DE2759053A1

DE2759053A1 - Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns

Info

Publication number: DE2759053A1
Application number: DE19772759053
Authority: DE
Inventors: Bernt Eric Uhlin
Original assignee: UHLIN
Current assignee: UHLIN
Priority date: 1977-12-30
Filing date: 1977-12-30
Publication date: 1979-07-12
Also published as: US4499189A; GB1557774A; JPS6038114B2; US4495287A; JPS55500557A; DE2862473D1; EP0003062B1; JPS6143989A; EP0003062A3; WO1979000467A1; JPH0135638B2; EP0003062A2; US4487835A

Description

PAT E Γ J TA !V W Λ LT E

1) Bernt Eric Uhlin

2) Kurt Nordström

3) Sfiren Mol in

4-) Petter Gustafsson

Instituttet for molekylaer biologi
Odense Universitet, Campusvej 55»
DK-5230 Odense M, Dänemark

A.

H. KINKELDEY

OR-INQ

W. STOCKMAIR DR-Ma - AaE(CALTEOt

K. SCHUMANN

CR HER NOT. ■ OPL-PMVa

P. H. JAKOB

G. BEZOLD

DR RERNCT- ΟΗ.-Οβ(

8 MÜNCHEN 22

MAXIMILIANSTRASSE 43

30. Dezember 1977 P 12 309-Dr

Verfahren zum Herstellen von Genprodukten von Plasmid-DNS

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Genproduktes von Plasmid-DNS, auf Bakterien und Plasmide, die für das Verfahren nützlich sind, auf einen Klonierungs-Vektor, der benützt werden kann, um rekombinante DNS-Plasmide herzustellen, die für das Verfahren nützlich ist, und auf ein Verfahren, solche Bakterien, Plasmide und Klonierungs-Vektoren herzustellen.

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Es ist bekannt, nützliche Polypeptide und Proteine, z.B. Enzyme, Hormone und (z.B. für Impfstoffherstellung) Toxine und andere Antigene durch Kultivieren von Bakterien herzustellen, die Plasmide mit Genen tragen, die für die gewünschten Polyteptide oder Proteine codieren. Es ist auch bekannt, Plasmide, die die gewünschten Gene enthalten, durch eine sogenannte DNS-Rekombinationstechnik zu konstruieren, die es möglich macht, von den kultivierten Bakterien, die auf diese Weise rekombinierte DNS-Plasmide tragen, Genprodukte herzustellen, die von Natur aus für andere Organismen charakteristisch sind als für die Bakterien, die als Wirtzellen benützt werden. Bei der Herstellung von rekombinanter DNS wird ein sogenannter Klonierungs-Vektor, d.h. ein Plasmid, das fähig ist, in dem Wirtsbakterium zu replizieren, mit einem DNS-Bruchstück verbunden, das ein Gen oder Gene enthält, das bzw. die für das gewünschte Produkt oder die Produkte codiert bzw. codieren.

Die DNS-Rekombinations-Technik in ihrer nützlichsten Art, gründet sich auf dem folgenden Prinzip:

DNS kann durch Restriktions-Endonukleasen auf sehr spezifische Weise in Stücke geschnitten werden. Diese Stücke können dann durch DNS-Ligase miteinander verbunden werden. Für das Klonieren von DNS wird ein Plasmid-Vektor benützt, der ein zirkuläres DNS-Molekül ist, welches nur eine Erkennungsregion für eine Restriktions-Endonuklease oder verschiedene Restriktions-Endonukleasen besitzt. Behandelt man einen derartigen Vektor mit einen Restriktions-Enzym-, so erhält man eine Art von linearen Molekülen. Wenn dieses Molekül mit einer DNS-Probe vermischt wird, die mit derselben Endonuklease behandelt wurde, ist es durch Verknüpfung möglich, Moleküle zu erhalten, die zusammengesetzt sind aus dem Vektor, an den Bruchstücke fremder DNS angefügt wurden. Diese Plasmid-Moleküle werden rekombinante DNS genannt. Der Vektor mit der fremden DNS kann in bakterielle Wirtszellen transformiert werden, was bedeutet, daß er vom bakteriellen Wirt aufgenommen und in der Zelle repliziert wird.

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Da der Vektor in der Lage ist zu replizieren, wird auch die fremde DNS repliziert.

Falls die fremde DNS in dem bakteriellen Wirt transkribiert und translatiert wird, werden die Genprodukte der fremden DNS in dem bakteriellen Wirt produziert. Diese Produktion ist im allgemeinen proportional zur Genkonzentration, die ihrerseits wieder proportional ist zur Anzahl der Kopien des rekombinanten DNS-Plasmid-Moleküls pro Zelle. Das bedeutet, daß eine große Anzahl von Kopien der Plasmide pro Bakterienzelle angestrebt werden sollte, um große Mengen des gewünschten Genproduktes zu erhalten. Es ist bekannt, daß einige Klonierungs-Vektoren sich von Natur aus zu hohen Kopienzahlen (bis zu 100) pro Bakterienzelle replizieren. Wenn jedoch das Genprodukt, das durch die fremde, mit einem derartigen Klonierungs-Vektor kombinierte DNS produziert wird, eines ist, das vom bakteriellen Wirt nicht gut vertragen wird, kann es schwierig sein, einen bakteriellen Klon bis zu einer produktionsfähigen Kultur zu vermehren, da das Genprodukt hemmend wirkt. Andererseits ergibt sogar eine Kopien-Zahl in der Größenordnung von ungefähr 20 bis 100 nicht immer eine genügend große Ausbeute des gewünschten Genproduktes in der Produktionskultur. Es ist bekannt, daß die Anzahl der Kopien von Plasmiden durch Verstärkung weiter erhöht werden kann, indem die Proteinsynthese, z.B. durch Zugabe von Chloramphenicol, gehemmt wird · Da. jedoch Proteinsynthese für die Herstellung der Genprodukte der klonierten DNS nötig ist, kann die vermehrte DNS nur dann nützlich für die Bildung von Genprodukten sein, wenn die die Proteinsynthese hemmenden Komponenten wieder entfernt werden können, was nicht immer möglich und oft ein kompliziertes Verfahren ist.

Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zum Herstellen eines Genproduktes mittels eines DNS-Plasmids, wobei das Plasmid so geartet ist, daß es sowohl eine wirkungsvolle Plasmidvermehrung erlaubt, als auch große Mengen des Genproduktes des Plasmids zu erhalten sind. Die Erfindung benützt

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Plasmide, die eine temperaturabhängige Charakteristik der Plasmid-Kopienzahl haben, insofern, als die Plasmide eine gesteuert konstante Plasmid-Kopienzahl zeigen, wenn Wirtsbakterien, die das Plasmid tragen, bei einer Temperatur kultiviert werden, die gleichen Plasmide jedoch, wenn die Wirtsbakterien, die das Plasmid tragen,bei einer von der ersten Temperatur verschiedenen Temperatur wachsen, eine geänderte Charakteristik der Plasmid-Kopienzahl zeigen mit einer viel höheren oder völlig ungesteuerten Kopienzahl. Die Zahl der Kopien eines solchen Plasmides ist daher bei einer Temperatur niedrig, was ein Vorteil ist, da das Risiko verringert wird, daß die klonierten Plasmide oder deren Genprodukte das Wachstum des Wirtsbakteriums stören. Der Anteil an Plasmiden kann jedoch rasch durch eine einfache Temperaturveränderung erhöht werden, wobei eine gleichzeitige Bildung der klonierten Plasmide und deren Genprodukte erhalten wird, und die Herstellung des Genproduktes des Plasmids schnell fortschreitet.

In Übereinstimmung damit, schafft die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Genproduktes von DNS, gekennzeichnet durch Kultivieren von Bakterien, die ein Plasmid tragen, das beim Kultivieren der Wirtsbakterien bei einer ersten Temperatur eine gesteuert konstante Plasmidkopien-Zahl aufweist und daß beim Kultivieren der Wirtsbakterien, bei einer von der ersten Temperatur abweichenden, zweiten Temperatur eine geänderte Steuerung der Plasmid-Kopien-Zahl zeigt, die eine viel höhere oder völlig ungesteuerte Kopien-Zahl erlaubt, unter Bedingungen, die zumindest einen Zeitabschnitt des Wachstums bei oder in der Nähe der zweiten Temperatur einschließen, und Gewinnen eines Genproduktes des Plasmids aus der Bakterienkultur.

Der Kern der vorliegenden Erfindung ist das Benützen eines besonderen Typs von Plasmid, das die temperaturabhängige Charakteristik der Plasmid-Kopien-Zahl hat und die Erkenntnis, daß dieser Typ von Plasmid, wenn er bei einer bestimmten Temperatur in sehr

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großer Zahl kopiert wird, auch Anlaß gibt zur Produktion einer großen Menge seiner Genprodukte. Die Kultivierung an sich wird in geeigneter Weise durchgeführt, wobei übliche Techniken benützt werden, einschließlich der üblichen Nährmedien, von denen bekannt ist, daß sie für die in Frage stehenden bakteriellen Arten optimal sind* ebenso wird die Gewinnung der Genprodukte in Übereinstimmung mit gut bekannten Verfahren durchgeführt, Jeweils angepaßt an die Identität und Eigenschaften des speziellen Genproduktes, das hergestellt wird, die Eigenschaften der Wirtsbakterien usw.. Charakteristisch und entscheidend für das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Temperaturregulierung, die mindestens einen Zeitabschnitt der Kultivierung bei oder in der Nähe einer Temperatur einschließt, bei der die Plasmide eine geänderte Charakteristik der Kopien-Zahl zeigt, die eine viel höhere oder völlig unkontrollierte Kopien-Zahl erlaubt, mit anderen Worten, es ist während der Kultivierung ein Zeitabschnitt enthalten, währenddessen das Plasmid zu einer hohen Anzahl von Kopien vervielfacht wird, und, wie gezeigt werden konnte, währenddessen Genprodukte des Plasmids in entsprechend hohem Anteil gebildet werden.

Das Plasmid mit der temperaturabhängigen Charakteristik der Plasmid-Kopien-Zahl kann durch DNS-Bekombinations-Technik entstanden sein, wobei ein Klonierungs-Vektor benützt wurde, der die temperaturabhängige Charakteristik der Kopien-Zahl zeigt, oder das" Plasmid kann durch Mutagenisieren eines bestehenden Plasmids erhalten werden, das die Gene für die gewünschte Produktion hat.

Eine genaue Beschreibung eines Plasmids, das die oben erwähnte temperaturabhängige Charakteristik der Plasmid-Kopi.en-Zahl zeigt, ist bislang nicht gegeben worden, und ergibt sich aus den unten angegebenen Beispielen, die die Herstellung einiger Plasmide dieser Art beschreiben, einschließlich von Plasmiden, die als Klonierungs-Vektoren nützlich sind.

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Das Plasmid, das die oben erwähnte temperaturabhängige Charakteristik der Plasmid-Kopien-Zahl mit gesteuert konstanter Kopien-Zahl pro Zelle bei einer Temperatur zeigt, und eine viel höhere oder völlig ungesteuerte Kopien-Zahl (im folgenden oft "runaway-Replikation" genannt) bei einer anderen Temperatur, kann durch Mutagenisieren eines vorhandenen Plasmids, von dem bekannt ist, daß es sich in dem in Frage stehenden Wirtsbakterium autonom repliziert, hergestellt werden. In Übereinstimmung mit bekannten Prinzipien, kann die Mutagenese In vivo oder in vitro durchgeführt werden, und obwohl die Mutageneseagenzien, soweit sie benutzt wurden, den Beispielen zu entnehmen sind, wird angenommen, daß die Art der Mutagenese nicht entscheidend ist. Nach der Mutagenese (und, falls die Mutagenese in vitro durchgeführt wurde, nach der Transformation des mutagenisierten Materials in den bakteriellen Wirt), wird dann ein bakterieller Klon isoliert, in dem die Plasmid-Kopien-Zahl gesteuert ist, wenn die Bakterien bei einer Temperatur kultiviert werden, und in denen die Plasmid-Kopien-Zahl viel höher oder völlig ungesteuert ist, wenn die Bakterien bei einer anderen Temperatur wachsen. Das Isolierungsverfahren kann auf Screening bei zwei Temperaturen basieren, zwischen denen eine Veränderung der Steuerungscharakteristik der Plasmid-Kopien-Zahl gesucht wird. Ein nützlicher Hinweis für so eine Auswahl ist die Tatsache, daß auf einem Substrat, das dafüjq bekannt ist, daß es das in Frage stehende Wirtsbakterium nicht hemmt, die Wachstumshemmung, insbesondere bei einer speziellen Temperatur, wahrscheinlich auf die Herstellung einer großen Zahl von Kopien des Plasmids und/oder auf eine große Menge des Genproduktes dieses Plasmids zurückzuführen ist.

Es hat sich gezeigt, daß ein besser geeigneter Weg zur Isolierung einer Plasmid-Mutante, die die runaway-Replikationscharakteristik zeigt, eft derjenige einer zweistufigen Mutagenese ist. Diese schließt einen ersten Schritt ein ,in dem : ein plasmidtragender Bakterienklon isoliert wird,in dem das Plasmid eine Steuercharakteristik der Plasmid-Kopien-Zahl bei einer Temperatur zeigt,

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und eine andere Steuercharakteristik der Plasmid-Kopien-Zahl mit einer höheröi Kopien-Zahl bei einer anderen Temperatur erlaubt. Ein zweiter Schritt besteht darin, von der Mutante, die aus dem ersten Schritt erhalten wurde, einen plasmidtragenden Bakterienklon zu isolieren, in dem das Plasmid eine viel höhere oder völlig unkontrollierte Kopien-Zahl bei der genannten, zweiten, unterschiedlichen Temperatur zeigt. Dieses Verfahren erlaubt eine optimale Ausnützung geeigneter Selektionstechniken, z.B. der zweifachen Antibiotikaselektion:

Ein Typ der Plasmid-Kopie-Mutanten hat die folgende Charakteristik: Bei niedriger Temperatur (z.B. 3O⁰C), ist die Kopien-Zahl ähnlich der des Elternplasmids, während bei höherer Temperatur (z.B. 40⁰C), die Kopien-Zahl ungefähr vierfach höher ist. Ein geeignetes Isolierungsverfahren, das benützt wurde, um solche Mutanten zu isolieren, macht Gebrauch von der Tatsache, daß die Eesistenz gegen Ampicillin und Chloramphenicol direkt proportional ist zur Konzentration der Gene, die für das entsprechende Resistenzenzym codieren (Uhlin und Nordström, Plasmid J[, 1977)· Das Isolierungsverfahren macht weiterhin von der Tatsache Gebrauch, daß Ampicillin nur Bakterien tötet, die sich in einer Wachstumsphase befinden.

Es ist entdeckt worden, daß Stämme, die das Plasmid R1drd-19 (welches weiter unten genauer beschrieben wird) enthalten, eine Einzelzellenresistenz auf LA-Platten gegen ungefähr 100 jug Ampicillin/ml und gegen ungefähr 100 yag Chloramphenicol/ml zeigen. Die Resistenz gegen diese beiden Antibiotika ist in Flüssigmedium ungefähr genauso groß wie auf LA-Platten. Die Resistenz gegen Ampicillin und Chloramphenicol ist direkt proportional zur Genkonzentration (Uhlin und Nordstrom, Plasmid J.» 1977)- Dieser Effekt wurde benützt, um Mutanten des Plasmides R1drd-19 mit einer erhöhten Kopien-Zahl, sogenannte Kopien-Mutanten^ zu isolieren. Die Kombination eines bakteriostatisch und eines bakterizidvrirkenden Antibiotikums kann jedoch auch be-

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— %■ —

nützt werden, um Kopien-Mutanten mit verschiedener Kopien-Zahl bei verschiedenen Temperaturen zu isolieren, da dieses Selektionsverfahren eine leichte Gegenselektion .der Elternplasmide und unabhängiger Kopien-Mutanten erlaubt. Folgendes Verfahren wurde als geeignet angesehen: Man nimmt an, daß eine Kopien-Mutante exisitert, die bei einer niedrigen Temperatur (30°) eine geringe Kopien-Zahl und bei einer hohen Temperatur (A-O⁰C) eine hohe Kopienzahl hat ( das Verfahren ist jedoch nicht begrenzt auf diesen Typ der Kopienmutante, sondern kann auch zur Isolierung anderer möglicher Typen temperaturabhängiger Kopien-Mutanten benützt werden).

Man läßt die Kultur der plasmidenthaltenden Zellen bei 30°C wachsen, gibt Chloramphenicol in einer Konzentration (300 ^ig/ml) dazu, die das Wachstum der Zellen, die eine normale Kopien-Zahl enthalten, verhindert. Die Zellen, die Plasmide mit einer hohen Kopien-Zahl bei 30⁰C enthalten, werden mit Ampicillin getötet (4000 pg/ml). Die überlebenden Zellen werden gesammelt und die Temperatur auf 40⁰C erhöht. Zellen, die Plasmide mit einer hohen Kopien-Zahl bei 40⁰C enthalten, werden auf Ampicillin-Platten selektiert (500 - 2000 jig/ml). Unter den überlebenden Zellen sollten einige temperaturabhängige Plasmidkopien-Mutanten enthalten

Zellen, die auf die genannte Weise selektiert wurden, können einer weiteren Mutagenese unterzogen werden und ein geeignetes Verfahren zur Selektion einer Mutante aus diesen mutagenisierben Zellen, die "runaway"-Verhalten bei der zweiten Temperatur zeigt, umfaßt eine ursprüngliche Selektion nach Zellen, die bei niedriger Temperatur eine gesteuerte und konstante, aber erhöhte Kopien-Zahl zeigt, was darauf hinweist, daß wieder das Eeplikations-Kontroll-System mutiert wurde.

Der spezifische Typ der Mutation, die sich in den speziellen Plasmiden, die in den Beispielen erläutert werden, ereignet hat, ist noch nicht mit Sicherheit bekannt, aber man glaubt,

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jrv

daß eine Wirkung der Mutation die ist, daß ein vom Plasmid gebildetes Protein, das an der Steuerung der Plasmid-Kopien-Zahl beteiligt ist, durch die Mutation in der Weise modifiziert wurde, daß es bei höherer Temperatur nicht stabil ist. Obwohl es klar ist, daß die · praktischste Ausführungsform des Plasmids der Erfindung, wenn man es als Klonierungs-Vektor benützt, derart ist, wie auch die Klonierungs-Vektoren, die in den Beispielen beschrieben sind, daß es in sich selbst alle Elemente enthält, die für das temperaturabhängige Kopien-Zahl-Verhalten nötig ist, ist es doch auch offensichtlich, daß die Wesensmerkmale der vorliegenden Erfindung und die durch diese erreichten Vorteile auch dann zutage treten, wenn die Mutation eine Nonsense-Mutation ist, kombiniert mit einem entsprechenden temperaturabhängigen Nonsense-Suppressor in dem Wirtsbakterium, wenn z.B. das Plasmid eine amber-Mutante ist, und das Wirtsbakterium eine temperaturabhängige amber-Suppressor-Wirkung zeigt.

Die Temperatur, bei der das Plasmid ein "runaway"-Verhalten zeigt, wird nicht notwendigerweise höher sein als die Temperatur, bei der das Plasmid eine gesteuert konstante Kopien-Zahl zeigt; es ist ebenso die umgekehrte Situation möglich. Wenn es wünschenswert ist, eine Mutante herzustellen, die ^lfrunaway"-Replikation bei einer geringeren Temperatur zeigt, als der Temperatur, bei der eine gesteuert konstante Kopien-Zahl vorliegt, müssen die Selektions- oder Auswahlkriterien entsprechend angepaßt werden. Wenn jedoch das durch die Kultivierung ä-er plasmidenthaltenen Bakterien herzustellende Genprodukt so ist, daß es nicht bei höherer Temperatur verschlechtert wird, ist vorzuziehen, daß die Temperatur bei der das Plasmid die ^Mrunaway"-Replikation zeigt, höher ist, als die Temperatur, bei der eine gesteuert konstante Plasmid-Kopien-Zahl vorhanden ist. Wenn dies zutrifft, findet die Vermehrung des Plasmids unter denselben Bedingungen statt, unter denen die relativ höchste Zeilwachstumsrate erlaubt wird. Die in den Arbeitsbeispielen dargestellten Plasmide wurden so konstruiert, daß sie in mesophilen Bakterien, beispielsweise

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bei Escherichia coli .eine gesteuert konstante Plasmid-Kopien-Zahl bei 3O°C, und ⁿrunaway"-Verhalten bei 40⁰C zeigen. Aus den Daten über diese Plasmide wird hervorgehen, daß die gesteuert konstante Plasmid-Kopien-Zahl bis zu 32⁰C aufrechterhalten wird, und daß die Temperatur, bei der die Plasmide "runäway"-Vexhalten zeigen, über ungefähr 36⁰C liegt.

Die interessantesten Plasmide der vorliegenden Erfindung sind solche, die eine verhältnismäßig große, aber konstante Kopien-Zahl bei einer Temperatur, und eine Kopien-Zahl, die mindestens 20 mal höher ist, bei einer anderen Temperatur zeigen. Ob völliges "runaway"-Verhalten mit nachfolgendem Tod der Zelle auftritt oder nicht, hängt in gewisser Weise von dem bakteriellen. Wirt und seiner Fähigkeit ab, das Plasmid und dessen Genprodukte in hoher Konzentration zu tolerieren.

Die vorliegende Erfindung erlaubt daher einerseits den Erhalt von Plasmid-Kopien-Zahlen, die bisher nicht erhältlich waren, nämlich bis in die Größenordnung von mehreren tausend pro Zelle, und, wie gezeigt werden konnte, eine entsprechend hohe Produktion von Genprodukten des Plasmids während einer ausreichend großen Zahl von Generationen,(gewöhnlich 4- bis 6) bei der hohen Kopien-Zahl, um eine erhebliche Produktion des Genprodukts zu sichern. Andererseits schafft die Erfindung eine äußerst einfache Kontrolle der Kopien-Zahl, was auf verschiedene Weise ausgenützt werden kann, abhängig von den individuellen Bedingungen hinsichtlich des bakteriellen Wirts, des gewünschten Genprodukts usw.: In den meisten Fällen wird es vorzuziehen sein, daß die Vermehrung der Bakterien von einem Individuum oder einem Klon bis zu einer für die Produktion geeigneten Größe der Kultur bei oder in der Nähe der Temperatur durchgeführt wird, bei der das Plasmid eine gesteuert konstante Kopien-Zahl zeigt, um jegliche Hemmung des bakteriellen Wachstums durch Zunahme der Plasmid- und Genproduktkonzentration zu vermeiden. Danach kann die Temperatur auf die Temperatur geändert werden, bei der das Plasmid eine

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geänderte Steuerung der Kopien-Zahl zeigt, die eine viel höhere oder völlig ungesteuerte Kopien-Zahl erlaubt, und nach einem geeigneten Produktionszeitabschnitt, oft, bis das Wachstum der Bakterien durch die Produktion des Plasmids und/oder dessen Genprodukte gehemmt wird, findet die Gewinnung des Genprodukts statt. Abhängig von den speziellen Bedingungen kann es wünschenswert sein, die Kultivierung im Produktionsmaßstab bei einer Temperatur durchzuführen, die sich nur der Temperatur annähert, bei der das Plasmid eine geänderte Steuerung der Kopien-Zahl zeigt, um einen Ronstant-Zustand der Kultur zu erhalten, bei dem ein hoher Ertrag an Genprodukten erzielt wird,( die dann kontinuierlich oder schrittweise aus der Kultur gewonnen werden auf eine Art und Weise,die an sich bekannt ist), wobei aber bei dieser Temperatur die Wirtszellen überleben und noch in der Lage sind, sich zu vermehren.

Ein Beispiel der einzigartigen Steuermöglichkeiten, die durch die vorliegende Erfindung erhalten werden, ist die Herstellung eines temperatursensitiven Proteins als das gewünschte Genprodukt. In diesem Fall kann das Bakterium bis zur produktionsfähigen Größe der Kultur bei einer Temperatur vermehrt werden, bei der die Plasmid-Kopien-Zahl gesteuert und konstant ist, und danach können die Plasmide durch eine Temperaturveränderung in die ¹¹ runaway"-Temperatur vermehrt werden. Im Anschluß an die Vermehrung der Plasmide und während die Zellen noch lebensfähig und zur Vermehrung fähig sind, wird die Temperatur wieder auf die niedrige Temperatur geändert, bei der sich eine konstante Kopien-Zahl ergibt, und bei dieser geringeren Temperatur werden die entstandenen Bakterien, die die viel höhere Zahl an Plasmiden pro Zelle tragen, für die Produktion des fraglichen temperatursensitiven Proteins benützt. Es ist bekannt, daß es viele Organismen gibt, die bei Temperaturen über ungefähr 30⁰C nicht lebensfähig sind, und deren Proteine deshalb bei höheren Temperaturen denaturiert werden können. Deshalb mag sich diese Art der Temperatursteuerung als besonders wichtig erweisen, wenn Genprodukte, die solchen Organismen eigen sind, durch die DNS-Eekombination/Kloning-Technik hergestellt werden sollen.

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Wie oben erwähnt, kann das Plasmid, das das charakteristische temperaturabhängige Kopien-Zahl-Verhalten mit "runaway"-Replikation zeigt, durch Mutagenese von einem Eltern-Plasmid abgeleitet v/erden, das die Gene für die gewünschte Produktion enthält, jedoch nicht das charakteristische "runaway"-Verhalten. Für viele praktische Zwecke wird jedoch das bei der Kultivierung im Produktionsmaßstab verwendete Plasmid durch DNS-Rekombinations-Technik hergestellt, wobei als Klonierungs-Yektor ein geeignetes Plasmid verwendet wird, das die charakteristische temperaturabhängige "runaway"-Eeplikation zeigt. Dadurch werden die Vorteile der konventionellen DNS-Rekombinations-Technik mit den Vorteilen der Temperatursteuerung und der sehr hohen Zahl erhaltbarer Plasmid-Kopien pro Zelle mit der daraus folgenden erhöhten Produktion von Polypeptiden oder Proteinen, die durch das fremde DNS-Bruchstück gesteuert wird, vereint. Es wird angenommen, daß die sehr hohe Zahl von Plasmid-Kopien, die durch Verwendung eines Klonierungs-Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich ist, die Produktion großer oder zumindest vernünftiger Proteinraengen erlaubt, die, da sie genetisch relativ weit entfernt sind von dem in Frage stehenden Wirtsbakterium, bisher überhaupt nicht, oder jedenfalls nicht in zufriedenstellender Menge durch Klonierungstechniken hergestellt werden konnten. Daher hat der Klonier-Vektor-Aspekt der vorliegenden Erfindung eine sehr große Bedeutung.

Um als Klonierungs-Vektor brauchbar zu sein, sollte das Plasmid eine und nur eine Erkennungsregion für mindestens eine Restriktions-Endonuklease zeigen. Diese Erkennungsregion soll so beschaffen sein, daß nach Einfügung eines Bruchstückes fremder DNS an dieser Region die entstehende rekombinante DNS fähig ist, autonom zu replizieren. Und um die Vorteile der vorliegenden Erfindung zu erhalten, soll das Plasmid die Fähigkeit beibehalten, eine temperaturabhängige Charakteristik der Kopien-Zahl zu zeigen.

Die zur Verwendung bei der DNS-Rekombinations-Technik geeigneten Restriktions-Endonukleasen sind diejenigen, die sogenannte

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"kohäsive-Enden" sowohl an dem Klonierungs-Vektor als auch an dem DNS-Bruchstück ergeben. Mit anderen Worten sollen Einzelstrangregionen an den Enden der Moleküle mit komplementären Basensequenzen entstehen, die Basenpaarung mit identischen (komplementären) Sequenzen erlauben.

Wie aus den Beispielen hervorgeht, wurden Klonierungs-Vektoren hergestellt, die eine Erkennungsregion für eine Eestriktions-Endonuklease haben. Ferner wurden auch Vektoren hergestellt, die eine Erkennungsregion für eine Eestriktions-Endonuklease haben und eine andere Erkennungsregion für eine andere Eestriktions-Endonuklease. Ein vorteilhafter Weg, um Klonierungs-Vektoren, die die oben genannten E aingungen erfüllen, zu konstruieren, besteht oft darin, von einem größeren Plasmid, das die temperaturabhängige "runaway"-Eeplikation zeigt, ein "Miniplasraid" herzustellen, das klein genug ist, um nur eine Erkennungsregion für eine brauchbare Eestriktions-Endonuklease zu zeigen, aber doch groß genug ist, um noch die Gene zu enthalten, die unerläßlich für das spezifische temperaturabhängige Eeplikationsverhalten sind. Solche Miniplasmide können aus einem größeren Plasmid hergestellt v/erden, indem Bakterienklone isoliert werden, die entweder spontan aufgetretene oder jln vitro hergestellte (und danach transformierte) Miniplasmidabkömmlinge des Elternplasmids tragen. Die Isolierung der gewünschten Miniplasmide (oder der Bakterien, die sie enthalten) wird durch geeignete und gut bekannte Auswahl-und/oder Selektionsverfahren durchgeführt.

Grundsätzlich enthält ein idealer Klonierungs-Vektor so wenig Gene wie möglich, die für unerwünschte Proteine codieren. Für viele Zwecke ist es jedoch erwünscht, daß der Klonierungs-Vektor Gene enthält, die einen sogenannten Marker darstellen, der für die Identifizierung und/oder Selektion der das Plasmid tragenden Zellen brauchbar ist. Der am besten brauchbare Marker ist Antiobiotikaresistenz, da diese nach der Transformierung einer rekombinanten DNS in einem bakteriellen Wirt eine leichte

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Gegenselektion auf Bakterien, die das rekombinante Plasmid nicht erhalten haben, erlaubt. Es können jedoch auch Klonierungs-Vektoren ohne einen Marker als Klonierungs-Vektoren brauchbar sein, beispielsweise wenn die Gene, die durch Rekombination eingefügt werden, selbst einen Marker tragen. Wenn es erwünscht ist, einen Marker, z.B. Antibiotikaresistenz, in ein als Klonier-Vektor zu verwendendes Plasmid der vorliegenden Erfindung einzuführen, so kann das durch Transposition eines DNS-Bruchstückes auf eine Weise geschehen, die an sich bekannt ist. Ein Beispiel für eine solche Transposition ist in Beispiel 5 dargestellt. Ein anderer Weg, um ein fremdes DNS-Bruchstück, das eine Markerfunktion zeigt, einzufügen, wäre die DNS-Rekombinations-Technik, diese würde jedoch eine Erkennungsregion für Restriktion auf dem Klonierungs-Vektor verbrauchen; sie kann deshalb nur in solchen Fällen benützt werden, in denen der Klonieru.ngs-Vektor mindestens zwei Restriktions-Erkennungsregionen hat, die für die DNS-Rekombinations-Technik brauchbar sind.

Eine v/eitere Möglichkeit zur Herstellung eines Klonierungs-Vektors gemäß vorliegender Erfindung besteht darin, daß durch Mutagenisieren die oben beschriebene temperaturabhängige "runawa3'"-Replikation in einen bestehenden Klonierungs-Vektor eingeführt wird, von dem man >;eiß, daß er gut in einem gewünschten Organismus funktioniert, z.B. das Plscmid pSC1O1, das ein guteingeführter Klonierungs-Vektor in E^ £oLi_ ist.

Methoden, die in den Beispielen benützt wurden.

Es wurden verschiedene Stämme von Escherichia coli K-12 (Tabelle 1) und Plasmide (Tabelle 2) benützt.

Die benützten experimentellen Techniken waren Standardtechniken, wie sie in mikrobiologischer Genetik (J. Miller, Methods in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory) und beim Genetic Engineering (T. Tanaka und B. Weissblum, J. Bacteriol. 212 (1975) 354-362) angewandt werden.

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QO
QO

Tabelle 1 Escherichia coli K-12 Stämme

Stamm

Genotyp Quellenangabe

EC1005 DIl
C600
UB1731

1100

Table 2.

Plasmid

Rldrd-19 PSF2124

thi, met, nal, relA thi, his, pro, trp, strA thi, Iac, leu, thr Grindsted £t al, J. Bact. 110 (1972) 529. Boman et al, Genet. Res. I_-^ (1968) 169. Appleyard, R.K., Genetics 39 (1954) 440.

thi) met, pro, amp (Tn8O2),nal Bennett, P.M. and M.H. Richmond, J.Bact.

(1976)

thi, endol

Plasmide Quellenangabe

Meynell & Datta, Nature _2M (1967) 885.

So e^ al_, Molec. gen. Genet. 1£2 (1975) 239

Das Plasmid R1 ist ein übertragbares Plasmid, das Resistenz gegen die folgenden Antibiotika verursacht: Ampicillin, Chloramphenicol, Kanamycin, Streptomycin und Sulphonamide. Das Plasmid hat ein Molekulargewicht von 65 x 10 Daltons. Normalerweise liegt das Plasmid in Escherichia coli in ungefähr einer Kopie pro Chromosomenäquivalenz vor. Es ist möglich, durch eine Mutation in diesem Plasmid die Kopien-Zahl um ein Mehrfaches über dieses Niveau anzuheben. Diese Mutanten werden Kopien-Mutanten genannt (K. Nordström et al., J. Bacteriol. 110, 562-569 (1972)).

In den Beispielen werden folgende Stufen beschrieben:

Beispiel 1: Isolierung einer Plasmid-Mutante (pKH3O1), die

eine "temperaturabhängige Replikationssteuerung hat. Die Kopien-Zahl dieses Plasmids steigt um ungefähr das Vierfache bei höherer Temperatur.

Beispiel 2: Die Isolierung einer Mutante (pKIWOO) vom Plasmid pKN301, der eine Replikationssteuerung bei höherer Temperatur fehlt (eine runaway-Mutante).

Beispiel 3- Die Isolierung eines Miniplasmids (ρΚΝ402) vom Plasmid pKN^OO, das das "runaway"-Verhalten beibehält, aber nur eine Erkennungsregion für die Restriktions-Endonuklease EcoR1 hat.

Beispiel 4: Die Isolierung eines anderen Miniplasmids von einem Abkömmling des Plasmids pKN400, das das "runaway"-Verhalten beibehält, aber nur eine Erkennungsregion für die Restriktions-Endonuklease EcoR1 hat.

Beispiel 5: Die Insertion eines Resistenzmarkers gegen Antibiotika in das Miniplasmid pKN402 durch Translokation, um das Miniplasmid pKN403 zu erhalten.

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Beispiel 6: Die Insertion eines Gens für Streptomycinresistenz in das Miniplasmid pKN403 und dessen Klonierung.

Fig. 1 zeigt die Eigenschaften einer ^Mrunaway"-Replikations-Plasmid-Mutante. Den Stamm D11, der entweder das Plasmid R1drd-19 (o) oder das Plasmid pkN400 (A) trägt, läßt man logarithmisch in LB-Medium bei verschiedenen Temperaturen wachsen.

Fig. 1a) Die Menge von !covalent geschlossener zirkulärer DNS (covalentIy closed circular DHA = ccc) wurde,

■ζ
nach Markierung mit -Ή-Thymidin durch Ethidiumbromid-Caesiumchlorid-Gradienten-Zentrifugation bestimmt. Der Gehalt an Plasmid-DNS wurde als prozentualer Anteil der chromosomalen DNS berechnet.

Fig. 1b) Der Gesamtanteil der DNS und des Proteins der Zellen wurde chemisch gemessen und das Verhältnis DNS/ Protein wird in einem relativen Maßstab dargestellt, wobei der Wert des Stammes D11-R1drd-19 bei 30⁰C als 100 % gesetzt wird.

Fig. 1c) Die Wachstumsrate (Verdoppelung/Stunde) wurde durch Messen der optischen Dichte in einem Klett-Summerson Colorimeter bestimmt.

Fig. 2 zeigt die relative Erhöhung des auf das Plasmid zurückgehenden ß-Lactamase-Gehalts und d_es Gesamtproteins des Stammes D11-PKN400 bei 40⁰C. Eine in LB-Medium bei 30⁰C logarithmisch wachsende Kultur wurde in 40⁰C überführt. Während des nachfolgenden Wachstums wurden Proben entnommen und auf ihren Gehalt an ß-Lactamase und Gesamtprotein untersucht. Der relative Zuwachs nach der Temperaturänderung wurde auf Logarithmenpapier graphisch dargestellt.

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Pig. 3 zeigt den Plasmid-DNS-Gehalt des Stammes C600-pKN402. Kulturen von C600-pKN402, die in LB-Medium gewachsen und mit

H-Thymidin markiert worden waren, wurden Ethidiumbromid-Zentrifugation untersucht.

H-Thymidin markiert worden waren, wurden durch Caesiumchlorid

Fig. 3a) zeigt das Ergebnis nach logarithmischem Wachstum bei 3O⁰C und

Fig. 3b) zeigt das Ergebnis nach 3 Stunden Wachstums bei 40°C.

Die Dichte der Gradienten steigt von rechts nach links und die Gesamtzahl der Fraktionen betrug 63 (Fig. 3a), bzw. 52 (Fig. 3b).

Fig. 4 zeigt eine Untersuchung von EcoRI-Restriktions-Bruchstücken von in_ vitro kontruierten Hybrid-Plasmiden. Gereinigte Plasmid-DNS wurde mit EcoRI-Endonuklease geschnitten und das Bruchstück-Muster durch Agarose-Gel-Elektrophorese untersucht. Nach Behandlung mit Ethidiumbromid-Lösung wurde das Gel bei Beleuchtung durch UV-Licht fotografiert. Von links handelt es sich um folgende Plasmide: Der Klonierungs-Vektor pKN403, zwei von pEN403 ausgehende Hybrid-Plasmide (pKN404, pKN4O5), das Plasmid R1drd-19 als Referenz und das Plasmid pKN402 als Vergleich. Die Bezeichnungen der EcoRI-Bruchstücke des Plasmids R1drd-19 sind rechts aufgeführt.

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Beispiel 1

Eine 40 ml-Kultur des Stammes EC1OO5» der das Plasmid R1drd-19 enthält, ließ man bei 3O°C in einem Medium aus säurehydrolisiertem Kasein wachsen. Bei einer

Zelldichte von ungefähr 10 Zellen/ml wurden die Zellen gekühlt und durch Zentrifugation bei 4⁰C geerntet. Die Zellen wurden einmal in isotonischer NaC1-Lösung gewaschen, in 1M Hydroxylaminhydrochlorid (pH 6.0) wieder aufgenommen, und bei 37°C 20 Minuten lang inkubiert. Nach der Mutagenese wurden die Kultur vorn Mutagen gereinigt und in EB-Medium (30°C) zu einer

Zelldichte von ungefähr 10^r Zellen/ml verdünnt. Diese Kultur wurde in 4 Aliquots geteilt und die Inkubation bei 30°C weitergeführt. Nach 60 Minuten bei 30°C wurde Chloramphenicol (300 μg/πll) dazugegeben und 10 Min. später Ampicillin (4000 jig/ml). Die Inkubation wurde für weitere 60 Min. fortgesetzt. Die überlebenden Zellen wurden geerntet, zweimal in LB-Medium (40°C) gewaschen und in LB-Mediutn (40°C) in einer Zelldichte von unge- ·

fähr 5 x 10 Zellen/ml wieder aufgenommen. Die Kulturen wurden für 30 Min. bei 40°C inkubiert, und die Zellen in den Kulturen

dann auf LA-Platten plattiert, die unterschiedliche Konzentrationen von Ampicillin enthalten (300-2000 pg/ml). Die Platten wurden über Nacht bei 40⁰C inkubiert und die überlebenden Kolonien isoliert und auf ihr Resistenzmuster bei 30°C und 40⁰C geprüft. Zellen, die eine Ampicillin-Resistenz von mindestens 500 jig/ml bei 40°C besitzen, wurden mit einer Häufigkeit von 10 gefunden. 400 Kolonien, isoliert von 5O0-2O0Ojig Ampicillin/ml wurden abgeimpft, weiter vermehrt und auf temperaturabhängige Resistenz untersucht. 5 Klone, 4 davon aus einzelnen Unterkulturen, zeigten einenmehr als 3-fachen Unterschied in der Resistenz zwischen 30⁰C und 40⁰C. Nach der Überführung des Plasmids in einen unmutagenisierten Stamm EC1005» wurde die Resistenz gegen Ampicillin, Streptomycin und Chloramphenicol bestimmt. Alle 5 Klone zeigten eine 3-bis 5-fach erhöhte Resistenz zeigen alle drei Antibiotika bei 40⁰C, verglichen mit 30°C. (Das Eltern-Plasmid zeigte beispielsweise eine Resistenz von und 125 ug Ampicillin/ml bei 30⁰C und 40°C). Eine der Mutanten,

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nämlich pKN3O1, wurde mit größerer Genauigkeit untersucht. Dieses Plasmid hat dasselbe Molekulargewicht wie das EItern-Plastnid R1drd-19 (65 x 10⁶ Daltons).

Untersuchung der Kopien-Zahl des Plasmids pKN3O1♦

Der Plasmidgehalt wurde auf zwei Weisen gemessen, durch Bestimmung der CCC-DNS und über die spezifische Aktivität von ß-Lactamase.

Die Menge von CCC-DNS für jedes unter verschiedenen Wachstumsbedingungen erhaltene Plasmid wurde sowohl als Menge des schnell-sedimentierenden Materials in einem alkalischen Sucrosegradienten als auch als Anteil einer Nebenbande in einem Farb-Caesiumchlorid-Schwinnndichte-Gradienten gemessen (Tabelle 3)· Wenn die Mutante bei einer höheren Temperatur wächst, zeigt sie 3 bis /j. mal so viel Plasmid-DNS, als dasselbe Bakterium, wenn es das Plasmid R1drd-19 enthält, während bei einer niedrigen Temperatur der Anteil an Plasmid-DNS in der Nähe desjenigen des Eltern-Plasmids lag.

Tabelle 3

Plasmid-Kopien-Zahl von Zellen, die das Plasmid pKN3O1 tragen, bei verschiedenen Temperaturen^

Temperatur Kopien-Zahl '

(⁰C) pKN3O1

30 .1.2

34 1-3

35 1.7 37 4.0

39 4.1

40 3-4 44 3-7

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a) Als Wirt wurde der Stamm EC1005 benutzt.

b) Die Kopien-Zahl wurde ermittelt durch Bestimmung des Verhältnisses CCC-DNS/chromosomaler DNS durch Farbcaesiuittchlorid-Dichtegradienten. Die Werte werden relativ zum Eltern-Plasmid Ridrd-19 angegeben, dem bei jeder Temperatur der Wert 1 gegeben wird.

Beispiel 2 Isolierung einer "runaway'^Replikations-Plasmid-Mutante (pKN400).

Wie in Beispiel 1 beschrieben, ist es offensichtlich, daß, wenn die Mutation im Plasmid pKN301 deutlich wird, die Kopien-Zahl noch sorgfältig kontrolliert ist. Diese temperaturabhängige Kopien-Zahl-Mutante wurde bei der Suche nach Plasmidmutanten, die, unter einer Bedingung,bei der die Mutation erkennbar wird, keine Steuerung der Kopien-Zahl haben, als Eltern-Plasmid benützt. Es wurde eine zweite Mutation eingeführt, die das Kopien-Zahl-Niveau von pKN301 bei 30°C beeinflußt. Dann wurde das Verhalten der Mutante bei höherer Temperatur überprüft:

Der Stamm 1005, der das Plasmid pKN301 trägt, wurde mit Xtbylmethansulfonat , mutagenisiert und Klone mit erhöhter Resistenz gegen Ampicillin auf Platten bei 30°C selektiert. Dann wurden die Klone bei verschiedenen Temperaturen überprüft, und einige dieser Isolate zeigten eine drastisch verringerte Lebensfähigkeit bei 37°C und 4-2⁰C. Durch Überführung des Plasmids in einen unmutagenisierten Wirtsstamm durch Konjugation, wurde gezeigt, daß die verringerte Lebensfähigkeit durch das mutierte Plasmid verursacht wurde. Eins der Isolate wurde für die weitere Arbeit ausgesucht. Für die Übertragung auf den unmutagenisxerten Wirt (Stamm D11) wurde die Selektion auf den Plasmidempfanger durch die Selektion von Zellen durchgeführt, die resistent gegen

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Chloramphenicol waren (25 ug/ml), und der Empfänger, der nun das Plasmid trägt, wurde anschließend auf die Anwesenheit anderer Plasmid-verursachter Resistenzen überprüft. Das Plasmid eines Klons, das alle E1-verursachten Resistenzen zeigt, wurde pKMOO genannt. Einige der Eigenschaften von pKiM-00 im Stamm D11 sind in Fig. 1 dargestellt, die die Ergebnisse zusammenfaßt, nachdem die Zellen bei einer anderen Temperatur gewachsen sind. Man erkennt einen drastischen Anstieg der Plasmid-DNS-Menge bei Temperaturen über 3^⁰C (Fig. 1a). Ein ähnlicher Anstieg wurde für die Gesamtmenge an DNS in der Zelle gezeigt (Fig. 1b), ebenfalls ein entsprechendes Absinken der Wachstumsrate der Zellen (Fig. 1c). Bei Temperaturen über 35°C wu&hsen die Bakterien nicht bis zu einer meßbaren Menge.

Wenn eine Kultur, die bei 3O⁰C wuchs, in 37°C (oder 4O°C) überführt wird, konnte gezeigt werden, daß bei der höheren Temperatur keine Steuerung der Kopien-Zahl mehr vorhanden ist, um die Plasmid-Replikation zu regeln. Die Plasmid-Kopien-Zahl erhöht sich dann logarithmisch, was schließlich für die Wirtszelle tödlich ist. Ein wichtiger Befund ist der, daß, während einer solchen Temperaturänderung, die Gene des Plasmids den gesamten Zeitabschnitt hindurch,in dem die Plasmidmenge anwächst, exprimiert werden. Der darauf zurückzuführende Gen-Dosis-Effekt ist in Fig. 2 dargestellt, die das Anwachsen der Gesamtmenge dies Proteins und der plasmidbedingten ß-Lactamase zeigt.

Beispiel 3

Ein Miniplasmid mit temperaturabhängiger "runaway"-Replikation (pKN402).

Vor einigen Jahren wurde entdeckt, daß eine Plasmid-Kopien-Mutante spontan Ausgangspunkt für kleinere Plasmidabkommlinge, Miniplasmide, sein kann, die in der Lage sind, sich autonom zu

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replizieren (Goebel und Bonewald, J. Bact. 125 (1975), 658-665). Später wurde eine große Anzahl solcher Miniplasmide von verschiedenen Kopien-Mutanten isoliert. Es wurden Miniplasmide von verschiedenen Größen erhalten, mit Molekulargewichten bis hinunter zu 4 χ 10 DaItons. Es zeigte sich, daß das "runaway"-Eeplikations-Mutanten-Plasmid pKN400 ein guter Ausgangspunkt war, um Miniplasmide zu isolieren, besonders, wenn durch Wachstum der Wirtszellen bei höherer Temperatur ungesteuerte Plasmid-Eeplikation erlaubt wurde.

Nach der Übertragung des pKN400 in den Stamm C600 schienen einige Klone sehr instabil im Hinblick auf die Erhaltung des Plasmids zu sein, wie nach Überprüfung (bei 30⁰C) der plasmidbedingten Antibiotikaresistenz vermutet werden kann. In einigen Fällen konnte jedoch der temperaturempfindliche Phänotyp erhalten werden, obwohl die Zellen keine Resistenz gegen Antibiotika mehr trugen. Durch Agarose-Gel-Elektrophorese konnte gezeigt v/erden, daß diese Zellen ein Plasmid tragen, und in allen Fällen betrug das Molekulargewicht ungefähr 5 x 10 Daltons. Ein derartiger Klon wurde für die weitere Arbeit ausgewählt und das Plasmid wurde pKN402 genannt. Experimente mit Temperaturveränderung zeigten, daß dieses Miniplasmid das gleiche temperaturabhängige Verhalten äußert wie das große Plasmid (pKN400). Der Anteil der Plasmid-DNS im Stamm C600/pKN402 wurde nach Wachstum bei 30⁰C (Fig. 3a) und nach ungefähr 3 Stunden Wachstum bei 40⁰C (Fig. 3b) durch Caesiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichte-Gradientenzentrifugation bestimmt. Da das Molekulargewicht von pKN402 schätzungsweise 4,65 x 10 Daltons beträgt, kann vermutet werden, daß ungefähr 50 Plasmid-Kopien pro Zelle bei 30⁰C vorliegen, und nach der Temperaturänderung die Anzahl auf etwa 5000 Kopien pro Zelle anwächst. Für die Zerlegung mit Restriktions-Endonukleasen wurde die DNS von pKN402 durch Ethidiumbromid-Caesiumchlorid-Gradienten-Zentrifugation gereinigt. Es wurde gefunden, daß das Schneiden mit der EcoRI-Endonuklease ein lineares Molekül liefert; d.h., daß auf dem pKN402-Plasmid eine Erkennungsregion für das Enzym liegt. Dies ist ein sehr wichtiger Befund, wenn die Nützlichkeit

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dieses Plasmids als Klonierungs-Vektor in Erwägung gezogen wird.

Der Stamm E^ coli K 12 C600/pKN402 ist in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstr. 8, D-34-OO Göttingen (im folgenden DSM genannt) unter der Nr. DSM 1228 hinterlegt.

Beispiel

Ein weiteres Miniplasmid mit temperaturabhängiger "runaway"-Replikation (pKNA-10).

Mit einem anderen Verfahren wurde ein weiteres Miniplasmid, das vom Plasmid pKN4-O1 (einem Abkömmling des Plasmids pKN4OO, das die Eesistenz gegen Kanamycin verloren hat) abgeleitet wurde, isoliert. Die Plasmid-DNS (pKN401) wurde in vitro mit dem Restriktionsenzym EcoR1 geschnitten und danach mit dem Enzym DNS-Ligase behandelt, um die Enden der erhaltenen linearen DNS-Bruchstücke fest miteinander zu verschmelzen. Die DNS wurde in E_^ coli C600 Zellen transformiert und Klone, die gegen Ampicillin resistent waren, isoliert und weiter überprüft. Von einem dieser Klone, der einen Phänotyp ähnlich solchen E_-_ coli Zellen zeigt, die das Plasmid ρΚΝ4Ό1 (Temperaturempfindlichkeit) tragen, konnte gezeigt werden, daß er ein Plasmid von der Größe 12 χ 10⁶ Daltons (pKN410) trägt.

Es wurde gefunden, daß die Kopien-Zahl dieses Plasmids bei 3O°C ungefähr 20 Kopien pro Zelle betrug und ungefähr 2000 Kopien pro Zelle bei einer Temperatur über 37°C

Die Anwesenheit des Gens für Ampicillinresistenz auf dem Plasmid wurde über Transformation nachgewiesen. Eine Zerlegung durch Restriktionsenzyme zeigte, daß pKN410 nur eine Erkennungsregion für das Restriktionsenzym EcoR1 und nur eine Erkennungsregion für das Restriktionsenzym BamH1 trägt.

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Kulturen aus Zellen, die pKN4-1O tragen, zeigen genau dasselbe Wachstumsmuster nach einer Temperaturänderung von 30 C auf 40 C, wie das Eltern-Plasmid pKN400, und es zeigte sich ein ähnliches Anwachsen der auf das Plasmid zurückzuführenden Menge an ß-Lactamase

Der Stamm E^ coli K12 C600/pKII410 ist bei der DSM unter der Nr. 123C hinterlegt.

Beispiel 5

Einführung eines Gens für Ampicillinresisteiiz in das Minplasmid pKN402, um das Miniplasmid pKN4O3 zu erhalten.

Das Plasmid pKN402, von dem man weiß , daß es die wichtigen Eigenschaften der temperaturabhängigen Replikation und die Anwesenheit von nur einer Erkennungsregion für das Restriktionsenzym EcoRI hat, besitzt keinen Marker, der für die Selektion nach Bakterienklonen, die das Plasmid beherbergen,benützt werden kann. Da der nächste Schritt nach der in vitro Verbindung von DNS-Bruchstücken mit dem Vektor die Transformation der DNS in kompetente Bakterienzellen ist, ist es von Vorteil, daß transformierte Zellen leicht gefunden werden können. Deshalb tragen die meisten Klonierungs-Vektoren ein Gen für Antibiotikaresistenz, welches Genzellen, die den Vektor enthaltenen einem Medium, da das entsprechende Antbiotikum enthält, überleben ermöglicht. Es wurde ein Plasmid von pEN402 hergestellt, das die Gene enthält, die für ß-Lactamase codieren, d.h. daß der Klonierungs-Vektor gegen Penicilline resistent ist:

Der erste Schritt bei der Konstruktion des penicillinresistenten Abkömmlings von pKN402 war die Überführung des -T_nA Transposons in den E^ coli-Stamm, der das Plasmid pKK4O2 trug. (Eine Beschreibung von Transposons ist bei Kleckner, Cell 11. (1977) 11-23), zu finden.)

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Dieser Schritt wurde als Transduktion mit dem Bakteriophagen P1 durchgeführt. Der Stamm Ε_^ coli K12, UB1731 trägt das Transposon Tn802 (TnA) auf dem bakteriellen Chromosom.

Eine Kultur dieses Stammes wurde mit dem Bakteriophagen P1 infiziert und Phagen-Nachkommen hergestellt. Diese Phagennachkominen wurden benützt, um den Stamm C600/pKN402 zu transduzieren. Die mit P1 infizierten Zellen wurden auf Platten verteilt, die Ampicillin enthalten (50 ug/ml). Kolonien, die auf diesen Platten wachsen, wurden gereinigt und auf Ampicillinresistenz und Temperaturempfindlichkext überprüft. (Alle Verfahren sind bei J. Miller in*Methods in Molecular Biology beschrieben). Wenn Tn802 in das Chromosom von E^ coli eingefügt wurde,wurden die Zellen gegen ca. 300 ug/ml Benzylpenicillin resistent. Wenn jedoch das Transposon in ein Viel-Kopien-Plasmid eingefügt ist, ist das Resistenzniveau viel höher. Es wurde deshalb unter den transduzierten C600/pKN4-02 Zellen nach Klonen selektioniert, die gegen 1000 jug/ml Benzylpenicillin resistent \yaren. Da pEN402 bei 30⁰C in ca. 50 Kopien pro Zelle vorliegt, war zu erwarten, daß eine Translokation von Tn802 in pKN402 eine höhere Penicillinresistenz nach sich ziehen würde. Für weitere Untersuchungen wurden 4 Kolonien von 0600/ρΚΝ^02, die auf 1000/ig/ml Benzylpenicillin gewachsen waren, selektiert. Als der Plasmidgehalt dieser 4· Klone untersucht wurde, hatte einer nur eine Art von Plasmid mit einem Molekulargewicht von ca. 8 χ 10 . (Die Einfügung von Tn802 zieht eine Erhöhung des Molekulargewichts des Plasmids um 3,2 χ 10 nach sich). Dieser Klon wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt und das Plasmid wurde pKN4-O3 genannt. Um nachzuweisen, daß pKN403 alle Eigenschaften von pKN402 hat und zusätzlich das Tn802-Transposon trägt, wurde die Plasmid-DNS aus dem Stamm C600/pKN403 hergestellt und mit dieser DNS ein anderer Stamm von E^ coli K12 transformiert. Die transformierten Zellen ließ man auf Platten wachsen, die Ampicillin enthielten (50^g/ml). Eine Kolonie, die auf einer solchen Platte wuchs,'wurde auf die Anwesenheit des Plasmids und auf Temperaturempfindlichkeit untersucht. Es wurde gefunden,

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daß die ampicillinresistenten Zellen ein Plasmid von der gleichen Größe wie pKN403 enthielten, und daß sie temperaturempfindlich waren. Die DNS von pKN403 wurde hinsichtlich der Zahl der Erkennungsregionen für die Restriktionsenzyme EcoRI und BamHI untersucht und es wurde gefunden, daß das Plasmid pKN4-O3, genau wie pKN4-O2,nur eine EcoB1 Erkennungsregion hatte. Zusätzlich trägt pKN403 eine Schneidestelle für BamH1 (vermutlich in der Tn802-Sequenz). Dadurch können mindestens zwei Enzyme benützt werden, wenn pKN4O3 als Klonierungs-Vektor verwendet wird.

Bei einem Teinperaturwechsel von 3O°C nach 4O°C beendet die Kultur bald danach das Wachstum. Die Kopien-Zahl kann auf einem hohen gleichmäßigen Niveau gehalten werden, wenn eine mittlere Temperatur benützt wird (z.B. 34°C).

Der Stamm E^ coli K12 C600/pKN403 ist bei der DSM unter der Nr. 1229 hinterlegt.

Zusammenfassung der Eigenschaften temperaturabhängiger Klonierungs-Vektor en.

Die Beispiele beschreiben die Isolierung und Charakterisierung von drei kleinen Plasmiden, die alle als Klonierungs-Vektoren benützt werden können.

Einem Plasmid (pKN402) fehlt jeder Antibiotikaresistenz-Marker. Er kann daher benützt werden, wenn die DNS, die in den Vektor eingefügt werden soll, einen für die Selektion nützlichen genetischen Marker hat, oder wenn anschließend an die Rekombination die Auslese nach Plasmiden mit erhöhtem Molekulargewicht durchgeführt wird. Dieser Vektor kann sehr nützlich bei der Konstruktion anderer Vektoren oder bei der Rekombination mit DNS, die verschiedene genetische Marker trägt, sein. Im Plasmid pKB'403 erleichtert die Anwesenheit eines Gens für Ampicillinresistenz eine Selektion nach plasmidtragenden Zellen. Das Plasmid pKN410

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schließlich, das Gene für Ampicillinresistenz trägt, zeigt die Wachstumscharakteristiken von pKN400 nach einer Temperaturänderung auf 40⁰C. Dieses Plasmid ist bei 3O°C in einer niedrigen Zahl (20 Kopien/ZeUe) anwesend.

Alle diese Plasmide haben eine Erkennungsregion für das Eestriktionsenzym EcoR1.

Beispiel 6

Klonierung eines Gens für Streptomycin-Resistenz auf dem Plasmid pKN403»

Hit dem Vektor pKN403 wurde ein Klonierungsexperiment durchgeführt, i-ⁿ dem ein EcoEI-Bruchstück, das das streptomycin-resistenzbewirkende Gen trägt, in den Vektor eingefügt wurde. Als Quelle für das Gen für Streptomycin-Resistenz wurde ein früher konstruiertes Hybriä-Plasmid benützt, das aus dem Plasmid pSF2i24 und dem EcoR1-Bruchstück G des Plasmids R1drd-19 besteht. Die gereinigte DNS des Vektors pKN4O3 und das erv/ähnte Hybridplasmid wurden gemischt und mit der EcoRI-Endonuklease geschnitten, um lineare Bruchstücke zu erhalten. Die DNS wurde dann mit PoIynukleotidligase behandelt und in E. coli Zellen transformiert. Es wurden Zellen selektioniert, die bei 30⁰C resistent gegen Ampicillin und Streptomycin waren. So erhaltene Klone wurden auf Wachstum bei 40⁰C überprüft und bei den meisten von ihnen zeigte sich, daß sie unfähig waren, bei dieser Temperatur zu wachsen. Weitere Untersuchungen dieser Klone zeigten, daß sie Plasmide von genau dem Molekulargewicht trugen, das für ein Hybridplasmid, bestehend aus dem Plasmid pKN403 und dem Bruchstück G vorhergesagt werden konnte. Fig. 4 zeigt das EcoEI-Bruchstückmuster zweier solcher Hybridplasmide (pKN404, pKN40$). Es wurde auch gezeigt, daß die Vermehrung der Plasmid-DNS bei 37 bis 40⁰C im
gefunden wurde.

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37 bis 40⁰C im Fall von pKN404 ähnlich war, wie es für pKN403·

Es kann daher geschlossen werden, daß das Einfügen eines DNS-Bruchstückes in die EcoR1 -Erkennungsregion des Vektors und die dadurch erfolgte Konstruktion eines rekombinierten DNS-Moleküls die günstigen Eigenschaften des Vektors bezüglich der Vermehrung von DNS und/oder von Genprodukten nicht verändert.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Herstellen eines Genprodukts von DNS, gekennzeichnet durch

Kultivieren von Bakterien, die ein Plasmid tragen, das beim Kultivieren der Wirtsbakterien bei einer ersten Temperatur eine gesteuert konstante Plasmid-Kopien-Zahl aufweist und beim Kultivieren der Wirtsbakterien bei einer von der ersten Temperatur abweichenden, zweiten Temperatur eine geänderte Steuerung der Plasmid-Kopien-Zahl zeigt, die eine viel höhere oder völlig ungesteuerte Kopien-Zahl erlaubt,

unter Bedingungen, die zumindest einen Zeitabschnitt des Wachstums bei oder in der Nähe der zweiten Temperatur einschließen,

und Gewinnen eines Genprodukts des Plasmids aus der Bakterienkultur.

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TELBKOPIERER

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η nz e i ch η e t, daß bei oder in der Nähe der ersten Temperatur kultiviert wird, solange angeimpft und bis zum Erreichen einer für eine produktionsfähige Kultur ausreichenden Zellzahl vermehrt wird, und daß danach durch Kultivieren bei der zweiten Temperatur die Herstellung des Genprodukts durchgeführt wird, unldaß dieses gewonnen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei der zweiten Temperatur fortgesetzt wird, bis das Wachstum der Bakterien durch die Produktion des Plasmids und/oder dessen Genprodukts gehemmt wird.

4-, Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung im Produktionsmaßstab kontinuierlich bei oder in der Nähe der zweiten Temperatur durchgeführt wird, um das Überleben der Wirtszellen unter gleichzeitiger Bildung einer erhöhten Menge von Genprodukten des Plasmids zu ermöglichen, wobei das Genprodukt des Plasmids kontinuierlich oder schrittweise aus der Kultur entnommen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Vermehrung der Bakterienkultur auf eine produktionsfähige Größe die Temperatur auf die zweite Temperatur verändert wird und diese für einen einerseits genügend langen Zeitraum beibehalten wird, um eine wesentliche Vermehrung des Plasmids zu erhalten, andererseits dieser Zeitraum genügend kurz gewählt wird, um jeglichen wesentlichen Schaden der Bakterienkultur zu vermeiden, daß danach die Temperatur wieder auf die erste Temperatur geändert wird, und daß die Produktionskultivierung der die erhöhte Plasmid-Kopien-Zahl aufweisenden Kultur bei der genannten ersten Temperatur fortgesetzt wird.

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6. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Temperatur höher ist als die erste Temperatur.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtsbakterien mesophil sind und die erste Temperatur "bis zu 32°C "beträgt, wohingegen die zweite Temperatur über 36°C liegt.

8. Bakterium, das ein Plasmid trägt, welches bei seiner Kultivierung bei einer ersten Temperatur eine gesteuert konstante Plasmid-Kopien-Zahl aufweist, und das bei seiner Kultivierung bei einer von der ersten abweichenden Temperatur eine geänderte Steuerung der Plasmid-Kopien-Zahl zeigt, die eine viel höhere oder völlig ungesteuerte Kopien-Zahl erlaubt.

9. Bakterium nach Anspruch 8, das ein mesophiles Bakterium ist, und bei dem die erste Temperatur bis zu 32⁰C beträgt, wohingegen die zweite Temperatur oberhalb 36° C liegt.

"10. Bakterium nach Anspruch 9 vom Stamm Escherichia coli.

11. Verfahren zum Herstellen eines Bakteriums nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Plasmidtragende Bakterien mutagenisiert werden, und von diesen mutagenisierten Bakterien ein Klon isoliert wird, bei dem die Plasmid-Kopien-Zahl gesteuert ist, wenn die Bakterien bei einer Temperatur kultiviert werden und bei dem die Plasmid-Kopien-Zahl sehr viel höher oder völlig ungesteuert ist, wenn die Bakterien bei einer von der ersten Temperatur verschiedenen Temperatur wachsen.

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12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutagenisierung eine erste Stufe umfaßt, in der ein Plasmid-tragender Bakterienklon isoliert wird, dessen Plasmid eine Steuerungscharakteristik der Plasmid-Kopien-Zahl bei einer ersten Temperatur und eine andere, eine höhere Kopien -Zahl erlaubende Steuerungscharakteristik bei einer anderen zweiten Temperatur zeigt, sowie eine zweite Stufe, in der ein Plasmid-tragender Bakterienklon erhalten wird, dessen Plasmid eine viel höhere oder völlig ungesteuerte Kopien-Zahl bei der genannten zweiten Temperatur zeigt.

13- Verfahren nach Anspruch 12, dadurch g e k e η η-z ei chn et, daß bei der Isolierung der Bakterienklon, dessen Plasmid eine viel höhere oder völlig ungesteuerte Kopien-Zahl bei der zweiten Temperatur aufweist, als Mutante selektiert wird, die eine erhöhte, aber gesteuert konstante Kopien-Zahl bei der genannten ersten Temperatur zeigt.

14. Plasmid, das eine gesteuert konstante Plasmid-Kopien-Zahl zeigt, wenn das Plasmid tragende Wirtsbakterien bei einer ersten Temperatur kultiviert werden, und das eine andere Steuerung der Plasmid-Kopien-Zahl aufweist, die eine viel höhere oder völlig ungesteuerte Kopien-Zahl erlaubt, wenn die Wirtsbakterien bei einer unterschiedlichen, von der ersten abweichenden zweiten Temperatur wachsen.

15· Plasmid nach Anspruch 14-, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Temperatur höher ist als die erste.

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16. Plasmid nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß die erste Temperatur bis ungefähr. 32⁰C und die zweite Temperatur ungefähr 36⁰C beträgt.

17· Plasmid nach einem der Ansprüche 14- - 16, und als Kolonierungsvektor "brauchbar, gekennzeichnet durch eine und nur eine Erkennungsregion für wenigstens eine Restriktionsendonuklease, wobei die Erkennungsregion so beschaffen ist, daß nach der Einfügung eines Bruchstücks fremder DNS an dieser Region, die resultierende rekombinante DNS fähig ist, autonom zu replizieren, wobei die Fähigkeit beibehalten wird, eine gesteuert konstante Plasmid-Kopien-Zahl zu zeigen, wenn die Wirtsbakterien, die die rekombinante DNS enthalten, bei einer ersten Temperatur kultiviert werden, sowie eine veränderte Plasmid-Kopien-Zahl-Steuerung mit viel· höherer oder völlig ungesteuerter Kopienzahl zu zeigen, wenn die Wirtsbakterien, die die rekombinante DNS enthalten, bei einer zweiten Temperatur wachsen.

18. Plasmid nach Anspruch 17» dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungsregion von einer Restriktionsendonuklease erkennbar ist, die einen einzelsträngigen Abschnitt mit komplementärer Basensequenz an den Enden des Moleküls erzeugt, so daß eine Basenpaarung mit identischen Sequenzen ermöglicht wird.

19· Plasmid nach einem der Ansprüche 14-18, gekennzeichnet durch einen Marker zum Identifizieren und/oder Selektieren von Zellen, die das Plasmid tragen.

20. Plasmid nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker ein Gen ist, das dem Wirtsbakterium Antibiotika-Resistenz verleiht.

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21. Plasmid nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Antibiotika-Resistenz Ampicillin-Resistenz ist.

22. Verfahren zum Herstellen eines Plasmids nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß ein Plasmid mutagenisiert wird und ein Bakterienklon isoliert wird, der ein mutagenisiertes Plasmid trägt, das eine gesteuerte Plasmid-Kopien-Zahl zeigt, wenn die Bakterien bei einer ersten Temperatur kultiviert werden und das eine viel höhere oder völlig ungesteuerte Plasmid-Kopien-Zahl zeigt, wenn die Bakterien bei einer zweiten Temperatur wachsen.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutagenese _in vivo durchgeführt wird, indem Plasmid-tragende Bakterien mutagenisiert werden.

24-, Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß gereinigte Plasmid-DNS in vitro mutagenisiert wird und das mutagenisierte Material in Bakterienzellen transformiert wird, um Mutantenklone zu isolieren, die eine Plasmidmutante tragen, welche eine gesteuerte Plasmid-Kopien-Zahl zeigt, wenn die Bakterien bei einer ersten Temperatur kultiviert werden, und eine viel höhere oder völlig ungesteuerte Plasmid-Kopien-Zahl zeigt, wenn die Bakterien bei einer zweiten Temperatur wachsen.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 - 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutagenese eine erste Stufe umfaßt, in der ein Plasmid-tragender Bakterienklon isoliert wird, dessen Plasmid eine Steuerungscharakteristik der Plasmid-Kopien-Zahl bei einer ersten Temperatur und eine andere, eine höhere Kopien-Zahl erlaubende Steuerungscharakteristik bei einer anderen, zweiten Temperatur zeigt,

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sowie eine zweite Stufe, in der ein Plasmid-tragender Bakterienklon erhalten wird, dessen Plasmid eine viel höhere oder völlig ungesteuerte Kopienzahl bei der genannten zweiten Temperatur zeigt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Isolierung der Bakterienklon, dessen Plasmid eine viel höhere oder völlig ungesteuerte Kopien-Zahl bei der zweiten Temperatur aufweist, als Klon selektiert wird, der eine erhöhte, aber gesteuert konstante Kopien-Zahl bei der genannten ersten Temperatur zeigt.

2?. Verfahren zum Herstellen eines kleineren Plasmides, das die Replikations-Steuerungscharakteristik des Elternplasmids beibehält, aus einem Plasmid nach Anspruch 14, dadurch g ekennzeichnet, daß Bakterienklone isoliert werden, die spontan auftretende oder in vivo erzeugte Miniplasmid-Abkömmlinge des Eltern-Plasmids enthalten, die die Replikations-Steuerungscharakteristik des Eltern-Plasmids beibehalten.

28. Verfahren nach Anspruch 27 zum Herstellen eines als Klonier-Vektor verwendbaren Plasmids nach Anspruch 27, dadurch gekennz eichnet_r daß Miniplasmide ausgewählt v/erden, die eine und nur eine Erkennungsregion für wenigstens eine Restriktionsendonu lease aufweisen, wobei die Fähigkeit beibehalten wird, eine gesteuert konstante Plasmid-Kopien-Zahl zu zeigen, wenn die Wirtsbakterien, die die rekombinante DNS enthalten, bei einer ersten Temperatur kultiviert werden, sowie eine veränderte Plasmid-Kopien-Zahl-Steuerung mit viel höherer oder völlig ungesteuerter Kopienzahl zu zeigen, wenn die Wirtsbakterien, die die rekombinante DNS enthalten, bei einer zweiten Temperatur wachsen.

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29- Verfahren zum Herstellen eines Plasmids nach Anspruch. 19, dadurch gekennz eichnet, daß in ein Plasmid nach einem der Ansprüche 14 - 18 ein DNS-Bruchstück mit einem Marker zum Identifizieren und/oder Selektieren von Zellen, die das Plasmid tragen, eingeführt vrird.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch g e k e η n-

z eichne t, daß das DNS-Bruchstück durch Transposition eingefügt wird.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker ein Gen ist, das dem Wirtsbakterium Antibiotika-Resistenz verleiht.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Antibiotika-Resistenz eine Anroicillin-Resistenz ist.

33· Verfahren nach Anspruch 1, (dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid ein solches ist, das durch Kombination eines Kolonierungs-Vektors nach Anspruch 17 mit einem Bruchstück fremder DNS zur Bildung rekombinanter DNS hergestellt wurde.

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