JPH01235584A - 新規シュードモナス属菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なシュードモナス属菌に関するものであ
る。

従来、−最に蛋白質を微生物によって生産させるという
場合、微生物と培養し、微生物１体を磨砕後、蛋白質を
抽出、精製することにより得ていた。

また、一般に遺伝子組換えの微生物生産の宿主としては
、大腸菌が主に使用されているが、大腸菌では、８＋１
換え遺伝子によって合成されるペプチドや蛋白質は細胞
内にとどまり培地中に分泌生産されないため、自づとそ
の生産Ｉは制限されていた。

その上、細胞磨砕によりペプチド、蛋白質を抽出精製す
ることは、操作が煩惟になるなどの欠点が措摘されてい
る。

鵜高は、先に、遺伝子組換えにおける宿主菌として蛋白
質を菌体外に分泌する微生物を求めて研究した結果、蛋
白質を多量に分泌生産する微生物として、約１．２００
株のなかからバチルス・プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｂｒｅｖｉｓ）　４株、新菌株バチルス・プロテイホー
マンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｆｏｒｍａｎ
ｓ）１株の計５株を分離同定するに至った。［Ａｇｒｉ
ｃ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅ＋ｍ、、４０　（３）、　５２３−５２８（１９
７６１］また、一方、分泌宿主−ベクターとして枯草菌
も１用され、α−アミラーゼ、インターフェロンなど各
種異種蛋白質を培地中に蓄積させることに成功している
が、菌体内外の強い１０テアーゼにより生産量が制限さ
れたり、分解されたりして、良好な結果は得られていな
い。

先に、鵜高らは、バチルス・ステアロサーモフィルス（
Ｂａｃ目１ｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒａ＋ｏｐｈｉｌ
ｕｓ）　ＤＹ−５の耐熱性α−アミラーゼ遺伝子をプラ
スミド　ｐｕＢｔｔｏに組込んだｐＢＡＭｉｏ＋を保有
するバチルス　プレビス４７及び枯草菌を３７℃、４８
時間培養した時、バチルス・プレビス４７では約１５．
０００Ｕ／＋＋＋１．枯草菌では３，０００Ｕ／ｍ俊程
度のα−アミラーゼをそれぞれ培地中に生産１１ａｆル
ノをｆＩ認した。［Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　１
６４゜（３１，１１８２−１１８７（１９８５）］ここ
に、全く同一のプラスミドを保有するバチルス・プレビ
ス４７と枯草菌とでは、耐熱性α−アミラーゼの生産に
おいてバチルス・プレビス４７の方が約５倍も生産効率
のよいという事実から蛋白質生産菌の有する蛋白質分泌
能を用いることにより異種遺伝子産物を効率良く分泌生
産させうろことが判明した。

そこで、本発明者らは、蛋白質を著１分泌しする菌が遺
伝子組換えにおける宿主菌としてすぐれたものであると
の発想から、このような菌株を求めて鋭意選別を行った
ところ、各種資料から分離した約　１００．０００株の
なかから菌体外に著量の蛋白質を生産する株をｊｊＬＩ
した。

ここに単離された株について、種の同定を行ったところ
、はとんどはバチルス属に属するものと同定された。

本発明者等は、更に鋭意選別を行ったところ、バチルス
属以外にも、蛋白質を著量に菌体外に分泌生産する菌株
を単離することに成功したのである。ここに単離された
株について、穐の同定を行ったところ、シュードモナス
属に属するものと同定され、本発明を完成するに到った
。

本発明は、菌体外に著量の蛋白質を生産するシュードモ
ナス属菌である。

従来、バチルス属において、蛋白質を生産する１株は知
られているが、シュードモナス属ｌで蛋白質を５　ｇ／
ｅ以上もの著量菌体外に生産する菌株は知られていない
。

本発明においてはじめて分離された新菌株、即ち、菌体
外に著量の蛋白質を生産するシュードモナス属の新菌株
は全く新規である。

本発明においては、蛋白質を５　ｇ／１以上培地中に分
泌生産する菌株を目標に選択分離された。

まず、土壌などの試料から分離された約１００．０００
株の菌株をＴ２寒天平板培地（１％グルコース、１％ペ
プトン、０．５％肉エキス、０．２％酵母エキス、１５
％寒天末、ｐｔ１７．Ｑ＞に接種し、平板培地上でコロ
ニー周辺が５％過塩Ｉｇ酸により白濁する細菌を選択し
た０次に、ここに分離した細菌株をＴ２液体培地（１５
０ｍ１容三角フラスコ、培地量１０ｍ１　）で振盪培養
（３０℃、４８時間）シ、その培養ｒ液中に１．２ｇ／
１以上の蛋白質を生産する菌株を８０株得々菌体外蛋白
質の測定においては、培養液に等量の０．２Ｎ　ＮａＯ
Ｈを加え攪拌後１０，０００ｒｐ＋ｍ　Ｘ　５分遠心分
離処理して菌体を除き、１漬に等量の１０％トリクロル
酢酸を加えてｌＯ分渣３．ＯＯＯｒｐｍＸＩＯ分間遠心
分離して沈殿を集め、ＩＮ　Ｎａ０）１で溶解したｆｌ
Ｌｏｗｒｙ法［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ａ、　１９３．
２６５（１９５１）］によって定量し、蛋白質量は牛血
清アルブミンとして換算した。

蛋白質高生産培地として第１表に示す培地を選んだ。

第１表　蛋白質生産菌１ｍｌ これらの５種類の培地のすべての培地に、先に得られた
８０株の菌を振盪培養し、いずれがの培地で菌体外蛋白
質を５ｇ／Ｉ以上生産する菌株を３１株選択した。

これら３１株を、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏ
ｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉ−ｎａｔｉｖｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ　＜第８版）　、Ｂｅｒｇｅｙ’Ｍａｎｕａ
ｌ　ｏｆ　５ｙｓｔｅ＋ａａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｉｇｙ　ｖｏｌ、ｌ及び、ＴｈｅＰｒｏｋａｒｙｏｔ
ｅ　（＾）Ｉａｎｄｂｏｏｋ　ｏｎ　Ｈａｂｉｔａｔｓ
。

ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）によって同定したと
ころ、６株は、まず、好気性、ダラム染色陰性、桿菌、
胞子を形成しない点においてシュードモナス属に属する
ものと；２められたそのうち、ｌ０１６株をその他の形
も的性質、各培地における生育状態、生理学的性質につ
いて、シュードモナス属の従来知られている菌種と比較
検討した結果、シュードモナス属のどの菌種とも異って
いた。

従って、本菌種はシュードモナス属の新油種として同定
された。

かくて、本傷種はシュードモナスｓｐ、ＨＯＩ６と命名
された。シュードモナスｓｐ、１ｌｏ１６はＦＥＲＭ　
Ｐ−９７３９として微工研に寄託されている。

次にシュードモナス　ｓｐ、ＨＯ１６の菌学的性質を示
す。

（Ａ）形態的性質 （１１）　３＋、’地における生ｒＮＫ聾（Ｃ）生理学
的性質 つづきあり （Ｄ）ＩＩ及びガスの生成 （Ｅ）炭素源の資化性 Ａｃｅｔａｔｅ　　　　　　　　　　　　＋５ｕｃｃｉ
ｎａｔｅ　　　　　　　　　　　＋Ｆｕ＋ａａｒａｔｅ
　　　　　　　　　　　　　　　　　−し−１４ａｌａ
ｔｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋ｊ−
）１ｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｌａｔｅ　　　　　　＋Ｌａ
ｃｔａｔｅ　　　　　　　　　　　　＋Ｃ１ｔｒａｔｅ
　　　　　　　　　　　　＋ｇ−Ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒ
ａｔｅ　　　　　　　−Ｇｌｙｃｅｒｏｌ　　　　　　
　　　　　＋し一＾１ａｎｉｎｅ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　＋Ｌ−Ａｓｐａｒｔａｔｅ　　　　
　　　　　　−Ｌ−Ｇｌｕｔａｍａｔｅ　　　　　　　
　　　＋し一＾ｒｇｉｎｉｎｅ　　　　　　　　　　−
Ｌ−Ｐｒｏｌ　ｉｎｅ　　　　　　　　　　　＋し−Ｔ
ｙｒｏｓｉｎｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
＋５ｕｃｒｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　
−Ｍａｌｔｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　−Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ　　　　　　　　　　　　
　　　−Ｌａｃｔｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　−Ｄ−＾ｒａｂｉｎｏｓｅ　　　　　　　　　
　　　　　　−＾ｒａｂｉｔｏ＋　＋ ５ｔａｒｃｈ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
−１ｎｕｌｉｎト ０ｘａｌａｔｅ＋ Ｅｔｈｙｌｅｎ　ｇｌｙｃｏｌ　　　　　　　　　　　
−Ｌ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　　　　　　　　　　　　　
　−Ｄ−Ｒｉｂｏｓｅ　　　　　　　　　　　＋Ｍａｎ
ｎｉｔｏｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　＋５ｕｃｒｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　
＋Ｌ−Ａｒａｂｉｎｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　
＋Ｌ−Ｒｈａｍｎｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　
　−Ｇｌｕｃｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　　　
＋Ｄ−Ｍａｎｎｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　＋
Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　
＋Ｌ−１１ｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌ　ｉｎｅ　　　　　　
　　　＋１ｎｏｓｉｎｅ　　　　　　　　　　　　　　
　　＋Ｂｅｔａｉｎｅ　　　　　　　　　　　　　　　
　　−Ｄ−ＦｒｕｃＬｏｓｅ　　　　　　　　　　　　
　　　＋５ｕｃｒｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　−Ｔｒｅｈａｒｏｓｅ　　　　　　　　　　
　　　　　＋５ｕｃｃｎａｔｅ　　　　　　　　　　　
　　　　←Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ　＋ Ｍａｌｏｎａｔｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　−Ｄ（−）−Ｔａｒｔｒａｔｅ　　　　　
　　　　　　−５ｏｒｂｉｔｏｌ　　　　　　　　　　
　　　　　　　−Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　
　　　　　　　　−Ｅｔｈａｎｏｌ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　−ｎ−Ｂｕｔａｎｏｌ　＋ Ｂｅｎｚｏａｔｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　−ｍ−１１ｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ　　　　　
　　　　　　　−ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ
　　　　　　　　　−Ｐｈｅｎｏｌ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　−Ｇｌｙｃｉｎｅ　　　　　　　
　　　　　　　　　−Ｌ−３ｅｒｉｎｅ　＋ し−しｅｕｃｉｎｅ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　＋しｌ５ｏｌｅｕｃｉｎｅ　　　　　　　　＋
Ｎ−＾ｃｅｔｙ１ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ　　　　　　
士Ｒａｆｆ１ｎｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　−
Ｃｒｅａｔｉｎｅ　　　　　　　　　　　　　　　−Ｄ
ｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ　　　　　　　　　　　−Ｄ−
Ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ　　　　　　　　　　　−本発
明は、菌体外に著量の蛋白質を生産するシュードモナス
属菌で、特にシュードモナス　ｓｐ。

）１０１６である。

本発明のシュードモナス　Ｓｐ、ＨＯ１６を培養するこ
とにより著量生産した蛋白質の性質次第では、それ自体
食糧蛋白質やゲル化剤、膨化剤等の食品加工素材または
、ガラス様素材、紙、人工皮革等の表面加工等の工業素
材としての利用等産業上の有用性が非常に高い。

また、本発明のシュードモナス　ｓｐ、）１０１６を遺
伝子組換えの宿主菌として利用した場合遺伝子組構えに
よる生産物を効率良く菌体外に分泌することができるの
で、遺伝子組換えにおける宿主菌としてきわめてすぐれ
たものになるであろう。

この系は、医薬品、良質な食糧蛋白質やゲル化剤、Ｉｌ
化剤等の食品加工素材または、ガラス様素材１紙、人工
皮革等の表面加工の工業素材などの生産手段としての活
用が期待できる。

以上のように本発明の有用性は産業上極めて意義深いも
のである。

以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する
。

実施例１ ｗ記第１表ｔａノ５ＹＰＣ培地５００１を２Ｑ容のジャ
ーファーメンタ−に分注し、常法により　１２１℃２０
分滅菌した後、冷却した。

別に、　５ＹＰＣ培地５＋ｍｅ分注した試験管をオート
クレーブすることにより滅菌し、これにシュードモナス
ｓｐ、ＮＯ＋６を１白金耳摺種し、３７℃で１４時間振
１培養した。この前培養−５満１をジャーファーメンタ
−に接種し、３７℃　４８時間　通気１０．５１／分回
転数４００ｒｐ−で培養した。培養終了後、培養物に等
孟ノ０．２Ｎ　ＮａＯＨを加え攪拌ｆ＆　　１０１００
００ｒｐ　５分遠心分離処理して１１体を除き、上清１
００１に等量のｌｏｚトリクロル酢酸を加え１０分後　
３０００ｒｐｍＸ　１０分１副遠心分離して沈殿を集め
た。５％トリクロル酢酸で洗浄し、遠心分離に沈殿を集
めＩＮ　Ｎａ０ＩＩで溶解したｆＡＬｏｗｒｙ法によっ
て定量した。蛋白質は牛血清アルブミンに換算して示し
た。その結果、菌体外に生産された蛋白質量は６ｇ／Ｉ
であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 菌体外に著量の蛋白質を生産する新規シュードモナス属
   菌。