DE60023501T2

DE60023501T2 - Einstufiger allel-austausch in mykobakterium mittels konditionell transduzierendem phagen

Info

Publication number: DE60023501T2
Application number: DE60023501T
Authority: DE
Inventors: R. William JACOBS; Stoyan S. Bardarov
Original assignee: Albert Einstein College of Medicine
Current assignee: Albert Einstein College of Medicine
Priority date: 1999-07-08
Filing date: 2000-07-06
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2020-07-07
Also published as: WO2001004267A1; EP1194526B1; EP1194526A1; EP1194526A4; US6271034B1; AU6803700A; DE60023501D1; ATE307880T1; WO2001004267A9

Description

Hintergrund der Erfindung
Im April 1993 wurde erklärt, dass Tuberkulose eine Bedrohung für die globale Gesundheit darstellt – zum ersten Mal in der Geschichte der Weltgesundheitsorganisation wurde eine solche Aussage getätigt. Diese „Auszeichnung" ist bedauerlicherweise gerechtfertigt, da Tuberkulose eine der häufigsten Ursachen von Krankheit und Tod in der Welt ist (37), teilweise bedingt durch die erhöhte Empfänglichkeit von HIV-infizierten Individuen und dem bedenklichen Auftreten von Stämmen, die gegen viele Medikamente resistent sind sowohl in Industrie- als auch in Entwicklungsländern. Effektive neue Tuberkulosekontroll- und Vorbeugungsstrategien benötigen zusätzliches Wissen über den verursachenden Erreger und seine Interaktion mit dem menschlichen Wirt.
In dieser Hinsicht hat die Bestimmung der Genomsequenz von Mycobacterium tuberculosis (7) viele neue Möglichkeiten zum Untersuchen der Tuberkulosepathogenese gegeben. Viele der Gene in dem Genom von M.tuberculosis besitzen keine bekannte Funktion. Ein erster Schritt beim Bestimmen einer Funktion eines unbekannten Gens liegt in der Generierung einer Mutation in diesem Gen und der Charakterisierung des resultierenden Mutantenstamms. Studium des Verhaltens dieser Mutanten in einem Modellsystem von Tuberkulose könnte den Mechanismus offenbaren, über den M.tuberculosis sich innerhalb der Wirtszellen multipliziert und den immunologischen Effektorfunktionen des Wirtes widersteht.
Die Verfügbarkeit der M.tuberculosis Genomsequenzen und die Entwicklung erfolgreicher Transformationsprotokolle für das langsam wachsende Mycobakterium (32, 34) gestaltet das Konstruieren spezifischer Mutationen einfach. Jedoch war das Einbringen dieser mutierten Allele in ihre homologen Bereiche in dem Chromosom, d.h. Allelaustausch, in diesem Organismus bekanntermaßen schwierig. Langsam wachsende Mycobakterien wie M.bovis BCG und M.tuberculosis können exogene DNA sowohl über illegitime als auch über homologe Rekombination (13, 16) in ihr Chromosom intergrieren. In den letzten Jahren wurde über eine große Anzahl erfolgreicher Genspaltungen in verschiedenen Mycobakterienarten unter Verwendung von kurzen (1, 13, 28) oder langen linearen DNA-Fragmenten (2) als homologe DNA-Substrate berichtet. Eine „suizidale" Vektor-Annäherung unter Verwendung rekombinanter Plasmide, die unfähig zur Replikation in Mycobakterien waren, wurde ebenfalls häufig zum Bewirken von Allelaustausch in sowohl schnell als auch langsam wachsenden Mycobakterien verwendet (5, 14) (22) (23) (24, 25, 31). Unglücklicherweise ist es sehr schwierig, die tatsächliche Häufigkeit von Allelaustauschereignissen in diesen Experimenten einzuschätzen aufgrund der geringen Anzahl erhaltener Transformanten, insbesondere wenn langsam wachsende Mycobakerien verwendet wurden. Dies führte zu der allgemeinen Schlussfolgerung, dass homologe Rekombinationen in langsam wachsenden Mycobakterien ineffizient ist (16).
Ein zweistufiges Selektionsverfahren unter Verwendung einer selektierbaren und gegenselektierbaren Markierungssubstanz, die auf einem entweder replizierenden oder nicht replizierenden Plasmid plaziert ist, wurde bei M.smegmatis (14, 24) erfolgreich eingesetzt. Zudem hat die Verwendung eines konditionalen replizierenden temperatursensitiven Plasmids als Bezugsvektor die Reproduzierbarkeit des Allelaustauschs in langsam wachsenden Mycobakterien (23) deutlich gesteigert.
Jedoch wäre der natürliche Mechanismus des Austauschs genetischer Information wie Konjugation oder Transduktion eine alternative Strategie zum Einbringen homologer DNA in Mycobakterien mit einer hohen Effizienz. Obwohl Konjugation für M.smegmatis (17, 20, 33) beschrieben wurde, wurde es für langsam wachsende Mycobakterien noch nicht beschrieben. Ebenso wurde Transduktion für M.smegmatis (26) beschrieben, aber nicht für BCG oder M.tuberculosis.
Da die Bildung von Mutanten bei M.tuberculosis und BCG von besonderer Wichtigkeit bei der Analyse von Genfunktionen ist, ist es wünschenswert effektive Mittel und Verfahren zum allelischen Austausch für M.tuberculosis, BCG und andere langsam wachsende Mycobakterien zu entwickeln. Verfahren zum effektiven Allelaustausch würden die Bestimmung von Wildtyp- und Mutanten-Genen von M.tuberculosis und BCG-Mycobakerien erleichtern und dabei die notwendigen Werkzeuge zum Verstehen des Mechanismus, über den diese Mycobakterien überleben und replizieren, bereitstellen. Zudem würde es die Entwicklung von Impfstoffen und neuen Medikamenten, die bei der Behandlung von Infektionen, die von M.tuberculosis, BCG und anderen Mycobakterien verursacht werden, wirksam sind, erleichtern.
Die WO 99/16868 offenbart ein konditionales Shuttle-Phasmid, das über Einbringen eines Cosmids in eine nicht essentielle Region des TM4-Mycobakteriophags, der die betreffende DNA in Mycobakterien einbringt, konstruiert wird. Das Journal of Bacteriology (1996) 273–279 offenbart den allelischen Austausch beim Mycobakterium für M.tuberculosis mit langen linearen Rekombinationssubstraten von 40 bis 50 kb Länge.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein neues einstufiges Verfahren zum Bewirken von hochfrequentem allelischem Austausch in schnell- und langsam wachsenden Mycobakterien unter Verwendung von in vitro generierten konditionalen transduzierenden Phagen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten mutierenden Mycobakteriums bereit einschließlich eines rekombinanten mutierenden langsam wachsenden Mycobakteriums, umfassend das Infizieren eines Mycobakteriums mit einem konditionalen transduzierenden Phagen, bei dem der konditionale transduzierende Phage ein mutiertes DNA-Substrat zum allelischen Austausch mit einer homologen Wildtyp-Nukleinsäuresequenz des Mycobakteriums aufweist. Das infizierte Mycobakterium wird unter Bedingungen kultiviert, in denen der konditionale transduzierende Phage nicht repliziert. Das mutierte DNA-Substrat wird in das Chromosom des Mycobakteriums über homologe Rekombination eingebracht, wobei ein rekombinantes mutierendes Mycobakterium gebildet wird, das das mycobaterielle DNA-Substrat anstelle der homologen Wildtyp-Nukleinsäuresequenz des Mycobakteriums aufweist.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen konditionalen transduzierenden Phagen bereit, der einen konditionalen Mycobakteriumphagen umfasst, der ein E.coli Bakteriophage Lambdacosmid, eingebracht in eine nicht essentielle Region des Micobakteriophagen, aufweist, wobei dieses Cosmid zusätzlich ein mutiertes DNA-Substrat umfasst, das homolog zu einer Wildtyp-Nukleinsäuresequenz von Mycobakterium ist.
Zusätzliche Ziele der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung hervor.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 stellt ein Schema eines einstufigen Genaustauschs in Mycobakterien dar, wobei in vitro konstruierte spezialisierte konditionale transduzierende Phagen verwendet werden. Das erwünschte Mycobakteriumgen wird unter Verwendung von PCR amplifiziert und in E.coli-Plasmid kloniert (pBluescript^®). Über Restriktionsenzymdigestion oder long range invers PCR wird eine Deletion geschaffen und mit einer res-aph-res oder res-hyg-res Genkassette markiert. Das Rekombinationssubstrat wird in den konditionalen replizierenden TM4ts-Phagen (bezeichnet als phAE87, hinterlegt bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Zugangs-Nr. 209306) zur Herstellung eines spezialisierten konditionalen transduzierenden Phagen eingebracht. Hoch-Titer-Lysate dieses rekombinanten Phagen werden über Propagieren in M.smegmatis bei 30°C erhalten. Die Lysate werden mit Wirtszellen bei einem MOI von 10 vermischt, bei 37°C inkubiert, um die Absorption des Phagens zu ermöglichen, anschließend werden die Zellen auf Selektionsmedien bei 37°C plattiert. Antibiotika-Resistenz-Transduktanten werden auf Auxotrophie über Plattieren auf komplettem und minimalem Medium und auf die Gegenwart von Allelaustausch über PCR oder Southern-Blotting analysiert.
2 zeigt Southern-Blot-Analyse der Genom-DNA des Wildtyps M.smegmatis mc²155 (Bahn 1) und M.smegmatis mc²1494 (Bahn 2) digeriert mit PvuII und sondiert mit einem 2,3 kb EcoR1-Fragment von pYUB619, das das ΔlysA4::res-hyg-res-Allel umfasst. Das Wildtyp-Fragment zeigt die erwarteten 1,9 kb, während die genomische DNA des Mutanten das erwartete 3,4 kb-Fragment aufweist.
3 ist eine Analyse von M.bovis BCG ΔlysA5::res-aph-res lysA auxotrophen Mutanten, die über spezialisierte Transduktion mit phAE128 erhalten wurden. Tafel A gibt ein auxotrophes Screening von BCG-Pasteur Transduktanten, plattiert auf minimalem und komplettem Medium auf einer 96 Vertiefungen aufweisenden Platte wieder. Tafel B zeigt die Ergebnisse der PCR-Analyse von 12 willkürlich ausgewählten kanamycinresistenten BCG-Pasteur Transduktanten unter Verwendung der Primer Pv21 und Pv22 (Bahnen 5 bis 16). Negative Kontrollen schließen ein Plasmid pYUB665 ein, das das Wildtyp lysA Gen (Bahn 2) trägt, gereinigte Wildtyp-chromosomale DNA (Bahn 4) und das Plasmid pYUB669, enthaltend das ΔlysA5::res-aph-res-allel (Bahn 3). Ebenfalls gezeigt ist ein Schema der Primer, die auf lysA⁺ und ΔlysA5::res-aph-res positioniert sind.
4 zeigt die Southern-Blot-Analyse des lysA und leuCD-Lokus von M.bovis BCG-Pasteur, Kopenhagen und Moreau auxotrophen Mutanten. Genom-DNA von den auxotrophen Stämmen wurde mit ApaLI für ΔlysA5::res-aph-res-Auxotrophe oder SacII für ΔleuCD6::res-aph-res-Auxotrophe verdaut. Tafel A zeigt Genom-DNA des Wildtyp-BCG-Substamms Pasteur (Bahn 1), des BCG-Substamms Pasteur auxotroph mc²1507 (Bahn 2), des BCG-Substamms Kopenhagen mc²1508 (Bahn 3) und des BCG-Substamms Moreau mc²1509 (Bahn 4), sondiert mit lysA PCR-Produkt von BCG Pasteur Wildtyp-Genom-DNA. Das Wildtypfragment ist das erwartete 1,1 bp, während die Genom-DNA der auxotrophen Stämme das erwartete 2,2 kb Fragment hat. Bild B zeigt Genom-DNA des Wildtyp-BCG-Substamms Pasteur (Bahn 1), des BCG-Substamms Pasteur auxotroph mc²1510 (Bahn 2), des BCG-Substamms Kopenhaben mc²1511 (Bahn 3) und des BCG-Substamms Moreau mc²1512 (Bahn 4), sondiert mit 3,3 kb PstI – HindIII-Fragment von pYUB853. Das Wildtypfragment ist das erwartete 1,9 kb, während die Genom-DNA der auxotrophen Stämme das erwartete 3,4 kb Fragment hat. Ebenfalls gezeigt ist das Schema der markierten Deletionsallele von ΔlysA5::res-aph-res und ΔleuCD6::res-aph-res.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zum Erzeugen von hochfrequentem allelischen Austausch bei schnell und langsam wachsenden Mycobakterien bereit unter Verwendung von in vitro generierten spezialisierten konditionalen transduzierenden Mycobacteriophagen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist insbesondere für die Bildung von Mutanten über allelischen Austausch in Mycobacterium tuberculosis Komplex Organismen geeignet, bevorzugt in Stämmen von M.tuberculosis, M.bovis und Bacille-Calmette-Geurin (BCG), die langsam wachsende Mycobakterien sind, sowie in anderen langsam wachsenden Mycobakterien zusätzlich zu nicht tuberkulösen schnell wachsenden Myco bakterien, die üblicherweise in biologischen Proben angetroffen werden, die isoliert von menschlischen Subjekten sind, z.B. M.avium-intracellulare, M.kansasii, M.xenopi, M.scrofulaceum, M.simiae, M.szulgai, M.gordonae, M.gastri, M.smegmatis und M.chelonae. Der Ausdruck „mutiertes Mycobakterium" bedeutet hier, dass das mutierte Mycobakterium mindestens ein mutantes Gen aufweist, so dass die Expression oder Funktion des Gens im Vergleich zu dem nicht mutierten Gen in dem Ausgangsstamm verändert ist.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Mycobakterium mit einem konditionalen transduzierenden Phagen infiziert, der ein mutiertes DNA-Substrat umfasst, das homolog zu einer Wildtyp-Nukleinsäuresequenz des Mycobakteriums ist, in das das mutierte DNA-Substrat über allelischen Austausch eingebracht werden soll. Das infizierte Mycobakterium wird bei nicht permissiver Temperatur (d.h. unter Bedingungen, in denen der konditionale transduzierende Phage nicht repliziert) aufgezogen. Die Phagen-DNA dringt demnach in das Mycobakterium ein aber ohne Lysis des infizierten Mycobakteriums. Auf diese Weise kann das mutierte DNA-Substrat für den Allelaustausch in das Mycobakteriumchromosom über homologe Rekombination mit der homologen Mycobakteriumnukleinsäuresequenz integriert werden, was in einem Austausch der Wildtyp-Nukleinsäuresequenz des Mycobakteriums durch die Nukleotidsequenz des mutierten DNA-Substrats führt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Herstellung von rekombinanten mutierenden schnell wachsenden Mycobakterien eingesetzt werden einschließlich rekombinanter mutierender Stämme von M.smegmatis oder M.avium, aber wird vorzugsweise zur Herstellung rekombinanter mutierender Stämme von langsam wachsenden Mycobakterien eingesetzt und besonders bevorzugterweise von rekombinanten Mutanten von M.tuberculosis, M.bovis BCG oder M.leprae.
Der Vektor der vorliegenden Erfindung, der das mutierte DNA-Substrat für den allelischen Austausch in ein Mycobakterium einbringt, ist ein spezialisierter konditionaler transduzierender Phage. „Konditionale" Phagen wie sie hier verwendet werden sind solche, die sich lediglich unter bestimmten Bedingungen, wie bei bestimmten Temperaturen, replizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der konditionale transduzierende Phage ein TM4 Phage, der bei 30°C repliziert, aber bei 37°C nicht repliziert und seine Gastzelle nicht lysiert. Dieser konditionale transduzierende Phage wird über Einbringen von mutiertem DNA-Substrat zum allelischen Austausch in ein Cosmid hergestellt, welches wiederum in eine nicht essentielle Region des Genoms eines TM4 Mycobacteriophagen eingebracht wird. Der Begriff „insertiert" wie er hier verwendet wird bedeutet die Ligation des fremden DNA-Fragments und Vektor-DNA über Techniken, wie dem Annealing von kompatiblen kohäsiven Enden, die über Restriktionsendonuklease-Digerierung oder über Blunt-End-Ligationstechniken hergestellt wurde. Andere Verfahren zum Ligieren von DNA-Molekülen sind dem Fachmann bekannt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das mutierte DNA-Substrat für den allelischen Austausch in das E.coli Bakteriophage Lambdacosmid des konditionalen Shuttle Phasmids, bezeichnet als pHAE87, eingebracht, wobei dieses Phasmid unter dem Budapester Vertrag vom 26. September 1997 bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland hinterlegt wurde und mit der Zugangsnummer 209306 bezeichnet wurde. PhAE87 wird über die Verfahren, die in der US 5 972 700 , betitelt TM4 CONDITIONAL SHUTTLE PHASMID AND USES THEREOF, offenbart werden, hergestellt.
Das DNA-Substrat für den Allelaustausch kann jeden Ursprungs sein. Vorzugsweise stammt es jedoch von einem Mycobakterium. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammt das mutierte DNA-Sustrat für den Allelaustausch von einem Mycobakterium und ist homolog zu einer Wildtyp-Nukleinsäuresequenz des Mycobakteriums, in der das mutierte DNA-Substrat anstelle der Wildtyp-Nukleinsäuresequenz eingebracht werden soll.
Das DNA-Substrat für den Allelaustausch enthält die interessierende Mutation, die über Allelaustausch in die homologe Region der Mycobakteriumnukleinsäure eingebracht worden ist. Der Ausdruck „mutiertes DNA-Substrat", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Nukleotidsequenz für mindestens ein Allel, das über Addition, Substitution oder Deletion von mindestens einem Nukleotid verändert worden ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das mutierte DNA-Substrat eine Deletionsmutation der Wildtyp-Nukleinsäuresequenz. Mutationen, die Deletions-, Substitutions- oder Insertionsmutationen einschließen, aber nicht auf diese beschränkt sind, können über alle bekannten Verfahren hergestellt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf das Behandeln mit Restriktionsendonukleasen, inverser PCR und Subklonierungstechniken. Die Wildtyp-Nukleinsäuresequenz kann ein Protein oder Polypeptid kodieren und in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kodiert es ein Enzym, das wesentlich für den biosynthetischen Weg eines Baustoffs ist, die strukturelle oder Zellwandkomponente des Mycobakteriums oder eine Aminosäure wie Lysin oder Leucin. Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst ist, dass die Wildtyp-Nukleinsäure des Mycobakteriums ein Operon oder einen Cluster von Allelen aufweisen kann, das eine Anzahl von Proteinen oder Polypeptiden kodiert, oder einen oder mehrere Promotoren, Enhancer oder Regulatoren, die in die Expression und Translation von mycobakteriellen Proteinen und Polypeptiden involviert sind. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Wildtyp-Nukleinsäure das lysA Gen oder die leuCD Gene.
Zusätzlich zu dem mutierten DNA-Substrat für den Allelaustausch kann ein selektierbares Markergen, das ein Gen, das Antibiotikaresistenz verleiht, einschließt aber nicht auf dieses beschränkt ist, mit dem DNA-Substrat ligiert sein und das hierbei entstehende Molekül in phAE87 oder ein äquivalentes Phasmid unter Verwendung von Standardverfahren ligiert sein. Selektierbare Markergene, die in dem DNA-Substrat enthalten sein können, sind in der Technik gut bekannt und schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Gene, die Widerstandskraft gegen Antibiotika verleihen wie Kanamycin, Ampicillin, Viomycin, Thiostrepton, Hygromycin oder Bleomycin.
Die erhaltene ligierte DNA, die die Phasmid DNA umfasst, das mutierte DNA-Substrat und/oder die selektierbare Marker DNA wird anschließend in Bacteriophagen-Lambdaköpfe gepackt unter Verwendung eines allgemein verfügbaren in vitro Packgemisches. E.coli wird anschließend mit dem Phagengemisch, das die ligierte DNA enthält, transduziert und die Transduktanten werden über ihre Fähigkeit isoliert in einem Medium wachsen zu können, das das Antibiotikum, das dem selektierbaren Marker-Gen auf dem Cosmid entspricht. Die daraus hervorgehenden konditionalen Phasmide werden isoliert und in irgendein infizierbares Mycobakterium eingebracht, das zur Replikation bei der permissiven Temperatur, d.h. M.smegmatis bei 30°C, befähigt ist.
Die daraus hervorgehende Plaque, die zusätzlich konditionale transduzierende Phagen enthalten, welche das mutierte DNA-Substrat umfassen, können anschließend zum Infizieren der interessierenden Mycobakterien, z.B. M.tuberculosis und BCG verwendet werden. Mycobakterien, die einen Allelaustausch erfahren haben, können durch ihr Überleben und Wachstum in einem geeigneten Auswahlmedium detektiert werden ebenso wie über Selektion hinsichtlich Auxotrophie, die von der Spaltung der Wildtypallele in Mycobakterien resultiert, wenn es angemessen ist, oder über Verwendung von PCR-Analyse, Southern- Blot-Analyse oder andere bekannte Verfahren.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann zur Herstellung zahlreicher Stämme von auxotrophen rekombinanten mutierenden Mycobakterien eingesetzt werden, die für einen bestimmten Bau stoff oder Baustoffe aufgrund Substitution über allelischen Austausch einer Wildtyp-Nukleinsäuresequenz eines Mycobakteriums mit einem mutierten DNA-Substrat auxotroph sind. Der Begriff „auxotrophes rekombinantes mutierendes Mycobakterium", wie er hier verwendet wird, wird definiert als ein Mycobakterium, das eine nutritionale Mutation aufweist, wobei die nutritionalen Anforderungen des Mycobakteriums verändert sind. Beispielsweise sind einige auxotrophe Mutanten unfähig zum Synthetisieren von Aminosäuren oder können spezifische Aminosäuren benötigen, die von den parentalen oder prototrophen Stämmen nicht benötigt werden. Spezifische auxotrophe rekombinante mutierende Mycobakterien schließen langsam wachsende Mycobakterien, die auxotroph für Leucin oder Lysin sind, ein. Vorzugsweise sind die auxotrophen rekombinanten mutierenden Mycobakterien die Stämme M.bovis, BCG oder M.tuberculosis, aber die Erfindung ist nicht auf diese Mycobakterienarten beschränkt. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung schließt das auxotrophe rekombinante mutierende Mycobakterium, das für Lysin auxotroph ist, eine Mutation des lysA-Gens ein, während das auxotrophe rekombinante mutierende Mycobakterium, das für Leucin auxotroph ist, eine Mutation des leuCD-Gens einschließt.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Impfstoff bereit, umfassend ein auxotrophes rekombinantes mutantes Mycobakterium, das für Leucin und/oder Lysin auxotroph ist, und ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Tuberkulose bei einem Subjekt, das eine Behandlung oder Vorbeugung benötigt, unter Verwendung des Schutzstoffes. In dieser Hinsicht kann der Schutzstoff, der das rekombinante mutante Mycobakterium enthält, in Verbindung mit einem geeigneten physiologisch verträglichen Träger verabreicht werden. Mineralöl, Alaun, synthetische Polymere etc. sind repräsentative Beispiele geeigneter Träger. Bindemittel für Schutzstoffe und therapeutische Mittel liegen innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns. Die Auswahl eines geeigneten Schutzstoffes hängt ebenfalls von der Art ab, auf die der Schutzstoff oder das therapeutische Mittel verabreicht werden soll. Der Impfstoff oder das therapeutische Mittel kann in Form einer injizierbaren Dosis vorliegen und intramuskulär, intravenös, oral, intradermal oder über subkutane Administration verabreicht werden.
Ferner kann das rekombinante mutante Mycobakterium, das für Lysin auxotroph ist, bei der Konstruktion von DAP-Auxotrophen (Peptidoglycanmutanten) eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung wird in der folgenden Sektion über experimentelle Einzelheiten beschrieben, die zum Verständnis der Erfindung angefügt ist, und sollte nicht dahingehend verstanden werden, dass sie auf irgendeine Weise den Schutzbereich der Erfindung, wie er in den nachfolgenden Ansprüchen definiert ist, einschränken soll.
Experimenteller Teil
A) Experimentelle Verfahren
Bakterienstämme, Medien und Kulturverfahren: Die in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die E.coli-Stämme werden in LB (Luria-Bertani) Nährlösung oder auf LB Agar (DIFCO) gezogen für die Amplifikation rekombinanter Klone, Plasmidisolierung und Transformierung, und in 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 0,2% Maltose (TYM-Nährlösung) zur Transduktion mit λ-gepackten Cosmiden. Zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen wurde M.smegmatis mc²155 in LB-Nährlösung, enthaltend 0,5% (Gew./Vol.) Tween 80 (LBT) (22) gezogen. Wenn nötig wurden die folgenden Antibiotika in den angegebenen Konzentrationen eingesetzt: Carbenicillin (50 μg/ml), Kanamycin (25 μg/ml) und Hygromycin B (50 μg/ml für E.coli und 150 μg/ml für M.smegmatis). Hygromycin B wurde von Boehringer Mannheim bezogen (50 mg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung), alle anderen Antibiotika wurden von Sigma Chemical bezogen. Die Mycobakterienstämme (ausgenommen M.smegmatis) wurden in Basis-Middlebrook 7H9-Nährlösung (DIFCO), versetzt mit 1X ADS (0,5% Rinderserum Albumin, Fraktion V (Boehringer, Mannheim), 0,2% Glucose und 0,085% Natriumchlorid), 0,2% Glycerol und 0,1% Tween-80 (M-ADS-TW-Nährlösung) (11) gezogen. Das komplette Medium besteht aus M-ADS-TW, versetzt mit einzelnen L-Aminosäuren (Sigma Chemical), bei einer Endkonzentration von 80 μg/ml. Für die Transduktionsexperimente wurden Kulturen der BCG-Stämme durch Inokulieren von 10 ml M-ADC-TW-Nährlösung mit 1 ml gefrorener Lösung in 30 ml Plastikkulturflaschen hergestellt und bei 37°C in einem Inkubator-Schüttler (100 rpm) inkubiert. Größere Kulturen wurden durch Inokulieren von 100 ml M-ADS-TW-Nährlösung mit 1 ml einer 7 Tage alten Kultur in einer 490-cm²-Rollerflasche (Corning, Corning, N.Y.) hergestellt und bei 37°C auf einem Roller bei 8 rpm inkubiert. Zur Propagation von Mycobacteriophagen in M.smegmatis wurde mc²155 Tryptic Soy Agar (Difco), versetzt mit 0,4% Glycerol und 2 mM CaCl₂, als Grundagar verwendet und 0,6% Agar in Wasser, versetzt mit 2 mM CaCl₂, wurde als Deckelagar verwendet. Suspensionen von Mycobacteriophagen höheren Titers wurden routinemäßig von Phagen hergestellt, die in M.smegmatis vermehrt wurden, das auf diesem festen Medium bei 30°C gezogen wurde. Phagenlysate wurden in MP-Puffer (50 mM Tris.HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ und 2 mM CaCl₂) gelagert. Absorption der Phagen wurde bei 37°C 30 Minuten lang durchgeführt. Das Auswachsen der infizierten Zellen wurden über Transferieren des Phagen-Zellgemischs in einer Rollerflasche, die 50 ml komplette M-ADS-TW vorgewärmt auf 37°C enthält, durchgeführt.
DNA-Reinigung: Plasmide und Phasmide, die in dieser Studie verwendet werden, sind in Tabelle 2 aufgelistet. DNA-Manipulationen wurden im wesentlichen wie vorangehend beschrieben durchgeführt (30). Plasmid- und Phasmid-Konstruktionen wurden in E.coli DH5α oder E.coli HB101 durchgeführt und DNA wurde über ein alkalisches Mini-prep-lyse-Verfahren gereinigt. Größe re Mengen Plasmid oder Phasmid-DNA wurden wie vom Hersteller empfohlen unter Verwendung einer Qiagen (Chatsworth, CA)-Ausstattung gereinigt. DNA-Fragmente wurden über Agarosegelelektrophorese analysiert und DNA-Fragemente für die Konstruktion rekombinanter Plasmide wurden über Absorption auf Glaskügelchen gereinigt (GeneClean, Bio 101, Vista, CA). Chromosomale DNA hohen Molekulargewichts von M.smegmatis oder M.bovis BCG wurde, wie vorangehend beschrieben (2), von Bakterien, die in 50 ml Kulturen gezüchtet wurden, gereinigt wobei Glycin zu der Endkonzentration von 1% 24 Stunden vor der Zellernte zugegeben wurde. Phagen-DNA von Mycobakteriophagen wurde, wie vorangehend beschrieben (11), aber mit leichten Veränderungen gereinigt. Phagenlysate höheren Titers (30 ml) wurden auf 5 ml Puffer aus 50% Glycerol in MP-Puffer in einem 35 ml Nitrocellulose-Zentrifugenröhrchen (Beckmann, Palo Alto, CA) geschichtet und bei 25.000 Upm 2 Stunden lang in einem SW27-Rotor bei 15°C zentrifugiert. Phagen-Pellets wurden in 500 μl MP-Puffer resuspendiert, zu welchem 25 μl (0,05% vol/vol) STEP-Lysis-Lösung (0,4 M EDTA.Na₂ 1% SDS, 50 mM Tris.HCl pH 8,0, Proteinase K 500 μg/ml) zugegeben wurde und die Suspension wurde 30 Minuten lang bei 56°C inkubiert. Im Anschluss an die Extraktion mit Phenol:Chloroform (1:1) und Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) wurde die Phagen-DNA durch Zugabe von 2 vol 100%-igem Ethanol ausgefällt, in 70%-igem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und bei einer Konzentration von etwa 200 μg/ml in TE-Puffer (10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTANa₂) resuspendiert.
Konstruktion von spezialisierten transduzierenden Mycobakteriophagen: Das Plasmid pYUB665 wurde als Quelle für das M.tuberculosis ΔlysA5::res-aph-res-Gen (21) verwendet. Eine spezialisierte res-aph-res-Genkassette markiert die Deletion in dem lysA-Gen. Die spezialisierte Kassette besitzt ein aph-Gen, das von zwei γδ-Resolvase-Bereichen von dem E.coli-Transposon γδ (Tn1000) (4,9,27) flankiert wird. Die Gegenwart der Resolvase-Bereiche ermöglicht es, den antibiotischen Marker über vorüber gehende Expression des Resolvase (tnpR)-Gens zu exzidieren, nachdem die Kassette in das Mycobakterienchromosom eingebracht worden ist. A 4198 bp BclI-AscI-Fragment von pYUB665, das das ΔlysA5::res-aph-res-Gen enthält, wurde von etwa 1 kb DNA-Sequenz flankiert, jede Seite wurde über Blunt-End-Ligation in ein BspHI digeriertes Cosmid pYUB572 zur Generierung von pYUB586 kloniert.
Zum Isolieren der leuCD-Operon-Primer wurden Pleul (5'-TGAACACCGCCTTTGGCAAT-3') und Pleu2 (5'-GCCTTACGCACCGATGCCTT-3') aufgebaut unter Verwendung der M.tuberculosis-Genomsequenzdatenbank (7) zum Amplifizieren des 3342 bp DNA-Fragments von M.bovis BCG (Pasteuer-Stamm) chromosomaler DNA, enthaltend die leuC und leuD-Gene, die von etwa 0,6 kb homologer DNA-Sequenz auf jeder Seite symmetrisch flankiert wurden. Dieses PCR-Produkt wurde in den einzigen EcoRV-Bereich des pBluescript I⁺KS-Plasmids über Blunt-End-Ligierung kloniert. Eine Deletion von 944 bp wurde über Spaltung mit MluI und SphI generiert und markiert mit der res-aph res-Genkassette, die über Blunt-End-Ligierung eingeführt worden ist. Das resultierende Plasmid pYUB595 wurde mit PstI und HindIII digeriert zur Herstellung eines 3342 bp DNA-Fragments, enthaltend ΔleuCD6::res-aph-res. Das erhaltene Fragment wurde in BspHI, verdaut mit pYUB572, über Blunt-End-Ligierung kloniert zum Generieren des Cosmids pYUB597.
Das M.smegmatis ΔlysA4::res-hyg-res-Phasmid wurde von dem Plasmid pYUB617 (21) konstruiert. Dieses Plasmid enthält die ΔlysA4-Deletionsallel, die res-hyg-res-Kassette wurde in den einzigen SnaB1-Bereich bei dem Deletionspunkt in das ΔlysA4-Allel eingebracht, wobei das Plasmid pYUB619 entstand. Ein 4130 BamHI-NotI-Fragment, enthaltend das ΔlysA4::res-hyg-res-Allel wurde kloniert in BspHI, verdaut mit pYUB572, über Blunt-end-Ligierung zum Herstellen zweier Cosmide, pYUB854 und pYUB855, die sich durch die Orientierung des ΔlysA4::res-hpt-res hinsichtlich des BamH1-Bereichs in dem Cosmid unterscheiden.
Konstruktion von spezialisierten transduzierenden Mycobacteriophagen: Es wurden Concatemere von phAE87 über Selbstligation von gereinigter Phagen-DNA hergestellt, welche anschließend mit PacI verdaut wurde. Zum Generieren der spezialisierten transduzierenden Phagen phAE128 und phAE134 wurden die PacI verdauten Cosmide pYUB586 und pYUB597 zum Ersetzen des pYUB328-Cosmids in phAE87 in einer in-vitro λ-Packungsreaktion (GIGAPackII, Stratagene) verwendet. Nach dem Transduzieren von E.coli HB101 und Plattieren der Transduktanten auf Selektionsmedium, enthaltend Kanamycin, wurde Phasmid DNA durch Vereinigen der gegen Antibiotikaresistenz-Transduktantenausgehend hergestellt und in M.smegmatis mc²155 elektroporiert. In ähnlicher Weise wurden die transduzierenden Phagen phAE143 und phAE144 unter Verwendung der durch PacI verdauten Cosmide pYUB854 und pYUB855 konstruiert. Alle transduzierenden Phagen wurden von Plaque gereinigt und auf den temperatursensitiven Phänotyp hin getestet. Die Gegenwart des homologen DNA-Substrats in den rekombinanten Phagen wurde über Southern-Blot-Analyse bestätigt. Die von Plaque gereinigten Phagen wurden auf einen höheren Titer an M.smegmatis mc²155 bei 30°C vermehrt.
Transduktionsprotokoll: M.smegmatis mc²155 wurde in LBT zu einem OD bei A₆₀₀ von 1,0 (6 × 10⁸ cfu/ml) aufgezogen. M.bovis BCG-Stämme wurden in M-ADS-TW zu einem OD bei A₆₀₀ (0,8–1,0) aufgezogen. 10 Milliliter der Kultur wurde zentrifugiert und resuspendiert in 10 ml Waschmedium (7H9-ADS-10% Glycerol) und als stehende Kulturen bei 37°C für mindestens 24 Stunden inkubiert. Diese Inkubierung ist notwendig, um Spuren des Tween-80-Detergenzes, das Phagen-Infektion verhindern kann, zu entfernen. Nach dieser Inkubationszeit wurden die Zellen nochmals gewaschen und in 1,0 ml auf 37°C vorgewärmtem Absorptionsmedium (7H9-ADS-5% Glycerol) resuspendiert und mit spezialisiertem, transduzierendem Phagen bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 gemischt. Das Phagen-Zellgemisch wird bei der nicht-permissiven Temperatur (37°C) 30 Minuten lang (M.smegmatis) oder 3 Stunden lang (BCG) inkubiert, wonach das Gemisch in 50 ml LBT (M.smegmatis) oder M-ADS-TW (BCG-Stämme) vorgewärmt auf 37°C inokuliert wird. Die Protuberanz der Kulturen wird 30 Minuten lang (M.smegmatis) oder 24 Stunden lang (BCG) bei 37°C durchgeführt. Die Zellen werden über Zentrifugierung pelletiert, in PBS-TW (0,5% Tween-80 in phosphatgepufferter Salzlösung) resuspendiert und auf M-ADS-TW, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin und 80 μg/ml der jeweiligen L-Aminosäure (L-Lysin oder L-Leucin) plattiert. Auxotrophe Analyse wurde über Plattierungen der Transduktanten auf kompletten und minimalem Medium durchgeführt. Die Transduktionsfrequenzen werden berechnet über Teilen der Anzahl der erhaltenen Hyg^R- oder Kan^R-Kolonien minus der Anzahl der spontanen Medikamenten-resistenten Kolonien der Kontrollzellen, die keinen Phagen erhalten, durch die Gesamtanzahl der wachstumsfähigen Zellen. Die Anzahl der allelischen Austausche wurde berechnet als Prozentsatz der Auxotrophen in der Population der Kan^R-Transduktanten.
PCR-Analyse und Southern-Blotting: PCR-Amplifikation wurde über AmpliTaq-Polymerase (Perkin-Elmer) unter Standardbedingungen durchgeführt. Die Primerkonzentrationen und die Zykluskonditionen wurden gemäß der Größe des amplifizierten Produkts eingestellt. Long range invertierte PCR wurde durchgeführt unter Verwendung einer Heiß-Starttechnik mit rTth-Polymerase unter Verwendung von PCR XL-Kit (Perkin-Elmer). Alle PCR-Reaktionen wurden in einem Perkin-Elmer 9600 thermalen Durchläufer durchgeführt. Die folgenden diagnostischen Primer wurden zur Analyse der auxotrophen Stämme eingesetzt:Pv21 (5'GAATTCCACTGACGCAGCTC-3') und Pv22 (5'-GCCGACCATGTTGTAACGAC-3') für lysA; PleuCD1 (5'-GG AAGGCCGGATGACGATCT-3') und PleuCD2 (5'-TCTTGAAC GGCAGCACCACT-3') für leuCD. Southern-Blotting wurde über das alkalische Denaturingsverfahren durchgeführt. DNA wurde auf HyBond-N+ Membran (Amersham) über das Kapillarverfahren transferiert. Hybridisierung und Detektion wurden, wie vom Hersteller empfohlen, mit einem Chemilumineszens-Detektionssystem (ECL, Amersham) unter hochstringenten Bedingungen für die Prä-Hybridisierung und die Hybridisierung (0,1 M NaCl und 42°C) durchgeführt. Gewaschen wurde bei 42°C mit primären Waschpuffern, enthaltend 6 M Harnstoff und 0,1 × SSC (1 × SSC ist 0,15 M NaCl plus 0,015 M Natriumcitrat).
B) Experimentelle Ergebnisse
Spezialisierte Transduktionsmethodik: Konditionale replizierende Mycobakteriophagen haben sich als hocheffizientes System zur Generierung großer Bibliotheken unabhängiger Transposonmutanten in M.tuberculosis und BCG erwiesen, da sie die Mittel bereitstellen, die Transposonkonstrukte nahezu in jede Zelle in der Bakterienpopulation (3) einzubringen. Die Erfinder schlussfolgerten, dass dieses System zur Generierung spezialisierter transduzierender Mycobacteriophagen modifiziert werden kann, die DNA-Substrate für den allelischen Austausch (1) liefern können. PhAE87 wurde als Phagen-Vektor eingesetzt, ein temperatursensitiver TM4-Phage, der einen großen Bereich an Mycobakterienzellen infiziert. Er repliziert und bildet klare Platten bei 30°C in M.smegmatis, aber tötet die Zellen nicht bei 37°C (3, 6). Das durch PacI exzidierbare Cosmid pYUB328 in diesem Shuttle-Phasmid kann in E.coli leicht durch Cosmide ersetzt werden, die mycobakerielle chromosomale DNA-Fragemente enthalten, die als Substrate für die Gendisruption gebildet wurden. Lysate mit hohem Titer an transduzierenden Phagen können anschließend in M.smegmatis hergestellt werden und zum Infizieren der erhaltenen Zellen eingesetzt werden.
Konstruktion von lysA auxotrophen Mutanten von M.smegmatis über spezialisierte Transduktion: Die Erfinder entschlossen sich, zunächst die vorliegende Erfindung bei dem schnell wachsenden Mycobakterium M.smegmatis mc²155 zu testen, einem Ersatzwirt für die Analyse von Genen von pathogenen Mycobakterien. Dies ermöglicht üblicherweise das Ausgestalten einer nützlichen Methodik für die Stammkonstruktionen bei diesem sehr nützlichen genetischen Hintergrund. Das Plasmid pYUB619 (21) wurde mit NotI und BamHI verdaut und das hierbei erhaltene 4552 bp-Fragment, dass das ΔlysA4::res-hyg-res-Gen enthält, wurde gereinigt und in das pYUB572-Cosmid kloniert, wobei das Cosmid pYUB854 erhalten wurde. Die Erfinder erzeugten zwei Arten spezialisierter transduzierender Phagen – phAE143 mit ΔlysA4::res-hyg-res in der gleichen transkriptionalen Orientierung mit der Phagen-Transkription (8) und pHAE144 mit der ΔlysA4-Allele in der entgegengesetzten Orientierung. M.smegmatis-Zellen wurden mit den transduzierenden Phagen bei einem MOI von 10 15 Minuten lang adsorbiert und die Phagen-Zellgemische wurden auf komplettem Medium, enthaltend Hygromycin sofort oder nach einer Protuberanzzeit 2 Stunden lang bei 37°C in Gegenwart des Phagen plattiert (Tabelle 3). Wie in Tabelle 3 gezeigt, wurde die vergleichbare Anzahl von Hyg^R-Kolonien für beide Inkubationszeiten erhalten. Die beobachteten Transduktionsfrequenzen waren in dem Bereich von 10^–6 für die Phagen-infizierten Zellen, während die Frequenzen der Hyg^R-Kolonien der uninfizierten Zellen routinemäßig weniger als 10^–8 waren. Zellsuspensionen, die mit phAE143 infiziert waren und das Hygromycin-Gen in der gleichen Orientierung wie das Hauptphagen-Transkript enthalten, verursachten einen Zellrasen auf dem Hygromycin-Medium mit großen Kolonien auf dem Rasen. Dies wurde nicht beobachtet mit dem Phasmid phAE144, das das Hygromycin-Gen in entgegengesetzter transkriptionaler Orientierung aufweist. Man geht davon aus, dass das transkriptionale Durchlesen des Phasmids in das Hycromycin-Gen stark genug war, das Erscheinen von abortiven Transduktanten auf dem Selektionsmedium in dem phAE143-Experiment zu begünstigen. Als echte Hyg^R-Transduktanten auf Auxotrophie gescreent wurden, war ein überraschend großer Prozentsatz (90% bis 95%) der Transduktanten Lysinauxotrophe. Southern Analysis bestätig te den allelischen Austausch des ΔlysA4::res-hyg-res-Allels mit dem Wildtyp lysA-Allel (2).
Konstruktion von lysA-auxotrophen Mutanten von drei unterschiedlichen BCG-Stämmen über spezialisierte Transduktion: Zum Testen, ob die konditionalen replizierenden Mycobakteriophagen als spezialisierte transduzierende Phagen in langsam wachsenden Mycobakterien verwendet werden können, haben die Erfinder Lysin-Auxotrophe in BCG generiert unter Verwendung eines aph-markierten Deletionsallels des lysA-Gens (ΔlysA5::res-aph-res). Ein Raster für Lysinauxotrophie würde es einem ermöglichen, leicht allelische Austauschereignisse von spontanen Kan^R-Mutanten oder illegitimen Rekombinationsereignissen zu unterscheiden. Darüber hinaus würde dieses System erlauben, die Fähigkeit von spezialisierten transduzierenden Phagen zum Aufbau von Mutationen in verschiedenen variierenden Umfeldern zu testen, da die BCG-Unterstämme verwandte, aber genetisch verschiedene Varianten darstellen. Ein DNA-Fragment, enthaltend das M.tuberculosis ΔlysA4::res-aph-res-Allel an jeder Seite flankiert durch nahezu 1 kb DNA in dem Cosmid pYUB598, wurde aufgebaut zu dem konditionalen replizierenden Phagen phAE87. Hohe Titer des dabei entstehenden Phagens phAE128 wurden unter Verwendung von M.smegmatis generiert. Drei unterschiedliche Stämme von BCG, Pasteur, Kopenhagen und Moreau wurden infiziert mit phAE128 mit einem MOI von 10. Da die Zeit, die für eine optimale Rekombination benötigt wird, unbekannt war, wurden Zell Phagen-Gemische bei 37°C unterschiedliche Zeitintervalle lang inkubiert, bevor auf einem kompletten Medium, das Kanamycin enthält, plattiert wurde (Tabelle 4). Kan^R-Kolonien wurden bei Frequenzen von etwa 10^–6 von Input-Zellen für ale drei BCG-Stämme bei allen drei Inkubationszeiten erhalten. Zelltiter, die zu Beginn der Infektion und 24 h später gemessen wurden, zeigten keine eindeutige Veränderung bezüglich der Zellzahlen (Datensätze nicht gezeigt). Zum Test auf allelische Austauschereignisse wurden die Kan^R-Transduktanten auf Ly sin-Auxotrophie untersucht (3, Abbildung A). Während die Anzahl der Kan^R-Kolonien nicht deutlich während der veränderten Inkubationszeiten anstieg, wurde ein leichter Anstieg bei der Prozentzahl der Lysin-Auxotrophe bei allen drei BCG-Stämmen beobachtet. Der größte Prozentsatz an Auxotrophen wurde in BCG-Pasteur und BCG-Kopenhagen nach 24 h Protuberanzzeit (34% und 29% jeweils) beobachtet, wo die Anzahl der Auxotrophe sich nahezu verdreifacht hat. Obwohl unerwartet niedrige Häufigkeiten für den allelischen Austausch beobachtet wurden bei der Verwendung des BCG-Moreau-Stamms, wurde diese Tendenz des Ansteigens der Auxotrophe nach 24 h Protuberanzzeit (von 2% bis 6%) ebenfalls beobachtet. Zum Test, ob die Lysinauxotrophie durch einen allelischen Austausch des ΔlysA5::res-aph-res-Allels in die BCG-Chromosomen bewirkt wird, wurde eine PCR-Analyse des lysA-Locus durchgeführt. Für alle untersuchten Auxotrophe (> 10 für jeden Stamm) führte die PCR-Analyse lediglich zu einem Band von 2,4 kb, der erwarteten Größe für das ΔlysA5::res-aph-res-Allel. Im Unterschied dazu ergaben die Kan^R-prototrophen Kolonien ein einziges Band von 1,1 kb in Übereinstimmung mit der Größe der Wildtyp lysA⁺-Allele der Mutterstämme (vgl. 3, Abb. B für repräsentive Datensätze für BCG-Pasteur). Die PCR-Ergebnisse wurden durch Southern-Blot-Analyse (4, Abb. A) bestätigt. Für alle drei BCG-Stämme wiesen die Lysin-Auxotrophe ein einziges Hybridisierungsband von der gleichen Größe wie das ΔlysA5::res-aph-res-Allel auf. Im Unterschied dazu besaßen die Mutterstämme oder die Kan^R-prototrophen Stämme ein einzelnes Band, das dem Wildtyp lysA⁺-Allel entspricht.
Konstruktion von ΔleuCD-auxotrophen Mutanten von drei unterschiedlichen BCG-Stämmen über spezialisierte Transduktion: Zum Test der Allgemeingültigkeit der speziellen Transduktion als Verfahren zur insertionalen Inaktivierung verschiedener Gene in langsam wachsenden Mycobakterien haben die Erfinder einen spezialisierten transduzierenden Phagen, der ein ΔleuCD6::res-aph-res-Allele trägt, konstruiert. Dieses Allel wurde in das phAE87 insertiert zur Bildung des spezialisierten transduzierenden Phagen phAE134. Die BCG-Stämme Pasteur, Kopenhagen und Moreau wurden mit phAE134 wie oben beschrieben transduziert unter Verwendung von 24 h Protuberanzzeit. Die Untersuchung der Platten drei Wochen nach der Inkubation enthüllte die Gegenwart von sowohl großen als auch kleinen Kolonien. Keine der großen Kolonien jedes BCG-Stamms waren auxotrophe Mutanten. Die PCR-Analyse von 20 großen Klonen zeigte das Wildtyp leuCD-Allel (Datensätze nicht gezeigt). Nach weiterer zweiwöchiger Inkubation wuchsen die kleinen Kolonien an Größe und wurden anschließend auf Auxotrophie untersucht. Ein großer Prozentsatz der kleinen Kan^R-Kolonien jedes BCG-Unterstamms waren Leucin-Auxotrophe (Tabelle 5). Southern-Analysis bestätigte, dass die Leuxin-Auxotrophe von einem Allelaustausch des ΔleuCD6::res-aph-res-Allels mit dem Wildtyp leuCD-Allel (4, Abb. B) stammt.
C) Diskussion
Mit der Verfügbarkeit der Genomsequenz von M.tuberculosis wurde das komplette Gen-Set vorausgesagt. Während 40% der vorausgesagten Gene präzise Funktionen zugeschrieben worden sind, haben 44% Homologien nahegelegt und 16% besitzen keine bekannten Funktionen. Die Bestimmung der Funktion eines individuellen Gens erfordert den Vergleich der Phänotypen der isogenen Stämme, die genetisch identisch sind mit Ausnahme des betreffenden Gens. Während effiziente Transposonmutagenese-Systeme für M.tuberculosis entwickelt worden sind, verbleibt der Genaustausch bei langsam wachsenden Mycobakterien ein schwieriger und/oder zeitlich ineffizienter Prozess, insbesondere bei M.tuberculosis und M.bovis. Entsprechend beschreiben die Erfinder hier ein einstufiges, zeitsparendes System zum Bewirken von Genaustauschen in Mycobakterien unter Verwendung von spezialisierten transduzierenden Phagen. Transduktion, ein natürliches System für den Austausch genetischer Information unter Verwen dung von Phagen-vermitteltem Gentransfer wurde zum ersten mal als überraschendes Ergebnis der folgenden Versuche zur Beobachtung der Konjugation in Salmonella (36) beschrieben. Im Gegensatz zu der Konjugation bei E.coli wurde gefunden, dass genetisches Material über einen Nuklease-resistenten Mechanismus, der keinen Kontakt zwischen den Zellen benötigt, transferiert werden konnte. Bei der Beobachtung, dass Gentransfer „Mittel" Filter passieren und durch Antikörper zu Phage P22 inhibitiert werden, schlossen Zinder und Lederberg, dass ein neues Phagenvermitteltes Gentransfer-System entdeckt worden ist, das als Transduktion bezeichnet wurde (36). Auf ähnliche Weise entdeckte Lenox, dass der Phage P1 den Gentransfer zwischen E.coli-Stämmen für eine große Vielzahl von Genen vermitteln kann (15). Spätere Studien enthüllten, dass Bakteriophagen-Lambda-Lysate, die von Lysogenen induziert worden sind, den Transfer von zwei Genmarkern, gal und bio vermitteln können, die zufälligerweise benachbart zu der Lambda-Bindungsstelle attB (18) sind. Dieser Transfer wurde spezialisierte Transduktion genannt, weil er auf wenige Gene beschränkt war, im Unterschied zu der allgemeinen Transduktion von P22 und P1, die eine große Anzahl genetischer Marker transferieren können. Die Basis für den spezialisierten Transfer ist eine abweichende Excision des lysogenen Phagens im Unterschied zu einem zufälligen „headfull"-Packen von chromosomaler DNA über allgemein transduzierende Phagen. Der Ausdruck „spezialisierte Transduktion" bezieht sich demnach auf den Transfer des genetischen Materials mit einem hybriden Phagen-Molekül, das teils Phage ist und teils chromosomale DNA. Im Unterschied dazu wird die allgemeine Transduktion vermittelt über eine Subpopulation von Phagen in einem Lysat, das zur Gänze chromosomale DNA (35) enthält. Spezialisierte transduzierende Phagen können ein spezifisches Gen-Set in ein individuelles Lysat transduzieren, während allgemein transduzierende Phagen eine Vielzahl von Genen innerhalb eines einzelnen Lysats transferieren können.
Konditionell replizierende Mycobacteriophagen haben sich als hocheffizientes genetisches System für die Erzeugung großer Bibliotheken unabhängiger Transposonmutanten sowohl in BCG als auch in M.tuberculosis erwiesen, da sie die Mittel zum Liefern von Transposonkonstrukten in nahezu jede Zelle in der bakteriellen Population bereitstellen (12) (10) (3) (19). Die Erfinder haben dieses System modifiziert und spezialisierte transduzierende Mycobacteriophagen generiert, die dazu fähig sind homologe DNA-Substrate für allelische Austausche bereitzustellen. Demnach teilen diese Phagen einige der Eigenschaften der spezialisierten und generalisierten transduzierenden Phagen. Sie ähneln den spezialisierten transduzierenden Phagen dadurch, dass sie lediglich einen kleinen, nicht essentiellen Teil des Phagen-Genoms ersetzt durch chromosomale DNA aufweisen, während der allelische Austausch, den sie über homologe Rekombination via Doppelkreuzung begünstigen, mehr den P1 oder P22 allgemein transduzierenden Phagen ähnelt. Einer der großen Vorteile der spezialisierten transduzierenden Mycobacteriophagen, die in dieser Studie verwendet werden, ist die Gegenwart von natürlichen Gegenselektionsmechanismen zur Integrierung des gesamten Phagens oder Teile von ihm in das Wirtschromosom über eine einzige kreuzweise oder illegitime Rekombination, da wenn eine solche Integration vorkommt, ist die Expression von Phagen-Genen als Teil des Chromosoms schädlich für die Wirtszelle. In zahlreichen Hybridisierungsexperimenten unter Verwendung von Phagen-DNA-Sequenzen als Probe waren die Erfinder niemals dazu fähig, eine Phagen-Integration in das Hist-Chromosom der auxotrophen Stämme aufzufinden (Datensätze nicht gezeigt). Die Erfinder haben die Reproduzierbarkeit und die Nützlichkeit der spezialisierten Transduktion für das Liefern von homologen DNA-Substraten für allelische Austausche von markierten Mutationen sowohl in schnell als auch in langsam wachsenden Mycobakterien demonstriert. Unter Verwendung der M.tuberculosis-Sequenzdatenbank (7) wurden ΔlysA5::res-aph-res-mutierende Deletionsallele generiert, welche, wenn sie über Transduktion in drei unterschiedliche Substämme von BCG eingebracht wurden, Lysin-Auxotrophe mit einer Häufigkeit generierten, die die Häufigkeiten, die erhalten werden, wenn ein „Selbstmord"-Plasmid-Ansatz oder lange lineare DNA-Substrate verwendet werden, deutlich übersteigt. Dieser Unterschied könnte mit der sehr hohen Effizienz der Übertragung des Rekombinationssubstrats in die Wirtszelle im Vergleich mit der Transformationseffizienz über Elektroporation erklärt werden. Wenn die speziellen transduzierenden Phagen in einer geeigneten Infektionsmultiplizität verwendet werden, wird nahezu jede Zelle in der Bakterienpopulation über den rekombinanten Phagen infiziert. Solche Ergebnisse stehen in Einklang mit den Schlussfolgerungen, die von Pavelka et al. (21) gemacht wurden, nämlich dass die Häufigkeit der homologen Rekombination in den langsam wachsenden Mycobakterien sich nicht deutlich von denen unterscheidet, die bei den schnell wachsenden Mycobakterien beobachtet werden. Dennoch räumt die Tatsache, dass das gleiche Target-Gen verwendet wird, nicht die Bedenken aus, dass die lysA-Region des Chromosoms die homologe Rekombination besser zulässt.
Dieses neue Verfahren der spezialisierten Transduktion für Mycobakterien weist einige nützliche Merkmale auf. Zunächst kann das spezialisierte Transduktions-Phagen-System leicht auf jedes Gen-Set übertragen werden aufgrund der günstigen Klonierungseigenschaften der Shuttle-Phasmid-Eigenschaften des konditionalen replizierenden Mycobacteriophagen-Vektors. Sobald eine spezifisch mutiertes Allel in den Phagen eingebaut ist, ermöglicht der Phage das Einbringen des mutierten Allels in jeden BCG-Stamm oder BCG-Mutanten. Die Erfinder haben chromosomale DNA-Fragmente von mindestens 4 kb, die einige spezielle Gene enthielten, inkorporiert. Es wird davon ausgegangen, das die Klonierungskapazität des Phasmid-Vektors bis auf 8 kb expandiert werden kann über Generieren zusätzlicher Deletionen in nicht essentiellen Regionen des Phagen-Genoms. Diese Verbesserung des Systems würde es ermöglichen, Verknüpfungsanalysen zum charakterisieren spezifischer Punktmutationen in einem speziellen Gen, das einen verknüpften auswählbaren Marker neben sich aufweist, durchzuführen. Im Unterschied zu einem Plasmid-Transformationssystem ist die vorliegende Erfindung ein Einstufensystem zum Erhalt unabhängiger Allelaustausch e. Die Verwendung von Plasmid-Transformationssystemen macht es schwierig, unabhängige homologe Rekombinationsereignisse von Geschwistern zu unterscheiden. Letztlich sollte die vorliegende Erfindung sich als sehr nützlich für die Konstruktion und die Entwicklung von M.tuberculosis-basierten Impfstämmen erweisen mit zahlreichen definierten nicht revertiblen Mutationen.
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Claims

Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten, mutierenden, langsam wachsenden Mycobakteriums, umfassend (a) Infizieren eines langsam wachsenden Mycobakteriums mit einem konditionalen transduzierenden Phagen, umfassend einen konditionalen Mycobacteriophagen, der ein E.coli Bacteriophagen-Lambdacosmid enthält, das in eine nicht essentielle Region des Mycobacteriophagens eingebracht ist, wobei das Cosmid ein mutiertes DNA-Substrat enthält, welches homolog zu einer Wildtyp-Kernsäuresequenz eines langsam wachsenden Mycobakteriums ist; und (b) Kultivieren des infizierten langsam wachsenden Mycobakteriums unter Bedingungen, bei denen der konditionale transduzierende Phage nicht repliziert und das mutierte DNA-Substrat in das Chromosom des langsam wachsenden Mycobakteriums über homologe Rekombination eingebracht wird, wodurch das rekombinante, mutierende, langsam wachsende Mycobakterium gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Wildtyp-Nukleinsäuresequenz des langsam wachsenden Mycobakteriums ein Protein oder ein Polypeptid kodiert.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Protein oder Polypeptid ein Enzym ist, das wesentlich für den biosynthetischen Weg eines Baustoffs, einer strukturellen Komponente oder einer Aminosäure ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die Wildtyp-Nukleinsäuresequenz lysA oder leuCD kodiert.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das rekombinante, mutierende, langsam wachsende Mycobakterium auxotroph für Lysin oder Leucin ist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das langsam wachsende Mycobakterium ausgewählt ist aus M.tuberculosis, M.bovis-BCG und M.leprae.
Konditionaler transduzierender Phage, umfassend einen konditionalen Mycobacteriophagen, der ein E.coli Bacteriophagen-Lambdacosmid enthält, das in eine nicht essentielle Region des Mycobacteriophagens eingebracht ist, wobei dieses Cosmid ein mutiertes DNA-Substrat enthält, das homolog zu einer Wildtyp-Nukleinsäuresequenz eines langsam wachsenden Mycobakteriums ist.
Konditionaler transduzierender Phage nach Anspruch 7, worin die Wildtyp-Nukleinsäuresequenz ein Protein oder ein Polypeptid kodiert.
Konditionaler transduzierender Phage nach Anspruch 8, worin das Protein oder Polypeptid ein Enzym ist, das essentiell für den biosynthetischen Weg eines Baustoffs, einer strukturellen Komponente oder einer Aminosäure ist.
Konditionaler transduzierender Phage nach Anspruch 9, worin die Wildtyp-Nukleinsäure das lysA-Gen oder leuCD-Gene umfasst.