GACACTTACAAATTAATCC(配列番号32))とアンチセンスプライマー(ATTGGATCC TTATTCAGTAACTGTAAAGGT(配列番号33))、M-PG19およびM-PG20についてはセンスプライマー(ATAGCTCCATG GATACCTACAAACTGATCC(配列番号34))とアンチセンスプライマー(ATTGGATCC TTATTCGGTAACGGTGAAGGT(配列番号35))を用いた。得られた増幅物は、アガロース電気泳動法(3%, 100V)で確認後、QIAquick PCR Purification kit (Qiagen) を用いて精製した。その後、制限酵素Nco IとBamH I (日本ジーン, 37℃, 一昼夜)で消化し脱リン酸化(宝酒造, CIAP, 50℃, 30分)させたプラスミドpET16b (Novagen) と、同じ制限酵素で消化したPG遺伝子(pg01、pg07、pg19、またはpg20)をライゲーション(東洋紡, Ligation High, 16℃, 1時間)し、得られたプラスミドベクターを用いて保存用大腸菌DH5α株(東洋紡, Competent high)を形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含むLBプレート培地で選択した。正しい挿入配列をもつ形質転換体をcolony PCR、DNA sequencing (AB, BigDye Terminator v1.1) により選別し、Qiaprep Spin Miniprep kit (Qiagen) を用いてM-PG発現用プラスミドを抽出した。これを用い、さらに発現用大腸菌BL21(DE3) 株(Novagen)を形質転換した。
LB培地で前培養した大腸菌BL21(DE3) 形質転換体を、2.5ml / 500mlでLB培地に継代し、O.D.600 = 0.8〜1.0になるまで振とう培養した。最終濃度0.5mM でIPTGを加え、さらに37℃で2時間振とう培養した。回収した菌体を10mlのPBSに懸濁し、超音波破砕を行った。破砕液は濾過滅菌後、濾液をIgG Sepharose 6 Fast Flowカラム (GEヘルスケアバイオサイエンス)をセットした液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GEヘルスケアバイオサイエンス)に注入し、アフィニティークロマトグラフィー法(running buffer: 50mM Tris-HCl(pH7.6), 150mM NaCl, 0.05% Tween20; elution buffer: 0.5M 酢酸)および/またはRESOURCE Sカラム (GEヘルスケアバイオサイエンス)をセットした液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GEヘルスケアバイオサイエンス)に注入し、イオン交換クロマトグラフィー法(running buffer: 20mM クエン酸, pH3.5; elution buffer: 20mM クエン酸, 1M NaCl, pH3.5)によりM-PG組換えタンパク質を精製した。分画したフラクションはNaOHで中和後、遠心濃縮機(RABCONCO, CentriVap concentrator)で濃縮し、50mM リン酸緩衝液(pH6.8)で透析した。各溶液を凍結乾燥し、粉末状の組換えタンパク質(M-PG01、M-PG07、M-PG19、M-PG20)を-20℃で保存した。
本実施例においては、改良型プロテインGの純度をポリアクリルアミドゲル電気泳動法で確認した。
精製前後の改良型プロテインGをそれぞれ75μM程度の濃度の水溶液に調製したのち、Tricine-SDS-PAGE(16%T, 2.6%C, 100V, 100min)を行いCBB (G-250) 染色によりバンドを検出し純度を確認した。その結果、改良型プロテインGは、測定したすべての試料のメジャーバンドとして検出され、改良型プロテインG(OXADac-PG19、OXADac-PG20、M-PG01、M-PG07)の合成収率は高く(>10mg/L-培地)、また精製度も充分であることが確認された。
本実施例においては、改良型プロテインGの分子量をMALDI-TOF型質量分析計で計測することで、製造したタンパク質を同定した。
まず、単離精製した改良型タンパク質を15〜25μMの濃度の水溶液に調製した。次いで、質量分析用サンプルプレートにマトリックス溶液(50%(v/v)アセトニトリル-0.1%TFA水溶液にα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸を飽和させた溶液)1μlを滴下し、これに各試料溶液を1μl滴下してサンプルプレート上で混合、乾燥させた。その後、質量分析装置Voyager(Applied Biosystems)にて、強度2500-3000のLaserを照射し質量スペクトルを得た。質量スペクトルにより検出されたピークの分子量と製造した改良型タンパク質のアミノ酸配列より算出された理論分子量を比較した結果、両者は測定誤差内で一致し、目的のタンパク質(OXADac-PG19)が製造されていることが確認された。
本実施例においては、OXADac-PG融合タンパク質を固定化したカラムを用いてpH勾配アフィニティークロマトグラフィーを行い、モノクローナル抗体の溶出するpHを調べることで、改良型プロテインGの弱酸性域での抗体解離性を評価した。
OXADac-PG融合タンパク質固定化カラムを液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GE Healthcare Bioscience) にセットし、TST buffer(50mM Tris-HCl(pH7.6), 150mM NaCl, 0.05% Tween20)を1ml/minの条件で流し平衡化させた後、100μg/200μlに調製したIgG1タイプのヒト化モノクローナル抗体を注入した。次いで、TST bufferを50mM Na3 citrate(pH7.0) に置換し、さらに0.5ml/minの流速で10minかけて連続的に0.5M acetate(pH2.5) へ置換することで、pH勾配(pH7.0→2.5/10min)を実現した。液体クロマトグラフィー装置に付属しているUVメータ(280nm)とpHメータの出力から、モノクローナル抗体が溶出するピークのpHを記録した。
その結果、測定したすべての改良型プロテインG(OXADac-PG13、OXADac-PG17、OXADac-PG19、OXADac-PG20)を固定化したカラムにおいて、野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質(OXADac-PG01)を固定化したカラムに比べて、高いpHでヒト化モノクローナル抗体が溶出することが明らかになった(図7)。たとえば、このうち最も優れた改良型プロテインG (OXADac-PG20)は野生型に比べて1.1ポイントも高いpHで溶出する。(表2)
本実施例においては、OXADac-PG融合タンパク質を固定化したカラムを用いてステップワイズpHアフィニティークロマトグラフィーを行い、モノクローナル抗体の溶出を、いくつかのpHで調べることで、改良型プロテインGの弱酸性域での抗体解離性を評価した。
OXADac-PG融合タンパク質固定化カラムを液体クロマトグラフィー装置 AKTA prime plus (GE Healthcare Bioscience)にセットし、リン酸バッファ(50μm Na2HPO4/NaH2PO4 (pH7.0))を0.4ml/minの条件で流し平衡化させた後、100μLの1mg/mlのサンプル(ChromPure Human IgG, Fc Fragment)を添加した。12mlのリン酸バッファで洗浄、10mlの溶出バッファ(100mM CH3COOH/CH3COONa, pH 4)で溶出を行った。その後、pH2.5、500mMのCH3COOHでカラムを洗浄し、最後に12mlのリン酸バッファでカラムを再平衡した。液体クロマトグラフィー装置に付属しているUVメータ(280nm)の出力から、ヒトポリクローナルFc領域のステップワイズpHの溶出するパターンを得られた。
その結果、測定した改良型プロテインG(OXADac-PG19、OXADac-PG20)を固定化したカラムにおいて、野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質(OXADac-PG1)を固定化したカラムにくらべ、高いpHでヒトポリクローナル抗体Fc領域が溶出することが明らかになった(図8)。pH 4領域でのPG1、PG19、PG20の溶出率は各々10%、88%、71%で、改良型プロテインG(OXADac-PG19、OXADac-PG20)が野生型に比べて7倍以上高くなったことが確認された(表2)。
本実施例においては、改良型タンパク質(プロテインG変異体)の結合解離性を表面プラズモン共鳴(SPR)法により評価した。SPR法は、生体高分子間の特異的相互作用を経時的に測定し、反応を速度論的観点から定量的に解釈できる優れた方法であることが認識されている。
まず、センサーチップSA (Biacore)の測定セルに、ビオチンを介してOXADac-PG融合タンパク質を固定化した。次いで、ヒト免疫グロブリンIgGを、ランニング緩衝液であるHBS-P (10mM HEPES pH7.4, 150mM NaCl, 0.05% v/v Surfactant P20)に溶解し、1μMの試料溶液を調製した。SPRの測定は、Biacore T100 (Biacore)を用い、反応温度25℃で行った。試料溶液の添加後、解離溶液(10mM 酢酸ナトリウム pH4.0)によるIgGの解離挙動を測定した。観測結果の解析にはBIAevaluation version 4.1を用いた。解離前後のRU変化をIgGの結合RU値で除することでIgGの残存量比を算出し、また、その解離曲線を1:1のラングミュアモデルにフィッティングさせることで解離速度定数koffを決定した。
実験に用いた解離条件下の下、野生型のアミノ酸配列を有するOXADac-PG01は有意な解離を示さなかったのに対し、改良型タンパク質(OXADac-PG13, OXADac-PG14, OXADac-PG19, OXADac-PG20)は顕著な解離挙動を示した (表2)。たとえば、OXADac-PG19は本条件下において吸着IgGの60%以上を解離しており、その解離速度定数は野生型のそれに比較して3オーダー以上の上昇を示した。
本実施例では、中性領域、およびヒスチジン残基の95%以上がプロトン化する弱酸性領域において、改良型タンパク質の抗体結合性を表面プラズモン共鳴(SPR)法により評価した。
まず、センサーチップの測定セルにヒト免疫グロブリンのFc領域をアミンカップリング法により固定化した。測定のコントロールとして、カルボキシメチル基をエタノールアミンでブロッキングした対照セルを用いた。センサーチップとして、中性領域の測定にはCM5 (Biacore)、弱酸性領域下での測定にはCM4 (Biacore) を用いた。次いで、単離精製した改良型タンパク質を、中性領域のランニング緩衝液であるHBS-P (10mM HEPES pH7.4, 150mM NaCl, 0.05% v/v Surfactant P20)、または弱酸性領域のランニング緩衝液 (10mM 酢酸ナトリウム pH4.5, 150mM NaCl, 0.05% v/v Surfactant P20)に溶解し、それぞれ500, 400, 300, 200, 100 nM、および1000, 800, 600, 400, 200 nMの5種の濃度の試料溶液を調製した。SPRの測定は、Biacore T100 (Biacore)を用い、反応温度25℃で行った。収集したデータは、Biacore T100 Evaluation Softwareを用いて解析し、1:1のラングミュアモデルにフィッティングさせ、解離平衡定数KDを算出した(図9)。
その結果、改良型タンパク質M-PG19は野生型のアミノ酸配列を有するコントロールタンパク質M-PG01に比較し、中性領域では11倍以上の親和性を示した一方、酸性領域での親和性は0.6倍程度にまで減少していることが明らかとなった(表3、図10)。また、各々のタンパク質において、pH4.0のKDとpH7.0のKDの比を計算すると、改良型タンパク質M-PG19は際立ってのその値が大きい(図11)。これは、pHのシフトによって溶出される抗体の量が大きいことを意味し、即ち、改良型タンパク質M-PG19を用いることでアフィニティクロマトグラフィーにおける抗体の回収率を大きく向上させることが可能であることを示す。
本実施例においては、改良型タンパク質の熱安定性を評価した。円偏光二色性(CD)スペクトルは、タンパク質の二次構造の変化を鋭敏に反映する分光学的分析方法であることが知られている。CDスペクトルの強度に相当するモル楕円率を試料の温度を変化させながら観測することで、どの程度の温度で各々の改良型プロテインGが変性するのかを明らかにすることができる。
単離精製した改良型タンパク質をそれぞれ15〜25μMの濃度で含む水溶液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.8)に調製した。この試料溶液を円筒型セル(セル長0.1cm)に注入し、J805型円偏光二色性分光光度計(日本分光)を用いて、20℃の温度で測定波長を260nmから195nmに移動させCDスペクトルを得た。同じ試料を98℃に加熱、さらに98℃から20℃に冷却し260nmから195nmの円二色性スペクトルを得た。加熱後再冷却したスペクトルのモル楕円率は60%以上回復し、改良型プロテインGの立体構造が熱変性に対し、ある程度可逆であることが確認された。
実施例13
本実施例においては、改良型タンパク質の単結晶を作成し、立体構造をX線回折解析により決定した。
まず、単離精製した改良型タンパク質M-PG19を、以下に示すハンギングドロップ法を用いて結晶化した。空間群P43212に属する結晶を得るには、このタンパク質試料を10mMトリス塩酸緩衝液pH7.4に5〜10mg/mlの濃度になるように溶解したタンパク試料溶液1μlと、等量の結晶化剤溶液(70% MPD、20mM HEPES緩衝液pH7.4)とをピペットマンを用いてカバーガラス(Hampton社製)上で滴下・混合して結晶化溶液とした。上述の結晶化剤溶液をHampton社製24穴プレートに注入し、結晶化溶液を滴下したカバーガラスで蓋をして高真空グリースを用いて密封した。このプレートを20℃に保たれたインキュベーター中で保管した。およそ1〜2週間後に良質の単結晶が結晶化溶液中に得られた。
続いて、得られた単結晶を微量の母液とともに結晶解析用ループですくい、液体窒素ガスを用いて急速凍結させ、X線回折実験に供した。回折測定は、高エネルギー加速器研究機構の放射光科学研究施設のビームラインBL−6Aにて定法に従い行い、分解能1.6Åまでの回折データを収集した。得られた回折像は、プログラムHKL-2000(HKL Research社)を用いて回折点の指数付けおよび積分強度の測定・数値化をおこない68935個の強度データを得た。この段階で、使用した単結晶の結晶パラメータが決定された。すなわち、結晶の空間群は正方晶系P43212、格子定数はa=b=23.26 Å、およびc=178.7Åであった。さらにHKL-2000を用いてマージとスケーリングを行い、8862個のユニークな強度データを得た。これらのRsym値は6.8%であった。
構造決定は、野生型プロテインG B1ドメインの立体構造座標データとプログラムMolrep(Vagin, A., and Teplyakov, A. (1997) Journal of Applied Crystallography 30, 1022-1025)を用いた分子置換法によって行い、引き続きプログラムCNS(Brunger, A. et al.(1998) Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 54, 905-921)、REFMAC5(Murshudov, G. N., et al. (1997) Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53, 240-255)、Coot(Emsley, P., and Cowtan, K. (2004) Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 2126-2132)を用いて構造精密化をおこなった。その結果、当業者においてパラメータ精度の指標とされているR値は、全強度データに対し23%となった。
このようにして得られた改良型タンパク質M-PG19の3次元構造は野生型プロテインG B1ドメインと極めて相似であった。即ち、決定したM-PG19の主鎖の座標と、Protein Data Bankに登録されている野生型の主鎖の座標(PDBコード:1PGA)を比較すると、その二乗平均平方根残差(RMSD)は0.71Åである。これより、本発明で改良型タンパク質に施したアミノ酸置換が、野生型プロテインG B1ドメインの立体構造をほとんど変化させないことが証明された(図12)。
Claims (20)
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B1ドメインタンパク
質の変異体タンパク質であって、以下の(a)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(a)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・B1ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(a)
AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaThrAlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnX36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X36 X37 X47 X48はAspAsnAspAla又はGluHisProGluを、X22はAsp又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、X40及びX42の少なくとも一つはHisであるか、又は、X11X17はArgIleである。) - 配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B2ドメインタンパク
質の変異体タンパク質であって、以下の(b)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(b)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・B2ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性
が低下した変異体タンパク質。
(b)
ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaThrAlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnX36X37GlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X36 X37 X47 X48はAspAsnAspAla又はGluHisProGluを、X22はAsp又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、X40及びX42の少なくとも一つはHisであるか、又は、X11X17はArgIleである。) - 配列番号3で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B3ドメインタンパク
質の変異体タンパク質であって、以下の(c)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(c)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・B3ドメインタンパク質に比べ、少なくとも、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質。
(c)
ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluThrAlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnX36X37GlyValX40GlyValTrpThrTyrAspX47X48ThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X36 X37 X47 X48はAspAsnAspAla又はGluHisProGluを、X22はAsp又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、X40はHisであるか、又は、X11X17はArgIleである。) - 配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B1ドメインタンパク
質の変異体タンパク質であって、以下の(d)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(d)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B1メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab
領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変
異体タンパク質。
(d)
AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaThrAlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、X40及びX42の少なくとも一つはHisであるか、又は、X11X17はArgIleである。) - 配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B2ドメインタンパク
質の変異体タンパク質であって、以下の(e)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(e)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B2メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab
領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変
異体タンパク質。
(e)
ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrGluAlaValX22AlaAlaThrAlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、X40及びX42の少なくとも一つはHisであるか、又は、X11X17はArgIleである。) - 配列番号3で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B3ドメインタンパク
質の変異体タンパク質であって、以下の(f)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(f)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B3メインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab
領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変
異体タンパク質。
(f)
ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysX11LeuLysGlyGluThrX17ThrLysAlaValX22AlaGluThrAlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X11はThr又はArgを、X17はThr又はIleをそれぞれ表す。ただし、X40はHisであるか、又は、X11X17はArgIleである。) - 配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B1ドメインタンパク
質の変異体タンパク質であって、以下の(g)で示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは(g)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ、野生型プロテインG・B1ドメインタンパク質に比べ、Fc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(g)
AspThrTyrLysLeuIleLeuAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaThrAlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisをそれぞれ表す。ただし、X40及びX42の少なくとも一つはHisである。) - 配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B2ドメインタンパク
質の各変異体タンパク質であって、以下の(h)で示されるアミノ酸配列からなるか、ある
いは(h)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置
換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合
活性を有し、かつ野生型プロテインG・B2ドメインタンパク質に比べ、Fc領域に対し弱酸
性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(h)
ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrGluAlaValX22AlaAlaThrAlaGluLysValPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyX42TrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はAsp又はHisを、X42はGlu又はHisをそれぞれ表す。ただし、X40及びX42の少なくとも一つはHisである。) - 配列番号3で示されるアミノ酸配列からなる野生型プロテインG・B3ドメインタンパク
質の各変異体タンパク質であって、以下の(i)で示されるアミノ酸配列からなるか、ある
いは(i)で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置
換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合
活性を有し、かつ野生型プロテインG・B3ドメインタンパク質に比べ、Fc領域に対し弱酸
性領域での結合活性が低下した上記変異体タンパク質。
(i)
ThrThrTyrLysLeuValIleAsnGlyLysThrLeuLysGlyGluThrThrThrLysAlaValX22AlaGluThrAlaGluLysAlaPheLysX32TyrAlaAsnAspAsnGlyValX40GlyValTrpThrTyrAspAspAlaThrLysThrPheThrValThrGlu
(上記アミノ酸配列中、X22はAsp又はHisを、X32はGln又はHisを、X40はHisをそれぞれ表す。) - 配列番号14、15、18〜20のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の変異体タンパク質。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列とリンカーペプチドあるいはリンカータンパク質のアミノ酸配列が交互に並んだアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 請求項1〜11のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列と他のタンパク質のアミ
ノ酸配列を連結したアミノ酸配列からなる融合タンパク質。 - 請求項1〜12のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
- 配列番号22、24、25、28、29のいずれかで示される塩基配列からなる核酸。
- 請求項13又は14に記載の核酸の塩基配列に相補的な配列からなる核酸と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、免疫グロブリンGのFc領域に対する結合活性を有し、かつ野生型プロテインG・B1ドメインタンパク質に比べ、免疫グロブリンGのFab領域に対する結合活性及び/又はFc領域に対し弱酸性領域での結合活性が低下した変異体タンパク質をコードする核酸。
- 請求項13〜15のいずれかに記載の核酸を含有する組換えベクター。
- 請求項16に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
- 請求項1〜12のいずれかに記載のタンパク質が、水不溶性の固相支持体に固定化され
ていることを特徴とする、固定化タンパク質。 - 請求項1〜12のいずれかに記載のタンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫
グロブリンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質の捕捉剤。 - 請求項18に記載の固定化タンパク質からなることを特徴とする、抗体、免疫グロブリ
ンGあるいは免疫グロブリンGのFc領域を有するタンパク質の捕捉剤。
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