Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia hybrydowych bakterii.Mozliwosci stosowania technologii genów w tech¬ nice sa olbrzymie, jezeli wezmie sie pod uwaga mozliwosci wprowadzania do róznych bakterii DNA pochodzacego z dowolnego zródla, np. z innych batoteriii, z drozdzy, gtrzybów, zwierzait i ludzi. Po¬ stepy w chemii DNIA sprawilaja, ze zastosowanie technologii transplantacji DNA w celu wytwarza¬ nia hybrydowych batoteri, które z obcym DINA mo¬ ga dawac produkty o gospodarczym znaczeniu, jest tylko kweistia czasu. Bardzo duze znaczenie tech¬ niczne mia np. wytwarzanie ludzkiego hormonu lub grzybowego antybiotyku przez dajaca sie laflwo hodowac wzglednie fermentowac bakterie, np. ta¬ ka jak Escherichlia coli.(Frzeglajd znanych sposobów transformacji podaje Colinis w publikacji Ourrent Top. Microbiol. Im- munol., 718 (1977) 101^-170, 129. Hohn i Murray opisuja w Proc. Nlat. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 3)215*9^30613 upakowywande DNA Iaga lambda i fa¬ gów lambdoidowych. kombinowanych (sprzezonych) z fragmentami obcego DNA, w otoczki faga w celu wyftwarzania in viitre nowych bakterii hybry¬ dowych. Schemait tych znanych sposobów jest na¬ stepujacy: /l. System transformacji dowolny fragment DNA (DNA faga lambda (w skrócie lambda DNA) nosnik = wektor (czyHi lambda DNA „noszacy" fragment obcego DNA) + Ejcoli bakterie 25 30 transformacja hybrydowe 2. System upakowywania/lransdukicji (Hohn i Murray) dowolny fragment DNA (lambda DNA) + otoczka fage produkt ^upakowania + Ejcoli nosnik = wektor upakowanie -?bakterie hybrydowe io transdukcja Te znane sposoby mlaja jednak wady z pumkttu widzenia ich sprawnosci wzglednie wydajnosci, to¬ tez zadaniem wynalazku jest opracowanie proce¬ su przebiegajacego sprawniej: 15 Wedlug wynalazku sposób wyitwarzania bakterii hybrydowych droga upakowania plateimidu hybry¬ dowego z lizatem faga lambda lub larnbdoidowego i tranisdukcjd produktu upakowania do Bscherichda coli, polega na tym, ze stosuje sie hybryidowy plaz- 20 mid otrzymany z bakteryjnego .plazmidu o nie wie¬ cej niz okolo 21 rnegadiaOitonach i tyflko jednej sekwencji cos faga lambda lub lambdoidowego i z fragmentu DNA nadajacego bakterii zadana wla¬ snosc.W sposobie wedlug wynalazku korzyistnie stosuje sie hybrydowy plazmid otrzymany przez decie plazmidu majacego tylko jedno miejsce ciecia dla kazdej endonukleazy restrykcyjnej, w obecnosci Jednej lub dwóch endonukleaiz restrykcyjnych i sprzeglanie w obecnosci ligazy. 138 3133 138 313 4 Pojecie plazmidu jest wyjasnione blizej przez Collinsa w Cutrreart Top. Micsobiol. Immumol., 78 (¦19717) ll2il—il7l0, str. 102 i tam tez podano dalsza li¬ terature. Wytwarzanie plazmidów jest znane fa¬ chowcom. Mozna je wyttwarzac nip. meltoda Olewell i HeOitasky, Blochem. 9 (Ii97i0) 441281 lUM lub w sposób analogiczny. Do oznaczania wielkosci plaz¬ midów mozna, stosowac zwykle metody analitycz¬ ne, pn. metode zelowej elektroforezy, podana np. uprzez OoMiimsAa w Corrent Top. Microbiol. Immiu- nol., 7i8 (1977) lfcl—(170, fig. 3—5 na str. 140-^142.Sekwencja cos oznacza rejon rozpoznawany przez uklad ipakujacy DNA do otoczki. W przypaidku fa- ga*lan«bdaJ sekwencja cos oznacza rejon wykazuja¬ cy polaczone lepkie konce.: W procesie wedlug wynalazku stosuje sie plaz- tófefy/w kftore wbudowano rejon cos tak, ze i te ^lazm^y^^lWiieraija rejon cos. Plaemtiidów nie za¬ wierajajcych tego rejonu nie mozna upakowywac.W celu wytwarzania plazmiidów zawierajacych re¬ jon cos, mozna stosowac metode Collins, Fili, J0r- gansen i Friescen, Oonftrol of Riibosome Syinthesis, Alfred Beinzon Symp. IX, Muimksgaard, str. 3i56»— 3'69, wydawnictwo Maaloe S Kjeldgaard, Kopen¬ haga, 19716, albo metody analogiczne. W publikacji tej sekwencja cos jest oznaczona w tablicy 3 sym¬ bolem m'm. Odnosnie stwierdzenia obecnosci tej sekwencji i ustalania ich liczby patrz np. Michols i Donedson, J. Viirology, 26 (1«W 429^314. Sposób wedlug wynalazku nie jest naturalnie ograniczo¬ ny tylko do stosowania plazmidów otrzymanych wyzej opiisanym sposobem luJb metodami analogi¬ cznymi. Mozna tez np. stosowac pochodne tych plazmidów, a wiec plazmidy zmodyfikowane w stosunku do iplaizmidów wyjisctiowych.Znane enzymy restrykcyjne sa opisane mp. przez Roberta w GRC Crit. Rev. Biochem., 4 (1976) 103—1KJ4. Silosowanie endonukleaz restrykcyjnych jest znane, patrz nip. Cohen, Chang, Boyer i Hell- ing, Proc. Natl. Acad. Scd. USA, 70- (19(713) 31240^- 31244 i Collins, Current Top. Microbiol. Immunol., 78 (J1977) 112)1—OTO, zwlaszcza str. Ii24. Zwyklymi mte-todamd analitycznymi, np. metoda zelowej elek¬ troforezy, -mozna ustalic, czy plazmid ma jedno lub wdeksza liczbe miejsc ciecia w odmies;endu do okreslonego enzymu restrykcyjnego. Na przyklad, w przypadku jednego miejsca ciecia wytwarza sie tylko jeden prodlukt ciecia, podczas gidy przy dwóch miejscach ciecia otrzymuje sie dwa fragmenty.Stwierdzono, ze pewnych plaizmidów nie mozna w ogóle ciac za pomoca okreslonych enzymów re¬ strykcyjnych. W celu umozliwienia stosowania zgodnie z wynalazkiem jednak i takich enzymów restrykcyjnych korzystnie mozna postepowac w ten sposób, ze plazmid tnie sie za pomoca enzymu re¬ strykcyjnego w jednym miejscu i równolegle mozna z obcego DNA wycinac fragiment, który moze byc w jednym miejscu oiety przez iirmy enzym restryk¬ cyjny, który nie tnie plazmidu. Nastejpnie frag¬ ment obcego DNA sprzega sie z rozcietym plazmi¬ dem, uzyskujac pflazmid hylbrydowy, który juz mozna cdac w jednym miejscu takze i za pomoca innego enzymu restrykcyjnego.Fragment dbcego DNA, który zgodnie z proce¬ sem wedlug wynalazku sprzega sie z plazmidem, jest fragmentem, który wytwarzanej bakterii hy¬ brydowej nadaje zaidana wlasciwosc.Sprzeganie w obecnosci ligazy mozna prowadzic np. metoda Cohen Chang. Boyer i Helliing, Proc. 5 Natl. Acad. Sci. USA 70 (1973) 321410—321414 luib me¬ todami analogicznymi. Przy wytwarzaniu hybry¬ dowych plazmidów uwzglednia sie tez wszystkie metody zestawione przez Collins'a w Current To- pies Microbiol. Immunol., 718 (1977) U2)l—170, stro¬ na 1126.Do wytwarzania lizatu faga mozna stosowac fa¬ gi laimibdoidowe, np. Phi 80. Do wytwarzania liza¬ tu faga, do uipakowywanaia i do transdukcji mozan stosowac metode Hohn i Murray, Proc. Nat. Acad.Sci. USA, 74 (1977) 3l250^-^3j26l3 lub analogiczne me¬ tody.W celu okreslenia wydajnosci procesu prowadzo¬ nego sposobem wedlug wynalazku stosuje sie zna¬ ne metody analitycz*ie obliczania wytworzonych bakterii hybrydowych. Wybiera sie przy tym jed¬ na ceche hybrydowej bakterii odpowiednia do prze¬ prowadzenia selekcji np. odpornosc na dzialanie antybiotyków, np. talklich jak ryfampdcyna lub am¬ picylina, przy czym korzystnie wybiera sie ceche zakodowana przez plazmid.Sposobem wedlug wynalazku proces prowadzi sie in vitro.Zaleta sposobu wedlug wynalazku w porówna¬ niu ze znanym systemem transformacjli jest to, ze przy transdukcji uzyskuje sie wyzsza wydajnosc procesu i mozna transdukowac wieksze fragmen¬ ty obcego DNA, np. wieksze niz 2 Md, zwlaszcza 3 Md i wieksze, korzystnie 5 Md luib wieksze, przy czym górna granica wielkosci zalezy od systemu upakowywania i systemu transdukowainia. Zgod¬ nie z wynalazkiem mozna hybrydy plazmid — DNA wprowadzac do zywych bakterii co najmniej 100 razy lepiej niz to jest mozliwie przy stosowa¬ niu znanego sposobu transformacji, a w przypad¬ ku wiekszych hyibrydowych plazmidów nawet co najmniej 1 ODO do lWOOO razy Jepiej (patrz Collins, jak wyzej, 170). Te lepsza sprawnosc w przypad¬ ku duzych hyibrydowych plazmidów przypisuje sie bardzo silnej przeciiwseleksgi, wystepujacej przy wprowadzaniu wieklszych czasteczek.Szczególna zailete sposobu wedlug wynalazku w porównaniu ze znanym sposobem uipakowywania i transdukcji z wektorami lambda jest nieznacz¬ na wielkosc wektorów plazmidowych, co umozliwia uipakowywanie duzych fragmentów obcego DNA.Nieoczekiwanie wysoki udzial hybrydowych bak¬ terii uzyskiwanych w procesie prowadzonym spo¬ sobem wedlug wynalazku znacznie ulatwia dalsze zabiegi, podczas gdy w znanych procesach zabie¬ gi selekcjonowania i wyodrebniania sa klopotliwe.Wedlug wynalazku korzystnie stosuje sie plaz¬ mid o nie wiecej niz okolo 13 megadaltonach. W przypadku takich plazmidów, w odróznieniu od plazmidów hybrydowych, sam plazmid uipafcowu- je sie i transdukuje znacznie gorzej, totez wyste¬ puje szczególnie sdUna selekcja na korzysc plaz¬ midów hybrydowych (patrz Oolins i Briiniing, Ge- ne 4 (191718) 85^-107.W sposobie wedlug wynalazku stosuje sie plaz¬ mid o tylko jednej sekwencji cos i moznosc pro- 15 20 25 30 33 40 45 50 55 60138 313 wadzenia procesu wedlug wynalazku w takim wla¬ snie przypadku jest calkowicie nieoczekiwana, gdyz dotychczas uwazano, ze DNA tylko o jednej sek¬ wencji cos nde moze byc upakowany (patrz np.Hohn i Kats-ura, Current Top. Microbiol. Immu- nol., 78 (1977), 92 i dailsze publikacje).W zwiazku z nazewnictwem stosowanym w tej dziedzinie nalezy wskazac nastepujace prace: (1) Bachman, Low i Taylor, Baoteriol. Rev., 40 ' (.1976) 116—1167; (2) Collins, Current Top. Microbiol. Immunol., 78 (19T77) 121^170; (3) Collins i Hohn. Proc. Naft. Acad. Sci. 715 (1-9T76) 4i2i4J2—4i24)6; (4) Emmons, Maccoshau i Baldwin, J. Mol. Biol., 911 (1M5) 13t3—14i6; (5) Hershey, Tihe Baoterophage Lambda, wyd. Cold Spring Barber Lab. (H9T71) 773—77^; (6) Novick, Cloiwes, Cohen, Curtiss, Datta i Fal¬ ków. Bactterdod. Rev., 410 (107)6) 168—1819; (7) Roberts, CRC Crit. Rev. Biochem. 4 (1976) 123—1.64.Stosowane skróty ATP/= 5'trójfosforan adenozyny (lamibda) b2 = bakterio¬ fagi lambda b2 Bacta—Tryptone/= wyciag proteinowy pro¬ dukcji firmy DIFCO Laboratories) 1 Bgl II = enzym restryk¬ cyjny Bgi II z Bacilius megaterium 890 Clts (wrazliwosc na tem- .peraiture represora bak¬ teriofaga lambda) Gol El = gen plazmidowy dla kolicyny Ei 1 D = Gen D bakteriofaga lamlbdia (wspólodpowie- dziaitaiy za tworzenie glówki faga) Dwutiotreitol = 1,4-dwu- merkaptobuitanodiol-S^ E = gen E bakteriofaga lamlbda (wispólodpowie- dteiaflny za tworzenie giówki faga) EcoRI = enzym restryk¬ cyjny Eco RI Hiod III = enzym re¬ strykcyjny Hind III t + hem — = aktywnosc lv modyfikujaca gospodarza 1 (DNA-metylaza Ejcold K) Cytowana wyzej literatura Numer | Strona 1 5 7 5 6 5 5 2 2 1 779 6 778 162 778 778 L30 pozycja 98 | 10 15 20 25 35 40 45 55 Stosowane skróty hsr — = aktywnosc K restrykcyjna gospodarza (endonukleaza E.coOi K) 1 imim434 = odcinek DiNA bakteriofaga lambda wa¬ runkujacy odpornosc, któ¬ rego nde mozna wbudo¬ wac do hybrydu z odpor¬ noscia 4faga 4134 Kpn I — enzym restryk¬ cyjny Kpn I z Klebsiella pneuimoniae OK8 + leu —= gen warunkujacy synteze 1 leucyny pel —= gen warunkujacy synteze | sciany komórkowej |PFU = jednostka infek¬ cyjnosci faga pro —= gen warunkujacy, synteze proliny Putrescyna = dwuami- nobutan [Czynnik R~^DNA wa¬ runkujacy odpornosc na antybiotyki rec A —= gen warunkujacy zdolnosc do genetycznej rekombinacji i reperacji uszkodzen popromiennych red 3 =^ mutacja w genie red (odpowiedzialny na specyficzny uklad rekom- binacyjny bakteriofaga lamibda) rpo B = gen kodujacy p-podjednostke polime- razy RNA S. (gen) S, S Lysis = S gen bakteriofaga lamlbda odpowiedzialny za lize komórki Sal I = enzym restryk- 1 cyjny Sal I Spermidyna = N-/3-ami- 1 nopropylo-1,4^butano- dwuamina | Cytowana wyzej literatura Numer 1 1 5 7 | 1 1 4 1 6 | 1 5 1 | 6 S Strona 130 pozycja 98 7715 1 11 131 133—146 134 | 172 cytat 19 135 1 778 | 136 778 | V 1138 313 s Stosowane skróty + bu —= supresor Iris = trój/hydiroksyime- tyWnamihometan + thii —= gen wa¬ runkujacy synteza tia- sminy + thr —= gen wa¬ runkujacy synteze tfeoniny Cytowana wyzej literatura Niuimer | Strona 1 1 137 137 137 10 15 Benson Symp. IX, Mumksgaard, str. 3l5r6—<36d, wyd.Maclfle Kjeldgaard, Kopenhaga Ii9f76 i Collins i wsjpólpracownficy, Davis and Novik, Microbiology, Ani. Soc. Mkrobdol., Washington 19T7B.Baikterie Sftosowane baklterie, ich cechy, miejsce zdepono¬ wania i znaki, pod którymi sa zdeponowane po¬ dano w tablicy 1.Upakowywanie metoda Hohn i Murray.Wariant 1.Egzogenny DNA uipakowywano in viltro metoda Hohn i Murray (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74 (li977) 3i260—3(2613), stosujac nastepujace, niewielkiie zmiany. Pojedyncze kolonie szczepów N20i5=BHB 2690 i N120f5=BiHIB 2S8B rozsimarowywano na plylt- kach LA i pozostawiano na noc w temperaturze 30°C, umozliwiajac ich wzrost. Plytki LA sa omó- wiione w pracy Hohn i Hohn, Proc. Nat. Acad. Sci.USA, 71 (1974) 231712^2376. Na plytki nanoszono równiez próby porównawcze, w celu zbadania wrazliwosci na cieplo w temperaturze 42°C. Po¬ jedyncze kolonie zaszczepiono w cieplym srodowi- Tablica 1 Szczep i) Gscherichia coli N20&=BHB 2600 N205=BHB 2688 9K | HB 101 GL ipel 31W 3 101 CC 703 CC 720 ii) Piseudomonas spec.| AM i Cechy Szczep K 12 hsrk+, hsmk+, recA-, su-; (ilamlbda imm43^0It^b2 redi3 Eam4 Sam7) (ilamlbda Szczep K 112 hsrk+, hsmk+, recA~, su—; (lambda imm«4CItffo2 re,dj3 DamT5 Sam7) (lambda. hsrk", hsmk+, thr~, thi~ hisTk-, hswik", leu~, pro—, recA+ patrz Emmons i wspólpracownicy J. Mol. Biol., 9(1 (1976), (136^14)6) patrz Collins i wspólpracownicy Control of Riibosome Synthesis, jak wyzej s. 357 Miejisce zdeponowania DSM Gottingen DSM Gottingen DSM Gottingen DSM Gottingen DSM Gottingen DSM G&ttingen DSM GSttingen NCIB Znak, pod którym zdeponowano szczep 1450 1451 14154 1 1452 | 1453 1 1449 1448 9138 Czesc eksperymentalna POazmidy Pirójby prowadzono z dwoma plazmidami o wiel¬ kosci 17,3 i 16 Md, majacymi tyflko po jednej sekwencji cos i oznaczonymi symbolami pJC 703 i pJC 700. Przynajmniej jedna endonukleaza re¬ strykcyjna rozcinala wiekszy plazmid PJC 703 w dwóch miejscach i mniejszy plazmid pJC 720 w Jednym miejscu. Jako wyznaczniik ciezaru czast¬ kowego stosowano takie pdazmid o 25 Md, ozna¬ czony symbolem pJC 802.Wytwarzanie pfla&mddow pJC 7120 i pJC 703 (ta¬ blica 3) opisano w publikacjach: Collins i wspól¬ pracownicy, Oomitrol of Riibosome Synthesis, Alfred 05 sku LB o optycznej gestosci przy 600 miMmiikroaiach (oDeoo) wynoszacej nde wiecej niz 0415 i poddawano wstrzasowej hodowli, az do osiagniecia gestosci optycznej oDeoo wynoszacej 0,3. srodowisko (po¬ zywka) LB jest opisane w wyzej cytowanej pracy Hohn i Hohn. Pobudzanie profagów osiagano pro¬ wadzac hodowle kultur w temperaturze 45°C w oiagu 15 minut, po czym pozostawiono je w spo¬ koju, nastepnie doprowadzono ich temperature do 3T7°C i prowadzono hodowle w ciagu 3 dalszych godzin przy silnym napowietrzaniu. (Mala próbke kazdej kultury, która byla hamowana przez S lysis na skutek mutacji w genie, poddawano próbie na pobudzenie: po dodaniu kropli chloroformu kultu-9 ra stawala sie klarowna). Nastepnie obie kultury mieszano, odwirowywano w ciagu 10 minut przy 5000 obrotówi/iminulte i w temperaturze 0°C ponow¬ nie sporzadzono z nich zawiesine w Vwo pierwotnej objejbosci kultury, ufciulpelniajac roztworem bufo¬ rowym (40 mM Triis-iHlCl, wartosc pH 8,0, 10 mM cMorowodorfeu spermidyny, 10 mM chlorowodorku pultrescyny, 0,la/o merkapttoetanolu, 7% sulfotlenku dwumetylu, przy cizyim roztwór buforowy dopro¬ wadzano do stezenia ATP wynoszacego 1,5 mH).Biologiczna aktywnosc endogennego DNA mozna zniweczyc przez naswietlanie promieniami nadfio¬ letowymi przed zatezeniem. Zawiesine komórek umieszczano porcjami po 20 mikrolitrów w rur¬ kach do odwirowywania, wykonanych ze. sztucz¬ nego tworzywa i majacych pojemnosc 1,5 ml (Ep- pendorf), zamrazano w cieklym azocie i przecho- wywano w temperaturze —60°C. lUpakowywanie prowaidizono w nastepujacy spo¬ sób. W miare potrzeby jedna z wyzej opisanych próbek zawiesiny komórek umieszczano w cieklym azocie i wykladano na lód i bezposrednio po roz- tajianiu (3 do 4 minut na lodzie) dodawano DNA przeznaczony do upakowania (to jest plazmid hy¬ brydowy w ilosci 0,01—0,2 midcrjograma), majacy objetosc 1—15 mdkrolilfcra. DNA (plazmid hybrydo¬ wy) dodawano zwykle w wiazacym roztworze bu¬ forowym, w którym byl on tu)z przed tym sprze¬ gany. W miare tajania roztwory starannie mie¬ szano i usuwano peciherzyfci stosujac killkosekun- dowe odwiiTOwywaffiie w wirówce stolowej (Eppen- dorf). Mieszanine poddawano hodowli w ciagu 30 minut w temjperaturze 3T7°C i po zakonczeniu pro¬ cesu hodowania kazda próbke mieszano z 20 mi- kroliitrami zamrozonej i roatajanej mieszaniny ujpa- kowujacej, zawierajacej Mgda o stezeniu 0,01 m i do której dodano gotowej dezoksyrybonukleazy (10 rndkrograjmów na 1 ml), po czyim kontynuowa¬ no proces hodowania w ciagu 20^h90 minut w 0,5 ml buforu SMC (odnosnie buforu patrz Hohn i Hohn, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, T\l (1974) 2372— 28)76), a nastepnie dodano krople chloroformu. Po wymieszaniu odwirowano zdenaturowany material i roztwór stosowano jaiko zawiesine fagów.Proces transdukcji prowadzono w ten sposób, ze 0,4 ml tej zawiesiny fagów dodawano do 1 ml ko¬ mórek N2015 lulb komórek pel~ (wczesna faza sta¬ cjonarna, cDwo=!2,0D w brzeczce maltozowej L (lV§ Bacto-Tryptone, Oy^/o wyciagu drozdzowego firmy Oxoid, 0,5^/t NaO, O^/o maltozy). W próbie z Pseu- damonas- DNA stosowano jaiko czynnik przyjmu¬ jacy HB 101. Pb albsoribowaniu w ciagu 10 minut w temiperattuinze 30°C mieszanine rozcienczano dwu¬ dziestokrotnie w swiezej brzeczce L i prowadzono hodowle w ciagu 2 godzin w temperalturze 30°C, w celu wykazania odpoirnosci na ryflairipdcyne. Ba¬ danie odpornosci na ryfaimjpicyne patrz Morrison, J. Baot. 11312 <1177) 949^351.Wariant 2.(Mieszanina do upakowywanda zawierala w kaz¬ dym przypadku cieplnie pobudzone E.coli N206= BHB 2690 i NB0|5<=iBiHIB 26818 w roztworze buforo¬ wym zawierajacym 40 mM rDris-(HiCl, wartosc pH 8,0, 10 mM chlorowodorku, spermidyny, 10 mM chlorowodorfcu putrescyny, 0,lf/t meikapAoetanolu 313 10 i 7% sulrotilenku dwuimetyiu. Po 20 mikrolitrów tej mieszaniny umieszczano w zamknietych rur¬ kach do odwirowywania, wykonanych ze sztucz¬ nego tworzywa (1,5 ml, Eppendorf), zamrozono w 5 cieklym azocie i przechowywano w temperaturze —<©5°C w ciagu 2 miesdejcy. Bezposrednio przed uzyciem przeprowadzono próbki przez ciekly azot i umieszczono na lodzie na okres okolo 3 minut.Do jeszcze zamarzonych próbek dodano po 1 mi- 10 krolitrze 38 mMimoloweigo ATP i po uplywie kilku sekund dodano sprzezona próbke DNA (1—15, prze¬ waznie 5 miktrofldtrów) i mieszano podczas tajania, które wystapilo niezwlocznie. Ilosc DNA dodawa¬ nego do 20 rndkrolitrów upakowywanej mieszani-- 15 ny wynosila przewaznie 1 mfikrogram, ale przy zwiekszeniu, tej ilosci do 4,5 mikrograma jeszcze uzyskano w przyblizeniu taka sama wydajnosc hy¬ brydu w przeliczeniu na 1 mikrograirn DNA. Mie- szamiiny hodowano w temperaturze 3f7°C (albo 25°C) 20 w ciagu 30 minut, po czyim dodano dezokisyryfbo- niukaeazy (10 mikrogiramów/mil) i MigClj (10 mtili- moli). Gdy gesta masa stala sie ponownie ciekla d2—H0 minut w temperaturze 37°C dodano 0,5 ml roztworu buforowego opisanego w wariancie lii 25 krople chloroformu. Nastepnie w ciagu 2 minut ciecz odwirowywano przy 5000 obrotacfotoinute i stosowano jako zawiesine bakteriofagów do prze¬ noszenia EjcoM HB 10(1, przy ozym szczep podda¬ wano rozmnazaniu do póznej fazy wykladniczej 30 (oD=il,0) w brzeczce L o zawartosci 0,5Vt maltozy.Plytkowanie i selekcjonowanie prowadzono jak w wariancie 1.Tfransfiorimacja {próba porównawcza) Transformacje prowadzono stosujac szczep 5 K.M Kultury wyhodowane do wartosci oD§oo=0,5 chlo¬ dzono szybko na lodzie, odwirowywano i wytwa¬ rzano z nich na lodzie zawiesine w polowie obje¬ tosci roztworu Na/Cl o stezeniu 10 mM. Po utrzy¬ mywaniu na lodzie w ciagu 30 minut odwirowano 40 komórki i ponownie wykonano z nich zawiesine w polowie objetosci roztworu CaOi o stezeniu 50 mM i ponownie poddawano hodowli w temperatu¬ rze 0°C w ciagu 30 minut. Nastepnie komórki od¬ wirowano i wytworzono iclh zawiesine w 04 oi&JS- *5 tosci 30 mM roztworu Cada i 2(M glicerytny. Otrzy¬ many preparat komórek podzielono na jednakowe próbki po 1 ml i przechowywano w temfeeratuirze —60°C do dalszego uzytku. W celu dctotiania transformacji roztajano na lodzie, dodajac 0,5 ml 60 TEN (0,04 M Tris, wartosc pH 6,0, 0, i 1 mM EDTA), zawderajajcego 30 mM CaCli i DNA do transformacji (0,/l—1 mSkrograima). Mieszanine pozostawiono na okres 30 minut na lodzie, po czym w ciagu 2 minut ognzewano do temperatury 55 42°C i szybko ochlodzono w lodzie. Komórki roz¬ cienczone w stosunku 1:30 w brzeczce L i podda¬ wano hodowli w temiperaturze 37°C w ciagu 2 go¬ dzin, w celu okreslenia odpornosci na ryfampicyne.Okreslenie tej odpornosci opisano w pracy Morri¬ sa son'a, J. Bact, 1I3& fl*77|) 04BM3I51).Odpornosc na dzialanie ryiiampicyny.Odpornosc na dzialanie ryfaim^icyny bada sie na plytkach z brzeczki L, które zawieraja ryfamjpi- cyne w ilosci 100 mlikrogramówi/imil w przypadku «5 stosowania .plazmidu pJC 700 lufo 30 makrogra-? 11 mów/ml przy stosowaniu piaamidu pJC 720. Ko¬ lonie powstajace po transformacji albo transdukcji plalzmidu pJC 712(0 rozwijaja sie powoli na ryfarci- picynie. przy czym do wytworzenia duzych kolo¬ nii potrzeba 2 dni w temperaturze 37°C. Ponie¬ waz ry£aroficynia jeslt wrazliwa na swiatlo, trzeba w czasie trwania procesu hodowania utrzymywac plytki w ciemnosci, w celu zapobiezenia powsta¬ waniu kolonii na dallszym planie.Reakcja ciecia i sprzegania.Restrykcje za pomoca Hlind III prowadzono az do konca w srodowisku zawierajacym 3<0 mM Tris (wartosc pH 7,6), 10 mM Mg02 i 10 mlM NaO.Stosowano Hind in produkcji firmy Boehringer.Traktowanie (wytrawianie) za pomoca Sal I, EcoRI i Bgl II prowadzono w takim samym roztworze buforowym. Sal I i EcoRI otrzymano z firmy H.Mayer und H. Schutte, a Bgl II z firmy R. Eichen- latito. Traktowanie (wyftrawianie) za pomoca Kpn I prowadzono w srodowisku zawierajacym TO Mm Tris (wartosc pH 7,9), 6 mM Mg02, 6 mM NaCl, 10 mM dwuitaotreiibolu i 100 mikrogramów/ml wo¬ lowej albuminy surowiczej. Kpa I otrzymano z firmy Bio-IiaJbis.Zelowa elektroforeze prowadzono w le/o zelach agarowych, jak to opisal np. Collins, Current Top.Mterobtal. Imimunol., 7<8 (177) 121'—llTK).Wytwarzanie dajacego sie upakowywac substra- tu z plazmidu-DN)A.Plazmidy pJC 703 (itabTica 3) przy restrykcji za pomoca Hind III daja 2 fragmenty, mianowicie fragment A, który zawiera sekwencje cos lamlbda i replikon ColEl oraz fragment B, który zawiera gen warunkujacy odpornosc na ryfampicyneCrpoB).Spodziewano sie, ze ciecie i sprzeganie plazmidów pJC 70& prizy uzyciu Hind in i Kgazy DNA spo¬ woduje wytworzenie polimerów, które moglyby imitowac naturalny suibstrat do upakowywania.Wydaje sie, ze cecha istojtna dla upakowywania i ciecia lamlbda DNA jest wystepowanie rejonów cos lezacych w odleglosci miedzy soba wynoszacej okolo 23—3i3iX106 dalttonów (patrz Feiss, Fischer, Grayton i E&mer, Virodogy, 77 (Ii9f77) 2&1^296). Tego nalezaloby oczekiwac w takiej nieregularnie sprze¬ zonej mieszaninie z powodu wytwarzania czaste¬ czek takich jak ABBA, ABBBA i AABA. Ciecie takich czasteczek w sekwencjach cos i nastepu¬ jace dalej zaimykanie pierscienia doprowadziloby do calkowitej straty fragftnentu A tak, ze wytwa¬ rzalyby sie pdaemiidy AHB, ABBB i AAB.Analiza plazmidów utworzonych po upakowaniu i transdukcji.Po upakowaniu potraktowanych ligaiza fragmen¬ tów Hind III pJC 703 i po trarisdukejfi do szczepu NS2f0l5 otrzymuje sie wiele tysiecy kolonii odpor¬ nych na dzialanie rytfampicyny dpróba I w talb&icy 2). Wydajnosc klonów odpornych na dzialanie ry- fempdcyiny zalezy w znacznej mierze od stezenia wektora — DNA przy taktowaniu ligaiza. Potwier¬ dza to hipoteze, ze przez wytwarzanie dlugich pofójmerów upakowywanie staje sie wydajniejsze, jak to opisano wyzej. W przeciwienstwie do tego, wytwartzanie takich dlugflch lancuchów poliimery- cztiych wplywa bardzo ujeittnie na wydajnosc pró- cesu trsrartorimacjii jak to podawano poprzednio i 313 12 (patrz Ool/linis, Current Top. Microbiol. Immiunol.r 78 (1I9T77) 1.21—/17«0.Do dalszych badan wybrano przypadkowo 52 ko¬ lonie. Stwierdzono, ze wszystkie one sa odporne 5 na dzialanie koiicyny El i wrazliwe na dzialanie kolicyny E2. Dowodzi to, ze zakodowana w plaz¬ midzie odpornosc na El byla w fragmencie A Hind III. Z wszystkich próbek wyiwarzaino male klarowne ilosci lizatu w celu stwierdzenia obec¬ nosci i okreslenia przyblizonej wielkosci plazmidu DNA. W tym celu, próbki (5 mtikroliltrów+SDS do 0,1%) na zelach Tris-Boran-Agarotea ("0,8^/o boranu) poddawano elektroforezie (patrz Collins, Current Top. Microbiol. Immunol., 78 (1977) 121—170.» Z pierwszych 12 próbek, a nastepnie z tych pró¬ bek z pozostalych 40, w których stwierdzono obec¬ nosc plazmidów wiekszych niz pJC 703, wytwa¬ rzano silnie spiralne kwaisy DNA. Kwasy te, a w niektórych przypadkach produkty drugiego stopnia 20 upakowywania, badano starannie, stosujac naste¬ pujace enzymy restrykcyjne: Bgl II, Kpn I, Sal Ir EcoRI i Hind III.Wiekszosc plazmidów nailezala do jednej z trzech nastepujacych klais wielkosci: 17,3 Md, okolo 24 Md 25 i okolo 29 Md .(po elektroforezie wysoce spiral¬ nych czaistek w zelach agarozowych z pJC TOB i pJC 8012 (J25 Md) jako miernikach ciezaru czastecz¬ kowego). Przy cieciu za pomoca specjalnej nukle- azy z tych Wiekszych plazmidów otrzymywano pas- 30 ma o wielkosci takiej samej jak plazmidów wyj¬ sciowych i jedno dodatkowe pasmo. Pomijajac te nowe .pasma stwierdzono, ze pasma otrzymane z fragmentów B Hind IIIb sa intensywniejsze od . pochodzacych z fragimemtów A Hind IIIa. 35 Wplyw wielkosci na sprawnosc upakowywania hybrydowych pdaamidów Jest rzecza oczywista, ze plazmidy pJC 706 (lO Md) sa in vitro o wiele rzadziej upakowywane niz ich wieksze pocMbdne hybrydowe. Ten wysoki od- 40 setek upakowywainia duzych hybrydów jest uza¬ sadnieniem faktu, ze selekcja wedlug wie/ikosci wystepuje równiez w przypadku DNA rozcietego za pomoca endonukleazy restrykcyjnej i ponownie sprzezonego. Te zaleznosc qd wielkosci badano 45 równiez przy uzyciu pttaamidów pJC 7120 (16 Md) zawierajacych jedno tylko miejsce Hind III (fig. 1), a to w celu klonowania (rozmnazania wegetatyw¬ nego) fragmentów czynnika R Rildrd-19 (pr6ba $ w tablicy 2). so Fragmenty Hind III tych plazmidów maja na¬ stepujace wielkosci wyrazone w megadaltonach: 42J8, 111,5, 2,9, 2,0, 1,95, 1,8, 0,15 i 0,1 (Biohm, Proc. 2-nd Iht. Symp. Microbiol. Drug Resist., tom 2r Tokio 1977). Fragmenty o wielkosci -1)1,5- Md niosa w gen warunkujacy odpornosc wzgfledem ampicyliny.Stwierdzono, ze 9*0^/o klonów badanych z punktu widzenia ich odpornosci na dzialanie ryfamlpicynjr wykazywalo takze odpornosc na dzialanie ampi¬ cyliny i zawieralo co najmniej 11,5 Md fragment w Htind III z Rldrd-119, ponownie wprowadzony.Z tego wynika, ze w porównaniu z hybrydami o 17-^16 Md nastapila bardzo sillna selekcja od¬ nosnie wielkosci przy upakowywaniu i tranisdukcji na korzysc hybrydów o wielkosci 27,5—89,5 Md.•* W przeciwienstwie do tego, transformacja przjr %13 138 313 Tablica 2 14 1 Numer próby 1 23 4 DNA ipjc Toax Hindlll (i2 miejsca ciecia) sprzezony ipJC 720X Hindlll + m Hindlll pJC 720X Hindlll + Pseudo- monas AM1X Hindlll sprze¬ zone sprze¬ zone Ciezar czas¬ teczko¬ wy kos- mida (meg^- daltony) 17,3 16 16 Stezenie DNA podczas etapu sprze- giria 300 i90 146 17 330 75 Transformacja Liczba kolonii odpornych na dzialanie ryfampicyny na 1 (JUg DNA (to jelslt wszy¬ stkie kolonie hyibrydy i niehybrydy) 3)0 1,4X108 4,1X10* nie badano hybryd nie badano 10,15 Upakowanie i transdukcja Dfczba kolonii odpor¬ nych na dzialanie ry- famipiicyny na 1 |ig DNA (to jest wszystkie kolonie hybrydy i niie- nybrydy) 1,0X10*; 12,4X10* jl,0XM* 1#X10*; 4X10* 5X10* •/o hybryd okolo 1 m okolo 90 okolo 90 uzyciu takiego sarniego DNA dawala niewiele hy¬ brydów odpornych na dzialanie ryfampicyny i am¬ picyliny.W próbie 4 (tablica 2) badano takze pJC 720, w celu klonowania fragmentów chromosomalnego DNA z Pseuidomonas AM1, czesciowo rozcietych za pomoca Hind III. Wiekszosc pierwszych 3(2 ba¬ danych klonów miala nowe fragmenty DNA o wielkosci 4—U4 Md, przy czym przewaznie byly to fragmenty o wielkosci przekraczajacej 7 Md.Na tej .podstawie kilkaset' otrzymanych klonów •moze stanowic bank genów z chromosomalnych Pseuidomonas AM1 — DNA w Escherichia coli (patrz Clarfcs i Garbom, Ooia, 9 (197i6), 91—95).W przypadku szczepu pel~ jako odbiorcy wy-s dajnosc procesu injekcji DNA zalezy od wielkosci lamibda DNA (patrz Emmons, J. Molec. Biol. 9S (1974) 511—5215). Gdy jako szczep przyjmujacy roz¬ cieto za pomoca Hind III i ponownie zlaczone i upakowane pJC 703 stosowano ^szczep pel^, to stwierdzono jeszcze wieksza zaleznosc od wielko¬ sci. Z 28 badanych klonów 19 mialo plazmidy o wielkosci 124—25 Md i 8 mialo plazmidy o wiel¬ kosci 29-^30 Md, co oznaczono metoda zelowej elektroforezy klarownych lizatow. Jeden tylko plazmid mial poczatkowa wlielkosc 17 Md. Sltwier- dzono, ze wszystkie wieksze plazmliidy (23,6 i 29.9 35 Md) mialy postac ABB lub ABBB (ciecie za pomoca Sal I i BcoRI), jak to wykazaly badania przy uzyciu N20I5 jako szczepu przyjmujacego.Uipakowywamie hybrydowych pdaizniidów z rejo¬ nem cos jako bardzo wydajny system klonowania 50 55 60 dla duzych fragmentów DNA (porównanie z syste¬ mem transformacji i systemem transdukcji wedlug Hohn i Murray).¦Stwierdzono, ze jezeli stosuje sie zespól pdazimi- dów-DNA sprzezony* in viitro z fragmentami ob¬ cego DNA, to upakowywanie takiego zespolu w czastkach bakteriofagów lambda moze byc stoso¬ wane do wytwarzania plazmildów hybrydowych o wielkosci 20-^30 Md. Wydajnosc klonów zawiera¬ jacych te hybrydy, zwlaszcza w klasie o wiek¬ szych wymiarach, jest kilkaset a nawet kilka ty¬ siecy razy wieksza niz to ma miejsce przy znanej transformacji. Poza tym, przy stosowaniu malych plazmidów, które same nie moga byc wydajnie trainsdukowane, obecne równoczesnie nie zhybry- dyzowane klony sa w ramach jednego zabiegu skutecznie usuwane, bez koniecznosci modyfnko- wainia substratów DNA luib stosowania selekcjono¬ wania czy wyodrebniania, które to zabiegi sa nie¬ zbedne w znanych próbach klonowania.Stosowanie plazmidów z rejonem cos w tym systemie mozna korzystnie porównac z prowadzo¬ nym in viitro upakowywaniem wektorów klonuja¬ cych lambda, co jak stwierdzono nie zalezy od wielkosci DNA w granicach 24—(28 Md (Hohn i Murray, Proc. Nat.^Acad. Sci. USA, 74 Cl'977) 3250— 3203) i w którym to procesie nie trzeba stosowac zwyklej selekcji hybrydów lamibda w zaleznosci od wielkosci, jezeli nie prowadzi sie drugiego cyklu infekcyjnego. Zwykla selekcja stosownie do wiel¬ kosci jest opisana np. przez: Thomas, Cameron i Davis, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 71 (1974) 49719^138 313 15 16 4583, Misrray i Murray, Nature, 251 (1074) 4716— 481, Murray, Braimmar i Murray, Molec. gen. Ge- net, 15)0 (19717) 58h-61. Blattner, Williams, Blehl, Denniston-Ttompeon, Faiber. Furlomg, Grundwald, Ksefer, Moore, Schuman, SheUdon i SmAthies, Scien- 5 ce 196 (10771) 161—160. Tego rodzaju drugi cykl niesie niebezpieczenstwo wytwarzania klonów bliz¬ niaczych i selektywnej abraty niektórych hybry¬ dów (patrz Cameron, Panosenko, Dohman i Davis, Proc. Nat. Acad, Scd. USA 72 (1976) 3416—0400). »¦ Dla wielkosci 24—&L megadaltonów jest jednak pewna zaleznosc od wielkosci w przypadku ukladu do upakowywania in viitro (Sterniberg, Tiemeier i Enaudst, Gene, 1 (1977) 256—280), ale w ukladzie tym warunkiem jest nizsza granica wielkosci, a to ^ ze wzgledu na konieczna zdolnosc bakteriofagów do wytwarzania lytsinek. Ta zaleznosc od wielkosci umozliwila wytwarzanie transdukowanej jopulacji, w której 5—ilOP/a wszystkilch lysdnek zawieralo hy- brydofagi (patrz Stermfoerg, Tiemeier i Enauist., 2° Gene, 1 (11977) 2661—12900. W odwróznieniu od tego, w próbach 3 i 4 Ctaibdiioa 2) zgodnie z wynalazkiem otrzymano zasadnicze tylko hybrydy.Tablica 2 ((porównanie z systemem transforma¬ cji). Wydajnosc procesu transformacji i upakowy- 25 wamia plazmidów z rejonem cos okreslano przed i po rozcinaniu za pomoca Hind III i sprzeganiu z ligaza DNA. Material przeznaczony do transdu- kowania luib (po upakowaniu) do transformacji do¬ bierano dla srodowiska zawierajacego ryfampdcy- 80 ne. Wydajnosc podano jako liczbe kolonii odpor¬ nych na dzialanie ryfamipdcyny na 1 mikrogram uzytego DNA. W próbie 1 procentowa zawartosc hybrydoklonów odnosi sie do kflonów zawieraja- cych wiecej niz jedna kopie fragmentu Hind IIIb. ^ W próbie 3 okolo 90i/t kotami odpornych na dzia¬ lanie ryfampicyny zawieralo równiez fragment Hind III (11 M|d) z BI dnd-40, fetory równiez la- daje odpornosc na dzialanie ampicyliny.Wydajnosc upakowywania lambda — b2 DNA *o w równolegle prowadzonych próbach wynosila okolo 1XF—lfO8 piFU/mitarogram uzytego DNA.Fig. 1 przedstawia schemat rozcinania pJC 703 i pJC 720 przez endonukleaze. Fragmenty otrzy¬ mane przy uzyciu kazdego z tych enzymów poda¬ no alfabetycznie wedlug wielkosci Linie przery¬ wane pokazuja wzgledne polozenie miejsca ciecia EcoRi w kazdej z czesci schematu, a ciagle linie pionowe pokazuja polozenie miejsc ciecia Hind III.Odleglosc miejsc ciecia Hind III do najblizszego miejsca ciecia jest dla kazdego z enzymów po¬ dana w megiadialtonach. Wartosci te wykorzystuje sie, przy analizie plazmidów zawierajacych poli- meryczne fragmenty Hflmd UL Czesc Col El tych plazmidów pochodzi od niezwyklego produktu wy¬ osobnionego (pJC 309), który wykazuje miejsce ciecia Sal I a Col El brak.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania hybrydowych bakterii, polegajacy na upakowywaniu plazmidu hybrydo¬ wego z lizatem faga lambda lub lambdoidowego i transdukcji protiukftu upakowania do Escherichia coli, inamienny tym, ze stosuje sie hybrydowy plazmid otrzymany z bakteryjnego plazmidu o nie wiecej niz okolo 21 megadaltonach i tylko jednej sekwencji cos faga lambda lub lambdoidowego i z fragmentu DNA nadajacego bakterii zajdana wlas¬ nosc. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie hybrydowy plazmid otrzymany przez ciecie plazmidu majacego tylko jedno miejsce cie¬ cia dla kazdej endonuMeazy restrykcyjnej, w obec¬ nosci jednej lub dwóch endonukleaz restrykcyj¬ nych i sprzeganie w obecnosci ligazy. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, inamienny tym, ze stosuje sie plazmid o nie, wiecej niz okolo 16 me¬ gadaltonach. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, inamienny tym, ze stosuje sie plazmid rozciety tyflko w jednym miej¬ scu w obecnosci endonukleazy restrykcyjnej i sprzezony z fragmentem DNA, który daje sie ciac w obecnosci innej endonuklealzy restrykcyjnej tyl¬ ko w jednym miejscu.138 313 r i "A -A -A ' -A rt A " 5-6 1.2 I ' 3.1 c 11,0 1 1,37 1.67 c ^0,02 E I r 4 0,8 D r -j _ |F l ' 1 Di I D i i i i 1 ii i i i : ib C703 0,15, C |G| 1 E If !0/^ n ¦ 3J4; Bi ; B |0,7 i rpoB ^ A I1'2 E ^ 2,75 B 0,9, 11,0 t 1 r B i A" A- A- A- C olE1 EcoRI Sali Bglll Kpnl Hind III usuniete w pJC720 FiG. 1 PL PL PL