JPS6038114B2 - プラスミドｄｎａの遺伝子産物の製法 - Google Patents
プラスミドｄｎａの遺伝子産物の製法Info
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- C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
- C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
- C10L1/32—Liquid carbonaceous fuels consisting of coal-oil suspensions or aqueous emulsions or oil emulsions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
- C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
- C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
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Description
【発明の詳細な説明】
明細書
本発明はプラスミドＤＮＡの遺伝子産物の製法を提供す
るもので、該製法において有用な細菌類ならびにプラス
ミド類、該製法において有用な細０み換えＤＮＡプラス
ミド類の組立てに利用し得るクローニング・ベクター類
、およびそのような細菌類、プラスミド類ならびにクロ
ーニング・ベクター類の製法に関する。
るもので、該製法において有用な細菌類ならびにプラス
ミド類、該製法において有用な細０み換えＤＮＡプラス
ミド類の組立てに利用し得るクローニング・ベクター類
、およびそのような細菌類、プラスミド類ならびにクロ
ーニング・ベクター類の製法に関する。
所望のポリベプチドや蛋白質を暗号する遺伝子夕をもつ
プラスミドを保持する細菌類の培養によって、有用なポ
リベブチドおよび蛋白質、たとえば酵素、ホルモンなら
びに（たとえばワクチン製造用の）毒素および他の抗原
を製造することが知られている。
プラスミドを保持する細菌類の培養によって、有用なポ
リベブチドおよび蛋白質、たとえば酵素、ホルモンなら
びに（たとえばワクチン製造用の）毒素および他の抗原
を製造することが知られている。
また、所望の遺伝子を含有するプラス０ミド類を、いわ
ゆるＤＮＡ組み換え技術によって組立て、そのような組
み換えＤＮＡプラスミド類を有する細菌の培養物から、
宿主細胞として用いられた細菌以外の生物体に固有の遺
伝子産物を得ることが可能となることも知られている。
組み換えＤＮＡの調製に際し、いわゆるクローニング・
べクターすなわち宿主細菌中において増殖し得るプラス
ミドが所望の単一もしくは複数の産物を暗号する単一も
しくは複数の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントと結合さ
れる。ＤＮＡ組み換え技術はそのもっとも有用な態様に
おいては下記の原理に基ずし、ている。
ゆるＤＮＡ組み換え技術によって組立て、そのような組
み換えＤＮＡプラスミド類を有する細菌の培養物から、
宿主細胞として用いられた細菌以外の生物体に固有の遺
伝子産物を得ることが可能となることも知られている。
組み換えＤＮＡの調製に際し、いわゆるクローニング・
べクターすなわち宿主細菌中において増殖し得るプラス
ミドが所望の単一もしくは複数の産物を暗号する単一も
しくは複数の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントと結合さ
れる。ＤＮＡ組み換え技術はそのもっとも有用な態様に
おいては下記の原理に基ずし、ている。
ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉ
ｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）により非常に特殊な方
法で細分割できる。
ｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）により非常に特殊な方
法で細分割できる。
これらの分割片は次いでＤＮＡリガーゼ（ｌｉ鱗ｓｅ）
によって互いに結合できる。ＤＮＡクローニングには単
一のもしくは数個の制限エンドヌクレアーゼに対し一作
用部位のみを含む環状ＤＮＡ分子であるプラスミド・ベ
クターが利用される。制限酵素によるそのようなべクタ
ーの処理により、鎖状分子の１種が生成する。もし、こ
の分子が同一エンドヌクレアーゼで処理されたＤＮＡ試
料と混合されると、異種ＤＮＡフラグメントが融合され
ているべクターによって構成された分子を連結（ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ）によって得ることが可能となる。これらの
プラスミド分子は組み換えＤＮＡと呼ばれている。異種
ＤＮＡをもつべクターは宿主細菌細胞中に形質転換でき
るが、このことは宿主細菌によってそれが取り込まれ、
その中に複製されていることを意味する。べクターが複
製可能であるから異種ＤＮＡもまた複製可能である。異
種ＤＮＡが宿主細菌中に転写されさらに翻訳されれば異
種ＤＮＡの遺伝子産物が宿王細菌中に生成する。
によって互いに結合できる。ＤＮＡクローニングには単
一のもしくは数個の制限エンドヌクレアーゼに対し一作
用部位のみを含む環状ＤＮＡ分子であるプラスミド・ベ
クターが利用される。制限酵素によるそのようなべクタ
ーの処理により、鎖状分子の１種が生成する。もし、こ
の分子が同一エンドヌクレアーゼで処理されたＤＮＡ試
料と混合されると、異種ＤＮＡフラグメントが融合され
ているべクターによって構成された分子を連結（ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ）によって得ることが可能となる。これらの
プラスミド分子は組み換えＤＮＡと呼ばれている。異種
ＤＮＡをもつべクターは宿主細菌細胞中に形質転換でき
るが、このことは宿主細菌によってそれが取り込まれ、
その中に複製されていることを意味する。べクターが複
製可能であるから異種ＤＮＡもまた複製可能である。異
種ＤＮＡが宿主細菌中に転写されさらに翻訳されれば異
種ＤＮＡの遺伝子産物が宿王細菌中に生成する。
この生成は一般的には細胞当りの組み換えＤＮＡプラス
ミド分子のコピー数に比例する遺伝子濃度に比例してい
る。これは所望のプラスミドの遺伝子産物を大量に得る
ためには、細菌細胞当りのプラスミドコピーの高いこと
を目ご・さねばならないことを意味している。数種のク
ローニング・ベクター類は、本態的に細菌細胞当りほぼ
１００に達する程の高いコピー数（ｃｏｐｙｎｕｍ戊ｒ
）で複製することが知られている。しかしながら、もし
そのようなクローニング・ベクターと結合する異種ＤＮ
Ａによって生成した遺伝子産物が宿主細菌によって充分
耐性化されていないものであれば、遺伝子産物によって
及ぼされる阻害のため、所望の量産サイズの培養物まで
細菌性クローンを増殖させるのは困難であろう。一方、
約２０〜１００のオーダーのコピー数であっても、培養
生産物中の所望の遺伝子産物収量を必らずしも充分に上
げ得るとは限らない。プラスミドコピーの数が蛋白合成
の阻害にたとえばクロムフェニコールの添加による増幅
により一層増加しうろことが知られているが、蛋白合成
がクローン化ＤＮＡの遺伝子産物の調製に必要なごとく
、増幅されたＤＮＡはもし蛋白合成阻害成分の再除去が
可能ならば（それは必らずしも常に可能ではなく、また
往々にして複雑な操作を要するが）、それらの遺伝子産
物の形成に役立つだけであろう。本発明はＤＮＡプラス
ミド、就中、該プラスミドが効果的なプラスミド増幅と
大量のプラスミド遺伝子産物取得を可能とするものであ
るようなＤＮＡプラスミドの遺伝子産物（ｇｅｎｅ ｐ
ｒｏｄｕｃｔ）の製法を提供するものである。
ミド分子のコピー数に比例する遺伝子濃度に比例してい
る。これは所望のプラスミドの遺伝子産物を大量に得る
ためには、細菌細胞当りのプラスミドコピーの高いこと
を目ご・さねばならないことを意味している。数種のク
ローニング・ベクター類は、本態的に細菌細胞当りほぼ
１００に達する程の高いコピー数（ｃｏｐｙｎｕｍ戊ｒ
）で複製することが知られている。しかしながら、もし
そのようなクローニング・ベクターと結合する異種ＤＮ
Ａによって生成した遺伝子産物が宿主細菌によって充分
耐性化されていないものであれば、遺伝子産物によって
及ぼされる阻害のため、所望の量産サイズの培養物まで
細菌性クローンを増殖させるのは困難であろう。一方、
約２０〜１００のオーダーのコピー数であっても、培養
生産物中の所望の遺伝子産物収量を必らずしも充分に上
げ得るとは限らない。プラスミドコピーの数が蛋白合成
の阻害にたとえばクロムフェニコールの添加による増幅
により一層増加しうろことが知られているが、蛋白合成
がクローン化ＤＮＡの遺伝子産物の調製に必要なごとく
、増幅されたＤＮＡはもし蛋白合成阻害成分の再除去が
可能ならば（それは必らずしも常に可能ではなく、また
往々にして複雑な操作を要するが）、それらの遺伝子産
物の形成に役立つだけであろう。本発明はＤＮＡプラス
ミド、就中、該プラスミドが効果的なプラスミド増幅と
大量のプラスミド遺伝子産物取得を可能とするものであ
るようなＤＮＡプラスミドの遺伝子産物（ｇｅｎｅ ｐ
ｒｏｄｕｃｔ）の製法を提供するものである。
本発明は、温度依存性（ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）のプラス
ミドコピー数パターンを有するプラスミド類、殊にその
プラスミドを保持する宿主細菌がある一の温度において
培養される場合にはコントロ−ルされた一定のプラスミ
ドコピー数を示すが、プラスミドを保持する宿主細菌が
別の温度において培養される場合にはより多数のもしく
はコントロールされていないコピー数を与える改変され
たプラスミドコピー数パターンを示すようなプラスミド
を利用するものである。従って、そのようなプラスミド
のコピー数はある一つの温度では低く、このことはクロ
ーン化プラスミドもしくはその遺伝子産物が宿王細菌の
成育を阻害するりスクを減少するのでひとつの利点であ
る。しかしながら、プラスミド量は簡易な温度シフトに
よって急速に増加でき、かくしてクローン化ブラスミド
とその遺伝子産物とが同時に形成され、プラスミドの遺
伝子産物の生成を急速に促進することができる。このよ
うに、本発明はプラスミドＤＮＡの遺伝子産物の製法を
提供するものであり、該製法は、宿主細菌をある一つの
温度で培養する際にコントロールされた一定のプラスミ
ド数を示し、かつそのプラスミドを保持する宿主細菌を
ある別の温度で培養する際により多数かまたは全体にコ
ントロールされていないコピー数を与える改変したプラ
スミドコピ−数コントロールを示すプラスミドを有する
細菌を、該ブラスミドがより多数かまたは全くコントロ
ールされないコピー数を与える改変したコピー数コント
ロールを示す温度下またはそれに近い（ａｐｐｒｏａｃ
ｈｉｎｇ）温度下での培養期間を少なくとも含む条件下
で、培養し、次いでその細菌培養物からプラスミドの遺
伝子産物を収得することからなるものである。
ミドコピー数パターンを有するプラスミド類、殊にその
プラスミドを保持する宿主細菌がある一の温度において
培養される場合にはコントロ−ルされた一定のプラスミ
ドコピー数を示すが、プラスミドを保持する宿主細菌が
別の温度において培養される場合にはより多数のもしく
はコントロールされていないコピー数を与える改変され
たプラスミドコピー数パターンを示すようなプラスミド
を利用するものである。従って、そのようなプラスミド
のコピー数はある一つの温度では低く、このことはクロ
ーン化プラスミドもしくはその遺伝子産物が宿王細菌の
成育を阻害するりスクを減少するのでひとつの利点であ
る。しかしながら、プラスミド量は簡易な温度シフトに
よって急速に増加でき、かくしてクローン化ブラスミド
とその遺伝子産物とが同時に形成され、プラスミドの遺
伝子産物の生成を急速に促進することができる。このよ
うに、本発明はプラスミドＤＮＡの遺伝子産物の製法を
提供するものであり、該製法は、宿主細菌をある一つの
温度で培養する際にコントロールされた一定のプラスミ
ド数を示し、かつそのプラスミドを保持する宿主細菌を
ある別の温度で培養する際により多数かまたは全体にコ
ントロールされていないコピー数を与える改変したプラ
スミドコピ−数コントロールを示すプラスミドを有する
細菌を、該ブラスミドがより多数かまたは全くコントロ
ールされないコピー数を与える改変したコピー数コント
ロールを示す温度下またはそれに近い（ａｐｐｒｏａｃ
ｈｉｎｇ）温度下での培養期間を少なくとも含む条件下
で、培養し、次いでその細菌培養物からプラスミドの遺
伝子産物を収得することからなるものである。
本発明の要点は、温度調節されたプラスミドコピー数パ
ターンを有する特殊なタイプのブラスミドの利用と、こ
のタイプのプラスミドがある一の温度において極めて多
数複製された場合に、その遺伝子産物の大量生産をもた
らすという認識とにある。
ターンを有する特殊なタイプのブラスミドの利用と、こ
のタイプのプラスミドがある一の温度において極めて多
数複製された場合に、その遺伝子産物の大量生産をもた
らすという認識とにある。
培養それ自体は問題の細菌種に適するものとして知られ
ている普通の栄養培地を含む通常の技術を用いて適宜に
行われ、また遺伝子産物の取得も調製された個々の遺伝
子産物の相同性（ｉｄｅｎｄ〇）や固有性質（ｐｒｏｐ
ｅｎｉｅｓ）、宿主細菌の性質等に適合する周知の方法
に従って行われる。
ている普通の栄養培地を含む通常の技術を用いて適宜に
行われ、また遺伝子産物の取得も調製された個々の遺伝
子産物の相同性（ｉｄｅｎｄ〇）や固有性質（ｐｒｏｐ
ｅｎｉｅｓ）、宿主細菌の性質等に適合する周知の方法
に従って行われる。
本発明の方法に特有かつ重要なことは、プラスミドがよ
り多数のもしくは全くコントロールされていないコピー
数を与える改変されたコピー数パターンを示すような温
度またはそれに近い温度での培養の期間を少なくとも含
む、云いかえればその期間にプラスミドが多数のコピー
数で複製され、かつ始めて見出されたことであるが、そ
の期間にプラスミドの遺伝子産物が対応して大量形成さ
れる培養の期間を含んでの温度規制にある。温度依存性
のプラスミドのコピー数パターンを有するプラスミドは
、温度依存性のコピー数パターンを示すクローニング・
ベクターを用いる組み換えＤＮＡ技術により調製された
ものであり得るし、また該プラスミドは所望の生産性の
ための遺伝子を有する既存プラスミドの変異（ｍｕねｇ
ｅｎｉｚａｔｉｏｎ）によって得られるものであっても
よい。
り多数のもしくは全くコントロールされていないコピー
数を与える改変されたコピー数パターンを示すような温
度またはそれに近い温度での培養の期間を少なくとも含
む、云いかえればその期間にプラスミドが多数のコピー
数で複製され、かつ始めて見出されたことであるが、そ
の期間にプラスミドの遺伝子産物が対応して大量形成さ
れる培養の期間を含んでの温度規制にある。温度依存性
のプラスミドのコピー数パターンを有するプラスミドは
、温度依存性のコピー数パターンを示すクローニング・
ベクターを用いる組み換えＤＮＡ技術により調製された
ものであり得るし、また該プラスミドは所望の生産性の
ための遺伝子を有する既存プラスミドの変異（ｍｕねｇ
ｅｎｉｚａｔｉｏｎ）によって得られるものであっても
よい。
上記の温度依存性プラスミドコピー数パターンを示すプ
ラスミドは、それらを詳述せるものはこれ迄のところ見
当らないが、クローニング・ベク夕−類として有用なプ
ラスミド類を含むいくつかのこの種プラスミド類の調製
を記述する下記実施例から明らかとなろう。
ラスミドは、それらを詳述せるものはこれ迄のところ見
当らないが、クローニング・ベク夕−類として有用なプ
ラスミド類を含むいくつかのこの種プラスミド類の調製
を記述する下記実施例から明らかとなろう。
ある一の温度では細菌当りコントロールされた一定のコ
ピー数をもち、かつ他の温度においては、より多数のも
し〈は全くコントロールされていないコピー数〔以下に
おいてはいよいよ“爆発的増殖”（ｒｕｎａｗａｙ−ｒ
ｅｐｌｉｃａｔ；ｏｎ）と称する〕をもつ上記温度依存
性のブラスミドコピー数パターンを示すプラスミドは、
問題の宿主細菌中で自律的増殖をすることが知られてい
る既存のプラスミドの変異誘起によって調製することが
できる。
ピー数をもち、かつ他の温度においては、より多数のも
し〈は全くコントロールされていないコピー数〔以下に
おいてはいよいよ“爆発的増殖”（ｒｕｎａｗａｙ−ｒ
ｅｐｌｉｃａｔ；ｏｎ）と称する〕をもつ上記温度依存
性のブラスミドコピー数パターンを示すプラスミドは、
問題の宿主細菌中で自律的増殖をすることが知られてい
る既存のプラスミドの変異誘起によって調製することが
できる。
既知の諸原理に従い、変異処理は生体内もしくは試験管
内において行うことができ、実施例では従来用いられて
いる変異剤が出てくるけれども変異処理の種類は限界的
なものではないと推測される。変異処理（及びもし変異
処理が試験管内で行われた場合には変異処理されたマテ
リアルの宿主細菌中への形質転換）の後、該細菌がある
一の温度で培養された場合にはプラスミドコピ−数がコ
ントロールされており別の温度で培養された場合にはプ
ラスミドコピー数がより高いかもしくは全くコントロー
ルされていない細菌クローンが単離される。この単離操
作は、プラスミドコピ−数コントロールパターンのシフ
トがその間に求められている２つの温度におけるスクリ
ーニングをベースとしてできる。そのようなスクリーニ
ングに有用な一つの指針は、問題の宿主細菌に限定され
ないことが知られている基質上においては、殊に特定温
度における成育阻害が多数のプラスミドのコピーの生成
および／または大量のそれらの遺伝子産物の生成による
ものであると思われる事実である。爆発的増殖パターン
を示すプラスミド変異体を単離するより適切な方法は、
いまいまプラスミドがある一の温度では、一つのプラス
ミドコピー数コントロールパターンを示すが、別の温度
ではより多数のコピー数を可能とするような異なるプラ
スミドコピー数コントロールパターンを示すプラスミド
を保持する細菌性クローンが単機される第１段階と、第
１段階で得た変異株からプラスミドが第２段階の（異な
る）温度においてはより多数のもしくは全くコントロー
ルされていないコピー数を示すようなプラスミド保持細
菌性クローンを取得する第２段階、とよりなる２段階変
異処理法を用いることであることが判明した。この操作
は、通成な選別技術、たとえば抗性物質の二重選択など
の適宜利用を可能とする：あるタイプのプラスミドコピ
一変異体は以下のような諸性質を有する：すなわち、低
温度（たとえば３０℃）ではコピー数は親プラスミドの
それに近いが高温度（たとえば４０Ｃ０）ではコピー数
は約４倍大となる。
内において行うことができ、実施例では従来用いられて
いる変異剤が出てくるけれども変異処理の種類は限界的
なものではないと推測される。変異処理（及びもし変異
処理が試験管内で行われた場合には変異処理されたマテ
リアルの宿主細菌中への形質転換）の後、該細菌がある
一の温度で培養された場合にはプラスミドコピ−数がコ
ントロールされており別の温度で培養された場合にはプ
ラスミドコピー数がより高いかもしくは全くコントロー
ルされていない細菌クローンが単離される。この単離操
作は、プラスミドコピ−数コントロールパターンのシフ
トがその間に求められている２つの温度におけるスクリ
ーニングをベースとしてできる。そのようなスクリーニ
ングに有用な一つの指針は、問題の宿主細菌に限定され
ないことが知られている基質上においては、殊に特定温
度における成育阻害が多数のプラスミドのコピーの生成
および／または大量のそれらの遺伝子産物の生成による
ものであると思われる事実である。爆発的増殖パターン
を示すプラスミド変異体を単離するより適切な方法は、
いまいまプラスミドがある一の温度では、一つのプラス
ミドコピー数コントロールパターンを示すが、別の温度
ではより多数のコピー数を可能とするような異なるプラ
スミドコピー数コントロールパターンを示すプラスミド
を保持する細菌性クローンが単機される第１段階と、第
１段階で得た変異株からプラスミドが第２段階の（異な
る）温度においてはより多数のもしくは全くコントロー
ルされていないコピー数を示すようなプラスミド保持細
菌性クローンを取得する第２段階、とよりなる２段階変
異処理法を用いることであることが判明した。この操作
は、通成な選別技術、たとえば抗性物質の二重選択など
の適宜利用を可能とする：あるタイプのプラスミドコピ
一変異体は以下のような諸性質を有する：すなわち、低
温度（たとえば３０℃）ではコピー数は親プラスミドの
それに近いが高温度（たとえば４０Ｃ０）ではコピー数
は約４倍大となる。
そのような変異体を単離するのに用いる適切な単離操作
には、アンピシリンおよびクロラムフェニコールに対す
る耐性が対応する耐性酵素を膳号した遺伝子の濃度に比
例するという事実（ＵｈｌｉｎｅｔＮｏｒｄｓｔｒｏｍ
、プラスミド 第１巻、１９７７）、およびアンピシリ
ンは成育期にある細菌のみを殺すという事実が利用され
る。プラスミドＲ，ｄｒｄ−１９を含む菌株（本株につ
いては以下に詳述する）は、アンピシリン約１００り夕
／机上及びクロラムフェニコール１００仏夕／叫のＬＡ
プレート上で単一の細胞耐性を示すことが判明した。
には、アンピシリンおよびクロラムフェニコールに対す
る耐性が対応する耐性酵素を膳号した遺伝子の濃度に比
例するという事実（ＵｈｌｉｎｅｔＮｏｒｄｓｔｒｏｍ
、プラスミド 第１巻、１９７７）、およびアンピシリ
ンは成育期にある細菌のみを殺すという事実が利用され
る。プラスミドＲ，ｄｒｄ−１９を含む菌株（本株につ
いては以下に詳述する）は、アンピシリン約１００り夕
／机上及びクロラムフェニコール１００仏夕／叫のＬＡ
プレート上で単一の細胞耐性を示すことが判明した。
液体培地中でのこれら２種の抗生物質に対する耐性はＬ
Ａプレート上でのそれとほぼ同一である。アンピシリン
およびクロラムフエニコ−ルに対する耐性は遺伝子濃度
に比例する（肌ｌｉｎｅｔＮｏｒｄｓｔｒｏｍ、プラス
ミド第１巻、１９７７）。この効果はプラスミドＲ，ｄ
ｒｄ−１９の三ピー数増加変異株、いわゆるコピー変異
株の単離に利用された。しかしながら静菌剤と殺菌剤と
の組合せは、この選択方法が親プラスミドと非制限的（
ｎｏｎ−ｃｏｎｄｉｔｉｏ岬１）コピー変異株との双方
の簡易な相互選別を可能とするので、異なる温度では異
なるコピー数をもつコピー変異株を単離するのにも使用
できる。以下の操作がもっとも適切なのであることが見
出された。すなわち、コピー変異株は低温度（３０ｑｏ
）では低コピー数のものとして存在し、高温度（４００
０）では高コピー数のものとして存在することが推測さ
れる。（しかしながらその操作はこのタイプのコピー変
異株に限定されず、他の存在し得るタイプの温度依存性
コピー変異株を単離するのにも用いることができる。）
プラスミド含有細胞の培養物は３０ｑ０において培養さ
れそしてクロラムフェニコールが正常コピー数のプラス
ミドを含有する細胞の成育が阻害される濃度（３００Ａ
ｇ／私）まで添加される。
Ａプレート上でのそれとほぼ同一である。アンピシリン
およびクロラムフエニコ−ルに対する耐性は遺伝子濃度
に比例する（肌ｌｉｎｅｔＮｏｒｄｓｔｒｏｍ、プラス
ミド第１巻、１９７７）。この効果はプラスミドＲ，ｄ
ｒｄ−１９の三ピー数増加変異株、いわゆるコピー変異
株の単離に利用された。しかしながら静菌剤と殺菌剤と
の組合せは、この選択方法が親プラスミドと非制限的（
ｎｏｎ−ｃｏｎｄｉｔｉｏ岬１）コピー変異株との双方
の簡易な相互選別を可能とするので、異なる温度では異
なるコピー数をもつコピー変異株を単離するのにも使用
できる。以下の操作がもっとも適切なのであることが見
出された。すなわち、コピー変異株は低温度（３０ｑｏ
）では低コピー数のものとして存在し、高温度（４００
０）では高コピー数のものとして存在することが推測さ
れる。（しかしながらその操作はこのタイプのコピー変
異株に限定されず、他の存在し得るタイプの温度依存性
コピー変異株を単離するのにも用いることができる。）
プラスミド含有細胞の培養物は３０ｑ０において培養さ
れそしてクロラムフェニコールが正常コピー数のプラス
ミドを含有する細胞の成育が阻害される濃度（３００Ａ
ｇ／私）まで添加される。
３０ｑｏにおいて高コピー数のプラスミドを含有する細
胞はァンピシリン（４０００仏夕／汎‘）により殺減さ
れる。
胞はァンピシリン（４０００仏夕／汎‘）により殺減さ
れる。
生き残った細胞は集められて温度を４０００まで上げら
れる。４０００で高コピー数を有するプラスミドを含有
する細胞はアンピシリンプレート（５００〜２０００ム
タ／似）上で選別される。
れる。４０００で高コピー数を有するプラスミドを含有
する細胞はアンピシリンプレート（５００〜２０００ム
タ／似）上で選別される。
生存細胞中いくつかは温度以存性プラスミドのコピー変
異株を含有する。上記方法で選別された細胞は、次いで
再変異処理にかけることができ、そしてこのようにして
変異させた細胞の中から第２の温度で爆発的（ｍＭｗａ
ｙ）挙動を呈する変異株を選別するための適切な方法が
、低温度ではコントロールされた一定のしかし増大した
コピー数を示すがその複製コントロール機構が再び変異
に付されたことを示す細胞を最初に選別することからな
ることが見出された。
異株を含有する。上記方法で選別された細胞は、次いで
再変異処理にかけることができ、そしてこのようにして
変異させた細胞の中から第２の温度で爆発的（ｍＭｗａ
ｙ）挙動を呈する変異株を選別するための適切な方法が
、低温度ではコントロールされた一定のしかし増大した
コピー数を示すがその複製コントロール機構が再び変異
に付されたことを示す細胞を最初に選別することからな
ることが見出された。
実施例中で例示した特定のブラスミド中に生じた特殊な
タイプの変異は確実に禾知であるが、しかしこの変異の
効果は、ブラスミドーこよって伝達され、ブラスミドコ
ピー数コントロールに関与した蛋白質が変異により、高
温度では不安定な形態に修飾されるに到ることであると
信ぜられる。
タイプの変異は確実に禾知であるが、しかしこの変異の
効果は、ブラスミドーこよって伝達され、ブラスミドコ
ピー数コントロールに関与した蛋白質が変異により、高
温度では不安定な形態に修飾されるに到ることであると
信ぜられる。
本発明のプラスミドのもっとも実際的な態様は、クロー
ニング・ベクターとして用いられる場合に、実施例で記
述せるクローニング・ベクターと同様に、それ自身の中
に温度依存性のコピー数挙動に必要な全ての要素を含む
ものであることが明白であるが、変異が宿主細菌中にお
いて対応する温度依存性のナンセンスサプレッサーと結
合されたナンセンスタイプのものである場合、たとえば
プラスミドがアンバー変異株であり、宿主細菌が温度依
存性のアンバー抑制効果を示すものである場合に、本発
明の原理やそれによってもたらされる利益もまたおのず
から明らかとなる。プラスミドが爆発的挙動を示す温度
は、プラスミドがコントロールされた一定のコピー数を
示す温度より高い温度であるとは限らないし、この逆の
状況もまたあり得る。
ニング・ベクターとして用いられる場合に、実施例で記
述せるクローニング・ベクターと同様に、それ自身の中
に温度依存性のコピー数挙動に必要な全ての要素を含む
ものであることが明白であるが、変異が宿主細菌中にお
いて対応する温度依存性のナンセンスサプレッサーと結
合されたナンセンスタイプのものである場合、たとえば
プラスミドがアンバー変異株であり、宿主細菌が温度依
存性のアンバー抑制効果を示すものである場合に、本発
明の原理やそれによってもたらされる利益もまたおのず
から明らかとなる。プラスミドが爆発的挙動を示す温度
は、プラスミドがコントロールされた一定のコピー数を
示す温度より高い温度であるとは限らないし、この逆の
状況もまたあり得る。
もしコントロールされた一定のコピー数を与える温度よ
り低い温度で爆発的増殖を示す変異株の調製が望まれる
場合、選別もしくはスクリーニング基準が相応して適用
される。しかしながら、プラスミド含有細菌を培養する
ことによって調製されるべき遺伝子産物がより高温度で
劣化されないものである場合は、プラスミドが爆発的増
殖を示す温度はコントロールされた一定のプラスミドコ
ピー数を与える温度より高いものであることが望ましい
。これが適用されるときはプラスミドの増幅は、相対的
にもっとも高い細胞成育速度となるような同一条件下に
進行する。各実施例に示したプラスミド類は、ェシェリ
ヒア・コリによって例示された中温性（ｍｅｓｏｐｈｉ
ｌｉｃ）細菌中において、３０００で一定のコントロー
ルされたブラスミドコピー数ならびに４０℃における爆
発的増殖を示すようにデザインされている。
り低い温度で爆発的増殖を示す変異株の調製が望まれる
場合、選別もしくはスクリーニング基準が相応して適用
される。しかしながら、プラスミド含有細菌を培養する
ことによって調製されるべき遺伝子産物がより高温度で
劣化されないものである場合は、プラスミドが爆発的増
殖を示す温度はコントロールされた一定のプラスミドコ
ピー数を与える温度より高いものであることが望ましい
。これが適用されるときはプラスミドの増幅は、相対的
にもっとも高い細胞成育速度となるような同一条件下に
進行する。各実施例に示したプラスミド類は、ェシェリ
ヒア・コリによって例示された中温性（ｍｅｓｏｐｈｉ
ｌｉｃ）細菌中において、３０００で一定のコントロー
ルされたブラスミドコピー数ならびに４０℃における爆
発的増殖を示すようにデザインされている。
これらのプラスミド類のデータから分かるように、これ
らのプラスミドについて一定のコントロールされたプラ
スミドコピー数が保持されるのは３２０までであり、プ
ラスミドが爆発的挙動を示す温度は約３６ｏｏ以上であ
る。本発明のもっとも興味深いプラスミド類は、ある温
度においては適度に大であるが一定のコピー数を示しま
た別の温度では少なくとも２併音大のコピー数を示すプ
ラスミド類である。
らのプラスミドについて一定のコントロールされたプラ
スミドコピー数が保持されるのは３２０までであり、プ
ラスミドが爆発的挙動を示す温度は約３６ｏｏ以上であ
る。本発明のもっとも興味深いプラスミド類は、ある温
度においては適度に大であるが一定のコピー数を示しま
た別の温度では少なくとも２併音大のコピー数を示すプ
ラスミド類である。
細胞死をきた夕す全く爆発的な挙動が得られるか否かは
、ある程度は宿主細菌、および宿主細菌のプラスミドや
高温度の遺伝子産物に対する耐性に左右される。従って
、本発明は一方では、これまで得られなかった細胞毎に
数千のオーダーに達するプラスミ０ドコピー数の取得、
ならびにはじめて見出されたことであるが、相当量の遺
伝子産物の生産を保証する高コピー数で培養する充分な
成育世代数（通常４〜６）間に付随するブラスミドの遺
伝子産物の高率生産を可能とする。他方、本発明は宿王
細菌や所望の遺伝子産物などのそれぞれについて固有の
諸条件に従い、各種の方法で利用可能なもっとも簡易な
コピー数コントロールを提供する。すなわち多くの場合
、量産サイズの培養まで固体（ｉｎｄＭｄｕｕｍ）また
はクローンからの細菌の増殖は、増加するプラスミドや
遺伝子産物濃度による細菌の成育阻害を避けるため、プ
ラスミドがコントロールされた一定のコピー数を示すよ
うな温度もしくはその付近の温度で達成されることが望
ましい。それ故、その温度は、プラスミドがより多数の
もしくは全くコントロールされていないコピー数が可能
となる改変されたコピー数コントロールを示す温度へシ
フトすることができ、また適当な生産期間経過後いまい
ま細菌の成育がプラスミドおよび／またはそれらの遺伝
子産物の生産によって阻害されるまで、遺伝子産物の収
穫が行われる。個々の条件によって、量産培養は、遺伝
子産物を好収量で与える確実に安定した培養物が得られ
るよう（それは次いで連続的もしくは間けつ的にそれ自
体公知の方法による培養物から収穫される）にプラスミ
ドが改変されたコピー数コントロールを示すがしかし宿
主細胞は生存しかつなお増殖しうる温度に近い温度で行
われることが望ましい。本発明により得られるユニーク
なコントロール可能聖の１例は、所望の遺伝子産物とし
ての温度感受性蛋白質の製造である。
、ある程度は宿主細菌、および宿主細菌のプラスミドや
高温度の遺伝子産物に対する耐性に左右される。従って
、本発明は一方では、これまで得られなかった細胞毎に
数千のオーダーに達するプラスミ０ドコピー数の取得、
ならびにはじめて見出されたことであるが、相当量の遺
伝子産物の生産を保証する高コピー数で培養する充分な
成育世代数（通常４〜６）間に付随するブラスミドの遺
伝子産物の高率生産を可能とする。他方、本発明は宿王
細菌や所望の遺伝子産物などのそれぞれについて固有の
諸条件に従い、各種の方法で利用可能なもっとも簡易な
コピー数コントロールを提供する。すなわち多くの場合
、量産サイズの培養まで固体（ｉｎｄＭｄｕｕｍ）また
はクローンからの細菌の増殖は、増加するプラスミドや
遺伝子産物濃度による細菌の成育阻害を避けるため、プ
ラスミドがコントロールされた一定のコピー数を示すよ
うな温度もしくはその付近の温度で達成されることが望
ましい。それ故、その温度は、プラスミドがより多数の
もしくは全くコントロールされていないコピー数が可能
となる改変されたコピー数コントロールを示す温度へシ
フトすることができ、また適当な生産期間経過後いまい
ま細菌の成育がプラスミドおよび／またはそれらの遺伝
子産物の生産によって阻害されるまで、遺伝子産物の収
穫が行われる。個々の条件によって、量産培養は、遺伝
子産物を好収量で与える確実に安定した培養物が得られ
るよう（それは次いで連続的もしくは間けつ的にそれ自
体公知の方法による培養物から収穫される）にプラスミ
ドが改変されたコピー数コントロールを示すがしかし宿
主細胞は生存しかつなお増殖しうる温度に近い温度で行
われることが望ましい。本発明により得られるユニーク
なコントロール可能聖の１例は、所望の遺伝子産物とし
ての温度感受性蛋白質の製造である。
その場合、細菌はプラスミドコピ−数がコントロールさ
れかつ一定となる温度で量産サイズの培養物になるまで
増殖され、さらにその後爆発（ｍ雌ｗａｙ）温度への温
度シフトによりプラスミドが増幅される。このプラスミ
ド増幅にひき続き、また細胞がなお成育しかつ増幅可能
である間に、再び温度を一定のコピー数を与える低温度
側へシフトし、そして生成した細胞あたりより多数のプ
ラスミドを保持している細菌が、この低温度において、
問題の温度感受性蛋白質の生産に用いられる。約３０こ
０以上の温度では生育可能でない生物は多数存在し、そ
れらの蛋白質は、そのためより高温度においては変性さ
れることが知られている。従って、この温度規制の実施
態様は、該生物に固有の遺伝子産物が組み変えＤＮＡノ
クローニング技術によって調製される場合に特に重要な
ことが分る。以上に示した如く、爆発的増殖を含む特徴
的な温度依存性のコピー数挙動を示すプラスミドは、所
望の生産性に関する遺伝子を有するが特徴的な爆発的行
動はもたない親プラスミドからの変異処理によって誘導
しうる。
れかつ一定となる温度で量産サイズの培養物になるまで
増殖され、さらにその後爆発（ｍ雌ｗａｙ）温度への温
度シフトによりプラスミドが増幅される。このプラスミ
ド増幅にひき続き、また細胞がなお成育しかつ増幅可能
である間に、再び温度を一定のコピー数を与える低温度
側へシフトし、そして生成した細胞あたりより多数のプ
ラスミドを保持している細菌が、この低温度において、
問題の温度感受性蛋白質の生産に用いられる。約３０こ
０以上の温度では生育可能でない生物は多数存在し、そ
れらの蛋白質は、そのためより高温度においては変性さ
れることが知られている。従って、この温度規制の実施
態様は、該生物に固有の遺伝子産物が組み変えＤＮＡノ
クローニング技術によって調製される場合に特に重要な
ことが分る。以上に示した如く、爆発的増殖を含む特徴
的な温度依存性のコピー数挙動を示すプラスミドは、所
望の生産性に関する遺伝子を有するが特徴的な爆発的行
動はもたない親プラスミドからの変異処理によって誘導
しうる。
しかしながら、多くの実際的目的のため量産培養で用い
るプラスミド‘まクローニング・ベクタ−として、特徴
的な温度依存性の爆発的増殖を示す適当なプラスミドを
用いる組み変えＤＮＡ技術によって調製されたものであ
ろう。これは、在来の組み変えＤＮＡ技術の利点と、温
度規制及び細胞あたり極めて高いプラスミドコピー数が
得られるという利点とが組合わされ、その結果、異種Ｄ
ＮＡフラグメントにより伝達されたポリベプチドもしく
は蛋白質の生産が増幅されるものである。本発明のクロ
ーニング・ベクターを用いて得られる極めて大きなプラ
スミドコピー数は「発生学的には問題の宿主細菌から比
較的に遠隔であるため、これ迄は全く生産され得なかっ
たかもしくはいかなる程度においても充分量は生産され
得なかった蛋白質の大量生産や任意な適当量の生産をク
ローニング技術によって可能とすることを期待させる。
従って本発明のクローニング・ベクターに関する部分は
非常に重要な部分である。クローニング・ベクターとし
て有用であるためには、プラスミドは少なくとも１種の
制限エンドヌクレアーゼに対して、一つおよび一つだけ
のエンドヌクレアーゼに感受性部位（ｓｉｔｅ）を示さ
ねばならず、該部位はこの部位に異種ＤＮＡのフラグメ
ントを挿入したのち、生成した組み変えＤＮＡが自動的
に増殖することを可能とし、本発明の利点をあげるため
温度依存性のコピー数パターンを示す能力を保有するも
のであるべきである。
るプラスミド‘まクローニング・ベクタ−として、特徴
的な温度依存性の爆発的増殖を示す適当なプラスミドを
用いる組み変えＤＮＡ技術によって調製されたものであ
ろう。これは、在来の組み変えＤＮＡ技術の利点と、温
度規制及び細胞あたり極めて高いプラスミドコピー数が
得られるという利点とが組合わされ、その結果、異種Ｄ
ＮＡフラグメントにより伝達されたポリベプチドもしく
は蛋白質の生産が増幅されるものである。本発明のクロ
ーニング・ベクターを用いて得られる極めて大きなプラ
スミドコピー数は「発生学的には問題の宿主細菌から比
較的に遠隔であるため、これ迄は全く生産され得なかっ
たかもしくはいかなる程度においても充分量は生産され
得なかった蛋白質の大量生産や任意な適当量の生産をク
ローニング技術によって可能とすることを期待させる。
従って本発明のクローニング・ベクターに関する部分は
非常に重要な部分である。クローニング・ベクターとし
て有用であるためには、プラスミドは少なくとも１種の
制限エンドヌクレアーゼに対して、一つおよび一つだけ
のエンドヌクレアーゼに感受性部位（ｓｉｔｅ）を示さ
ねばならず、該部位はこの部位に異種ＤＮＡのフラグメ
ントを挿入したのち、生成した組み変えＤＮＡが自動的
に増殖することを可能とし、本発明の利点をあげるため
温度依存性のコピー数パターンを示す能力を保有するも
のであるべきである。
組み換えＤＮＡ技術に用いるのにもっとも適した制限エ
ンドヌクレアーゼ類は、クローニング・べクタ−および
ＤＮＡフラグメントの両者上にいわゆる“付着端”（ｃ
ｏｈｅｓｉｖｅｅｎ船）、云いかえれば塩基対（舷ｓｅ
ｐａｉｒｉｎｇ）を同一配列になし得る相補的塩基配列
をもつ分子末端において一重鎖領域（ｓｉｎｇｅｓｔｒ
ａｎｄｅｄｒｅｇｏｎｓ）、を与えるものである。
ンドヌクレアーゼ類は、クローニング・べクタ−および
ＤＮＡフラグメントの両者上にいわゆる“付着端”（ｃ
ｏｈｅｓｉｖｅｅｎ船）、云いかえれば塩基対（舷ｓｅ
ｐａｉｒｉｎｇ）を同一配列になし得る相補的塩基配列
をもつ分子末端において一重鎖領域（ｓｉｎｇｅｓｔｒ
ａｎｄｅｄｒｅｇｏｎｓ）、を与えるものである。
実施例にみられる如く、制限エンドヌクレァーゼに対し
て１部位を有するクローニング・ベクター類が調製され
、また一つの制限エンドヌクレアーゼに対する１部泣と
他の制限エンドヌクレアーゼに対するもうひとつの部位
とを有するべクター類も調製された。
て１部位を有するクローニング・ベクター類が調製され
、また一つの制限エンドヌクレアーゼに対する１部泣と
他の制限エンドヌクレアーゼに対するもうひとつの部位
とを有するべクター類も調製された。
上記藷条件をみたすクローニング・ベクタ−類を組立て
る有利な方法としては、温度依存性の爆発的増殖を示す
より大きいプラスミドから、有用な制限エンドヌクレア
ーゼに感受性の１部位のみを示す充分４・サイズであっ
て、しかもなお特定の温度依存性の増殖挙動に不可欠な
遺伝子を含有するに充分なサイズをもった“ミニプラス
ミド”（ｍｉｎｉｐｌａｓｍｉｄ）を調製する場合が多
い。そのようなミニプラスミド類は、より大きなプラス
ミドから、同時に生成するかもしくは生体外で調製され
た（次いで形質転換される）、親プラスミドのミニプラ
スミド譲導体を保持する細菌性クローンを単離すること
によって調製できる。所望のミニプラスミド類（もしく
はそれらを含有する細菌類）の単離は適切なよく知られ
たスクリーニング法および／または選別方法によって達
成される。原則として、理想的なクローニング・ベクタ
ーは、望ましくない蛋白質の生産をコードした遺伝子は
できるだけ僅かしか含有していないものである。
る有利な方法としては、温度依存性の爆発的増殖を示す
より大きいプラスミドから、有用な制限エンドヌクレア
ーゼに感受性の１部位のみを示す充分４・サイズであっ
て、しかもなお特定の温度依存性の増殖挙動に不可欠な
遺伝子を含有するに充分なサイズをもった“ミニプラス
ミド”（ｍｉｎｉｐｌａｓｍｉｄ）を調製する場合が多
い。そのようなミニプラスミド類は、より大きなプラス
ミドから、同時に生成するかもしくは生体外で調製され
た（次いで形質転換される）、親プラスミドのミニプラ
スミド譲導体を保持する細菌性クローンを単離すること
によって調製できる。所望のミニプラスミド類（もしく
はそれらを含有する細菌類）の単離は適切なよく知られ
たスクリーニング法および／または選別方法によって達
成される。原則として、理想的なクローニング・ベクタ
ーは、望ましくない蛋白質の生産をコードした遺伝子は
できるだけ僅かしか含有していないものである。
しかしながら多くの目的のためには、プラスミドを保持
する細胞の同定および／または選別に有用ないわゆるマ
ーカーを伝達する遺伝子を含有するクローニング・ベク
タ−が望ましい。もっとも有用なマーカーは抗生物質耐
性、たとえばアンピシリン耐性であり、これは宿主細菌
中への組み換えＤＮＡの形質転換のための処理後、組み
換えプラスミドを受取っていない細菌の簡易な相互選別
を可能とするためである。しかしながら、マ−カーをも
たないクローニング・ベクターもたとえば、組み換えに
よって挿入されるべき遺伝子が自身内にマーカーを保持
している場合等においては有用なクローニング・ベクタ
ーたり得る。クローニング・ベクターとして用いられる
本発明のプラスミドにマーカー、たとえば抗生物質耐性
の導入が望まれる場合、それ自体公知のＤＮＡフラグメ
ントの転座（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）法によって
行われる。
する細胞の同定および／または選別に有用ないわゆるマ
ーカーを伝達する遺伝子を含有するクローニング・ベク
タ−が望ましい。もっとも有用なマーカーは抗生物質耐
性、たとえばアンピシリン耐性であり、これは宿主細菌
中への組み換えＤＮＡの形質転換のための処理後、組み
換えプラスミドを受取っていない細菌の簡易な相互選別
を可能とするためである。しかしながら、マ−カーをも
たないクローニング・ベクターもたとえば、組み換えに
よって挿入されるべき遺伝子が自身内にマーカーを保持
している場合等においては有用なクローニング・ベクタ
ーたり得る。クローニング・ベクターとして用いられる
本発明のプラスミドにマーカー、たとえば抗生物質耐性
の導入が望まれる場合、それ自体公知のＤＮＡフラグメ
ントの転座（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）法によって
行われる。
そのような転座の１例は、実施例５に例示されている。
マーカー機能を伝達する異種ＤＮＡフラグメントを導入
する他の方法は、組み換えＤＮＡ技術によるものであろ
うが、これはクローニング・ベクター上の制限部位（ｒ
ｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉに）を便い尽すので、クロー
ニング・ベクターが組み換えＤＮＡ技術に有用な少なく
とも２つの制限部位を有する場合においてのみ利用し得
る。本発明のクローニング・ベクター調製の他の実施態
様は、変異により、所望の生物内で充分作動することが
知られている既存のクローニング・ベクター中に、たと
えばＥ．ｃｏｌｉ中で充分確立されたクローニング・ベ
クターであるプラスミドＰＳＣＩＯＩ中に上述の温度依
存性の爆発的増殖を変異によって導入することである。
マーカー機能を伝達する異種ＤＮＡフラグメントを導入
する他の方法は、組み換えＤＮＡ技術によるものであろ
うが、これはクローニング・ベクター上の制限部位（ｒ
ｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉに）を便い尽すので、クロー
ニング・ベクターが組み換えＤＮＡ技術に有用な少なく
とも２つの制限部位を有する場合においてのみ利用し得
る。本発明のクローニング・ベクター調製の他の実施態
様は、変異により、所望の生物内で充分作動することが
知られている既存のクローニング・ベクター中に、たと
えばＥ．ｃｏｌｉ中で充分確立されたクローニング・ベ
クターであるプラスミドＰＳＣＩＯＩ中に上述の温度依
存性の爆発的増殖を変異によって導入することである。
実施例でも用Ｃ、られた方法
数種のェシヱリヒア・コリＫ−１２株（第１表）および
プラスミド（第２表）が用いられた。
プラスミド（第２表）が用いられた。
用いた実験法は、微生物遺伝学（Ｊ．ミラー、メンツズ
イン モレキユラー バイオロジイ、コールドスプリン
グ，ハーバー研究所）および遺伝子工学（Ｔ．田中およ
びＢ．バィスフルム、Ｊ．バクテリオロジィ、第２１２
蓋（１９７５）、３５４〜３６２）に用いられた標準法
であった。第１表 第２表 プラスミドＲ，は下記抗生物質；すなわちアンピシリン
、クロラムフヱニコール、カナマイシン、ストレプトマ
イシンならびにスルホンアミド類に対する耐性を伝達す
る伝達可能な（ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ）プラスミド
である。
イン モレキユラー バイオロジイ、コールドスプリン
グ，ハーバー研究所）および遺伝子工学（Ｔ．田中およ
びＢ．バィスフルム、Ｊ．バクテリオロジィ、第２１２
蓋（１９７５）、３５４〜３６２）に用いられた標準法
であった。第１表 第２表 プラスミドＲ，は下記抗生物質；すなわちアンピシリン
、クロラムフヱニコール、カナマイシン、ストレプトマ
イシンならびにスルホンアミド類に対する耐性を伝達す
る伝達可能な（ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ）プラスミド
である。
このプラスミドは６５×１ぴダルトンの分子量を有する
。通常、ェシェリヒア・コリ中でこのプラスミドは染色
体当量（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）
あたり約１個のコピーとして存在する。変位によってこ
のプラスミド中においてコピー数をこのレベルより数倍
高めることが可能である（いわゆるコピー変位株類）〔
Ｋ．ノルトシュレェム他、Ｊ．Ｂａｃにｒｉｏｌ、第１
１庇藍、５６２〜５６９（１９７２）〕。なお、Ｒ，ｄ
ｒｄ−１９は野生タイプのＲ，の変異体でプラスミド伝
達が抑制解除されており、複製還伝子はＲ．と同一であ
る。実施例には下記諸段階が記述されている。実施例
１ 温度依存性の複製コントロールを有するプラスミド変異
株（ｐＫＮ３０１）の単機。
。通常、ェシェリヒア・コリ中でこのプラスミドは染色
体当量（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）
あたり約１個のコピーとして存在する。変位によってこ
のプラスミド中においてコピー数をこのレベルより数倍
高めることが可能である（いわゆるコピー変位株類）〔
Ｋ．ノルトシュレェム他、Ｊ．Ｂａｃにｒｉｏｌ、第１
１庇藍、５６２〜５６９（１９７２）〕。なお、Ｒ，ｄ
ｒｄ−１９は野生タイプのＲ，の変異体でプラスミド伝
達が抑制解除されており、複製還伝子はＲ．と同一であ
る。実施例には下記諸段階が記述されている。実施例
１ 温度依存性の複製コントロールを有するプラスミド変異
株（ｐＫＮ３０１）の単機。
このプラスミドのコピー数は高温側では約４倍増加する
。実施例 ２プラスミドｐＫＮ３０１からの、高温での
複製コントロール欠除変異株（ｐＫＮ４００）の単離。
。実施例 ２プラスミドｐＫＮ３０１からの、高温での
複製コントロール欠除変異株（ｐＫＮ４００）の単離。
（爆発性変異株）実施例 ３
プラスミドｐＫＮ４００から、爆発的挙動は維持してい
るが制限エンドクアーゼＥｃｏＲＩに対して１部位し保
持していないミニプラスミド（ｐＫＮ４０２）の単離。
るが制限エンドクアーゼＥｃｏＲＩに対して１部位し保
持していないミニプラスミド（ｐＫＮ４０２）の単離。
実施例 ４プラスミドｐＫＮ４００の議導体から、爆発
的挙動は維持しているが制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩに対して１部位しか保持していない他のミニプラス
ミドの単離。
的挙動は維持しているが制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩに対して１部位しか保持していない他のミニプラス
ミドの単離。
実施例 ５
ミニプラスミドｐＫＮ４０３を得るためのミニブラスミ
ドｐＫＮ４０２中への抗生物質耐性マーカーのトランス
ロケーションによる挿入。
ドｐＫＮ４０２中への抗生物質耐性マーカーのトランス
ロケーションによる挿入。
実施例 ６
ミニプラスミドｐＫＮ４０３上へのストレプトマイシン
耐性遺伝子の挿入およびクローニング。
耐性遺伝子の挿入およびクローニング。
第１図は爆発的複製プラスミド変異株の性質を示す。プ
ラスミド単聖ヒ凶（○）又はｐＫＮ４００（△）を保持
するＤＩＩ株は、ＬＢ培地中で異なる温度において対数
的に成育した。簾ｌａ図）共有的に閥環せる環状（ｃｃ
ｃ）ＤＮＡの量は、３Ｈ−チミジンでラベル化したのち
、ェチジウム・ブロマイドーセシウム・クロリド密度勾
配平衡遠心法によって分析された。プラスミドＤＮＡ含
量は染色体ＤＮＡ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａＩ ＤＮＡ）
の％で算出された。第ｌｂ図）細胞のＤＮＡおよび蛋白
質の全量が化学的に測定され、ＤＮＡ／蛋白質比が３０
℃におけるＤＩＩ−Ｒ，ｄｒｄ−１９株に対する値を１
００％とし、これに対する相対的値で示されている。
ラスミド単聖ヒ凶（○）又はｐＫＮ４００（△）を保持
するＤＩＩ株は、ＬＢ培地中で異なる温度において対数
的に成育した。簾ｌａ図）共有的に閥環せる環状（ｃｃ
ｃ）ＤＮＡの量は、３Ｈ−チミジンでラベル化したのち
、ェチジウム・ブロマイドーセシウム・クロリド密度勾
配平衡遠心法によって分析された。プラスミドＤＮＡ含
量は染色体ＤＮＡ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａＩ ＤＮＡ）
の％で算出された。第ｌｂ図）細胞のＤＮＡおよび蛋白
質の全量が化学的に測定され、ＤＮＡ／蛋白質比が３０
℃におけるＤＩＩ−Ｒ，ｄｒｄ−１９株に対する値を１
００％とし、これに対する相対的値で示されている。
第ｌｃ図）成育比〔ダブりング
（ｄｏｕｂｌｉ増ｓ）／時〕はクレットーサマーソン（
Ｋｌｅｅｔ−Ｓｍｍｍｅｒｓｏｎ）カラリメーター中で
光学密度測定によって決定された。
Ｋｌｅｅｔ−Ｓｍｍｍｅｒｓｏｎ）カラリメーター中で
光学密度測定によって決定された。
第２図は、４０ｑｏにおけるＤＩＩ−ｐＫＮ４０の朱の
プラスミドが伝達した８−ラクタマーゼ舎量および総額
白量の相対的増加を示す。
プラスミドが伝達した８−ラクタマーゼ舎量および総額
白量の相対的増加を示す。
３０００でＬＢ−培地中で指数関数的に増殖中の培養物
は４０℃にシフトされた。
は４０℃にシフトされた。
その後の成育中、検体が採取され、８−ラクタマーゼ量
と総蛋白量が測定された。温度シフト後の相対的増加は
対数目盛上にプロットされている。第３図は、Ｃ６００
−ｐＫＮ４０２株のプラスミド○ＮＡ含量を示す。
と総蛋白量が測定された。温度シフト後の相対的増加は
対数目盛上にプロットされている。第３図は、Ｃ６００
−ｐＫＮ４０２株のプラスミド○ＮＡ含量を示す。
ＬＢ−塔地中で成育し、３日ーチミジンでラベルされた
Ｃ６００−５ＫＮ４ｏ２の培養物は、セシウム・クロリ
ドーエチジウム・プロミド遠０法で分析された。第３ａ
図）は３０ｏｏにおける対数増殖後の結果を示し、第３
ｂ図）は４０℃における成育３時間後の結果を示す。
Ｃ６００−５ＫＮ４ｏ２の培養物は、セシウム・クロリ
ドーエチジウム・プロミド遠０法で分析された。第３ａ
図）は３０ｏｏにおける対数増殖後の結果を示し、第３
ｂ図）は４０℃における成育３時間後の結果を示す。
勾配の深さは右から左へかけて増加し、フランクション
総数はそれぞれ６３（第３ａ図）及び５２（第３ｂ図）
であった。第４図は生体外組立混成プラスミド類のＥｃ
ｏＲＩ制限フラグメント分析を示す。
総数はそれぞれ６３（第３ａ図）及び５２（第３ｂ図）
であった。第４図は生体外組立混成プラスミド類のＥｃ
ｏＲＩ制限フラグメント分析を示す。
純化されたプラスミドＤＮＡはＥｃｏＲ，エンドヌクレ
アーゼで消化され、そのフラグメントパターンはアガロ
ースーゲル−霞気泳動によって分析された。ェチジウム
・プロミド溶液で染色後、ゲルは柴外線照明下に撮影さ
れた。左からプラスミド類は；クローニングベヒクルｐ
ＫＮ４０３ ２つのｐＫＮ４０３をベースとする混成プ
ラスミド類（ｐＫＮ４０４、ｐＫＮ４０５）、対照とし
てのプラスミドＲ，ｄｒｄ−１９および比較のためのプ
ラスミドｐＫＮ ４０２である。Ｒ，ｄてｄ−１９のＥ
ｃｏＲ，フラグメントの表示（ｄｅｎｏｔｉｏｎｓ）は
右側に示されている。実施例 １ プラスミドＲ，ｄｒｄ−１９を含有するＥＣＩＯ０５株
の培養物４０泌がカザミノ酸培地中、３０００で成育さ
れた。
アーゼで消化され、そのフラグメントパターンはアガロ
ースーゲル−霞気泳動によって分析された。ェチジウム
・プロミド溶液で染色後、ゲルは柴外線照明下に撮影さ
れた。左からプラスミド類は；クローニングベヒクルｐ
ＫＮ４０３ ２つのｐＫＮ４０３をベースとする混成プ
ラスミド類（ｐＫＮ４０４、ｐＫＮ４０５）、対照とし
てのプラスミドＲ，ｄｒｄ−１９および比較のためのプ
ラスミドｐＫＮ ４０２である。Ｒ，ｄてｄ−１９のＥ
ｃｏＲ，フラグメントの表示（ｄｅｎｏｔｉｏｎｓ）は
右側に示されている。実施例 １ プラスミドＲ，ｄｒｄ−１９を含有するＥＣＩＯ０５株
の培養物４０泌がカザミノ酸培地中、３０００で成育さ
れた。
細胞濃度約１ぴｃｅｌｌｓ／の【においてこの細胞は冷
却され、４℃における遠Ｄ分離によって採取された。細
胞は等張ＮａＣ〆溶液で１回洗浄され、変異処理剤とし
てのＩＭヒドロキシルアミン塩酸塩（ｐＨ６．０）中に
再懸濁され、そして３７０で２０分間培養された。この
変異処理後、培養物は変異原物質を除き、ＬＢ培地（バ
クトトリプトン１０夕、ＮａＣ夕１０夕、酵母エキス５
夕、水１０００肌、ＰＨをＮａＯＨで７．４に調製後、
加圧滅菌）中に細胞濃度が約１０でｅｌｌｓ／泌になる
までうすめられる（３０ｏｏ）。この培養物は４標本に
分割され、培養が３０ｏｏで続けられた。３０ｏｏで６
０分後、クロラムフェニコール（３００ｒ夕／叫）が、
さらに１０分後にアンピシリン（４０００ムタ／の【）
が加えられた。
却され、４℃における遠Ｄ分離によって採取された。細
胞は等張ＮａＣ〆溶液で１回洗浄され、変異処理剤とし
てのＩＭヒドロキシルアミン塩酸塩（ｐＨ６．０）中に
再懸濁され、そして３７０で２０分間培養された。この
変異処理後、培養物は変異原物質を除き、ＬＢ培地（バ
クトトリプトン１０夕、ＮａＣ夕１０夕、酵母エキス５
夕、水１０００肌、ＰＨをＮａＯＨで７．４に調製後、
加圧滅菌）中に細胞濃度が約１０でｅｌｌｓ／泌になる
までうすめられる（３０ｏｏ）。この培養物は４標本に
分割され、培養が３０ｏｏで続けられた。３０ｏｏで６
０分後、クロラムフェニコール（３００ｒ夕／叫）が、
さらに１０分後にアンピシリン（４０００ムタ／の【）
が加えられた。
培養はさらに６０分間続けられた。生存細胞は孫収され
、２回ＬＢ培地（４０℃）で洗浄され、ＬＢ培地（４０
℃）中に細胞濃度が約５×１ぴｃｅｌｌｓ／泌になるま
で再懸濁された。培養物は３０分間４０００で培養され
、培養物中の細胞は次いで異なった濃度のアンピシリン
（３００−２００ムタ／の【）を含有するＬＡプレート
上にのせられた。プレートは４０００で一夜培養され、
生存コロニーは単離され、３０００および４０ｏｏにお
いて耐性パターンをテストされた。４０ｑｏにおいて少
なくとも５００ムタ／泌のアンピシリン耐性を有する細
胞は１０‐６の頻度で見出された。
、２回ＬＢ培地（４０℃）で洗浄され、ＬＢ培地（４０
℃）中に細胞濃度が約５×１ぴｃｅｌｌｓ／泌になるま
で再懸濁された。培養物は３０分間４０００で培養され
、培養物中の細胞は次いで異なった濃度のアンピシリン
（３００−２００ムタ／の【）を含有するＬＡプレート
上にのせられた。プレートは４０００で一夜培養され、
生存コロニーは単離され、３０００および４０ｏｏにお
いて耐性パターンをテストされた。４０ｑｏにおいて少
なくとも５００ムタ／泌のアンピシリン耐性を有する細
胞は１０‐６の頻度で見出された。
アンピシリン５００−２０００メタ／舷から単離された
４００のコロニ−は摘みとられ、準培養（ｓｕｂｕｌｔ
ｍｅ）し、温度依存性耐性をテストされた。５つのクロ
ーンは、内４つは個々の準培養からのものであるが、３
０００と４０ｏｏ間で耐性に３倍以上の違いを示した。
４００のコロニ−は摘みとられ、準培養（ｓｕｂｕｌｔ
ｍｅ）し、温度依存性耐性をテストされた。５つのクロ
ーンは、内４つは個々の準培養からのものであるが、３
０００と４０ｏｏ間で耐性に３倍以上の違いを示した。
ブラスミドを未変異ＥＣＩＯ０５株に伝達後、アンピシ
リン、ストレプトマイシンおよびクロラムフエニコール
に対する各耐性が測定された。５クローン全てが４００
０において、３０ｏｏに比較して３一５倍増加した耐性
を３抗生物質全てに対して示した。
リン、ストレプトマイシンおよびクロラムフエニコール
に対する各耐性が測定された。５クローン全てが４００
０において、３０ｏｏに比較して３一５倍増加した耐性
を３抗生物質全てに対して示した。
（親プラスミドは３０ｑ０および４０ｑ０において、そ
れぞれ７５および１２５山タアンピシリン／の‘の耐性
を示した。）変異株のうち１つ、ｐＫＮ３０１は、より
詳細に分析された。このプラスミドは親プラスミド、Ｒ
ｉｄｒｄ−１９と同一の分子量（６５×１ぴダルトン）
を有している。プラスミドｐＫＮ ３０１のコピー数分
析プラスミド含量は２種の方法、ＣＣＣ−ＤＮＡの、お
よび８ーラクタマーゼの比活性の測定によって測定され
た。
れぞれ７５および１２５山タアンピシリン／の‘の耐性
を示した。）変異株のうち１つ、ｐＫＮ３０１は、より
詳細に分析された。このプラスミドは親プラスミド、Ｒ
ｉｄｒｄ−１９と同一の分子量（６５×１ぴダルトン）
を有している。プラスミドｐＫＮ ３０１のコピー数分
析プラスミド含量は２種の方法、ＣＣＣ−ＤＮＡの、お
よび８ーラクタマーゼの比活性の測定によって測定され
た。
異なる成育条件下の各プラスミドーこついてＣＣＣ−Ｄ
ＮＡ量は、アルカリ性シュークロース濃度勾配中の急速
沈降物質量および染料−ＣｓＣそ浮力・密度勾配（ｄｙ
ｅ−ＣｓＣそｂｕｏ匁ｎｔｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅ
ｎｔ）におけるサテライトバンド量の両者として測定さ
れた（第３表）。変異株は高温側で成育したときはブラ
スミドＲ．ｄｒｄ−１９を保持する同一細菌の３乃至４
倍のプラスミドＤＮＡを示したが、低温側ではプラスミ
ドＤＮＡ量は親プラスミドのそれに近かった。第３表 ａ ＥＣＩＯ０３珠が宿主として用いられた。
ＮＡ量は、アルカリ性シュークロース濃度勾配中の急速
沈降物質量および染料−ＣｓＣそ浮力・密度勾配（ｄｙ
ｅ−ＣｓＣそｂｕｏ匁ｎｔｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅ
ｎｔ）におけるサテライトバンド量の両者として測定さ
れた（第３表）。変異株は高温側で成育したときはブラ
スミドＲ．ｄｒｄ−１９を保持する同一細菌の３乃至４
倍のプラスミドＤＮＡを示したが、低温側ではプラスミ
ドＤＮＡ量は親プラスミドのそれに近かった。第３表 ａ ＥＣＩＯ０３珠が宿主として用いられた。
ｂ コピー数は染料／ＣｓＣ〆密度勾配上のＣＣＣ−Ｄ
ＮＡ／染色体ＤＮＡ比を測定することによって確認され
た。数値は各温度において親プラスミドＲｉｄｒｄ−１
９を１．０とした場合の相対値である。実施例 ２ 爆発性複製プラスミド変異株（ｐＫＮ４００）の単離実
施例１で記述した如くトプラスミドｐＫＮ３０１内で変
異が発現したとき、コピー数はなお注意深くコント。
ＮＡ／染色体ＤＮＡ比を測定することによって確認され
た。数値は各温度において親プラスミドＲｉｄｒｄ−１
９を１．０とした場合の相対値である。実施例 ２ 爆発性複製プラスミド変異株（ｐＫＮ４００）の単離実
施例１で記述した如くトプラスミドｐＫＮ３０１内で変
異が発現したとき、コピー数はなお注意深くコント。
−ルされていることが極めて明白である。この温度依存
性のコピー数変異株は、変異が発現される条件ではコピ
ー数がコントロールされないプラスミド変異株の探索に
おいて親プラスミドとして用いられた。３０００におい
てｐＫＮ３０１のコピー数レベルに影響を与えた第２の
変異が導入され、次いで高温側における変異株の挙動に
ついてのテストが行なわれた：プラスミドｐＫＮ３０１
を保持する１００５株がエチルメタンスルホネートで変
異処理され、アンピシリン耐性の増加したクローンが３
０午０においてプレート上で選別された。
性のコピー数変異株は、変異が発現される条件ではコピ
ー数がコントロールされないプラスミド変異株の探索に
おいて親プラスミドとして用いられた。３０００におい
てｐＫＮ３０１のコピー数レベルに影響を与えた第２の
変異が導入され、次いで高温側における変異株の挙動に
ついてのテストが行なわれた：プラスミドｐＫＮ３０１
を保持する１００５株がエチルメタンスルホネートで変
異処理され、アンピシリン耐性の増加したクローンが３
０午０においてプレート上で選別された。
（なお変異処理は、Ｌ餅青地中の１００８珠１０の‘に
、エチルメタンスルホネート１００泌を加え、２時間の
培養を行い、培養物を遠心分離して集め、細胞をＬＢ借
地の１０の上で洗浄し、ＬＢ培地１０の‘に再懸濁する
。細胞を一夜培養して行なった。）次いでクローンは異
なる温度でテストされ、単離されたもののうちいくつか
は３７℃と４〆０における生育能力が劇的に減少してい
ることが判明した。末変異宿主株に対する接合によるブ
ラスミドの伝達により、生育能力の減少は変異株プラス
ミド‘こよって生じたものであることが示された。（な
お接合による伝達は、供与及び受容細胞をＬＢ培地中で
ほぼ１０８セル／地まで指数関数的に生育させ、各１の
【づっを試験管中で混合し３７ｏ０で３０分間静直培養
し、次いで得られた培養物０．１の‘を関連の抗生物質
含有の選別プレート上に流延して行った）単離物の一つ
はひきつついての研究用に選び出された。未変性宿王（
ＤＩＩ株）への伝達において、プラスミド受容体につい
ての選別がクロラムフェニコール（２５ムタ／のと）に
耐性の細胞の選別によって行われ、今やプラスミドを保
持するに到った受容体はひき続き他のプラスミド伝達耐
性の存在についてテストされた。全ＲＩ−伝達耐性を示
したクローンのブラスミドはｐＫＮ４００と表示された
。ＤＩＩ株におけるｐＫＮ４００の性質のいくつかは第
１図に示されており、それは細胞が異なる温度において
成育したのちの結果を要約するものである。弘℃以上の
温度ではプラスミドＤＮＡ量に劇的な増加がみられた（
第ｌａ図）。同様の増加が細胞中の全ＤＮＡ量について
も示され（第ｌｂ図）、そして細胞の成育比に、対応す
る減少がみられた（第ｌｃ図）。この細菌は、３５ｑｏ
以上の温度では測定できる程の比で成育をしなかった。
３０ｑ０における培養物の成育を３７℃（または４０℃
）へシフトすることによって、高温側ではプラスミド複
製を規制するいかなるコピー数コントロールも残ってい
ないことが示された。
、エチルメタンスルホネート１００泌を加え、２時間の
培養を行い、培養物を遠心分離して集め、細胞をＬＢ借
地の１０の上で洗浄し、ＬＢ培地１０の‘に再懸濁する
。細胞を一夜培養して行なった。）次いでクローンは異
なる温度でテストされ、単離されたもののうちいくつか
は３７℃と４〆０における生育能力が劇的に減少してい
ることが判明した。末変異宿主株に対する接合によるブ
ラスミドの伝達により、生育能力の減少は変異株プラス
ミド‘こよって生じたものであることが示された。（な
お接合による伝達は、供与及び受容細胞をＬＢ培地中で
ほぼ１０８セル／地まで指数関数的に生育させ、各１の
【づっを試験管中で混合し３７ｏ０で３０分間静直培養
し、次いで得られた培養物０．１の‘を関連の抗生物質
含有の選別プレート上に流延して行った）単離物の一つ
はひきつついての研究用に選び出された。未変性宿王（
ＤＩＩ株）への伝達において、プラスミド受容体につい
ての選別がクロラムフェニコール（２５ムタ／のと）に
耐性の細胞の選別によって行われ、今やプラスミドを保
持するに到った受容体はひき続き他のプラスミド伝達耐
性の存在についてテストされた。全ＲＩ−伝達耐性を示
したクローンのブラスミドはｐＫＮ４００と表示された
。ＤＩＩ株におけるｐＫＮ４００の性質のいくつかは第
１図に示されており、それは細胞が異なる温度において
成育したのちの結果を要約するものである。弘℃以上の
温度ではプラスミドＤＮＡ量に劇的な増加がみられた（
第ｌａ図）。同様の増加が細胞中の全ＤＮＡ量について
も示され（第ｌｂ図）、そして細胞の成育比に、対応す
る減少がみられた（第ｌｃ図）。この細菌は、３５ｑｏ
以上の温度では測定できる程の比で成育をしなかった。
３０ｑ０における培養物の成育を３７℃（または４０℃
）へシフトすることによって、高温側ではプラスミド複
製を規制するいかなるコピー数コントロールも残ってい
ないことが示された。
プラスミドコピー数は次いで宿主細胞にとってついには
致死的となる対数的増加を来たす。重要な発見は、その
ような温度シフト中、プラスミド遺伝子がプラスミド量
が増加した全期間を通じて発現されたことである。かく
して得られた遺伝子投与量効果は第２図に示されており
、それは総蛋白量とプラスミド伝達総３ーラクタマーゼ
量の増加を示している。実施例 ３ 温度依存性の爆発的複製のあるミニプラスミド（ｐＫＮ
４０２）数年前、プラスミドコピー変異株が自然に、よ
り小さいプラスミド・セグリンガンツ（ｓｅ母ｅ鞍ｎ＄
）、すなわち自然に複製可能なミニプラスミドを生ずる
ことが見出された。
致死的となる対数的増加を来たす。重要な発見は、その
ような温度シフト中、プラスミド遺伝子がプラスミド量
が増加した全期間を通じて発現されたことである。かく
して得られた遺伝子投与量効果は第２図に示されており
、それは総蛋白量とプラスミド伝達総３ーラクタマーゼ
量の増加を示している。実施例 ３ 温度依存性の爆発的複製のあるミニプラスミド（ｐＫＮ
４０２）数年前、プラスミドコピー変異株が自然に、よ
り小さいプラスミド・セグリンガンツ（ｓｅ母ｅ鞍ｎ＄
）、すなわち自然に複製可能なミニプラスミドを生ずる
ことが見出された。
（ゲーベル及びボンバルト、Ｊ．Ｂａｃｔ，第１２３巻
（１９７５）、６班−６６５）その後、そのようなミニ
プラスミド類がより多種類各種コピ−変異株から単離さ
れた。各種サイズのミニプラスミドが分子量約４×１ぴ
ダルトンのものまで得られた。爆発的複製変異株プラス
ミドｐＫＮ４００は、殊にもしコントロールされていな
いプラスミド複製が高温度において宿主細胞の成育によ
って可能となった場合に、ミニプラスミド単離のための
好適源となることが見出された。ｐＫＮ４００のＣ６０
の朱への伝達後、いくつかのクローンがプラスミド伝達
抗生物質耐性のためのテスト（３０ｏｏで）によって判
定されたとき、プラスミド維持に関しては非常に不安定
であることが判明した。
（１９７５）、６班−６６５）その後、そのようなミニ
プラスミド類がより多種類各種コピ−変異株から単離さ
れた。各種サイズのミニプラスミドが分子量約４×１ぴ
ダルトンのものまで得られた。爆発的複製変異株プラス
ミドｐＫＮ４００は、殊にもしコントロールされていな
いプラスミド複製が高温度において宿主細胞の成育によ
って可能となった場合に、ミニプラスミド単離のための
好適源となることが見出された。ｐＫＮ４００のＣ６０
の朱への伝達後、いくつかのクローンがプラスミド伝達
抗生物質耐性のためのテスト（３０ｏｏで）によって判
定されたとき、プラスミド維持に関しては非常に不安定
であることが判明した。
しかしながら、いくつかの場合では、温度感受性フェノ
タイプ（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）は、細胞がもはや抗生物
質耐性を保持していないのに、依然として持続されてい
た。ァガロースゲル電気泳動によって、これらの細胞が
プラスミドを保持しており、またいずれの場合において
も分子量はほぼ５×１ぴダルトンであったことが示され
た。そのようなクローンの一つは、その後の研究用に選
び出され、そのプラスミドはｐＫＮ４０２と表示された
。温度シフト実験はこのミニプラスミドが大きいプラス
ミド（ｐＫＮ４００）と同一の温度依存性挙動を現わす
ことを示した。Ｃ６００／ｐＫＮ４０２株中のプラスミ
ドＤＮＡ量は、３０午Ｃにおける成育後（第３ａ図）お
よび４０ｑｏにおける成育約３時間後（第３ｂ図）にセ
シウムクロリドーヱチジウムフロミド密度勾配平衡遠心
法によって分析された。ｐＫＮ４０２の分子量が４．６
５×１ぴダルトンであると測定されたので、３０００に
おいては細胞あたり約５０プラスミドコピーであるが温
度シフト後は細胞あたり約５０００コピーにまで増数す
るものと計算できた。制限エンドヌクレアーゼについて
での分析のためにｐＫＮ４０２のＤＮＡはエチジウムプ
ロミド／セシウムクロリド匂酌遠心法によって精製され
た。ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼによる消化によって
一つ線状分子を生ずること；すなわち、そこにはｐＫＮ
４０２上にその酵素に感受性の１部位が存在すること及
びそれはこのプラスミドのクローニング・ベヒクルとし
て有用性を考えるためには非常に重要な事実であること
が見出された。Ｅ．コリ Ｋ１２Ｃ６００／ｐＫＮ４０
２菊まドイツ微生物コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎｍｉｋｒｏｏｒｇａｎＩｓｍ
ｅｎ，Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒ，８，Ｄ３４００Ｇｏ
ｔｔｉｎ餌ｎ）、以下においてはＤＳＭと呼ぶ、に国際
寄託番号１２２８をもって寄託されている。
タイプ（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）は、細胞がもはや抗生物
質耐性を保持していないのに、依然として持続されてい
た。ァガロースゲル電気泳動によって、これらの細胞が
プラスミドを保持しており、またいずれの場合において
も分子量はほぼ５×１ぴダルトンであったことが示され
た。そのようなクローンの一つは、その後の研究用に選
び出され、そのプラスミドはｐＫＮ４０２と表示された
。温度シフト実験はこのミニプラスミドが大きいプラス
ミド（ｐＫＮ４００）と同一の温度依存性挙動を現わす
ことを示した。Ｃ６００／ｐＫＮ４０２株中のプラスミ
ドＤＮＡ量は、３０午Ｃにおける成育後（第３ａ図）お
よび４０ｑｏにおける成育約３時間後（第３ｂ図）にセ
シウムクロリドーヱチジウムフロミド密度勾配平衡遠心
法によって分析された。ｐＫＮ４０２の分子量が４．６
５×１ぴダルトンであると測定されたので、３０００に
おいては細胞あたり約５０プラスミドコピーであるが温
度シフト後は細胞あたり約５０００コピーにまで増数す
るものと計算できた。制限エンドヌクレアーゼについて
での分析のためにｐＫＮ４０２のＤＮＡはエチジウムプ
ロミド／セシウムクロリド匂酌遠心法によって精製され
た。ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼによる消化によって
一つ線状分子を生ずること；すなわち、そこにはｐＫＮ
４０２上にその酵素に感受性の１部位が存在すること及
びそれはこのプラスミドのクローニング・ベヒクルとし
て有用性を考えるためには非常に重要な事実であること
が見出された。Ｅ．コリ Ｋ１２Ｃ６００／ｐＫＮ４０
２菊まドイツ微生物コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎｍｉｋｒｏｏｒｇａｎＩｓｍ
ｅｎ，Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒ，８，Ｄ３４００Ｇｏ
ｔｔｉｎ餌ｎ）、以下においてはＤＳＭと呼ぶ、に国際
寄託番号１２２８をもって寄託されている。
実施例 ４温度依存性の爆発的複製のミニプラスミド（
ｐＫＮ４１０） ｐＫＮ４０１（カナマイシン耐性を失なったｐＫＮ４０
０の誘導体）から誘導された他のミニプラスミドがもう
一つの方法によって単離された。
ｐＫＮ４１０） ｐＫＮ４０１（カナマイシン耐性を失なったｐＫＮ４０
０の誘導体）から誘導された他のミニプラスミドがもう
一つの方法によって単離された。
プラスミドＤＮＡ（ｐＫＮ ４０１）は生体外で制限酵
素ＥｃｏＲＩで消化され、その後、生成した線状ＤＮＡ
フラグメントの末端を溶融し、封ずるために酵素ＤＮＡ
リガーゼで処理された。このＤＮＡはＥ．コリＣ６０既
細胞中に形質転換され、ァンピシリン耐性クローンが単
離され、さらにテストされた。プラスミドｐＫＮ４０１
（温度感受性）を保持するＥ．コリ細胞に似たフェノタ
イプをもつこれらのクローンの一つは１２×１びダルト
ンサイズのプラスミドを保持することが示された（ｐＫ
Ｎ４０１）。このプラスミドのコピー数は３０ｑ０にお
いては細胞あたり約２０コピーであり、３７０以上の温
度においては細胞あたり約２０００コピーであることが
見出された。プラスミド上のアンピシリン耐性遺伝子の
存在は形質転換によって証明された。
素ＥｃｏＲＩで消化され、その後、生成した線状ＤＮＡ
フラグメントの末端を溶融し、封ずるために酵素ＤＮＡ
リガーゼで処理された。このＤＮＡはＥ．コリＣ６０既
細胞中に形質転換され、ァンピシリン耐性クローンが単
離され、さらにテストされた。プラスミドｐＫＮ４０１
（温度感受性）を保持するＥ．コリ細胞に似たフェノタ
イプをもつこれらのクローンの一つは１２×１びダルト
ンサイズのプラスミドを保持することが示された（ｐＫ
Ｎ４０１）。このプラスミドのコピー数は３０ｑ０にお
いては細胞あたり約２０コピーであり、３７０以上の温
度においては細胞あたり約２０００コピーであることが
見出された。プラスミド上のアンピシリン耐性遺伝子の
存在は形質転換によって証明された。
制限酵素分析はｐＫＮ４１０が制限酵素ＥｃｏＲＩに感
受性の部位を１つだけ、また制限酵素ＢａｍＨＩに感受
性の部位も１つしか保持していないことを示した。ｐＫ
Ｎ４１０を保持する細胞の培養物は３０℃から４０ｏｏ
への温度シフト後は親プラスミドｐＫＮ ４００と完全
に同一の成育パターンを示し、プラスミド伝達Ｐーラク
タマーゼ量の同様の増加がみられた。
受性の部位を１つだけ、また制限酵素ＢａｍＨＩに感受
性の部位も１つしか保持していないことを示した。ｐＫ
Ｎ４１０を保持する細胞の培養物は３０℃から４０ｏｏ
への温度シフト後は親プラスミドｐＫＮ ４００と完全
に同一の成育パターンを示し、プラスミド伝達Ｐーラク
タマーゼ量の同様の増加がみられた。
Ｅ．コリ Ｋ１２Ｃ６００／ｐＫＮ４１の％まＤＳＭに
国際寄託番号１２３０のものとして寄託されている。
国際寄託番号１２３０のものとして寄託されている。
実施例 ５ミニプラスミドｐＫＮ ４０３取得のための
ミニプラスミドｐＫＮ４０２中へのアンピシリン耐性遺
伝子の導入プラスミドｐＫＮ４０２は、温度依存性複製
と制限酵素ＥｃｏＲＩに対する単一作用部位の存在とい
う重要な性質をもっているものの、プラスミドをひそま
せる細胞クローンの選別に際して使用し得るマーカーを
もっていない。
ミニプラスミドｐＫＮ４０２中へのアンピシリン耐性遺
伝子の導入プラスミドｐＫＮ４０２は、温度依存性複製
と制限酵素ＥｃｏＲＩに対する単一作用部位の存在とい
う重要な性質をもっているものの、プラスミドをひそま
せる細胞クローンの選別に際して使用し得るマーカーを
もっていない。
ＤＮＡフラグメントとべクタ−との生体外結合に続く段
階がＤＮＡを適当な細菌の細胞中に形質転換させること
であるため、形質転換された細胞が容易に見出せること
は利点となる。従って、多くのクローニング・ベクター
は、そのべクターを有する細胞が対応する抗生物質を含
有する培地中での生存を可能とする抗生物質耐性遺伝子
を保持している。８−ラクタマーゼをコードされた遺伝
子を保持するｐＫＮ４０波由来のプラスミド（すなわち
このクローニング・べクターはペニシリン類に耐性であ
る）が調製された：ｐＫＮ４０２のペニシリン耐性誘導
体組立の第１工程はＥ．コリのｐＫＮ４０２保持株にＴ
ｎＡトランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）をもたら
すことである。
階がＤＮＡを適当な細菌の細胞中に形質転換させること
であるため、形質転換された細胞が容易に見出せること
は利点となる。従って、多くのクローニング・ベクター
は、そのべクターを有する細胞が対応する抗生物質を含
有する培地中での生存を可能とする抗生物質耐性遺伝子
を保持している。８−ラクタマーゼをコードされた遺伝
子を保持するｐＫＮ４０波由来のプラスミド（すなわち
このクローニング・べクターはペニシリン類に耐性であ
る）が調製された：ｐＫＮ４０２のペニシリン耐性誘導
体組立の第１工程はＥ．コリのｐＫＮ４０２保持株にＴ
ｎＡトランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）をもたら
すことである。
〔トランスポゾンに関する記述は、クレックナーＣｅｌ
ｌ第１１巻（１９７７）１１−２３を参照〕この工程は
バクテリオフアージＰＩによる形質導入（ｔｒａｎｓｄ
ｕｃｔｉｏｎ）として行われる。Ｅ．コリ１２、ＵＢ１
７３１株は細菌性染色体上にトランスポゾンＴｎ８０２
（ＴｎＡ）を保持している。この株の培養物はバクテリ
オフアージＰＩに感染され、ファージストツクが調製さ
れる。
ｌ第１１巻（１９７７）１１−２３を参照〕この工程は
バクテリオフアージＰＩによる形質導入（ｔｒａｎｓｄ
ｕｃｔｉｏｎ）として行われる。Ｅ．コリ１２、ＵＢ１
７３１株は細菌性染色体上にトランスポゾンＴｎ８０２
（ＴｎＡ）を保持している。この株の培養物はバクテリ
オフアージＰＩに感染され、ファージストツクが調製さ
れる。
このＰＩ−ストックはＣ６００／ｐＫＮ４０２を形質導
入するのに用いられる。このＰＩ感染された細胞はアン
ピシリン（５０〃夕／机）含有プレート上に拡げられた
。これらのプレート上に成育させるコロニーは精製され
、ァンピシリン耐性ならびに温度感受性をテストされた
（全操作法がＪ．ミラー：メソツズ・ィン・モレキュラ
ー・バイオロジィに記載されている）。Ｔｎ８０２がＥ
．コリの染色体中に挿入されたとき、細胞はほぼ３００
〃夕／凧とのペンジルベニシリンに対して耐性となった
。しかしながら、トランスポゾンがマルチ コピー ブ
ラスミド中に挿入された場合は耐性レベルはより一層高
い。従って、クローンは１０００メタ／の上のペンジル
ベニシリン耐性を有する形質導入されたＣ６００／ｐＫ
Ｎ４０２の中から選出された。３０００においてｐＫＮ
４０２は細胞あたりほぼ５０コピーで存在するので、Ｔ
ｎ８０２のｐＫＮ４０２へのトランスロケーションはペ
ニシリン耐性レベルを一層高くすることになることが期
待された。
入するのに用いられる。このＰＩ感染された細胞はアン
ピシリン（５０〃夕／机）含有プレート上に拡げられた
。これらのプレート上に成育させるコロニーは精製され
、ァンピシリン耐性ならびに温度感受性をテストされた
（全操作法がＪ．ミラー：メソツズ・ィン・モレキュラ
ー・バイオロジィに記載されている）。Ｔｎ８０２がＥ
．コリの染色体中に挿入されたとき、細胞はほぼ３００
〃夕／凧とのペンジルベニシリンに対して耐性となった
。しかしながら、トランスポゾンがマルチ コピー ブ
ラスミド中に挿入された場合は耐性レベルはより一層高
い。従って、クローンは１０００メタ／の上のペンジル
ベニシリン耐性を有する形質導入されたＣ６００／ｐＫ
Ｎ４０２の中から選出された。３０００においてｐＫＮ
４０２は細胞あたりほぼ５０コピーで存在するので、Ｔ
ｎ８０２のｐＫＮ４０２へのトランスロケーションはペ
ニシリン耐性レベルを一層高くすることになることが期
待された。
１０００ムタ／の【のペンジルベニシリン上に成育して
いるＣ６００／ｐＫＮ４０２の４コロニーが更に分析す
るために選び出された。
いるＣ６００／ｐＫＮ４０２の４コロニーが更に分析す
るために選び出された。
これらの４クローンのプラスミド含量を分析すると１つ
は分子量ほぼ８×１びのプラスミドの１つのタイプのみ
をもっていた。（Ｔｎ８０２の挿入は、３．２×１びの
プラスミドの分子量増加をもたらした。
は分子量ほぼ８×１びのプラスミドの１つのタイプのみ
をもっていた。（Ｔｎ８０２の挿入は、３．２×１びの
プラスミドの分子量増加をもたらした。
）このクローンはさらに分析するために摘みとられ、そ
のプラスミドはｐＫＮ ４０３と名付けられた。ｐＫＮ
４０３がｐＫＮ ４０２の全性質に加えて更にＴｎ８
０２トランスポゾンをも有し、プラスミドＤＮＡはＣ６
００／ｐＫＮ ４０３珠から調製され、そしてこのＤＮ
Ａは、Ｅ．コリ Ｋ１２の他の菌株に形質転換された。
形質転換細胞はァンピシリン（５０仏夕／叫）含有プレ
ート上に成育され、該プレート上に成育する１つのコロ
ニーがプラスミドの存在と温度感受性について分析され
た。アンピシリン耐性細胞がｐＫＮ４０３と同サイズの
プラスミドを有し、かつ温度感受性であることが見出さ
れた。ｐＫＮ４０３のＤＮＡは制限酵素ＥｃｏＲＩ及び
ＢａｍＨＩの作用部位数について分析され、プラスミド
ｐＫＮ４０３はｐＫＮ ４０２と同様にＥｃｏＲＩ部位
１つだけを有することが見出された。さらにｐＫＮ４０
３は脇ｍ印に対し１つのカット部位を保持する（たぶん
Ｔｎ８０２配列）。このようにして、少なくとも２種の
酵素がｐＫＮ４０３をクローニング・ベクタ−として適
用するときに用いることができる。３０ｏｏから４０ｑ
ｏへのシフトに際しては、培養物はその後ほどなく成育
を停止する。
のプラスミドはｐＫＮ ４０３と名付けられた。ｐＫＮ
４０３がｐＫＮ ４０２の全性質に加えて更にＴｎ８
０２トランスポゾンをも有し、プラスミドＤＮＡはＣ６
００／ｐＫＮ ４０３珠から調製され、そしてこのＤＮ
Ａは、Ｅ．コリ Ｋ１２の他の菌株に形質転換された。
形質転換細胞はァンピシリン（５０仏夕／叫）含有プレ
ート上に成育され、該プレート上に成育する１つのコロ
ニーがプラスミドの存在と温度感受性について分析され
た。アンピシリン耐性細胞がｐＫＮ４０３と同サイズの
プラスミドを有し、かつ温度感受性であることが見出さ
れた。ｐＫＮ４０３のＤＮＡは制限酵素ＥｃｏＲＩ及び
ＢａｍＨＩの作用部位数について分析され、プラスミド
ｐＫＮ４０３はｐＫＮ ４０２と同様にＥｃｏＲＩ部位
１つだけを有することが見出された。さらにｐＫＮ４０
３は脇ｍ印に対し１つのカット部位を保持する（たぶん
Ｔｎ８０２配列）。このようにして、少なくとも２種の
酵素がｐＫＮ４０３をクローニング・ベクタ−として適
用するときに用いることができる。３０ｏｏから４０ｑ
ｏへのシフトに際しては、培養物はその後ほどなく成育
を停止する。
コピー数は中間温度（たとえば３４ｑｏ）を用いること
によって高度に定常状態のレベルに保たれ得る。Ｂ．コ
リ Ｋ１２Ｃ６００／ｐＫＮ４０３総まドイツ微生物コ
レクション（ＤＳＭ）に国際寄託番号１２２９のものと
して寄託されている。
によって高度に定常状態のレベルに保たれ得る。Ｂ．コ
リ Ｋ１２Ｃ６００／ｐＫＮ４０３総まドイツ微生物コ
レクション（ＤＳＭ）に国際寄託番号１２２９のものと
して寄託されている。
温度依存性クローニング・ベクタ−類の性質のまとめ実
施例は全てクローニング・ベクターとして使用し得る３
つの４・プラスミドの単離と特性化を記述した。
施例は全てクローニング・ベクターとして使用し得る３
つの４・プラスミドの単離と特性化を記述した。
１つのプラスミド（ｐＫＮ４０２）はどの抗生物質耐性
マーカーも欠除しており、それ故、ベクター中に挿入さ
れるべきＤＮＡが選別に際して有用な遺伝的マーカ〜を
有する場合や、分子量の増加したプラスミドのスクリー
ニングが組換えにひき，続いて行われる場合に使用でき
る。
マーカーも欠除しており、それ故、ベクター中に挿入さ
れるべきＤＮＡが選別に際して有用な遺伝的マーカ〜を
有する場合や、分子量の増加したプラスミドのスクリー
ニングが組換えにひき，続いて行われる場合に使用でき
る。
このべクターは他のべクター類の組立てに際して、ある
いは異なる遺伝子的マーカーを保持するＤＮＡによる組
換えに際して非常に有用となろう。プラスミドｐＫＮ４
０３中では、アンピシリン耐性遺伝子の存在がプラスミ
ド保持細胞の選別を容易にする。最終的に、ブラスミド
ｐＫＮ４１０はアンピシリン耐性遺伝子を保持し、４０
ｑ０への温度シフト後はｐＫＮ４００の成育特性を示す
。このプラスミドは３０ｑｏでは細胞あたり少数（２０
コピー／細胞）で存在する。全てのプラスミドは制限酵
素ＥｃｏＲＩに感受性の１部位を有する。
いは異なる遺伝子的マーカーを保持するＤＮＡによる組
換えに際して非常に有用となろう。プラスミドｐＫＮ４
０３中では、アンピシリン耐性遺伝子の存在がプラスミ
ド保持細胞の選別を容易にする。最終的に、ブラスミド
ｐＫＮ４１０はアンピシリン耐性遺伝子を保持し、４０
ｑ０への温度シフト後はｐＫＮ４００の成育特性を示す
。このプラスミドは３０ｑｏでは細胞あたり少数（２０
コピー／細胞）で存在する。全てのプラスミドは制限酵
素ＥｃｏＲＩに感受性の１部位を有する。
実施例 ６
プラスミドｐＫＮ ４０３上のストレプトマイシン耐性
遺伝子のクローニングクローニング実験が、ストレプト
マイシン耐性を伝達する遺伝子を保持するＥｃｏＲＩフ
ラグメントが挿入されたべクターｐＫＮ４０３で行われ
た。
遺伝子のクローニングクローニング実験が、ストレプト
マイシン耐性を伝達する遺伝子を保持するＥｃｏＲＩフ
ラグメントが挿入されたべクターｐＫＮ４０３で行われ
た。
プラスミドｐＳＦ２１２４およびプラスミドＲｉｄｒｄ
一１９由来のＥｃｏＲＩフラグメントＧとより成るあら
かじめ組立てられた混成プラスミドがストレプトマイシ
ン耐性遺伝子源として用いられた。べクターｐＫＮ４０
３の精製ＤＮＡおよび上記混成プラスミドが混合され、
線状フラグメントを得るためにＥｃｏＲＩエンドヌクレ
アーゼで消化された。このＤＮＡは次いでポリヌクレオ
チド・リガーゼで処理され、Ｅ．コリ細胞の形質転換に
用いられた。３０００でアンピシリンおよびストレプト
マイシンに耐性を有する細胞についての選別が行われた
。
一１９由来のＥｃｏＲＩフラグメントＧとより成るあら
かじめ組立てられた混成プラスミドがストレプトマイシ
ン耐性遺伝子源として用いられた。べクターｐＫＮ４０
３の精製ＤＮＡおよび上記混成プラスミドが混合され、
線状フラグメントを得るためにＥｃｏＲＩエンドヌクレ
アーゼで消化された。このＤＮＡは次いでポリヌクレオ
チド・リガーゼで処理され、Ｅ．コリ細胞の形質転換に
用いられた。３０００でアンピシリンおよびストレプト
マイシンに耐性を有する細胞についての選別が行われた
。
そのようにして得られたクローソは４０００における成
育についてテストされ、それらの多くがこの温度では成
育不能であることが分った。そのようなクローンをさら
に分析すると、それらがプラスミドｐＫＮ４０３とフラ
グメントＧとより成る混成プラスミドについて計算せる
分子量を正確に有することが示された。第４図はそのよ
うな２つの組換えＤＮＡブラスミド（ｐＫＮ ４０４，
ｐＫＮ ４０５）のＥｃｏＲＩフラグメント・パターン
を示す。ｐＫＮ４０４の場合の３７−４０ｏｏにおける
プラスミドＤＮＡの増幅は、ｐＫＮ４０３について見出
されたそれと同様のものであったこともまた示された。
従って、ベクターのＥｃｏＲＩ作用部位へＤＮＡフラグ
メントを挿入しＤＮＡ分子を絹立てることは、ＤＮＡお
よび／または遺伝子産物の増殖に関与するべクタ−の有
利な性質を変えるものではないことが結論された。
育についてテストされ、それらの多くがこの温度では成
育不能であることが分った。そのようなクローンをさら
に分析すると、それらがプラスミドｐＫＮ４０３とフラ
グメントＧとより成る混成プラスミドについて計算せる
分子量を正確に有することが示された。第４図はそのよ
うな２つの組換えＤＮＡブラスミド（ｐＫＮ ４０４，
ｐＫＮ ４０５）のＥｃｏＲＩフラグメント・パターン
を示す。ｐＫＮ４０４の場合の３７−４０ｏｏにおける
プラスミドＤＮＡの増幅は、ｐＫＮ４０３について見出
されたそれと同様のものであったこともまた示された。
従って、ベクターのＥｃｏＲＩ作用部位へＤＮＡフラグ
メントを挿入しＤＮＡ分子を絹立てることは、ＤＮＡお
よび／または遺伝子産物の増殖に関与するべクタ−の有
利な性質を変えるものではないことが結論された。
本発明に関するプラスミドの諸性質をまとめると次表の
とおり。
とおり。
注１）Ａｐ＝アンビシリン、Ｋｍ＝カナマイシン、Ｓｍ
＝トレプトマイシン、Ｓｕ＝スルホンアミド、０ｍ＝ク
ロラムマエニ２）１メカタルトンは１、４キ。
＝トレプトマイシン、Ｓｕ＝スルホンアミド、０ｍ＝ク
ロラムマエニ２）１メカタルトンは１、４キ。
ベースＫ相当する。ＦＩＧ．ＩＡ．ＦＩＧ．ＩＢ．
ＦＩＧ．ＩＣ．
ＦＩＧ．２
ＦＩＧ．３Ａ．
Ｆ白Ｇ−３８
ＦＩＧ．４．
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 宿主細菌をある一つの温度で培養した際にコントロ
ールされた一定のプラスミドコピー数を示し、かつプラ
スミド保持宿主細菌をより高い温度で成育させた際に、
少なくとも２０倍多数かまたは全くコントロールされて
いないコピー数を与える改変されたプラスミドコピー数
コントロールを示す組み換えＤＮＡプラスミドを保持す
る細菌を、プラスミドが少なくとも２０倍多数かまたは
全くコントロールされていないコピー数を与える改変さ
れたプラスミドコピー数を示す温度またはそれに近い温
度での培養期を少なくとも含む条件下で、培養し、次い
で細菌培養物から該プラスミドの遺伝子産物を収得する
ことからなるＤＮＡ遺伝子産物の製法。 ２ 該プラスミドがミニプラスミドである請求の範囲第
１項記載の方法。 ３ 該プラスミドは少なくとも一つの制限エンドヌクレ
アーゼのための一つかつ一つだけのエンドヌクレアーゼ
感受性の作用部位を保持するプラスミドから組立てられ
、該部位は、この部位に異種ＤＮＡのフラグメントを挿
入後、生成せる組み換えＤＮＡが自律的に複製可能であ
り、組み換えＤＮＡを保持する宿主細菌が一つの温度で
培養される場合はコントロールされた一定のプラスミド
コピー数を示し、かつ組み換えＤＮＡを保持する宿主細
菌がより高い温度で成育される場合は少なくとも２０倍
多数のもしくは全くコントロールされていないコピー数
を与える改変されたプラスミドコピー数コントロールを
示す性能を保持している、ような部位である請求の範囲
第１又は２項に記載の方法。 ４ 培養が、プラスミドが少なくとも２０倍多数のもし
くは全くコントロールされていないコピー数を与える改
変されたコピー数コントロールを示す温度で、細菌の成
育がプラスミドまたはその遺伝子産物の生産によつて阻
害されるまで続ける請求の範囲第１項、第２項または第
３項に記載の方法。 ５ 量産スケールの培養が、宿主細胞を生存させ付随し
て該プラスミドの遺伝子産物の増量生成をするように、
プラスミドが少なくとも２０倍多数のもしくは全くコン
トロールされていないコピー数を与える改変されたコピ
ー数コントロールを示す温度に近い温度で、連続的に行
われ、次いで、該プラスミドの遺伝子産物が連続的にも
しくは間けつ的に培養物から収穫される請求の範囲１項
、第２項または第３項の記載の方法。 ６ 細菌培養物の増殖が量産サイズの培養に達したのち
、温度が、プラスミドが少なくとも２０倍多数のもしく
は全くコントロールされていないコピー数を与える改変
されたコピー数コントロールを示す温度もしくはそれに
近い温度にシフトされ、次いで該温度がプラスミドの実
質的な増殖が得られるのに充分な期間ではあるが、しか
し細菌培養物のいかなる実質的な減損も回避するに充分
短い期間維持され、その後、温度はプラスミドがコント
ロールされた一定のプラスミドコピー数を示す温度もし
くは該温度に近い温度に再シフトされ、次いで増殖され
たプラスミドコピー数を有する培養物の量産培養が該温
度で続けられる請求の範囲第１項、第２項または第３項
に記載の方法。 ７ 宿主細菌が中温性細菌であり、プラスミドが一定の
コントロールされたプラスミドコピー数を示す温度が３
２℃までであり、一方、プラスミドが少なくとも２０倍
多数のもしくは全くコントロールされていないコピー数
を与える改変されたコピー数コントロールを示す温度が
３６℃以上である請求の範囲第１〜６項の何れか１つに
記載の方法。 ８ プラスミドＲ１誘導体である請求の範囲第１〜７項
の何れか１つに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19772759053 DE2759053A1 (de) | 1977-12-30 | 1977-12-30 | Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns |
| DE2759053.0 | 1977-12-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS55500557A JPS55500557A (ja) | 1980-08-28 |
| JPS6038114B2 true JPS6038114B2 (ja) | 1985-08-30 |
Family
ID=6027810
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP54500225A Expired JPS6038114B2 (ja) | 1977-12-30 | 1978-12-29 | プラスミドｄｎａの遺伝子産物の製法 |
| JP60077523A Granted JPS6143989A (ja) | 1977-12-30 | 1985-04-11 | 組み換えｄｎａプラスミドとその保持細菌 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60077523A Granted JPS6143989A (ja) | 1977-12-30 | 1985-04-11 | 組み換えｄｎａプラスミドとその保持細菌 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US4495287A (ja) |
| EP (1) | EP0003062B1 (ja) |
| JP (2) | JPS6038114B2 (ja) |
| DE (2) | DE2759053A1 (ja) |
| GB (1) | GB1557774A (ja) |
| WO (1) | WO1979000467A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0240914U (ja) * | 1988-09-14 | 1990-03-20 |
Families Citing this family (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6297355B1 (en) | 1978-12-22 | 2001-10-02 | Biogen, Inc. | Polypeptides displaying HBV antigenicity or hbv antigen specificity |
| FI793884A (fi) * | 1978-12-26 | 1980-06-27 | Cetus Corp | Stabila plasmider med stort kopieantal |
| US4966840A (en) * | 1978-12-26 | 1990-10-30 | Cetus Corporation | Stable high copy number plasmids |
| FI88175C (fi) | 1980-04-03 | 1993-04-13 | Biogen Inc | Rekombinant-dna-molekyler och foerfaranden foer framstaellning av polypeptider liknande humant -interferon |
| US4874702A (en) * | 1980-09-08 | 1989-10-17 | Biogen, Inc. | Vectors and methods for making such vectors and for expressive cloned genes |
| FI64813C (fi) * | 1980-12-31 | 1984-01-10 | Ilkka Antero Palva | Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer |
| JPS57206699A (en) * | 1981-06-10 | 1982-12-18 | Takeda Chem Ind Ltd | Plasmid patm 3 and its preparation |
| CA1198069A (en) * | 1982-06-08 | 1985-12-17 | David H. Gelfand | Temperature sensitive multicopy plasmids |
| US4806471A (en) * | 1982-09-16 | 1989-02-21 | A/S Alfred Benzon | Plasmids with conditional uncontrolled replication behavior |
| CA1209501A (en) * | 1982-09-16 | 1986-08-12 | Nikos Panayotatos | Expression vector |
| DK410783D0 (da) * | 1982-09-16 | 1983-09-09 | Benzon A Salfred | Fremgangsmade til stabilisering af plasmider |
| HU201116B (en) * | 1982-09-16 | 1990-09-28 | Benzon As Alfred | Process for producing plasmids having uncontrolled replication conduct under given circumstances |
| NL8203716A (nl) * | 1982-09-24 | 1984-04-16 | Tno | Dna en plasmiden. |
| US4634678A (en) * | 1982-12-13 | 1987-01-06 | Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership | Plasmid cloning and expression vectors for use in microorganisms |
| JPS59151889A (ja) * | 1983-02-19 | 1984-08-30 | Agency Of Ind Science & Technol | 組換えｄｎａ分子の安定化及び発現量増大方法 |
| GB8308236D0 (en) * | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Dna vectors |
| US4710473A (en) * | 1983-08-10 | 1987-12-01 | Amgen, Inc. | DNA plasmids |
| EP0152483B1 (en) * | 1983-08-22 | 1989-03-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing peptide |
| HU194307B (en) * | 1983-09-16 | 1988-01-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Process for producing plasmidvectors of high copy number |
| DE3585170D1 (de) * | 1984-03-06 | 1992-02-27 | Lilly Co Eli | Expressionsvektoren fuer rinderwachstumshormonderivate. |
| GB8414271D0 (en) * | 1984-06-05 | 1984-07-11 | Cpc International Inc | Recombinant dna |
| US4925791A (en) * | 1984-07-20 | 1990-05-15 | Celltech Limited | Eucaryotic expression vectors |
| US4753886A (en) * | 1984-08-10 | 1988-06-28 | Eli Lilly And Company | Plasmid PHJL210 and related bifunctional cloning vectors for use in streptomycetes |
| US5840522A (en) * | 1984-09-20 | 1998-11-24 | Chiron Corporation | Recombinant lectins |
| US5747281A (en) * | 1984-09-28 | 1998-05-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | System useful for the production of proteins from recombinant DNA in single celled organisms |
| US4761367A (en) * | 1984-11-07 | 1988-08-02 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Vectors suitable for detection of eukaryotic DNA regulatory sequences |
| GB2166743B (en) * | 1984-11-13 | 1989-01-05 | Solvay | Process for a thermo-inducible gene expression in gram positive bacteria and bacillus subtilis strains containing plasmids which induce such an expression |
| US6084073A (en) * | 1985-03-25 | 2000-07-04 | Chiron Corporation | Recombinant ricin toxin |
| US4943531A (en) * | 1985-05-06 | 1990-07-24 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Expression of enzymatically active reverse transcriptase |
| US5173418A (en) * | 1985-05-10 | 1992-12-22 | Benzon Pharma, A/S | Production in Escherichia coli of extracellular Serratia spp. hydrolases |
| US4935350A (en) * | 1985-11-18 | 1990-06-19 | Amgen | Materials and methods for controlling plasmid copy number and stability |
| US4892819A (en) * | 1985-11-25 | 1990-01-09 | Eli Lilly And Company | Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from penicillium chrysogenum |
| GB8606384D0 (en) * | 1986-03-14 | 1986-04-23 | Ici Plc | Replication control mutants |
| JPS63503356A (ja) * | 1986-05-20 | 1988-12-08 | ザ・トラステイーズ・オブ・コロンビア・ユニヴアーシテイ・イン・ザ・シテイ・オブ・ニユー・ヨーク | ヒトｔ細胞リンパ球向性ウイルス（ｈｔｌｖ‐３）逆転写酵素の発現及びその使用 |
| US5202259A (en) * | 1986-05-20 | 1993-04-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Expression of human immunodeficiency virus (HIV) reverse transcriptase |
| US5256554A (en) * | 1986-05-20 | 1993-10-26 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Expression of human immunodeficiency virus (HIV) reverse transcriptase |
| US5089406A (en) * | 1987-01-07 | 1992-02-18 | Allied-Signal Inc. | Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences |
| US5063158A (en) * | 1987-11-09 | 1991-11-05 | Eli Lilly And Company | Recombinant DNA expression vector comprising both transcriptional and translational activating sequences |
| US5192669A (en) * | 1987-11-09 | 1993-03-09 | Eli Lilly And Company | Method to produce recombinant proteins using an expression vector comprising transcriptional and translational activating sequences |
| US5518907A (en) * | 1989-06-07 | 1996-05-21 | Center For Innovative Technology | Cloning and expression in Escherichia coli of the Alcaligenes eutrophus H16 poly-beta-hydroxybutyrate biosynthetic pathway |
| US5334520A (en) * | 1990-05-25 | 1994-08-02 | Center For Innovative Technology | Production of poly-beta-hydroxybutyrate in transformed escherichia coli |
| GB9215540D0 (en) * | 1992-07-22 | 1992-09-02 | Celltech Ltd | Protein expression system |
| US6553317B1 (en) * | 1997-03-05 | 2003-04-22 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Relational database and system for storing information relating to biomolecular sequences and reagents |
| US20030203845A1 (en) * | 2001-02-05 | 2003-10-30 | Knudsen Jens Bjerre | Combined use of factor VII polypeptides and factor IX polypeptides |
| JP2004517950A (ja) * | 2001-02-05 | 2004-06-17 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | 第ｖｉｉ因子ポリペプチド及び第ｖｉｉｉ因子ポリペプチドの組合された使用 |
| US7794971B1 (en) | 2003-07-01 | 2010-09-14 | Epicentre Technologies Corporation | Compositions and methods for controlling copy number for a broad range of plasmids and uses thereof |
| EP1733034A4 (en) * | 2004-03-15 | 2010-01-20 | Biogen Idec Inc | METHOD AND CONSTRUCTS FOR THE EXPRESSION OF POLYPEPTIDE MULTIMERS IN EUKARYONTIC CELLS USING ALTERNATIVE SPLEISSEN |
| WO2019014027A1 (en) * | 2017-07-14 | 2019-01-17 | Zume Pizza, Inc. | SYSTEMS AND METHODS BASED ON A SALES KIOSK FOR SELLING AND / OR PREPARING PRODUCTS, FOR EXAMPLE PREPARED FOODS |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
-
1977
- 1977-12-30 DE DE19772759053 patent/DE2759053A1/de not_active Withdrawn
-
1978
- 1978-05-22 US US05/908,108 patent/US4495287A/en not_active Expired - Lifetime
- 1978-05-26 GB GB23209/78A patent/GB1557774A/en not_active Expired
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- 1978-12-29 DE DE7878101877T patent/DE2862473D1/de not_active Expired
-
1980
- 1980-12-08 US US06/214,424 patent/US4499189A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-12-08 US US06/214,423 patent/US4487835A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-04-11 JP JP60077523A patent/JPS6143989A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0240914U (ja) * | 1988-09-14 | 1990-03-20 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP0003062A3 (en) | 1979-08-08 |
| WO1979000467A1 (en) | 1979-07-26 |
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| EP0003062A2 (en) | 1979-07-25 |
| US4487835A (en) | 1984-12-11 |
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