CH642396A5 - Verfahren zur herstellung von hybrid-bakterien. - Google Patents
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Description
Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Bakterien zu entwickeln, das einen guten Wirkungsgrad besitzt, so dass mit diesem Verfahren hohe Anteile an Hybrid-Bakterien produziert werden können. Durch die Bildung hoher Anteile an Hybrid-Bakterien sind die nachfolgenden Selektionierstufen und Auslesestufen wesentlich einfacher durchführbar als bei bisher bekannten Verfahren, wo nur geringe Anteile an Hybrid-Bakterien gebildet werden.
Überraschenderweise zeigte es sich, dass die angestrebten Ziele dadurch erreicht werden können, dass man aus einem besonders kleinen bakteriellen Plasmid und einem DNS-Fragment ein Hybrid-Plasmid herstellt und dieses mit dem Lysat eines Lambda- oder lambdoiden Phagen verpackt und anschliessend in ein Bakterium unter Bildung von Hybrid-Bakterien transduziert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Bakterien, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) aus einem bakteriellen Plasmid mit nicht mehr als 21 Megadalton und ein oder mehreren cos-Stellen eines Lambda- oder lambdoiden Phagen und einem DNS-Fragment ein Hybrid-Plasmid herstellt,
b) das gebildete Hybrid-Plasmid mit dem Lysat eines Lambda- oder lambdoiden Phagen verpackt und c) das Verpackungsprodukt in Escherichia coli unter Bildung von Hybrid-Bakterien transduziert.
Der Begriff des Plasmids ist von Collins in Current Top. Microbiol. Immunol., 78 (1977) 121-170, auf Seite 122 näher « erläutert; dort findet sich auch weitere Literatur. Die Herstellung von Plasmiden ist dem Fachmann geläufig; sie kann z.B. gemäss Clewell & Helinsky, Biochem., 9 (1970) 4428-4440 oder in analoger Weise vorgenommen werden. Zur Bestimmung der Plasmid-Grösse kann sich der Fachmann üblicher so analytischer Verfahren bedienen, z.B. der Gel-Elektrophorese; vergleiche z.B. Collins in Current Top. Microbiol. Immunol., 78 (1977) 121-170, Fig. 3 bis 5 auf Seiten 140 bis 142.
Unter einer cos-Stelle versteht man beim Phagen Lambda ss den Bereich, der die kohäsiven, zusammenhaftenden Enden aufweist.
Beim erfmdungsgemässen Verfahren werden nun Plasmide verwendet, in die dieser Bereich eingebaut worden ist, so dass auch diese Plasmide cos-Stellen aufweisen. Ohne cos-60 Stellen können Pasmide nicht verpackt werden. Zur Herstellung von Plasmiden mit cos-Stellen (sogenannten Cosmiden) kann man sich des von Collins, Fiil, Jorgensen & Friesen in Control of Ribosome Synthesis, Alfred Benson Symp. IX, Munksgaard S. 356-369, Verlag Maalae & Kjeldgaard, 65 Kopenhagen 1976, angegebenen Verfahrens oder analoger Verfahren bedienen; die cos-Stelle ist in der angeführten Arbeit in Fig. 3 mit m'm bezeichnet. Zur Ermittlung des Vorliegens und der Anzahl von cos-Stellen vergleiche man z.B.
3
642 396
Nichols & Donelson in J. Virology, 26 (1978) 429-434. Selbstverständlich lassen sich für das erfindungsgemässe Verfahren auch Cosmide verwenden, die sich von Cosmiden ableiten,
die nach dem bekannten Verfahren oder analogen Verfahren hergestellt wurden. 5
Zum Stand der Technik von Restriktionsenzymen vergleiche man z.B. Roberst in CRC Crit. Rev. Biochem., 4 (1976)
123-164. Die Anwendung von Restriktionsendonukleasen ist dem Fachmann geläufig, vergleiche z.B. Cohen, Chang,
Boyer & Helling, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 70 (1973) io
3240-3244 und Collins, Current Top. Microbiol. Immunol.,
78 (1977) 121-170, insbesondere Seite 124. Durch übliche analytische Methoden, z.B. durch Gel-Elektrophorese, lässt sich ermitteln, ob ein Plasmid ein oder mehrere Spaltstellen für ein bestimmtes Restriktionsenzym aufweist. So wird bei- is spielsweise bei einer Spaltstelle nur ein Spaltprodukt gebildet,
während bei zwei Spaltstellen zwei Fragmente anfallen.
Es hat sich gezeigt, dass sich einige Plasmide mit bestimmten Restriktionsenzymen überhaupt nicht spalten lassen. Um auch derartige Restriktionsenzyme beim erfindungs- 20 gemässen Verfahren einsetzen zu können, kann man folgen-dermassen vorgehen. Man kann ein Plasmid mit einem Restriktionsenzym spalten, das das Plasmid an einer Stelle auftrennt. Parallel dazu kann man aus einer Fremd-DNS ein DNS-Fragment herausschneiden, das an einer Stelle durch 25 ein anderes, das Plasmid nicht spaltendes Restriktionsenzym spaltbar ist. Danach kann man das Fremd-DNS-Fragment mit dem gespaltenen Plasmid kuppeln, wodurch man ein Hybrid-Plasmid erhält, das nun auch mit d&n anderen Restriktionsenzym an einer Stelle spaltbar ist. 30
Bei dem Fremd-DNS-Fragment, das man bei der vorstehend genannten Stufe b des erfindungsgemässen Verfahrens mit dem Plasmid kuppelt, handelt es sich um ein Fragment,
mit dem man dem herzustellenden Hybrid-Bakterium eine gewünschte Eigenschaft verleiht. 35
Bei der Kupplung in Gegenwart einer Ligase kann man z.B. gemäss Cohen, Chang, Boyer & Helling, Proc. Nati.
Acad. Sei. USA, 70 (1973) 3240-3244, oder nach analogen Verfahren arbeiten. Zur Herstellung von Hybrid-Plasmiden kommen auch sämtliche von Collins, Current Topics Micro- 40 biol. Immunol., 78 (1977) 121-170, auf Seite 126 zusammengestellten Methoden in Betracht.
Zur Herstellung des Phagenlysats kann man Phagen Lambda oder lambdoide Phagen, wie z.B. Phi 80, verwenden. Zur Herstellung des Phagenlysats, zum Verpacken und zur « Transduktion kann man gemäss Hohn & Murray, Proc. Nat.
Acad. Sei. USA, 74 (1977) 3259-3263, oder nach analogen Verfahren arbeiten.
Zur Bestimmung des Wirkungsgrades des erfindungsgemässen Verfahrens wird sich der Fachmann üblicher und ana- so lytischer Verfahren bedienen, um die hergestellten Hybrid-Bakterien zu ermitteln. Der Fachmann wird sich dabei an eine für die Selektion geeignete Eigenschaft der Hybrid-Bak-terien halten, z.B. an deren Resistenz gegen Antibiotika, wie z.B. Rifampicin oder Ampicillin, wobei es sich vorzugsweise um eine vom Plasmid kodierte Eigenschaft handelt.
Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich in vitro durchführen.
Der Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens gegenüber dem bekannten Transformationssystem besteht darin,
dass bei der Transduktion ein höherer Wirkungsgrad erreicht wird und dass sich grössere Fremd-DNS-Fragmente transdu-zieren lassen, z. B. einer Grösse von mehr als 2 Md, insbesondere 3 Md und mehr und vorzugsweise 5 Md und mehr,
wobei die Obergrenze durch das gewählte Verpackungs- und « Transduktionssystem vorgegeben wird. So kann beim erfin- imm434 dungsgemässen Verfahren die Hybridplasmid-DNS minde- Kpn I stens hundertmal besser in lebende Bakterien eingebracht leu*
werden, als es bei dem bekannten Transformationssystem der Fall ist; bei grösseren Hybridplasmiden verläuft das erfindungsgemässe Verfahren sogar mindestens tausendmal bis hunderttausendmal besser; vergleich Collins, loc. cit. 170. Dieser bessere Wirkungsgrad bei grossen Hybridplasmiden beruht auf der sehr starken Gegenselektion, die bei der Transformation grosser Moleküle eintritt.
Der besondere Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens gegenüber dem bekannten Verpackungs-Transduktions-System mit Lambda-Vektoren beruht auf der Kleinheit der Plasmid-Vektoren, die die Verpackung von grossen Fremd-DNS-Fragmenten ermöglicht.
Der beim erfindungsgemässen Verfahren erzielbare überraschend hohe Anteil an Hybridbakterien macht das weitere Arbeiten sehr viel einfacher, während die Selektionier- und Auslesestufen des bekannten Stands der Technik nachteilig aufwendig sind.
Vorteilhafterweise verwendet man ein Plasmid von nicht mehr als etwa 18 Megadalton. Bei derartigen Plasmiden wird das Plasmid selbst (im Unterschied zum Hybrid-Plasmid) wesentlich schlechter verpackt und transduziert, so dass es zu einer besonders starken Selektion zugunsten der Hybrid-Plas-mide kommt; vergleiche Collins & Brüning in Gene 4 (1978) 85-107.
Vorteilhafterweise verwendet man ein Plasmid mit nur einer cos-Stelle. Die Durchführbarkeit des erfindungsgemässen Verfahrens in dieser Ausführungsform ist überraschend, da DNS mit nur einer cos-Stelle als nicht verpackbar angesehen wird; vergleiche z.B. Hohn & Katsura in Current Top. Microbiol. Immunol., 78 (1977), 92 mit weiterer Literatur.
Hinsichtlich der Nomenklatur aus dem vorliegenden Gebiet wird auf die folgenden Arbeiten hingewiesen:
(1) Bachmann, Low & Taylor, Bacteriol. Rev., 40 (1976) 116-167; (2) Collins, Current Top. Microbiol. Immunol., 78
(1977) 121-170; (3) Collins & Hohn, Proc. Nat. Acad. Sei. 75
(1978) 4242-4246; (4) Emmons, Maccosham & Baldwin, J. Mol. Biol. 91 (1975) 133-146; (5) Hershey, The Bacterophage Lambda, Pubi. Cold Spring Harbor Lab. (1971) 773-779; (6) Novick, Clowes, Cohen, Curtiss, Datta & Falkow, Bacteriol. Rev., 40 (1976) 168-189; (7) Roberts, CRC Crit. Rev. Biochem. % (1976) 122-164.
Verwendete Abkürzungen
Zitat Seite Nr.
55
ATP (= Adonosin-5'-triphosphat) (lambda) b2
Bacto-Tryptone ( = Proteinextrakt von DIFCO Laboratories)
Bglll
CIts (ts = temperature sensitiveness = Temperaturempfindlichkeit) Col El D
Dithiothreitol
(= l,4-Dimercapto-2,3-butandiol) E
EcoRI Hind III hsmf hsr*
779
6
778
182 778
778
130
Pos. 98 der Darstellung
130
Pos. 98 der Darstellung 775 11
131
w*A jyv
4
Verwendete Abkürzungen
Zitat Nr.
Seite pel*
4
133-146
PFU ( = plaque forming unit =
Fleckenbildungseinheit)
pro*
1
134
Putrescin ( = Diaminobutan)
R-Faktor
6
172
Zitat 19
recA*
1
135
red3
5
778
rpoB
1
136
S
5
778
(gen) S
5
778
Sali
2
SLysis
5
778
Spermidin
( = N-(3-Aminopropyl-1,4-butandi-
amin)
su* ( = spu)
1
137
Tris
( = Tris-(hydroxymethyl)-aminome-
than)
thi*
1
137
thr* '
1
137
Experimenteller Teil Plasmide
Die Versuche wurden mit 2 Plasmiden mit einer Grösse von 17,3 bzw. 16 Md durchgeführt, von denen jedes nur eine cos-Stelle aufwies, wobei die Plasmide pJC 703 bzw. pJC 720 bezeichnet wurden. Zumindest eine Restriktionsendonuklease spaltete das grössere Plasmid (pJC 703) an zwei und das kleinere Plasmid (pJC 720) an einer Stelle. Ferner wurde ein Plasmid mit 25 Md als Molekulargewichtsmarke verwendet (pJC 802).
Die Herstellung dr Plasmide pJC 720 und pJC 703 (Fig. 1) wurde von Collins et al. in Control of Ribosome Synthesis, Alfred Benson Symp. IX, Munksgaard, S. 336 bis 369, Verlag Maaloe & Kjeldgaard, Kopenhagen 1976, und Collins et al. in Davis & Novik, Microbiology, Am. Soc. Microbiol., Washington 1978, beschrieben.
Bakterien
Die verwendeten Bakterien, ihre Merkmale, Hinterlegungsstelle und Hinterlegungsbezeichnung vergleiche Tabelle I.
Verpackungssystem nach Hohn & Murray Variante 1
Es wurde exogene DNS in vitro gemäss Hohn & Murray (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 74 (1977) 3259-3263) mit den folgenden geringfügigen Abänderungen verpackt. Es wurden einzelne Kolonien der Stämme N205 = BHB 2690 und N205 = BHB 2688 auf LA-Platten aufgestrichen und über Nacht bei 30°C wachsen gelassen; hinsichtlich der LA-Platten vergleiche Hohn & Hohn, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71 (1974) 2372-2376.
Tabelle I
Stamm Merkmale Hinterle- Hinterle gungsstelle gungsbe-zeichnung
I. Escherichia coli
N205 =
K 12 Stamm; hsrjf,
DMS
1450
BHB 2690
hsmf, rocA-, su~ ;
Göttingen
(lambda imm434CItsb2
red3 Eam4
Sam7)/lambda
N205 =
K12 Stamm; hsrjj",
DSM
1451
BHB 2688
hsmk, recA-, su~;
Göttingen
(lambda imm434CItsb2
red3 Dam 15 Sam
7)/lambda
5K
hsrk , hsm^ , thr-, thi-
DSM
1454
Göttingen
HB 101
hsrfc , hsmir, leu-, pro~
, DSM
1452
recA+
Göttingen
GL pel vgl. Emmons et al., J.
DSM
1453
21W 3 101
Mol. Biol., 91 (1975)
Göttingen
133-146
CC 703
vgl. Collins et al. in
DSM
1449
CC 720
Control of Ribosome
Göttingen
Synthesis, loc. cit. S.
DSM
1448
357
Göttingen
Alle obigen Stämme wurden am 16. Januar 1979 hinterlegt. II. Pseudomonas spec.
AM 1 NCIB 9133
Ferner wurden Vergleichsproben auf Platten aufgebracht, um die Temperaturempfindlichkeit bei 42 °C zu testen. Es wurden einzelne Kolonien in warmes LB-Medium bei einer optischen Dichte bei 600 [im (oDóoo) von nicht mehr als 0,15 inokuliert und unter Schütteln inkubiert, bis ein oDeoo-Wert von 0,3 erreicht wurde; zum LB-Medium vergleiche Hohn & Hohn, loc. cit. Die Induktion der Prophagen wurde dadurch erzielt, dass man die Kulturen bei 45 °C 15 min lang inkubierte, wobei sie stehenliess. Danach wurden sie auf 37 °C gebracht und 3 weitere h lang unter kräftiger Belüftung inkubiert. (Es wurde eine kleine Probe jeder Kultur, die infolge der Mutation im Gen S Lysis-inhibiert war, auf eine Induktion überprüft: Nach Zugabe eines Chloroformtropfens klärte sich die Kultur.). Die beiden Kulturen wurden danach gemischt, 10 min lang mit 5000 U/min zentrifugiert und erneut auf 0°C in Vsoo des Ausgangskulturvolumens mit Puffer zur Ergänzung suspendiert. (40 mM Tris-HC, pH 8,0,10 mM Spermidinhydrochlorid, 10 mM Putrescinhydrochlorid, 0,1% Mercaptoäthanol, 7% Dimethylsulfoxid, wobei der Puffer auf eine ATP-Konzentration von 1,5 mM eingestellt wurde.) Der Abbau der biologischen Aktivität der endogenen DNS kann dadurch erreicht werden, dass man vor dem Konzentrieren mit UV-Licht bestrahlt. Die Zellensuspension wurde in Portionen (20 ul) in 1,5-ml-Kunststoffzentrifugen-röhrchen (Eppendorf) gegeben, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei — 60 ° C aufbewahrt.
Die Verpackung wurd folgendermassen durchgeführt. Bei Bedarf wurde eine der vorstehend genannten Zellsuspen-sions-Proben in flüssigen Stickstoff überführt und auf Eis gegeben. Unmittelbar nach dem Auftauen (3 bis 4 min auf Eis) wurde die zu verpackende DNS (d.h. das Hybridcosmid; 0,01 bis 0,2 (ig) in einem Volumen von 1 bis 5 p.1 zugegeben. Die DNS (das Hybridcosmid) wurde im allgemeinen in dem Ligationspuffer zugegeben, in dem sie gerade gekuppelt worden war. Die Lösungen wurden beim Auftauen sorgfältig
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
5
642 396
gemischt; Blasen wurden dadurch entfernt, dass man einige sek lang mit einer Tischzentrifuge (Eppendorf) zentrifugierte. Die Mischung wurde 30 min lang bei 37 °C inkubiert. Am Ende dieser Inkubierung wurden 20 jj.1 einer eingefrorenen und aufgetauten Verpackungsmischung, die auf eine MgCl-Konzentration von 0,01 M eingestellt worden und zu der eine fertige DNAsc (10 (ig/ml) zugegeben worden war, zu jeder Probe zugemischt, wobei man das Inkubieren 20 bis 60 min lang in 0,5 ml eines SMC-Puffers fortsetzte (hinsichtlich des Puffers vergleiche man Hohn & Hohn, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71 (1974) 2372-2376); es wurde ein Tropfen Chloroform zugegeben. Nach dem Mischen wurde denaturiertes Material abzentrifugiert; die Lösung wurde als Phagensu-spension verwendet.
Man führte die Transduktion durch, indem man 0,4 ml dieser Phagensuspension zu 1 ml N205-Zellen bzw. pel--Zellen (frühe Stationärphase; oDôoo = 2,0) in L-Brühe-Maltose gab (1% Bacto-Tryptone, 0,5% Hefeextrakt (von Oxoid), 0,5% NaCl, 0,4% Maltose). Für den Versuch mit Pseudomonas-DNS wurde HB101 als Rezipient verwendet. Nachdem man 10 min lang bei 30 °C absorbieren liess, wurde die Mischung 20fach in frischer L-Brühe verdünnt und 2 h lang bei 30 °C inkubiert, um die Rifampicin-Resistenz anzuzeigen; zur Prüfung der Rifampicin-Restistenz vergleiche man Morrison, J. Bact., 132(1977) 349-351.
Variante 2
Die Verpackungsmischung enthielt jeweils wärmeinduziert E. coli N205 = BHB 2690 und N205 = BHB 2688 im folgenden Puffer: 40 mM Tris-HCl, pH 8,0,10 mM Spermidin-hydrochlorid, 10 mM Putrescinhydrochlorid, 0,1% Mercapto-äthanol, 7% Dimethylsulfoxid. Diese Mischung wurde in 20-ji-Portionen auf verschlossene Kunststoffzentrifugenröhr-chen (1,5 ml; von Eppendorf) verteilt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und 2 Monate lang bei — 65 °C aufbewahrt. Unmittelbar vor der Verwendung wurde die Mischung in flüssigen Stickstoff übergeführt. Die Mischung wurde etwa 3 min lang in Eis gegeben; es wurden 1 |il 38 mM ATP zur noch gefrorenen Mischung zugegeben. Einige Sekunden später wurde die gekuppelte DNS-Probe (1 bis 15 jü, üblicherweise 5 |il) zugegeben und beim Auftauen gemischt, das sofort eintrat. Die DNS-Menge, die je 20 jxl Verpackungsmischung zugegeben wurde, betrug im allgemeinen 1 |ig, wobei jedoch bei einer Erhöhung bis zu 4,5 |ig noch etwa die gleiche Hybridausbeute je ng DNS erhalten wurde. Nach dem Inkubieren der Verpackungsmischung bei 37 °C (oder 25 °C) im Verlauf von 30 min wurde DNASc (10 [ig/ml) und MgCh (10 mM) zugegeben. Als die dicke Masse wieder flüssig wurde (2 bis 10 min bei 37 °C) wurden 0,5 ml des gleichen Puffers wie bei Variante 1 und ein Tropfen Chloroform zugegeben. Nach 2minütigem Zentrifugieren bei 5000 g wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und als Bakteriophagensu-spension zum Transduzieren von E. coli HB 101 verwendet, wobei der Stamm bis zur späten exponentiellen Phase (oD = 1,0) in L-Brühe mit einem Gehalt von 0,5% Maltose vermehrt worden war. Das Aufbringen auf Platten (plating) und die Selektionierung wurden wie bei der Variante 1 durchgeführt.
Transformation (Vergleich)
Es wurde eine Transformation mit einem 5 K-Stamm durchgeführt. Kulturen, die bis zu einem oDöoo-Wert von 0,5 herangewachsen waren, wurden rasch auf Eis abgekühlt, zen-trifugiert und im halben Volumen einer 10 mM NaCl-Lösung auf Eis suspendiert. Nachdem man 30 min lang auf Eis stehengelassen hatte, wurden die Zellen zentrifugiert und erneut im halben Volumen einer 50 mM CaCh-Lösung suspendiert und erneut 30 min lang bei 0°C inkubiert. Nach dem Abzen-trifugieren der Zellen wurden sie in einem Zehntel ihres Volumens einer 30 mM CaCh-Lösung in 20prozentigem Glycerin suspendiert. Diese Zellzubereitung wurde in gleiche Mengen von 1 ml aufgeteilt und bis zur Verwendung bei - 60 °C gefroren gehalten. Zur Transformation wurde die Probe auf Eis aufgetaut, wobei 0,5 ml TEN (0,04 M TRIS, pH 8,0,0,04 m NaC, 1 mM EDTA) zugegeben wurden, die 30 mM CaCh und die DNS für die Transformation (0,1 bis 1 (ig) enthielten. Nachdem man die Mischung 30 min lang auf Eis stehengelassen hatte, wurde 2 min lang auf 42 °C erwärmt und rasch auf Eis abgekühlt. Die Zellen wurden im Verhältnis 1:30 in L-Brühe verdünnt und 2 h lang bei 37 °C inkubiert, um die Rifampicin-Beständigkeit zu ermitteln; zur Ermittlung der Rifampicin-Beständigkeit vergleiche Morrison, J. Bact., 132 (1977) 349-351.
Rifampicin-Beständigkeit
Die Rifampicin-Beständigkeit wurde auf L-Brühe-Platten getestet, die entweder 100 jig/ml Rifampicin enthielten, wenn Plasmid pJC703 verwendet wurde, oder die 30 ng/ml enthielten, wenn Plasmid pJC720 verwendet wurde. Die sich nach der Transduktion bzw. Transformation von pJC720 bildenden Kolonien wachsen langsam auf Rifampicin, wobei es 2 Tage bei 37 °C dauert, um grosse Kolonien zu bilden. Da Rifampicin lichtempfindlich ist, müssen die Platten bei dieser langen Inkubation im Dunkeln gehalten werden, um das Wachstum von Kolonien im Hintergrund (background colonies) auszu-schliessen.
Restriktions- und Ligations-Reaktionen (Spaltungs- und Kupplungsreaktionen)'
Die Restriktion mit Hindlll wurde in einem Medium mit 30 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCh und 10 mM NaCl bis zur Vervollständigung durchgeführt; Hindlll wurde von Boeh-ringer bezogen. Die Behandlung (digestion) mit Salii, EcoRI und BglHI wurde im selben Puffer durchgeführt. Sali und Eco Ri wurden von H. Mayer und H. Schütte bezogen und Bglll von R. Eichenlaub. Die Behandlung (digestion) mit Knpl wurde in einem Medium mit 10 mM Tris (pH 7,9), 6 mM MgCh, 6 mM NaCl, 10 mM Dithiothreitol und 100 (ig/ml Rinderserumalbumin durchgeführt. Kpnl wurde von Bio-Labs bezogen.
Die Gelelktrophorese wurde in l%igen Agarose-Gelen durchgeführt ; vergleiche dazu Collins, Current Top. Microbiol. Immunol., 78 (1977) 121-170.
Herstellung eines verpackbaren Substrats aus Plasmid-DNS
Plasmide pJC703 (Fig. 1) liefern zwei HindHI-Spaltfrag-mente, nämlich Fragment A, das die Lambda-cos-Stelle und das ColEl-Replikon enthält, und Fragment B, das das Gen für die Rifampicin-Resistenz enthält (rpoB). Es wurde erwartet, dass die Spaltung und Kupplung von Plasmiden pJC703 mit Hindlll und DNS-Ligase eine Population von Polymeren liefern würde, die das natürliche Substrat zum Verpacken imitieren könnten. Das wesentliche Merkmal zum Verpacken und Spalten von Lambda-DNS scheinen cos-Stellen zu sein, die etwa 23 bis 33 x 106 Dalton auseinanderliegen ; vergleiche Feiss, Fisher, Craxton & Egner, Virology, 77 (1977) 281-293. Das Vorliegen ist in dieser unregelmässig verknüpften Mischung durch die Bildung von Molekülen wie ABBA, ABBBA und AABA zu erwarten. Die Spaltung derartiger Moleküle an den cos-Stellen und der folgende Ringschluss würden zum völligen Verlust eines A-Fragments führen, so dass ABB-, ABBB- und AAB-Plasmide gebildet würden.
Analyse der nach Verpacken und Transduktion gebildeten Plasmide
Nach dem Verpacken der mit Ligase behandelten Hind-
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III-Fragmente des pJC703 und dem Transduzieren in den Stamm N205 wurden mehrere Tausend Rifampicin-resistente Kolonien erhalten (Versuch 1 in Tabelle II). Die Ausbeute an Rifampicin-resistenten Klonen hängt sehr von der Konzentation der Vektor-DNS (Cosmid) bei der Ligase-Behandlung ab. Dadurch wird die Annahme gestützt, dass durch die Bildung von langen Polymeren das Verpacken wirksamer wird, wie vorstehend ausgeführt wurde. Demgegenüber ist die Bildung von derartigen hochpolymeren Ketten für den Wirkungsgrad der Transformation ausserordentlich nachteilig, wie zuvor ausgeführt wurde; vergleiche Collins, Current Top. Microbiol. Immunol., 78 (1977) 121-170.
Zum weiteren Testen wurden 52 Kolonien willkürlich ausgewählt. Man stellte fest, dass sie alle Colicin-El-resistent und Colicin-E2-empfindlich waren, was anzeigte, dass die vom Plasmid kodierte El-Immunität auf dem HindHI-Frag-ment A sass. Es wurden jeweils kleine, klare Lysatmengen (small cleared-lysates) hergestellt, um die Anwesenheit und die ungefähre Grösse der Plasmid-DNS zu prüfen; dazu wurden Proben (5 pi; + SDS bis 0,1%) auf Tris-Borat-Agarose-Gelen (0,8% Borat) einer Elektrophorese unterworfen; vergleiche Collins, Current Top. Microbiol. Immunol., 78 (1977) 121-170. Aus den ersten 12 Proben und ferner aus den Proben unter den restlichen 40 Proben, bei denen die Anwesenheit von Plasmiden grösser als pJC703 ermittelt wurde, wurde superhelikale DNS hergestellt. Diese DNSäuren und in einigen Fällen die Produkte einer zweiten Verpackungsstufe wurden sorgfältiger untersucht, wobei die folgenden Spaltenzyme verwendet wurden: Bglll, Kpnl, Sali, EcoRI und Hindlll.
Die Mehrzahl der Plasmide fiel in eine der folgenden drei Grössenklassen: 17,3 Md, etwa 24 Md und etwa 29 Md (nach einer Elektrophorese von superhelikalen Molekülen in Aga-rose-Gelen mit pJC703 und pJC 802 (25 Md) als Molekulargewichts-Marken). Bei der Spaltung mit einer speziellen Nuklease lieferten diese grösseren Plasmide gleichgrosse Banden wie die Ausgangsplasmide und eine zusätzliche Bande. Abgesehen von dieser neuen Bande wurde festgestellt, dass die die Banden der HindIIIB-Fragmente (B) im Vergleich zu den Banden der HindIIIA-Fragmente (A) intensiver ausfielen.
Der Einfluss der Grösse auf den Wirkungsgrad der Cosmid-Hybrid-Verpackung
Es ist offensichtlich, dass die Cosmide pJC703 (17,3 Md) in vitro viel seltener verpackt werden als ihre grösseren Hybridderivate. Dieser hohe Prozentsatz der Verpackung von grossen Hybriden belegt, dass die Grössenselekton auch bei mit Restriktionsendonuklease gespaltener und danach wieder gekuppelter DNS eintritt. Diese Grössenabhängigkeit wurde auch unter Verwendung von Cosmiden pJC720 (16) Md) getestet, die eine einzige HindHI-Stelle enthalten (Fig. 1), um Fragmente des R-Faktors Rldrd-19 zu klonen (Versuch3 in Tabelle II). Die HindHI-Fragmente dieser Plasmide besassen folgende Grössen: 42,8, 11,5,2,9,2,0,1,95,1,8, 0,15 und 0,1 Md; Blohm, Proc. 2nd Int. Symp. Microbiol. Drug Resist., Bd. 2, Tokyo 1977. Die 11,5 Md grossen Fragmente tragen das Gen für die Amplicillin-Resistenz. Es wurden festgestellt, dass auch 90% der getesteten Rifampicin-beständigen Klone Ampicillin-bständig waren und zumindest das 11,5 Md grosse HindHI-Fragment des Rldrd-19 trugen, das neu eingesetzt worden war. Daraus ergab sich eine sehr starke Grössenselek-tion, bei der die 27,5 bis 29,5 Md grossen Hybride hinsichtlich der Verpackung und Transduktion gegenüber den 17 bis 18 Md grossen Hybriden bevorzugt wurden. Demgegenüber lieferte die Transforamtion mit derselben DNS einige Rifampicin- und Ampicillin-beständige Hybride.
Schliesslich wurde im Versuch 4 (Tabelle II) pJC720 verwendet, um Fragmente chromosomaler DNS von Pseudomonas AMI zu klonen, die teilweise mit Hindlll gespalten worden war. Die meisten der ersten getesteten 32 Klone trugen neue DNS-Fragmente einer Grösse entsprechend 4 bis 14 Md, wobei die Mehrzahl Fragmente einer Grösse von mehr als 7 Md trug. Auf dieser Basis können einige Hundert der erhaltenen Klone eine Genbank von chromosomaler Pseudo-monas-AMl-DNS in Escherichia coli bilden; vergleiche Clarke & Carbon, Cell, 9 (1976), 91-99.
Bei dem pel--Stamm hängt der Wirkungsgrad der DNS-Injektion von der Grösse der Lambda-DNS ab ; vergleiche Emmons, J. Molex. Biol. 93 (1974) 511-525. Als der pel "-Stamm als Wirtsstamm für mit Hindlll gespaltene, wieder verknüpfte und verpackte pJ0703 verwendet wurde, wurde eine noch stärkere Grössenabhängigkeit festgestellt. Von 23 getesteten Klonen besassen 19 Plasmide im Bereich von 24 bis 25 Md und 8 im Bereich von 29 bis 30 Md, wobei die Bestimmung durch Gelelktrophorese klarer Lysate durchgeführt wurde; ein einziges Plasmid besass die Ausgangs-grösse von 17 Md. Es wurde festgestellt, dass alle grösseren Plasmide (23,6 und 29,9 Md) die Form ABB bzw. ABBB besassen (Spaltung mit Sali und EcoRI), wie unter Verwendung von N205 als Wirtsstamm festgestellt worden war.
Verpackung von Cosmid-Hybriden als sehr wirksames Klo-nungssystem für grosse DNS-Fragmente (Vergleich mit dem Transformationssystem und dem Hohn & Murray-Transduk-tionssystem).
Es wurde gezeigt, dass das Verpacken von Plasmid-DNS in Bakteriophage-Lambda-Teilchen als eine Methode zur Herstellung von Plasmid-Hydriden im Grössenbereich von 20 bis 30 Md angewendet werden kann, wenn Plasmid-DNS verwendet wird, die in vitro mit Fremd-DNS-Fragmenten verknüpft worden ist. Die Ausbeute an Klonen mit einem Gehalt an diesen Hydriden ist insbesondere in der grösseren Grös-senklasse mehrere hundert- bzw. mehrere tausendmal besser als bei der üblichen Transformation. Ferner werden bei der Verwendung von kleinen Plasmiden, die kaum transformiert werden, die mitlaufenden nicht-hybridisierten Klone wirksam in einer einzigen Stufe eliminiert, ohne das man die DNS-Substrate modifizieren oder Selektionier- oder Auslesearbeitsweisen vorsehen muss, die normalerweise bei Klonierversuchen angewendet werden.
Der Einsatz von Cosmiden in dieses System kann sehr vorteilhaft mit dem in vitro vorgenommenen Verpacken von Lamdba-Kloniervektoren verglichen werden, das unabhängig von der Grösse der DNS im Bereich von 24 bis 28 Md ist (Hohn & Murray, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 3259-3263) und bei dem die übliche grössenabhängige Selektion für Lambda-Hybride nicht vorgesehen werden kann, sofern nicht ein zweiter Infektionszyklus (infectious cycle) durchgeführt wird; zur normalen grössenabhängigen Selektion für Lambda-Hybride vergleiche z.B. Thomas, Cameron & Davis, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71 (1974) 4579-4583; Murray & Murray, Nature, 251 (1974) 476-481 ; Murray, Brammar & Murray, Molec. gen Genet., 150 (1977) 53-61 ; Blattner, Williams Biechi, Denniston-Thompson, Faber, Grundwald, Kiefer, Moore, Schümm, Sheldon & Smithies, Science 196 (1977) 161-169. Ein derartiger zweiter Zyklus bringt die Gefahr der Herstellung von Zwillingsklonen und des selektiven Verlustes von einigen Hybriden mit sich; vergleiche Cameron, Panosenko, Lehman & Davis, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72 (1975) 3426-3420. Im Bereich von 24 bis 31 Md ist jedoch eine Grössenabhängigkeit für ein in vitro erfolgendes Verpackungssystem beschrieben worden (Sternberg, Tiemeier & Enquist, Gene, 1 (1977) 255-280), jedoch wird eine niedriger Grössenbegrenzung für den Vektor durch die Forderung
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nach bakteriophagen zur Fleckenbildung (plaque production) gesetzt. Diese Grössenabhängigkeit erlaubte die Herstellung einer transduzierten Population, bei der 5 bis 10% aller Flek-ken Hybrid-Phagen enthielten; vergleiche Sternberg, Tiemeier & Enquist, Gene 1 (1977) 255-280. Im Unterschied 5 dazu wurden bei den Versuchen 3 und 4 (Tabelle II) im wesentlichen nur Hybride erhalten.
Tabelle II: (Vergleich mit dem Transformationssystem).
Wirkungsgrade von Transformation und Verpackung von Plasmiden mit cos-Stellen vor und nach Spaltung mit Hindlll10 und Verknüpfen mit DNS-Ligase. Das zu transformierende bzw. (nach dem Verpacken) zu transduzierende Material wurde für ein Medium mit einem Gehalt an Rifampicin selektiert. Die Ausbeuten sind ausgedrückt als Rifampicin-resistente Kolonien/(ig eingesetzte DNS. Bei Versuch 1 betrifft is der Prozentsatz an Hybrid-Klonen Klone mit mehr als einer Kopie des HindIIIB-Fragments. Etwa 90% der Rifampicinresistenten Kolonien des Versuchs 3 enthielten gleichfalls das
Hindlll-Fragment (11 Md) aus Rldrd-19, das ferner eine Ampicillin-Resistenz trägt.
Wirkungsgrad des Verpackens von Lambda-b2-DNS in Parallelversuchen betrug etwa IO7 bis 108 pFU/|j.g eingesetzte DNS.
Figur 1 : Restriktionsendonuklease-Schema für pJC703 und pJC720. Die Fragmente, die mit jedem Enzym erhalten wurden, sind alphabetisch entsprechend ihrer Grösse angeführt. Die gestrichelten Linien zeigen die relative Stellung der EcoRI-Spaltstelle jedes Schemas und die durchgehenden senkrechten Linien die HindHI-Spaltstellen. Der Abstand der HindHI-Spaltstelle zur nächsten Spaltstelle jedes Restriktionsenzyms ist in Md angegeben. Diese Werte werden bei der Analyse von Plasmiden verwendet, die polymere HindHI-Fragmente enthalten. Der ColEl-Teil dieser Plasmide leitet sich von einem ungewöhnlichen Isolât (pJC309) ab, das eine Sall-Spaltstelle aufweist.
G
1 Blatt Zeichnungen
Claims (3)
1. Transformations-System DNS-Fragment/Lambda-DNS + E. coli « ... « .
(Träger = Vektor)System (Transformation) 5 Hybndbaktenen
1. Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass man a) aus einem bakteriellen Plasmid mit nicht mehr als 21 Megadalton und ein oder mehreren cos-Stellen eines Lambda- oder lambdoiden Phagen und einem DNS-Fragment ein Hybrid-Plasmid herstellt,
b) das gebildete Hybrid-Plasmid mit dem Lysat eines Lambda- oder lambdoiden Phagen verpackt und c) das Verpackungsprodukt in Escherichia coli unter Bildung von Hybrid-Bakterien transduziert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Stufe a ein Plasmid mit nur einer Spaltstelle je Restriktionsendonuklease in Gegenwart von ein oder zwei Restriktionsendonukleasen spaltet und in Gegenwart einer Ligase zu einem Hybrid-Plasmid kuppelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Plasmid mit nicht mehr als 18 Megadalton verwendet.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Plasmid mit nur einer cos-Stelle verwendet.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe a ein an nur einer Stelle in Gegenwart einer Restriktionsendonuklease gespaltenes Plasmid einsetzt, das mit einem DNS-Fragment gekuppelt ist, das sich in Stufe a an nur einer Stelle in Gegenwart einer anderen Restriktionsendonuklease spalten lässt.
5 Die möglichen technischen Anwendungen der Gentechnologie sind enorm, wenn man an die Möglichkeit denkt, DNS einer beliebigen Quelle, von z.B. Bakterien, Hefe, Pilzen, Tieren und Menschen in (andere) Bakterien einzubringen. Die Fortschritte der DNS-Chemie und der Molekularge-10 netik von Escherichia coli machen es wahrscheinlich, dass die Anwendung der DNS-Transplantationstechnologie zur Herstellung von Hybrid-Bakterien, die mit Fremd-DNS-Produkte von wirtschaftlichem Interesse erzeugen können, nur eine Frage der Zeit ist. Die Herstellung beispielsweise eines 15 menschlichen Hormons oder eines Pilz-Antibiotikums mit einem leicht kultivierbaren bzw. fermentierbaren Bakterium, wie Echerichia coli, ist technisch von hervorragendem Interesse.
Collins gibt eine Übersicht über das bekannte Transfor-20 mations-Verfahren in Current Top. Microbiol. Immunol., 78 (1977) 121-170,129, Hohn & Murray beschreiben in Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 3259-3263 die Verpackung von DNS des Phagen Lambda und lambdoider Phagen, die in vitro mit Fremd-DNS-Fragmenten kombiniert worden sind, 25 zur In-vitro-Herstellung neuer Hybride. Es folgt ein Schema dieser bekannten Systeme:
2. Verpackungs/Transduktions- DNS-Fragment/Lambda-DNS +Phagenhülle ,,, ,
System (Hohn & Murray) (Träger=Vektor)-System (Verpackung)
3 Verpackungsprodukte
JD
+ E. coli
(Transduktion)
-> Hybridbakterien
Diese bekannten Systeme haben jedoch hinsichtlich ihres Wirkungsgrades bzw. Leistungsfähigkeit noch nicht befriedigt.
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