DE2644432C2 - - Google Patents

Description

Bekanntlich kann man genetische Veränderungen in Mikroorganismen hervorrufen, wenn man die Zellen UV- und Röntgenstrahlung aussetzt oder mit chemischen Mutagenen behandelt. Viele genetisch veränderte Mikroorganismen, die durch solche Techniken geschaffen wurden, sind von großer Bedeutung nicht nur in der Industrie und Medizin sondern auch für die Forschung.

Ein neues Forschungsgebiet von speziellem Interesse ist die Erstellung rekombinanter DNS-Moleküle. Ihm wird besondere Bedeutung beigemessen, nicht nur weil es besondere, bisher unbekannte Mikroorganismen verfügbar machen kann, die in der Medizin für die Behandlung von Krankheiten nützlich sein können, sondern weil solche bis heute unbekannte Mikroorganismen eine einzigartige biologische Gefahr darstellen können. Techniken sind bekannt und wurden entwickelt, um rekombinante DNS-Moleküle in Mikroorganismen einzuführen, so daß diese rekombinanten DNS-Moleküle Teil der genetischen Struktur der Mikroorganismen werden, in welche sie eingebracht wurden. Solche DNS-Moleküle können Plasmide oder von Viren abgeleitete, zu ihrer Vermehrung geeignete Vektoren sein, die DNS von jedem beliebigen Organismus oder Virus enthalten. Die Fachwelt ist sich des Nutzens und der Gefahren dieses Forschungsgebietes bewußt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Mikroorganismen der Art Escherichia coli und Verfahren zu ihrer Herstellung zu schaffen, die für die DNS-Rekombinationstechnologie von Nutzen sind. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft somit die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstände.

Erfindungsgemäß werden Mikroorganismen der Art Escherichia coli (Sicherheitsstämme) geschaffen, die sich auszeichnen durch den Besitz aller nachstehend aufgeführten Qualitäten und Fähigkeiten:

• (a) Die Fähigkeit zum Empfang und zur Wiedergewinnung fremder genetischer Information und zur Expression dieser Information und zur Produktion nützlicher Genprodukte;
• (b) Die Abhängigkeit von definierten Bedingungen zur Vermehrung und zum Überleben;
• (c) Die Unfähigkeit zur Ansiedlung oder Vermehrung oder Koloniebildung und/oder zum Überleben unter Bedingungen oder in ökologischen Nischen, die als natürlich und/oder unerwünscht für die Mikroorganismen angesehen werden;
• (d) Die Fähigkeit zum Abbau inkorporierter genetischer Information unter Bedingungen oder in ökologischen Nischen, die als natürlich und/oder unerwünscht für die Mikroorganismen angesehen werden;
• (e) Die Fähigkeit, die in ihnen inkorporierten Kloniervektoren, die die Vermehrung der fremden genetischen Information besorgen, abhängig sein zu lassen in ihrer Replikation, Erhaltung und/oder Funktion von den Mikroorganismen;
• (f) Die Unfähigkeit, Kloniervektoren oder diesen inkorporierte rekombinante DNS-Moleküle auf andere Organismen zu übertragen unter Bedingungen oder in ökologischen Nischen, die als natürlich und/oder unerwünscht für die Mikroorganismen angesehen werden;
• (g) Die Möglichkeit ihrer Registrierung durch geeignete Methoden und/oder Techniken ohne jegliche Änderung der Mikroorganismen und
• (h) Die Empfindlichkeit gegen sehr geringe Verunreinigungen durch andere Organismen, sofern die Mikroorganismen rekombinante DNS-Moleküle beinhalten, und die Unfähigkeit, andere Organismen zu kontaminieren, wenn sie in diesen inkorporiert oder von diesen aufgenommen werden, sofern rekombinante DNS-Moleküle in den Mikroorganismen enthalten sind.

Zur Herstellung der Mikroorganismen der Art Escherichia coli mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften werden vorzugsweise und wann immer möglich Deletionsmutationen und/oder zwei Mutationen, die dieselbe Funktion betreffen, durchgeführt, um die Wahrscheinlichkeit auszuschließen oder stark zu verringern, daß der Stamm die Eigenschaft, die ihm durch die Mutation oder Mutationen verliehen wird, verliert. Beispiele für solche Mikroorganismen sind
Escherichia coli K-12 χ1776, Escherichia coli K-12 x1972,
Escherichia coli K-12 χ1976 und Escherichia coli K-12 χ2076.

Zusätzlich wurden Techniken entwickelt und angewandt, um den Mikroorganismen spezielle genetische Fähigkeiten zu verleihen, die den daraus hervorgehenden Mikroorganismus einzigartig werden lassen.

Die E. coli-Mikroorganismen dieser Erfindung sind nicht nur nützlich für die DNS-Rekombinationstechnologie sondern es können erfindungsgemäß auch Mikroorganismen der Art E. coli hergestellt werden, die in Anlagen zur Behandlung von Abwasser oder für biotechnische Zwecke eingesetzt werden, beispielsweise zur fermentativen Umwandlung von Glucose zu einem Gemisch von wichtigen Carbonsäuren, wie Bernsteinsäure, Milchsäure, Essigsäure und Ameisensäure.

Speziell zur Schaffung von Mikroorganismen der Art E. coli mit den vorstehend genannten Eigenschaften, wie der Produktion der Mikroorganismen E. coli K-12 χ1776 und anderer, wie χ1972, χ1976 und χ2076, die ebenfalls die vorstehend beschriebenen erwünschten Eigenschaften besitzen, wurden erfindungsgemäß spezielle Techniken zur Induktion, Isolation und Charakterisierung von Mutationen entwickelt. Die nachstehende Mutationstabelle A gibt eine Aufzählung und Beschreibung der Eigenschaften von einzelnen und kombinierten Mutationen, von denen gezeigt wurde, daß sie die vorstehend beschriebenen Eigenschaften verleihen.

Mutationstabelle A

Die für bekannte Gene benutzten Gensymbole wurden von Bachmann et al., Bacteriol. Rev., Bd. 40 (1976), Seiten 116 bis 167 übernommen. Neue Gene wurden entsprechend den Konventionen für genetische Nomenklatur, die von Demerec et al., Genetics, Bd. 54 (1966), S. 61 bis 76 vorgeschlagen wurden, benannt.

• a1. Zur wirksamen Einführung von fremder genetischer Information in Mikroorganismen:
  • (1) hsdR - verhindert die Restriktion, benutzt in χ1776 und χ2076.
  • (2) hsdS - verhindert Restriktion und Modifikation, benutzt in χ1972, χ1976 und anderen Stämmen, die entwickelt und vorstehend erwähnt wurden.
  • (3) dap und/oder asd - verhindert die Synthese von Diaminopimelinsäure (siehe unten) und erhöht die Fähigkeit zur Transformierbarkeit um einen Faktor von etwa 3, bentzt in χ1776, x1972, χ1976 und χ2076.
  • (4) Δ[gal-uvrB] - verhindert den Einbau von Galactose in die Lipopolysaccharide der äußeren Membran (das ist die äußere Schicht der Zellwand) und erhöht die Fähigkeit zur Transformierbarkeit um den Faktor 5 bis 10 (diese Mutation hat noch weitere Auswirkungen wie unten erwähnt). galE-Mutationen führen zum selben Ziel, wurden jedoch in keinem der Stämme benutzt wegen der zusätzlichen Vorteile der Mutation Δ[gal-uvrB], welche durch eine Deletion der Gene galE gekennzeichnet ist. Benutzt in x1776, χ1972, χ1976 und χ2076.
  • (5) endA - verhindert die Wirkung der Endonuclease I und erhöht die Fähigkeit zur Transformierbarkeit um den Faktor 5 bis 10; nicht benutzt in χ1776, jedoch benutzt in χ1972, χ1976 und χ2076.
• a2. Zur wirksamen Wiedergewinnung fremder genetischer Information von Mikroorganismen:
  • (1) dap und asd (siehe oben) - bedingt Fragilität der Zellen und erleichtert den Zellaufschluß bei der Isolierung rekombinanter DNS, benutzt in x1776 und χ2076 und dap-Mutationen nur in χ1972 und χ1976.
  • (2) rfb und oms - die Kombination beider Mutationen bedingt eine Veränderung der äußeren Membran, was die Zellen empfindlicher gegen Lysozym und Tenside werden läßt, die während des Zellaufschlusses zur Isolierung rekombinanter DNS angewandt wurden, benutzt in x1776 und χ2076.
  • (3) rfa, 1pcA und 1pcB - allein oder in Kombination bedingen diese Mutationen eine Änderung der Lipopolysaccharide in der äußeren Membran, was die Zellen empfindlicher gegen Lysozym und Tenside werden läßt, die während des Zellaufschlusses zur Isolierung rekombinanter DNS angewandt wurden, benutzt in χ1972, χ1976 und x2076.
• a3. Zur Expression fremder genetischer Information, was zu nutzvollen Produkten führt:
  • (1) minA+minB - bedingt die Produktion von Minizellen, die frei von chromosomaler DNS sind, jedoch Plasmid-Vektor-DNS besitzen können und so Untersuchungen zur Expression fremder DNS ermöglichen, vorhanden in χ1776 und χ2076.

Notwendige Manipulationen zur Expression fremder DNS in E. coli erfordern die Entwicklung von spezifischen Plasmid- oder Phagen-Kloniervektoren, die selbst wieder die in vitro Konstruktion rekombinanter DNS-Moleküle notwendig machen. Andere genetische Standardtechniken müssen auf den Wirt angewendet werden, die die Einführung von Mutationen, die den Abbau von fremden Proteinen verhindern (wie z. B. deg, lon), und die Ausscheidung von fremden Proteinen aus den Zellen in das Kulturmedium ermöglichen.

• b. Für Mikroorganismen, die vollständig abhängig sind von genau definierten Bedingungen für ihr Wachstum und Überleben:
  • (1) dap - verhindert die Synthese von Diaminopimelinsäure, eines essentiellen Bestandteiles der starren Schicht der Zellwand, welcher normalerweise in der Natur nicht gefunden wird, benutzt in χ1776, χ1972, χ1976 und χ2076.
  • (2) asd (Δ[bioH-asd]) - verhindert ebenso die Synthese von Diaminopimelinsäure, benutzt in χ1776 und χ2076.
  • (3) thyA - verhindert die Synthese von Thymidion-5′-monophosphat, einem wesentlichen Bestandteil der DNS. Solche Zellen müssen supplementiert werden entweder mit Thymidin (welches normalerweise in der Natur nicht zur Verfügung steht) oder mit Thymin (welches eher in der Natur vorkommt), benutzt in χ1776, x1972, χ1976 und χ2076.
  • (4) deoA - verhindert die Fähigkeit von thyA-Stämmen, niedrige Konzentrationen von Thymin zu verwerten, und macht sie abhängig von Thymidin, um die Bedürftigkeit von thyA-Mutationen zu befriedigen, benutzt in χ1972, χ1976 und χ2076.
  • (5) upp - unterbindet einen Stoffwechselnebenweg, der thyA deoA-Stämmen das Wachstum in Medium mit hohen Konzentrationen von Thymin erlaubt. Daraus folgt, daß ein Stamm mit thyA deoA und upp-Mutationen vollständig von Thymidin im Wachstumsmedium abhängig ist und somit in der Natur eine geringere Überlebenschance hat als ein Stamm, der nur die thyA-Mutation besitzt, benutzt in x1972, χ1976 und χ2076.
• c. Um die Ansiedlung oder das Wachstum oder die Koloniebildung und/oder das Überleben von Mikroorganismen unter Bedingungen oder in ökologischen Nischen zu verhindern, die als natürliche oder unerwünschte Orte angesehen werden:
  • (1) dap und asd (siehe oben) in Verbindung mit Mutationen wie Δ[gal-uvrB] (benutzt in χ1776, χ1972, χ1976 und χ2076), galE, galU, man und non, die die Synthese von Colaminsäure unterbindet, verhindert ein längerfristiges Überleben durch Zellyse unter praktisch allen möglichen natürlichen und unnatürlichen Umweltbedingungen. Die Absterberate durch Zellyse ist jedoch abhängig von der Fähigkeit der Umwelt, den Zellstoffwechsel der Mikroorganismen zu ermöglichen.
  • (2) thyA (wie benutzt in χ1776) und deoA und upp (wie benutzt in χ1972, x1976 und χ2076) verhindert längerfristiges Überleben unter praktisch allen natürlichen und unnatürlichen Umweltbedingungen. Die Absterberate ist jedoch abhängig von der Fähigkeit der Umwelt, den Zellstoffwechsel der Mikroorganismen zu ermöglichen.
  • (3) rfb und oms (wie benutzt in χ1776 und χ2076) verleihen erhöhte Sensitivität gegenüber Galle, und verhindern so das Überleben im Intestinaltrakt, verleihen erhöhte Sensitivität gegenüber Tensiden, die ein wahrscheinlicher Bestandteil von Abwasser darstellen, welches in Abwassersystemen gesammelt wird, und verursachen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber den verschiedensten Arzneistoffen, Antibiotika und Chemikalien, die in der Natur als Verunreinigung im Abwasser angetroffen werden, welche sich in Abwassersystemen, Flüssen und Seen ansammeln. Diese Empfindlichkeiten sind unabhängig von der Stoffwechselaktivität der Zellen und sollen die Überlebensrate in Abwasser und Gewässern herabsetzen.
  • (4) rfa, lpcA und lpcB - allein oder in Kombination übertragen sie die gleichen Eigenschaften wie rfb und oms-Mutationen, benutzt in χ1972, χ1976 und χ2076.
  • (5) Δ[gal-uvrB] - verursacht eine Überempfindlichkeit der Mikroorganismen gegenüber ultraviolettem Licht (und damit auch Sonnenlicht), da die Zellen UV-induzierte Schäden weder im Dunkeln noch in Gegenwart von sichtbarem Licht reparieren können. Diese Eigenart vermindert die Überlebensrate in Luft, auf dem Boden und auf Pflanzen und in Oberflächengewässern, welche dem Sonnenlicht ausgesetzt sind. Diese Empfindlichkeit ist unabhängig von einer Stoffwechselaktivität der Zelle, benutzt in χ1776, χ1972, χ1976 und χ2076.
  • (6) recA - verantwortlich für eine Überempfindlichkeit der Mikroorganismen gegen ultraviolettes Licht und chemische Mutagene. Exponiert man die Mikroorganismen denselben, so führt das zu schnellem Tod mit einer begleitenden Zerstörung der genetischen Information, benutzt in χ1976. Wenn benutzt in Verbindung mit polA(CS) (siehe unten), so führt dies zum Tod mit zusätzlicher Zerstörung der genetischen Information bei 32°C und tiefer auch in Abwesenheit von ultraviolettem Licht und/oder chemischen Mutagenen, benutzt in χ1976.
• d. Um die genetische Information, die in Mikroorganismen enthalten ist, zu zerstören, unter Bedingungen oder in ökologischen Nischen, die als natürlich und/oder als unerwünschte Umweltbedingungen für die Mikroorganismen angesehen werden:
  • (1) thyA - verhindert die Synthese von Thymidin-5′-monophosphat, das zur DNS-Synthese benötigt wird, verursacht in Abwesenheit von Thymin oder Thymidin den thyminlosen Tod, welcher begleitet wird von einem Abbau der DNS, benutzt in χ1776.
  • (2) thyA deo upp - bedingt die obligate Abhängigkeit von Thymidin, welches in der Natur nicht zur Verfügung steht und führt dadurch zu einem schnelleren und wirksameren Abbau der genetischen Information, als er durch die thyA-Mutation allein bewirkt wird, benutzt in χ1972, χ1976 und χ2076.
  • (3) polA(CS) - verursacht eine Inaktivität der DNS-Polymerase I bei Temperaturen von 32°C und darunter, (d. h. kälte-sensibel). Die DNS-Polymerase I ist auf jeden Fall beteiligt bei der Reparatur von DNS-Schäden, spielt aber auch eine wichtige Rolle bei der DNS-Synthese. Wenn das Enzym inaktiviert ist, dann findet de thyminlose Tod und die DNS-Zerstörung schneller statt. Dies ist die erste Isolierung einer solchen kältesensiblen polA-Mutation, benutzt in χ1972 und χ1976.
  • (4) recA - verhindert genetische Rekombination und bedingt eine Überempfindlichkeit gegen ultraviolettes Licht (d. h. auch Sonnenlicht) und gegenüber anderen Chemikalien, die in der Umwelt vorkommen können. Eine Behandlung mit ultraviolettem Licht, etc., verursacht einen schnellen Abbau der DNS. In Verbindung mit der polA(CS)-Mutation bedingt sie eine rasche Zerstörung der DNS bei 32°C und darunter, und führt so zur schnellen Zerstörung der genetischen Information in Mikroorganismen, die sich in alle Umwelten, die anders sind als innerhalb eines Warmblüters, zurückziehen können, benutzt in χ1976.
    Die Kombination der Mutationen thyA deoA upp polA(CS) recA, wie sie benutzt werden in χ1976 verursacht eine große Erhöhung der Sicherheit über jene hinaus, die zustande gebracht wird durch die thyA-Mutation alleine, wie sie in χ1776 benutzt wird.
• e. Um Kloniervektoren, die für die Erforschung rekombinanter DNS-Moleküle benutzt werden, abhängig zu machen in ihrer Replikation, Aufrechterhaltung und/oder Funktion von den Mikroorganismen:
  • (1) supE - Amber-Suppressor, der amber nonsens-Mutationen zu lesen vermag, die in von Viren oder Plasmiden abgeleiteten Kloniervektoren vorhanden sein können, so daß ihre Reifung, Aufrechterhaltung, Funktion und/oder Replikation abhängig ist vom mikrobiologischen Wirt. Man geht davon aus, daß die meisten Mikroorganismen in der Natur keine Amber-Suppressor-Mutationen besitzen. Daraus folgt, daß von Viren oder Plasmiden abgeleitete Kloniervektoren nicht reifen können, keine Funktion haben und/oder nicht replizieren können in diesen Wildtyp-Mikroorganismen, die in der Natur angetroffen werden, benutzt in χ1776, x1976 und χ2076.
  • (2) supF (tyrT) - ein anderer Typ von Amber-Suppressor mit ähnlicher Funktion aber unterschiedlicher Spezifität als supE, benutzt in χ1976.
  • (3) sup⁺ - Abwesenheit von jeder Art von nonsens-Suppressor-Mutation. Erlaubt den Gebrauch der von Viren abgeleiteten Vektoren, welche Amber-Mutationen in Genen beinhalten, die für die Synthese von viralen Strukturproteinen, wie z. B. Schwanzproteinen, codieren, so daß nur nicht-infektiöse Virenköpfe produziert werden, die rekombinante DNS enthalten. Diese Mutation erlaubt die Lysogenisierung des Wirtes mit von Viren abgeleiteten Vektoren, welche Amber-Mutationen besitzen, so daß die Virusreifung nicht möglich ist und die Aufrechterhaltung der von Viren abgeleiteten Vektoren allein abhängig ist von der Replikation des Wirtschromosoms, benutzt in χ1972.
  • (4) polA(CS) - verursacht eine Inaktivität der DNS-Polymerase I bei Temperaturen unter 32°C. Verschiedene von Plasmiden abgeleitete Kloniervektoren, wie z. B. ColE1 und seine Derivate, sind abhängig in ihrer vegetativen Replikation von einer Aktivität der DNS-Polymerase I. Daraus folgt, daß diese Plasmide in polA(CS)-Zellen bei Temperaturen unter 32°C nicht replizieren können und ausverdünnt werden (verloren werden), benutzt in χ1972 und χ1976.
  • (5) recA - verhindert genetische Rekombination, welche notwendig ist für eine stabile Aufrechterhaltung von g dv Plasmid Kloniervektoren, benutzt in χ1976.
• f. Um die Möglichkeit oder Fähigkeit, rekombinante DNS auf andere Organismen in der Natur zu übertragen, auszuschließen oder zu verringern:
  Alle obengenannten Mutationen, die die Überlebensrate des Wirts verringern und die zu einem Abbau der genetischen Information in anderen als den sorgfältig kontrollierten Labor-Umwelten führen, werden die Transmission von rekombinanter DNS auf andere Organismen natürlich verringern. Manche dieser Mutationen und andere haben eine spezifische positive Wirkung auf die Erniedrigung der Transmissionsrate von rekombinierter DNS, was oben noch nicht erwähnt wurde.
  • (1) thyA - da DNS-Synthese notwendig ist für die Vermehrung der von Viren abgeleiteten Kloniervektoren und da DNS-Synthese bei der Transmission von Plasmid DNS durch Konjugation eine Begleiterscheinung und wahrscheinlich sogar notwendig ist, wird die thyA-Mutation (wie benutzt in χ1776), zusammen mit der deoA- und upp-Mutation (wie benutzt in χ1972, χ1976 und χ2076) die DNS-Synthese in nicht laborentsprechenden Umwelten blockieren und dadurch die Transmission rekombinanter DNS hemmen.
  • (2) polA(CS) - die Aktivität der DNS-Polymerase I ist notwendig für die Transmission von ColE1 Kloniervektoren und seinen Derivaten bei Konjugationsexperimenten. Dadurch verringert die Anwesenheit einer polA(CS)-Mutation die Transmission von rekombinanter DNS, die in ColE1 Vektoren enthalten ist, unter 32°C, benutzt in χ1972 und χ1976.
  • (3) Δ[gal-uvrB] - (benutzt in x1776, χ1972, χ1976 und χ2076), lps und oms (benutzt in χ1776 und χ2076) und/oder rfa, lpcA und/oder lpcB (benutzt in χ1972, χ1976 und χ2076) - verändern die äußere Membran der Zelle und reduzieren die Fähigkeit der Zelle mit einer Vielzahl von verschiedenen Spender-Stämmen zu paaren. Sie verhindern so die Weitergabe der durch Konjugation übertragbaren Plasmide, die notwendig sind für die Mobilisierung und Transmission von nicht durch Konjugation verbreitbaren Plasmiden (d. h. nicht selbst-transmissibel), die als Kloniervektoren benutzt werden. Diese Mutationen bewirken auch eine Resistenz gegen die Phagen D108 und Mu und eine partielle oder vollständige Resistenz gegen den Phagen P1, welche allgemein transduzierende Phagen sind. Es wird so die Wahrscheinlichkeit der Transmission von rekombinanter DNS durch Transduktion herabgesetzt. Die Deletionsmutation Δ[gal-uvrB] eliminiert weiter die natürlichen Integrationsstellen auf dem Chromosom für temperente transduzierende Phagen, wie λ, 82 und 434.
  • (4) tonA - führt zur Resistenz gegen die Phage T1, T5 und Φ80 und verhindert die Transmission rekombinanter DNS durch Transduktion durch die transduzierenden Phagen T1 und Φ80, benutzt in χ1776, χ1972, χ1976 und x2076.
  • (5) Δ[bioH-asd] - bedingt Resistenz gegen transduzierende Phagen wie λ, benutzt in χ1776 und x2076.
  • (6) sup⁺ - Abwesenheit jeglicher nonsens-Suppressor-Mutationen, was die Produktion von infektiösen, von Viren abgeleiteten Vektoren verhindert, die rekombinante DNS enthalten. Diese Produktion wird verhindert, entweder wenn der im Wirtschromosom integrierte und deshalb von der Replikation des Wirtschromosoms abhängige Vektor amber nonsens-Mutationen in Genen für Schwarzproteine oder in jedem anderen Strukturgen enthält.
• g. und h. zur Registrierung von Mikroorganismen und Verringerung der Wahrscheinlichkeit einer Kontamination der Mikroorganismen während der Untersuchung der rekombinanten DNS-Moleküle:
  • (1) nalA - bedingt Resistenz gegen Nalidixinsäure. Da Nalidixinsäureresistenz bei Mikroorganismen selten in der Natur angetroffen wird, und da die Häufigkeit der Mutation zur Nalidixinsäureresistenz extrem niedrig liegt, kann der nalA-Marker benützt werden, um das Entkommen und das Überleben von einer sehr geringen Anzahl von Wirtsmikroorganismen festzustellen. Nalidixinsäure kann weiterhin zu Kulturen während der Transformation mit rekombinanter DNS zugegeben werden, um die Transformation von kontaminierenden Mikroorganismen vollkommen auszuschließen, benutzt in χ1776, χ1972, χ1976 und x2076.
  • (2) cycA und cycB - bedingt Resistenz gegen Cycloserin, was den Gebrauch von Cycloserin anstatt oder in Verbindung mit Nalidixinsäure erlaubt, benutzt in x1776 und χ2076.
  • (3) thyA - bedingt Resistenz gegen Trimethoprim, was den Gebrauch von Trimethoprim anstelle oder in Verbindung mit Nalidixinsäure und/oder Cycloserin erlaubt, benutzt in χ1776, χ1972, χ1976 und χ2076.

Material und Methoden, die bei der genetischen Modifikation von Mikroorganismen der Art E. coli benutzt werden Allgemeines

Alle Methoden sind bekannt und beschrieben von Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972, bzw. soweit nicht anders angegeben in den zitierten Literaturangaben.

Medien

Komplexe Medien sowie Penassay-Nährlösung und Agar (8 g Natriumchlorid/Liter wurde zu Penassay-Agar zugegeben, wenn nicht anders angegeben), L-Nährlösung (Lennox, 1955), L-Agar (L-Nährlösung, die 15 g Agar/Liter enthält außer für den Gebrauch bei P1L4, in welchem Falle 12 g Agar/Liter und 2,5×10^-3 M Calciumchlorid zugegeben wurde) Hirn-Herzinfusions-Nährlösung und Agar, Trypton-Nährlösung (10 g Trypton und 5 g Natriumchlorid/Liter) und Agar (Trypton-Nährlösung, welche 12 g Agar/Liter enthält), EMB-Agar (EMB Agar Base, welche 5 g Hefeextrakt und 5 g Natriumchlorid/Liter enthält) und MacConkey Base Agar. EMB und MacConkey Agar wurden nach dem Autoklavieren supplementiert mit sterilen Kohlenstoffquellen geeigneter Konzentration (Endkonzentration normalerweise 1%). L-Weichagar war L-Nährlösung, welche 6,5 g Agar/Liter enthielt.

Synthetische Medien waren ML und MA (Curtiss, 1965) und wurden supplementiert mit Aminosäuren, Purinen, Pyrimidinen und Vitaminen bis zu einer optimalen Konzentration (Curiss et al., 1968) und mit Kohlenstoffquellen bis zur Endkonzentration von 0,5%. Casaminosäuren (CAA) wurden bis zu einer Endkonzentration von 0,5 oder 1,5% wie angegeben zugefügt. 10 µg/ml Thymidin (Thd) oder Thymin (Thy) wurden zu komplexen Medien und 40 µg/ml zu synthetischen Medien zugegeben. 0,5 µg/ml Biotin (Bio) und 100 µg/ml DL-Diaminopimelinsäure (DAP) wurden benutzt, letztere wurde beim Arbeiten mit dap-Mutanten zu allen Medien und Verdünnungen zugegeben. Purin, Pyrimidin und Vitaminsupplementierungen wurden zur Trypton-Nährlösung und Agar und MacConkey-Agar hinzugefügt, wenn Stämme verwendet wurden, die diese Verbindungen benötigten.

Gepufferte Kochsalzlösung mit Gelatine (BSG; Curtiss, 1965) wurde benutzt als Verdünnungsmedium.

Bakterienstämme

Die benutzten Bakterienstämme sind in Tabelle I aufgeführt. Die Gensymbole, ausgenommen für neu identifizierte Gene, sind jene, die von Bachmann et al. (1976) benutzt wurden. Die meisten Allel-Nummern wurden vom Coli Genetic Stock Center bestimmt. Allel-Nummern für bestimmte Mutationen, die erst kürzlich isoliert wurden, oder in Stämmen, die früher nicht benutzt wurden, wurden bis jetzt noch nicht festgelegt. Für Gene, die bei der Konstruktion von Stämmen benutzt wurden, wurde deren Position in der Genkarte, falls sie bekannt war, in Tabelle II aufgeführt. Der Stammbaum von χ1276 (der Vorfahre von χ1776 und χ2076) und x1038 (der Vorfahre von χ1972 und χ1976) ist in Tabelle A bzw. B wiedergegeben. Die Stämme wurden weitergezogen in Penassay-Agarschrägröhrchen (supplementiert mit Thymidin und/oder DAP wenn notwendig) bei 4°C, wenn sie ständig benutzt wurden und in 1% Pepton-5% Glycerin (supplementiert wie oben, wenn notwendig) bei -70°C für Langzeitaufbewahrung.

Bakteriophagen

T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7, Φ12, Φ14 und der F^--spezifische Phage ΦII, PV, ΦW und ΦH wurden vermehrt und E. coli B (χ8). g, 434, 21, Φ80 und deren Derivate wurden induziert aus lysogenen Zellen oder vermehrt auf χ289 oder χ1918. S13 wurde vermehrt auf E. coli C (x695). Die F-Donor-spezifischen Phagen f1, MS-2, Qβ, R17 und fcan1 wurden vermehrt auf χ1365 und die I-Donor-spezifischen Phagen If2 auf χ1005. Mu, BF23, P1L4, D108 und K3 wurden vermehrt auf χ289 ebenso wie die rough-specific Phagen, 6SR, Ffm, Br60, FP1, FP3 und Br10. C21 wurde vermehrt auf einem galE Salmonella typhimurium LT2-Stamm (χ1890). Alle Phagen wurden vermehrt und geprüft unter Verwendung geeigneter Medien, welche die optimalen Konzentrationen von Natrium-, Magnesium- oder Calciumionen enthalten. Bestimmte obenerwähnten Phagen oder deren Derivate wurden vermehrt auf anderen Wirtsstämmen, besonders für Transduktions-Experimente, oder bei Restriktions-Modifikations-Experimenten und bei der Prüfung von Suppressor-Phänotypen etc., wie im Text angegeben. Die allgemeinen Methoden für das Arbeiten mit Phagen folgten den von Adams (1959) angegebenen Methoden.

Transduktion

P1L4 wurde vermehrt auf geeigneten Donorstämmen. Die Transduktion wurde durchgeführt, indem P1L4 in einer Multiplizität von etwa 3 pro Bakterium (tatsächlich moi etwa 1) zu Empfängerbakterien mit dem Titer von 2×10⁸/ml zugegeben wurde, welche 90 bis 120 Minuten in L-Nährlösung gewachsen sind, die 2,5×10^-3 M CaCl₂ enthält. Nach einer Inkubationszeit von 20 bis 30 Minuten bei 37°C wurden Proben auf geeignete Selektivmedien plattiert. Wenn phänotypische Verzögerung und/oder Segregationsverzögerung erwartet wurde, wurde die Kultur 100 bis 1000fach in einem geeigneten flüssigen Medium verdünnt, welches 10^-2 M Citrat enthielt, und bei 37°C weiter bebrütet, bis ein Titer von 10⁸ Zellen/ml erreicht wurde, und sodann plattiert.

Mutagenese und Anreicherung von Mutanten

Mutationen, welche bei der Konstruktion von Stämmen benutzt wurden, waren entweder spontan entstanden oder waren induziert worden durch salpetrige Säure, ultraviolettes Licht (UV), Nitrosoguanidin oder Stickstoff-Lost. Die Überlebensrate nach mutagener Behandlung war in allen Fällen 10% oder höher, um die Wahrscheinlichkeit multipler Mutationsereignisse möglichst gering zu halten. Der Einführung von Mutationen durch Mutagene und/oder durch Transduktion folgten üblicherweise zwei Anreicherungscyclen, bei denen 100 µg Cycloserin/ml und 100 µg Ampicillin/ml angewandt wurden, wenn eine direkte Selektion der Mutation nicht möglich war. Spontante thyA-Mutanten wurden angereichert mit Hilfe von Trimethoprim.

Konjugation

Optimale Wachstumsbedingungen für die Stämme zur maximalen Ausprägung der Spender- und Empfänger-Phänotypen und für deren Paarung wurden benutzt.

Minizellenproduktion

Während der Konstruktion von χ1776 und χ2076 wurden gute Minizellen-produzierende Isolate ausgewählt. Die Minizellen-Produktion der späten log-Phase-Kulturen wurde mit Hilfe des Mikroskops abgeschätzt. Das Verhältnis von Minizellen zu normalen Zellen und die Häufigkeit von Zellen, die im Begriffe waren, Minizellen zu produzieren, wurden bei der Auswahl der Isolate beachtet.

Bei manchen Experimenten wurden die Minizellen quantitativ gereinigt mit Hilfe der doppelten Sacharosegradienten-Reinigungstechnik, die von Frazer und Curtiss (1975) beschrieben wurde.

Wachstum

Bei jedem Schritt der Stammkonstruktion wurde eine sorgfältige Selektion auf gutes Wachstum unternommen. Das Wachstum aller bei 37°C in verschiedenen Medien gezüchteten Kulturen wurde spektrophotometrisch aufgenommen.

Tabelle II

Genorte, die bei der Konstruktion der Stämmea) benutzt wurden

Tabelle A

Stammbaum von χ1276a)

Tabelle B

Stammbaum von χ1038

Arber 803, der auch KH 803 benannt wird, ist x1038 in der E. coli Stammsammlung von Curtiss (siehe Tabelle I). Die Entwicklung von Arber 803 und den Derivaten von Arber 101 und Arber 151 sind von Kellenberger et al. (1966) und Wood (1966) beschrieben worden.

Genetische Modifikation von Mikroorganismen der Art E. coli Konstruktion von 1776

In Tabelle C ist der Stammbaum von χ1776 und von χ1276 (siehe Tabelle A) aufgezeigt. Von χ1276 wurde ausgegangen, da er (i) genetische Merkmale besitzt, die entweder für die Herstellung eines Stammes oder für Sicherheitsvorkehrungen von Nutzen sind, (ii) 80 bis 90% seines Chromosoms von W1485 abstammen und (iii) Minizellen produziert, die zum Studium der Expression von Plasmid-kodierten Chimeren von Nutzen sein können. Das Hauptziel der Konstruktion von χ1776 war, zu erfahren, ob eine gegebene Konstellation von genetischen Marken die Zellwandsynthese blockieren und das Überleben in laborfremder Umgebung ausschließen würde. Das Ziel, Isogenität mit W1485 aufrechtzuerhalten, wurde aus Zweckmäßigkeitsgründen mehrmals aufgegeben. Bei jedem Schritt der Konstruktion wurden gewissenhaft solche Clone selektiert, die sehr schnell wuchsen und die die größte Ausbeute und Reinheit von Minizellen lieferten.

Als erstes wurde das hsdR2 Allel in χ1276 eingeführt, um das K-12 Restriktionssystem auszuschalten und so die Einführung fremder DNS-Sequenzen in den Stamm zu ermöglichen. Dies gelang mit Hilfe von Konjugationsexperimenten mit χ1487, einem F⁺-Abkömmling von χ1037; Spender und Empfänger wurden im Verhältnis 1 : 5 gemischt und 10 Minuten gepaart, so daß eine große Zahl der Ara⁺ Str^r-Rekombinanten F^- blieb. Eine schnell wachsende, viele Minizellen hervorbringende F^- Ara⁺ Str^r Rekombinante, die λ vir, der auf χ1038 gewachsen ist, nicht in der Vermehrung hemmt (Tabelle I), wurde in die Stammsammlung als χ1488 eingeführt. Da χ1487 ein nicht von W1485 abgeleiteter Stamm ist, wurden die Gene zwischen 3 und 10 Minuten in χ1488-Chromosom durch Gene von einem Stamm ersetzt, der nicht von W1485 abgeleitet ist. Im nächsten Schritt wurde das Allel rpsL97 (Str^r) im Stamm χ1488 entfernt, damit Plasmid-Kloniervektoren mit Sm^r als selektierbarem Merkmal in diesem Stamm benützt werden konnten. Dies wurde erreicht durch eine Konjugation mit χ602 (Tabelle I), einem Hfr-Abkömmling von W1485; daraus entstand χ1678. Das Ersetzen des rpsL97-Allels in diesen oder anderen Stämmen war begleitet von einer leichten aber meßbaren Verlängerung der Generationszeit.

Das nächste Ziel war, die Fähigkeit des Stammes zu unterbrinden, seine Zellwand in anderen als sorgfältig kontrollierten Laborumgebungen zu synthetisieren. Da die Diaminopimelinsäure (DAP) nur in den Mucopeptiden der Zellwand der meisten gram-negativen Bakterien vorkommt und da nicht bekannt ist, daß die DAP in Eukaryonten vorkommt, konnte man annehmen, daß freie DAP in der Natur kaum vorkommt, was zur Folge hat, daß DAP^--Mutanten in der freien Natur lysieren und somit nicht überleben können. Man prüfte zahlreiche dao-Allele auf genetische Stabilität und fand, daß der dapD8-Marker, der durch Nitrosoguanidin-Behandlung induziert worden war, der geringsten Reversionsrate unterlag (Reversionsrate ca. 10^-9). Dieser Marker wurde deshalb in χ1678 eingeführt. Dies gelang, indem die dapD8- und tonA53-Marker cotransduzierte (Cotransduktionsrate ca. 90%). χ1678 ließ man nach der Transduktion mit P1L4 (χ1656) 9 Generationen in Nährlösung+DAP wachsen, bevor man ihm mit einer hohen Multiplizität von T5 behandelte. Die Einführung des Allels dapD8 in χ1678, wodurch man x1697 erhielt, gelang mit Hilfe einer Mutation, die Temperatursensibilität verursacht. Später fand man diese in χ1656 und einigen, aber nicht allen T5^r dapD8 Transduktanten, die man von χ1678 erhalten hatte. Diese Temperatursensibilität wurde eliminiert durch Spontanreversion, was zu dem Stamm χ1702 führte.

Mit χ1702 wurden zahlreiche Versuche mit enttäuschenden Ergebnissen durchgeführt. Er unterlag keinem durch DAP-Mangel herbeigeführten Tod in L-Nährmedium, Penassay-Nährmedium, oder ML (mit oder ohne Casaminosäure), denen keine DAP zugegeben wurden. Vielmehr konnte der Stamm in diesen DAP-Mangelmedien sogar wachsen. Er überdauerte weiter die Passage durch den Intestinaltrakt von Ratten (siehe unten) und war ein guter Empfänger in Paarungsversuchen mit R⁺-Spenderstämmen. Zunächst nahm man deshalb an, daß das DAPD8 Allel nicht nur revertierbar, sondern sogar "leaky" war. Eine Suche nach anderen stabilen Mutationen, die sich in einem Dap^--Phänotyp äußerten, wurde deshalb begonnen, während die Studien der Eigenschaften von χ1702 fortgesetzt wurden. Man beobachtet bald, daß χ1702 dem Dap^--Mangel bei 42°C in allen Medien, den DAP fehlte, erlag und daß der Stamm Kolonien auf L- und Penassay-Agarplatten ohne DAP bei 30°C und bei 37°C bilden konnte, aber nicht bei 42°C. Diese Kolonien waren mucoid. Durch Stempelversuche fand man, daß die Zahl der Kolonien, die auf DAP-Mangelmedium anwuchsen, zunahmen in dem Maße, wie die DAP-Konzentration in den Mutterplatten abnahm. Außerdem stellte man fest, daß das Fehlen von Natriumchlorid in dem L- oder Penassay-DAP-Mangelagar Koloniebildung ausschloß, und daß in flüssigem DAP-Mangelmedium das Fehlen von Natriumchlorid ebenso zu einer höheren Absterberate durch DAP-Mangel und zur Unfähigkeit des Stammes χ1702, ohne DAP zu wachsen, führte. Man konnte daraus schließen, daß die Fähigkeit von χ1702 in Flüssigmedium ohne DAP aber mit Natriumchlorid zu wachsen, auf die Fähigkeit Sphäroplasten zu bilden, zurückzuführen ist, die umgeben waren von einer Mucopolysaccharidkapsel, die fähig ist, die osmotische Druckdifferenz zwischen dem Zellplasma der Umgebung auszugleichen. Auch die mucoiden Kolonien, die auf festem DAP-Mangelmedium gebildet wurden, bestanden aus von Kapseln umgebenen Sphäroplasten. Nun schien es also sicher, daß χ1702 und einige andere Dap^--Stämme Colaminsäure herstellen, deren Synthese (i) reguliert wird vom lon (capR) Gen, (ii) verhindert wird bei einer Inkubationstemperatur von 42°C und (iii) angeregt wird durch die Gegenwart von Natriumchlorid und widrigen Umweltbedingungen während des Zellwachstums. Somit wurde es also notwendig, die Fähigkeit Colaminsäure zu bilden, zu unterbinden, um einen Stamm zu erhalten, der keine Zellwand synthetisieren kann, und nicht in anderen als in sorgfältig überprüften Laborbedingungen überleben kann. Im Laufe dieser Studien wurde der Stamm χ1702 in drei Schritten behandelt (Tabelle C), was zu dem Stamm χ1845 führt, der nunmehr die Deletion Δ29[bioH-asd] besitzt, die auch einen Dap^--Phänotyp verursacht, da Homoserin-semialdehyd nicht synthetisiert werden kann. Der Stamm χ1845 kann ebenso wie χ1702 Colaminsäure herstellen und ohne DAP unter geeigneten Bedingungen überleben, obgleich der Stamm nicht zu Dap⁺ revertieren kann. Es wurde eine durch Spontanmutation gegen hohe Konzentrationen von Nalidixinsäure resistente Mutante selektiert, um das Wiederauffinden des Stammes nach Durchgang durch den Intestinaltrakt von Ratten zu erleichtern. Diese Spontanmutante erhielt man, indem man eine große Zahl von Zellen des Stammes x1845 auf L-Agarplatten plattierte, die DAP und 100 µg/ml Nalidixinsäure enthielten. χ1846 trägt vermutlich eine Mutation in dem nalA-Gen, denn dies ist der einzige Ort, der bekannt ist für die Mutationen, die Resistenz gegen hohe Konzentrationen von Nalidixinsäure bewirken. χ1846 wurde dann mit dem Mutagen salpetrige Säure behandelt, und nach genügend langem Wachstum, um Segregation und Expression zu erreichen, auf MacConkey-Agarplatten ausplattiert, die DAP, Adenin, Galaktose und 0,2% KC10₃ enthielten. Diese Platten wurden unter anaeroben Bedingungen in einem BBI-Glasdruckbehälter inkubiert, um Gal^- Chl^r-Mutanten zu erhalten, die keine Colaminsäure synthetisieren können. Die Deletion Δ40[gal-uvrB], die in dem Stamm χ1846 induziert wurde, um den Stamm χ1849 zu erhalten, verursacht eine Hemmung der Colaminsäuresynthese und macht den Stamm gleichzeitig hochgradig UV-sensibel, verhindert die Photoreaktivierung und die Lysogenisierung durch Phagen λ, 82 und 434. x1849 konnte, wie gezeigt wurde, in Abwesenheit von DAP nicht überleben und zeigte eine gute Absterberate durch DAP-Mangel, obgleich er Passagen durch den Intestinaltrakt von Ratten überleben konnte und ein guter Empfänger für einige, aber nicht alle durch Konjugation übertragbaren R-Plasmide war. Deshalb wurde beschlossen, die his-53, purE41 und ilv-277 Allele zu entfernen, da diese die Wachstumsraten in laborfremder Umgebung unter Umständen reduzieren und so entweder die durch DAP-Mangel verursachte Absterberate oder deren Wahrscheinlichkeit verringern könnten. Es soll daran erinnert werden, daß, obgleich Studien mit Mäusen schon vor 10 Jahren anzeigten, daß pur Mutationen schädlich für das Überleben von Bakterien und/oder die Besiedlung des Intestinaltraktes waren (Jones und Curtiss, unveröffentlicht), solche Auswirkungen mit pur ^- Stämmen nicht beobachtet wurden in Experimenten, bei denen die Stämme an Ratten verfüttert wurden.

Gleichzeitig mit der Beseitigung dieses his-53 Alleles, was zu x1855 führte, wurde eine andere Mutation eingeführt, was Sensibilität gegen Gallensäuresalze und Tenside, vermehrte Sensitivität gegen zahlreiche Antibiotika, veränderte Sensitivität des Stammes gegen Phagen und eine reduzierte Empfängerfähigkeit bei Paarungsexperimenten mit Spendern, die mehrere verschiedene R-Plasmidtyp besitzen, zur Folge hat. Man nimmt an, daß diese Läsion entweder im rfbA oder rfbB Locus sitzt. Beide Loci sind kotransduzibel mit dem his Locus. Die Grundlage für diese Annahme, sowie die Abhängigkeit des Phänotyps, der hervorgerufen wird von dieser Mutation in Gegenwart von wenigstens einer zusätzlichen Mutation in x1949, die oms-1 genannt wird, wurde bestätigt. Die kombinierten Wirkungen der rfb-2 und oms-1 Mutationen resultieren auch in einem Con^- Empfängerphänotyp, einer vermehrten Resistenz gegen verschiedene Phagen und in einer Sensitivität gegen Gallensäuresalze, Antibiotika etc. χ1855 und seine Nachkommen sind auch temperatursensibel, d. h. sie sind unfähig, Kolonien bei 42°C zu bilden. χ1849 und seine Vorfahren (ausgenommen χ1697) bilden normalerweise Kolonien bei 42°C.

Das Entfernen der purE41 und ilv-277 Allele durch Transduktionsversuche mit P1L4 (χ289), woraus χ1864 resultiert (Tabelle C), gelang ohne große Schwierigkeiten. Erwähnenswert scheint, daß trotz der Teilresistenz von χ1855 und χ1859 gegen P1L4, welche durch die oms-1 und rfb-2 Mutationen, die man in χ1849 und χ1855 einführte, hervorgerufen wurde, die Transduzierbarkeit dieser Stämme nur um das 5- bis 10fache reduziert wurde, verglichen mit χ1849. Die Raten des Auftretens der Ilv⁺- und Pur⁺-Transduktanten waren immer noch weit größer als die Reversionsraten.

Da die thyA Mutationen zu Thyminmangeltod und zum Abbau von DNS im thyminlosen Medium und zu verringerten Überlebenschancen von Stämmen während der Passage durch den Ratten intestinaltrakt führen, wurde beschlossen, als letzten Schritt bei der Herstellung von χ1776 die thyA57 Mutation von χ559 (Tabelle I) in χ1864 zu überführen. Das thyA57 Allel wurde ausgewählt, da man bei diesem Allel niemals Reversion beobachtet hat, weder in χ559 noch in irgendeinem anderen Stamm, in welchen dieses Allel eingeführt worden war. Es erwies sich aber als schwierig, diese Mutation in χ1864 zu überführen, was auch wahrscheinlich nicht gelang. Nachdem P1L4 (χ559) 30 Minuten an χ1864 adsorbieren konnte (der Versuch wurde in L-Nährlösung+DAP+2,5×10^-3 M Calciumchlorid durchgeführt), wurde die Mischung einmal plattiert auf MA+Thr, Met, DAP, Bio, Thd, Glukose+10 µg/ml Trimethoprim und das andere Mal verdünnt in L-Nährlösung+Thd+DAP+10^-2 M Citrat (1 ml in 9 ml), um Wachstum für die Segregation und Expression zu ermöglichen. Nachdem ein Zelltiter von ungefähr 2×10⁸/ml erreicht war, wurden die Proben auf Selektionsmedien ausplattiert. Eine andere 1 : 10-Verdünnung wurde hergestellt mit L-Nährlösung+Thd+DAP+10^-2 M Citrat. Diese Versuche wurden zweimal durchgeführt. Die Häufigkeiten des Auftretens von Kolonien auf Selektionsmedien waren 1,2×10^-6 für das sofortige Plattieren und 7,0×10^-7, 1,3×10^-6 und 1,8×10^-6 nach Wachstum der ersten, zweiten und dritten verdünnten Mischung. Die Prozentzahlen der temperaturempfindlichen Thy^- Klone waren 40, 29, 21 und 11 für die vier Plattierungsversuche. Hierbei wuchsen die Trimethoprim-resistenten Kolonien nach dreitägiger Inkubation bei den zwei ersten Plattierungsversuchen, während die beiden letzten Plattierungsversuche nur 2 Tage inkubiert werden mußten. Da ungefähr die Hälfte der spontanen Thy^- Mutanten temperaturempfindlich sind in ihrer Thyminbedürftigkeit (z. B. wuchsen sie bei 30°C ohne Thymin) und da transduzierende Kolonie schneller wachsen sollten als Kolonien, die von Spontanmutationen abstammen, die auf Platten zu finden sind, nahm man an, daß die nicht-temperaturenempfindlichen Klone, die bei den beiden letzten Plattierungsversuchen auftraten, wirklich thyA57-Transduktanten repräsentieren. Einer dieser Klone wurde χ1776 genannt. Später entdeckte man jedoch, daß χ1776 wie auch einige andere dieser nicht-temperaturempfindlichen thyA-Klone mit einer geringen Rate zu Thy⁺ revertieren können. Deshalb kamen Zweifel darüber auf, ob die thyA-Mutation in χ1776 wirklich das thyA57 Allel sei. Dieses Allel könnte in Wirklichkeit zusammengesetzt sein aus zwei Mutationen in dem thyA-Gen. Möglicherweise ist nur eine der beiden Mutationen in den Stamm χ1776 eingeführt worden. χ1776 kann auch weniger gut bei 42°C wachsen als χ1864 und besitzt wenigstens eine zusätzliche Mutation, die die Ursache ist für die Veränderung in der Struktur der äußerem Membran, für die Sensibilität gegenüber Gallensäuren, für die Phagenresistenz und für den Con^- Empfänger Phänotyp. Diese Mutation wird oms-2 genannt und ist ungefähr 65% bis 80% kotransduzibel mit thyA.

Tabelle C

Stammbaum von χ1776

χ1849 bis χ1776 sind phänotypisch T3-sensibel. Die Bezeichnung thyA57*, die beim Genotyp χ1776 gewählt wurde, soll anzeigen, daß diese thyA-Mutantion, die revertieren kann, wohl nicht von der nicht-revertierbaren Mutation thyA57 im Stamm χ559 abgeleitet ist.

Aufbau von χ2076

Bei der Untersuchung von χ1776 wurde offensichtlich, daß sowohl thyA⁺ als auch Gallensäuresalze-Resistenz-Revertanten in sehr geringen, aber meßbaren Häufigkeiten erhalten wurden. Bei anderen Untersuchungen wurde festgestellt, daß die endA1-Mutation die Fähigkeit von Stämmen zur Transformation um den Faktor 5 bis 10 erhöhte, und daß die Kombination thyA deoA upp das Wachstum von Stämmen auf Thymin ausschloß und eine höhere Absterberate infolge Thyminmangels zur Folge hatte. Man beschloß deshalb, einen verbesserten Abkömmling von χ1776 zu konstruieren, mit der Bezeichnung χ2076 (siehe Tabelle D).

Nachstehend werden die Schritte erläutert, die bei der Konstruktion von x2076 vorgenommen wurden. Die Beseitigung der thyA57*-Mutation mit der lysA32-Mutation war jedoch mit einigen Schwierigkeiten verbunden, da einige dieser Kotransduktanten vermutlich oms-2⁺ wurden und dadurch geringfügig resistent gegen Gallensäuresalze. Ebenso wurden einige der Kotransduktanten, die Gallensäuresalz-sensitiv blieben, völlig resistent gegen P1L4, das eine weitere Benutzung der P1-Transduktion zur Konstruktion von Stämmen ausschloß. Aus diesem Grund wurde eine thy⁺ lysA32 Kotransduktante ausgewählt, die noch sensitiv für P1 war, und dieser Stamm (χ2065) wurde durch Transduktion zu lysA⁺ thyA57, also zum Stamm χ2067, verändert. Es wurde nicht beobachtet, daß die thyA57-Mutation in diesem Stamm zu thyA⁺ revertierte.

Die Einführung des serA12-Allels zum Zwecke der Kotransduktion von serA⁺ und endA1 und die Einführung des serB31-Allels zum Zwecke der Einführung von serB⁺ und Δ deoA benützt die Ampicillin-Cycloserin-Anreicherungstechnik, gefolgt von einer P1L4 Transduktion und einer Periode des Wachstums unter erlaubten Bedingungen, um Segregation und Expression des Phänotyps zu ermöglichen.

upp-Mutationen bedingten Resistenz gegen 5′-Fluoruracil und können deswegen als Spontanmutanten selektiert werden mit einer nachfolgenden Prüfung der Mutanten mittels Standardtechniken, um sicherzugehen, daß die Resistenz gegen 5′-Fluoruracil von einer upp-Mutation herrührt. Die Selektion von Spontanmutanten mit der Resistenz gegen den Phagen K3, die auf einer Änderung des Proteins 3a der äußeren Membran und eines Con^--Empfängerphänotyps bei Paarungsexperimenten mit Spendern, die ein Plasmid vom F-Typ besitzen, beruht, ist leicht durchzuführen. Ebenso leicht ist die Selektion von Spontanmutanten mit der Resistenz gegen den Phagen T4, die auf Mutantionen in den lpcA oder lpcB Genen beruht und Sensitivität für Gallensäuresalze verleiht, leicht durchzuführen. Die Tatsache jedoch, daß χ1776 schon Con^- ist und für Gallensäuresalze sensitiv, kompliziert die genetische und phänotypische Analyse von Stämmen mit zusätzlichen Mutationen, die diese Eigenschaften betreffen. Obwohl die Nicht-Revertierbarkeit der Gallensäuresalzsensitivität und die verminderte Fähigkeit als Empfänger zu wirken, verglichen mit χ1776, überprüfbare Eigenschaften von χ2076 darstellen, schließt die völlige Resistenz dieses Stammes gegen transduzierende Phagen und die Unmöglichkeit, Konjugationsanalysen anzuwenden, eine genetische Analyse zur Bestimmung der durch Mutationen defekten Gene praktisch aus.

Tabelle D

Stammbaum von χ2076

Aufbau von χ1972 und χ1976

Obwohl χ1776 und χ2076 geeignete und sichere Wirte für die Benützung mit Plasmid-Kloniervektoren bei der Untersuchung rekombinanter DNS-Moleküle sind, sind sie - infolge Resistenz gegen den Bacteriophagen λ - nicht besonders geeignet in Verbindung mit Kloniervektoren, die von λ herrühren. Aus diesem Grund, und da die Produktion von Minizellen bei Experimenten mit λ-Kloniervektoren weniger wichtig ist, wurde eine Reihe von Stämmen entwickelt, um den Umgang mit diesen Vektoren ebenso wie mit Plasmid-Kloniervektoren zu vereinfachen. Tabelle E zeigt die Abstammung von χ1972 und χ1976. Die Entwicklung und Konstruktion basierte auf Befunden und Techniken, die darin beschrieben sind. Außer χ1972 und χ1976 bringen die Stämme χ1961, χ1963, χ1966, x1968, χ1969, χ1970, χ1973, χ1974 und χ1975, die während der Konstruktion von χ1972 und χ1976 hergeleitet wurden, Nutzen für den Gebrauch mit bestimmten Phagenarten und Plasmid-Kloniervektoren.

Tabelle E

Stammbäume von χ1972 und χ1976

Methoden zum Test der genotypischen und phänotypischen Eigenschaften der Mikroorganismen, aufgezeigt an Hand des Stammes χ1776 Material und Methoden Allgemeines

Die Medien, Bakteriophagen und Bakterienstämme (siehe Tabelle I) und das Vorgehen bei Transduktionsversuchen, Herstellung von Mutanten und Anreicherung derselben, bei Konjugationsversuchen, Erzeugung von Minizellen und Wachstum derselben, wurden oben beschrieben. Tabelle III zeigt die Stämme, die durch Konjugation übertragbare Plasmide enthalten, die benutzt wurden, um die Empfängerfähigkeit von χ1776 unter verschiedenen Bedingungen zu testen, und um die Mobilisierung und Transmission von nicht-konjugativen Plasmid-Kloniervektoren, wie pSC101, pM89 und pCR1, in biparentalen und triparentalen Paarungsversuchen zu erforschen.

Überleben

Die Fähigkeit von Zellen zum Koloniewachstum, als eine Funktion der Zeit unter verschiedenen nicht-permissiven Bedingungen, wurde gemessen durch Plattieren geeigneter Verdünnungen auf Medien, die optimal waren für die Wiederherstellung der Fähigkeit zur Koloniebildung und zum Wachstum von x1776 oder seinen Plasmid-tragenden Abkömmlingen.

Markierung und Isolierung von DNS

Die Zellen wurden mit [³H]Thymidin markiert, in denen die üblichen Standardmethoden benutzt wurden. Plasmid DNS wurde isoliert mit Hilfe der "clearend lysate"-Methode und/oder der Ethidiumbromid-Cäsiumchloridmethode. Zur Plasmid-DNS-Isolierung aus Minizellen und zum Analysieren derselben wurde nach der alkalischen und neutralen Saccharose-Gradienten-Zentrifugationsmethode vorgegangen. Die alkalische Saccharose-Gradienten-Zentrifugation wurde ebenso angewandt, um das Ausmaß des Abbaus der chromosomalen DNS abzuschätzen.

Bestimmung der Radioaktivität

Proben, die radioaktiv markierte DNS enthielten, wurden auf Whatman 3 MM Filter gegeben. Die DNS wurde mit Trichloressigsäure gefällt. Die Radioaktivität wurde in einem Beckman LS-230 Scintillationszähler bestimmt. Es wurde BBOT-Toluol-Scintillationsflüssigkeit in kleinen Gläschen benutzt.

Transformation

Zu Beginn wurde die von Lederberg und Cohen (1974) beschriebene Methode benutzt, um Stämme mit Plasmid DNS zu transformieren, obgleich diese Methode für den Stamm χ1776 und andere Stämme mit Mutationen, die eine äußere Membranstrukturveränderung verursachen, unbefriedigend war. So wurde eine neue Transformationsmethode für solche Stämme entwickelt, die nachstehend beschrieben ist. Die pSC101-Plasmid-DNS wurde benutzt, um χ1776 zu transformieren, was zu χ1876 führte, der zum Vergleich von χ1776 getestet wurde, um zu zeigen, daß ein Plasmid-Kloniervektor in dem Stamm χ1776 den Nutzen und die Sicherheit dieses Stammes nicht verändert. Limitiertere Versuche wurden mit Derivaten des Stammes χ1776 durchgeführt, die mit pMB9 DNS (χ2042) und pCR1 DNS (χ2043) transformiert worden waren.

Andere Methoden

Methoden, die nur bei besonderen Experimenten angewandt wurden, sind dort beschrieben. Wenn nicht anders angegeben, wurde immer bei 37°C inkubiert.

Ergebnisse Genotypische und phänotypische Charakterisierung der Stämme Phänotypen, die von Mutationen in χ1776 bedingt sind

Die phänotypischen Eigenschaften von χ1776 und das Auflisten von Mutationen, die für jedes Merkmal verantwortlich sind, sind Tabelle IV zu entnehmen.

Stabilität von genotypischen und phänotypischen Merkmalen

Reversionsraten verschiedener Mutationsmarker von χ1776 und χ1876 sind aus Tabelle V zu ersehen. Wie erwartet, revertieren solche Merkmale nicht, die von Deletionen und/oder von zwei Mutationserreignissen verursacht werden. Die meisten dieser Merkmale wurden auf Stabilität in einigen der Vorfahren des Stammes χ1776 (Tabelle C) getestet und es wurde gezeigt, daß sie nicht revertieren. Zusätzlich wurde χ1776 nach Behandlung mit den Mutagenen Nitrosoguanidin und Methylmethansulfonat untersucht. Man fand keine Revertanten bis auf Thy⁺. Deshalb ist es sehr wahrscheinlich, daß die Dap^-, Mal^-, Bio^-, Gal^-, Met^-, Thr^- und Glyc^- Merkmale nicht revertieren. Die Reversion der thyA-Mutation war jedoch ganz unerwartet, da man geglaubt hatte, daß das nicht-revertierende thyA57-Allel erfolgreich auf den Stamm χ1776 transduziert worden war.

Tabelle VI gibt Daten über die Häufigkeit der Änderung mehrerer anderer phänotypischer Merkmale, die in χ1776 und χ1876 ausgedrückt werden, wieder. Die Häufigkeiten von deoB und deoC Mutationen, die den Stämmen x1776 und χ1876 gestatten, auf Medien mit 2 µg/ml Thymin anstelle von 40 µg/ml Thymin oder Thymidin zu wachsen (Tabelle VI), ist etwa 1000mal höher als die Häufigkeit von Mutanten, die auftreten, wenn man Thy⁺-Revertanten selektiert (siehe Fußnote zu Tabelle V). Wie nachstehend gezeigt, beeinflußt diese zweite Art von Mutation zu deoB oder deoC in χ1776 die Absterberate infolge Thyminmangels oder die Überlebensraten während der Passage durch den Intestinaltrakt der Ratten kaum. Revertanten, die fähig sind bei 42°C zu wachsen, sind ebenfalls leicht erhältlich, obwohl sie nicht entdeckt werden, wenn hohe Zelldichten (größer als 5×10⁷) plattiert werden. Beim Vergleich dieser Revertanten mit thermoresistenten Transduktanten (siehe unten) wurde bemerkt, daß einige der Transduktanten verglichen mit dem Wachstum bei 37°C bei 42°C in 100% Ausbeute anwachsen, während für drei getestete Revertanten die Ausbeute bei 42°C nur 0,3 bis 0,7% derjenigen bei 37°C betrug. Die Revertanten wachsen auch bei 37°C, aber nicht bei 42°C, auf supplementiertem Minimalagar, während die TS^r-Transduktanten auf supplementiertem Minimalagar sowohl bei 37°C als auch bei 42°C wachsen. TS^r-Revertanten und einige Transduktanten behalten die Sensitivität für Gallensäuresalze und wachsen nicht auf MacConkey-Agar. Es ist daher wahrscheinlich, daß die Revertanten durch verschiedene sekundäre, an anderen als den ursprünglichen Mutationsstellen aufgetretene Mutationsereignisse verursacht werden, die den ursprünglichen Mutanten-Phänotyp unterdrücken, und nicht durch Reversion. Man ist jetzt der Ansicht, daß der TS-Phänotyp durch zwei Mutationen verursacht wird, nämlich oms-1 und oms-2, wobei der letztere mit thyA cotransduzierbar ist, und wobei beide die Struktur der äußeren Membran, die Sensitivität für Gallensäuresalze etc. beeinflussen.

Revertanten, die auf Medien wachsen können, die entweder Gallensäuresalze oder Tenside enthalten, erscheinen mit ähnlichen Häufigkeiten (Tabelle VI). Auf MacConkey-Agar und L-Agar+Gallensäuresalze sind verschiedene Kolonietypen festzustellen. Diese können in Beziehung gebracht werden mit verschiedenen Graden der Resistenz gegen Tenside. Daraus kann wahrscheinlich abgeleitet werden, daß verschiedene Mutationstypen verantwortlich sind für die Gallensäuresalz- und Tensid-Resistenz-Phänotypen. Jene Revertanten, die gut anwachsen und große Kolonien auf MacConkey-Agar und L-Agar mit Gallensäuresalzen (0,37% und mehr) bilden besitzen eine Reihe weiterer Veränderungen, die in mancher Hinsicht die Sicherheit der Stämme χ1776 und χ1876 verringern. Von einigem Interesse ist die Beobachtung, daß die gegen hohe Konzentrationen von Gallensäuresalzen resistenten Revertanten mit geringer Effizienz (etwa 1%) auf L-Agar+DAP, Thd bei 42°C anwachsen. Obwohl diese Eigenart dem Verhalten der TS^r-Revertanten gleicht, sind die bis heute getesteten TS^r-Revertanten sensibel geblieben gegen Gallensäuresalze.

Überprüfung des Genotyps χ1776

Der Genotyp von χ1776 wurde mit Hilfe einer Transduktion mit P1L4 überprüft. Es wurden verschiedene Transduktanten-Klassen selektiert, die dann weiter untersucht wurden. Tabelle VII zeigt die Ergebnisse dieser Transduktionsexperimente. Eine repräsentative Anzahl von Transduktanten-Kolonien wurde in BSG+DAP überimpft und auf Selektionsmedium neu ausgestrichen. Einzelkolonien hiervon wurden auf verschiedene Selektivmedien ausgestrichen. Alle Transduktanten, die als Thr⁺, Mal⁺, Thr⁺, Mal⁺ oder Glyc⁺ selektiert worden waren, hatten die gleichen Eigenschaften und waren Thr⁺, Mal⁺, Glyc⁺, λ ^s, T5^r, Bio^-, Met^-, Gal^-, Thy^- Dap^- und UV^s. Diese Ergebnisse und die Tatsache, daß keine Bio⁺ oder Met⁺-Transduktanten gefunden wurden, deutet auf die Existenz von zwei, den Met^--Phänotyp bedingende Mutationen in χ1776 (metC65 und Δ29[bioH-asd]) und zwei, den Bio^- Phänotyp bedingende Mutationen (Δ40[gal-uvrB] und Δ29[bioH-asd]) hin. Als Bestätigung hierzu kann angeführt werden, daß die Gal⁺-Transduktanten Thr^-, Met^-, Dap^-, Thy^-, Mal^-, Glyc^- und Bio^- blieben, jedoch wie erwartet, UV^r wurden und unter geeigneten Bedingungen mucoide Kolonien bildeten, was auf die Fähigkeit zur Bildung von Colaminsäure hindeutet. Auch die Thy⁺-Transduktanten besaßen die erwarteten Eigenschaften und hatten die Phänotypen behalten, die mit den verschiedenen Mutationen gekoppelt sind; jedoch hatten zwischen 65 und 85% der Isolate die Temperatursensibilität verloren. Einige dieser Stämme konnten mit 100% Ausbeute bei 42°C auf L-Agar bzw. auf supplementierten Minimalagar gezogen werden. Daraus wird klar, daß eine zur Ausprägung des TS-Phänotyps notwendige Mutation eng gekoppelt mit dem Gen thyA ist.

Die sogenannten "Dap⁺-Transduktanten" (Tabelle VII) bleiben weiterhin ein Rätsel, da sie tatsächlich Dap^- sind. Sie bleiben Thr^-, Mal^-, Bio^-, Glyc^-, Met^-, Thy^-, Gal^- und UV^s. Wenn diese Transduktanten in L-Nährlösung mit DAP, Bio und Thd gezogen und danach gleich auf DAP-freien Penassay-Agar gebracht werden, dann können manche Kolonien hier wachsen, wenn der Penassay-Agar Natriumchlorid enthält. Wenn diese Kulturen 10fach verdünnt werden in BSG und DAP und dann erst auf DAP-freien Penassay-Agar gebracht werden, wachsen wiederum Kolonien heran, vorausgesetzt, daß Natriumchlorid im Agar vorhanden ist. Kulturen von χ1776, die auf dieselbe Weise gezogen und plattiert werden, können auf DAP-freien Platten keine Kolonien bilden. Wenn diese Transduktanten zuvor 1000fach in BSG verdünnt und dann erst auf Penassay-Agar mit ohne DAP gebracht werden, dann bilden sie Kolonien nur auf dem DAB-supplementierten Medium. Diese sogenannten "DAP⁺-Transduktanten" von χ1776 bilden schneller wachsende Kolonien als χ1776 auf MA-Platten, die DAP enthalten, obwohl nach 3tägiger Inkubation bei 37°C die Koloniegröße nicht unterscheidbar geworden ist. Die sogenannten Dap⁺-Transduktanten könnten deshalb Phänotypen repräsentieren, die geringere Konzentrationen von DAP zum Wachstum benötigen. Sie sind somit fähig, eine zum Wachstum genügende Menge von DAP aus der DAP-haltigen L-Nährlösung oder der BSG-Verdünnungslösung aufzunehmen, welche den Platten beim Plattieren zugegeben wurde. Es sollte daran erinnert werden, daß diese sogenannte Dap⁺-Typen langsamer wachsen als x1776 in beiden Medien. Auch wurde ihr Auftreten nicht beobachtet während der Reversionstests mit Hilfe von Mutagenen. In einem weiteren Versuch, das Wesen dieser sogenannten Dap⁺-Transduktanten zu verstehen, wurden sie zu Thr⁺ transduziert, um die Deletion Δ29[bioH-asd] zu eliminieren. Auch danach konnte gezeigt werden, daß sie immer noch die dapD8-Mutation besaßen.

P1L4 wurde vermehrt auf χ1925, einer gegenüber Gallensäuresalze resistenten Revertante von χ1776 (Tabelle VI), um die Mutationen in χ1776 weiter zu untersuchen. Verschiedene Stämme mit den Mutationen galK und galT wurden transduziert, um festzustellen, ob Gal⁺-Transduktanten gebildet wurden. Es wurden keine gefunden mit Häufigkeiten, die bis zu 10⁴ niedriger hätten liegen können, als die Häufigkeiten von Leu⁺-Transduktanten, welche im gleichen Empfänger selektiert wurden. Das heißt also, daß die Δ40[gal-uvrB] die meisten, wenn nicht gar alle Gene des gal Operons umfaßt. P1L4 (χ1925) wurde ebenso benützt, um χ1753 durch Transduktion LysA⁺ werden zu lassen. Eine Anzahl von thyA Cotransduktanten wurden selektiert, um festzustellen, ob die thyA-Mutation revertieren würde oder nicht, wenn sie in einen kleinen, von W1485 abgeleiteten Stamm zurückkehrt. Verschiedene dieser thyA-Stämme revertierten zu Thy⁺ mit Häufigkeiten von etwa 10^-9. P1L4 (χ559) wurde ebenso benutzt, um in χ1753 die Genorte LysA⁺ thyA57 durch Transduktion einzuführen. Verschiedene dieser Transduktanten konnten keine meßbare Anzahl von ThyA⁺-Revertanten erbringen. Es scheint deshalb, daß nur eines von beiden transduziert worden wäre in χ1864, aus dem dann χ1776 entstanden ist.

Transduktionsversuche mit P1L4 wurden ebenso benutzt bei Versuchen, die genetische Grundlage für die Gallensäuresalzresistenz zu klären, welche gleichzeitig mit dem TS-Defekt während der Transduktion von χ1849 zu einem His⁺-Stamm mit P1L4 (χ289) aufgetreten war, woraus der Stamm χ1855 entstand (Tabelle C). Wenn der Phage P1L4 (χ289) zur Einführung des Allels ThyA⁺ in den Stamm χ1776 durch Transduktion benutzt wurde, dann wurde 65 bis 85% der Transduktanten temperaturresistent und bekamen eine teilweise, jedoch nicht vollständige Resistenz gegen Gallensäuresalze. Gal⁺-Transduktanten von χ1776, die nach Anwendung von P1L4 (χ289) erhalten wurden, behielten ihre Gallensäuresalzsensitivität und konnten auf MacConkey-Agarplatten nicht anwachsen. Diese Transduktanten waren weiter gekennzeichnet durch ihren temperaturempfindlichen Phänotyp, ihre UV-Resistenz und die wiedererhaltene Fähigkeit, Colaminsäure zu synthetisieren. Es scheint deshalb so, als ob die Deletion Δ40[gal-uvrB] nicht notwendig ist für die Expression obwohl der Gallensäuresalzsensitivität als auch der Temperaturempfindlichkeit. Wenn χ1849 durch Transduktion mit P1L4, der auf χ289, χ1038 oder Derivaten von C600 und K-12-112-Linien gezogen worden war, zu His⁺ transduziert wurde, dann wurden 30% der His⁺-Transduktanten Gallensäuresalz-sensibel und temperaturempfindlich.

Da keine der His⁺-Transduktanten von χ1846 oder keiner der Stämme, von denen er abgeleitet ist, gallensäuresalzsensitiv wurde, kann abgeleitet werden, daß eine zusätzliche Mutation, die unabhängig ist von der Deletion Δ40[gal-uvrB] entstanden ist während der Ableitung des Stammes χ1849 vom Stamm χ1846. Diese Mutation erlaubt die Expression einer Mutation, die gekoppelt ist mit dem Gen his und die wahrscheinlich in vielen K-12-Linien vorhanden ist. Diese Annahme stimmt überein mit der Tatsache, daß eine Selektion von Gallensäuresalz-resistenten Transduktanten von χ1776 nach Transduktion mit P1L4, der auf χ403 gewachsen war, einer his-Mutante, die sich von χ289 ableitet (Tabelle I), zu einer hohen Ausbeute solcher Transduktanten führt, von denen keine His^- wurde. Diese Transduktanten jedoch sind ebenso wie die Gallensäuresalz-resistenten Revertanten teilweise temperaturresistent mit einer Keimungsrate von 10^-2 auf L-Agar bei 42°C. Sie behalten auch alle weiteren bekannten Mutationen von χ1776 bei. Daraus folgt, daß die als oms-1 bezeichnete Mutation, die die Expression der his-gekoppelten Mutation in χ1776 erlaubt, die jedoch im Wildtyp die Expression der his-gekoppelten Mutation in verschiedenen K-12-Stämmen verhindert, nicht eng gekoppelt ist mit irgend einer der genetischen Marken des Stammes χ1776. Gestützt auf die Cotransduktionshäufigkeiten und das Muster der Phagensensitivität wird angenommen, daß die mit his-gekoppelte Mutation entweder der rfbA oder der rfbB Locus ist. In einer anderen Art von Experiment, in welchem ein Hfr-Spender, der sein Chromosom im Uhrzeigersinn beginnend in der Nähe des Gens metC (bei 64 Minuten) transferiert und der die thyA-lysA Region (bei 60 bis 61 Minuten) transferiert und der mit dem Stamm χ1776 gepaart wird, wurden vollständig gallensäuresalzresistente Transkonjuganten schon im frühen Paarungsstadium gebildet. Diese Transkonjuganten waren teilweise temperaturresistent. Die Gesamtheit dieser Resultate legt nahe, daß das oms-1 benannte Gen, das im χ1849 anwesend ist, im Intervall zwischen 64 und 72 Minuten auf dem E. coli-Chromosom lokalisiert ist und daß es in Verbindung mit dem rfb-2-Allel die Sensitivität gegen Gallensäuresalze, Tenside, Gifte und Antibiotika etc. und die Resistenz gegen Phagen bedingt und daß es zu der Unfähigkeit, bei 42°C zu wachsen, beiträgt. Diese Ergebnisse deuten weiter auf die Existenz eines weiteren Genes oms-2 hin, welches zuerst in χ1776 auftauchte, und das etwa bei 60,2 Minuten auf dem E. coli-Chromosom gekoppelt mit dem Gen thyA lokalisiert ist. Es verstärkt die Temperaturempfindlichkeit und die Gallensäuresalzempfindlichkeit von χ1776. Die Unfähigkeit des transduzierenden Phagen P1L4, auf χ1776 zu wachsen, macht eine vollständige genetische Analyse der Grundlage und Wechselwirkungen der rfb-2, oms-1 und oms-2 Mutationen sehr schwierig.

Bei der Überprüfung des restiktionslosen Phänotyps von χ1776 wurde zuerst festgestellt, daß die Phagen 434, Φ12, P1L4, 6SR, FP3, Br10, BF23 und ΦH nicht der Restriktion des K-12-Systems unterworfen waren. λ und 21 konnten selbstverständlich nicht getestet werden auf χ1776, wegen der Deletion Δ29[bioH-asd]. Das gleiche gilt für T1 und Φ80 wegen der Mutation tonA53. Es wurde deshalb entschieden, die Thr⁺-Transduktanten, die von x1776 und λ vir erhaltenen zu benützen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß λ1776 Thr⁺-Transduktanten kein Restriktionssystem besitzen. Dagegen zeigten die Thr⁺-Transduktanten von χ1776 allgemein eine dreifache Reduktion der Fähigkeit von λ vir, sich auf ihnen zu vermehren. Es wurde ferner festgestellt, daß das Wachstum der Wirtsbakterien in einer glucosehaltigen L-Nährlösung und das Plattieren auf maltosefreie Medien zu einer 90fachen Reduktion der Fähigkeit auf λ1776 Thr⁺-Transduktanten zu Wachstum führte, verglichen mit dem Wachstum auf λ289 unter denselben Bedingungen. Ein Wachstum der Wirtsstämme in einem modifizierten maltosehaltigen L-Medium und das anschließende Plattieren auf maltosefreies Medium führte zu einer 5fachen Reduktion. Diese Effekte sind spezifisch für die Abkömmlinge des Stammes λ1776, da gleiches Wachstum von λ vir bei allen Medienkombinationen mit oder ohne Maltose gefunden wurde, wenn man λ vir auf g1776 wurde ebenso bestätigt in Transformationsversuchen mit Plasmid-DNS von λ289 und λ1038-Abkömmlingen.

Die Anwesenheit der supE42-Mutation wurde auch mit Hilfe der χ1776 Thr⁺-Transduktanten untersucht. λ cI857 N7 N213 erbrachte eine Ausbeute nach Wachstum auf den meisten dieser Stämme in Anwesenheit von Maltose von ca. 10^-1. Wenn 0,1% Glucose ersetzt wurde durch 0,3% Maltose in allen Medien, wurden keine λ cI857 N7 N213 Plaques mehr gefunden. Diese Ergebnisse zeigen ebenso, daß die χ1776 Thr⁺-Transduktanten bezüglich des Wachstums abhängiger von Maltose sind, aber weniger in der Lage, die Vermehrung von λ zu fördern, als Wildtyp K-12-Stämme. Das geringe Wachstum der Doppelmutante N λ können jedoch bedeuten, daß das supE42-Allel in den χ1776 Thr⁺-Transduktanten derart modifiziert ist, daß nur eine schwache Unterdrückung der Doppelmutante N λ erfolgt. Um diese Erklärung auszuschließen, wurde das pLM2-Plasmid, das Ambermutationen in den bla und tet Genen hat, in χ1776 eingeführt. Die Resistenz sowohl gegen Ampicillin als auch Tetracyclin wurde normal ausgedrückt, was die Gegenwart eines unveränderten supE42-Allels anzeigt.

Wachstumseigenschaften

Die Ausbeuten von Plattierungsversuchen mit χ1776 wurden auf einer Reihe von Medien in Gegenwart und Abwesenheit von Cycloserin und Nalidixinsäure als Mittel getestet, die geeignetsten Medien für sein Wachstum und seine Gewinnung aus gemischten Populationen von Mikroorganismen zu bestimmen, und um bestimmte erwartete Phänotypen zu prüfen. Ähnliche Tests, obwohl in begrenzterem Rahmen, wurden mit den meisten der Vorfahren von χ1776 und mit χ1876 durchgeführt.

χ1776 ergibt eine 100prozentige Ausbeute bei der Plattierung auf geeignet supplementiertem L-Agar, Penassay-Agar und Minimal-Agar, der Glucose mit oder ohne Casaminosäuren enthält. Entsprechend wurden Ausbeuten von 90 und 80% auf geeignet supplementiertem EMB und Brain Heart Infusion Agarmedium beobachtet. Die Ausbeute auf Minimal-Agar, der Casaminosäuren ohne Zusatz einer Kohlenstoffquelle enthielt, war 10^-2, bei Zusatz von Glycerin jedoch weniger als 10^-6. Dieses letztere Resultat war zu erwarten, da die Δ29[bioH-asd] Mutation eine Deletion der Gene für die aerobe Glycerinphosphat-Dehydrogenase bedingt und sich daher Glycerinphosphat in den Zellen ansammeln und einen Glycerinstau verursachen sollte. χ1776 ergibt auch eine Ausbeute von 10^-5 auf Trypton-Agar (1%), der DAP, Thd und Bio enthält.

Wenn hohe Dichten von χ1776 auf die Medien plattiert wurden, die eine geringe Ausbeute ergeben, wurden manchmal Mutanten und/oder Revertanten erhalten. Derartige Typen wurden auf denselben Selektivmedien rein dargestellt, und anschließend wurden repräsentative Typen zahlreichen Tests unterworfen. Diese Tests schlossen die Überprüfung wichtiger phänotypischer Eigenschaften ein (mehr Ansprüche; Plattierungsergebnisse; Sensitivität gegenüber Phagen, Antibiotika, Tensiden, etc.; Absterberaten infolge DAP- und Thymin-Mangels; Überleben während der Passage durch Ratten; etc.). Alle Isolate hatten dieselben Nähransprüche wie χ1776 und wuchsen mit denselben oder gewöhnlich mit niedrigeren Raten als χ1776 in Flüssigmedien. Mit Ausnahme einiger Gallensäuresalz-resistenter Mutanten besaßen sie dieselben Phänotypen und zeigten dieselben oder höhere Absterberaten infolge DAP- und Thymin-Mangels wie χ1776. Einige dieser Isolate zeigten eine veränderte Ausbeute auf verschiedenen Medien, besonders auf dem Medium, auf dem sie selektiert wurden.

Tabelle VIII gibt Ausbeuten von Plattierungsversuchen für 1776 auf verschiedenen Medien bei verschiedener Konzentration von Nalidixinsäure und/oder Cycloserin wieder. EMB-Agar, der 75 µg Nalidixinsäure/ml enthielt, wurde verwendet, um Stämme der gemischten Flora, die im Rattenintestinaltrakt vorhanden ist, wiederzufinden. Es wurde Hefeextrakt-freier EMB-Agar verwendet, um Stämme in Rattenfütterungstests wiederzufinden, da es wünschenswert war, das Medium für die bestehende Flora so arm als möglich zu machen. Pdx und Ade wurden diesem Medium hinzugefügt, da das erstere von χ1841 (χ1488 Nal^r) und das letztere von vielen Vorfahren des Stammes χ1776 (siehe Tabelle C) benötigt wird. Außer beim verwendeten EMB-Agar wurde Nalidixinsäure gewöhlich mit einer Konzentration von 25 µg/ml benutzt. Tatsächlich ist die minimale Hemmkonzentration (MKH) von Nalidixinsäure für Nal^s-Stämme im EMB-Agar doppelt so hoch wie im L-Agar. Normaler EMB-Agar (der Hefeextrakt, DAP und Thd enthält) mit 25 µg Nalidixinsäure/ml und manchmal mit 10 bis 15 µg Cycloserin/ml wird routinemäßig bei der Transformation von χ1776 benutzt, um eine unerwünschte und unwahrscheinliche Transformation einer Kontaminante auszuschließen.

Nach der Durchführung von Vorversuchen über das Wachstum von χ1776 und χ1876 in komplexen Flüssigmedien wurde festgestellt, daß supplementierte L-Nährlösung höhere Wachstumsraten und Zellerträge erbringt als Penassay-Nährlösung oder Brain Heart Infusion Nährlösung. So haben χ1776 und χ1876 Generationszeiten von 50 bis 60 min in L-Nährlösung+DAP+Thd, 85 bis 95 min in ML+CAA+DAP+Bio+Thd+Glucose, und 160 bis 180 min in ML+Thr+Met+DAP+Bio+Thd+Glucose. χ1841 hat Generationszeiten von etwa 42, 70 und 150 min in diesen drei Medien. Es ist ersichtlich, daß die Wachstumsraten von χ1776 und χ1876 ein wenig hinter der von χ1841, dem Nal^r-Abkömmling ihres gemeinsamen Vorfahrens x1488, zurückblieben. Es sind noch höhere Wachstumsraten für χ1776 und χ1876 gemessen worden, als hier angegeben sind. Tatsächlich kann χ1776 in supplementierten ML mit einer Generationszeit von 130 min wachsen. Dieses schnellere Wachstum ist vermutlich eine Folge der viel höheren Sorgfalt beim Waschen und Spülen der Laborglasgeräte. Es wurde nämlich festgestellt, daß χ1776 und x1876 gegenüber ionischen Tensiden extrem empfindlich sind. χ1776 und χ1876 erreichen selten Titer lebensfähiger Zellen von mehr als 5 bis 8×10⁸/ml. Der Grund hierfür ist unbekannt, aber es ist unwahrscheinlich, daß dies entweder durch Erschöpfung der Nährlösung oder durch Anhäufung von toxischen Nebenprodukten bedingt ist, da keine weitere Zunahme der Zellzahl beobachtet wird, wenn eine Kultur mit annähernd 6×10⁸ Zellen/ml sedimentiert und dann in frisches Medium suspendiert wird, und da die überstehende Flüssigkeit einer solchen Kultur das erneute Wachstum von χ1776-Zellen bis zu einem Titer von 5 bis 8×10⁸/ml erlaubt.

Wirkung der Temperatur auf Überleben und Plasmid-Curing

Läßt man χ1776 bis zur log-Phase in L-Nährlösung+DAP+Thd wachsen, suspendiert in BSG oder L-Nährlösung+DAP+Thd und inkubiert dann bei 43°C, so findet man exponentielle Verlustraten in der Fähigkeit zur Koloniebildung während der ersten 6 bis 9 Stunden der Inkubation. Die Überlebenschance nimmt in L-Nährlösung um 55%/Stunde, in BSG um 84%/Stunde ab. Es wurde auch beobachtet, daß während 20stündigem Wachstum in L-Nährlösung oder in Penassay-Nährlösung (+DAP und Thd) bei 42°C pSC101-enthaltende Abkömmlinge von χ1846 und χ1849, aber nicht von x1841 (χ1488 Nal^r), das Plasmid bei 19% bzw. 32% der Zellen verlieren. Dieses "Curing" während der Inkubation bei 42°C ist somit eine Eigenschaft der Zellen und nicht des Plasmids. Obwohl x1876 bei 42°C nicht wächst, wächst er bei 41°C ganz langsam, und 3,4% der Zellen, die bei dieser Temperatur über Nacht gewachsen sind, verlieren pSC101. Diese Eigenschaft könnte für bestimmte Experimente von Nutzen sein. pSC101 ist jedoch absolut stabil in allen vier Stämmen, wenn man sie bei 37°C bebrütet, da ein Verlust der Tetracyclinresistenz bei mehr als 4000 Klonen, die durch Stempeltest geprüft wurden, nicht beobachtet wurde.

Resistenz gegen Bakteriophagen

Die Wirkung verschiedener E. coli Phagen auf χ1776, seine Vorfahren und Abkömmlinge, wird in Tabelle X gezeigt. Diese Ergebnisse erhielt man mit Hilfe der Kreuzstrichmethode, die etwas unempfindlich zum Nachweis niederer Sensibilitätsniveaus oder Teilresistenzen sein kann. Man erhält z. B. beim Plattieren des Phagen 434 auf χ1776 eine Ausbeute von 10^-3 im Vergleich mit χ289, obgleich es nach der Kreuzstrichmethode so aussieht, als ob χ1776 sehr empfindlich gegen 434 sei. Im Hinblick auf die Empfindlichkeit gegen P1L4 wurden Resistenzunterschiede während der Ableitung von χ1776 von χ1488 festgestellt (Tabelle C). Dies zeigte sich durch eine starke Verringerung der Ausbeute von P1L4, was eine Begleiterscheinung bei der Einführung der his⁺ und Gallensäuresalzempfindlichkeit-Marker (vermutlich rfbA oder rfbB; siehe unten) war, um aus dem Stamm χ1849 den Stamm χ1855 herzustellen, und eine Begleiterscheinung des langsamen Abfalls der Transduktionshäufigkeit von P1L4 (χ289) während der Ableitung von χ1776 (Tabelle XI). Es wurden Ausbeuten von P1L4 bei Plattierungsversuchen von weniger als 10^-10 auf x1776 beobachtet sowohl bei der Benutzung von L-Medium als auch bei im P1-Minimalmedium. Eine Anzahl von Experimenten wurde durchgeführt, um die Transduktionsfähigkeit von P1L4 auf χ1776, nicht aber die Plaquebildung, abzuschätzen. Mit Hilfe der Standard-anti-P1-Serummethode wurde festgestellt, daß während einer Adsorptionsdauer von 30 Minuten nur 5% der Menge an P1, die den Stamm χ289 infiziert, den χ1776 infiziert. Weiterhin wurde mit dieser Methode festgestellt, daß die Latenzzeit von χ1776 zweimal so lang ist, wie die von χ289, und die mittlere Anzahl von Phagen, die aus einer Bakterienedle hervorgehen, bei beiden Stämmen gleich ist (Wurfgröße). Zusätzlich zeigte sich, daß Resistenz des Stammes χ1776 gegen eine Infektion durch P1L4 ihre Ursache hat in Defekten in P1-Infektionsfähigkeit und nicht in der P1-Fortpflanzung. Diese Erkenntnisse lieferten Versuche über die Phagenvermehrung, die einer Temperaturinduktion von Plcml clr100 lysogenen Stämmen von χ1776 und χ289 folgt. Mit beiden lysogenen Stämmen χ289 und χ1776 erhielt man die gleiche Anzahl von plaquebildenden Einheiten und transduzierenden Phagen, die die Resistenz gegen Chloramphenicol cordieren.

Die gegen Gallensäuresalze resistenten Revertanten von χ1776 und χ1876 (χ1925 und χ1928) werden wieder sensibel gegen die Phagen P1L4, D108, ΦW, PV, Br60 und C21 und wieder resistent gegen Φ12, wie dies auch der Stamm χ1849 zeigt (Tabelle X). Es folgt daraus, daß die Veränderung in der Oberfläche der Bakterienzelle, die gekoppelt ist mit der Empfindlichkeit gegen Gallensäuresalze, sich auch auswirkt auf die Fähigkeit zahlreicher Phagen, mit dieser Zelloberfläche in Wechselwirkung zu treten.

Zusammenfassend zeigen alle Versuche, die sich mit der Resistenz von x1776 gegen verschiedene Phagen befassen, daß χ1776 vollständig resistent ist gegen die speziell transduzierenden Phagen χ, 21 und 80 und wahrscheinlich vollständig resistent gegen Mu, D108 und T1 ist, welche mit geringer Frequenz allgemein transduzieren können. Die Versuche zeigten auch, daß χ1776 teilresistent ist gegen den spezifisch transduzierenden Phagen 434 und teilresistent gegen den allgemein transduzierenden P1. Obwohl diese Veränderungen vermutlich die Wahrscheinlichkeit des natürlichen potentiellen Gentransfers von χ1776 verringern, ist es dennoch offensichtlich, daß die Zelloberflächenveränderungen die Ursache für die Sensibilität gegen einige bekannte (Tabelle X) und vermutlich auch unbekannte Phagen sind, die speziell oder allgemein transduzieren können.

Reaktion auf Antibiotika, Mutagene, Arzneistoffe, Tenside und Gallensäuresalze

In Tabelle XII sind die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) zahlreicher Antibiotika, Mutagene, Arzneistoffe, Tenside und Gallensäuresalze für χ289, χ1841 (χ1488 Nal^r), χ1776 und χ1876 sowie für einen gegen Gallensäuresalze resistenten Abkömmling von χ1776 (χ1925, siehe Tabelle VI) aufgeführt. Diese Daten zeigen, daß die Stämme χ1776 und χ1876 stärker empfindlich gegenüber fast allen geprüften Verbindungen sind als ihre Vorfahren. Ausnahmen dieser allgemeinen Regel bilden diejenigen, die verstärkt resistent sind gegen Nalidixinsäure (verursacht durch die nalA25-Mutation), Trimethoprim (verursacht durch die thyA57*-Mutation) und Cycloserin (verursacht durch die cycA1- und cycB2-Mutationen) und, im Falle von χ1876, gegen Tetracyclin (codiert auf dem Plasmid pSC101). Es ist darauf hinzuweisen, daß die MHK von Tetracyclin (50 µg/ml) für den Stamm 1876 niedriger ist als für andere "normale" Stämme, die das Plasmid pSC101 besitzen. Um diese "normalen" Stämme zu hemmen, müssen mindestens 100 bis 200 µg/ml im Nährmedium enthalten sein. Der Stamm χ1876 wächst tatsächlich nicht mit 100prozentiger Ausbeute auf Agarplatten, die mehr als 12,5 µg/ml Tetracyclin enthalten. Der Stamm χ1841 und die Abkömmlinge von χ1846, die das Plasmid pSC101 enthalten, wachsen jedoch mit 100prozentiger Ausbeute auf Agarplatten, die 50 oder gar 100 µg/ml Tetracyclin enthalten. Somit ist es wahrscheinlich, daß die Einführung von Plasmid-Kloniervektoren in den Stamm χ1776, die die Resistenz gegen andere Antibiotika codiert, zu Stämmen führen wird, die gegen geringere Antibiotikakonzentrationen resistent sind, als es "normale" Stämme von E. coli K-12 wären.

Die zunehmenden Sensibilitäten der Stämme χ1776 und χ1876 gegen Chloramphenicol sollten zur Folge haben, daß geringere Mengen davon ausreichen, um zu einer Vermehrung des ColE1-Plasmid-Kloniervektors zu führen. Die außerordentliche Sensibilität dieser Stämme für Rifampicin sollte für Studien, die sich mit der von "chimären" Plasmiden gesteuerten RNS-Synthese in Minizellen beschäftigen, von Nutzen sein.

Der gegen Gallensäuresalze resistente Abkömmling χ1925 gewinnt vollständige Resistenz gegen Natriumdodecylsulfat, Sarcosyl, Desoxycholat, Gallensäuresalze und Rifampicin; er wird teilresistent gegen Streptomycin, Spectinomycin und Kanamycin und bleibt unverändert im Hinblick auf seine erhöhte Sensibilität für Chloramphenicol, Tetracyclin und Mitomycin C, im Vergleich mit den Reaktionen der Stämme χ289, χ1841 und χ1776 (Tabelle XII). Es ist deshalb wahrscheinlich, daß die Mutationen, die die Sensibilität gegen Gallensäuresalze übertragen, auch verantwortlich sind für die erhöhte Sensibilität des Stammes χ1776 gegenüber den meisten, wenn nicht sämtlichen genannten Verbindungen.

In kinetischen Experimenten wird χ1776 schnell abgetötet von entweder 0,15% Gallensäuresalze oder 0,02% Natriumdodecylsulfat, während der Stamm χ289 gut in Gegenwart von 0,15% Gallensäuresalzen und 0,4% Natriumdodecylsulfat, die gleichzeitig zum Nährmedium gegeben werden, wächst. Andere Versuche ergaben, daß der Stamm χ289 in L-Nährmedium, das entweder 0,75% Gallensäuresalze oder 1% Natriumdodecylsulfat enthält, normal wächst. χ1876 zeigt dieselben, durch Gallensäuresalze und Natriumdodecylsulfat verursachten Absterberaten, wie sie für χ1776 gefunden wurden. Erhöht man die Gallensäuresalzkonzentration über 0,15%, so wird das Absterben der Stämme χ1776 und χ1876 nicht beschleunigt, wogegen die Verwendung von mindestens 0,1% Natriumdodecylsulfat zu der größten Absterberate, die für Gallensäuresalze beobachtet wurde, führt. Die außerordentliche Empfindlichkeit von x1776 gegenüber Tensiden sollte seinen Gebrauch bei der Plasmid-DNS-Isolierung erleichtern, und die Empfindlichkeit gegen Gallensäuresalze sollte seine Überlebenschance im Intestinaltrakt von Tieren verringern. Die extreme Empfindlichkeit von χ1776 gegen ionische Tenside kann jedoch Transformationsexperimente erschweren, in denen die DNS von Zellen erhalten wurde, die der leichteren Lyse wegen mit ionischen Tensiden behandelt wurden. Darum ist es sehr wichtig, entweder die DNS sorgfältig zu dialysieren, um alle Spuren von ionischen Tensiden zu beseitigen, oder keine ionischen Tenside zur DNS-Isolierung zu benutzen, da Calciumchlorid-behandelte, kalt inkubierte, hitzegeschockte 1776-Zellen sehr schnell schon bei den geringsten Konzentrationen von ionischen Tensiden abgetötet werden.

Grundlage für die Zuordnung einer Mutation, die die Empfindlichkeit für Gallensäuresalze in den rfbA oder rfbB Locis bewirkt

In E. coli K-12 wurde kürzlich die Struktur der Lipopolysaccharide charakterisiert als [Lipid A, (P_i)_n, Ketodeoxy­ octanat]-[heptose]-[(glucose)₄]-[(glucose)₂-(galactose)₂-rhamnose]. Das Entfernen der Galactose und somit auch der Rhamnose, was durch die galE- oder galU-Mutationen verursacht wird, führt zu einer Sensibilität gegen den Phagen C21, welcher x1849 und die gegen Gallensäuresalze resistenten Abkömmlinge χ1925 und χ1928, aber nicht χ1776 und χ1876 infizieren kann (Tabelle X). Für die Infektion durch den Phagen C21 ist die Heptose-(glucose)₄-Struktur notwendig. Sie geschieht aber unabhängig von den zwei terminalen Glucoseresten, die in Form von UDP-Glucose zugegeben werden, deren Synthese vom galU-Gen gesteuert wird. Da die Gal⁺-Transduktanten von χ1776 (Tabelle VII) Colaminsäure produzieren können, kann die Mutation in χ1776, die die Sensitivität für Gallensäuresalze verursacht, nicht die Synthese von Colaminsäure blockieren. Diese Mutation kann daher nicht in der galU-Region sein. Die vier an Heptose gebundenen Glucosereste sind an die LPS-Moleküle als TDP-Glucose gebunden, deren Synthese von den rfbA- und rfbB-Loci kontrolliert wird. So würde eine Mutation in jedem Gen Resistenz gegen C21 bewirken. Mutationen in den lpcA-, lpcB- und rfa-Genen betreffen (P_i)_n und Heptose in der LPS-Hülle, bewirken erhöhte Sensibilität für Antibiotika und Resistenz gegen den Phagen T4. Diese Mutationen verleihen außerdem Resistenz gegen P1 und gegen Gallensäuresalze, Tenside etc. Da x1776 empfindlich gegen T4, T7 und einige andere Phagen bleibt, die nur an rough-Stämmen adsorbieren (FP3, BR10, 5SR), und da χ1776 nur teilresistent gegen P1 ist, können Mutationen in den lpcA-, lpcB- und rfa-Genen als für den Phänotyp von χ1776 verantwortliche Mutationen ausgeschlossen werden. Mutationen in den envA- und envB-Locis können ebenso ausgeschlossen werden, da sie mit unnormaler Zellteilung und ungewöhnlichen Zellformen, die nicht für χ1776 charakteristisch sind, einhergehen. Man schließt deshalb daraus, daß sehr wahrscheinlich eine der Mutationen, die Sensibilität gegen Gallensäuresalze bewirken (zum ersten Mal beim Stamm χ1855 beobachtet), ihren Sitz entweder in dem rfbA-Gen 72777 00070 552 001000280000000200012000285917266600040 0002002644432 00004 72658 oder im rfbB-Gen hat, welche mit einer Wahrscheinlichkeit von ungefähr 30% kotransduzibel mit dem his-Operon wären. Die vorliegenden Ergebnisse deuten sehr darauf hin, daß das angenommene rfb-Allel in dem Stamm χ289 und anderen K-12-Stämmen vorhanden ist, aber dort nicht zur Expression gelangt, und daß seine Expression in χ1855 der Gegenwart einer anderen Mutation, die oms-1 genannt wird und in χ1849 vorkommt, zu verdanken ist.

Sensitivität gegen UV- und Fluoreszenzlicht

Durch die Δ40[gal-uvrB]-Deletion fehlt eines der Gene, die die für das Herausschneiden von Thymindimeren (uvrB) verantwortliche Endonuclease codieren, und das Gen, das die Photoreaktivierungsenzyme codiert (phr). Deshalb sollte man erwarten, daß χ1776 und χ1876 extrem empfindlich gegen UV-Bestrahlung sind und unfähig sind, UV-induzierte Schäden bei Bestrahlung mit Licht von 365 nm zu reparieren. Diese Voraussagen wurden experimentell bestätigt durch Messungen der Überlebensrate als einer Funktion der UV-Bestrahlungsdosis und durch Bestrahlung der Zellen mit Wärmestrahlen und Fluoreszenzstrahlen. Die Sensibilität von χ1846 und χ1776 gegenüber Fluoreszenzstrahlung wurde auch gemessen, um zu entscheiden, ob das Arbeiten mit χ1776 im Labor entweder unter abgeschattetem oder unter gelbem Licht geschehen sollte. Die Zellen wurden in BSG+DAP+Thd suspendiert und bei Raumtemperatur in abgeschlossenen benetzbaren Plastikkulturschalen mit zwei parallelen, 15 W kalten, weißfluoreszierenden Röhren bestrahlt, die in einer Standardpultlampe 10 cm über den Kulturen angeordnet waren. Nach 48 Stunden hatten von χ1846 6% und von χ1776 0,07% überlebt. Die erhöhte Sensibilität von χ1776, verglichen mit χ1846, ist höchstwahrscheinlich dem kleinen Anteil UV-Licht, das vom Glas der fluoreszierenden Röhren und den Plastikdeckeln der Zellkulturschalen durchgelassen wird, zuzuschreiben und auch der Tatsache zuzuschreiben, daß χ1776 etwas schneller abstirbt als "Wildtyp"-Stämme, wenn man ihn in BSG bei Raumtemperatur aushungern läßt.

Das Überleben von Stämmen Tod infolge Dap-Mangel

Oftmals und unter zahlreichen Bedingungen wurden die DAP-Mangelabsterberaten für die Stämme χ1776 und χ1876 getestet. Die Dap-Absterberaten sind mäßig, wenn für die Zellen die Bedingungen günstig sind, Makromolekülsynthese durchzuführen, was in L-Nährmedium+Thd und in NL-Medium+Casaminosäuren+Bio, Thd, Glc der Fall ist. Jedoch tritt in supplementiertem ML-Medium, dem sowohl DAP als auch Lysin fehlt, wenig oder gar kein Dap-Mangeltod mit Verlust von koloniebildenden Einheiten auf, ähnlich wie es auch für Suspensionen von χ1776 in BSG beobachtet wird. Fügt man Lysin den ML-Medien zu, so kann die Proteinsynthese ablaufen, und DAP-Mangeltod tritt ein, aber mit geringeren Raten als in den besseren Medien. DAP-Mangeltod war in allen Fällen eine Folge von defekter Zellwandbiosynthese, wie man im Lichtmikroskop beobachten konnte, und eine Folge der Lyse der Zellen, was durch Messungen der optischen Dichte gezeigt wurde.

In einigen früheren Versuchen, die der Erforschung der DAP-Mangelabsterberate dienten, wurden Auswirkungen, die durch Zugabe von Nalidixinsäure und/oder Cycloserin verschiedener Konzentration zum Flüssig- und Festmedium entstanden, erforscht. Bei diesen wie bei anderen Experimenten wurde festgestellt, daß Nalidixinsäure in L-Nährmedium und L-Agar nur bis zu einer Konzentration von 25 µg/ml zugefügt werden soll, wenn ein Überleben der Stämme χ1776 und χ1876 gefordert wird, obgleich dafür bis zu 75 µg/ml in EMB-Agar noch zulässig sind. Cycloserin kann auch diesen Medien bis zu einer Konzentration von 10 µg/ml bei maximaler Erholung lebensfähiger Zellen zugesetzt werden.

Während der Konstruktion von χ1776 und vor der Einführung einer Δ40[gal-uvrB]-Mutation, zur Blockade der Biosynthese von Colaminsäure, beobachtete man, daß die DAP-Mangelabsterberate abhängig von der NaCl-Konzentration im L-Nährmedium ist. Es wurde experimentell nachgewiesen, daß die Gegenwart von NaCl in L-Nährmedium eine deutliche Abnahme der DAP-Mangelabsterberate für den Stamm χ1846 zur Folge hatte (welcher Colaminsäure herstellen kann), die NaCl-Konzentration auf den Stamm χ1849 eine geringere Wirkung hatte und auf die Überlebensrate von χ1776 gar keine. In zahlreichen Experimenten mit χ1776 und χ1876, die sowohl mit einer Exponentialkultur als auch einer Übernachtungskultur durchgeführt wurde und bei welchen die Anfangsdichte von 10⁶ bis zu 10¹⁰ Zellen/ml verändert wurde, zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in DAP-Mangelanfangsabsterberate in Abhängigkeit von der Gegenwart oder Abwesenheit von NaCl im Medium. Da NaCl eine leichte, aber reproduzierbare Schutzwirkung auf χ1849 hat, hat wohl eine oder mehrere genetische Veränderungen beim Übergang von χ1849 auf x1776 (Tabelle C) diese Schutzwirkung von NaCl abgeschafft, indem die DAP-Mangelabsterberate verringert wurde. Es wurde jedoch gefunden, daß die Fähigkeit von χ1776- und χ1876-Zellen, die ein DAP-Aushungern 6 bis 10 Stunden überleben können, um dann während der nächsten 60 bis 90 Stunden in L-Nährmedium ohne DAP langsam zu wachsen, abhängig von der Anwesenheit von NaCl im L-Nährmedium ist (oder dadurch Überleben und Wachsen wenigstens erleicht werden). Mit anderen Worten, in natriumchloridfreiem L-Nährmedium sterben die Zellen der Stämme χ1776 und χ1876 vollständig ab, während in normalem, Natriumchlorid enthaltendem L-Nährmedium langsames Wiederanwachsen der überlebenden Zellen beobachtet wird. Deshalb erschien es logisch zu vermuten, daß Natriumchlorid die Aufnahme von DAP aus lysierten Zellen erleichtert. Es ist darauf hinzuweisen, daß die Dap⁺-Transduktanten (Tabelle VII) auch unfähig sind zur Koloniebildung auf L-Agar, dem DAP und Natriumchlorid fehlt, sogar auch dann, wenn sie aus der BSG+DAP-Verdünnungslösung ausplattiert werden. Da Magnesium, Calcium und Kalium statt Natrium substituiert werden können, um die Colaminsäuresynthese zu stimulieren und um längerfristiges Überleben von Dap^--Stämmen zu erlauben (Pereira und Curtiss, unveröffentlicht), ist es wahrscheinlich, daß χ1776 und χ1876 weniger gut überleben würden in natürlicher Umgebung mit geringerer Kationenkonzentration.

Die durch DAP-Mangel bedingte Absterberate wurde auch für Kulturen unterschiedlicher Anfangsdichte gemessen, indem man Exponentialkulturen bzw. Übernachtkulturen benutzte. Die Tatsache, daß Zellen aus Exponentialkulturen schneller sterben als Zellen aus Übernachtkulturen, erhärtet den Schluß, daß die Absterberate durch DAP-Mangel und das Ausmaß des Absterbens steigt, wie die Fähigkeit zum Stoffwechsel der Zellen zunimmt. Dieser Schluß wird gestützt durch die Beobachtung, daß DAP-Mangeltod nur in geringem Ausmaß beobachtet wird, wenn sehr hohe Zelldichten in das DAP-freie L-Nährmedium eingeimpft werden.

Bei einer Zahl von Experimenten wurde beobachtet, daß χ1776 und χ1876 weder unter erlaubten noch unter nicht-permissiven Umständen durch die Gegenwart von robusteren Bakterienstämmen angegriffen werden, einschließlich einer großen Zahl von Laborkontaminationen, wie Stämme von Pseudomonas, Staphylococcus und Serratia. Aus diesen Beobachtungen schloß man, wie auch aus Rekonstruktionsexperimenten, daß die Stämme χ1776 und χ1876 kaum fähig sind, mit anderen Wildtyporganismen zu wetteifern und somit auch weniger fähig sind zu überleben und tatsächlich schneller absterben in Gegenwart von anderen Organismen, als in deren Abwesenheit. Dadurch würde es noch unwahrscheinlicher, daß χ1776 in der Natur überleben könnte, sollte der Stamm wirklich einmal der sorgfältig überprüften Laborumgebung entrinnen.

Da χ1776 und χ1876 empfindlich gegen Gallensäuresalze und ionische Tenside sind, wurden deren Wirkungen auf DAP-Mangeltod geprüft. Unterschiede, wenn auch geringe, zeigten einen leichten Zuwachs der durch DAP-Mangel bedingten Inaktivierung durch Natriumdodecylsulfat und mit Gallensäuresalzen umgekehrt einen leichten Abfall der Inaktivierungsrate. Es wurde auch festgestellt, daß die Zugabe von Ampicillin (100 µg/ml) und/oder Cycloserin (100 µg/ml) zu den χ1776-Kulturen in DAP-Mangelmedien die Absterberate steigert über jene hinaus, die nur durch DAP-Aushungerung hervorgerufen wird.

Diese Beobachtung führte also zu der Entwicklung einer wirksamen Methode, die DAP-Mangeltod und Thymin-Mangeltod verbindet. Die zusätzliche Zugabe von Cycloserin und Ampicillin machte sie zu einer sehr wirkungsvollen Methode zur Anreicherung von Mutanten, die abgeleitet werden können von χ1776, was im folgenden beschrieben wird.

Die DAP-Mangelabsterberaten von drei gegen Gallensäuresalze resistente Derivate von χ1776 wurden gemessen. χ1925 (Tabelle VI) und χ1951 erscheinen vollständig zur Gallensäuresalzresistenz mutiert zu sein, denn sie haben Eigenschaften, die denen von χ1849 sehr ähnlich sind. χ1926 ist aber nur eine Teilrevertante, da die Ausbeute bei Plattierungsversuchen auf L-Agar+0,15% Gallensäuresalz gering ist (Tabelle VI). Die Raten und das Ausmaß des DAP-Mangeltodes dieser gegen Gallensäuresalze resistenten Revertanten waren ähnlich wie die, die für χ1776 und χ1876 gefunden wurden, obwohl wesentlich verringerte Absterberaten durch DAP-Mangel bei ein oder zwei Gelegenheiten festgestellt wurden.

Thyminloser Tod

x1776 und χ1876 werden in L-Nährmedium nicht inaktiviert durch thyminlosen Tod (wie erwartet), da sie in L-Nährlösung gut wachsen auch ohne Thy oder Thd. Sie wurden jedoch inaktiviert in ML und in ML mit Casaminosäuren. In diesen beiden synthetischen Medien wurden dieselben Inaktivierungsraten durch thyminlosen Tod beobachtet, wenn die Zellen, die eine 20stündige Aushungerung überlebt hatten, unter permissiven Bedingungen angezüchtet und dann auf thyminlosen Tod hin erneut getestet wurden. Es wurde weiter festgestellt, daß eine längere Aushungerung zu einem langsameren Wiederanwachsen der Zellen führt und daß ein hoher Prozentsatz der Zellen nach 72 oder 96 Stunden deoB- oder deoC-Mutationen enthält, da sie gut wachsen in supplementiertem MA mit 2 µg/ml Thymin. Thyminloser Tod wird nicht beobachtet, wenn sehr hohe Zelldichten verwendet werden. Für die Rate und das Ausmaß des thyminlosen Todes ist die Zelldichte der Kultur der wichtigere Faktor verglichen mit der Wachstumsphase der Kultur am Beginn der Aushungerung. Die Geschwindigkeit des Wachstums ist ebenso entscheidend, da in ML, welches Casaminosäure enthält, der thyminlose Tod stärker auftritt als in ML ohne Casaminosäure.

Kombinierte Inaktivierung durch DAP- und Thymin-Mangel

Es wurde die Auswirkung einer kombinierten Aushungerung bezüglich DAP und Thymidin in L-Nährlösung, ML+CAA, Bio, Glc und ML+Thr, Met, Lys, Bio, Glc auf χ1776 und χ1876 untersucht. Sowohl die Inaktivierungsrate als auch die endgültige Anzahl der überlebenden Zellen war in kombinierten Experimenten ähnlich, wie bei den Experimenten, bei denen DAP oder Thymin jeweils allein in den entsprechenden Medien fehlte. Das heißt also, daß die zweifache Aushungerung nicht synergistisch wirkt. Ein langsames Wiederanwachsen der Kulturen in ML-Medium wurde jedoch nie bemerkt, auch wenn die Inkubation über mehr als 100 Stunden weitergeführt wurde.

DNS-Abbau während der Inaktivierung durch DAP- und/oder Thyminmangel

Da der thyminlose Tod auf Einzelstrangbrüche in der DNS zurückzuführen ist und da dies zu einem Abbau der DNS führen sollte, wurde die Geschwindigkeit der Freisetzung von [³H]Thymidin aus markierter DNS in χ1776 und χ1876 gemessen, welche der Inaktivierung durch DAP- und/oder Thyminmangel ausgesetzt waren. Es wird mehr DNS während der Inaktivierung durch DAP-Mangel abgebaut (mit oder ohne gleichzeitiger Aushungerung bezüglich Thymidin) als während des thyminlosen Todes. Dies ist wahrscheinlich auf eine gleichzeitige Freisetzung von DNS und Nucleasen während des DAP-losen Todes zurückzuführen, mit der Konsequenz, daß die freigesetzte DNS in Kulturmedien rasch abgebaut wird.

Markierte DNS von χ1776 und χ1876 wurde auf alkalischen Saccharosegradienten analysiert während des thyminlosen Todes in ML-Medium+Casaminosäure, DAP, Bio und Glc. Es war keine merkliche Abnahme des Molekulargewichts von Einzelsträngen zu beobachten während der Abnahme des gesamten säureunlöslichen Materials. Es sieht also so aus, daß der DNS-Abbau in χ1776 und χ1876 bei jeder einzelnen Zelle als Alles-oder-Nichts-Antwort erfolgt.

Überleben der Zellen unter Bedingungen, die ein Wachstum nicht erlauben

Die Überlebensrate von χ1776 und χ1876 wurde unter einer Vielzahl von Bedingungen, die ein Wachstum ausschlossen, gemessen. Das Überleben von χ289, χ1776 und χ1876 in BSG, Leitungswasser und vollentsalztem Wasser bei Raumtemperatur wurde gemessen. Obwohl die Abtötung in diesen Medien langsam erfolgt, ebenso wie in ML, dem DAP und Lysin fehlt, zeigten die nach 8 Tagen überlebenden Zellen von χ1776 und χ1876 eine zweifach höhere Sensibilität gegen Natriumdodecylsulfat, Sarcosyl und Gallensäuresalze als die ursprünglichen χ1776- und χ1876-Kulturen. Anders verhielt sich der Stamm χ289, dessen Sensivität gegenüber diesen Verbindungen sich während der Aushungerungszeit nicht veränderte. Es wurde weiter beobachtet, daß eine Belüftung der in Wasser suspendierten Zellen von χ1776 und χ1876 jedoch nicht in BSG, deren Absterbegeschwindigkeit erhöhte verglichen mit χ289.

Wenn χ1776 und χ1876 suspendiert in BSG oder L-Nährmedium+DAP+Thd bei 4°C aufgehoben wurden, konnte keine Abnahme der Überlebensfähigkeit während einer Zeit von 2 Wochen beobachtet werden. Weiter wurden Zellen von χ1776 und χ1876 suspendiert in 1% Pepton - 5% Glycerin (DAP und Thymidin enthaltend). Jeweils 2 ml wurden in verschraubbare Wassermann-Röhrchen überführt, um die Auswirkung von raschem Einfrieren und Auftauen zu bestimmen. Das Einfrieren von χ1776 und χ1876 führte zu einem etwa 50prozentigem Verlust der Lebensfähigkeit pro Einfrier- und Wiederauftauvorgang, während χ289 nur einen 30prozentigen Verlust der Lebensfähigkeit bei gleicher Behandlung aufwies. Es sieht also nicht so aus, als ob Schwierigkeiten auftreten würden bei der Haltung von χ1776 und χ1876 unter nicht-physiologischen Bedingungen, wie sie üblich sind für kurz- und längerfristige Aufbewahrung von lebensfähigen bakteriellen Kulturen.

Überleben während einer Passage durch den Intestinaltrakt von Ratten

Während der Konstruktion von χ1776 wurde wiederholt die Fähigkeit der verschiedenen Stämme geprüft, während einer Passage durch den Intestinaltrakt von Ratten zu überleben und/oder sich zu vermehren. Diese Versuche wurden unternommen, um herauszubekommen, welche Mutationen wichtig oder unwichtig seien für die Verhinderung eines solchen Überlebens. Es wurden jeweils hohe Konzentrationen von Zellen mit Hilfe einer Magensonde eingeführt, so daß definierte Mengen von Zellen bis zum Ösophagus gebracht werden konnten. Die Zellen waren jeweils suspendiert in Milch, um so gut als möglich Probleme auszuschließen, die von der Magensäure herrühren können. Im allgemeinen wurden junge entwöhnte Ratten und auch ältere Tiere verwendet. Die Ergebnisse einer Reihe solcher Versuche sind in Tabelle XIII zusammengefaßt.

Der prototrophe Stamm x1833 (χ289 Nal^r) überlebt eine Passage recht gut und scheint sich sogar bis zu einem gewissen Grade zu vermehren. Dies muß angenommen werden, um die Exkretion von zwischen 10⁶- und 10⁸-Zellen pro 0,1 g Faeces während des ersten Tages oder 2 Tage nach der Verfütterung und um die anhaltende Exkretion während einiger weiterer Tage zu erklären. Der Stamm χ1922, der ein thyA-Abkömmling von χ1833 darstellt, überlebt etwas weniger gut als χ1833, was anzeigt, daß die thyA-Mutation einen gewissen selektiven Nachteil darstellt während der Passage durch den Intestinaltrakt. Diese Annahme wurde bestätigt durch Tests mit anderen thyA-Stämmen. χ1841, der ein Nal^r-Abkömmling von χ1488 ist [das war der erste Stamm, der von x1276 während der Konstruktion von χ1776 abgeleitet worden war (siehe Tabelle C)], besitzt etwa dieselben Überlebenscharakteristika wie der Stamm χ1922. Der Doppel-Dap^--Stamm χ1846, der weiterhin Colaminsäure synthetisieren kann, überlebt etwas schlechter, und χ1849, der von χ1846 isoliert worden war und der Colaminsäure nicht mehr produzieren kann, wird noch schneller inaktiviert. Alle diese Stämme jedoch überleben die Passage durch den Intestinaltrakt. Daraus geht klar hervor, daß die 6 Stunden, innerhalb der ein verfütterter Stamm in den Faeces erscheint, nicht genügen, um ausreichend Stoffwechsel zu erlauben, was notwendig wäre für eine 100prozentige Inaktivierung durch DAP-Mangel.

Die verschiedenen, gegen Gallensäuresalze empfindlichen Abkömmlinge von χ1849 jedoch konnten eine Passage durch den Intestinaltrakt unter normalen Bedingungen niemals überstehen (Tabelle XIII). Ein weiterer Hinweis für die Wichtigkeit der Gallensäuresalzsensibilität ist die Fähigkeit von χ1925 und χ1928 (zwei gallensäuresalzresistente Revertanten von χ1776 und χ1876), eine solche Passage durch den Intestinaltrakt zu überleben. Keiner der beiden Stämme überlebt jedoch ebensogut wie χ1849. Dies könnte erklärbar sein, wenn χ1925 und χ1928 keine echten Revertanten des Allels für Gallensäuresalzsensitivität darstellen. Tatsächlich überlebt der gallensäuresalzresistente Abkömmling x1926, der noch teilweise gallensäuresalzsensivit ist (Tabelle VI) und der deswegen wahrscheinlich keine echte Revertante repräsentiert, die Passage durch den Intestinaltrakt der Ratte nicht. Fünf verschiedene Abkömmlinge von χ1776, die aufgrund ihrer Fähigkeit, auf verschiedenen Medien zu wachsen oder größere Kolonien zu bilden, ausgewählt worden waren, waren ebenso unfähig, die Passage durch den Intestinaltrakt der Ratte zu überleben. Das gleiche galt für eine temperatursensible Revertante von χ1776 (χ1929). Ein deoC-Abkömmling von χ1776 (χ1930), der mit geringen Mengen von Thymin wachsen kann, überlebt die Passage durch den Intestinaltrakt der Ratte ebenfalls nicht. In dieser Hinsicht ist bekannt durch andere Untersuchungen mit anderen Stämmen, daß die deoC-Mutation das intestinale Überleben von thyA-Stämmen verringert, obwohl die deoB-Mutation keinen Einfluß hat.

Von einigem Interesse ist die Beobachtung, daß die Verfütterung von Tetracyclin an die Ratten 1 Tag vor und während der Fütterung mit x1876 als Ergebnis das Überleben einiger χ1876-Zellen hat. Die gegebene Tetracyclindosis war relativ hoch, so daß es sein könnte, daß der Tod infolge DAP-Mangels und/oder Thyminmangels mittels einer durch Tetracyclin hervorgerufenen Wachstumshemmung verhindert wurde, wobei die geringere Überlebensrate von χ1876 wahrscheinlich durch Sensitivität gegen Gallensäuresalze verursacht wurde. Diese Erklärung wird teilweise gestützt durch die Beobachtung, daß der Gallensäuresalze resistente Abkömmling von χ1876, nämlich χ1928, höhere Überlebenstiter in Faeces zeigte, nachdem Tetracyclin gefüttert worden war, als dies x1876 zeigte. Diese Ergebnisse betonen jedoch die Notwendigkeit, daß Personen, die mit rekombinanten DNS-Molekülen arbeiten, sich mit derartigen Arbeiten während einer Antibiotikatherapie und anschließend 7 weiteren Tagen nicht beschäftigen sollen.

Fähigkeit zur Übertragung genetischer Information durch Stämme. Fähigkeit, als Empfänger bei Konjugationsexperimenten unter erlaubten Bedingungen zu wirken

Da die Übertragung chimärer Plasmide mittels Konjugation die wahrscheinlichste Möglichkeit des erfolgreichen Entkommens und Überdauerns clonierter DNS sein kann, wurden über 500 Paarungsversuche mit χ1776, seinen Abkömmlingen und seinen Vorfahren vorgenommen, um unter verschiedenen Bedingungen die Fähigkeit als Empfänger und Spender zu wirken, zu prüfen; 22 verschiedene, mittels Konjugation übertragbarer Plasmide, die 15 verschiedene imkompatible Gruppen vertreten, wurden für diese Experimente verwendet.

Im Hinblick auf die Fähigkeit, als Empfänger zu wirken, wurden χ1841, χ1849 und χ1776 mit 22 Donoren gepaart, von denen jeder ein anderes, zur Übertragung befähigtes Plasmid hatte und welche gemeinsam 15 inkompatible Gruppen vertraten. Diese Paarungen wurden unter optimal erlaubten Bedingungen durchgeführt, um die Verteilung verschiedener Mutationen in χ1776 zu prüfen und ihre Fähigkeit, als Empfänger zu wirken, zu vermindern. Da Plasmide in bestimmten Unverträglichkeitsgruppen in Mikroorganismen vorherrschen, die in der Erde, im Wasser oder im Intestinaltrakt von Fischen etc. vorkommen, wurden diese Paarungen bei 27, 32 und 37°C ausgeführt, um den Anteil der Temperatur an der Effizienz des Plasmidtransfers zu prüfen. Die meisten der Paarungen wurden über einen Zeitraum von 24 Stunden ausgeführt, wobei die Erträge der Transkonjuganten und die Titer der Elternstämme nach 30 und 90 Minuten und 24 Stunden Paarung bestimmt wurden. Es wurde jedoch bald sichtbar, daß der Titer der lebensfähigen Zellen von χ1776 nach 24 Stunden Paarung bei 37°C 10- bis 10 000fach abnahm. Da dies auch der beobachteten Abnahme im Titer der Transkonjuganten Rechnung trug, wurden die 24-Stunden-Paarungen unterbrochen, um die Fähigkeit von χ1776 abzuschätzen, als Empfänger zu wirken. Dieses Verhalten wurde bei Paarungsversuchen mit elf verschiedenen Donorstämmen festgestellt (die anderen elf wurden nicht auf diese Eigenschaft hin geprüft). Von Interesse ist die Tatsache, daß χ1776 lebensfähig bleibt und tatsächlich bei 32°C in Gegenwart anderer Bakterien wächst, sofern DAP vorliegt.

Die Fähigkeit von χ1776, als Empfänger zu wirken, wurde mit Donorstämmen getestet, die zur Übertragung befähigte Plasmide in den C, FI, FII, H, Iα, J, L, M, N, O, P, T, W, X, 9 und 10 Inkompatibilitätsgruppen enthielten. Bei Paarungen unter optimal erlaubten Bedingungen bei 37°C war die Häufigkeit einer Übertragung 10^-1 für ein I-Typ-Plasmid (R64-11), 10^-2 für verschiedene FII-Plasmide, 10^-3 bis 10^-4 für die N- und andere Iα-Plasmide, 10^-5 für P-Plasmide, 10^-6 für Inc-9-Plasmide, 10^-7 für L-, M- und Inc-10-Plasmide, 10^-8 für T-Plasmide und weniger als 10^-9 für C-, H- und X-Plasmide.

Ganz allgemein hatten Paarungsversuche, die bei der niedrigeren Temperatur von 32°C ausgeführt wurden, eine verminderte Häufigkeit von Transkonjuganten zur Folge. Es gab jedoch drei Ausnahmen dieses Verhaltens: R27 (H), R831 (L) und R394 (T) waren fähig, bei 32°C 1000fach, 10fach bzw. 100 000fach besser zu übertragen. Die Fähigkeit von χ1776, als Empfänger für R831 und R394 zu dienen, nimmt bei einer Temperaturerniedrigung auf 27°C um etwa das 10fache ab, aber für R27 ergab sich bei dieser geringeren Temperatur ein erneuter 10facher Anstieg in der Häufigkeit der Transkonjuganten. Bei einer Paarungstemperatur von 22°C war die Häufigkeit der Transkonjuganten etwa dieselbe wie bei der Durchführung von Paarungsversuchen bei 32°C mit dem Donorstamm, der R27 beinhaltet.

Die niedrigere Temperatur von 27°C scheint auch die Häufigkeit von Transkonjuganten in Paarungen zwischen χ1776 und Donorstämmen, die C- oder M-Typ-Plasmide beinhalten, zu steigern, obwohl die Häufigkeiten recht gering sind: 10^-7 bzw. 10^-6. Bei allen anderen Plasmiden, außer denen, die oben erwähnt sind, nahm die Häufigkeit der Transkonjuganten bei Paarungsversuchen, die bei 27°C vorgenommen wurden, im Vergleich mit denen, die bei 37°C oder 32°C vorgenommen wurden, ab und waren tatsächlich sehr gering: 10^-6 bis zu weniger als 10^-9.

Die Fähigkeit von χ1776, von verschiedenen Donorstämmen unter optimal erlaubten Paarungsbedingungen Plasmide aufzunehmen, zeigt folgendes Muster, verglichen mit der Fähigkeit von χ1841, als Empfänger zu wirken:

• 1. Die Transkonjugantenhäufigkeit von χ1776 ist weniger als 10mal geringer als die für χ1841. Dieses Verhalten wurde an einem FII- und drei I-Typ-Plasmiden und Plasmiden der H, N, P, W und 9 Inkompatibilitätsgruppen gezeigt.
  Für die meisten dieser Plasmide war die Fähigkeit von χ1776, als Empfänger zu wirken, zwei- bis sechsmal geringer als die von x1841, aber χ1776 war offensichtlich fähig, RP4, ein P-Typ-Plasmid, etwa mit der zweifachen Häufigkeit aufzunehmen, mit der χ1841 dasselbe Plasmid aufnahm.
• 2. Die Transkonjugantenhäufigkeit von χ1776 war 10- bis 100fach geringer als die von χ1841. In dieser Gruppe waren die anderen FII- und ein I-Typ-Plasmid und C- und M-Typ-Plasmide enthalten.
• 3. Die Transkonjugantenhäufigkeit von χ1776 war 1000- bis 100 000fach geringer als die von χ1841. Plasmide der J, L, O, T, X und 10 Inkompatibilitätsgruppen zeigen diese Art des Verhaltens.

In anderen Paarungsversuchen mit χ1849, der die Δ40[gal-uvrB]-Mutation beinhaltet, war es möglich, eine deutliche Reduktion in der Häufigkeit der Transkonjuganten zu zeigen, verglichen mit der Aufnahmefähigkeit von χ1841 für konjugative Plasmide der C, J, L, M, O, T, X und 10 Inkompatibilitätsgruppen. Auf diese Weise trägt die Δ40[gal-uvrB]-Mutation zum Con^--Phänotyp von χ1776 bei. Bei der Benutzung von χ1925, einer gallensäuresalzresistenten Revertante von χ1776, war es auch möglich zu zeigen, daß die verminderte Aufnahmefähigkeit von χ1776 für bestimmte konjugative Plasmide auf der gemeinsamen Wirkung der rfb-2-, oms-1- und oms-2-Mutationen beruht.

Um die Fähigkeit von χ1776 abschätzen zu können, ein konjugatives Plasmid zu erhalten, das notwendig wäre zur Mobilisation und Übertragung eines nicht-konjugativen Plasmid-Vektors, müssen mehrere Faktoren bedacht werden. Zuerst sollte erwähnt werden, daß R1drd19, R100drd1, R64drd11 und R549drd1 für die Expression des Donorphänotyps dereprimiert sind, und zwar derart, daß Donorstämme, die diese besitzen (oder sie zumindest besitzen sollten), 100 bis 10 000mal fertiler sind als Donorstämme, die dem Wildtyp entsprechend reprimierte konjugative Plasmide in sich tragen. In der Tat wurden nur 3 dereprimierte konjugative Plasmide jemals in der Natur isoliert; es sind dies F (der während seines 40jährigen Aufenthaltes in E. coli K-12 bereits mutiert sein könnte), ColV und ein R-Plasmid. Diese dereprimierten Plasmide wurden deshalb nur dazu benutzt, um die Möglichkeiten, seltene Ereignisse zu entdecken, zu vergrößern. Es sollte jedoch festgehalten werden, daß Donorstämme, die R648 (IncIα) und R66a-1 (IncIα) beherbergen, bei Paarungsexperimenten mit x1841 Transkonjugantenerträge ergeben, die denen, die für den Transfer dereprimierter Plasmide erwartet werden, nahe kommen. Zum zweiten nimmt der Ertrag von Transkonjuganten, die IncIα- und IncFII-Plasmide enthalten, mit dem Quadrat der Verdünnung der Bakteriendichte bei den Paarungsexperimenten unter 10⁸ Zellen/ml ab. Demzufolge vermindern sich die Erträge der Transkonjuganten bei Paarungsversuchen, die sich über eine Stunde erstrecken, und bei Zelldichten von 10⁶ ml ausgeführt werden, was etwa dem Titer von E. coli im Säugetierintestinaltrakt entspricht, um etwa das 10 000fache. Zum dritten gibt es in der Natur weitere Hemmnisse, ein konjugatives Plasmid zu erlangen, die die Häufigkeit potentieller Donorstämme, die konjugative Plasmidebesitzen (etwa 10%), die Anwesenheit von Restriktions-Modifikationssystemen in den meisten Mikroorganismen und die Existenz verwehrter Aufnahme, Inkompatibilität und Eigenschaften der Oberfläche der Donorzellen einschließen. Alle diese Faktoren vermindern die Wahrscheinlichkeit sehr, daß χ1776, wenn er ein nicht-konjugatives Plasmid enthält, ein derartiges konjugatives Plasmid in der Natur erhalten könnte. Das geringe Überlebenspotential von χ1776 in natürlicher Umgebung würde es ebenso höchst unwahrscheinlich machen, daß χ1776 jemals lange genug überleben könnte, um rekombinante DNS auf andere Organismen zu übertragen, selbst wenn er ein derartiges konjugatives Plasmid enthielte.

Mobilisation von pSC101 durch konjugative Plasmide unter erlaubten Bedingungen

Um die Folgen eines konjugativen Plasmids durch den Stamm χ1776 auf die nachfolgende Fähigkeit, DNS zu übertragen, die auf dem nicht-konjugativen Plasmid-Vektor pSC101 angereichert war, abschätzen zu können, wurden Abkömmlinge von x1876 konstruiert, die verschiedene konjugative R-Plasmide enthielten, die keinen Marker für Tetracyclin-Resistenz trugen. Alle diese R-Plasmide waren stabil im Stamm χ1876 und veranlaßten den Stamm x1876 nicht, das Plasmid pSC101 während der Bebrütung bei 37°C zu verlieren. Diese Spenderzellen wurden dann mit χ1763 gepaart und die Titer beider Elternstämme und aller Transkonjuganten nach 1, 6 und 24 Stunden Bebrütung bei 37°C bestimmt. Um weitere Ergebnisse über die Mobilisation von pSC101 zu erhalten, wurde mit Paarungsversuchen auch die Fähigkeit von χ1876 (und von χ1776), als Empfängerzelle für die verschiedenen konjugativen Plasmide zu dienen, abgeschätzt. Man fand, daß χ1876 normale Spenderfähigkeiten während einer Paarungszeit von 60 min für den Transfer von R1drd19, R549drd1, R69/2, R66a-1 und R648 zeigte und daß seine Transferfähigkeit defekt war in Bezug auf die Plasmide R394 und R40a, verglichen mit der Spenderfähigkeit von χ1753-Abkömmlingen, die diese Plasmide besaßen. Es ist darauf hinzuweisen, daß die Empfängerfähigkeit von χ1776 für das IncT-Plasmid R394 in Paarungsversuchen, die bei 27°C durchgeführt wurden, fast 5000mal höher ist als in denen, die bei 37°C stattfanden. Es ist somit denkbar, daß die Spenderfähigkeit von einem χ1876-Abkömmling, der R349 beherbergt, mit abnehmender Temperatur bei Paarungsversuchen anwachsen kann. Auf jeden Fall ist es offensichtlich, daß das IncM-Plasmid R69/2 das Plasmid pSC101 mit gleicher Wirksamkeit wie sich selbst mobilisiert und daß die IncI-Plasmide R549drd1 und R648, verglichen mit ihren eigenen Transferhäufigkeiten, das Plasmid pSC101 zu einer Transferhäufigkeit von 10^-1 bis 10^-2 mobilisieren. Auch das IncIα-Plasmid R66a-1 mobilisiert das Plasmid pSC101 zu einer Transferhäufigkeit von 10^-2 bis 10^-3, und das IncFII-Plasmid R1drd19 veranlaßt das Plasmid pSC101, mit einer Transferhäufigkeit von 10^-3 bis 10^-4 zu wirken. Die R40a-(IncC) und R394-(IncT)-Plasmide zeigten keine nachweisbaren Häufigkeiten der Mobilisierungen von pSC101. Der Titer der Donorzellen des Stammes χ1876 nahm im allgemeinen während der 24stündigen Paarung ab. Es ist jedoch zu beachten, daß, obwohl der Gesamttiter von χ1763 zwischen 6 und 24 Stunden Paarung ungefähr um das 10fache zunimmt, die χ1763-Abkömmlinge, die pSC101 erhielten (mit oder ohne das konjugative R-Plasmid), überhaupt nicht anwuchsen, eher sogar während dieses zeitlichen Intervalls abnahmen. Da nur die Titer der Transkonjuganten, die auf den Erwerb das konjugativen Plasmids hin selektiert wurden, im Laufe des Paarungsintervalls anstiegen, schloß man, daß viele der sich in der stationären Phase befindenden x1763-Zellen, die das Plasmid pSC101 enthielten, keine Kolonien auf Platten bilden könnten, die 12,5 µg/ml Tetracyclin enthielten. Dies folgt aus der Tatsache, daß die Expression von Tetracyclinresistenz, die pSC101 spezifisch ist, induzierbar und nicht konstitutiv ist, und aus der Tatsache, daß Zellen aus der stationären Phase, wenn sie Wachstumsbedingungen unterworfen sind, nur schwach gerüstet sind für sofortige Synthese eines Proteins, das für ihr Überleben notwendig ist.

Triparentale Paarungen unter erlaubten Stämmen

Um auf andere Art die Wahrscheinlichkeit zu prüfen, daß der Stamm χ1776, welcher ein "chimäres" Plasmid besitzt, die clonierte DNS auf einige andere Mikroorganismen übertragen kann, wurden triparentale Paarungen durchgeführt, indem eine Reihe sich von χ1753 ableitenden primären Donoren in Paarungsversuchen mit χ1876 und dem sekundären Empfänger χ1763 benutzt wurde. Bei diesen Paarungsversuchen, die unter optimalen erlaubten Bedingungen bei 37°C durchgeführt wurden, wurde pSC101 auf den Stamm χ1763 übertragen, und zwar in Gegenwart der primären Sender, die das dereprimierte Iα-Plasmid R549drd1 (10⁵/ml), die Iα-Plasmide R648 und R66a-1 und das L-Plasmid R471α (10³/ml), das dereprimierte FI-Plasmid F′his⁺ und das M-Plasmid R69/2 (10²/ml), das dereprimierte FII-Plasmid R1drd19 und das T-Plasmid R394 (10¹/ml), enthielten. Es wurde keine Transmission von pSC101 in Paarungsversuchen mit primären Donoren gefunden, die ein C- und ein Inc10-Gruppenplasmid enthielten. Von Interesse ist die Beobachtung, daß die triparentalen Paarungsversuche mit den Donoren, die das R394-Plasmid enthielten, sehr geringe Häufigkeiten von pSC101-Transkonjuganten in χ1763 ergaben, während χ1876-Abkömmlinge, die R394 beherbergten, bei Paarungsversuchen mit χ1763 keine pSC101-Transkonjuganten ergaben (außer einigen wenigen Kolonien nach 24 Stunden Paarung mit dem R40a⁺-Donorstamm). Die Titerabnahme χ1876 im Laufe der Paarungsversuche in manchen, aber nicht allen Versuchen, war ebenso eindeutig aus den erhaltenen Daten zu entnehmen.

Konjugationsfähigkeit während des DAP-Mangel- und/oder Thymin-Mangeltods

Untersuchungen, die sich mit den Empfänger- und Spenderfähigkeiten des Stammes χ1776 und χ1876 unter unerlaubten Bedingungen beschäftigten, wurden beschränkt auf Versuche mit dem dereprimierten IncFII-Plasmid R1drd19. Ein χ1776-Abkömmling, der das Plasmid R1drd19 trägt, verliert die Fähigkeit, R1drd19 auf χ1763 zu transferieren. Die Verlustrate ist der Spenderzellenabsterberate proportional. Tatsächlich ist der Wirkungsgrad überlebender R1drd19-χ1776-Zellen/Zelle fast so groß wie der nicht ausgehungerter R1drd19-χ1776-Zellen bei der Übertragung des Plasmids durch Transfer. Aushungerungsversuche in ML-Medium mit oder ohne Casaminosäuren führten zum selben Ergebnis, obgleich hier zu erwarten war, daß die Thyminaushungerung den Plasmidkonjugationstransfer sogar von überlebenden Zellen blockiert. Es folgt daraus, daß diese überlebenden Zellen entweder einen ausreichenden Pool Thymin enthaltender Nukleotide besitzen, der zur Plasmidreplikation während der Konjugation beiträgt, oder aber, daß der Konjugationsplasmidtransfer unabhängig von der DNS-Replikation ist.

Die Konjugationsfähigkeit als Funktion der Aushungerungszeit in Leermedien

Die Fähigkeit des Stammes χ1776, das Plasmid R1drd19 von χ1792 zu erhalten, wurde als Funktion von Aushungern und Paarungszeit in Wasser, BSG und ML+Glucose bei 24°C und bei 37°C aufgenommen. Die Paarungsversuche in Wasser und BSG lieferten bei beiden Temperaturen keine Transkonjuganten. Die Paarungsversuche, die in ML+Glucose bei 24°C und entsprechend bei 37°C stattfanden, erbrachten eine um 10 000- bis 100fache geringere Ausbeute an Transkonjuganten, verglichen mit den Ergebnissen, die man bei Paarungsversuchen in L-Nährmedien unter erlaubten Bedingungen beobachtete. Hungerte man χ1792 und x1776 4 Stunden in diesen Nährmedien aus, so erhielt man entweder gar keine Transkonjuganten mehr, oder aber die Anzahl der Transkonjuganten war um das 10- bis 100fache geringer als bei Versuchen, in denen die Zellen nicht ausgehungert waren. Im allgemeinen erhält man bessere Empfängerfähigkeit während des Aushungerns in ML+Glucose als in BSG-Medium. Sie ist auch besser bei Versuchen, die bei 37°C stattfinden, verglichen mit Ergebnissen aus Versuchen, die bei 24°C durchgeführt werden. Diese Messungen, die die Empfängerfähigkeit von χ1776 betreffen, sind nicht mittels Plattenkonjugation vorzunehmen, da das Selektivmedium Nalidixinsäure enthält, was den Plasmidtransfer sofort beendet.

Obgleich das Wachstum von Zellen, die Plasmide der IncF-Gruppe enthalten, bei 28°C oder geringeren Temperaturen zu Phänokopien führt, die zur Paarung unfähig sind, beeinträchtigt das Aushungern der Spenderzellen bei 24°C, die bei 37°C gewachsen sind, die Spenderfähigkeit von χ1792 nicht. Bekannt ist auch, daß das Aushungern von Spenderzellen bei 37°C auch zum Verlust der Spenderfähigkeit führt, obgleich das Aushungern einer stehenden, nicht heftig belüfteten Kultur die geringste Verlustrate der Spenderfähigkeit verursacht. Dies mag als Erklärung dienen für die geringe Transkonjugantenausbeute bei 37°C.

Die Donorfähigkeit des Stammes χ1776, der das Plasmid R1drd19 enthält, wurde auch mit und ohne ausgehungerten Zellen in Wasser, BSG und ML+Glucose bei 23, 37 und 43°C geprüft. Bei Paarungsversuchen, durchgeführt bei 43°C oder in Wasser oder BSG bei 23°C, beobachtete man keine Plasmid-Übertragungen in den Stamm χ1763. Für alle anderen Bedingungen nahm die Spenderfähigkeit um das 10²- bis 10⁷fache ab, wobei Wasser das schlechteste Paarungsmedium ist.

Diese Unterscheidungen deuten darauf hin, daß die meisten der nicht erlaubten Bedingungen, die in der Natur wahrscheinlich auftreten, die konjugative Übertragung von Plasmid-Chimären nicht fördern.

Potential für die Transduktionstransmission unter nicht-permissiven Bedingungen

Angesichts der erhöhten Resistenz von χ1776 und χ1876 gegen die Infektion durch P1L4 wurde entschieden, die Produktion anderer Phagen in χ1776 unter nicht-permissiven Bedingungen zu untersuchen. Ein Grund dafür, dies zu tun, ist die Tatsache, daß die Veränderungen der Zelloberfläche in χ1776-Zellen, die zu einer Resistenz gegen gut untersuchte E. coli Phagen führen, auch zu einer Sensibilität gegenüber anderen Phagen führen können, die nicht gut untersucht sind und deshalb zur Transduktion befähigt sein können. Während der Gewinnung von χ1776 wurde festgestellt, daß eine Umkehr der Phagen-Sensibilitätsmuster erfolgte. In einem Experiment wurde die Fähigkeit von χ1776-Zellen gemessen, nach 0 und 4 Stunden Hungern in BSG und ML+Glucose produktiv mit T6 Phagen infiziert zu werden. Selbst in Anwesenheit einer Kohlenstoffquelle kann T6 unter Hungerbedingungen von χ1776 wenig wirksam produziert werden. Hungern während 4 Stunden vor der Infektion gab eine bessere Ausbeute als Hungern während 0 Stunden, und dies ist höchstwahrscheinlich auf einen hungerinduzierten Turnover von Proteinen und anderen zellulären Bestandteilen zurückzuführen, die als Rohmaterial für die Phagenentwicklung bereitstehen. Unter diesen Bedingungen waren die Latentperioden lang (2 bis 3 Stunden), die Wurfgröße war jedoch gering (etwa 50).

Potential für die Transformation unter nicht-permissiven Bedingungen

Die Tatsache, daß χ1776 und x1876 unter Wachstumsbedingungen in Abwesenheit von DAP lysieren, gibt Anlaß zu der Frage, ob die von solchen lysierenden Zellen stammende DNS eventuell nicht aufgenommen wird und andere Bakterienzellen in der selben Umgebung transformiert. Von χ1776 und χ1876 während des DAP-losen Todes freigelassene DNS wird rasch abgebaut, wenn die Lysis in Kulturen von relativ hoher Dichte (10⁷ bis 10⁹ Zellen/ml) stattfindet, in welchem Fall die freigelassenen Nukleasen wahrscheinlich in genügend hoher Konzentration vorhanden sind, um die freigelassene DNS abzubauen. Es ist jedoch nicht wahrscheinlich, daß derartige Zelldichten während der Lyse von freigewordenen Bakterien in der Natur vorkommen, und man muß deshalb feststellen, ob Nukleasen in einer derartigen natürlichen Umgebung vorhanden sind. Es wurde festgestellt, daß DNS sehr rasch abgebaut wird, wenn sie dem Darminhalt von sowohl herkömmlichen als auch keimfreien, getöteten Ratten zugegeben wird, und ihre Überlebensdauer ist daher wahrscheinlich nicht lang genug, um andere Bakterien zu transformieren.

Die meisten Mikrobengenetiker glauben, es sei nötig, gram-negative Bakterien zunächst bei 0°C in Anwesenheit von Calciumchlorid und darauffolgend nach einem raschen Temperaturwechsel auf 30 bis 42°C zu inkubieren, um Transformation zu erzielen; und obwohl derartige Bedingungen in der Natur wahrscheinlich nicht angetroffen werden, dürften sie auch nicht notwendig sein. Es mag daher zum Beispiel möglich sein, eine Transformation von E. coli mit Plasmid DNS bei 37°C zu erzielen durch gleichzeitige Infektion mit einem Helfer-Virus, obwohl eine derartige Möglichkeit noch nicht untersucht worden ist.

Merkmale, die die Nützlichkeit von E. coli Stämmen beeinflussen Transformationsfähigkeit

χ1776 ist besser transformierbar mit pSC101-Plasmid-DNS als sein Vorfahr χ1841 (χ1488 Nal^r), doch weniger transformierbar als sein Vorfahr χ1849. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Δ[gal-uvrB]-Mutation die Transformationsfähigkeit erhöht und daß jene Mutationen, die eine Sensibilität gegenüber Gallensäuresalzen bedingen, sie vermindern. Einige verschiedene Transformationsmethoden wurden untersucht, und da keine der zuvor beschriebenen Methoden für χ1776 zufriedenstellend war, wurde eine neue Methode entwickelt, die nachstehend beschrieben ist.

Curing von Plasmiden

Das Wachstum von χ1876 bei 41°C, jedoch nicht bei 37°C, führt zu einem Verlust des pSC101-Plasmids. Diese Eigenschaft könnte von Nutzen sein. Von pSC101 geheilte Abkömmlinge von χ1876 wurden ebenfalls untersucht, um festzustellen, ob sie eine höhere Ausbeute von pSC101-Transformatoren ergaben als χ1776; es wurden jedoch keine Unterschiede festgestellt.

Minizellen-Produktion

Während der Herstellung von χ1776 wurde versucht, immer gute Minizellen-Bildner zu selektieren. χ1776- und χ1876-Kulturen besitzen 1 bis 2 Minizellen pro Zelle. Diese konnten leicht von den elterlichen Zellen, die sie produzieren, abgetrennt werden durch zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationen in linearen, 5- bis 20prozentigen Saccharose-BSG-Gradienten im SW-27-Rotor einer präparativen Beckmann-Ultrazentrifuge. Es wurden Minizellenpräparationen erhalten, die nur eine kontaminierende Bakterienzelle pro 10⁶ bis 10⁷ Minizellen enthalten.

Diese überlebenden Kontaminantenzellen lassen sich vollständig elimineren durch Inkubation der Minizellen in einem Wachstumsmedium ohne DAP. Da Minizellen weder wachsen noch sich teilen können, sind sie völlig resistent gegen DAP-Hungerbedingungen, und Minizellen von χ1876 behalten das pSC101-Plasmid in einem unverdauten Zustand während eines 24stündigen Entzugs von DAP und Thymin.

Da die von χ1776 und χ1876 produzierten Minizellen lange überleben können, sind einige Bemerkungen über ihr Potential für die Transmission genetischer Informationen angebracht. Ungefähr eine unter 10 00 Plasmid-enthaltenden Minizellen kann produktiv mit T4-Bakteriophagen infiziert werden und ergibt einen geringen Wurf nach einer langen Latenzzeit. P1kc kann ebenfalls Minizellen infizieren, die das Co1VB-trp-Plasmid (110×10⁶ Daltons) in sich bergen, und kann tranduzierende Phagen produzieren, die fähig sind, Trp⁺-Transduktanten zu erzeugen. In diesen Experimenten wurde eine von 10 000 Minizellen produktiv infiziert: Die Wurfgröße war 10, und etwa eines von 500 P1kc-Partikeln war fähig zur Transduktion eines trp^--Stammes. So war also die Gesamtausbeute transduzierender Phagen extrem gering.

Bezüglich der Konjugationstransmission von Plasmid DNS aus Minizellen weiß man, daß Minizellen als Rezipienten für Plasmid-DNS agieren können. Wenn diese Minizellen-Rezipienten von einem F^--Stamm abgeleitet und daher DNS-defizient sind, können sie durch Konjugation transferierte Einzelstrangplasmid-DNS nicht in eine doppelsträngige zirkuläre Form unwandeln; sie können auch keine Transkription und Translation durchführen, die nötig wäre, um den Donorphänotyp auszuprägen. Minizellen, die von einem Stamm produziert werden, der ein konjugatives Plasmid in sich birgt, können jedoch dieses Plasmid mit geringer Häufigkeit auf F^--Zellen transferieren. Da Plasmid enthaltende Minizellen Transkriptionen und Translationen ausführen können, ist es kaum möglich, daß Minizellen, die ein nicht-konjugatives Plasmid in sich bergen, fähig sind, einzelsträngige DNS eines konjugativen Plasmids zu erhalten und dann diese in eine doppelsträngige zirkuläre Form umzuwandeln und die Syntheseaktivitäten zu entwickeln, die der Minizelle erlauben würden, in der Konjugation ein wirksamer Donor zu werden.

Beobachtung und Ausschluß der Kontamination während der Versuche mit rekombinanten DNS-Molekülen

χ1776 und χ1876 sind resistend gegen Nalidixinsäure, Cycloserin und Trimethoprim. Da Resistenz gegen Nalidixinsäure und Cycloserin bei in der Natur vorkommenden Bakterien selten ist und unseres Wissens nicht von Plasmiden übertragen wird, sind diese Antibiotika brauchbare Zusätze zu Kulturen von χ1776 und Abkömmlingen, um Kontamination von Kulturen mit robusten Mikroorganismen der Laborumwelt auszuschließen. Dies könnte insbesondere von Bedeutung sein, um Transformation eines robusten Kontaminanten während des Klonierens von DNS auszuschließen. Diesbezüglich sollte erwähnt werden, daß Nalidixinsäure während des Autoklavierens bei normalem pH stabil ist und es daher schwierig ist, sie vor der Abgabe in die Umwelt zu zerstören. Cycloserin dürfte vorzuziehen sein, da es nicht so teuer ist und bei 37°C und bei neutralem pH eine normale Halbwertszeit von einem Tag hat. Lösungen müssen daher täglich frisch hergestellt und in Phosphatpuffer bei pH 8 bis zum Gebrauch suspendiert gehalten werden.

Um χ1776 und χ1876 in Gegenwart hoher Konzentrationen anderer Mikroorganismen beobachten zu können, ist Nalidixinsäure dem Gebrauch von Cycloserin weit überlegen. Nalidixinsäureresistenz ist ein seltenes Mutationsereignis, und Nalidixinsäure hemmt völlig das Hintergrundwachstum sensibler Zellen, selbst dann, wenn 10⁹ Zellen pro Platte plattiert wurden. Cycloserin erlaubt andererseits das Hintergrundwachstum sensibler Zellen, wenn die Plattierungsdichten 10⁷ Zellen pro Platte übersteigen.

Die erhaltenen Versuchsergebnisse zeigen, daß χ1776 Eigenschaften besitzt, die übereinstimmen mit den gesetzten Zielen, mit genetischen Mitteln einen sicheren und brauchbareren Wirtsmikroorganismus für die Forschung mit rekombinanten DNS-Molekülen herzustellen. Es können allerdings noch Verbesserungen vorgenommen werden; diese Verbesserungen sind folgende:

• (1) Die thya-Mutation revertiert mit geringer Häufigkeit - sie kann ersetzt werden durch die nicht-revertierende ΔthyA57-Mutation.
• (2) Der thyminlose Tod führt zur Akkumulation von deoB- und deoC-Mutanten, die wirksame Thyminverwerter sind - deoA- und upp-Mutationen sind einzuführen, um die Fähigkeit, das Thymin zu verwerten, auszuschalten.
• (3) Der DNS-Abbau während des thyminlosen Todes ist nicht so schnell und vollständig, wie man es sich wünschen würde - deoA- und upp-Mutationen sowie polA(CS)- und recA-Mutationen sind einzuführen.
• (4) Mutationen, die Sensibilität gegen Gallensäuren, ionische Tenside, Arzneistoffe, Antibiotika usw. und gegen Con^--Phänotyp verursachen, revertieren mit geringer Häufigkeit - zusätzliche Mutationen in den Genen con, rfa, lpcA und/oder lpcB sind durchzuführen.
• (5) Die Mutation Δ[bioH-asd] bedingt Resistenz gegen λ und schließt somit die Verwendung von λ als Vektor in Klonierungsexperimenten aus - sie ist zu ersetzen durch die Mutation dapA oder dapE.
• (6) Die Transformationsfähigkeit kann erhöht werden - die endA-Mutation ist einzuführen.

Alle oben angeführten Verbesserungen konnten als wirksam nachgewiesen werden, und es wurden Methoden entwickelt und auch angewendet bei der genetischen Herstellung anderer, sichererer, brauchbarerer Wirte für die Forschung an rekombinanten DNA-Molekülen (vgl. Tabelle D und E).

Tabelle III

Plasmide

PhänotypVerantwortliche Mutation(en)

Benötigt DAPdapD8 Δ29[bioH-asd] Benötigt ThreoninΔ29[bioH-asd] Benötigt MethioninmetC65 Δ29[bioH-asd] Benötigt BiotinΔ40[gal-uvrB] Δ29[bioH-asd] Benötigt ThymidinthyA57* Unfähig, Galactose zum Wachstum zu verwertenΔ40[gal-uvrB] Unfähig, Maltose zum Wachstum zu verwertenΔ29[bioH-asd] Unfähig, Glycerin zum Wachstum zu verwertenΔ29[bioH-asd] Unfähig, Colaminsäure zu synthetisierenΔ40[gal-uvrB] UV-sensibel (defekt in Photo- und Lichtreparatur)Δ40[gal-uvrB] Sensibel gegen Glycerin (unter aeroben Bedingungen)Δ29[bioH-asd] Sensibel gegen Gallensäuresalze,
ionische Tenside, Antibiotika und Chemikalienrfb-2 und zusätzlich die Mutationen oms-1 und wahrscheinlich oms-2 Resistent gegen NalidixinsäurenalA25 Resistent gegen CycloserincycA1 cycB2 Resistent gegen Chlorat (unter aeroben Bedingungen)Δ40[gal-uvrB] Resistent gegen TrimethoprimthyA57* Resistent gegen T1, T5, Φ80tonA53 Resistent gegen λ und 21Δ29[bioH-asd] Partiell resistent gegen P1rfb-2 und zusätzlich die Mutationen oms-1 und wahrscheinlich oms-2 Unfähig zur KonjugationΔ40[gal-uvrB] rfb-2 und zusätzlich die Mutationen oms-1 und wahrscheinlich oms-2 Zur Produktion von Minizellen befähigtminA1 minB2 Temperaturempfindlich bei 42°Coms-2-Mutation gekoppelt mit thyA57* und oms-1 in Verbindung mit rfb-2

Die Mutation thyA57* könnte abgeleitet sein von dem ΔthyA57-Allel, da sie jedoch revertiert, wurde sie mit einem Stern versehen.

Tabelle V

Stabilität genetischer Marker in χ1776 und χ1876a)

Tabelle XI

Fähigkeit von P1L4, Plaques zu bilden und χ1776 und dessen Vorfahren zu transduzieren

Die Nützlichkeit der mittels dieser Erfindung genetisch modifizierten Mikroorganismen der Art Escherichia coli Isolieren von mutierten Stammableitungen

Bekanntlich findet unter den nach DAP-losem Tod in Minimalmedium überlebenden dap-Zellen eine Anreicherung jener Mutanten statt, die in dem besagten Medium nicht wachsen können und die deshalb durch DAP-Mangel nicht inaktiviert werden. Ganz analog findet unter den nach thyminlosem Tod in Minimalmedium überlebenden thyA-Zellen eine Anreicherung solcher Mutanten statt, die in dem besagten Medium nicht wachsen können und die deshalb durch Thyminmangel nicht inaktiviert werden. Bei der Anreicherung von Mutanten in dap⁺thy⁺-Stämmen benützt man eine Zugabe von Ampicillin und/oder Cycloserin, um alle nicht mutierten Zellen auszuschalten und mutierte Zellen anzureichern. Die Tatsache, daß Stämme wie χ1776, χ1792, χ1976 und χ2076 zur Verfügung stehen, welche sowohl Diaminopimelinsäure und Thymidin zum Wachstum benötigen, erlaubt die Entwicklung eines Mutanten-Anreicherungsverfahrens, das die kombinierten Vorzüge des DAP-losen Todes, des thyminlosen Todes und der Ampicillin+Cycloserin-Anreicherung zur Isolation von seltenen Mutanten aus diesen Stämmen erlaubt. Eine solche Methode wurde entwickelt und ermöglicht die erwähnten Zielsetzungen. Mutierte Abkömmlinge der Stämme χ1776, χ1972, χ1976 und χ2076 sind für viele Untersuchungen, die mit rekombinanten DNS-Molekülen zu tun haben, sehr nützlich. Diese Mutantenanreicherungstechnik wird deshalb eine breite Anwendung finden.

Isolieren von Plasmid-Vektor-DNS

Da χ1776, χ1972, χ1976 und x2076 sehr empfindlich gegenüber ionischen Tensiden sind, ist es für den Erfolg von Versuchen, diese Stämme zu transformieren, entscheidend, daß sämtliche zur Transformation verwendete DNS-Präparationen frei von solchen ionischen Tensiden sind. Da diese Stämme gegenüber nicht-ionischen Tensiden wie z. B. Brÿ-58, Triton-X100 etc. ebenso resistent sind wie Wildtypstämme von E. coli, ist es ratsam, diese nicht-ionischen Tenside anstelle der ionischen Tenside zum Isolieren von Plasmid-Kloniervektor-DNS zu benützen, ganz gleich ob diese Fremd-DNS enthält zur Einführung durch Transformation in diese Stämme oder nicht. Methoden zur Isolierung von Kloniervektor-DNS, die überhaupt keine Tenside benötigen, sind bevorzugt.

Es wurden deshalb Methoden zur Isolierung von Plasmid-Kloniervektor-DNS entwickelt, die auf Modifikationen der Standardmethoden zur Präparation von "Cleared Lysates" (Guerry et al., 1973) und zur Reinigung der Plasmid-DNS durch Ethidiumbromid-Cäsiumchlorid Zentrifugation (Mukai et al., 1973) beruhen. Es handelt sich um folgende Modifikationen:

• 1. Wenn der einen Plasmid-Kloniervektor enthaltende Wirtsstamm ein Wildtyp-ähnlicher Wirt wie etwa W1485, C600 etc. ist, wird die Endkonzentration von Natriumdodecylsulfat oder Sarkosyl zur Lyse der Lysozym-erzeugten Sphäroplasten von der üblicherweise angewandten Konzentration von 1 bis 5% reduziert auf 0,25%. Die anderen Methoden werden nach Guerry et al. und Kukai et al. durchgeführt, jedoch wird nach Entfernung des Ethidiumbromids mittels einer Isopropanolextraktion die gereinigte Plasmid-Kloniervektor-DNS bei 4°C gegen 500 ml TEN-Puffer dialysiert (Tris, 20 mM; EDTA, 2 mM; NaCl, 10 mM; pH 8,0). Der Puffer wird während einer Zeit von 3 bis 4 Tagen alle 12 Stunden gewechselt, um sämtliches Cäsiumchlorid und restliches Tensid zu entfernen. Die so isolierte DNA wird dann in TEN-Puffer bei 4°C und verdünnt mit Tris (0,02 M) - NaCl (0,8%)-Puffer (pH 8,0), für Transformationsversuche aufbewahrt. Die Anwendung von nicht-ionischen Tensiden aus Wildtyp-ähnliche Wirte bringt keine zufriedenstellenden Ausbeuten von Plasmid-DNS.
• 2. Wenn der einen Plasmid-Kloniervektor enthaltende Wirtsstamm χ1776 oder ein ähnlicher modifizierter Wirt ist, dann kann die Endkonzentration von Natriumdodecylsulfat oder Sarkosyl bis auf 0,1% reduziert werden, um die Lyse der Lysozym-erzeugten Sphäroplasten zu ermöglichen. Das weitere Vorgehen ist wie oben unter 1 beschrieben.
• 3. Wenn der einen Plasmid-Kloniervektor enthaltende Wirt der Stamm χ1776 oder ein ähnlich modifizierter Wirt ist, so können die Lysozym-erzeugten Sphäroplasten durch Zugabe von Brÿ-58 oder eines anderen nicht-ionischen Tensids bis zur Endkonzentration von 0,25% lysiert werden. Die DNS wird bei 4°C wie oben unter 1 beschrieben dialysiert werden, jedoch nur über eine Zeit von 24 bis 36 Stunden.
• 4. Wenn der einen Plasmid-Kloniervektor enthaltende Wirt der Stamm χ1776 oder ein anderer ähnlich modifizierter Wirt ist, können die Lysozym-erzeugten Sphäroplasten durch einen osmotischen Temperaturschock durch Zugabe eines gleichen Volumens auf pH 9 eingestelltes eiskaltes Wasser lysiert werden. Die Lyse erfolgt wie oben unter 3 beschrieben.

Methodik der Transformation von χ1776

Entsprechend der Eigenart der Zelloberfläche von χ1776 und anderer genetisch modifizierter Mikroorganismen der Art E. coli, erbringen die bekannten Methoden zur Transformation mit Plasmid-Vektor-DNS nur sehr geringe Ausbeuten an Transformanten. Dieses Problem kann weiter erschwert werden, je nach der Methode der Plasmid-DNS-Isolierung und dem Ausmaß der Dialyse solcher DNS, wie oben besprochen. Es schien deshalb wünschenswert, eine neue Methode zur optimalen Transformation von χ1776 zu entwickeln. Es folgt eine Aufzählung der Schritte dieser Methode:

• 1. Stelle eine Übernacht-Kultur (18 Std.) von χ1776 durch Wachstum in einer stehenden Kultur von 5 ml L-Nährmedium+DAP (100 µg/ml)⁺Thd (5 µg/ml) bei 37°C her.
• 2. Verdünne die Übernacht-Kultur 1 : 10 mit 20 ml L-Nährmedium+DAP+Thd und inkubiere unter Belüftung (z. B. Schütteln) 3 bis 4 Stunden bei 37°C, bis die Kultur eine optische Dichte von 0,5 bis 0,6 bei A₆₀₀ erreicht.
• 3. Sedimentiere die Zellen der Kultur durch 10minütige Zentrifugation bei 4°C und 8700 g (z. B. 8500 rpm im SS-34-Rotor der Sorval Kühlzentrifuge).
• 4. Verwerfe den Überstand und resuspendiere sehr vorsichtig das Pellet in 10 ml eiskalter 10 mM Natriumchloridlösung.
• 5. Sedimentiere die Zellen wie oben unter 3.
• 6. Verwerfe den Überstand und resuspendiere das Pellet sehr vorsichtig in 10 ml eiskaltem Calciumchlorid (75 mM) in Tris-HCl (10 mM)-Puffer (pH 8,4) und stelle die Zellsuspension für 20 bis 25 Minuten in einen Eiseimer (vgl. auch Anmerkung zu Schritt 6 unten).
• 7. Sedimentiere die Zellen wie oben unter 3.
• 8. Verwerfe den Überstand und resuspendiere das Pellet sehr vorsichtig in 2,0 ml eiskaltem Calciumchlorid (75 mM) in Tris-HCl (10 mM)-Puffer (pH 8,4) und stelle die Zellsuspension in einen Eiseimer.
• 9. Füge 100 ml Plasmid-Vektor-und/oder Rekombinant-DNS in 0,02 M Tris, 0,8% Natriumchlorid (pH8,0) in ein reines Pyrex Reagenzglas im Eisbad bei 0°C. Die DNS-Lösung soll eine Konzentration von etwa 0,2 µg/ml besitzen.
• 10. Füge dann 200 µl abgekühlte Zellen aus Schritt 8 hinzu. Die Zellsuspension soll eine Konzentration von 0,9 bis 2,0×10⁹ Kolonie-bildende Einheiten/ml enthalten, obwohl niedere Zellkonzentrationen (z. B. 2,0×10⁸/ml) eine etwas höhere absolute Transformationsausbeute erbringen.
• 11. Halte das Röhrchen für 20 bis 25 Minuten im Eis.
• 12. Erhitze dann das Gemisch in einem Wasserbad schnell auf 42°C und lasse es dort bei dieser Temperatur für 1 Minute. Eine längere Inkubation bei 42°C hat wenig oder keinen Nutzen zur Anhebung der Transformationsrate.
• 13. Kühle dann das Reagenzglas im Eisbad 10 Minuten lang.
• 14. Wenn der Kloniervektor pSC101, pMB9 oder ein Abkömmling davon ist, plattiere eine 0,1-ml-Probe direkt auf EMB+DAP+Thd+1% Glucose+25 µg Nalidixinsäure/ml+12,5 µg Tetracyclin/ml. Beim Plattieren soll die Probe nur kurz über die Oberfläche der Platte verteilt werden und dann der Flüssigkeit Gelegenheit gegeben werden, in die Platte einzuziehen. Ein Ausstreichen bis zur Trockenheit reduziert die Ausbeute an Transformanten. Die Platten sollen am gleichen Tag hergestellt und nicht oberhalb 42°C getrocknet werden, da Tetracyclin hierbei zu einem toxischen Produkt umgewandelt wird.
• 15. Wenn der Kloniervektor pCR1 oder ein Abkömmling desselben ist, überführe 0,1 ml des Transformationsgemisches in 0,9 ml L-Nährlösung+DAP+Thd+25 µg Nalidixinsäure/ml und inkubiere bei 37°C 2 Stunden lang; plattiere auf EMB+DAP+Thd+1% Glucose+25 µg Nalidixinsäure/ml+25 µg Kanamycin/ml.
• 16. Inkubiere die Platten für 2 bis 3 Tage bei 37°C.

Anm.: Alle Glasgeräte, Zentrifugenröhrchen etc. müssen sauber und frei von Kratzern sein, die vom Spülen herrührende Tenside enthalten können.

Spezielle Vorteile von erfindungsgemäß genetisch modifizierten Mikroorganismen der Art Escherichia coli für das Arbeiten mit rekombinanten DNS-Molekülen

χ1776 (Tab. C):
- geeignet zum Arbeiten mit Plasmid-Kloniervektoren wie pSC101, pMB9, pCR1 etc., die nicht durch Konjugation übertragbar sind.

x2076 (Tab. D):
- geeignet zum Arbeiten mit nicht-konjugativen Plasmid-Kloniervektoren wie pSC101, pMB9, pCR1 etc.

χ1963 (Tab. E):
- geeignet zum Arbeiten mit von g-abgeleiteten Kloniervektoren, die unfähig sind, den Wirt zu lysogenisieren und die in ihrer Replikation und Reifung mit Produktion von infektiösen Phagen-Partikeln abhängig sind von der Anwesenheit von Amber-Supressor-Mutationen im Wirt.

χ1961 (Tab. E):
- nützlich zur Überprügung von λ-Vektoren, die verträglich sind mit χ1963 in der Beibehaltung von Amber-supprimierbaren Mutationen im Vektor; geeignet zum Arbeiten mit λ-Vektoren, die unfähig sind, den Wirt zu lysogenisieren und die Amber-supprimierbare Mutationen besitzen, welche die Produktion von Phagenschwänzen und/oder den Zusammenbau von Phagenschwänzen und Phagenköpfen verhindern, die jedoch nicht die Replikation des Phagenvektors oder den Zusammenbau des Kopfs des Phagenvektors, der schon DNS enthält, unmöglich machen.

x1972 (Tab. E):
- geeignet zum Arbeiten mit λ-Vektoren, die ihren Wirt lysogenisieren und deren Reifung und Zusammenbau zu infektiösen Phagenpartikeln von der Anwesenheit von Amber-supprimierbaren Mutationen im Wirt abhängig ist. Dieser Stamm ist weiterhin geeignet zum Arbeiten mit nicht-konjugativen Plasmid-Kloniervektoren, deren Aufrechterhaltung, Replikation und Funktion unabhängig von der Anwesenheit von Amber-Suppressor Mutationen im Wirt ist.

χ1976 (Tab. E):
- geeignet zum Arbeiten mit nicht-konjugativen Plasmid-Kloniervektoren wie pSC101, pMB9, pCR1 und Abkömmlingen davon; weiter geeignet zum Arbeiten mit Plasmid-Kloniervektoren, die sich von λ ableiten, wie etwa λ dv und dessen Abkömmlingen.

χ1966, χ1968, χ1969, x1970, χ1973, χ1974 und χ1975 (Tab. E):
- diese modifizierten Wirte sind wahrscheinlich nützlich zum Arbeiten mit verschiedenen, von Viren und Plasmiden abgeleiteten Kloniervektoren, die noch nicht entwickelt wurden.

Vom Stamm Escherichia coli K-12 χ1776 wurde in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.A., eine Kultur unter der ATCC Nr. 31 244 hinterlegt.

Nachstehend wird eine Aufzählung der zitierten Literatur und der Publikationen gegeben.

Anm. zu Schritt 6: Der pH-Wert der CaCl₂-Lösung ist kritisch. Der pH-Wert hängt davon ab, ob CaCl₂ oder CaCl₂ · 2H₂O verwendet wird. Er hängt ferner vom Alter der geöffneten Flasche mit CaCl₂-Lösung und der Qualität des Suspendierwassers ab. Lösungen mit einem pH-Wert von 8,4 ergeben optimale Ausbeuten an Transformanten.

Liste der zitierten Veröffentlichungen

•  1. Adams, M. H., Bacteriophages, Interscience Publishers, New York (1959), S. 592.
•  2. Bachmann, B. J., Bacteriol. Rev., 36 (1972), 525-557.
•  3. Bachmann, B. J., Low, K. B., and Taylor, A. L., Bacteriol. Rev. 40 (1976), 116-167.
•  4. Berg, C. M., and Curtiss, R., III, Genetics 56 (1967), 503-525.
•  5. Bukhari, A. I., and Taylor, A. L., J. Bacteriol. 105 (1971), 844-854.
•  6. Curtiss, R., III, Genetics 50 (1964), 679-694.
•  7. Curtiss, R., III, J. Bacteriol. 89 (1965), 28-40.
•  8. Curtiss, R., III, Charamella, L. J., Stallions, D. R., and Mays, J. A., Bacteriol. Rev. 32 (1968), 320-348.
•  9. Curtiss, R., III, Macrina, F. L., and Falkinham, J. O., III, Escherichia coli - An overview, Handbook of Genetics, Vol. I, R. C. King (ed.) (1974), 115-133.
• 10. Demerec, M., Adelberg, E. A., Clark, A. J., and Hartman, P. E., Genetics 54 (1966), 61-76.
• 11. Frazer, A. C., and Curtiss, R., III, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 69 (1975), 1-84.
• 12. Gross, J. D., and Caro, L. G., J. Mol. Biol. 16 (1966), 269-284.
• 13. Guerry, P., LeBlanc, D. J., and Falkow, S., J. Bacteriol. 116 (1973), 1064-1066.
• 14. Kellenberger, G., Symonds, N., and Arber, W., Z. Vererbungsl. 98 (1966), 247-256.
• 15. Lennox, E. S., Virology 1 (1955), 190-206.
• 16. Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972.
• 17. Mukai, T., Matsubara, K., and Takagi, Y., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 70 (1973), 2884-2887.
• 18. Reiner, A. M., J. Bacteriol. 97 (1969), 1431-1436.
• 19. Stallions, D. R., and Curtiss, R., III, J. Bacteriol. 105 (1971), 886-895.
• 20. Wood, W. B., J. Mol. Biol. 16 (1966), 118-133.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von Escherichia coli Sicherheitsstämmen, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:
entweder (A)

2. Escherichia coli Sicherheitsstämme, erhältlich nach einem der Verfahrensschritte, Teilschritte oder Einzelschritte gemäß Anspruch 1.

3. Verwendung eines Sicherheitsstammes von Escherichia coli gemäß Anspruch 2 in der DNS-Rekombinationstechnologie.