DK159121B - Fremgangsmaade til fremstilling af hybrid-bakterier - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af hybrid-bakterier Download PDFInfo
- Publication number
- DK159121B DK159121B DK131279A DK131279A DK159121B DK 159121 B DK159121 B DK 159121B DK 131279 A DK131279 A DK 131279A DK 131279 A DK131279 A DK 131279A DK 159121 B DK159121 B DK 159121B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- plasmid
- hybrid
- dna
- lambda
- plasmids
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 67
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 35
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 20
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 20
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 17
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 13
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 13
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 13
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 43
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 17
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 17
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 14
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 108010073254 Colicins Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101100038261 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) rpo2C gene Proteins 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 101150085857 rpo2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRROLJSGZKCWGR-UHFFFAOYSA-N 3-(4-aminobutylamino)propylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCCCNCCCN WRROLJSGZKCWGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000723438 Cercidiphyllum japonicum Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100001673 Emericella variicolor andH gene Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101150069639 LEU1 gene Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100409308 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) adv-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108020005088 Superhelical DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100181629 Thermus thermophilus leuA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- XXWCODXIQWIHQN-UHFFFAOYSA-N butane-1,4-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NCCCCN XXWCODXIQWIHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHWVXCQZPNWFRO-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diamine Chemical compound CC(N)C(C)N GHWVXCQZPNWFRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 101150098295 pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
DK 159121B
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af hybrid-bakterier under pakning af en dannet hybrid-DNA med lysatet af en lambda- eller lambdoid phag og transduce-ring af pakningsproduktet i Escherichia coli.
5 De mulige tekniske anvendelser af genteknologien er enorme, når man tager muligheden i betragtning for at indføre DNA fra en vilkårlig kilde, f.eks- fra bakterier, gær, svampe, dyr og mennesker, i (andre) bakterier. Fremskridtene i DNA-kemien og molekular-genetikken for Escherichia coli gør 10 det sandsynligt, at anvendelsen af DNA-transplantationstek-nologien til fremstilling af hybrid-bakterier, som med frem-med-DNA kan frembringe produkter af økonomisk interesse, kun er et tidsspørgsmål. Fremstillingen af f.eks. et menneskeligt hormon eller et svampe-antibiotikum med en let dyr- 15 kelig eller fermenterbar bakterie, f.eks. Escherichia coli, er teknisk set af særdeles betydelig interesse.
Collins giver en oversigt over den kendte transformationsmetode i Current Top. Microbiol. Immunol., 78, 121-170, (1977), 129. Hohn & Murray beskriver i Proc. Nat. Acad.
20 Sci. USA, 74, 3259-3263, (1977) pakningen af DNA af phagerne lambda og lambdoide phager, som in vitro er kombineret med fremmed-DNA-fragmenter, til in vitro-fremstilling af nye hybrider. Disse kendte systemer fremgår af følgende skema: 25 1) Transformations-system: DNA-fragment/Lambda- + E. coli -DNA (Bærer = Vektor)--> Hybrid-bakterier -system (Transformation) 30 2) Paknings/transduktions-system (Hohn & Murray): DNA-fragment/Lambda- + Phagomhylning Pakningsprodukt -DNA (Bærer = Vektor)--> 35 -system (Pakning) 40 Itfansduktlon} > Hybrid-bakterier
DK 159121B
2
Disse kendte systemer har imidlertid ikke været tilfredsstillende med hensyn til deres virkningsgrad.
Formålet med opfindelsen er således at anvise en fremgangsmåde med en bedre virkningsgrad.
5 Dette formål opnås ifølge opfindelsen ved hjælp af en fremgangsmåde til fremstilling af hybrid-bakterier, hvilken fremgangsmåde er af den ovenfor angivne art, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man (a) spalter et bakterielt plasmid på ikke mere end 21 Mega-10 dalton med ét eller flere cos-steder af en lambda- eller lambdoid phag og med hver gang kun ét spaltningssted for hver restriktions-endonuclease, i nærværelse af én eller to restriktions-endonucleaser, (b) kobler det spaltede plasmid med et fremmed-DNA-fragment 15 i nærværelse af en ligase til et hybrid-plasmid, (c) pakker det dannede hybrid-plasmid med lysatet af en lambda- eller lambdoid phag og (d) transducerer pakningsproduktet i Escherichia coli under dannelse af hybrid-bakterier.
20 Plasmid-begrebet er nærmere omtalt af Collins i Cur rent Top. Microbiol. Immunol., 78., 121-170, (1977), især på side 122. Yderligere litteratur er også nævnt her. Fremstillingen af plasmider er velkendt for fagmanden. Den kan f.eks. udføres ifølge Clewell & Helinsky, Biochem., 9, 4428-4440 25 (1970), eller på analog måde. Til bestemmelse af plasmid- . -størrelsen kan fagmanden anvende gængse analytiske metoder, f.eks. gel-elektroforese, jfr. f.eks. Collins i Current Top. Microbiol. Immunol., 78, 121-170, fig. 3-5 på side 140-142, (1977).
30 Ved et cos-sted forstår man ved phagen lambda det område, der udviser de kohæsive, sammenhæftende ender.
Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes der plasmider, i hvilke dette område er indbygget, således at også disse plasmider udviser cos-steder. Uden cos-steder 35 kan plasmider ikke pakkes. Til fremstilling af plasmider med cos-steder (såkaldte cosmider) kan man anvende den af 3
DK 159121 B
Collins, Fiil, Jørgensen & Friesen i Control of Ribosome Synthesis, Alfred Benzon Symp. IX, Munksgaard, side 356-369, forlaget Maaløe & Kjeldgaard, København 1976, angivne metode eller analoge metoder. Cos-stedet er i det anførte arbejde 5 i figur 3 betegnet med m'm. Konstateringen af forekomsten og antallet af cos-steder er uden videre mulig, jfr. f.eks. Nichols & Donelson i J. Virology., 26, 429-434 (1978). Naturligvis kan der til fremgangsmåden ifølge opfindelsen også anvendes cosmider, der er afledt af cosmider, som er frem-10 stillet efter den kendte metode eller dermed analoge metoder.
Med hensyn til teknikkens stade vedrørende restriktionsenzymer kan der f.eks. henvises til Roberst i CRC Crit.
Rev. Biochem., 4., 123-164 (1976) . Anvendelsen af restrik-tions-endonucleaser er velkendt for fagmanden, jf. f.eks.
15 Cohen, Chang, Boyer & Helling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70. 3240-3244 (1973), og Collins, Current Top. Microbiol.
Immunol., 78., 121-170 (1977), især side 124. Ved gængse analytiske metoder, f.eks. ved gel-elektroforese, kan det bestemmes, om et plasmid udviser ét eller flere spaltnings-20 steder for et bestemt restriktionsenzym. Således dannes der f.eks. ved ét spaltningssted kun ét spaltningsprodukt, medens der ved to spaltningssteder fremkommer to fragmenter.
Det har nu vist sig, at nogle plasmider overhovedet ikke lader sig spalte med bestemte restriktionsenzymer. For 25 at kunne anvende sådanne restriktionsenzymer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan man gå frem på følgende måde.
Man kan spalte et plasmid med et restriktionsenzym, der opdeler plasmidet på ét sted. Parallelt dermed kan man ud fra en fremmed-DNA udskære et DNA-fragment, som på ét sted 30 kan spaltes med et andet, plasmidet ikke-spaltende restriktionsenzym. Derefter kan man koble fremmed-DNA-fragmentet med det spaltede plasmid, hvorved der fås et hybrid-plasmid, som nu også kan spaltes med det andet restriktionsenzym på ét sted.
35 Ved det fremmed-DNA-fragment, som man ved det oven nævnte trin (b) i fremgangsmåden ifølge opfindelsen kobler •4
DK 159121 B
med plasmidet, er der tale om et fragment, med hvilket man meddeler en ønsket egenskab til den hybrid-bakterie, der skal fremstilles.
Ved koblingen i nærværelse af eri ligase kan man f.eks.
5 arbejde ifølge Cohen, Chang, Boyer & Helling, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 70, 3240-3244 (1973), eller efter analoge metoder. Til fremstilling af hybridplasmider kommer også samtlige de af Collins, Current Topics Microbiol. Immunol., 78. 121-170 (1977), på side 126 sammenstillede metoder i 10 betragtning.
Til fremstilling af phaglysatet kan man anvende phagen lambda eller lambdoide phager, f.eks. Phi 80. Til fremstilling af phaglysatet, til pakning og til transduktion kan der arbejdes ifølge Hohn & Murray, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 15 74, 3259-3263 (1977), eller ifølge analoge metoder.
Til bestemmelse af virkningsgraden ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen vil fagmanden anvende gængse analytiske fremgangsmåder til bestemmelse af de fremstillede hybrid--bakterier. Fagmandlen vil herved henholde sig til en for 20 selektionen egnet egenskab af hybrid-bakterierne, f.eks. deres resistens mod antibiotika, såsom rifampicin eller ampicillin, idet der fortrinsvis er tale om en fra plasmidet koderet egenskab.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan udføres in 25 vitro.
Fordelen ved den her omhandlede fremgangsmåde i forhold til det kendte transformationssystem består i, at der ved transduktionen opnås en højere virkningsgrad, og at større fremmed-DNA-fragmenter lader sig transducere f.eks.
30 med en størrelse på mere end 2 Md, især 3 Md og mere, og fortrinsvis 5 Md og mere, idet den øvre grænse på forhånd er givet ved det valgte paknings- og transduktionssystem.
Man kan således ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen indbringe den omhandlede hybridplasmid-DNA mindst hundrede 35 gange bedre i levende bakterier, end det er tilfældet med det kendte transformationssystem. Ved større hybridplasmider 5
DK 159121 B
forløber fremgangsmåden ifølge opfindelsen endog mindst tusinde til hundredetusinde gange bedre, jfr. Collins, loc. cit., 170. Denne bedre virkningsgrad ved store hybridplas-mider beror på den meget kraftige mod-selektion, som ind-5 træder ved transformationen af store molekyler.
Den særlige fordel ved den her omhandlede fremgangsmåde i forhold til det kendte paknings/transduktions-system med lambda-vektorer beror på plasmid-vektorernes lidenhed, der muliggør pakningen af store fremmed-DNA-fragmenter.
10 Den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnåelige, overraskende høje andel af hybrid-bakterier gør det videre arbejde væsentligt enklere, medens selektionerings- og udlæsningstrinnene ifølge den kendte teknik kræver et uønsket stort arbejdsopbud.
15 Der anvendes med fordel et plasmid på ikke mere end 18 Megadalton. Ved sådanne plasmider bliver plasmidet selv-til forskel fra hybrid-plasmidet - væsentligt dårligere pakket og transduceret, således at det kommer til en særlig kraftig selektion til gunst for hybrid-plasmiderne, jfr.
20 Collins & Bruning i Gene, 4^ 85-107 (1978).
Der anvendes med fordel et plasmid med kun ét cos--sted. Gennemførligheden af fremgangsmåden ifølge opfindelsen i denne udførelsesform er overraskende, da DNA med kun ét cos-sted anses for ikke-pakkelig, jfr. f.eks. Hohn & Katsura 25 i Current Top. Microbiol. Immunol., 78, 92 (1977), samt yderligere litteratur.
Med hensyn til nomenklaturen på det her omhandlede område kan der henvises til følgende arbejder: 30 (1) Bachmann, Low & Taylor, Bacteriol. Rev., .40, 116-167 (1976) ? (2) Collins, Current Top. Microbiol. Immunol., 78, 121-170 (1977) ; (3) Collins & Hohn, Proc. Nat. Acad. Sci. 75, 4242-4246 35 (1978);
DK 159121B
6 (4) Emmons, Maccosham & Baldwin, J. Mol. Biol. 91, 133-146 (1975); (5) Hershey, The Bacterophage Lambda, Publ. Cold Spring Harbor Lab. 773-779 (1971); 5 (6) Novick, Clowes, Cohen, Curtiss, Datta & Falkow,
Bacteriol. Rev., 40, 168-189 (1976); (7) Roberts, CRC Crit. Rev. Biochem., 4_^ 123-164 (1976).
7
DK 159121B
Anvendte forkortelser Litteraturcitat
Nr. Side 5 ATP (= Adenosin-5'-triphosphat) (lambda) b2 5 779
Bacto-trypton (= proteinekstrakt fra DIFCO Laboratories) 10
Bgl II 76 CIte (ts s= temperature sensitiveness = temperatur- 15 -følsomhed) 5 778
Col El 6 182 D 5 778 20
Dithiothreitol (= 1,4-dimer-capto-2,3--butandiol) 25 E 5 778
EcoRI 2
Hind III 2 30 hsmr 1 130 Position 98 i fremstilling 35 hsrr 1 130 Position 98 K i fremstil ling imiri434 5 775 40 Κρη I 7 11 leu1 1 131 45 pel1 4 133-146 PFU (= plaque forming unit = plaque-dannende enhed) pro1 1 134 50
Putrescin (= diaminobutan) R-Faktor 6 172, citat 19 55
DK 159121B
8 recA1 1 135 red3 5 778 5 rpoB 1 136 S 5 778 (gen) S 5 778 10
Sal I . 2 SLysis 5 778 15 Spermidin (= N-(3-aminopropyl)--1,4-butandiamin) su- (= spu) 1 137 20 Tris (= tris-(hydroxymethyl)-aminomethan) thi1 1 137 thr1 1 137 25 På tegningen viser figuren (fig. 1) et restriktions--endonuclease-skema for pJC 703 og pJC 720. De fragmenter, der fås med hvert enzym, er anført alfabetisk svarende til deres størrelse. De stiplede linier viser den relative stil-30 ling af EcoRI-spaltningsstedet i hvert skema, og de gennemgående lodrette linier viser Hindlll-spaltningsstederne. Afstanden fra HindllT-spaltningsstederne til det næste spaltningssted er for hvert restriktionsenzym angivet i Md. Disse værdier anvendes ved analyse af plasmider, der indeholder 35 polymere HinduI-fragmenter. ColE^-delen af disse plasmider er afledt af et usædvanligt isolat (pJC 309), der udviser et Sall-spaltningssted, som mangler ColE1.
Eksperimentel del 40 Plasmider
Forsøgene gennemføres med 2 plasmider med en størrelse på 17,3 resp. 16 Md, af hvilke hvert kun udviser ét cos— sted, idet pi asmiderne betegnes pJC 703 resp. pJC 720. I det mindste én restriktions-endonuclease spalter det større 9
DK 159121 B
plasmid (pJC 703) ved to og det mindre plasmid (pJC 720) ved ét sted. Endvidere anvendes der et plasmid med 25 Md som molekylvægtsmærke (pJC 802).
Fremstillingen af plasmiderne pJC 720 og pJC 703 5 (figur 1) er beskrevet af Collins et al. i Control of Ribosome Synthesis, Alfred Benzon Symp. IX, Munksgaard, side 356-369, forlaget Maaløe & Kjeldgaard, København 1976, og af Collins et al. i Davis & Novik, Microbiology, Am. Soc. Microbiol., Washington, 1978.
10
Bakterier
De anvendte bakterier, deres kendetegn, deponeringssteder og deponeringsbetegnelser fremgår af den følgende tabel I. DSM-stammerne såvel som NCIB-stammen er almindeligt 15 tilgængelige.
Pakningssystem ifølge Hohn & Murrav
Exogen DNA pakkes in vitro ifølge Hohn & Murray (Proc.
Nat. Acad. Sci. USA, 74, 3259-3263 (1977) med de følgende 20 mindre ændringer. Enkelte kolonier af stammen N 205 = BHB 2690 og N 205 = BHB 2688 stryges på LA-plader og får lov at • vokse natten over ved 30°C. Med hensyn til LA-pladerne kan der henvises til Hohn & Hohn, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 71, 2372-2376 (1974).
10 DK 159121 B
tn ; tr> tu ! id cn i •Η P P O) tDCio H cm ro σ> oo ro ; cjtriin to minto^^ro
0 P ·3< •d1 ·3< 'tf Μ* vF P
dl p p 1—I r-1 i—Ir—I P P O'* 1 <U P Q Λ cd cd cd cd cd cd 1 ω 5 α> α> <u <υ ω tn tn X, tn tn tn tn tn
tn Cd ? & G G G G
r! -H R -Η -Η B Ή -H
P p 'Γ1 P p P P P
p p fr P P P P P
p :0 :0 :0 :0 :0 :0
PCD $ ØØØOO
O Ti - _ ffl ditUgJ <1 S S 2 2 -¾
<u-Pco S; w ω. ω w w U
p tn p g PPPPQS
U-t
P O
O
-H 1—1
+ PQ O
C P -P
ϋ · -P -H
O) H CO 1 p o o ro ro 2 0· v tj ··* t3 - o
I (1) ID II · Ή O
3 p PP POO H
t n cn p Jd P
CM N tj -P Di > Ή - - P - P P · -. P cn I tn p I ii) S · · ^ m b c P Ti <3 PPI I Ph ' tu
O Η P O H i—I P P . cn P P
PUB pu\pppbpp p bp p b —~ p b o — P
··* ro i—i «— ro r'- tn sd QJ — B \ P B - - tn CD Cd >i
B + P B B + X G s + P i >: cd b b ω sd BB§t'-B2HPSSQBP
in ρωΒΒΡΡΒωωωΒίΒΡΓ- P P p ρ P P P P B ro O B “") P w pcoco ptn W ro 0 O ro tu -Ti — Ti * 1 — — *—1 tn
Ti Ν+ΛΛ ^ Ν+ΛΛ I I P4 - · OP
cd ΒΡΕ6·-·^66ΜΡΡ«»ΡΡτΐ cd cnpp cn ppcn tn βρβββ
« «pBHWPBQPp-ncnl Pd CHJ
-Η Ή O
BO CO o P
O cn co "—) Οι o cd to tn CM CM ro p p
B PQ CQ !s P
P Od Dd -! 5 om m m o
b B
p II II B B ro o O
p O P O CM Ti
p m tn Pilir-r-pP
Η O o O P _ p tn cm cm CQ t-d 0 0 tn 2 P B M S S inmøUU Ph <c P g P P ·— ^
P P -Η B
Βω ·η .11
DK 159121B
Endvidere anbringes der sammenl igningsprøver på plader til afprøvning af temperaturfølsomheden ved 42°c. Enkelte kolonier podes i et varmt LH-medium ved en optisk tæthed ved 600 nm (OD60o) På ikke mere end 0,15 og inkuberes under 5 omrystning, indtil der opnås en OD6oo_værdi på 0/3* Med hensyn til LH-mediet henvises til Hohn og Hohn, loc. cit. Induktionen af pro-phagerne opnås ved, at man inkuberer kulturerne ved 45°C i 15 minutter, hvorefter man lader dem henstå. Derpå bringes de på en temperatur på 37°C og inku-10 beres i yderligere 3 timer under kraftig beluftning. (En lille prøve af hver kultur, der som følge af mutationen er inhiberet i Gen S-lysen, afprøves ved induktion: efter tilsætning af en dråbe chloroform klares kulturen.). Begge kulturer blandes derefter, centrifugeres i 10 minutter med 15 5000 o/min og suspenderes på ny ved 0°C i 1/500 af udgangs kulturrumfanget med puffer til supplering (40 mM tris-HCl, pH 8,0), 10 mM spermidin-hydrochlorid, 10 mM putrescin-hydro-chlorid, 0,1% mercaptoethanol og 7% dimethylsulfoxid, idet pufferen indstilles på en ATP-koncentration på 1,5 mM. Ned-20 brydningen af den biologiske aktivitet af den endogene DNA kan opnås ved, at man før koncentreringen bestråler med UV--lys. Cellesuspensionen anbringes i portioner (20μ1) i 1,5 ml-kunstofcentrifugerør (Eppendorf), nedfryses i flydende nitrogen og opbevares ved -60°C.
25 Pakningen gennemføres på følgende måde. Efter behov overføres en af de ovennævnte cellesuspensionsprøver i flydende nitrogen og anbringes på is. Umiddelbart efter optøningen (3 til 4 minutter på is) tilsættes den DNA, der skal pakkes, dvs. hybridcosmidet i en mængde på 0,01 til 0,2 μg, 30 i et rumfang på 1-5 μΐ. DNA (hybridcosmidet) tilsættes i almindelighed i den ligationspuffer, i hvilken den netop er koblet. Opløsningerne blandes omhyggeligt ved optøningen.
Blærer fjernes ved, at man centrifugerer i nogle sekunder med en bordcentrifuge (Eppendorf). Blandingen inkuberes i 35 30 minutter ved 37°c. Ved afslutningen af denne inkubering tilblandes der til hver prøve 20 μΐ af en frosset og optøet 12
DK 159121 B
pakningsblanding, der er indstillet på en MgCl-koncentration på 0,01 M, og hvortil der er sat en færdig DNAse (10 /xg/ml), idet man fortsætter inkuberingen i 20-60 minutter i 0,5 ml af en SMC-kpuffer. Med hensyn til pufferen kan der henvises 5 til Hohn & Hohn, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 71, 2372-2376 (1974). Derpå tilsættes der en dråbe chloroform. Efter blandingen fracentrifugeres denatureret materiale, og opløsningen anvendes som phag-suspension (pakningsprodukt).
Man gennemfører transduktionen på den måde, at man 10 sætter 0,4 ml af denne phag-suspension til 1 ml N 205-celler resp. pel“-celler (tidlig stationær fase, ODgoo=2'0) i L_ -maltose-medium (1% Bacto-trypton, 0,5% gærekstrakt (fra Oxoid) , 0,5% NaCl og 0,4% maltose). Til forsøget med Pseudo-monas-DNA anvendes der HB 101 med recipient. Efter absorption 15 i 10 minutter ved 30° C fortyndes blandingen 20 gange i frisk L-medium og inkuberes i 2 timer ved 30°C til påvisning af rifampicin-resistensen. Vedrørende afprøvningen af rifampi-cin-resistens kan der henvises til Morrison, J. Bact., 132. 349-351 (1977).
20
Transformation (sammenligning^
Der gennemføres en transformation med en 5 K-stamme. Kulturer, der er fremvokset til en ODgoo-værdi på 0,5, afkøles hurtigt på is, centrifugeres og suspenderes i det halve 25 rumfang af en 10 mM NaCl-opløsning på is. Efter 30 minutters henstand på is centrifugeres cellerne, suspenderes på ny i det halve rumfang af en 50 mM CaCl2-opløsning og inkuberes på ny i 30 minutter ved 0°C. Efter fracentrifugeringen af cellerne suspenderes de i en tiendedel af deres rumfang af 30 en 30 mM CaCl2-opløsning i 20%'s glycerol. Dette cellepræparat opdeles i lige store portioner på 1 ml og holdes ned-frosset ved -60°C, indtil de skal anvendes. Til transformationen optøs prøven på is, idet der tilsættes 0,5 ml TEN (0,04 M TRIS, pH 8,0, 0,04 NaCl og 1 mM EDTA), som indeholder 35 30 mM CaCl2 og den til transformationen nødvendige DNA (0,1 til 1 μg). Efter henstilling af blandingen i 30 minutter på
DK 159121B
13 is opvarmes der i 2 minutter til 42°C og afkøles hurtigt på is. Cellerne fortyndes i forholdet 1:30 i L-medium og inkuberes i 2 timer ved 37°C til bestemmelse af rifampicin-be-standigheden. Vedrørende rifampicin-bestandigheden kan der 5 henvises til Morrison, J. Bact., 132, 349-351 (1977).
Rifampicin-bestandiqhed
Rifampicin-bestandigheden afprøves på L-medium-plader, der enten indeholder 100 μιη/ml rifampicin, når der anvendes 10 plasmid pJC 703, eller indeholder 30 μg/ml, når der anvendes plasmid pJC 720. De kolonier, der dannes efter transduk-tionen, henholdsvis transformationen, af pJC 720, vokser langsomt på rifampicin, idet det tager 2 dage ved 37°C at få dannet store kolonier. Da rifampicin er lysfølsomt, må 15 pladerne ved denne langvarige inkubation holdes i mørke til udelukkelse af vækst af kolonier i baggrunden ("background colonies").
Restriktions- og licrations-reaktioner (spaltnings- og kob-20 lingsreaktioners.
Restriktioner med Hindlll gennemføres i et medium med 30 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl2 og 10 mM NaCl til fuldstændiggørelse. Hindlll fås fra Boehringer. Behandlingen (digestionen) med Sall, EcoRI og BolII gennemføres i den 25 samme puffer. Sall og EcoRI fås fra H. Mayer og H. Schiitte, og Bglll fås fra R. Eichenlaub. Behandlingen (digestionen) med Kpnl udføres i et medium med 10 mM Tris (pH 7,9), 6 mM MgCl2, 6 mM NaCl, 10 mM dithiothreitol og 100 μg/ml oksese-rumalbumin. Kpnl fås fra Bio-Labs.
30 Gelelektroforesen gennemføres i 1%’s agarose-gel, jfr. Collins, Current Top. Microbiol. Immunol., 78, 121-170 (1977).
35
DK 159121B
14
Fremstilling af et pakkeliat substrat af Plasmid-DNA
Plasmidet pJC 703 (figur 1) giver to Hindlll-spalt-ningsfragmenter, nemlig fragment A, der indeholder Lambda--cos-stedet og ColEl-replikonen, og fragment B, der indehol-5 der genet for rifampicin-resistensen (rpoB). Det var ventet, at spaltningen og koblingen af plasmidet pJC 703 med HindiII og DNA-ligase ville give en population af polymere, der kunne imitere det naturlige substrat til pakningen. Det væsentlige kendetegn til pakning og spaltning af lambda-DNA 10 synes at være cos-steder, der har en afstand fra ca. 23 til 33·106 Dalton, jfr. Freiss, Fisher, Crayton & Egner, Virology, 77, 281-293 (1977). Forekomsten af cos-steder er at vente i denne uregelmæssigt sammenknyttede blanding gennem dannelsen af molekyler såsom ABBA, ABBBA og AABA. spaltningen 15 af sådanne molekyler ved cos-stederne og den følgende ringslutning ville føre til totalt tab af et A-fragment, således at der ville dannes ABB-, ABBB- og AAB-plasmider.
Analyse af de efter pakning og transduktion dannede plasmider 20 Efter pakningen af de med ligase behandlede Hindlll- -fragmenter af pJC 703 og transduktionen i stammen N 205 fås der flere tusinde rifampicin-resistente kolonier, jfr. forsøg 1 i tabel II. Udbyttet af rifampicin-resistente kloner afhænger meget af koncentrationen af vektor-DNA (cosmidet) 25 ved ligase-behandlingen. Herved støttes den antagelse, at pakningen bliver mere virksom ved dannelsen af lange polymere, således som det fremgår af det foranstående. Derimod er dannelsen af sådanne højpolymere kæder overordentlig uheldig for virkningsgraden af transformationen, således 30 som det tidligere er anført, jfr. også Collins, Current Top. Microbiol. Immunol., 78, 121-170 (1977).
Til yderligere afprøvning udvælges der vilkårligt 52 kolonner. Det fastslås, at de alle er Colicin-El-resistente og Colicin-E2-følsomme, hvilket viser, at den fra plasmidet 35 koderede El-immunitet sidder på Hindlll-fragmentet A. Der fremstilles hver gang små, klare lysatmængder ("small cleared
DK 159121 B
15 lysates") til påvisning af tilstedeværelsen af den omtrentlige størrelse af plasmid-DNA. Til dette formål underkastes prøver (5 μΐ; + SDS til 0,1%) på tris-borat-agarose-geler (0,8% borat) en elektroforese, jfr. Collins, Current Top.
5 Microbiol. Immunol., 78, 121-170 (1977). Ud fra de første 12 prøver og endvidere ud fra prøverne blandt de resterende 40 prøver, ved hvilke tilstedeværelsen af plasmider større end pJC 703 konstateres, fremstilles der superhelikal DNA. Disse DNA-syrer og i nogle tilfælde produkterne fra et andet pak-10 ningstrin undersøges mere omhyggeligt, idet der anvendes følgende spaltningsenzymer: Bglll, KpnI. Sall, EcoRI og
Hindlll.
Hovedparten af plasmiderne falder i én af de følgende tre størrelsesklasser: 17,3 Md, ca. 24 Md og ca. 29 Md (efter 15 en elektroforese af superhelikale molekyler i agarose-geler med pJC 703 og pJC 802 (25 mD) som molekylvægts-markeringer).
Ved spaltningen med en speciel nuclease giver disse større plasmider lige så store bånd som udgangsplasmiderne og et yderligere bånd. Bortset fra dette nye bånd fastslås det, 20 at båndene fra HindIIIB-fragmenterne (B) i sammenligning med båndene fra HindIIIA-fragmenterne (A) fremkommer med større intensitet.
Størrelsens indflydelse på virkningsgraden af cosmid-hvbrid-25 -pakningen
Det er åbenbart, at cosmidet pJC 703 (17,3 Md) in vitro er meget mindre hyppigt pakket end dets større hybridderivater. Denne høje procentdel af pakningen af store hybrider viser, at størrelses-selektionen også indtræder ved med 30 restriktions-endonuclease spaltet og derpå igen koblet DNA.
Denne størrelsesafhængighed prøves også under anvendelse af cosmidet pJC 720 (16 Md), der indeholder et enkelt Hindlll--sted (fig. 1), til kloning af fragmenter af R-faktoren Rldrd-19 (forsøg 3 i tabel II) . Hindlll-fraqmenterne af 35 disse plasmider har følgende størrelser: 42,8, 11,5, 2,9, 2,0, 1,95, 1,8, 0,15 og 0,1 Md, jfr. Biohm, Proc. 2nd Int.
16
DK 159121 B
Symp. Microbiol. Drug Resist., Bd. 2, Tokyo 1977. Det 11,5 Md store fragment bærer genet for ampicillin-resistensen. Det fastslås, at også 90% af de afprøvede rifampicin-bestandige kloner er ampicillin-bestandige og i det mindste bærer det 5 11,5 Md store HindIII-fragment af Rldrd-19. som på ny anven des. Heraf fremgår en meget kraftig størrelses-selektion, ved hvilken de 27,5 til 29,5 Md store hybrider med hensyn til pakningen og transduktionen foretrækkes i forhold til de 17 til 18 Md store hybrider. Derimod giver transf ormat io-10 nen med den samme DNA nogle rifampicin- og ampicillin-bestandige hybrider.
Endelig anvendes der i forsøg 4 (Tabel II) pJC 720 til kloning af fragmenter af chromosomal DNA fra Pseudomonas AMI, der delvis er spaltet med Hindlll. De fleste af de 15 første afprøvede 32 kloner bærer nye DNA-fragmenter af en størrelse svarende til 4 til 14 Md, idet flertallet af fragmenterne bærer en størrelse på mere end 7 Md. På basis heraf kan nogle hundrede af de opnåede kloner danne en gen-bank af chromosomal Pseudomonas-Aml-DNA i Escherichia coli, jfr.
20 - Clarke & Carbon, Cell, 9, 91-99 (1976).
Ved pel”-stammen afhænger virkningsgraden af DNA— injektionen af størrelsen af Lambda-DNA'en, jfr. Emmons, J. Molec. Biol., 93, 511-525 (1974). Når pel~-stammen anven-des som værtsstamme for med Hindlll spaltet, igen sammenknyt-25 tet og pakket pJC 703, konstateres der en endnu kraftigere størrelsesafhængighed. Af 28 afprøvede kloner har 19 plas-mider i området fra 24 til 25 Md, og 8 har plasmider i området fra 29 til 30 Md, idet bestemmelsen gennemføres ved gelelektroforese af klare lysater. Et enkelt plasmid har en 30 udgangs størrelse på 17 Md. Det konstateres, at alle større plasmider (23,6 og 29,9 Md) har formen ABB resp. ABBB (spaltning med Sall og EcoRI) , således som konstateret under anvendelse af N 205 som værtsstamme.
17
DK 159121 B
Pakning af cosmid-hybrider som meget virksomt klonings-system for store DNA-fragmenter (sammenligning med transformationssystemet og Hohn & Murray-transduktionssystemet 5
Det har vist sig, at pakningen af plasmid-DNA i bak-teriophag-Lambda-partikler kan anvendes som en metode til fremstilling af plasmid-hybrider i størrelsesområdet fra 20 til 30 Md, når der anvendes plasmid-DNA, som in vitro er 10 sammenknyttet med fremmed-DNA-fragmenter. Udbyttet af kloner med et indhold af disse hybrider er især i den større størrelsesklasse flere hundrede resp. flere tusinde gange bedre end ved den gængse transformation. Ved anvendelsen af små plasmider, der næppe transformeres, elimineres endvidere de 15 medløbende, ikke-hybridiserede kloner virksomt i ét enkelt trin, uden at man må modificere DNA-substraterne eller benytte selektionerings- eller udlæsningsarbejdsmetoder, der normalt anvendes ved kloningsforsøg.
Anvendelsen af cosmider i dette system kan med stor 20 fordel sammenlignes med den in vitro udførte pakning af lambda-klonings-vektorer, som uafhængigt af størrelsen af DNA ligger i området fra 24 til 28 Md (Hohn & Murray, Proc.
Nat. Acad. Sci. USA, 74, 3259-3263 (1977) , og ved hvilken den gængse størrelsesafhængige selektion for lambda-hybrider 25 ikke kan anvendes, såfremt der ikke gennemføres en anden infektionscyklus ("infectious cycle"). Med hensyn til normal størrelsesafhængig selektion for lambda-hybrider kan der f.eks. henvises til Thomas, Cameron & Davis, Proc. Nat.
Acad., Sci. USA, 71, 4579-4583 (1974), Murray & Murray, 30 Nature, 251. 476-481 (1974), Murray, Brammar & Murray,
Molec.gen. Genet., 150. 53-61 (1977) og Blattner, Williams,
Blechl, Denniston-Thompson, Faber, Furlong, Grundwald,
Kiefer, Moore, Schumm, Sheldon & Smithies, Science, 196.
161-169 (1977). En sådan anden cyklus medfører risiko for 35 fremstillingen af tvillingkloner og selektivt tab af nogle hybrider, jfr. Cameron, Panosenko, Lehman & Davis, Proc.
Nat. Acad. Sci. USA, 72, 3416-3420 (1975). I området fra 24
DK 159121B
18 til 31 Md er der dog beskrevet en størrelsesafhængighed for et in vitro-pakningssystem (Sternberg, Tiemeier & Enquist,
Gene, ,1*. 255-280 (1977), men der sættes dog en lavere størrelsesbegrænsning for vektoren gennem fordringen til bak-5 teriophage gener til plaque-dannelse. Denne størrelsesafhængighed tillader fremstillingen af en transduceret population, ved hvilken 5-10% af alle plaques indeholder hybrid-phager, jfr. Sternberg, Tiemeier & Enquist, Gene, 1, 255-280 (1977).
Til forskel herfra fås der ved forsøgene 3 og 4 (Tabel II) 10 i det væsentlige kun hybrider.
Tabel II (sammenligning med transformationssystemet):
Virkningsgrad af transformation og pakning af plas-mider med cos-steder før og efter spaltning med Hindlll og 15 sammenknytning med DNA-ligase.
Det materiale, der skal transformeres eller (efter pakningen) transduceres, udvælges til et medium med et indhold af rifampicin. Udbytterne er udtrykt som rifampicin--resistente kolonier pr. /tg anvendt DNA. Ved forsøg 1 ved-20 rører procentdelen af hybrid-kloner kloner med mere end én kopi af HindIII-fracnnentet. Ca. 90% af de rifampicin-resi-stente kolonier fra forsøg 3 indeholder ligeledes HindTII--fragmentet (11 Md) fra Rldrd-19, som endvidere bærer en ampicillin-resistens.
25 Virkningsgraden af pakningen af lambda-b2-DNA ved parallelforsøg andrager ca. 107 til ca. 108 pFU pr. μg anvendt DNA.
19 DK 159121 B
Tj O O o β m cn ολ
β cfiP
Λ · · · >i tf ni fd !U O 0 0
G
O I
β II -H
β β
Ml U A
β β ri« Q) >i Ό (liS'Hil ω β § β i
β Bl H O (I) "3* rO
tf β enH M o o
β Bl 3 OM Η H
β Φ \A! -ri X X
β β ^ ^ tT> β <D <D *1· - O -γΙίΗγΗ CM cm cm
O β Η β ·» O
&i β 0 tf Φ m H ro ro β ftH Ό σ ο o ! β g Ο · -Η ι—I X Η Η
β tf A! ω β X X
Α! β > Λ β ο ο oo X
β β φ >0 >ι Φ * ·* - Αη ρβ +-»— ,β Ό β β ή m Ό i -β Ό.
β ύ? Ο β m Λ Μ Οπβ Ή > λ; m ο β Κ -β β > Ο ο -β + -μ ι β Ο β g I I Η φ ~ Η β Φ Ο Ο Ό β -β Η 0 β γΗ Α! β Φ Ο β 0 (β β Ό ro > βωβΑΙβΦ,ββ ο «· Ο β ·β Ρ Η >ι β Η cm β β tf ο Φ β ,β Λ ο ft ιβ β rtiJ Dm! >ι X 1-1 β EH EH Dj β 3 II tf
g (UV · I β X
βββωβφ - o m w φ > φ α: η h a: -β -β -β Ό -β μ ο *» α: βΙωβ^β-βοο •μ1 -β •β I ί ι ω β β βιβ Λ-< J^-:-- 0) Ο β (!) Ο -β ·β β β -Ρ ι—ι β ο ο νο r- ο m Ο tf Λ -β ο m Η ro γ·~ g « β 0 β m Η ro ρ I -Ρ Α! -Ρ ι -ρ i Η β 0) ! >1 tf Ό ^ Α! · -β *0 ro ; α) β g g Η tji w '— t-» >χ> Ο g Ο β β β g > Ο β β Φ I β Φ β β Φ g β Φ β g ίβ g β tf β β g >1 Β1Μ φ β β --- β ta Μ ω η Ν ι β ----. tf η Φ >ι Λ βΗ χββ Χ+Χ X + Ο Ό riJ Η β -— Α! ΗΟϊΗ Η g β ζ ro Η tf β β ΟΗ βΗ ΟΗ Ο Η ρ Ο Η ft Φ φ ΙΝΗ Ό Η CM Η fl Κ
Γ" Ό ω Β Γ'Ό β Ό η3 3 X
0)β Φ S Od Ό β Οβ φβ Ι~3 β CM β tf Ρ ·Η Η β β) β W g
ftM^CflM ft Μ Pi PC ft P! ft<C
β tr> · O -S β [β ω β β ro
Claims (3)
1. Fremganglsmåde til fremstilling af hybrid-bakterier under pakning af en dannet hybrid-DNA med lysatet af en lambda- eller lambdoid phag og transducering af pakningspro-5 duktet i Escherichia coli, kendetegnet ved, at man (a) spalter et bakterielt plasmid på ikke mere end 21 Mega-dalton med et eller flere cos-steder af en lambda- eller lambdoid phag og med hver gang kun ét spaltningssted for 10 hver restriktions-endonuclease, i nærværelse af én eller to restriktions-endonucleaser, (b) kobler det spaltede plasmid med et DNA-fragment i nærværelse af en ligase til et hybrid-plasmid, (c) pakker det dannede hybrid-plasmid med lysatet af en 15 lambda- eller lambdoid phag og (d) transducerer pakningsproduktet i Eschericia coli under dannelse af hybrid-bakterier.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes et plasmid med ikke mere end 20 ca. 18 Megadalton og/eller med kun ét cos-sted.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at man i trin (a) anvender et kun på ét sted i nærværelse af en restriktions-endonuclease spaltet plasmid, der er koblet med et DNA-fragment, som i trin (a) 25 kun ved ét sted lader sig spalte i nærværelse af en anden restriktions-endonuclease.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2814039 | 1978-03-31 | ||
| DE2814039A DE2814039C3 (de) | 1978-03-31 | 1978-03-31 | Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Bakterien |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK131279A DK131279A (da) | 1979-10-01 |
| DK159121B true DK159121B (da) | 1990-09-03 |
| DK159121C DK159121C (da) | 1991-02-11 |
Family
ID=6035887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK131279A DK159121C (da) | 1978-03-31 | 1979-03-30 | Fremgangsmaade til fremstilling af hybrid-bakterier |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4304863A (da) |
| JP (1) | JPS5922512B2 (da) |
| AT (1) | AT368548B (da) |
| CH (1) | CH642396A5 (da) |
| DE (1) | DE2814039C3 (da) |
| DK (1) | DK159121C (da) |
| FR (1) | FR2421214A1 (da) |
| GB (1) | GB2017754B (da) |
| PL (1) | PL138313B1 (da) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6270955B1 (en) | 1978-12-22 | 2001-08-07 | Biogen, Inc. | Pharmaceutical compositions and methods for producing antibodies to hepatitis b virus and kits and methods for detecting antibodies to hepatitis b virus |
| JPS55156591A (en) * | 1979-05-23 | 1980-12-05 | Ajinomoto Co Inc | Method for stabilizing property of bacteria containing plasmid |
| JPS57146571A (en) * | 1981-03-09 | 1982-09-10 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Killer yeast |
| US5236831A (en) * | 1981-12-29 | 1993-08-17 | Kiowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Amino acid synthesis in corynebacteria using E. coli genes |
| US4476227A (en) * | 1982-10-06 | 1984-10-09 | Smithkline Beckman Corporation | Cosmid cloning vectors |
| US4634678A (en) * | 1982-12-13 | 1987-01-06 | Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership | Plasmid cloning and expression vectors for use in microorganisms |
| US4661450A (en) * | 1983-05-03 | 1987-04-28 | Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership | Molecular cloning of RNA using RNA ligase and synthetic oligonucleotides |
| US4735800A (en) * | 1983-09-09 | 1988-04-05 | Molecular Genetics, Inc. | Vaccines against rift valley fever virus |
| US4808700A (en) * | 1984-07-09 | 1989-02-28 | Praxis Biologics, Inc. | Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers |
| US5308835A (en) * | 1984-07-09 | 1994-05-03 | Praxis Biologics, Inc. | Production of the E. coli LT-B enterotoxin subunit |
| DE3572510D1 (de) * | 1984-09-27 | 1989-09-28 | Lilly Co Eli | Recombinant dna cosmid shuttle vectors |
| US4921801A (en) * | 1984-09-27 | 1990-05-01 | Eli Lilly And Company | Novel recombinant DNA cosmid shuttle vectors |
| DK171119B1 (da) * | 1985-04-19 | 1996-06-17 | Hoffmann La Roche | AIDS-viruskappeprotein, ekspressionsvektor bærende viruskappeproteinet, transformanter transformeret med ekspressionsvektoren, fremgangsmåde til fremstilling af viruskappeproteinet, fremgangsmåde til detektion af AIDS-antistoffer, fremgangsmåde til bestemmelse af AIDS-virus, vaccine mod AIDS, antistoffer mod viruskappeproteinet samt anvendelse af dette til fremstilling af en vaccine og til testnin |
| US5773210A (en) * | 1985-04-19 | 1998-06-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Acquired immune deficiency syndrome (AIDS) viral envelope protein and method of testing for AIDS |
| US4925784A (en) * | 1986-04-04 | 1990-05-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein |
| US4992367A (en) * | 1986-05-12 | 1991-02-12 | Hoffmann-La Roche Inc. | Enhanced expression of human interleukin-2 in mammalian cells |
| US5306493A (en) * | 1986-10-03 | 1994-04-26 | Miles Inc. | FeLV-infected feline cell line |
| US6348332B1 (en) | 1987-11-24 | 2002-02-19 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | DNA molecule encoding gonorrhoeal hybrid PIA/PIB protein |
| CA1340506C (en) * | 1987-11-24 | 1999-04-20 | Nicholas H. Carbonetti | Production of gonorrheal pi proteins and vaccines |
| ZA893740B (en) | 1988-06-03 | 1990-02-28 | Hoffmann La Roche | Recombinant coccidiosis vaccines |
| US5079165A (en) * | 1988-06-29 | 1992-01-07 | Praxis Biologics, Inc. | Production of the E. coli LT-B enterotoxin subunit in S. typhi |
| US5223409A (en) * | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
| CA2000878C (en) | 1988-10-18 | 1999-06-29 | Jean-Pierre Kinet | Cdnas coding for the subunit of the high-affinity receptor for immunoglobulin e |
| US7413537B2 (en) * | 1989-09-01 | 2008-08-19 | Dyax Corp. | Directed evolution of disulfide-bonded micro-proteins |
| AU8740491A (en) * | 1990-09-28 | 1992-04-28 | Protein Engineering Corporation | Proteinaceous anti-dental plaque agents |
| DE69233769D1 (de) * | 1991-03-01 | 2009-09-24 | Dyax Corp | Chimäres Protein mit Mikroprotein mit zwei oder mehr Disulfidbindungen und Ausgestaltungen davon |
| DE19542051C2 (de) | 1995-11-10 | 2000-03-23 | Asta Medica Ag | Gentechnisch veränderte tumorigene Zellinien und Verwendung derselben für die Testung von Antitumor-Wirkstoffen |
| WO1999001387A1 (en) | 1997-07-04 | 1999-01-14 | Krüger A/S | Method for biological purification of waste water by the activated sludge method and apparatus for carrying out the method |
| EP1027293B1 (en) | 1997-09-16 | 2001-07-25 | Krüger A/S | A process for biological purification of waste water with reversing operation |
| CN107072963B (zh) | 2014-09-03 | 2020-07-07 | 吉倪塞思公司 | 治疗性纳米粒子和相关的组合物、方法和系统 |
-
1978
- 1978-03-31 DE DE2814039A patent/DE2814039C3/de not_active Expired
-
1979
- 1979-03-27 FR FR7907602A patent/FR2421214A1/fr active Granted
- 1979-03-28 JP JP54035732A patent/JPS5922512B2/ja not_active Expired
- 1979-03-29 AT AT0234379A patent/AT368548B/de not_active IP Right Cessation
- 1979-03-30 CH CH299379A patent/CH642396A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-03-30 GB GB7911241A patent/GB2017754B/en not_active Expired
- 1979-03-30 DK DK131279A patent/DK159121C/da not_active IP Right Cessation
- 1979-03-30 PL PL1979214512A patent/PL138313B1/pl unknown
- 1979-03-30 US US06/025,719 patent/US4304863A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK159121C (da) | 1991-02-11 |
| DK131279A (da) | 1979-10-01 |
| CH642396A5 (de) | 1984-04-13 |
| JPS5558091A (en) | 1980-04-30 |
| ATA234379A (de) | 1982-02-15 |
| FR2421214B1 (da) | 1984-07-20 |
| FR2421214A1 (fr) | 1979-10-26 |
| DE2814039B2 (de) | 1980-05-29 |
| PL214512A1 (da) | 1980-02-25 |
| GB2017754A (en) | 1979-10-10 |
| AT368548B (de) | 1982-10-25 |
| JPS5922512B2 (ja) | 1984-05-26 |
| DE2814039A1 (de) | 1979-10-11 |
| US4304863A (en) | 1981-12-08 |
| GB2017754B (en) | 1982-07-07 |
| PL138313B1 (en) | 1986-09-30 |
| DE2814039C3 (de) | 1981-02-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK159121B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af hybrid-bakterier | |
| Gryczan et al. | Molecular cloning of heterologous chromosomal DNA by recombination between a plasmid vector and a homologous resident plasmid in Bacillus subtilis | |
| AU2020267249A1 (en) | Genome editing using campylobacter jejuni crispr/cas system-derived rgen | |
| EP3091072A1 (en) | Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof | |
| Baty et al. | Extracellular release of colicin A is non‐specific. | |
| Jacobs et al. | In vivo repackaging of recombinant cosmid molecules for analyses of Salmonella typhimurium, Streptococcus mutans, and mycobacterial genomic libraries | |
| CN114410625A (zh) | 通过Cas9-crRNA复合物的RNA指导的DNA裂解 | |
| Cue et al. | A site required for termination of packaging of the phage lambda chromosome. | |
| US4332900A (en) | Construction of co-integrate plasmids from plasmids of Streptomyces and Escherichia | |
| JP2023542976A (ja) | カーゴヌクレオチド配列を転位させるための系および方法 | |
| US4338400A (en) | Co-integrate plasmids and their construction from plasmids of Escherichia and Streptomyces | |
| CN120359023A (zh) | 包含脂质纳米颗粒或脂质重构的天然信使包的rna组合物 | |
| US4340674A (en) | Cointegrate plasmids and their construction from plasmids of Escherichia and Streptomyces | |
| US20240301374A1 (en) | Systems and methods for transposing cargo nucleotide sequences | |
| Watson et al. | Cloning of the ColE3-CA38 colicin and immunity genes and identification of a plasmid region which enhances colicin production | |
| EP0035914A2 (en) | Plasmid vectors, plasmids and their preparation, and cloning processes using them | |
| EP1041141A1 (en) | A novel bacteriophage, a process for the isolation thereof and a universal growth medium useful in the process thereof | |
| Hermesz et al. | Stable incorporation of genetic material into the chromosome of Rhizobium meliloti 41: construction of an integrative vector system | |
| JP2003235565A (ja) | 乳酸菌用シャトルベクター | |
| Barany et al. | Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by DNA cloned into the single-stranded bacteriophage f1 | |
| EP0218468A2 (en) | Safe, versatile cloning vector | |
| EP0115936A1 (en) | Chimeric plasmids | |
| Pettijohn et al. | Chemical, Physical, and Genetic Structure of Prokaryotic | |
| Rivosecchi | Sen1-mediated RNAPIII transcription termination controls the positioning of condensin on mitotic chromosomes | |
| Hickson et al. | Construction of recombinant λ phages that carry the E. coli recB and recC genes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired | ||
| PUP | Patent expired |