DD245444B5 - Verfahren zur Herstellung einer neuen Staphylokinase mit heterologen Produzenten - Google Patents

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Herstellung von gentechnisch konstruierten, rekombinanten Plasmiden, die ein Staphylokinase-Gen tragen, und deren Einführung in verschiedene heterologe bakterielle Wirte, die im Ergebnis dieser Manipulationen vorteilhaftzur Produktion der neuen Staphylokinase durch submerse Fermentation benutzt werden können.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit hauptsächlich in der mikrobiologisch-pharmazeutischen Forschung und Industrie.

Staphylokinase (SAK) ist ein Protein, das - in der Regel nach lysogener Konversion - von Staphylococcus-aureus-Stämmen gebildet und ins Kulturmedium ausgeschieden wird. Heterolog nennen wir erfindungsgemäß solche Staphylokinaseproduzierenden Bakterien, die nicht dem Genus Staphylococcus angehören und natürlicherweise die Fähigkeit, SAK zu produzieren, nicht besitzen, diese aber durch gezielte genetische Manipulation erwerben können.

Staphylokinase wandelt das fibrinolytisch inaktive Plasminogen des Blutplasmas zum Plasmin um, das durch begrenzte Proteolyse des Fibrinnetzwerkes Blutgerinnsel auflöst (Lack und Glainville, in: Methods in Enzymology XIX, 706-714[197O]). Das ist die bisher einzige bekannte Eigenschaft dieses bakteriell gebildeten Proteins.

Die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin wird auch von einer Reihe anderer Proteine bewirkt (Streptokinase, Urokinase, Gewebeplasminogenaktivator), die z.T. bereits in der klinische Medizin alsthrombolytische Therapeutika eingesetzt werden. Das mögliche Haupteinsatzgebiet von Staphylokinase liegt daher auch in der Humanmedizin, in gewissem Umfang aber auch in der Veterinärmedizin.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Staphylokinase (SAK) kann aus dem Kulturüberstand bestimmter Staphylococcus-aureus-Stämme gewonnen werden. SAK-produzierende Stämme sind in der Regel lysogen für temperente Bakteriophagen, deren Anwesenheit die Zelle zur Staphylokinase-Bildung befähigt (lysogene Konversion) (Winkler et al., J. gen. Microbiol. 39:321-333 [1965]).

Es ist in diesem Zusammenhang jedoch bekannt, daß S.-aureus-Stämme eine Reihe von extrazellulären Proteinen bilden, die wesentlich für die hohe Pathogenität und Virulenz dieser Bakterien verantwortlich sind (Rogolsky, Microbiol. Rev. 43: 320-360 H 979]). Diese Vielzahl toxischer Produkte und die damit verbundenen Probleme für Fermentationen im technischen Maßstab haben es bislang unmöglich gemacht, SAK in ausreichender Menge und Qualität zu gewinnen, um sie auf ihre Eignung als Therapeutikum hin untersuchen zu können.

Mittels Standardmethoden der Gentechnik (zusammengefaßt beispielsweise in Maniatis, Fritsch, Sambrook: Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) ist vor kurzem ein Gen für die Bildung von Staphylokinase aus der DNA des Staphylokokken-Phagen S0-C isoliert und auf dem Plasmid pBR322 in dem gramnegativen Bakterium Escherichia coli kloniert worden (Sakoet al., Mol. Gen. Genetics 190:271-277 [1983]). Die so konstruierten E.-coli-Stämme waren zur Bildung von Staphylokinase befähigt, wobei allerdings das gebildete SAK-Protein nicht oder nur in geringem Anteil in das umgebende Kulturmedium ausgeschieden wurde. Aufschluß oder osmotische Schockbehandlung der Zellen waren zur quantitativen Gewinnung der Staphylokinase nötig (Sakoet al., Mol. Gen. Genet. 190: 271-277(1983]; Sako, Eur. J. Biochem. 149: 557-563

Das in diesem Verfahren klonierte Staphylokinase-Gen ist einer Primärstrukturanalyse unterzogen worden. Die DNA-Sequenz dieses Genes aus S0-C und daraus abgeleitet die Aminosäuresequenz dieser Staphylokinase liegen vor (Sako u. Tsuchida, Nucleic Acids Research 11: 7679-7693 [1983]).

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, heterologe bakterielle Wirte nach Einführung eines zuvor isolierten Gens, das für eine neue Staphylokinase kodiert, zur Produktion dieses Proteins zu befähigen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gentechnisches Verfahren zur Isolierung und Klonierung eines Staphylokinase-Gens sowie zur anschließenden Herstellung von heterologen bakteriellen Wirten für die fermentative Produktion des Genprodukts zu entwickeln.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug wie folgt gelöst:

Aus der DNA von Staphylococcus-aureus-Phagen werden zunächst DNA-Fragmente isoliert, die das durch die Nukleotidsequenz gemäß Abb. 1 a charakterisierte Gen für eine neue Staphylokinase (SAK-Gen) enthalten. DNA-Fragmente dieser Charakterisierung werden dann auf einen E.-coll-Klonierungsvektor überführt und die hierbei resultierenden Abkömmlinge einem Screening auf SAK*-rekombinante Vektoren - im weiteren bezeichnet als SAK-Screening - unterworfen (Verfahrensschritt I).

Aus jeweils einem der in Verfahrensschritt I erhaltenen SAK^T-rekombinanten (Primär-)Vektoren werden im nächsten Schritt Fragmente mit funktionellem SAK-Gen entnommen und zwecks Erhalt von SAK⁺-rekombinanten Sekundärplasmiden auf jeweils einem Vektorplasmid, welches Komponente eines heterologen bakteriellen Wirts-Vektor-Systems ist, subkloniert, wobei die in diesem Schritt resultierenden Abkömmlinge wiederum einem SAK-Screening unterworfen werden (Verfahrensschritt II).

Jedes in den Verfahrensschritten I und Il erhaltene SAK⁺-rekombinante Plasmid wird anschließend in heterologe bakterielle Produzentenstämme transformiert (Verfahrensschritt III), und jeder in dieser Weise gentechnisch manipulierte heterologe bakterielle Produzentenstamm wird im letzten Schritt (Verfahrensschritt IV) für eine Submerskultivierung eingesetzt, um die durch die Aminosäuresequenz gemäß Abb. 1 b charakterisierte Staphylokinase zu gewinnen.

In weiterer Ausgestaltung dieses Grundzuges wird die Erfindungsaufgabe durch die nachstehenden experimentellen Teilschritte realisiert:

1. isolation der DNA des Gen-spendenden Phagen

Als Donor für das SAK-Gen gemäß Abb. 1 wird in Schritt I des Verfahrens ein temperenter Staphylococcus-aureus-Phage der serologischen Gruppe F, vorzugsweise ein Phage aus der Menge 0W46,0L80,0L55,042 D, eingesetzt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird als Gendonor der in obiger Menge letztgenannte Phage 042 D, ein bekannter Typisierungsphage, gewählt. Von diesem Bakteriophagen ist bekannt, daß er nach Lysogenisierung von empfindlichen S.-aureus-Stämmen diese zur Bildung von Staphylokinase konvertiert.

Zur Isolation seiner DNA wird der jeweils gewählten Gruppe F-Gendonor, so auch der vorzugsweise verwendete Phagen 042 D, auf einem empfindlichen Wirtsstamm der Art S.aureus, vorzugsweise auf dem Stamm S.aureusW57, mit der an sich bekannten Weichagarschichttechnik vermehrt und angereichert.

Nach Extraktion der Phagen, vorzugsweise der 042 D-Phagen, aus der Weichagarschicht liegt ein Phagenlysat mit einem Titer von wenigstens 10¹⁰pfu/ml vor. Zur Abtrennung von Zelltrümmern und zur weiteren Konzentrierung der Bakteriophagen wird das Lysat einem Zyklus von niedrig- und hochtourigen Zentrifugationen unterworfen. Aus dem konzentrierten Phagenlysat wird die potentiell SAK-Gen-tragende DNA durch Zugabe eines Detergenz freigesetzt und in an sich bekannter Weise mittels Phenol- und Chloroformextraktionen von Protein befreit. Abschließend wird die in dieser Weise vorbereitete Phagen-DNA einer Zentrifugation im EB-CsCI-Dichtegradienten unterworfen, so daß gereinigte und konzentrierte Phagen-DNA, vorzugsweise die 042 D, für die nachfolgenden experimentellen Schritte zur Verfügung steht.

2. Klonierung von potentiell SAK-Gen-tragenden DNA-Fragmenten in einem E.-coli-Klonierungsvektor (Teil des Verfahrensschrittes I)

Die gereinigte Staphylococcus-aureus (GruppeF)-Phagen-DNA, vorzugsweise die gereinigte 042 D-DNA, wird zunächst mit Enzymen behandelt, die DNA an spezifischen Erkennungsstellen spalten. Vorzugsweise werden für diesen Zweck Restriktionsenzyme und insbesondere die Restriktionsenzyme CIaI, Hpall oder EcoRI eingesetzt. Im Ergebnis dieser Behandlung wird die Phagen-DNA, vorzugsweise die 042 D-DNA, jeweils in eine charakteristische Anzahl von Fragmenten zerlegt, die in ihrer Größe zwischen 0,5 und etwa 10,0knp variieren.

Parallel zur Behandlung der potentiell SAK-Gen-tragenden Phagen-DNA wird der gewählte E.-coli-Klonierungsvektor in Vorbereitung auf die angestrebte Überführung mit einem Restriktionsenzym linearisiert, für welches auf dem Vektor ein singulärer Spaltort vorhanden ist und welches gleichzeitig solche Enden generiert, die mit denen der Fragmente der DNA des Spender-Phagen kompatibel sind.

Als E.-coH-Klonierungsvektor wird entweder ein E.-coli-Phagenvektor, vorzugsweise ein λ-Phage, oder ein E.-coli-Plasm idvektor bereitgestellt. Aus der Gesamtheit der E.-coli-Plasmidvektoren wird für den verfahrensgemäßen Zweck ein Vektor aus der Teilmenge der amplifizierbaren E.-coli-Plasmidvektoren gewählt, vorzugsweise ein amplifizierbarer E.-coli-Plasmidvektor, der

a) ein CoIEI-oder ein p15A-Replikationsorigin und

b) darüber hinaus wenigstens zwei Antibiotika-Resistenzmarker sowie in einem dieser Marker wenigstens einen singulären Restriktase-Spaltort

aufweist.

Ein gebräuchlicher Vektor mit CoIE 1 -Replikationsorigin, welcher diesen Kriterien entspricht, ist Plasmid pBR 322; ein Vektor mit ρ 15 A-Replikationsorigin, welcher diesen Kriterien entspricht, ist Plasmid pACYC184. Letzteres wird in einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens als E.-coH-Klonierungsvektor verwendet.

Ein amplifizierbarer E.-coli-Plasmidvektor voranstehender Kennzeichnung wird für die angestrebte Überführung mit einem Restriktionsenzym linearisiert, dessen singulärer Spaltort auf diesem Vektor so lokalisiert ist, daß eine Insertion von Fremd-DNA zur Inaktivierung eines seiner beiden Antibiotika-Resistenzmarker führt und welches gleichzeitig wiederum solche Enden generiert, die mit denen der Fragmente der DNA des Spender-Phagen kompatibel sind.

Bei Verwendung des E.-coli-Plasmidvektors pBR322 wird diese Linearisierung mit CIaI vorgenommen; bei Verwendung des E.-coli-Plasmidvektors pACYC 184, d. h. in der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens, wird zur Linearisierung EcoRI oder CIaI eingesetzt.

Derart linearisierte E.-coli-Klonierungsvektor-DNA, vorzugsweise derart linearisierte E.-coli-Plasmidvektor-DNA und insbesondere derart linearisierte pACYC 184-DNA, wird mit nach voranstehender Vorschrift vorbereiteter S.-aureus-Phagen-DNA, vorzugsweise mit fragmentierter 042 D-DNA, nunmehr so gemischt, daß letztere DNA-Fragmente im Überschuß vorliegen. Durch Zugabe des Enzyms DNA-Ligase, vorzugsweise T4-DNA-Ligase, werden die Phagen-DNA-Fragmente mit dem linearisierten E.-coli-Vektor, insbesondere mit dem linearisierten pACYC184-Vektorplasmid, in an sich bekannter Weise in zufälliger Weise zu rekombinanten Vektoren, vorzugsweise zu zirkulären DNA-Molekülen (rekombinanten Plasmiden), verknüpft.

Das hierbei erhaltene Gemisch rekombinanter E.-coli-Phagen bzw. rekombinanter E.-coli-Plasmide, insbesondere das hierbei erhaltene Gemisch rekombinanter pACYC184-Abkömmlinge, wird in der Folge benutzt, um in an sich bekannter Weise einen gramnegativen Wirtsstamm, vorzugsweise einen E.-coli-Stamm und insbesondere den Stamm E.-coli 294, zu infizieren bzw. zu transformieren. Die anfallenden Transformanten werden im nächsten Schritt einem Vorscreening unterworfen, mit dem die erfolgreiche Etablierung der rekombinanten Phagen bzw. Plasmide in dem jeweiligen Rezipientenstamm feststellbar ist. Um die Beschreibung der erfinderischen Lösung auch im weiteren hinreichend übersichtlich halten zu können, wird die anschließende Darlegung des Wesens der Erfindung in seiner weiteren Ausgestaltung von nun an nur noch eine Grundvariante des Verfahrens umfassen, nämlich jene, bei der die Primärklonierung von potentiell SAK-Gen-tragenden 042 D-Fragmenten in einem E.-coli-Plasmidvektor vorgenommen wurde. Dieser Grundvariante liegt das Konstruktionsschema gemäß Abb.2 zugrunde. Für die erfolgreiche Etablierung der Plasmide in dem jeweils gewählten E.-coli-Stamm (siehe oben) wird durch Zusatz eines Antibiotikums, vorzugsweise durch Zugabe von Tetrazyklin oder Chloramphenikol, zum Kulturmedium selektiert (Vorscreening). Testung der Plasmid-tragenden Transformantenkolonien auf Resistenz gegen das jeweilige andere Antibiotikum, d. h. entweder gegen Chloramphenikol oder gegen Tetrazyklin, erlaubt die Differenzierung zwischen Transformanten mit rekonstituiertem pACYC184-Plasmid (= resistent) oder solchen mit rekombinanten 042 D-DNA-tragenden Plasmiden (= sensitiv).

3. Nachweis von Transformatoren mit rekombinanten Plasmiden, die das Staphylokinase-Gen tragen

Diejenigen E.-coli-Transformanten, die aufgrund des Vorscreenings als solche mit rekombinanten Plasmiden identifiziert sind, werden nunmehr auf Indikatorplatten ausgestrichen, die neben Agar (oder Agarose) und Hefeextrakt Casein in Form von Magermilch sowie Humanplasminogen enthalten. Transformanten, die auf Grund ihrer rekombinanten Plasmide zur Staphylokinase-Bildung befähigt sind, bilden eine klare Lysezone, die durch die caseinolytische Aktivität des SAK-aktivierten Plasminogens hervorgerufen wird. Unspezifische oder auf Proteasen zurückzuführende Reaktionen werden aufgeschlossen durch paralleles Testen dergleichen Transformanten auf Indikatorplatten, denen kein Humanplasminogen zugesetzt worden ist. SAK-positive Transformanten (SAK⁺-Transformanten) bilden auf solchen Platten keine Lysehöfe. In diesem Assaysystem zeigt der zur Klonierung verwendete E.-coli-Stamm keine unspezifische background-Aktivität.

4. Charakterisierung der rekombinanten SAK-Plasmide

Aus mehreren Transformantenklonen, die Staphylokinase bilden, werden die Plasmide in an sich bekannter Weise in sogenannten rapidscreening-Verfahren in kleinen Mengen gewonnen und einer schnellen Analyse mit Restriktionsenzymen,

insbesondere mit CIaI, Hpall und EcoRI, unterworfen. Für die weiteren Arbeiten wird unter den rekombinanten Plasmiden das mit dem kleinsten SAK⁺-042 O-DNA-Insert ausgewählt. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pDB 3. Es trägt ein ca. 7,0 knp großes 042 D-Fragment, das durch Clal-Orte flankiert ist

5. Subklonierung des Staphylokinasegens in E.-coli-Plasmidvektoren

Die DNA des rekombinanten SAK-Plasmides pDB3 wird aus dem E.-coll-Stamm 294 (pDB3) in an sich bekannter Weise in größerer Menge präparativ isoliert und über Farbstoffdichtegradientenzentrifugation gereinigt. Zunächst wird die pDB3-Plasmid-DNA mit einer Reihe unterschiedlicher Restriktasen gespalten, deren Schnittpunkte vorzugsweise im 042 D-DNA-Insert durch vergleichende Analyse in an sich bekannter Weise kartiert werden. Unter den verwendeten Restriktionsenzymen wird ein Paar ausgewählt, vorzugsweise das Enzym-Paar EcoRI und EcoRV, mit dem das 042 D-Insert von pDB3 in zwei nahezu gleichgroße Subfragmente zerlegt wird. Verknüpfung jedes dieser EcoRI-EcoRV-Subfragmente mit einem gleichfalls mit EcoRI bzw. Pvull sowie EcoRV geschnittenen E.-coli-Vektorplasmid, vorzugsweise mit pACYC184 bzw. mit pBR322, durch die Behandlung des Vektor-Fragmentgemisches mit dem Enzym T4-DNA-Ligase führt zur Herstellung neuer rekombinanter Plasmide mit verkürztem 042D-lnsert. Diese Plasmide werden in an sich bekannter Weise benutzt, um einen E.-coli-Wirtsstamm, vorzugsweise den Stamm E.-coli294, zu transformieren. Die Selektion von Plasmid-tragenden Transformanten und die Erkennung von Transformanten mit rekombinanten Plasmiden, darunter solchen, die das SAK-Gen tragen, enthalten, erfolgt in der bereits beschriebenen Weise (vgl. Teilabschnitt 3).

Im Ergebnis der vorzugsweise ausgeführten Variante dieser Subklonierung I.Ordnung liegt ein SAK-bildender E.-coli-Stamm vor, insbesondere Stamm E.-coil 294 (pDB12), der ein rekombinantes pBR322-Derivat- im weiteren bezeichnet als Plasmid pDB 12 - mit einem ca. 2,5 knp großen 0 42 D-DNA-Insert trägt.

In der Folge wird nun pDB 12-DNA in an sich bekannter Weise in größerer Menge isoliert, gereinigt und hinsichtlich der Lage von Restriktionsspaltorten im (SAK⁺)-042 D-DNA-Insert charakterisiert. Zu den verwendeten Enzymen gehört insbesondere die Restriktase Rsal.

Rsal-Fragmente des Plasmides pDB 12 werden in der Folge in an sich bekannter Weise hergestellt und vorzugsweise solche Rsal-Fragmente, die ca. 1,0knp groß sind, isoliert. Diese Rsal-Fragmente, von denen eines aus dem 042 D-DNA-Insert des Plasmides pDB 12 stammt, werden in der bereits beschriebenen Weise mit einem E.-coli-Vektorplasmid, vorzugsweise mit zuvor separat mit der Restriktase EcoRV linearisiertem Plasmid pACYC184 oder pBR322, verknüpft (Subklonierung 2. Ordnung). Transformation eines E.-coli-Wirtsstammes, vorzugsweise des Stammes E.-coli 294, führt in der bereits beschriebenen Weise zur Gewinnung eines Transformantenklons, der aufgrund der Anwesenheit eines neuen rekombinanten Plasmides, bezeichnet als Plasmid pDB17, zur Bildung von Staphylokinase befähigt ist. Nach präparativer Isolation von Plasmid-DNA erfolgt die strukturelle Charakterisierung von pDB 17 in an sich bekannter Weise durch eine Kartierung der Lage von Restriktionsspaltorten für verschiedene Enzyme. Danach ist das Plasmid pDB 17 4,1 knp groß und trägt ein ca. 1,0 knp großes Stück des 042 D-DNA-Inserts mit der kompletten Information für die Bildung von Staphylokinase; gleichzeitig hat es eine ca. 1,25knp große Deletion erlitten, die das gesamte Strukturgen der Tetrazyklinresistenz des Ausgangsvektors pBR322 umfaßt (siehe auch Abb.3). β. DNA-Sequenzanalyse des 042 D-DNA-Inserts von pDB 17

Aus gereinigter pDB17-Plasmid-DNA werden in an sich bekannter Weise Fragmente in präparativer Menge herausgeschnitten und isoliert, die das gesamte (SAK⁺)-042 D-DNA-Insert oder den größten Teil davon enthalten, vorzugsweise solche Fragmente, die mit den Restriktionsenzymen Hpall oder Hinfl gewonnen werden können.

Teilabschnitte dieser 042 D-Fragmente aus pDB 17, die vorzugsweise mit solchen kleinschneidenden Restriktasen wie Taql, Sau ЗА, AIuI und Haelll erzeugt werden, bzw. fakultativ auch das komplette Hpall-Fragment (vgl. Abb. 4) werden in der Folge in an sich bekannter Weise mit der doppelsträngigen replikativen Form der E.-coli-Phagen M 13mp9 oder M 13mp18, die mit den Restriktasen Accl oder Hincll linearisiert worden sind, in zufälliger Weise unter Verwendung des Enzyms T4-DN A-Ligase verknüpft. Diese rekombinanten DNA-Moleküle werden dann in an sich bekannter Weise zur Transfektion eines geeigneten E.-coli-Wirtsstamms, vorzugsweise des Stammes E.-collTGI, benutzt. Phagenplaques, die von rekombinanten M 13mp-Phagen herrühren, können in der Folge in an sich bekannter Weise erkannt und zur Gewinnung von hochtitrigen Phagenpräparaten benutzt werden. Dieeinzelsträngige DNA der rekombinanten Phagen wird dann in an sich bekannter Weise isoliert und nach Anheftung eines bekannten DNA-Oligonukleotidprimers als Template für die Synthese eines Komplementärstranges eingesetzt. Der Zusatz von Didesoxynukleotidtriphosphaten zur Synthesereaktion führt zum statistisch verteilten Abbruch der Synthese des Komplementärstranges und erlaubt in an sich bekannter Weise die Ermittlung der DNA-Sequenz des 042D-lnserts der rekombinanten M 13-Phagen.

Computergestützte Auswertung der Einzelsequenzen von 042 D-DNA-Inserts individueller rekombinanter M13 mp-Phagenklone erlaubt weiterhin in an sich bekannter Weise das Zusammensetzen der Gesamt-DNA-Sequenz des 042 D-DNA-Inserts aus dem rekombinanten Plasmid pDB 17 und gestattet damit die Ermittlung der DNA-Sequenz der Staphylokinasegens des Phagen 042 D. Diese Sequenz ist in Abb. lain einer Form dargestellt, die auf bestmögliche Weise den Vergleich mit der DNA-Sequenz des S0-C-Stapnylokinasegens ermöglicht.

Bei dem Vergleich zeigt sich: Im Abschnitt von Position 1 bis Position 951 bestehen 11 Unterschiede (sind in der Sequenz gemäß Abb.1 a durch Unterstreichungen kenntlich gemacht) zwischen 042D- und S0-C-SAK-Gen, Diese Unterschiede betreffen entweder Einzelbasenpaar-Austausche oder Insertionen. Im Abschnitt ab Position 952 weicht die Sequenz des 042 D-Fragments völlig ab von der Sequenz des S0-C-Fragments.

In der kodierenden Sequenz des Gens für das Enzym Staphylokinase liegen 3 Positionsunterschiede vor (kein Unterschied ist übrigens in der Signalpeptid-Sequenz lokalisiert). Von diesen 3 Positionsunterschieden ist einer phänotypisch nicht exprimiert, d. h., er zieht keine Veränderung in der korrespondierenden Aminosäuresequenz nach sich (sog. schweigende Mutation). Die beiden anderen Positionsunterschiede in der für Staphylokinase kodierenden Sequenz ziehen hingegen je einen Aminosäuren-Austausch nach sich (ein konservativer Austausch; aber auch ein Austausch zwischen Aminosäuren mit deutlich unterschiedlichen Eigenschaften).

Unter Berücksichtigung des letztgenannten Sachverhalts ist das vom 042D-SAK-Gen kodierte Enzym somit als eine neue Staphylokinase einzuordnen.

7. Klonierung des SAK-Gens in grampositiven Bakterien

Für die beiden grampositiven Bakteriengattungen Streptococcus und Bacillus stehen neben anderen eine Familie von Plasmidklonierungsvektoren zur Verfügung, die als natürliche shuttle-Vektoren zur autonomen Replikation in Vertretern beider

Genera befähigt sind. Diese als pGB-Plasmide bezeichneten Vektoren tragen Erythromycin- und/oder Chloramphenikol-Resistenzgene, die die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen gestatten. Aus der pGB-Vektorfamilie wird für die verfahrensgemäße Subklonierung 3.Ordnung des SAK-Gens, d. h. für die Subklonierung dieses Gens in grampositiven Wirten, vorzugsweise das Plasmid pGB3631 ausgewählt, das einen kurzen Polylinker sowie ein Erythromycin-(MLS)-Resistenzgen trägt und ca. 6,1 knp groß ist. Dieses Plasmid wird in präparativer Menge gewonnen, gereinigt und nachfolgend mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI im Polylinkerbereich gespalten. Parallel dazu wird, ausgehend von dem verfahrensgemäß gewonnenen rekombinanten E.-coli-Plasmid pDB 12, ein SAK-Gen tragendes DNA-Fragment (ca. 2,5 knp) gewonnen, das ebenfalls von Spaltstellen für die Restriktasen BamHI und EcoRI flankiert ist. Die Verknüpfung dieses Fragmentesmit dem pGB3631-Vektor erfolgt in an sich bekannter Weise durch das Enzym T4-DNA-Ligase. Die so konstruierten rekombinanten Plasmide werden benutzt, um parallel geeignete Wirtsstämme der Gattung Streptococcus und Bacillus, vorzugsweise Stämme der Arten S. mflleri var. anginosus oder S. sanguis (so insbesondere Stamm S. sanguis Challis57) sowie B.megaterium oder B.subtilis (so insbesondere Stamm B.subtilis GB500), in an sich bekannter Weise zu transformieren. Streptococcus- und Bacillus-Zellen, die Erythromycin-Resistenz aufweisen und zur Bildung von SAK befähigt sind, tragen das gleiche neue rekombinante Plasmid, das die Bezeichnung pDB 15 erhielt (Größe ca. 8,9knp; siehe auch Abb.5). Sowohl für Streptococcus-wie auch für Bacillus-Zellen ist generell bekannt, daß die Proteine, die die genetische Information für die Proteinsekretion in Form einer Signalpeptidsequenz tragen, in das umgebende Kulturmedium ausscheiden. Der gleiche Sachverhalt konnte auch in der vorliegenden erfinderischen Lösung festgestellt werden: Die mit dem SAK⁺-rekombinanten Plasmid pDB 15 transformierten Streptococcus- und Bacillus-Stämme des Verfahrens sind zur Ausscheidung aktiver SAK in das Kulturmedium befähigt.

8. Identifizierung des mit heterogenen Wirten gewonnenen SAK-Genproduktes

Folgende Beweise zeigen eindeutig, daß die ausgeführten Klonierungsexperimente zur Isolation eines weiteren Staphylokinasegens geführt haben, welches in den heterologen Wirten so ausgeprägt wird, daß ein Protein mit charakteristischer Substrat- und Immunospezifität gebildet wird:

- Die caseino- sowie fibrinolytische Aktivität aller Primär- und Subklone ist abhängig von der Anwesenheit von Humanplasminogen.

- Im Immunodiffusionstest liefern sowohl Staphylokinase, die aus Kulturüberständen heterologer Wirte gewonnen wurde, wie auch authentische Staphylokinase aus S.-aureus-Stämmen identische Präzipitationslinien mit einem gegen authentische Staphylokinase produzierten Antiserum (Abb.6).

9. Synthese von Staphylokinase mit heterologen Wirten

Im Ergebnis der Realisierung der Grundvariante des vorliegenden Verfahrens zur Herstellung einer rekombinanten Staphylokinase liegt eine Gruppe gentechnisch manipulierter heterologer bakterieller Stämme vor, die nunmehr Staphylokinase zu bilden vermögen. Aus dieser Gruppe werden namentlich die Produzentenstämme E.-coli SK1590 (pDB3), E.-coli SK1590 (pDB 12), E.-coli SK1590 (pDB 17), E.-coli 294 (pDB 3), E.-coli 294 (pDB 12), E.-coli 294 (pDB 17), S.-sanguis Challis 57 (pDB 15) sowie B.subtilis GB500 (pDB 15) zur Synthese von Staphylokinase eingesetzt.

Jeder dieser Produzenten wird bei Temperaturen im Bereich von 25°C bis 4O⁰C, vorzugsweise im Bereich von 33⁰C bis 37,5⁰C, submers in einem Medium mit jeweils an sich bekannten Nährquellen bis zum Ende der logarithmischen Wachstumsphase kultiviert, und die gebildete neue rekombinante Staphylokinase wird durch an sich bekannte Aufarbeitungsschritte, so durch Konzentrierung des Kulturüberstandes und Zellaufschluß im Falle der E.-coli-Stämme, gewonnen (s. a. Abschnitt E des Ausführungsbeispiels).

Hinweise zur Hinterlegung von Mikroorganismen

Im Zusammenhang mit dem vorliegenden Verfahren zur Herstellung einer neuen Staphylokinase in heterologen Produzenten ist in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR - 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, je eine biologisch reine Kultur von

Registriernummer

- Staphylococcus aureus-Bakteriophagen 042 D-Lysat ZIMET11193

- Stamm Bacillus subtilis GSB 26 (pGB 3631) ZIMET11137

- Stamm E. coli 294 (pDB 17) ZIMET11136

- Stamm B. subtilis GB 500 ZIMET hinterlegt worden.

Vorteile der Erfindung

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die Gewinnung einer neuen Staphylokinase durch submerse Fermentation von Bakterienspezies möglich, die nicht zur Gattung Staphylococcus gehören und nicht wie diese eine Vielzahl von toxischen und antigenen Produkten bilden. Dabei ist es von besonderem Vorteil, daß grampositive Bakterien wie B.-subtilis oder S.-sanguis als Produzent eingesetzt werden können, da diese Bakterien aktive Staphylokinase in das umgebende Kulturmedium ausscheiden.

Dieser Umstand macht aufwendige undteure Aufschlußarbeiten, wie sie für die heterologen E.-coli-Wirte nötig sind, überflüssig und senkt den für die Reinigung der Staphylokinase notwendigen Aufwand erheblich.

Die von B. subtilis gebildeten Mengen an Staphylokinase liegen deutlich höher als die in anderen heterologen Wirten gefundenen Werte. B.subtilis ist in der Fermentationsindustrie ein weit genutzter Mikroorganismus, insbesondere zur Produktion von Massenenzymen, die u.a. in der Nahrungsmittelindustrie zum Einsatz kommen. B.-subtilis-Stämme gelten als pathogenetisch unbedenklich.

Das klonierte Staphylokinase-Gen und die Kenntnis seiner Primärstruktur schafft die Voraussetzung für gezielte molekulare Manipulationen zur Erhöhung der Produktausbeute der Produktionsstämme.

Schließlich sind die die Expression und Sekretion der Staphylokinase steuernden DNS-Strukturen in weiterführenden gentechnischen Verfahren für die Bildung anderer Proteine eukaryotischen oder prokaryotischen Ursprungs durch heterologe bakterielle Wirte einsetzbar.

Die folgenden Ausführungen sollen an einem Beispiel die einzelnen Schritte des Verfahrens näher veranschaulichen. Sie enthalten jedoch keine detaillierten Angaben zu standardisierten Einzelverfahren der Gentechnologie (wie Gewinnung von Plasmid-DNA, Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen, Einfügen von Genen in Vektorplasmide, Transformation von bakteriellen Rezipientenstämmen mit Plasmid-DNA und DNA-Sequenzanalyse). Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und sind in einer Reihe von Veröffentlichungen ausführlich beschrieben, etwa in:

- Methods in Enzymology, Band 65: Nucleic Acids (Teil 1), Academic Press, 1980;

- Methods in Enzymology, Band 68: Recombinant DNA, Academic Press, 1980;

- Methods in Enzymology, Band 100, Academic Press, 1983;

- „Molecular cloning, a laboratory manual" (T.Maniatis, E.R.Fritsch, J.Sambrook), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982;

- „Advanced bacterial genetics, a manual for genetic engineering" R. W. Davis, D. Botstein, J. R. Roth, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980.

A. Primärklonierung des Staphylokinasegens (SAK-Gen)

A.1. Gewinnung der Donor-DNA aus dem S.-aureus-Phagen 042 D

Um hochtitrige Lysate des Staphylococcus-areus-Phagen 042 D zu erhalten, wird eine Oberflächenanreicherung in folgender Weise vorgenommen: Ausgehend von einer Einzelkolonie des S.-aureus-Stammes W57 werden 5 ml Nährbouillon Il (NBII)

Pankreatisches Pepton (Fleisch, Gelatine, Kasein) 6,75 g/l

Eiweißhydrolysat 1,75 g/l

Hefeextrakt 1,50 g/l

NaCI 5,00 g/l

(12 Minuten bei 121⁰C sterilisiert; pH 7,2 ± 0,3)

angeimpft und für ca. 2 Stunden bei 37 ⁰C geschüttelt. Diese Kultur wird im folgenden zur Vermehrung des Phagen 042 D benutzt, indem zu 2 ml verflüssigtem und temperiertem Weichagar (NBII + 0,7% Agar) 0,5ml der W57-Kultur, 0,1 ml eines 042D-Lysats (ca. 10⁷pfu/ml) sowie 0,05ml einer sterilen 10OmM CaC^-Lösung hinzugegeben werden und dieser nach gründlichem Mischen zum Überschichten von Nähragar Il (NAH; NBII mit 1% Agar verfestigt) Grundschichten in Petrischalen (0100 mm) verwendet wird. Nach Inkubation der Platten über Nacht bei 30⁰C ist der Bakterienrasen in der Oberschicht konfluent lysiert. Auf jede Platte werden 2 ml NBII gegeben, anschließend wird die Weichagaroberschicht sorgfältig mit einem Spatel abgekratzt und durch mehrfaches Pipettieren nachfolgend homogenisiert. Die festen Agar-Bestandteile und die Bakterientrümmer werden durch Zentrifugation abgetrennt (15 Minuten, 6000rpm) und die dekantierten, phagenhaltigen Überstände vereinigt. Um sekundäres Bakterienwachstum zu unterdrücken, wird dem Lysat ca. 1 % bis 2% Chloroform zugesetzt.

DerTiter des Phagenlysats wird ebenfalls mittels derWeichagarschichttechnik bestimmt. Hierbei werden jedoch dem Weichagar nur 0,1 ml einer W57-Kultur und 0,1 ml einer geeigneten Verdünnung des Phagenlysats neben 0,05ml 10OmM CaCI₂ zugesetzt. Lysate mit einer 042 D-Konzentration von —10¹⁰pfu/ml sind für die weitere Aufarbeitung zur DNA-Gewinnung geeignet. Zur Phagen-DNA-Gewinnung wird das Lysat zunächst einer niedrigtourigen Zentrifugation (10 Minuten; 5 000 rpm bis 6000 rpm) unterworfen, um Zelltrümmer zu entfernen. Danach werden die Phagen durch hochtourige Zentrifugation (2 Stunden; 25000rpm; 4°C) sedimentiert. Das Phagenpellet wird in Vio des Ausgangsvolumens (3,5 ml) TE-Puffer (5OmM Tris-HCI; pH 7,5; 10ml EDTA) aufgenommen und mit 0,25ml einer 10%igen SDS-Lösung versetzt. Anschließend wird zweimal mit je 1 Volumen Phenol-Chloroform (2:1, puffergesättigt), einmal mit 1 Volumen Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) und einmal mit 1 Volumen Ether extrahiert. Die Phagen-DNA wird schließlich mit 2,5 Volumen Ethanol bei -7O⁰C ausgefällt und in 500μΙ 1OmM Tris-HCI (pH 7,5) wieder aufgenommen. Zur weiteren Reinigung wird die Phagen-DNA einer Zentrifugation im Farbstoff-Dichtegradienten unterworfen. Die gereinigte 042D-Phagen-DNA liegt schließlich gelöst in 1OmM Tris-HCI (pH 7,5) in einer Konzentration von ca. 1 mg/ml vor und wird bei 4⁰C oder gefroren bei -20⁰C aufbewahrt. A.2. Klonierung von 042 D-DNA-Fragmenten in einen E.-coli Plasmidvektor

Eine ausreichende Menge (5цд bis Юмд) gereinigter DNA des Phagen 042D wird getrennt mit den Restriktionsenzymen EcoRI, CIaI und Hpall in bekannter Weise in Fragmente (0,5knp bis 10knp) zerlegt, die einzelsträngige 5'-Enden haben. Parallel dazu wird DNA des E.-coli-Plasmidvektors pACYC184 entweder mit dem Enzym CIaI oder dem Enzym EcoRI linearisiert. 042 D-DNA-Fragmente, die mit Hpall oder CIaI hergestellt wurden, haben kompatible einzelsträngige Enden mit dem Clal-Iinearisierten pACYC184-Vektor (Analoges gilt für EcoRI). Nach Verknüpfung der 042 D-DNA-Fragmente mit pACYC 184 unter Verwendung des Enzyms T4-DNA-Ligase werden die so in vitro generierten rekombinanten Plasmide durch Standardmethoden der Transformation in den Rezipientenstamm Е.СОІІ294 eingeführt. Die Selektion auf Transformanten erfolgt durch den Zusatz von 25pg/ml Chloramphenikol (bzw. 10pg/ml Tetrazyklin), falls pACYC184-Plasmide mit Clal-Insert (bzw. mit EcoRI-lnsert) gesucht werden. A.3. Erkennen von Transformanten mit SAK-rekombinanten Plasmiden

Die Erkennung von Transformanten mit SAK-rekombinanten Plasmiden basiert auf dem Nachweis der Bildung von Staphylokinase. Dazu wird die Staphylokinase-Eigenschaft ausgenutzt, die Aktivierung von Humanplasinogen zum proteolytisch (und fibrinolytisch) aktiven Plasmin zu bewirken. Die Transformantenklone werden zwecks Prüfung einer möglichen Staphylokinasebildung auf Indikatorplatten überimpft, die folgende Zusammensetzung haben:

9ml einer 1%igen Agaroselösung in 5OmM Tris-HCI (pH 8,1) 15OmM NaCI werden bei 48°C temperiert, mit 1 ml steriler Magermilch, 0,1 ml einer Humanplasminogen-Lösung (1 mg/ml) sowie 0,2ml einer sterilen 5%igen Hefeextraktlösung versetzt und in Petrischalen (100mm 0) ausgegossen. Die zu testenden Transformanten werden auf diese Indikatorplatten überstochen und über Nacht bei 37⁰C inkubiert. Staphylokinasebildung ist an einem den Transformantenklon umgebenden, scharf umgrenzten Lysehof erkennbar. Um die Bildung einer unspezifischen Protease auszuschließen, werden die positiven Klone anschließend auf den gleichen Indikatorplatten, jedoch ohne Zusatz von Humanplasminogen, getestet. Staphylokinase selbst besitzt keine proteolytische Aktivität, so daß in Abwesenheit von Humanplasminogen zwischen Protease- und Staphylokinasebildung diskriminiert werden kann. Aus den Klonierungsexperimenten mit pACYC 184 als Vektor gingen insgesamt 11 SAK-bildende rekombinante Plasmide hervor, 7 davon entstanden durch Insertion von Clal-Fragmenten, 3 durch Insertion von Hpall-Fragmenten und einer durch Insertion von EcoRI-Fragmenten des Phagen 042 D.

A.4. Restriktionsanalyse der rekombinanten SAK-Plasmide

Aus den SAK-bildenden Transformantenklonen, die über Einzelkolonie-Isolierung gereinigt worden sind, wird Plasmid-DNA in bekannterWeise isoliert und einer Restriktionsanalyse unterworfen. Dabei finden im ersten Schritt die zur Klonierung verwendeten Enzyme Anwendung. Unter den rekombinanten Plasmiden wird das Plasmid pDB3 für die detailliertere Restriktionskartierung ausgewählt, da es das kleinste 042 D-DNΑ-Insert, ein ca. 7,0knp großes Clal-Fragment, enthielt. Dieses Fragment ist auch in allen anderen mit CIaI erhaltenen rekombinanten Plasmiden nachweisbar und trägt offensichtlich die SAK-kodierenden Sequenzen. Analyse gereinigter pDB3-Plasmid-DNA mit weiteren Restriktionsenzymen (EcoRI, EcoRV, BgIII, Hindlll, Accl) gestattet die Aufstellung einer Restriktionskarte des Plasmides pDB3 (vgl. Abb.2).

B. Subklonierung der SAK-kodierenden Sequenzen in E. coli

Die Subklonierung der SAK-kodierenden Sequenzen wird hier in dem Plasmidvektor pBR322 im Stamm E.coli294 vorgenommen. Als Donor-DNA wird die DNA des Primärklons pDB3 verwendet. Die Subklonierung erfolgt in zwei Schritten, die zu einer weitestgehenden Einengung des SAK-Gens führen und die Grundlage für die DNA-Sequenzanalyse des SAK-Gens bilden.

B.1. Konstruktion des Plasmides pDB12

Zirka 20цд der DNA des Plasmides pDB3 werden mit den Restriktasen EcoRI und EcoRV simultan gespalten und die Fragmente im Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Unter den dabei erhaltenen 5 Fragmenten befinden sich zwei jeweils etwa 2,5knp große, durch EcoRI und EcoRV-Orte flankierte Fragmente, die zusammen den größten Teil des 042 D-DNA-Inserts überspannen (siehe Abb.2). Unter Verwendung von fow-melting-Agarose werden diese Fragmente aus dem Agarosegel herausgeschnitten, gereinigt und für die Insertion in den Plasmidvektor pBR322 verwendet. Der Vektor wird zu diesem Zweck ebenfalls mit dem Enzympaar EcoRI/EcoRV behandelt, und das Einfügen der 042 D-Fragmente erfolgt nach Standardmethoden. Transformanten des Stammes E.coli294 werden durch Inkubation in Abwesenheit von 40pg/ml Ampicillin selektiert. Transformantenklone, die ein Plasmid mit 042 D-Insert tragen, sind erkennbar durch Testung aufTetrazyklinresistenz:lnsert-tragende Plasmide vermitteln nun keine Tetrazyklinresistenz mehr. Die Tetrazyklin-sensitiven Transformantenklone werden mit Hilfe des unter 1.3 beschriebenen Assays auf die Bildung von SAK getestet. Unter den SAK-bildenden Transformantenklonen werden einige für eine vorläufige Charakterisierung ihrer rekombinanten Plasmide ausgewählt. Darunter befindet sich das Plasmid pDB 12, das erwartungsgemäß ein 2,5 knp großes 042 D-Insert trägt, das von EcoRI- und EcoRV-sites flankiert ist.

Nach Standardmethoden gereinigte DNA des Plasmides pDB12 wird einer eingehenden Restriktionsanalyse unterzogen. Dazu werden die Restriktasen EcoRI, EcoRV, Hindlll, BgIII, Bstll, Accl und Rsal verwendet. Ein Teil der Restriktionskarte des Plasmides pDB12 ist aus Abb.2 ersichtlich

B.2. Konstruktion des Plasmides pDB 17

Die Restriktionsanalyse des Plasmides pDB 12 ergab die Lokalisation eines ca. 1 knp großen Rsal-Fragmentes im Bereich des in pDB 12 vorliegenden 042D-DNA-Inserts. Dieses Rsal-Fragment wird in präparativer Menge gewonnen, indem ca. 1(^g eines pDB 12 x Rsal-Fragmentgemisches elektrophoretisch im Agarosegel aufgetrennt und das gewünschte Fragment aus dem Gel durch Standardmethoden extrahiert wird. Dieses Rsal-Fragment aus dem 042 D-DNA-Insert von pDB 12 wird dann in vitro in den EcoRV-Ort des Plasmides pBR322 hineinligiert. Nach Transformation des Stammes E. coli294 werden Klone mit rekombinanten Plasmiden durch ihre Resistenz gegen Ampicillin und ihre Empfindlichkeit gegenüber Tetrazyklin identifiziert. Nachfolgende Testung der Transformantenklone auf Magermilch/Plasminogen-Agar-Platten erlaubt die Erkennung von SAK-bildenden Transformantenklonen. Auf die beschriebene Weise wird ein Transformantenklon gewonnen, der das Plasmid pDB 17 trägt. Die Struktur dieses Plasmides ist in Abb.3 dargestellt. Das Plasmid pDB 17 ist ca. 4,1 knp groß und trägt ein ca. 1,0 knp großes 042 D-DNA-Insert. Während des Klonierungsvorganges ist spontan eine Deletion entstanden, die aus dem pBR322-Vektor ein 1225np langes Fragment entfernt hat, das den gesamten Bereich des Tetrazyklinreststenzgens einschließt.

C. DNA-Sequenzanalyse des SAK-Gens

CA. Klonierung von Subfragmenten des SAK-Gens in M 13mp-Bakteriophagenvektoren Gereinigte DNA des SAK-rekombinanten Plasmides pDB 17 wird in präparativer Menge gewonnen. 10 bis 200g dieser pDB 17-DNA werden mit dem Restriktionsenzym Hpall komplett verdaut und die Fragmente auf einem 1%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Mit Hilfe von Iow-melting-Agarose wird in bekannter Weise unter den pDB 17-Hpall-Fragmenten ein ca. 1,1 knp großes Fragment ausgewählt und fein gewonnen. Dieses 1,1 knp Hpall-Fragment von pDB 17 schließt das gesamte 042 D-DNA-Insert von pDB17 ein und wird von wenigen Nukleotiden der pBR322-Vektor-DNA flankiert. Derart gereinigtes Hpall-SAK-Fragment von pDB 17 wird anschließend in getrennten Reaktionen (jeweils ca. 1 \ig DNA) mit dem Enzym Taql oder einem Gemisch aus den Enzymen AIuI + Haelll (BspRI) in weitere Subfragmente zerlegt, die in bekannter Weise mit der doppelsträngigen replikativen Form der E.-coli-Phagen Mi3mp9 oder M13mp18, die zuvor entweder mit dem Enzym Accl (Enden kompatibel mit Hpall und Taql) oder Hincll (Enden kompatibel mit AIuI und Haelll) linearisiert worden waren, verknüpft werden. Transfektion des E.-coli-Stammes TG1 gestattet dann in bekannter Weise das Erkennen von Phagenplaques, die von rekombinanten M 13-Phagen herrühren (weiße Plaques, im Vergleich zu den blauen Plaques, die von nativen Phagen verursacht werden). Eine Anzahl solcher rekombinanter Phagen wird von jedem Subklonierungsexperiment gewonnen und in an sich bekannter Weise zur DNA-Gewinnung vermehrt. Die einzelsträngige DNA der rekombinanten Phagen wird in der Folge zur DNA-Sequenzanalyse nach dem Kettenterminationsverfahren (Sanger-Technik) eingesetzt. C.2. DNA-Sequenzanalyse des SAK-Gens von 042 D

Die DNA-Sequenz der 042 D-DNA-Inserte der rekombinanten M 13-Bakteriophagen wird in der bekannten Weise nach der Sanger-Technikermittelt. Abbildung 4zeigt die Lokalisation und die Länge der ermittelten Teilsequenzen des 042D-lnserts von pDB 17. Alle DNA-Sequenzen werden mindestens in zwei unabhängigen Experimenten ermittelt, und der größte Teil der Sequenzen beider DNA-Stränge wird bestimmt, um die Fehlerquote so klein wie möglich zu halten. Die Gesamtsequenz des 042 D-DNA-Inserts von pDB 17 wird teilweise mit Hilfe eines Computers aus den Einzelsequenzen der M 13-Klone zusammengesetzt. Sie ist in Abb. 1 dargestellt. Computeranalyse der Sequenz erlaubt dann die einzig mögliche Positionierung eines Gens, das für ein Protein von der Größe der Staphylokinase kodiert, in der in Abb. 1 gezeigten Weise.

D. Subklonierung des SAK-Gens in grampositiven Bakterien

Um das SAK-Gen in grampositiven Bakterien zur Expression zu bringen, wird es auf ein Trägerplasmid überführt, das als natürlicher shuttle-Vektor sowohl in Streptococcus- wie auch in Bacillus-Stämmen replikationsfähig ist. Als Trägerplasmid wird

zu diesem Zweck der von einem natürlichen Streptokokkenplasmid abgeleitete Vektor pGB3631 (Größe ca. 6,1 knp, kodiert für Resistenz gegen MLS-Antibiotika, trägt einen Polylinker mit verschiedenen unikalen Restriktionsspaltorten, siehe Abb. 2) in präparativer Menge in bekannter Weise isoliert. Aus ebenfalls gereinigter pDB 12-DNA wird mit Hilfe der Restriktionsenzyme BamHI und EcoRI ein 2,5knp großes Fragment mittels präparativer Agarosegelelektrophorese gewonnen. Dieses Fragment überspannt das gesamte 042 D-DNA-Insert von pDB 12 und ein ca. 200 np langes Bruchstück des Tet^R-Genes aus pBR 322. Dieses isolierte BamHI-EcoRI-Fragment von pDB12 wird in pGB3631, das ebenfalls mit diesem Enzympaar gespalten wurde, in bekannter Weise eingefügt. Nach primärer Transformation von S.-sanguis Challis 57 mit dem rekombinanten Plasmid werden mit Hilfe des bereits ausgeführten Tests SAK-bildende Transformantenklone identifiziert. Diese Transformantenklone enthalten das Plasmid pDB15, dessen Struktur durch standardgemäße Restriktionskartierung ermittelt wird und die im Detail in Abb. 5 wiedergegeben ist.

Plasmid-DNA, die aus SAK-positiven Transformantenklonen gewonnen wurde, wird in der Folge zur Konstruktion weiterer grampositiver SAK-Produzentenstämme mittels bekannter Transformationsprozeduren verwendet: Auf diese Weise wird der Stamm Bacillus subtilis GB 500 (pDB 15) gewonnen, der zu Staphylokinasebildung und-Sekretion befähigt ist. E. Synthese von SAK in heterologen Wirten; Identifizierung des gewonnenen SAK-Genproduktes Nachstehend wird die SAK-Synthese durch die verfahrensgemäß erhaltenen Produzenten

- S.-sanguis Challis 57 (pDB 15),

- E.-coll294(pDB17)und

- B.-subtilitis GB500 (pDB 15) beschrieben.

E.1. Genexpression bei S.sanguis Challis 57 (pDB 15)

Der Produzentenstamm S.sanguis Challis 57 (pDB 15) wird bei 34⁰C in einem Hefeextraktnährboden (40 g/l Hefeextrakt plus 4g/l pankreatisches Caseinpepton) mit 1 % Glucose-Gehalt sowie mit 5μg/ml Erythromycin-Zusatz bei pH 7,2 unter Rühren und ohne Belüftung gezüchtet.

Zur Erzielung gesteigerter Staphylokinase-Ausbeuten wird der pH-Wert durch automatische Zugabe von 5M Natronlauge bei gleichzeitiger Zudosierung entsprechender Mengen 2,75 M steriler Glucose-Lösung konstant gehalten.

Die SAK-Bildung erfolgt in der logarithmischen Wachstumsphase. Es wurden ca. 1^g/ml Staphylokinase serologisch durch radiale Immundiffusion nach Mancini gefunden.

E.2. Genexpression bei E. coil294 (pDB 17)

Die Bildung von Staphylokinase konnte bei o.g. Produzentenstamm in Schüttelkolben (150ml Hefedialysat-Nährboden in 500-ml-Rundkolben) bei 37⁰C nur bis in die späte logarithmische Phase (5,5 Stunden) nachgewiesen werden. Spätere Proben besaßen keine SAK-Aktivität.

Nach Konzentrierung des Kulturüberstandes sowie nach Zellaufschluß wurden nur je 0,75цд Staphylokinase pro ml gefunden.

E.3. Genexpression bei B.subtilis GB 500 (pDB 15)

Der Produzentenstamm B. subtilis G B 500 (pDB15) wirdzu 150ml in 500-ml-Rundkolben bei 37°C in Schüttelkultur gezüchtet. Als Nährboden wird wahlweise Trypticase soy broth (30g/l), Todd-Hewittbroth (30g/l), Hefeextrakt dialysiert (40g/l) oder Caseinpepton (20g/l) mit Salz- und Glucosezusätzen gewählt, wobei der Kultur jeweils 5 цд/ті Erythromycin zugegeben werden.

Die SAK-Bildung erfolgt in der logarithmischen Wachstumsphase. Es wurden bis zu 20^g/ml Staphylokinase serologisch durch radiale Immundiffusion nach Mancini gefunden.

Claims (48)

1. Verfahren zur Herstellung einer neuen Staphylokinase mit heterologen Produzenten unter Anwendung von Teilen gentechnischer Standardmethoden der DNA-Rekombination, gekennzeichnet dadurch, daß man

- DNA-Fragmente, die das durch die Nukleotidsequenz gemäß Abb. 1 a charakterisierte Gen für eine Staphylokinase (SAK-Gen) enthalten, auf einen E.-coli-Klonierungsvektor überführt und die resultierenden Abkömmlinge einem Screening auf SAK⁺-rekombinante Vektoren (SAK-Screening) unterwirft (Verfahrensschritt I),

- aus jeweils einem der hierbei erhaltenen SAK⁺-rekombinanten Vektoren Fragmente mit funktionellem SAK-Gen entnimmt und diese zwecks Erhalt von SAK⁺-rekombinanten Sekundärplasmiden auf jeweils einem Vektorplasmid, welches Komponente eines heterologen bakteriellen Wirts-Vektor-Systems ist, subkloniert (Verfahrensschritt II),

- jedes in den Schritten I und Il erhaltene SAK⁺-rekombinante Plasmid in heterologe bakterielle Produzentenstämme transformiert (Verfahrensschritt III) und

- jeden solcherart gentechnisch manipulierten heterologen bakteriellen Produzentenstamm in Submerskultivierung zur Gewinnung der durch die Aminosäurensequenz gemäß Abb. 1 b gekennzeichneten Staphylokinase einsetzt (Verfahrensschritt IV).

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man in Verfahrensschritt I als Spender für das SAK-Gen gemäß Abb. 1 einen temperenten Staphylococcus-aureus-Phagen der serologischen Gruppe F auswählt und bei der Gewinnung der potentiell SAK-Gen-tragenden DNA-Fragmente von Phagenlysaten mit einem Titer von wenigstens 10¹⁰pfu/ml ausgeht.

3. Ordnung einen natürlichen shuttle-Vektor, der zur autonomen Replikation in den grampositiven Bakteriengattungen Streptococcus und Bacillus befähigt ist, bereitstellt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß man als Spender für das SAK-Gen gemäß Abb. 1 einen temperenten Phagen aus der Gruppe {0 W46,0 L80,0 L55,042 D} auswählt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß man als Spender für das SAK-Gen gemäß Abb. 1 den temperenten Phagen 042D auswählt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Gewinnung des SAK-Gens gemäß Abb. 1 die gereinigte DNA des temperenten S.-aureus (Gruppe F)-Phagen mit den Restriktionsenzymen CIaI, Hpall oder EcoRI spaltet und das so gewonnene Fragmentgemisch für die Überführung auf einen E.-coli-Klonierungsvektor bereitstellt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß man in Verfahrensschritt I als Klonierungsvektor einen E.-coli-Phagenvektor einsetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß man in Verfahrensschritt I als E.-coli-Phagenvektor einen λ-Phagen auswählt.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß man in Verfahrensschritt I als Klonierungsvektor einen E.-coli-Plasmidvektor einsetzt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, gekennzeichnet dadurch, daß man in Verfahrensschritt I als E.-coli-Plasmidvektor einen Vektor aus der Gruppe der amplifizierbaren E.-coli-Plasmidvektoren einsetzt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet dadurch, daß man als amplifizierbaren E.-coli-Plasmidvektor ein Plasmid mit CoIE 1-Replikationsorigin auswählt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, gekennzeichnet dadurch, daß man als amplifizierbaren E.-coli-Plasmidvektor ein solches Plasmid mit CoIE 1-Replikationsorigin auswählt, welches wenigstens zwei Antibiotika-Resistenzmarker sowie in einem dieser Marker wenigstens einen singulären Restriktase-Spaltort aufweist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, gekennzeichnet dadurch, daß man als amplifizierbaren E.-coli-Plasmidvektor das Plasmid pBR322 auswählt.

13. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet dadurch, daß man in Verfahrensschritt I als amplifizierbaren E.-coli-Plasmidvektor ein Plasmid mitp15A-Replikationsorigin auswählt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet dadurch, daß man als amplifizierbaren E.-coli-Plasmidvektor ein solches Plasmid mit p15A-Replikationsorigin auswählt, welches wenigstens zwei Antibiotika-Resistenzmarker sowie in einem dieser Marker wenigstens einen singulären Restriktase-Spaltort aufweist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, daß man als amplifizierbaren E.-coli-Plasmidvektor das Plasmid pACYC 184 auswählt.

16. Verfahren nach Anspruch 6 bis 10 und 13, gekennzeichnet dadurch, daß man den E.-coli-Klonierungsvektor für die Überführung gemäß Verfahrensschritt I mit einem Restriktionsenzym linearisiert, für welches

a) auf dem Vektor ein singulärer Spaltort vorhanden ist und welches gleichzeitig

b) solche Enden generiert, die mit denen der Fragmente der DNA des Spender-Phagen kompatibel sind.

17. Verfahren nach Anspruch 6,11,14 und 16, gekennzeichnet dadurch, daß man den amplifizierbaren E.-coli-Plasmidvektorfürdie Überführung gemäß Verfahrensschritt I mit einem Restriktionsenzym linearisiert,

a) dessen Spaltort auf diesem Vektor so lokalisiert ist, daß eine Insertion von Fremd-DNA zur Inaktivierung eines seiner beiden Antibiotika-Resistenzmarker führt und welches gleichzeitig

b) solche Enden generiert, die mit denen der Fragmente der DNA des Spender-Phagen kompatibel sind.

18. Verfahren nach Anspruch 12 und 17, gekennzeichnet dadurch, daß man den amplifizierbaren E.-coli-Plasmidvektor pBR322 für die Überführung gemäß Verfahrensschritt I mit CIaI linearisiert.

19. Verfahren nach Anspruch 15 und 17, gekennzeichnet dadurch, daß man den amplifizierbaren E.-coli-Plasmidvektor pACYC 184 für die Überführung gemäß Verfahrensschritt I mit EcoRI linearisiert.

20. Verfahren nach Anspruch 15 und 17, gekennzeichnet dadurch, daß man den amplifizierbaren E.-coli-Plasmidvektor pACYC 184 für die Überführung gemäß Verfahrensschritt I mit CIaI linearisiert.

21. Verfahren nach Anspruch 1,4,5 und 20, gekennzeichnet dadurch, daß man das im Verfahrensschritt I erhaltene und im anschließenden SAK-Screening als SAK⁺-rekombinant erkannte Plasmid pDB3 (Molekülgröße ca. 11,0knp) nach Ermittlung der Lage von Restriktionsspaltorten für die Subklonierungen gemäß Verfahrensschritt Il sowie für Verfahrensschritt III bereitstellt.

22. Verfahren nach Anspruch 1 und21,gekennzeichnetdadurch,daßmanfürdie Restriktionsanalyse des Plasmids pDB3 die Restriktionsenzyme EcoRI sowie EcoRV verwendet und die nach Einsatz dieser Enzyme gewonnenen 2 Subfragmente, die jeweils einen Teil des 042 D-Fragments von pDB3 enthalten, für die Subklonierungen gemäß Verfahrensschritt Il bereitstellt.

23. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man im Verfahrensschritt Il Subklonierungen 1., 2. und 3.Ordnung ausführt.

24. Verfahren nach Anspruch 1 und 23, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Subklonierung I.Ordnung ein E.-coli-Vektorplasmid bereitstellt.

25. Verfahren nach Anspruch 24, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Subklonierung 1. Ordnung den mit EcoRI sowie Pvull geschnittenen E.-coli-Vektor pACYC 184 bereitstellt.

26. Verfahren nach Anspruch 24, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Subklonierung 1. Ordnung den mit EcoRI sowie EcoRV geschnittenen E.-coli-Vektor pBR322 bereitstellt.

27. Verfahren nach Anspruch 1,22 und 26, gekennzeichnet dadurch, daß man das in einer Subklonierung 1. Ordnung innerhalb Verfahrensschritt Il erhaltene und im anschließenden SAK-Screening als SAK⁺-rekombinant erkannte Sekundärplasmid pDB 12 (Molekülgröße 6,8 knp) nach Ermittlung der Lage von Restriktionsspaltorten für Subklonierungen höherer Ordnung und für Verfahrensschritt III bereitstellt.

28. Verfahren nach Anspruch 1,23 und 27, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Restriktionsanalyse des Plasmids pDB 12 das Restriktionsenzym Rsal verwendet und die nach Einsatz dieses Enzyms gewonnenen Subfragmente von ca. 1,0 knp Größe, die einen Teil des 0 42 D-Fragments von pDB 12 enthalten, für die anschließenden Subklonierungen gemäß Verfahrensschritt Il bereitstellt.

29. Verfahren nach Anspruch 1 und 23, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Subklonierung 2. Ordnung ein E.-coli-Vektorplasmid bereitstellt.

30. Verfahren nach Anspruch 29, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Subklonierung 2. Ordnung den mit EcoRV (bzw. mit anderen glatten Enden generierenden Enzymen) linearisierten E.-coli-Vektor pACYC 184 bereitstellt.

31. Verfahren nach Anspruch 29, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Subklonierung 2. Ordnung den mit EcoRV linearisierten E.-coli-Vektor pBR322 bereitstellt.

32. Verfahren nach Anspruch 1,28 und 31, gekennzeichnet dadurch, daß man das in einer Subklonierung 2. Ordnung innerhalb Verfahrensschritt Il erhaltene und im anschließenden SAK-Screening als SAK⁺-rekombinant erkannte Sekundärplasmid pDB 17 (Molekülgröße 4,10knp) Verfahrensschritt III bereitstellt.

33. Verfahren nach Anspruch 1,23 und 27, gekennzeichnet dadurch, daß man dem E.-coli-Sekundärplasmid pDB 12 ein ca. 2,8knp großes BamHI-EcoRI-Subfragment, welches das von pDB 12 beherbergte 042 D-Fragment enthält, entnimmt und für die Subklonierung 3. Ordnung gemäß Verfahrensschritt Il bereitstellt.

34. Verfahren nach Anspruch 1 und 23, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Subklonierung

35. Verfahren nach Anspruch 34, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Subklonierung 3. Ordnung einen natürlichen shuttle-Vektor aus der pGB-Plasmidfamilie bereitstellt.

36. Verfahren nach Anspruch 35, gekennzeichnet dadurch, daß man für die Subklonierung 3. Ordnung den Polylinker-tragenden und mit BamHI (bzw. mitzu ihm kompatiblen Enzymen) sowie mit EcoRI gespaltenen shuttle-Vektor pGB3631 bereitstellt.

37. Verfahren nach Anspruch 1,33 und 36, gekennzeichnet dadurch, daß man das in der Subklonierung 3. Ordnung innerhalb Verfahrensschritt Il erhaltene und im anschließenden SAK-Screening als SAK⁺-rekombinant erkannte Sekundärplasmid pDB 15 (Molekülgröße 8,9knp) für Verfahrensschritt III bereitstellt.

38. Verfahren nach Anspruch 1,21,27 und 32, gekennzeichnet dadurch, daß man jedes der SAK⁺- rekombinanten Plasmide pDB3, pDB12 bzw. pDB 17 zur Transformation von E.-coli-Produzentenstämmen bereitstellt.

39. Verfahren nach Anspruch 1 und 38, gekennzeichnet dadurch, daß man jedes der SAK⁺- rekombinanten Plasmide pDB3, pDB 12 bzw. pDB 17 zur Transformation des Stammes E.-coli SK1590 bereitstellt.

40. Verfahren nach Anspruch 1 und 38, gekennzeichnet dadurch, daß man jedes der SAK⁺- rekombinanten Plasmide pDB3, pDB 12 bzw. pDB 17 zur Transformation des Stammes E.-coli294 bereitstellt.

41. Verfahren nach Anspruch 1 und 37, gekennzeichnet dadurch, daß man das SAK⁺-rekombinante Plasmid pDB 15 zur Transformation von Produzentenstämmen der Gattungen Streptococcus bzw. Bacillus bereitstellt.

42. Verfahren nach Anspruch 1 und 41, gekennzeichnet dadurch, daß man das Plasmid pDB 15 zur Transformation von Produzentenstämmen der Art Streptococcus milleri var. anginosus bereitstellt.

43. Verfahren nach Anspruch 1 und 41, gekennzeichnet dadurch, daß man das Plasmid pDB 15 zur Transformation von Produzentenstämmen der Art Streptococcus sanguis bereitstellt.

44. Verfahren nach Anspruch 43, gekennzeichnet dadurch, daß man das Plasmid pDB 15 zur Transformation des Stammes Str. sanguis Challis 57 bereitstellt.

45. Verfahren nach Anspruch 1 und 41, gekennzeichnet dadurch, daß man Plasmid pDB 15 zur Transformation von Produzentenstämmen der Art Bacillus megaterium bereitstellt.

46. Verfahren nach Anspruch 1 und 41, gekennzeichnet dadurch, daß man Plasmid pDB 15 zur Transformation von Produzentenstämmen der Art Bacillus subtilis bereitstellt.

47. Verfahren nach Anspruch 46, gekennzeichnet dadurch, daß man Plasmid pDB 15 zur Transformation des Stammes B.subtilis GB500 bereitstellt.

48. Verfahren nach Anspruch 1 und 38 bis 47, gekennzeichnet dadurch, daß man die gentechnisch manipulierten heterologen bakteriellen Produzenten bei Temperaturen von 25⁰C bis 40⁰C jeweils bis zum Ende der logarithmischen Wachstumsphase kultiviert und die gebildete neue Staphylokinase durch an sich bekannte Aufarbeitungsschritte gewinnt.