NL8203716A

NL8203716A - Dna en plasmiden.

Info

Publication number: NL8203716A
Application number: NL8203716A
Authority: NL
Original assignee: Tno
Priority date: 1982-09-24
Filing date: 1982-09-24
Publication date: 1984-04-16
Also published as: DK433983D0; JPS59156283A; EP0105554A1; DK433983A

Description

—/ ·_··· ^ -yym· "Cf v » · < Γ r • .

VO 3723 DNA. en plasmiden.

De uitvinding* heeft betrekking op een werkwijze voor het op zeer efficiënte, wijze· in bacteriën produceren van prokaryotische en eukazyotische eiwitten. De uitvinding verschaft Escherichia coli bacteriën (in het bijzonder E. coli K12 JA221) welke een plasmide 5 (bij voorkeur het nieuwe pMBL24) bevatten dat op gecontroleerde wijze kan repliceren en dat gecontroleerde en efficiënte expressie van in ' het plasmide gekloneerde genen mogelijk maakt.

De efficiëntie waarmee een gekloneerd gen in bacteriën, in het bijzonder Escherichia coli tot expressie wordt gebracht hangto.a.

10 af van het aantal kopieën van dit gen dat per bacterie aanwezig is.

Voor veel genen geldt dat de expressie toeneemt naarmate het aantal kopieën van het gen per bacterie toeneemt. Wanneer de mogelijkheid bestaat het aantal gen-kopieën op gecontroleerde wijze te variëren, is daarmee, in principe, de mogelijkheid geopend om op gecontroleer-15 de wijze de expressie van het gekloneerde gen te beïnvloeden. Gecon-troleerde variatie van het aantal gen-kopieën is mogelijk wanneer - het bewuste gen onderdeel is van een DNA-molecuul, bijvoorbeeld een plasmide, waarvan de replicatie-frequentie beïnvloed kan worden.

Door Ohlin et al., Gene _6 91 (1979) en Andreoli et al., J. Bacteriol.

20 135, 612 (1978) zijn plasmiden beschreven waarvan de replicatie- freguentie gewijzigd kan worden door de temperatuur waarbij de bacteriën worden gekweekt, te veranderen. De mogelijkheid om de replicatie -frequentie te variëren is afhankelijk van de structuur van de oorsprong van replicatie (ori). Van het plasmide CloDF13 zijn. mutant 25 plasmiden geïsoleerd (Andreoli et al., J. Bacteriol. 135, 612 (1978) waarvan de replicatie -frequentie afhankelijk is van de temperatuur van het kweekmedium. De- temperatuursafhankelijke replicatie-frequentie is bij deze plasmiden toe te schrijven aan een mutatie in het ori gebied (Stuitje, et al., Nature 290, 264 (1981)). Een dergelijke 30 temperatuurgevoelige replicatie-oorsprong wordt aangeduid met ts-ori.

Voor het op efficiënte wijze tot expressie brengen van een soortvreemd gen in E. coli dient zo'n gen te worden voorafgegaan door een sterke promotor. Indien tevens verlangd wordt dat de expressie kan worden gereguleerd, moet gebruik worden gemaakt van een pro- 8203716 -2- # * motor die reguleerbaar is. De promotor van het tryptofaan (trp) operon van E. coli is een voorbeeld van een sterke en tevens door. keuze van het kweekmedium. regul eerbare promotor (Bertrand et al.., Science 189 22(1975)).

5 De uitvinding verschaft nu een. DNA, DNA fragment of plasmide, dat gekenmerkt wordt doordat het een temperatuurgevoelige replicatie-oorsprong en een sterke, reguleerbare promotor bevat.

Het heeft daarbij volgens, de uitvinding de voorkeur, dat het een temperatuurgevoelige replicatie-oorsprong van het plasmide 10 CloDFl3, alsmede de promotor van het tryptofaan operon van E. coli bevat.

In een concrete voorkeursuitvoeringsvorm verschaft de uitvinding een nieuw plasmide pMBL24, dat de ts-ori van het plasmide pVU208 en het trp promotor-operator complex van E. coli bevat. De ts-15 ori dient voor de controleerbare replicatie van het plasmide en het trp promotor-operator complex voor het op efficiënte en controleerbare wijze tot expressie brengen van gekloneerde genen.

De uitvinding strekt zich verder uit tot bacteriën, in het bijzonder Escherichia coli bacteriën, welke een of meer plasmiden 20 volgens de uitvinding bevatten, alsmede tot een. werkwijze voor het in dergelijke bacteriën produceren van eiwitten. Ook verschaft de uitvinding een werkwijze voor het maken van het nieuwe plasmide pMBL24.

Het plasmide pMBL24 kan als volgt worden gemaakt:

Uitgaande van de reeds beschreven plasmiden pVU208 (Hakkaart 25 et al., MGG 183 326 (1981)) en pBR322 (Bolivar et al.., Gene 2_ 95 (1977)) wordt het plasmide pMBL21 verkregen door knippen van beide ' plasmiden met restrictie-enzymen, in het bijzonder PvuII en PstI en koppelen met behulp van DNA ligase, in het bijzonder T4 DNA ligase, van het fragment van pVU208 dat de ts-ori bevat aan het fragment van 30 pBR322 dat het tetracycline resistentie (tet) gen bevat.

Uit het plasmide pMBL21 wordt het plasmide pMBL24 gemaakt door knippen van pMBL21 met restrictie-enzymen, in het bijzonder EcoRl en PstI en koppelen met behulp van DNA ligase, in het bijzonder T4 DNA ligase van het fragment dat de ts-ori bevat - aan een fragment uit 35 pHP16 dat de trp promotor (trp P) van E. coli bevat. In het aldus ontstane plasmide bevindt zich tussen het trp promotor-operator complex 8203716 • -3- I 4 en de ts-ori. een tran scrip tie-terminator die voorkomt, dat transcriptie afkomstig van. de trp promotor, doorloopt en de ts-ori overschrijft. Dit is van belang1 in verband met negatieve effecten hiervan op de replicatie van het plasmide (Remaut et al.., Gene 15 81 (1981)).

5 Het fragment dat de trp promotor bevat is verkregen door knippen van pHPlö met een restrictie-enzym, in het bijzonder PvuII, koppeling aan de uiteinden met DNA ligase, in het bijzonder T4 DNA ligase, van een synthetisch DNA fragment (Pstl linker) dat een Pstl herken-ningsvolgorde bevat en knippen van het produkt met restrictie-enzymen, 10 in het bijzonder Pstl en EcoiRX. Het hierbij gebruikte plasmide ρΗΡίβ is bekend (Enger et al., Nucl. Acid. Hes. 5 1973 (1981)).

De uitvinding strekt zich tevens uit tot deze werkwijze voor het maken van pMBL24.

De uitvinding verschaft verder een werkwijze voor het pro-15 duceren van eiwitten in bacteriën/ met name E. coli bacteriën/ in het bijzonder E.. coli K12 JA221 bacteriën. Volgens de uitvinding worden daartoe bacteriën gebruikt die een of meer dezelfde plasmiden met een ts-ori bevattenr waarin het gen of de genen waarvan expressie gewenst wordt/, onder controle van de trp promotor volgens de uitvinding staat, 20 respectievelijk staan. In een. voorkeursuitvoeringsvorm wordt hierbij gebruik gemaakt van bacteriën/ bijvoorbeeld. E. coli K12 JA221 bacteriën, waarin de expressie van genen, die gelegen zijn op een plasmide en onder controle staan van de trp promotor, sterk gereprimeerd is indien het juiste kweekmedium wordt gekozen. De bacterie E. coli K12 JA221 is 25 beschreven door Clarke en Carbon (J. Mol. Biol.. 120r 517 (1978)).

Volgens de uitvinding worden de bacteriën bij een geschikte temperatuur in een geschikt kweekmedium gekweekt. Een geschikt kweekmedium is Luria bouillon (LB kweekmedium). Een geschikte temperatuur voor efficiënte expressie is ± 42°C. Wanneer daarentegen geringe ex-30 pressie gewenst is, heeft een kweektemperatuur van ± 30°C de voorkeur.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de figuren en de voorbeelden. Van de figuren, die niet op schaal, zijn, toont; fig. 1 de constructie van het plasmide pMBL21 uit de plas-35 miden pVU208 en pBR322; 8203716 -4- 4 ' * f ig. 2 de constructie, van het plasmide pMBL24 uit de plas-miden pMBL21 en pHPlö; . fig. 3 de constructie van het plasmide pMBL23 uit de plas-miden ρΗΡΙδ en pBR322? 5 fig. 4 een elektroforese patroon van DNA, uit E„ coli K12 JA221 bacteriën met daarin het plasmide pMBL23 of pMBL24, gekweekt bij 30° of 42°C.

Voorbeeld Γ 10 Constructie van het plasmide pMBL21 (fig. 1): Voor de con structie van een plasmide met de ts-ori is uitgegaan van het plasmide pBR322. De replicatie-oorsprang van pBR322 werd vervangen door een thermosensitieve replicatie-oorsprong van plasmide pVU208, waarin de ts-ori afkomstig is van CloDFl3.

15 Hiertoe werd het plasmide pBR322 geknipt met PstI en PvuII, en werd het fragment dat het tet gen bevat, geïsoleerd. Uit plasmide pVU208 werd, na knippen met PstI en PvuII, het fragment dat de ts-ori bevat geïsoleerd. Beide fragmenten werden aan elkaar gekoppeld met behulp van T4 DNA ligase. Door koppeling van de twee fragmenten wordt het gen voor 20 ampicilline resistentie (amp), weer hersteld. Na.transformatie van E. coli JA221 bacteriën vond selectie van getransformeerde bacteriën plaats door uitplaten op voedingsbodems, waaraan ampicilline was toegevoegd. Het gevormde plasmide pMBL21 bevat een amp gen, een tet gen en een ts-ori.

25

Voorbeeld II

Constructie van de plasmiden pMBL24 en pMBL23 (fig. 2 en 3): ^Vcor de constructie van pMBL24 (fig. 2} werd pMBL21 geknipt met EcoRI en PstI en werd het fragment dat de ts-ori bevat geïsoleerd. Het frag- 30 ment dat het trp promotor-operator complex en trpE bevat werd geïsoleerd, na knippen van ρΗΡΙβ met PvuII, koppeling aan de uiteinden met

GCTGCAGC

behulp van T4 DNA ligase van een synthetisch DNA fragment CGACGTCG dat . een herkenninsplaats voor het restrictie-enzym PstI bevat en knippen van het gevormde produkt met PstI en EcoRI.

35 Deze fragmenten werden aan: elkaar gekoppeld, met behulp' van T4 DNA ligase. Na transformatie van E. coli K12 trpE bacteriën vond selectie van getransformeerde bacteriën plaats door uitplaten op voe- 8203716 P>.IFT' Ί..... •'.W'fv.'i T'Z; -· '·*?*' .

* % 4 -5— dingsbodems die tetracycline maar geen tryptofaan bevatten. De structuur van het gevormde plasmide pMEC.24 werd. bevestigd door middel van restric-tie-enzym analyse. Plasmide pMBL24 bevat, herkenningsplaatsen voor- de restrictie-enzymen BglXI,.Sstll, en PstI, welke geschikt zijn voor het 5 kloneren van soortvreemde genen onder controle van de trp promotor..

Het plasmide pMBL23 (fig. 3) bevat, evenals pMBL24 het tet gen, het trp promotor-operator complex en trpE, maar heeft, in afwijking van pMBL24, de replicatie-oorsprong van ColEX (Hershfield et. al., Proc.

Natl. Acad Sci U.S.A. 7^ 3455 (1974)), geïsoleerd uit pBR322. Plasmide 10. pMBL23 werd verkregen op overeenkomstige wijze zoals beschreven voor pMBI.24.

Voorbeeld IXX

Vergelijking van de hoeveelheid plasmide DNA-en de expres-15 sie-efficiêntie van bacteriën die het plasmide pMBL24 volgens de uitvinding bevatten met die van bacteriën die het plasmide pMBL23 bevatten.

De hoeveelheid plasmide DNA is bepaald voor E. coli KI2 JA221 bacteriën die pMBL24 of pMBL23 bevatten en die gekweekt werden bij 30°C. of 42°C. De-resultaten van deze analyse zijn weergegeven in fig. 4.

20 Deze figuur toont het elektroforese patroon van pMBL24 en pMBL23 DNA. Plasmide pMBL23 DNA (a,b) en pMBL24 DNA (c,d), geïsoleerd uit een gelijk aantal E. coli K12 JA221 bacteriën die gekweekt werden bij 30eC (a,c) of. 42°C (b,d), werd. geanalyseerd door middel van gel-elektroforese in 0,9% agarose, zoals beschreven door Aay en Borst,, B.B.A. 269 192 (1972). 25 Het DNA in de gel werd zichtbaar gemaakt door kleuring met ethidium bromide. De hoeveelheid plasmide DNA in de gel werd bepaald door kwantitatieve meting van de kleurintensiteit. Uit kwantitatieve bepalingen is gebleken dat de hoeveelheid pMBL24 DNA gemiddeld met een factor 10 toeneemt wanneer de temperatuur van de bacterie-cultuur wordt verhoogd van 30 30°C naar. 42°C en de bacteriën vervolgens gedurende 3 uur bij deze tem peratuur worden gekweekt. Voor bacteriën die pMBL23 bevatten werd geen verschil gevonden in de hoeveelheid plasmide DNA, wanneer de temperatuur van de bacterie-cultuur werd verhoogd van 3.0°C naar 42°C- De hoeveelheid pMBE.23 plasmide DNA. was in beide gevallen vrijwel gelijk aan de hoeveel- * 35 heid pMBI.24 DNA die bij 30°C wordt gesynthetiseerd.

8203716 -6— ψ *.

Het effect van de temperatuur, op de efficiëntie van expressie. van een gen dat onder controle staat van het trp promotor-operator complex in pMBL24 of pMBL23., is bepaald, door het meten van de hoeveelheid van het produkt van het trpE gen (Antranilaat synthetase ,. ASase 5 component I) in bacteriën die pMBL24 of pMBL23. bevatten. De resultaten, weergegeven in een tabel. (3e - 4e kolom) laten zien dat E. coli K12 trpE JA221 bacteriën die pMBL24 bevatten en die gekweekt, worden in LB kweekmedium (zie J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) bij 30°C zeer geringe hoeveelheden ASase 10 bevatten. Dit geldt zowel voor bacteriën die. gekweekt worden in een medium met als zonder tetracycline. De hoeveelhedei ASase zijn vergelijkbaar met. die door pMBL23 worden gemaakt onder dezelfde omstandigheden.

Wanneer de kweektemperatuur van de bacteriën wordt verhoogd naar 42°C neemt de hoeveelheid ASase die wordt gevormd door pMBL24 be-15 vattende bacteriën gemiddeld 50 maal toe.. Verhoging: van de temperatuur heeft vrijwel geen effect op de synthese van ASase in bacteriën die pMBL23 bevatten.

Een ASase activiteit van 1 eenheid (U) per mg eiwit betekent dat 1% van de totale hoeveelheid eiwit ASase is (Ito et al., J.

20 Bacteriol 97 725 (1969)). Bovengenoemde uitkomsten.laten zien dat in E. coli K12 JA221 bacteriën, gekweekt gedurende 3 uur bij 42°C, de hoeveelheid ASase toeneemt tot maximaal 28% van het. totale eiwit. In bacteriën die gekweekt worden bij 30°C is de hoeveelheid ASase ongeveer 0,5%..

25 Uit het voorgaande blijkt dat. de expressie van een gen in E. coli KI2 JA221 bacteriën,, onder controle van het trp promotor-operator. complex van pMBL24,. zeer gering is wanneer de bacteriën worden gekweekt in LB kweekmedium. bij 30°C. Zeer hoge niveaus van expressie kunnen echter verkregen worden wanneer de bacteriën, die. pMBL24 bevatten 30 gekweekt worden in LB kweekmedium bij 42°C.

Temperatuurverhoging veroorzaakt een belangrijk grotere toename van de ASase synthese (± 50 maal) dan van de plasmide DNA synthese (± 10 maal) in bacteriën die pMBL24 bevatten. Hieruit blijkt dat de zeer efficiënte gen expressie bij 42°C te danken is aan de aanwezig-35 heid op plasmide pMBL24 van zowel een ts-ori als een trp promotor-operator complex.

8203716 * -7- *

De zeer geringe efficiëntie van expressie bij lage temperatuur ia E. coli K12 bacteriën en de zeer efficiënte expressie na tempera taurverboging. levert voordelen, op bij het kloneren van genen waarvan het produkt een ongunstig effect heeft op de stofwisseling van de 5 bacterie ►Wanneer zo'n gen- in pMBL24 gekloneerd wordt en onder controle wordt gebracht van de trp promotor kan. naar wordt verwacht, de. bacterie, zonder nadelig, effect op.de stofwisseling van de bacterie bij 30°C worden gekweekt. Door de kweek tempera tuur te verhogen naar 42°C kan vervolgens·, het produkt van het gen in grote hoeveelheden worden gesynthe-10 tiseerd.

TABEL

temp. , V jj ASase activiteit (U/mg eiwit) CC)· :\*™*a**W· PMBL24 PMBL23 30 LB 0,5 0,3 15 42 LB 13 0,1 30 LB + 10ug Tet/ml 0,7 0,3 42 LB + 10ug Tet/ml 21 0,1 30 LB + 20yg Tet/ml 0,3 0,5 42 LB > 20yg Tet/ml 28 0,1 20 Tabel. Het effect van temperatuurverhoging op de expressie van een gen, dat gecontroleerd wordt door de trp promotor, werd. bepaald door het meten van de trpE enzym activiteit. E. coli K12 JA221 bacteriën werden gekweekt in LB kweekmedium in aan- of afwezigheid van tetracycline, zoals aangegeven. Nadat de bacteriën gedurende 3 uur bij de aan-25 gegeven tea^peratuur waren gekweekt werd de ASase activiteit bepaald volgens J. Ito en C. Yanofsky (J. Bacteriol. £7 725 (1969)).

8203716

Claims

1. DNA, DNA-fragment of plasmide, met het kenmerk, dat het een temperatuurgevoelige replicatie-oorsprong en een sterke, reguleer-bare promotor bevat.

2. DNA·, DNA-fragment of plasmide volgens conclusie 1, met 5 het kenmerk, dat het een temperatuurgevoelige replicatie-oorsprong van het plasmide CloDFl3 bevat.

3. DNA, DNA-fragment of plasmide volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het de promotor van het tryptofaan operon van E. coli bevat.

4. DNA, DNA-fragment of plasmide volgens conclusies 2-3,'met het kenmerk, dat het temperatuurgevoelige replicatie-oorsprong van het plasmide pVU208, alsmede de promotor van. het tryptofaan operon van het plasmide ρΗΡΙβ bevat -

5. Plasmide pMBL24.

6. Bacteriën, in het bijzonder Escherichia coli bacteriën, welke een of meer plasmiden volgens een of meer van de conclusies 1-5 bevatten.

7. Werkwijze voor'het produceren van eiwitten in bacteriën, in het bijzonder Escherichia coli bacteriën, met het kenmerk, dat bac- 20- teriën, welke- een of meer. plasmiden volgens een of meer van de conclusies 1-5 bevatten, waarin het gen of de genen, waarvan expressie gewenst wordt, onder controle van de sterke, reguleerbare promotor staat, resp. staan, en bij een geschikte temperatuur in een geschikt kweekmedium worden gekweekt. 25 8·. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat Escherichia coli bacteriën welke een of meerdere plasmiden volgens conclusies 1-5 bevatten, waarin het gen of de genen waarvan expressie gewenst wordt, onder controle van de promotor van het tryptofaan operon 'van E. coli staat, resp. staan, in Luria bouillon worden gekweekt bij 30 een temperatuur van ongeveer 30°C, zolang geringe expressie gewenst is, en bij een temperatuur van ongeveer 42°C, wanneer sterke expressie gewenst is.

9. Werkwijze voor het maken van plasmide pMBL24, met het ken- 8203716 -9- * merk, dak de plasmiden pVU2G8 en pBR322 worden, geknipt met restrictie-enzymen, in het. bijzonder Pst£ en PvuII., een uit pVü208 afkomstig fragment, dat de temperatuurgevoelige oorsprong bevat, met behulp van DNA ligase, in het bijzonder: T4 DNA Iigase> wordt gekoppeld aan een uit 5 pBR322 afkomstig fragment, dat het tetracycline resistentie gen bevat, onder vorming van een plasmide pMBL21, waaruit door knippen met restric-tie-enzymen, in het bijzonder PstI en EcoRI een fragment wordt geïsoleerd, dat de temperatuurgevoelige oorsprong bevat, welk fragment met behulp van DNA ligase, in het bijzonder T4 DNA ligase, aan een uit ρΗΡίβ 10 afkomstig fragment wordt gekoppeld, dat de promotor van het tryptofaan operon bevat,, verkregen door pEPlö te knippen met een restrictie-enzym, in het bijzonder PvuII, tussen de uiteinden een synthetisch DNA fragment ' GCTGCAGC (linker) met de nucleotiden volgorde CGacGTCG te koppel met behulp van DNA ligase, in het bijzonder T4 DNA ligase, en het produkt te knippen met 15 restrictie-enzymen, in het bijzonder PstI en EcoRI. ******** 8203716