JP3013008B2 - 無胞子性菌株バシラス・サチリス ｓｍｓ２７５ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、無胞子性菌株バシラス・サチリ
ス（Bacillussubtilis）SMS275（CMS 432.90）及び異質
生成物の製造のための宿主−ベクター系における宿主と
しての該菌株の使用に係る。

【０００２】当分野では、ある種の生産系（この用語
は、タンパク質又はポリペプチドをコード付ける遺伝子
を含有する発現ベクターと該ベクターを含有する宿主と
の組合せを意味する）を使用する発酵法によるタンパク
質及びポリペプチドの製造が知られている。現在市場に
ある多くの（遺伝子）組換え生成物は、大腸菌（Escher
ichia coli)、CHO細胞又はサッカロミセス・セレビシア
エ（Saccaromyces cerevisiae）を宿主として使用した
生産系の利用によって生成されたものである。

【０００３】しかしながら、これらの系は完全には満足
できるものではなく、従って、当分野では、基本的に
は、たとえばバシラス属菌（Bacillus）及びストレプト
ミセス属菌（Streptomyces）又は酵母のような細菌、ク
ルフェロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）及
びヤロヴィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）の
ような真菌又は昆虫細胞の如き宿主組織の使用に基づく
異質生成物生産用の他の生産系を提供することが求めら
れている。工業的見地からみて理想の生産系は、容易に
精製され、天然のタンパク質と同じ生物活性を有する組
換え生成物の生産を高収率かつ経済的に注目に値するコ
ストで実施し得るものである。このような系は下記のも
ので構成される。 １）細胞中にコピーが多数存在し、細胞内において目的
の生成物が高収率で生産されるように安定して保存され
る強い調節エレメント（プロモーター及びターミネータ
ー）を含有するベクター。 ２）異種遺伝子により提供される指令を正確に実行し
て、天然生成物と同一の生成物の生産を可能とし、コマ
ーシャルレベルでの培養に好適である［すなわち、耐性
であり、高密度に増殖でき、栄養因子に関する要求があ
まり過酷でなく、安全（すなわち毒性の汚染物を生産し
ない）である］宿主。

【０００４】現在、組換え生成物の生産用発現系の開発
に当たりバシラス・サチリス（Bacillus subtilis)(以
降、Ｂ．サチリスと表示する）が注目されている。実
際、Ｂ．サチリスは、完全な非病原性であり、培地中に
遺伝子発現生成物を分泌でき、大規模な生育が容易であ
るため、バイオテクノロジーの見地から特に注目される
微生物である。医薬品工業及び食品工業にとって興味深
い異質タンパク質及びポリペプチドの発現用宿主として
Ｂ．サチリスを使用することは、これら生成物の生産方
法の許可を受けるための重要な要因である。しかしなが
ら、微生物の使用に関する禁忌の１つは、ある種の生理
的生育条件下における胞子形成の能力による。事実、化
学的−物理的試薬に対する高い抵抗性によって特徴づけ
られる胞子は、最も一般的な環境条件下で生残る大きい
可能性を有する。医薬及び食品の分野で興味深い生成物
の製法においてＢ．サチリスの組換え菌株を使用するこ
とは、胞子が外部環境に分散される可能性が低いことを
示さない場合には、法律上の規制を受けることになる。
Ｂ．サチリスにおける内生胞子の形成は、細胞の生理系
及び超微細構造における変化（生育栄養源が限定される
条件に対する応答の結果として）によって生ずる細胞分
化過程である。胞子形成（平均して37℃において６ない
し８時間で行われる）の間に、細胞は一連の良好に限定
された形態学的段階を受ける。この段階は胞子嚢内での
増殖形への交代細胞形である内生胞子の形成によって終
わる。これらの段階（慣例的に段階０−VIIとして定義
される）は、異なる遺伝子（spo遺伝子）によってコー
ド付けられる一連の物質を要求する。当分野では、化学
試薬又は物理試剤によるspo遺伝子の突然変異により、
又はインビトロでの変異誘発技術の利用により胞子を生
産しないＢ．サチリスの菌株（無胞子性菌株）を調製す
ることが知られている。胞子の形成を生じなくなった突
然変異体は、理論的には、異質タンパク質の生産に使用
される。しかしながら、突然変異体のいくつかのもの
は、spo^-表現型の不安定性、発現ベクターを安定に保存
できないこと、菌株内に存在するベクターのコピー数が
少ないことにより、Ｂ．サチリスの無胞子性発現用の系
の開発に関して完全には満足できる宿主ではないことが
明らかになっている。

【０００５】発明者らは、上述の問題点を解消するＢ．
サチリスの無胞子性突然変異体を新たに単離した。この
突然変異体（SMS275として公知）は1990年10月５日付け
でCentraalbureau Voor Schimmelculturesに寄託してあ
り、その受託番号はCBS 432.90である。このように、本
発明の目的は、無胞子性菌株バシラス・サチリス SMS27
5を提供することにある。本発明の他の目的は、異質生
成物の生産用宿主−ベクター系における宿主としての該
菌株の使用にある。本発明の他の目的は、異質生成物を
コード付ける遺伝子を含有する発現ベクターによる無胞
子性菌株バシラス・サチリス SMS275の形質転換、好適
な培地中での形質転換菌株バシラス・サチリス SMS275
の生育及びこのようにして生産された遺伝子発現生成物
の分離及び精製を包含する所望の異質生成物の製法にあ
る。特に、本発明による無胞子性菌株バシラス・サチリ
ス SMS275は、遺伝子マーカー spoII:D^-、Leu（ロイシ
ンの不存在下では最小培地中で生育しない）、pyrD1
（ウラシルの不存在下では最小培地中で生育しない)、a
pr^-及びnpr^-（セリンプロテアーゼ及びニュートラルプ
ロテアーゼを生育しない）によって特徴づけられる。該
菌株はspo^-表現型を安定して保存でき（実際のところ、
胞子形成性への逆戻りの頻度は約10^-8である)、複製可
能な発現ベクターの多数のコピーを安定に保存できる。

【０００６】本発明による無胞子性菌株を構成するに当
たり使用できる方法は、Ｂ．サチリスの胞子形成菌株に
ついてトランスポゾンにより突然変異を生じさせ、この
ようにして生成した無胞子性突然変異体を単離すること
からなる。トランスポゾンは、移動可能で、ゲノム内の
異なった位置に挿入され、宿主の菌株に新たに遺伝性特
性を付与するDNAのエレメントである。事実、ゲノム内
の部位に挿入された後、トランスポゾン（抗生物質に対
する耐性をコード付ける遺伝子を含有する）は遺伝子の
配列を中断する（表現型突然変異によって表示される）
と共に、宿主に特殊な抗生物質に対する耐性を付与す
る。本発明の１具体例によれば、トランスポゾンTN917
（Tomich及びClewell，J．Bacteriol.,（1980)，141：1
366−1574)(中でも、抗生物質のエリスロマイシン（E
m）に対する耐性をコード付ける）を使用する。トラン
スポゾンの挿入による突然変異は、公知技術による接合
又は形質転換によって行われる。特に、本発明による無
胞子性菌株は、野生形（胞子形成性）の菌株Ｂ．サチリ
ス SMS118を、バシラス属菌において複製されないもの
であって、トランスポゾンTN917を含有するプラスミド
で形質転換させ、エリスロマイシンを添加した培地で突
然変異菌株を選別することによって調製される。実際の
ところ、理論上では、トランスポゾンTN917が胞子形成
性菌株の染色体DNA内に一体化されたクローンのみがこ
の培地で生育できる。

【０００７】この目的に好適なプラスミドは、たとえば
pTV1TS、pTV32TS、又はpTV51TS（Youngmannら，Regulat
ion of Prokaryotic development，I．Smith，R．A．Sl
epacky及びP．Settlow編，American Soc．for Microbio
logy，ｐ65−87，1989）である。一方、トランスポゾン
TN917は、プラスミドpAD2［Tomich及びClewell，J．Bac
teriol.,（1980)，141：1366−1574］から単離され、
Ｂ．サチリス内で複製されないプラスミドに導入され
る。エリスロマイシン耐性クローンの非胞子形成特性
を、光学顕微鏡での分析及び胞子形成培地上での直接表
示（胞子を形成するコロニーは数日後には褐色に着色す
るが、無胞子性のコロニーは白色のままであり、溶菌す
る傾向がある）の両方によってテストした。分析したい
くつかのEm耐性（Em^r）形質転換体はspo^-表現型を示し
た。spoII：D遺伝子内における変異を含むspo^-形質転換
体の１つ（SMS275と称す）を、さらにleu、pyrD1、apr^-
及びnpr^-遺伝子型の安定性をチェックするためテストに
供した。Leu及びpyrD1マーカーの分析を、ロイシン及び
ウラシルの不存在下及び存在下、最小培地で菌株SMS275
を生育することによって行った。両化合物を含有する培
地でのみ生育する菌株の能力はマーカーの安定性を示す
ものである。また、apr^-及びnpr^-マーカーの分析を、カ
ゼインを濃度１％で含有する最大培地（たとえばVY培地
又はTBAB培地（DIFCO）など）で菌株SMS275を平板培養
することによって行った。SMS275の周りに暈輪が存在し
ないことは、該菌株が２種のプロテアーゼを生産しない
ことを表示する。最後に、菌株SMS275のspo^-表現型の安
定性を、該菌株を高温で処理することにより検定した。
このテストは、胞子を生成し得ない菌株（spo^-表現型）
は短時間の高温処理に対する抵抗性が低下するとの事実
に基づくものである。熱処理は細胞を破壊するが、胞子
を破壊しないため、平面培地上で生育するコロニーは、
液体培地中での生育の間に生成され、最大培地上で平板
培養される際に発芽し得る胞子に由来するものである。
この目的のため、菌株SMS275を胞子形成培地において37
℃で約24時間生育させ、ついで80℃で約10分間熱処理し
た。ついで、培養物の好適な希釈物を、カナマイシン及
びクロラムフェニコールを含有する最大培地で平板培養
し、生きている細胞（CFU）を計数した。データの分析
結果は、菌株SMS275がspo⁺表現型に逆戻りする頻度は１
×10^-8より小であることを示した。このように、菌株
Ｂ．サチリス SMS275は、所望の異質生成物の生産用宿
主−ベクター系における宿主としての使用に特に適して
いると思われる。

【０００８】本発明による方法は、たとえば無胞子性菌
株を、所望の異質生成物をコード付ける遺伝子を含有す
る複製可能な発現ベクターで形質転換させ、このように
して形質転換した無胞子性菌株を好適な条件下で生育さ
せ、最後に、得られた遺伝子発現生成物を単離し、精製
することからなる。好適なベクターは、各種実験室及び
コレクションセンターから利用できるＢ．サチリスにお
いて複製可能なプラスミドの中から選択される。これら
ベクターによるＢ．サチリス SMS275細胞の形質転換
は、常法の１つを利用して行われる。無胞子性菌株Ｂ．
サチリス SMS275は、たとえば酵素（α−アミラーゼ、
β−アミラーゼ等）の如き原核性ポリペプチド、又はた
とえばインターロイキン、インターフェロン、ヒト生長
ホルモン、又はこれらの前駆体の如き真核性ポリペプチ
ドをコード付ける遺伝子の発現用宿主として有用であ
る。本発明の１具体例によれば、ヨーロッパ特許公開第
321940号に開示された如く、ヒト生長ホルモンの前駆体
をコード付けるDNA配列を含有するプラスミド pSM274で
菌株Ｂ．サチリス SMS275を形質転換させる。ついで、
形質転換された菌株を、炭素源、窒素源及びミネラル塩
を含有する培地において、光学密度（波長600nmで測
定）約３−４まで生育させる。

【０００９】つづいて、プラスミドの安定性及び菌株SM
S275（pSM274）のhGH前駆体の生産能力を測定する。そ
の結果は、プラスミド pSM274が安定であること（多数
のコピーが細胞中に存在する）を示した（図１）。さら
に、菌株から抽出された総可溶性タンパク質の電気泳動
分析では、ヒト生長ホルモンの前駆体に相当するバンド
の存在を示した。菌株Ｂ．サチリス SMS275（pSM274）
の生存度を、グリセリン中に６カ月間維持した培地１ml
当たりの生存細胞の数（CFU／ml）の測定によって評価
した。得られた結果は、これらが保持された条件下にお
いて細胞の生存度が良好であること及びspo^-表現型が安
定であることを示した。プラスミド pSM274を含有する
無胞子性菌株Ｂ．サチリス SMS275を1990年10月５日付
けでCentraalbureau Voor Schimmelcuturesに寄託して
あり、受託番号はCBS 433.90である。

【００１０】後述の比較例は、SMS275以外のＢ．サチリ
ス spo^-菌株をプラスミド pSM274で形質転換させる例を
開示する。プラスミドの安定性及びペアーの数について
及びspo^-表現型の安定性について分析を行った際、これ
らの菌株は下記の結果を示した。 −spoOF変異を有する菌株SMS268内では、プラスミド pS
M274は構造的には不安定である。 −spoIIA1変異を有する菌株SMS270内では、野生形菌株S
MS118内におけるよりも少ないプラスミド pSM274のコピ
ーが存在する。 −spoIIF96変異を有する菌株SMS272内では、プラスミド
は安定であり、コピーの数は野生形菌株SMS118内におけ
るものに匹敵する。しかしながら、顕微鏡観察によって
行った評価では、この菌株はかなり高い頻度でspo⁺表現
型を要求する傾向があった。 さらに、菌株SMS272は、たとえばグリセリン中に維持さ
れる際には、菌株SMS275（pSM274）よりも生存度が低い
ことを示す。事実、グリセリンの添加後、培地１ml当た
り生存細胞の数は3.7×10⁷ CFU／mlであり、７日後、こ
の値は73％に低下し、19日後では68％に、40日後では約
54％に低下した。これらの理由から、菌株SMS272は、工
業的発酵処理における使用には適していない。

【００１１】次に図面について詳述する。図１及び図２
の写真はアーガロースゲル上で行ったプラスミド pSM27
4のDNAの電気泳動の結果を示すものである。図１におい
て、１：pSM274コントロール（未消化)、２：EcoRI及び
Hind IIIで消化したpSM274コントロール、３：菌株SMS2
75（pSM274）から抽出したプラスミドDNA（未消化)、
４：菌株SMS275（pSM274）から抽出し、EcoRI及びHind
IIIで消化したプラスミドDNA、５：分子量基準である。
図２において、１−４：菌株spoIID SMS275（pSM274）
の２つのクローンから抽出されたプラスミドDNAであっ
て、１及び３は未消化のDNA、２及び４はEcoRI及びHind
IIIで消化したDNAであり；５−８；菌株spoIIA1 SMS27
0（pSM274）の２つのクローンから抽出されたプラスミ
ドDNAであって、５及び７は未消化のDNA、６及び８はEc
oRI及びHind IIIで消化したDNAであり；９は分子量基準
であり；10−13：菌株spoIIF96 SMS272（pSM274）の２
つのクローンから抽出されたプラスミドDNAであって、1
0及び12は未消化のDNA、11及び13はEcoRI及びHind III
で消化したDNAであり；14及び15：菌株spoOF SMS228（p
SM274）の１つのクローンから抽出されたプラスミドDNA
であって、14は未消化のDNA、15はEcoRI及びHindIIIで
消化したDNAである。図３は、菌株SMS275（pSM274）か
ら抽出されたタンパク質の12.5％ナトリウムドデシルポ
リアクリルアミドゲル（SDS−PAGE）における電気泳動
の結果を示す写真である。図中、Ａは標準（部分的に精
製したhGH前駆体）であり；ＢはhGH前駆体をコード付け
る配列を含有しないコントロールプラスミド pSM214に
よって形質転換された菌株275から抽出されたタンパク
質であり；Ｃ−Ｆ：プラスミド pSM274によって形質転
換された菌株SMS275の４つのクローンから抽出されたタ
ンパク質である。以下の実施例は本発明を説明するもの
であり、これらに限定されない。

【００１２】実施例１無胞子性菌株Ｂ．サチリス SMS275の構成 Contente及びDubnauによって開示された方法（Mol．Gen
etics,（1979)，167：251−258）に従い、トランスポゾ
ンTn917を含有するプラスミドDNA pTV5TS（１μｇ）を
使用してコンピテントＢ．サチリス SMS118細胞を形質
転換させた。ついで、細胞をVY最大培地（veal infusio
n)(veal infusion broth（DIFCO）25ｇ／リットル、酵母エ
キス５ｇ／リットル及び寒天（DIFCO）20ｇ／リットル）20ml上
で平板培養し、該プレート上にエリスロマイシン 125μ
ｇ／mlを含有するソフト寒天５mlを注加し、プレートを
37℃でさらに18時間インキュベートすることによって形
質転換体を選別した。エリスロマイシン耐性（Em^r）形
質転換体（すなわち、染色体レベルで同種の組換えが行
われたもの）を、胞子を形成しない能力に関するテスト
に供した。この目的のため、Em^rコロニーを、下記組成
を有するSchaeffer胞子形成培地（pH7.0）のプレート上
に移し、37℃で生育させた。 普通ブロス(DIFCO) 8.0 ｇ／リットル KCl 1.0 ｇ／リットル MgSO₄ 1.25×10^-1ｇ／リットル 寒天(DIFCO) 16.0 ｇ／リットル MnCl₂・4H₂O 0.98×10^-3 ｇ／リットル FeSO₄・7H₂O 2.78×10^-4 ｇ／リットル Na₂SO₄ 1.42×10^-1 ｇ／リットル H₂O 1.0 リットル 数日後、光学顕微鏡での観察、及びコロニーの形態的変
成の実施によって胞子の形成を測定した。胞子を形成し
たコロニーは実際に象徴的な褐色に着色し、一方、無胞
子性のコロニーは透明のままであり、溶菌する傾向を示
した。上述の如く得られた結果から、無胞子性表現型
（spo^-）を有するいくつかのEm^r形質転換体を単離する
ことができた。spoII:D遺伝子内に変異を有するこれら
形質転換体の１つをSMS275と表示した。

【００１３】実施例２菌株SMS275の特性表示 菌株SMS275について、さらに、遺伝子性マーカー ap
r^-、npr^-、leu、pyrD1及びspo^-の安定性をチェックする
ため検定を行った。詳述すれば、(ｉ）生育培地におけ
る菌株のプロテアーゼ活性が低いこと（セリンプロテア
ーゼ遺伝子（apr）及びニュートラルプロテアーゼ遺伝
子（npr）が不活性化されたことを示す)、(ii）ロイシ
ン及びウラシルの非存在下、最小培地において菌株が生
育しないこと及び、(iii）非胞子形性能をチェックする
ためテストを行った。カゼイン１％を含有するVY最大培
地に菌株SMS272を平板培養することによりプロテアーゼ
活性を測定した（Tomaら、J．Bacteriol.,（1986)，14
7：740−743）。セリンプロテアーゼ及びニュートラル
プロテアーゼの作用によるコロニーの周囲における特徴
的な加水分解暈輪の不存在は、これら２つの酵素が分泌
されていないことを示す。菌株SMS275から単離されたコ
ロニーはいずれも加水分解暈輪をもたない。しかしなが
ら、ロイシン（leu）及びウラシル（pyrD1）に関する栄
養要求については、P．YoungmanによりPlasmids：a pra
ctical approach，K．G．Hardy編，IRL Press,（198
6)，79−103に記載された組成を有する最小培地（生育
ファクターを含まない)、leu（50μｇ／ml）のみ含有す
る最小培地、ウラシル（50μｇ／ml）のみ含有する最小
培地、及び両方を含む最小培地で菌株を平板培養するこ
とによってコントロールテストを行った。両方の栄養フ
ァクターを含有する培地でのみ生育が観察された。これ
より、遺伝子性マーカー leu及びpyrD1の安定性が確認
された。最後に、細胞の総量に関連して生成する胞子の
量を測定し、同時に、エリスロマイシンによる選択的圧
力の不存在下におけるspo^-表現型の安定性をチェックし
た。該分析は、胞子を生成し得ない菌株は短時間の高温
処理に対する抵抗性が小さいとの事実に基づくものであ
る。それぞれSchaeffer液状胞子形成培地10mlを収容す
るフラスコ（100ml）２個に、それぞれ菌株SMS275及び
胞子形成性菌株SMS181（コントロール）を接種し、初め
に37℃で24時間、ついで80℃で10分間インキュベートし
た。ついで、培養物の一定量を適当に希釈し、各希釈物
0.1mlを、抗生物質を補充したVY最大培地で平板培養し
た。室温で生育後、生存する細胞（CFU）を80℃での処
理の前後で計数した。

【００１４】加熱処理は細胞を破壊するが、胞子を破壊
しないため、平板培地上で生育したコロニーは、37℃に
おける液体培地中での生育の間に生成し、最大培地上で
平板培養する際に発芽し得る胞子に由来するものであ
る。表１は上記テストの結果（CFU／mlで表示）を示
す。

【表１】 注１：表中の数値は３回の測定結果の平均値である。 注２：t．q.：希釈していない培養物（0.1ml） − ：加熱処理前 ＋ ：加熱処理後 データの分析から、下記の事項が認められる。 ｉ）37℃で生育させた菌株SMS118及びSMS275の培養物中
に存在する細胞の数は、それぞれ1.9×10⁸ CFU／ml及び
１×10⁸ CFU／mlである。 ii）菌株SMS275がspo⁺表現型に逆戻りする頻度は１×10
^-8より小であり、熱処理に対して生残るSMS275及びSMS1
18の百分率の間の比率は0.001％より小である。 iii）37℃、24時間後に生成され、最大培地で発芽し得
る胞子の量は、胞子形成性菌株SMS118については1.4×1
0⁵であり、非胞子形成性菌株SMS275については０であ
る。 液状培地中、37℃での培養をエリスロマイシンの不存在
下で行っているのであるから、80℃における熱処理後に
SMS275コロニーが全く存在しないことは、菌株SMS275に
よって獲得されたspo^-特性が非常に安定であることを示
す。実際、細胞はトランスポゾンを失っていると思われ
るが、無胞子性表現型を保持している。

【００１５】実施例３プラスミド pSM274による菌株SMS275の形質転換 コンピテントＢ．サチリス SMS275細胞をプラスミド pS
M274（10ng）で形質転換させ、ついで、カナマイシン５
μｇ／ml及びクロラムフェニコール５μｇ／mlを含有す
るVY最大培地のプレート上、37℃で18時間培養して形質
転換体を選別した。Recombinant DNA Techniques：an i
ntroduction［Rodriguez及びTait編，Addison−Wesley
Publishing Company,（1983)，164］に記載された急速
抽出法によって耐性コロニーの１つから単離したプラス
ミドDNAの一定量を、制限酵素EcoRI及びHind III（BR
L）により、該酵素の供給者の情報に従って消化した。
ついで、消化したプラスミドDNA ２μリットル及び未消化の
同じDNA ２μリットルを0.8％アーガロースゲル上に負荷
し、同様にプラスミド pSM274（コントロール)(２μリット
ル)(前記のものと同じ酵素で処理したもの及び処理して
いないもの）及びいくつかの分子量基準を負荷した。図
１に示す結果は、Ｂ．サチリス SMS275クローンから単
離し、制限酵素で消化したプラスミド pSM274が予想さ
れる移動速度を示し、pSM274のものと一致する消化パタ
ーンを示すことを表した。実際、6700bp及び800bpの長
さ（それぞれプラスミドベクター及びヒト生長ホルモン
をコード付けるインサートに相当）を有する２つのフラ
グメントに相当する２つのバンドを、脱色後、臭化エチ
ジウムで溶解させた。菌株Ｂ．サチリス SMS275（pSM27
4）のhGH前駆体を生成する能力を、該菌株をVY培地10ml
中、37℃で18時間生育させ、溶解させた細胞から抽出さ
れた可溶性の総タンパク質を12.5％SDS−PAGE上で電気
泳動させ、クマシーブルーで染色することによって分析
してチェックした。タンパク質抽出物中におけるヒト生
長ホルモン前駆体に相当するバンドの存在が図３に見ら
れる。

【００１６】比較例spoIIF96、spoIIA1及びspoOF変異を有する無胞子性菌株
の形質転換 それぞれspoIIF96、spoIIA1及びspoOF変異を有する無胞
子性菌株Ｂ．サチリスSMS268、SMS270及びSMS272をプラ
スミド pSM274で形質転換させ、ついでプラスミドの安
定性、存在するプラスミドのコピーの数及びspo^-表現型
の安定性をチェックするためテストを行った。図２から
見られるように、spoOF変異を有する菌株においてはプ
ラスミド pSM274は不安定であり、spoIIA1変異を有する
菌株内に存在するプラスミドのコピーの数は菌株SMS118
内よりも少ない。これに対して、spoIIF96菌株はプラス
ミドを安定状態で保持しており、そのコピー数は菌株SM
S118の場合に匹敵するものである。しかしながら、spo^-
の安定性をチェックするためにテストした際、この菌株
は顕微鏡観察によって行った評価では、かなり高い頻度
でspo^-表現型を要求する傾向を示した。

【００１７】実施例４無胞子性菌株SMS275及びSMS272の生存度の分析 菌株SMS275の生存度をチェックするため、グリセリン中
で４つの細胞ブランクを調製した。実際には、菌株SMS2
75（pSM274）及び菌株SMS272（pSM274）の予培養物（10
0ml）２つを下記処方のTYM培地中で調製した。 トリプトン 13ｇ／リットル 酵母エキス ３ｇ／リットル マルトース 40ｇ／リットル カナマイシン ５mg／リットル クロラムフェニコール ５mg／リットル フラスコを220rpmで撹拌し、37℃で24時間インキュベー
トした。それぞれTYM培地１リットルを収容する２つの発酵
槽（２リットル）に、予培養物の１つを100ml接種した（初
期光学密度（O．D．)：660nmにおいて0.190)。空気を0.
5v/v/分で充填しながら、800rpm、pH7.0で発酵を行っ
た。O．D．3.0まで15時間発酵を行った後、培養物を遠
心処理し、細胞を回収した。ついで、サンプル２mlにグ
リセリンを最終濃度15％となるまで補充し、−80℃に維
持した。調製の日から６カ月後、グリセリン内における
サンプル中の生存細胞（コロニー形成単位−CFU）の量
を測定した。このテストは、グリセリン中のサンプルの
一定量を培地で希釈し、直ちに希釈物0.1mlを寒天を含
有し、抗生物質（カナマイシン及びクロラムフェニコー
ル）を含有又は含有しないTBAB最大生育培地上で平板培
養することによって実施される。SMS275（pSM274）につ
いては、グリセリン中のサンプル１ml当たりの生存細胞
数は2.4×10⁸ CFU／mlであった。該分析を抗生物質（カ
ナマイシン及びクロラムフェニコール）の存在下又は不
存在下で実施した。これらの結果は、利用した保存条件
下においてSMS275細胞の安定性及び生存率が良好である
ことを示した。しかしながら、SMS272（pSM274）につい
て得られたCFU値は生存率が低いことを示した。実際の
ところ、グリセリンの添加後では、3.7×10⁷ CFU／mlの
値が測定された。７日後、この値は73％に低下し、19日
後では68％に、40日後では約54％に低下した。菌株SMS2
74（pSM274）の培養物についても、実施例２及び３に記
載の如く分析したところ、プラスミドは安定であり、hG
H前駆体をコード付ける遺伝子の配列が無傷であること
を示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミド pSM274のDNAの電気泳動の結果を示
す写真である。

【図２】菌株spoIID SMS275（pSM274）のクローンから
抽出されたプラスミドDNAの電気泳動の結果を示す写真
である。

【図３】菌株SMS275（pSM274）から抽出されたタンパク
質の電気泳動の結果を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:125） (73)特許権者 597035160 Ｓ−112 87 ＳＴＯＣＫＨＯＬＭ， ＳＷＥＤＥＮ (72)発明者 ギード・グランディ イタリー国セグラーテ・サン・フェリス 市ノーナ・ストラーダ４ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/00 - 1/38 C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】胞子形成性に逆戻りする頻度が10^-8より小
   であり、遺伝子性マーカー leu，pyrD１，apr^-及びnp
   r^-、及びSpoII:Dを有することによって特徴づけられ
   る、無胞子性菌株バシラス・サチリス SMS275（CBS 43
   2.90)。
2. 【請求項２】請求項１記載のものにおいて、組換えDNA
   技術による異質ポリペプチド及びタンパク質又はこれら
   の前駆体の製造に使用される宿主−ベクター系の宿主と
   して使用されるものである、無胞子性菌株バシラス・サ
   チリス SMS275。
3. 【請求項３】請求項２記載のものにおいて、前記ベクタ
   ーが、異質ポリペプチド又はタンパク質又はこれらの前
   駆体をコード付ける遺伝子を含むバシラス・サチリス内
   において発現可能なプラスミドである、無胞子性菌株バ
   シラス・サチリス SMS275。
4. 【請求項４】請求項３記載のものにおいて、前記プラス
   ミドがヒト生長ホルモンの前駆体をコード付ける遺伝子
   を含有するものである、無胞子性菌株バシラス・サチリ
   ス SMS275。
5. 【請求項５】請求項４記載のものにおいて、前記プラス
   ミドがpSM274（CBS 75288）である、無胞子性菌株バシ
   ラス・サチリス SMS275。
6. 【請求項６】受託番号CBS 433.90で寄託されている請求
   項５記載の無胞子性菌株バシラス・サチリス SMS275（p
   SM274)。
7. 【請求項７】異質ポリペプチド及びタンパク質又はこれ
   らの前駆体を製造する方法において、バシラス属菌内で
   発現可能であり、前記異質ポリペプチド又はタンパク質
   又はこれらの前駆体をコード付ける遺伝子を含有するベ
   クターによって形質転換させた請求項１記載の菌株バシ
   ラス・サチリス SMS275を、炭素源、窒素源、ミネラル
   塩、ロイシン及びウラシルを含有する培地中で生育さ
   せ、遺伝子発現生成物を回収することを特徴とする、異
   質ポリペプチド及びタンパク質又はこれらの前駆体の製
   法。
8. 【請求項８】請求項７記載の製法において、前記バシラ
   ス・サチリスがCBS433.90である、異質ポリペプチド及
   びタンパク質又はこれらの前駆体の製法。