DE2814039B2 - Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Bakterien - Google Patents

Description

IO

(a) ein bakterielles Plasmid von nicht mehr als 21 Megadalton mit ein oder mehreren cos-Stellen eines Lambda- oder !ambdoiden Phagen und mit jeweils nur einer Spaltstelle je Restriktionsendonuklease in Gegenwart von ein oder zwei Restriktionsendonukleasen spaltet,

(b) das gespaltene Plasmid mit einem DNS-Fragment in Gegenwart einer Ligase zu einem Hybrid-PIasmid kuppelt,

(c) das gebildete Hybrid-PIasmid mit dem Lysat

eines Lambda- oder lambdoiden Phagen verpackt und

(d)Jas Verpackungsprodukt in Escherichia coli unter Bildung von Hybrid-Bakterien transduzierL

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Plasmid von nicht mehr als 18 Megadalton und/oder mit nur einer cos-Stelle einsetzt

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (a) ein an nur einer Stelle in Gegenwart einer Restriktionsendonuklease gespaltenes Plasmid einsetzt, das mit einem DNS-Fragment gekuppelt ist, das sich in Stufe (a) an nur einer Stelle in Gegenwart einer anderen Restriktionsendonuklease spalten läßt

Die möglichen technischen Anwendungen der Gentechnologie sind enorm, wenn man an die Möglichkeit denkt, DNS einer beliebigen Quelle, von z. B. Bakterien, Hefe, Pilzen, Tieren und Menschen in (andere) Bakterien einzubringen. Die Fortschritte der DNS-Chemie und der Molekulargenetik von Escherichia coli machen es wahrscheinlich, daß die Anwendung der DNS-Transplantationstechnolie zur Herstellung von Hybrid-Bakterien, die mit Fremd-DNS Produkte von wirtschaftlichem Interesse erzeugen können, nur eine Frage der Zeit ist. Die Herstellung beispielsweise eines menschlichen Hormons ode. eines Pilz-Antibiotikums

I) Transformations-System

DNS-Fragment/Lambda-DNS
(Träger = Vektor) System

mit einem leicht kultivierbaren bzw. fermentierbaren Bakterium, wie Escherichia coli, ist technisch von hervorragendem Interesse.

Collins gibt eine Übersicht über das bekannte Transformations-Verfahren in Current Top. Microbiol. Immunol., 78 (1977), 121-170, 129. Hohn & Murray beschreiben in Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 74 (1977), 3259-3263 die Verpackung von DNS des Phagen Lambda und lambdoider Phagen, die in vitro mit Fremd-DNS-Fragmenten kombiniert worden sind, zur In-vitro-Herstellung neuer Hybride. Es folgt ein Schema dieser bekannten Systeme:

+ E. coli

(Transformalion) Hybridbakterien

2) Verpackungs/Transduktions-System
(Hohn & Murray)

DNS-Fragment/Lambda-DNS
(Träger = Vektor) — System

+ Phagenhülle (Verpackung) Verpackungsprodukt

4- E. coli

(Transduktion)

Hybridbakterien.

Diese bekannten Systeme haben jedoch hinsichtlich ihres Wirkungsgrades bzw. Leistungsfähigkeit noch nicht befriedigt.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren mit einem besseren Wirkungsgrad vorzusehen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Bakterien gelöst, bei dem man eine gebildete Hybrid-DNS mit dem Lysat eines Lambda- oder lambdoiden Phagen verpackt und das Verpackungsprodukt in Escherichia coli transduziert, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist,

to daß man

(a) ein bakterielles Plasmid von nicht mehr als 21 Megadalton mit ein oder mehreren cos-Stellen eines Lambda- oder lambdoiden Phagen mit jeweils nur einer Spaltstelle je Restriktionsendonuklease in Gegenwart von ein oder zwei Restriktionsendonukleasen spaltet,

(b) das gespaltene Plasmid mit einem DNS-Fragment in Gegenwart einer Ligase zu einem Hybrid-PIasmid kuppelt,

(c) das gebildete Hybrid-Plasmid mit dem Lysat eines Lambda- oder lambdoiden verpackt und

(d) das Verpackungsprodukt in Escherichia coli unter Bildung von Hybrid-Bakterien trmsduziert.

Der Begriff des Plasmids ist von Collins in Current Top. MicrobioL Immunol, 78 (1977), 121 -170, auf Seite 122 näher erläutert; dort findet sich auch weitere Literatur. Die Herstellung von Plasmiden ist dem Fachmann geläufig; sie kann z. B. gemäß Clewell ScHelinsky, Biochem, 9 (1970), 4428-4440, oder in analoger Weise vorgenommen werden. Zur Bestimmung der Plasmid-Größe kann sich der Fachmann üblicher analytischer Verfahren bedienen, z. B. der Gel-Elektrophorese; vgl. z. B. Collins in Current Top. MicrobioL Immunol, 78 (1977), 121-170, Figur 3 bis 5 aufSeitenl40bisK2.

Unter einer cos-Stelle versteht man beim Phagen Lambda den Bereich, der die kohäsiven, zusammenhaftenden Enden aufweist.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden nun Plasmide verwendet, in die dieser Bereich eingebaut worden ist, so daß auch diese Plasmide cos-Stellen aufweisen. Ohne cos-Stellen können Plasmide nicht verpackt werden. Zur Herstellung von Plasmiden mit cos-Stellen (sogenannten Cosmiden) kann man sich des von Collins, Fiil, J0rgensen & Friesen ir Control of Ribosome Synthesis, Alired Benson Symp. IX, Munksgaard, S. 356-369, Verlag Maal0e & Kjelclgaard, j< > Kopenhagen 1976, angegebenen Verfahrens oder analoger Verfahren bedienen; die cos-Stelle ist in der angeführten Arbeit in Figur 3 mit m'm bezeichnet. Die Ermittlung des Vorliegens und der Anzahl von cos-Stellen ist ohne Weiteres möglich; siehe hierzu z. B. r> auch Nichols & Donelson in J. Virology, 26 (1978), 429-434. Selbstverständlich lassen sich für das erfindungspemäße Verfahren auch Cosmide verwenden, die sich von Cosmiden ableiten, die nach dem bekannten Verfahren oder analogen Verfahren hergestellt wurden.

Zum Stand der Technik von Restriktionsenzymen vergleiche man z. B. Roberts in CRC Crit. Rev. Biochem, 4 (1976), 123-164. Die Anwendung von Restriktionsendonukleasen ist dem Fachmann geläufig, vgl. z.B. Cohen, Chang, Boyer & Helling, Proc. Natl. -r> Acad. Sei. USA, 70 (1973), 3240-3244, und Collins, Current Top. Microbiol. Immunol., 78 (1977), 121 -170, insbesondere Seite 124. Durch übliche analytische Methoden, z. B. durch Gel-Elektrophorese, läßt sich ermitteln, ob ein Plasmid ein oder mehrere Spaltstellen ·>η für ein bestimmtes Restriktionsenzym aufweist. So wird beispielsweise bei einer Spaltstelle nur ein Spaltprodukt gebildet, während bei zwei Spaltstellen zwei Fragmente anfallen.

Es hat sich nun gezeigt, daß sich einige Plasmide mit r> bestimmten Restriktionsenzymen überhaupt nicht spalten lassen. Um auch derartige Restriktionsenzyme beim erfindungsgemäßen Verfahren einsetzen zu können, kann man folgendermaßen vorgehen. Man kann ein Plasmid mit einem Restriktionsenzym spalten, das das t>u Plasmid an einer Stelle auftrennt. Parallel dazu kann man aus einer Fremd-DNS ein DNS-Fragment herausschneiden, das an einer Stelle durch ein anderes, das Plasmid nicht spaltendes Restriktionsenzym spaltbar ist. Danach kann man das Fremd-DNS-Fragment mit dem t>^r) gespaltenen Plasmid kuppeln, wodurch man ein Hybrid-Plasmid erhält, das nun auch mit dem anderen Restriktionsenzym an einer Stelle spaltbar ist.

Bei dem Fremd-DNS-Fragment, das man bei der vorstehend genannten Stufe (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem Plasmid kuppelt, handelt es sich um ein Fragment, mit dem man dem herzustellenden Hybrid-Bakterium eine gewünschte Eigenschaft verleiht

Bei der Kupplung in Gegenwart einer Ligase kann man z. B. gemäß Cohen, Chang, Boyer & Helling, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 70 (1973), 3240-3244, oder nach analogen Verfahren arbeiten. Zur Herstellung von Hybrid-Plasmiden kommen auch sämtliche von Collins, Current Topics Microbiol. Immunol, 78 (1977), 121-170, auf Seite 126 zusammengestellten Methoden in Betracht

Zur Herstellung des Phagenlysats kann man Phagen Lambda oder lambdoide Phagen, wie z. B. Phi 80, verwenden. Zur Herstellung des Phagenlysats, zum Verpacken und zur Transduktion kann man gemäß Hohn & Murray, Proc, Nat. Acad. Sei. USA, 74 (1977), 3259 — 3263, oder nach analogen Verfahren arbeiten.

Zur Bestimmung des Wirkungsgrades des erfindungsgemäßen Verfahrens wird sich der Fachmann üblicher analytischer Verfahren bedienen, um die hergestellten Hybrid-Bakterien zu ermitteln. Der Fachmann wird sich dabei an eine für die Selektion geeignete Eigenschaft der Hybrid-Bakterien halten, z. B. an deren Resistenz gegen Antibiotika, wie z. B. Rifampicin oder Ampicillin, wobei es sich vorzugsweise um eine vom Plasmid kodierte Eigenschaft handelt

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich in vitro durchführen.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem bekannten Transformationssystem besteht darin, daß bei der Transduktion ein höherer Wirkungsgrad erreicht wird und daß sich größere Fremd-DNS-Fragmente transduzieren lassen, z. B. einer Größe von mehr als 2 Md, insbesondere 3 Md und mehr und vorzugsewise 5 Md und mehr, wobei die Obergrenze durch das gewählte Verpackungs- und Transduktionssystem vorgegeben wird. So kann beim erfindungsgemäßen Verfahren die Hybridplasmid-DNS mindestens hundertmal besser in lebende Bakterien eingebracht werden als es bei dem bekannten Transformationssystem der Fall ist; bei größeren Hybridplasmiden verläuft das erfindungsgemäße Verfahren sogar mindestens tausendmal bis hunderttausendmal besser; vgl. Collins, loc. cit. 170. Dieser bessere Wirkungsgrad bei großen Hybridplasmiden beruht auf der sehr starken Gegenselektion, die bei der Transformation großer Moleküle eintritt.

Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem bekannten Verpackungs/ Transduktions-System mit Lambda-Vektoren beruht auf der Kleinheit der Plasmid-Vektoren, die die Verpackung von großen Fremd-DNS-Fragmenten ermöglicht.

Der beim erfindungsgemäßen Verfahren erzielbare überraschend hohe Anteile an Hybridbakterien macht das weitere Arbeiten sehr viel einfacher, während die Selektionier- und Auslesestufen des bekannten Stands der Technik nachteilig aufwendig sind.

Vorteilhafterweise verwendet man ein Plasmid von nicht mehr als 18 Megadalton. Bei derartigen Plasmiden wird das Plasmid selbst (im Unterschied zum Hybrid-Plasmid) wesentlich schlechter verpackt und transduziert, so daß es zu einer besonders starken Selektion zugunsten der Hybrid-Plasmide kommt; vgl. Collins & Brüning in Gene 4 (1978), 85-107.

Vorteilhafterweise verwendet man ein Plasmid mit nur einer cos-Stelle. Die Durchführbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahens in dieser Ausführungsform ist überraschend, da DNS mit nur einer cos-Stelle als nicht verpackbar angesehen wird; vgl. z. B. Hohn & Katsura in Current Top. Microbiol. Immunol., 78 (1977), 92 mit weiterer Literatur.

Hinsichtlich der Nomenklatur auf dem vorliegenden Gebiet wird auf die folgenden Arbeiten hingewiesen:

Verwendete Abkürzungen Zitat
Nr.

(1) Bachmann, Low & Taylor, Bacteriol. Rev., 40 (1976), 116-167;

(2) Collins, Current Top. Microbiol. Immunol., 78 (1977), 121-170;

(3) Collins & Hohn, Proc. Nat. Acad. Sei. 75 (1978), 4242-4246;

(4) Emmons, Maccosham & Baldwin, J. Mol. Biol. 91 (1975), 133-146;

(5) Hershey, The Bacterophage Lambda, Publ. Cold Spring Harbor Lab.(1971),773-779;

(6) Novick, Clowes, Cohen, Curtiss, Datta & Falkow, Bacteriol. Rev, 40(1976), 168-189;

(7) Roberts, CRC Crit Rev. Biochem. 4 (1976), 123-164.

Verwendete Abkürzungen Zitat

Nr. Seite

ATP	5	779	775
(= Adonosin-5'-tri-			11
phosphat) (lambda) b2			131
Bacto-Tryptone			133-146
(= Proteinextrakt von
DIFKO Laboratories)
BgIII	7	6
CI15	5	778
(ts = temperature
sensitiveness = Tem
peraturempfindlichkeit)
CoIEl	6	182
D	5	778
Dithiothreitol
(= 1,4-Dimercapto-
2,3-butandiol)
E	5	778
EcoRI	2
Hindlll	2
hsm*	1	130 Position 98 der
		Darstellung
hsr*	1	130 Position 98 der
		Darstellung
imm 434	5
Kpnl	7
leu*	1
pel*	4
PFU
(= plaque forming unit
= Fleckenbildungs
einheit')

134

Putrescin	6	172, Zitat 19
(= Diaminobutan)	1	135
R-Fa ktor	5	778
recA*	1	136
red3	5	778
rpoB	5	778
S	2
(gen) S	5	778
Sail
SLysis
Spermidin
(= N-(3-Aminopropyl-	1	137
1,4-butandiamin)
su* (= spu)
Tris
(= Tris-(hydroxy-	1	137
methyl)-aminomethan)	1	137
thi*		Experimenteller Teil
thr*

Plasmide

Die Versuche wurden mit 2 Plasmiden mit einer Größe von 17,3 bzw. 16Md durchgeführt, von denen jedes nur eine cos-Stelle aufwies, wobei die Plasmide pJC703 bzw. pJC720 bezeichnet wurden. Zumindest eine Restriktionsendonuklease spaltete das größere Plasmid (p]C703) an zwei und das kleinere Plasmid (pJC720) ar einer Stelle. Ferner wurde ein Plasmid mit 25 Md als Molekulargewichtsmarke verwendet (pJC802).

Die Herstellung der Plasmide pJC720 und pJC7O3 (F i g. 1) wurde von Collins et al. in Control of Ribosomc Synthesis, Alfred Benson Symp. IX, Munksgaard, S. 356 bis 369, Verlag Maal0e &. Kjeldgaard, Kopenhager 1976, und Collins et al. in Davis & Novik, Microbiology Am. Soc Microbiol, Washington 1978, beschrieben.

Bakterien

Die verwendeten Bakterien, ihre Merkmale, Hinterlegungsstelle und Hinterlegungsbezeichnung vgL Tabelle I.

Verpackungssystem nach Hohn & Murray

Es wurde exogene DNS in vitro gemäß Hohn & Mur ray (Proc. Nat Acad ScL USA 74 [1977], 3259-3263 mit den folgenden geringfügigen Abänderungen ver packt Es wurden einzelne Kolonien der Stämme N205=BHB 2690 und N205 = BHB 2688 auf LA-Platter auf gestrichen und über Nacht bei 30° C wachser gelassen; hinsichtlich der LA-Platten vgl. Hohn & Hohn Proc. Nat Acad. ScL USA, 71 (1974), 2372-2376.

Tabelle I

Stamm	Merkmale	Hinterlegungs stelle	Hinter legungs- bezeichnung
i) Escherichia coli N2O5 = BHB 2690	K12-Stamm; hsri, hsmi, recA , siT; (lambda JiDm414Cl,sb2 red3 Eam4 Sam7)/lambda	DMS Göttingen	1450
N205 = BHB 2688	K12-Stamm; hsri, hsnik, recA", su"; (lambda imtn434CIlsb2 red3 Dam 15 Sam7)/lambda	DSM Göttingen	1451
SK	hsrjT, hsmj", thr", thi"	DSM Göttingen	1454
HB 101	hsTy. hsrrik, leu", pro", recA+	DSM Göttingen	1452
GLpel21W3 101	vgl. Emmons et al., J. MoI. Biol., 91 (1975), 133-146	DSM Göttingen	1453
CC 703 CC 720	I vgl. Collins et al. in Control of I Ribosome Synthesis, loc. cit. S. 357	DSM Göttingen DSM Göttingen	1449 1448

ii) Pseudomonas spec. AMI

NCIB

9133

Ferner wurden Vergleichsproben auf Platten aufgebracht, um die Temperaturempfindlichkeit bei 42° C zu testen. Es wurden einzelne Kolonien in warmes LB-Medium bei einer optischen Dichte bei 600 nm (0D600) von nicht mehr als 0,15 inokuliert und unter Schütteln inkubiert, bis ein oDeoo-Wert von 0,3 erreicht wurde: zum LB-Medium vergleiche Hohn & Hohn, loc. cit. Die Induktion der Prophagen wurde dadurch erzielt, daß man die Kulturen bei 45° C 15 min lang inkubierte, wobei man sie stehenließ. Danach wurden sie auf 37°C gebracht und 3 weitere h lang unter kräftiger Belüftung inkubiert (Es wurde eine kleine Probe jeder Kultur, die infolge der Mutation im Gen S Lysis-inhibiert war, auf eine Induktion überprüft: Nach Zugabe eines Chloroformtropfens klärte sich die Kultur.) Die beiden Kulturen wurden danach gemischt, 10 min lang mit 5000 U/min zentrifugiert und erneut bei 0°C in 1/500 des Ausgangskulturvolumens mit Puffer zur Ergänzung suspendiert (4OmM Tris-HCI, pH 8,0, 1OmM Spermidinhydrochlorid, 1OmM Putrescinhydrochlorid, 0,1% Mercaptoäthanol, 7% Dimethylsulfoxid, wobei der Puffer auf eine ATP-Konzentration von 1,5 mM eingestellt wurde). Der Abbau der biologischen Aktivität der endogenen DNS kann dadurch erreicht werden, daß man vor dem Konzentrieren mit UV-Licht bestrahlt Die Zeliensuspension wurde in Portionen (20 μΐ) in 1,5-ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen (Eppendorf) gegeben, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -6O⁰C aufbewahrt.

Die Verpackung wurde folgendermaßen durchgeführt Bei Bedarf wurde eine der vorstehend genannten Zellsuspensions-Proben in flüssigen Stickstoff überführt und auf Eis gegeben. Unmittelbar nach dem Auftauen (3 bis 4 min auf Eis) wurde die zu verpackende DNS (d. h. das Hybridcosmid; 0,01 bis 0.2 μg) in einem Volumen von 1 bis 5 μΐ zugegeben. Die DNS (das Hybridcosmid) wurde im allgemeinen in dem Ligationspuffer zugegeben, in dem sie gerade gekuppelt worden war. Die Lösungen wurden beim Auftauen sorgfältig gemischt; Blasen wurden dadurch entfernt daß man einige see lang mit einer Tischzentrifuge (Eppendorf) zentrifugierte. Die Mischung wurde 30 min lang bei 37°C inkubiert. Am Ende dieser Inkubierung wurden 20 μΐ einer eingefrorenen und aufgetauten Verpackungsmischung, die auf eine MgCI-Konzentration von 0,01-M eingestellt worden und zu der eine fertige DNAse (10μg/ml) zugegeben worden war, zu jeder Probe zugemischt, wobei man das Inkubieren 20 bis 60 min lang in 0,5 ml eines SMC-Puffers fortsetzte (hinsichtlich des Puffers vgl. man Hohn & Hohn, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71 [1974], 2372-2376); es wurde ein Tropfen Chloroform zugegeben. Nach dem Mischen wurde denaturiertes Material abzentrifugiert; die Lösung wurde als Phagensuspension (Verpackungsprodukt) verwendet.

Man führte die Transduktion durch, indem man 0,4 ml dieser Phagensuspension zu 1 ml N205-Zellen bzw. peI--ZelIen (frühe Stationärphase; oDmx> = 2,0) in L-Brühe-Maltose gab (1% Bacto-Tryptone, 0,5% Hefeextrakt [von Oxoid], 0,5% NaCl, 0,4% Maltose). Für den Versuch mit Pseudomonas-DNS wurde HBlOl als Rezipient verwendet Nachdem man 10 min lang bei 30° C absorbieren ließ, wurde die Mischung 20fach in frischer L-Brühe verdünnt und 2 h lang bei 30° C inkubiert um die Rifampicin-Resistenz anzuzeigen; zur Prüfung der Rifampicin-Resistenz vgl. man Morrison, ]. Bact, 132 (1977), 349 - 351.

Transformation
(Vergleich)

Es wurde eine Transformation mit einem 5 K-Stamm durchgeführt Kulturen, die bis zu einem oDwo-Wert von 0,5 herangewachsen waren, wurden rasch auf Eis abgekühlt, zentrifugiert und im halben Volumen einer 10-mM-NaCl-Lösung auf Eis suspendiert Nachdem man 30 min lang auf Eis stehengelassen hatte, wurden die Zellen zentrifugiert und erneut im halben Volumen einer SO-mM-CaCb-Lösung suspendiert und erneut 30 min lang bei 0°C inkubiert. Nach dem Abzentrifugieren der Zellen wurden sie in einem Zehntel ihres Volumens einer 30-mM-CaCl2-Lösung in 20prozentigem Glycerin suspendiert Diese Zellzubereitung wurde in gleiche Mengen von 1 ml aufgeteilt und bis zur

Verwendung bei — 60°C gefroren gehalten. Zur Transformation wurde die Probe auf Eis aufgetaut, wobei 0,5 ml TEN (0,04 M TRIS, pH 8,0, 0,04-m NaCI, 1 mM EDTA) zugegeben wurden, die 30 mM CaCb und die DNS für die Transformation (0,1 bis 1 μg) enthielten. Nachdem man die Mischung 30 min lang auf Eis stehengelassen hatte, wurde 2 min lang auf 42°C erwärmt und rasch auf Eis abgekühlt. Die Zellen wurden im Verhältnis 1 : 30 in L-Brühe verdünnt und 2 h lang bei 37^CC inkubiert, um die Rifampicin-Beständigkeit zu ermitteln; zur Ermittlung der Rifampicin-Beständigkeit vgl. Morrison, J. Bact., 132(1977),349-351.

Rifampicin-Beständigkeit

Die Rifampicin-Beständigkeii wurde auf L-Brühe-Platten getestet, die entweder 100μg/ml Rifampicin enthielten, wenn Plasmid pJC703 verwendet wurde, oder die 30 μg/ml enthielten, wenn Plasmid pJC720 verwendet wurde. Die sich nach der Transduktion bzw. Transformation von pJC720 bildenden Kolonien wachsen langsam auf Rifampicin, wobei es 2 Tage bei 37⁰C dauert, um große Kolonien zu bilden. Da Rifampicin lichtempfindlich ist, müssen die Platten bei dieser langen Inkubation im Dunkeln gehalten werden, um das Wachstum von Kolonien im Hintergrund (background colonies) auszuschließen.

Restriktions- und Ligations-Reaktionen
(Spaltungs- und Kupplungsreaktionen)

Die Restriktion mit Hindlll wurde in einem Medium mit 30 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl₂ und 10 mM NaCI bis zur Vervollständigung durchgeführt; Hindlll wurde von Boehringer bezogen. Die Behandlung (digestion) mit SaJI, EcoRI und BgIII wurde im selben Puffer durchgeführt. SaJI und EcoRI wurden von H. Mayer und H. Schütte bezogen und BgIII von R. Eichenlaub. Die Behandlung (digestion) mit Kpnl wurde in einem Medium mit 10 mM Tris (pH 7,9), 6 mM MgCl₂, 6 mM NaCl, 1OmM Dithiothreitol, 100μg/ml Rinderserumalbumin durchgeführt. Kpnl wurde von Bio-Labs bezogen.

Die Gelelektrophorese wurde in l%igen Agarose-Gelen durchgeführt; vgl. dazu Collins, Current Top. Microbiol. Immunol, 78 (1977), 121-170.

Herstellung eines
verpackbaren Substrats aus Plasmid-DNS

Plasmide pJC703 (Figur) liefern zwei HindlH-Spaltfragmente, nämlich Fragment A, das die Lambda-cos-Stelle und das CoIEl-Replikon enthält, und Fragment B, das das Gen fü ' die Rifampicin-Resistenz enthält (rpoB). Es wurde erwartet, daß die Spaltung und Kupplung von Plasmiden pJC703 mit Hindlll und DNS-Ligase eine Population von Polymeren liefern würde, die das natürliche Substrat zum Verpacken imitieren könnten. Das wesentliche Merkmal zum Verpacken und Spalten von Lambda-DNS scheinen cos-Stellen zu sein, die etwa 23 bis 33x10* Dalton auseinanderliegen; vgl. Feiss, Fisher, Crayton & Egner, Virology, 77 (1977), 281 -293. Das Vorliegen ist in dieser unregelmäßig verknüpften Mischung durch die Bildung von Molekülen wie ABBA, ABBBA und AABA zu erwarten. Die Spaltung derartiger Moleküle an den cos-Stellen und der folgende Ringschluß würden zum völligen Verlust eines Α-Fragments führen, so daß ABB-, ABBB- und AAB-Plasmide gebildet würden.

ίο

Analyse der nach
Verpacken und Transduktion gebildeten Plasmide

Nach dem Verpacken der mit Ligase behandelten Hindlll-Fragmente des pJC703 und dem Transduzieren in den Stamm N205 wurden mehrere Tausend Rifampicin-resistente Kolonien erhalten (Versuch 1 in Tabelle II). Die Ausbeute an Rifampicin-resistenten Klonen hängt sehr von der Konzentration der Vektor-DNS (Cosmid) bei der Ligase-Behandlung ab. Dadurch wird die Annahme gestützt, daß durch die Bildung von langen Polymeren das Verpacken wirksamer wird, wie vorstehend ausgeführt wurde. Demgegenüber ist die Bildung von derartigen hochpolymeren Ketten für den Wirkungsgrad der Transformation außerordentlich nachteilig, wie zuvor ausgeführt wurde; vgl. Collins, Current Top. Microbiol. Immunol, 78 (1977), 121-170.

Zum weiteren Testen wurdeTr52\Kolonien willkürlich ausgewählt. Man stellte fest, daß sieVüle Colicin-El-resistent und Colicin-E2-empfindlich w^ren, was anzeigte, daß die vom Plasmid kodierte El-Immunität auf dem Hindill-Fragment A saß. Es wurden jeweils kleine, klare Lysatmengen (small clearedlysates) hergestellt, um die Anwesenheit und die ungefähre Größe der Plasmid-DNS zu prüfen; dazu wurden Proben (5 μΙ; +SDS bis 0,1%) auf Tris-Borat-Agarose-Gelen (0,8% Borat) einer Elektrophorese unterworfen; vgl. Collins, Current Top. Microbiol. Immunol, 78 (1977), 121 -170. Aus den ersten 12 Proben und ferner aus den Proben unter den restlichen 40 Proben, bei denen die Anwesenheit von Plasmiden größer als pJC703 ermittelt wurde, wurde superhelikale DNS hergestellt. Diese DNSäuren und in einigen Fällen die Produkte einer zweiten Verpackungsstufe wurden sorgfältiger untersucht, wobei die folgenden Spaltenzyme verwendet wurden:

BgIIl, Kpnl.
Sail. EcoRI und

Die Mehrzahl der Plasmide fiel in eine der folgenden drei Größenklassen: 17,3 Md, ca. 24 Md und ca. 29 Md (nach einer Elektrophorese von superhelikalen Molekülen in Agarose-Gelen mit pJC703 und pJC802 [25 Md]

4) als Molekulargewichts-Marken). Bei der Spaltung mit einer speziellen Nuklease lieferten diese größeren Plasmide gleichgroße Banden wie die Ausgangsplasmide und eine zusätzliche Bande. Abgesehen von dieser neuen Bande wurde festgestellt, daß die Banden der

so HindlUe-Fragmente (B) im Vergleich zu den Banden der HindlII_A-Fragmente (A) intensiver ausfielen.

Der Einfluß der Größe
auf den Wirkungsgrad der Cosmid-Hybrid-Verpackung

Es ist offensichtlich, daß die Cosmide p]C703 (173 Md) in vitro viel seltener verpackt werden als ihre größeren Hybridderivate. Dieser hohe Prozentsatz der Verpackung von großen Hybriden belegt, daß die Größenselektion auch bei mit Restriktionsendonuklease gespaltener und danach wieder gekuppelter DNS eintritt. Diese Größenabhängigkeit wurde auch unter Verwendung von Cosmiden pJC720 (16Md) getestet, die eine einzige Hind IH-St el Ie enthalten (Fig. i), um Fragmente des R-Faktors Rldrd-19 zu klonen (Versuch 3 in Tabelle II). Die Hindlll-Fragmente dieser Plasmide besaßen folgende Größen: 42,8, 11,5, 2£, 2,0, 1,95, 1,8, 0,15 und 0,1 Md; Blohm, Proc. 2nd Int Symp. Microbiol.

Drug Resist.. Bd. 2, Tokyo 1977. Die 11,5Md großen Fragmente tragen das Gen für die Ampicillin-Resistenz. Es wurde festgestellt, daß auch 90% der getesteten Rifampicin-beständigen Klone Ampicillin-beständig waren und zumindest das 11,5 Md große Hindlll-Fragment des R1drd-19 trugen, das neu eingesetzt worden war. Daraus ergab sich eine sehr starke Größenselektion, bei der die 27,5 bis 29,5 Md großen Hybride hinsichtlich der Verpackung und Transduktion gegenüber den 17 bis 18 Md großen Hybriden bevorzugt wurden. Demgegenüber lieferte die Transformation mit derselben DNS einige Rifampicin- und Ampicillinbeständige Hybride.

Schließlich wurde im Versuch 4 (Tabelle U) pJC720 verwendet, um Fragmente chromosomaler DNS von Pseudon-icnas AMI zu klonen, die teilweise mit Hind!!! gespalten worden war. Die meisten der ersten getesteten 32 Klone trugen neue DNS-Fragmente einer Größe entsprechend 4 bis 14 Md, wobei die Mehrzahl Fragmente einer Größe von mehr als 7 Md trug. Auf dieser Basis können einige Hundert der erhaltenen Klone eine Genbank von chromosomaler Pseudomonas-AMl-DNS in Escherichia coli bilden; vgl. Clarke & Carbon,Cell,9(1976),91 -99.

Bei dem gel--Stamm hängt der Wirkungsgrad der DNS-Injektion von der Größe der Lambda-DNS ab; vgl. Emmons, ]. Molec. Biol. 93 (1974), 511 -525. Als der gel--Stamm als Wirtsstamm für mit Hindlll gespaltene, wieder verknüpfte und verpackte p]C703 verwendet wurde, wurde eine noch stärkere Größenabhängigkeit festgestellt. Von 28 getesteten Klonen besaßen 19 Plasmide im Bereich von 24 bis 25 Md und 8 im Bereich von 29 bis 30 Md, wobei die Bestimmung durch Gelelektrophorese klarer Lysate durchgeführt wurde; ein einziges Plasmid besaß die Ausgangsgröße von 17 Md. Es wurde festgestellt, daß alle größerenj'lasmide (23,6 und 29,9 Md) die Form ABB bzw. ABBB besaßen (Spaltung mit Sail und EcoRl), wie unter Verwendung von N205 als Wirtsstamm festgestellt worden war.

Verpackung von Cosmid-Hybriden

als sehr wirksames Klonungssystem für

große DNS-Fragmente

(Vergleich mit dem Transformationssystem und
dem Hohn & Murray-Transduktionssystem)

Es wurde gezeigt, daß das Verpacken von Plasmid-DNS in Bakteriophage-Lambda-Teilchen als eine Methode zur Herstellung von Plasmid-Hybriden im Größenbereich von 20 bis 30 Md angewendet werden kann, wenn Plasmid-DNS verwendet wird, die in vitro mit Fremd-DNS-Fragmenten verknüpft worden ist. Die Ausbeute an Klonen mit einem Gehalt an diesen Hybriden ist insbesondere in der größeren Größenklasse mehrere hundert- bzw. mehrere tausendmal besser als bei der üblichen Transformation. Ferner werden bei der Verwendung von kleinen Plasmiden, die kaum transformiert werden, die mitlaufenden nicht-hybridisierten Klone wirksam in einer einzigen Stufe eliminiert, ohne daß man die DNS-Substrate modifzieren oder Selektionier- oder Ausiesearbeitsweisen vorsehen muß, die normalerweise bei Klonierversuchen angewendet werden.

Der Einsatz von Cosmiden in dieses System kann sehr vorteilhaft mit dem in vitro vorgenommenen Verpakken von Lambda-Kloniervektoren verglichen werden, das unabhängig von der Größe der DNS im Bereich von 24 bis 28 Md ist (Hohn & Murray, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 74 [1977], 3259-3263) und bei dem die übliche ' größenabhängige Selektion für Lambda-Hybride nicht vorgesehen werden kann, sofern nicht ein zweiter Infektionszyklus (infectious cycle) durchgeführt wird; zur normalen größenabhängigen Selektion für Lambda-Hybride vgl. z. B. Thomas, Cameron & Davis, Proc. Nat.

in Acad. Sei. USA, 71 (1974), 4579-4583; Murray & Murray, Nature, 251 (1974), 476-481; Murray, Brammar& Murray, Molec. gen. Genet., 150 (1977), 53-61; Blattner, Williams, Blechl, Denniston-Thompson, Faber, Furlong, Grundwald, Kiefer, Moore, Schumm, Shel-

!■■> don & Smithies, Science 196 (1977), 161-169. Ein derartiger zweiter Zyklus bringt die Gefahr der Herstellung von Zwillingsklonen und des selektiven Verlustes von eingen Hybriden mit sich; vgl. Cameron, Panosenko, Lehman & Davis, Proc. Nat. Acad. Sei. USA,

2n 72 (1975), 3416-3420. Im Bereich von 24 bis 31 Md ist jedoch eine Größenabhängigkeit für ein in vitro erfolgendes Verpackungssystem beschrieben worden (Sternberg, Tiemeier & Enquist, Gene, 1 [1977], 255-280), jedoch wird eine niedrigere Größenbegren-

2"' zung für den Vektor durch die Forderung nach bakteriophaten Genen zur Fleckenbildung (plaque production) gesetzt. Diese Größenabhängigkeit erlaubte die Herstellung einer transduzierten Population, bei der 5 bis 10% aller Flecken Hybrid-Phagen enthielten;

w vgl. Sternberg, Tiemeier & Enquist, Gene, 1 (1977), 255 — 280. Im Unterschied dazu wurden bei den Versuchen 3 und 4 (Tabelle H) im wesentlichen nur Hybride erhalten.

Tabelle II
(Vergleich mit dem Transformationssystem)

4(i Wirkungsgrade von Transformation und Verpackung von Plasmiden mit cos-Stellen vor und nach Spaltung mit Hindlll und Verknüpfen mit DNS-Ligase. Das zu transformierende bzw. (nach dem Verpacken) zu transduzierende Material wurde für ein Medium mit

4-, einem Gehalt an Rifampicin selektiert. Die Ausbeuten sind ausgedrückt als Rifampicin-resistente Kolonien^g eingesetzte DNS. Bei Versuch 1 betrifft der Prozentsatz an Hybrid-Klonen Klone mit mehr als einer Kopie des Hindllle-Fragments. Etwa 90% der Rifampicin-resi-

ϊ<> stenten Kolonien des Versuchs 3 enthielten gleichfalls das HindlH-Fragment (11 Md) aus R1drd-19, das ferner eine Ampicillin-Resistenz trägt.

Der Wirkungsgrad des Verpackens von Lambdab2-DNS in Parallelversuchen betrug etwa 10⁷ bis 10" pFU/^g eingesetzte DNS.

F i g. 1: Restriktionsendonuklease-Schema für pJC703 und pJC720. Die Fragmente, die mit jedem Enzym erhalten wurden, sind alphabetisch entsprechend ihrer Größe angeführt. Die gestrichelten Linien zeigen die

W) relative Stellung der EcoRl-Spaltstelle jedes Schemas und die durchgehenden senkrechten Linien die Hindlll-Spaltstellen. Der Abstand der Hindill-Spaltstelle zur nächsten Spaltstelle jedes Restriktionsenzyms ist in Md angegeben. Diese Werte werden bei der Analyse von

b5 Plasmiden verwendet, die polymere Hindi H-Fragmente enthalten. Der ColEI-Teil dieser Plasmide leitet sich von einem ungewöhnlichen Isolat (p]C309) ab, das eine Sall-Spaltstelle aufweist, die CoIEl fehlt

Tabelle II

14

Ver- DNS	Molekular	DNS-Kon	Transformation	Hybrid	Verpacken und	Trans-
such	gewicht des	zentration			duzieren
	Cosmids	in der	Rifampicin-		Rifampicin-	Kybrid
		Kupp	resistente		resistente
		lungsstufe	Kolonien/;jg		KoIonien/μg
			DNS (d. h. alle		DNS (d. h. alle
			Kolonien =	(%)	Kolonien =
			Hybride +	Hybride +
	(Md)		Nichthybride)	Nichthybride)	(%)

pJC703 x HindIII 17,3

(2 Spaltstellen),

verknüpft

pJC720 x Hindllll _ver 16

Rldrdl9XHindIIl[ ^knüpft pJC720 x HindIII .... 16

Pseudomonas
AMl xHindIII

verknüpft

500 50

146 17

330 75

30 1,4XlO³

4,1 x 10²

nicht getestet

nicht 1,0X10";

getestet 2,4XlO⁴ 1,0X10-

0,15

1,8XlO³; 2,4 x 10³

5XlO³

ca.

ca.

ca.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Bakterien unter Verpacken einer gebildeten Hybrid-DNS mit dem Lysat eines Lambda- oder lambdoiden Phagen und Transduzieren des Verpackungsp-odukts in Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, daß man