DE3005226A1 - Plasmid puc6, dieses enthaltende kultur von streptomyces espinosus und verfahren zum isolieren von plasmid puc6 aus streptomyces espinosus - Google Patents

Plasmid puc6, dieses enthaltende kultur von streptomyces espinosus und verfahren zum isolieren von plasmid puc6 aus streptomyces espinosus

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DE3005226A1 DE19803005226 DE3005226A DE3005226A1 DE 3005226 A1 DE3005226 A1 DE 3005226A1 DE 19803005226 DE19803005226 DE 19803005226 DE 3005226 A DE3005226 A DE 3005226A DE 3005226 A1 DE3005226 A1 DE 3005226A1
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Description

Henkel, Kern, Feiler &Hänzel .:.:.. Patentanwälte
Registered Representatives before the
_ European Patent Office
MöhlstraBe 37
D-8000 München 80
Tel.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkl d Telegramme: ellipsoid
TUC 3539 - Dr.F/rm
THE UPJOHN COMPANY Kalamazoo, Mich. V.St.A.
Plasmid pUC6, dieses enthaltende Kultur von Streptomyces espinosus und Verfahren zum Isolieren von Plasmid pUC6 aus
Streptomyces espinosus 030038/0632
- ir- ■■■-■■ Ή-
Beschreibung
Die Entwicklung von Plasmidvektoren für rekombinante DNs-Gentechnologie bei Mikroorganismen ist bekannt. Eine ausführliche Zusammenfassung über die DNS-Forschung findet sich in "Science", Band 196, April 1977.
Ähnliche DNS-Arbeiten sind derzeit bei industriell wichtigen Mikroorganismen der Gattung Streptomyces im Gange (vgl. M.J. Bibb, J.M. Ward und D.A. Hopwood in "Nature", Band 274, Seiten 398 bis 400 (1978) "Transformation of plasmid DNA into Streptomyces at high frequency"). Obwohl in verschiedenen Streptomyceten Plasmid-DNS'en nachgewiesen wurden (vgl. M.L.B. Huber und O. Godfrey in "Can. J. Microbiol.", Band 24, Seiten 631 und 632 (1978) "A general method for lysis of Streptomyces species"; H. Schrempf, H. Bujard, D.A. Hopwood und VT. Goebel in "J. Bacteriol.", Band 121, Seiten 416 bis 421 (1975) "Isolation of covalently closed circular deoxy-ribonucleic acid from Streptomyces coelicolor A3(2)"; H. Umezawa in "Biomedicine", Band 26, Seiten 236 bis 249 (1977) "Microbial secondary metabolities with potential use in cancer treatment (Plasmid involvement in biosynthesis and compounds)" und V.S. Malik in "J. Antibiotics", Band 30, Seiten 897 bis 899 (1977) "Preparative Method for the isolation of super-coiled DNA from a chloramphenicol producing Streptomycete"), wurde lediglich ein Streptomyceten-Plasmid physikalisch isoliert und ausführlich in der Literatur beschrieben (vgl. Schrempf aaO). Das Vorliegen anderer Plasmide in der Gattung Streptomyces wurde aus den in den folgenden Veröffentlichungen veröffentlichten genetischen Daten geschlossen:
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30ÜÜ226
(1) H. Akagawa, M. Okanishi und H. Umezawa in "J. Gen. Microbiol.", Band 90, Seiten 336 bis 346 (1975) "A plasmid involved in chloramphenicol production in Streptomyces venezuelae: Evidence from genetic mapping";
(2) R.P. Freeman und D.A. Hopwood in "J. Gen. Microbiol.", Band 106, Seiten 377 bis 381 (1978) "Unstable naturally occurring resistance to antibiotics in Streptomyces ";
(3) E.J. Friend, M. Warren und D.A. Hopwood in "J. Gen. Microbiol.», Band 106, Seiten 201 bis 206 (1978) "Genetic evidence for a plasmid controlling fertility in an industrial strain of Streptomyces rimosus";
(4) D.A, Hopwood und H.M. Wright in "J. Gen. Microbiol.", Band 79, Seiten 331 bis 34 2 (1973) "A plasmid of Streptomyces coelicolor carrying a chromosomal locus and its inter-specific transfer";
(5) K. Hotta, Y. Okami und H. Umezawa in "J. Antibiotics", Band 30, Seiten 1146 bis 1149 (1977) "Elimination of the ability of a kanamycin-producing strain to biosynthesize deoxystreptamine moiety by acriflavine";
(6) R. Kirby, L.F. Wright und D.A. Hopwood in "Nature", Band 254, Seiten 265 bis 267 (1975) "Plasmiddetermined antibiotic synthesis and resinstance in Streptomyces coelicolor";
(7) R. Kirby und D.A. Hopwood in "J. Gen. Microbiol.",
030038/0632 BAD ORIGINAL
Band 98, Seiten 239 bis 252 (1977) "Genetic determination of methylenomycin synthesis by the SCPI plasmid of Streptomyces coelicolor A3(2)" und
(8) M. Okanishi, T. Ohta und H. Umezawa in "J. Antibiotics", Band 33, Seiten 45 bis 47 (1969) "Possible control of formation of aerial mycelium and antibiotic production in Streptomyces by episomic factors".
Das Plasmid pUC6 erhält man aus dem neuen Mikroorganismus Streptomyces espinosus, Biotype 23724a (DSM ). Dieses Plasmid erhält man aus dem Mikroorganismus Streptomyces espinosus, Biotype 23724a (DSM ) durch Züchten der Kultur auf einem geeigneten Medium, Fragmentieren des Mycels, Inkubieren des fragmentierten Mycels, Ernten der Kultur nach einer geeigneten Zeit und anschließendes Lysieren des Mycels. Aus dem erhaltenen Lysat läßt sich im wesentlichen reines Plasmid pUC6 isolieren. Das Plasmid pUC6 ist in vorteilhafter Weise klein und in zahlreichen Kopien pro Zelle vorhanden. Als solches stellt das Plasmid pUC6 das bisher bei Streptomyces einzige beschriebene kleine und in hoher Kopienzahl vorliegende Plasmid dar. Seine Empfindlichkeit gegenüber den verschiedensten Restriktionsendonukleasen sollte es auf einfache Weise Modifizierungen zugänglich machen und an eine Reihe von Wirtvektorsystemen anpassen.
Das Plasmid pUC6 wird durch Standardkennzeichnungstests, z.B. sein Molekulargewicht von etwa 6,0 Megadalton, ein Restriktionsbild bzw. eine Restriktionskarte entsprechend der Zeichnung und die Anwesenheit von 20 bis 40 Kopien pro Streptomyces-espinosus-(DSM )-Zelle, gekennzeichnet.
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Das Plasmid pUC6 eignet sich als Klonungsvektor bei DNS-Arbeiten, bei welchen dem Plasmid die gewünschten Gene einverleibt werden und dann eine Transformierung des Plasmids in einen geeigneten Wirt erfolgt.
In der Zeichnung ist das Restriktionsendonuklease-Spaltungsbild für das Plasmid pUC6 dargestellt. Das Bild ist auf der Basis eines Plasmids pUC6 eines Molekulargewichts von etwa 6,0 Megadalton bzw. einer Moleküllänge von ca. 9,2 Kilobasen konstruiert. Die Bildpositionen der verschiedenen Restriktionsstellen sind als Kilobasekoordinaten relativ zu der Bgl-II-Restriktionsstelle bei 0,0/9,2 Kilobasen angegeben. Für die Restriktionsendonukleasen werden folgende Abkürzungen benutzt:
(1) BgI II ist ein Enzym aus Bacillus globigii;
(2) Bei I ist ein Enzym aus Bacillus caldolyticus;
(3) Pvu II ist ein Enzym aus Proteus vulgaris und
(4) Xho I ist ein Enzym aus Xanthomonas holcicola.
Wie bereits erwähnt, erhält man das Plasmid pUC6 aus Streptomyces espinosus, Biotype 23724a (NRRL 11439). Die biologisch reine Kultur ist in der Dauersammlung der Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, unter der Hinterlegungsnummer NRRL 11439 hinterlegt.
Eine aus einer Bodenprobe isolierte Actinomycetenkultur wird als Biotype des bekannten Mikroorganismus Strepto-
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myces espinosus (NRRL 3890) bestimmt. Das neue Isolat wird mit der Typenkultur Streptomyces espinosus (NRRL 3890) (vgl. US-PS 3 697 380) in den Tabellen 1 bis 5 verglichen. Die Biotype wächst auf den angegebenen Medien und nutzt die Kohlenstoffverbindungen in den synthetischen Medien weniger gut aus als die Typenkultur. Das Oberflächenwachstum bzw. Luftwachstum ist vornehmlich vegetativ und erscheint cremig weiß. Die Typenkultur zeigt ein starkes grau-grünes Luftwachstum (was auf eine starke Sporenbildung hindeutet). Kleine Flecken einer grau-grünen Sporenbildung finden sich (auch) bei der Biotype. Eine Prüfung des Materials aus der Sporenbildung beider Stämme läßt kurze Sporenketten erkennen, die gestreckt, gekrümmt, oder offenspiralig sind und die runde dornartige Sporen tragen. Beide Stämme sind hitzebeständig und produzieren das Antibiotikum Lincomycin. Der neue Stamm enthält das Plasmid pUC6. Die Eigenschaften des neuen Stammes sind denjenigen des Typenstammes so ähnlich, daß es sich hierbei offensichtlich um Streptomyces espinosus handelt. Der neue Stamm läßt sich jedoch von der Typenkultur durch in den Tabellen aufgeführte Eigenschaften unterscheiden. Der Stamm erhält eine Biotypenbezeichnung (vgl. S.P. Lapage und Mitarbeiter "International Code of Nomenclature of Bacteria (Bacteriological Code, 1976 Revision), ASM, Wash.,D.C., 1975), um anzuzeigen, daß seine Eigenschaften nicht mit den Eigenschaften der Typenkultur identisch sind. Die gewählte Bezeichnung ist Streptomyces espinosus, Biotype 23724a (DMS ).
Farbeigenschaften: Luftwachstum: schwach grau-grün; Melanin negativ; Aussehen auf Ektachromfilmen (vgl. A. Dietz "Ektachrome transparencies as aids in actinomycete classifiaction" in "Ann. N.Y. Acad. Sei.", Band 60, Seiten 152 bis 154) ist in Tabelle II angegeben. Die Kultur kann in
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die Grün- (GN-) und Grau- (GY-) Farbreihen von Tresner und Backus (vgl. H.D. Tresner und E.J. Backus in "Applied Micro-Mol.", Band 11, Seiten 335 Ms 338 (1963) "System of color wheels for streptomycete taxonomy") eingeordnet werden.
Mikroskopische Eigenschaften: Kurze Sporenketten, gestreckt bis gekrümmt, bis offenspiralig (RF, RA) im Sinne von Pridham und Mitarbeitern (T.G. Pridham, CW. Hesseltine und R.G. Benedict in "Applied Microbiol.", Band 6, Seiten 52 bis 79 (1958) "A guide for the classification of streptomycetes according to selected groups. Placement of strains in morphological sections."). Mit Hilfe des Abtastelektronenmikroskops beobachtete Sporen sind hauptsächlich sphärisch. Stachelige bis dornige Sporenoberfläche mit einem scheinbaren Übergang zu haarig bei einigen Dornen.
Kultureigenschaften und biochemische Eigenschaften: Die Kultur- bzw. Züchtungseigenschaften und die biochemischen Eigenschaften finden sich in Tabelle III.
Kohlenstoffausnutzung: Das Wachstum der Kultur auf Kohlenstoffverbindungen wird in dem künstlichen Medium nach Pridham und Gottlieb (vgl. T.G. Pridham und D. Gottlieb in "J. Bacteriol.", Band 56, Seiten 107 Ms 114 (1948) "The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination") und in deren modifiziertem Medium (vgl. E.B. Shirling und D. Gottlieb in "International Journal of Systematic Bacteriology", Band 16, Seiten 313 Ms 340 (1966) "Methods for characterization of Streptomyces species") (vgl. Tabellen IV und V) bestimmt.
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Temperatur: Das Wachstum ist schlecht bei 180C und fehlt bei 550C Es ist gut bei 24° bis 450C. Ein gutes Wachstum bei 45°C ist während 24 bis 48 h zu beobachten. Die zu den Temperaturuntersuchungen verwendeten Agarmedien bestehen aus Bennett'&> Czapek 1S Saccharose-, Maltose-Trypton- und Hickey-Tresner (modifiziert)-Medien.
Tabelle I
Aussehen von Streptomyces-espinosus-Eulturen auf Ektachrom Bestim
mung		 Streptomyces espi-
nosus (NRRL 3890)		 Streptomyces
espinosus,
Biotype 23724a
(DSM )
Agarmedium 0 grau-grün sehr schwache
Spuren "Weiß"
Bennett's R fahlgelb-lohfarben fahlgelb-loh
farben
0 grau-grün grau-grün
Czapek1s-Saccharose R fahlgrau fahlgrau
0 grau-grün grau-grün-weiß
Maltose-Trypton R gelb-lohfarben bis
oliv		 gelb-lohfarben
0 weiß fahlgrau-we iß
Pepton-Eisen R gelb gelb
0 farblos farblos
0,1% Tyrosin R rot rot
0 = Oberseite, R = Rückseite.
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Tabelle II Referenzfarbeigenschaften von Streptomyces-espinosus-Kulturen
Agarmedium
cr> ca
Bestim- Streptomyces espinosus (NRRL 3890) mung
Streptomyces espinosus,
Biotype 23724a (DSM )
Bennett's
Czapek's-Saccharose
Maltose-Trypton
Hickey-Tresner (modifiziert)
127 gy. 01 G grau-olivgrün
93 y Gy bis gelblich-grau 127 gy. 01 G bis grau-olivgrün
R 71 m. OY schwach orange
gelb		 70 1 . OY hellorange-gelb •
P 73 p. OY fahlorange-gelb 73 P . OY fahlorange-gelb
0 127 gy. 01 G grau-ölivgrün 93 y
127		 Gy bis
gy. 01 G		 gelblich-grau bis
grau-olivgrün
R 89 p. Y fahlgelb 89 ρ . Y fahlgelb ι
P
0		 127 gy. 01 G grau-olivgrün 93 y
127		 Gy bis
gy. 01 G		 gelblich-grau ν Λ
bis grau-oliv- J^1
grün ι		 U)
O
R
ρ		 89 p. Y fahlgelb 70 1 . OY hellorange-gelb W.
K)
K)
CD
JT
0		 93 y Gy bis
127 gy. 01 G		 gelblich-grau bis
grau-olivgrün		 93 y
127		 Gy bis
gy. o1 G		 gelblich-grau
bis grau-oliv
grün
R 70 1. OY hellorange-gelb 70 1 . OY hellorange-gelb
P
Fortsetzung Tabelle II
Hefeextrakt-Malzextrakt
(ISP-2)
Hafermehl
(ISP-3)
R P 0
R P 0
anorganische
— Salze - Stärke
S (ISP-4) R ο
ο Ρ
to
O0 Glycerin - As- 0 ^^ paragin
(ISP-5) ρ
127 gy. 01 G grau-olivgrün
70 1. OY
hellorange-gelb
172 gy. 01 G grau-olivgrün
70 1. OY
hellorange-gelb
127 gy. 01 G grau-olivgrün J 70 1. OY hellorange-gelb
127 gy. 01 G grau-olivgrün
p. OY
fahlorange-gelb 93 y Gy bis gelblich-grau bis 127 gy. 01 G grau-olivgrün
70 1. OY hellorange-gelb
93 y Gy bis gelblich-grau bis 127 gy. 01 G grau-olivegrün
70 1. OY
hellorange-gelb
93 y Gy bis gelblich-grau bis
127 gy. 01 G grau-olivgrün
70 1. OY hellorange-gelb
93 y Gy bis gelblich-grau bis
127 gy. 01 G grau-olivgrün
68 s. OY stark orange-gelb
= Oberseite, R = Rückseite, P = Pigment
Tabelle III
Kultureigenschaften und biochemische Eigenschaften von Streptomyces-espinosus-Kultüren
Agarmedium
Pepton-Eisen
Calciummalat
Glucoseasparagin
Magermilch
Bestim- Streptomyces espinosus (NRRL Streptomyces espinosus, Biotype mung 389O) 23724a (DSM )
O R P S O
R P S
P O
R P S
fahlgelb-grau gelb-lohfarben gelb Melanin-negativ
sehr fahlcremefarben-graugrün
sehr fahlcremefarben
Malat teilweise löslich gemacht
stark grau-grün
grau-grün-schwarz mit gelben Kanten
sehr fahlgrau-cremefarben
orange-braun
orange-1ohfarben
Casein wird löslich gemacht sehr fahlgrau gelb-lohfarben
Melanin-negativ sehr fahlcremefarben-grau-grün
sehr fahlcremefarben
Malat teilweise löslich . gemacht
fleckig cremefarben-grau-grün cremefarben-oliv
fahlgelb
cremefarben orange-lohfarben orange-lohfarben Casein wird rund um die wachsende Kultur löslich gemacht
Fortsetzung Tabelle III
O Tyrosin O
GO R
O P
O S
CO Xanthin O
OO R
—, P
O S
CO
o>		 Nährstärke O
03 R
>
D P
O S
33
Q Hefeextrakt - O
Z Malzextrakt
R
Gelatine
blank
mit Nährstoffen
stark grau-grün
dunkelrötlich-lohfarben-braun dunkelrötlich-lohfarben-braun Tyrosin wird löslich gemacht stark grau-grün
sehr fahlcremefarben-gelb sehr fahlcremefarben Xanthin geht nicht in Lösung
fahlgrau im Mittelpunkt, stark grau-grün an der Kante
fahlcremefarben-gelb sehr fahlgelb
Stärke geht in Lösung stark grau-grün
fahlgelb-lohfarben
Spuren cremigen Luftwachstums auf der Oberfläche
gelbes Pigment
Verflüssigung vollständig
weißes Luftwachstum auf der Oberfläche^
gelb-lohfarbenes Pigment Verflüssigung vollständig grau-rosa
dunkelrötlich-lohfarben-braun dunkelrötlich-lohfarben-braun Tyrosin wird löslich gemacht rosa-weiß, grüngefleckt sehr fahlcremefarben-gelb sehr fahlcremefarben Xanthin geht nicht in Lösung rosa-weiß, grüngefleckt
fahlcremefarben-gelb sehr fahlgelb
Stärke geht in Lösung
fahlgrau im Mittelpunkt, graugrün an der Kante
sehr fahlgelb
Spuren cremefarbenen Luftwachstums auf der Oberfläche
Verflüssigung vollständig
Spuren cremefarbenen Luftwachstums auf der Oberfläche
Verflüssigung vollständig
Fortsetzung Tabelle III
Brühe
synthetische Brühe mit Nitrat
Nährbrühe mit Nitrat
Lackmusmilch
ö Pepton-Hefeextrakt-
© Eisen (ISP-6)
S Tyrosin (ISP-7)
to
0 R P S 0 R P S
schwaches kompaktes Bodenwachstum
Oberflächenring und Häutchen mit grün-grau-weißem Luftwachstum
blau-grau-lohfarbener Oberflächenring mit schwach grauem Luftwachstum
tief purpurnes Pigment Peptoni s ierung fahlcremefarben-rosa gelb-lohfarbenes Pigment gelb-lohfarbenes Pigment Melanin-negativ gut grau-grün fahlgrau-grün
Melanin-negativ
sehr schwaches kompaktes Bodenwachstum
schwaches Oberflächenhäutchen eines farblosen vegetativen Wachstums
blau-grün-lohfarbener Oberflächenring mit grauem Luftwachstum
tief purpurnes Pigment Peptonisierung
fahlcremefarben-lohfarben-rosa fahlgelb-lohfarben fahlgelb-lohfarben Melanin-negativ
fleckiges grau-grün-cremefarben fahlgrau-grün
Melanin-negativ
0 = Oberseite, R = Rückseite, P = Pigment, S = sonstige Eigenschaften
CJ cn N) Ni
- vT
Tabelle IV
Ausnutzung von Kohlenstoffverbindungen durch Streptomycesespinosus-Kultüren in dem künstlichen Medium nach Pridham
und Gottlieb*
Streptomyces Streptomyces es-
espinosus pinosus, Biotype
(NRRL 3890) 23724a (DSM )
(Tj (7)
Blindprobe
1. D-XyIose
2. L-Arabinose
3. Rhamnose
4. D-Fruktose
5. D-Galaktose
6. D-Glukose
7. D-Mannose
8. Maltose
9. Saccharose
10. Laktose
11. Cellobiose
12. Raffinose
13. Dextrin
14. Inulin
15. lösliche Stärke
16. Glycerin
17. Dulcit
18. D-Mannit
19. D-Sorbit
20. Inosit
21. Salicin
22. Phenol
23. Kresol
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Fortsetzung Tabelle IV
24. Natriumformiat (+) (-)
25. Natriumoxalat (+) (+)
26. Natriumtartrat (+) (+)
27. Natriumsalicylat - -
28. Natriumacetat (+) (+)
29. Natriumeitrat (+) (+)
30. Natriumsuccinat (+) (+)
+ = gute Ausnutzung
(+) = schlechte Ausnutzung
(-) = zweifelhafte Ausnutzung
= kein Wachstum
* T.G. Pridham und D. Gottlieb in "J. Bacteriol.", Band 56, ' Seiten 107 bis 114 (1948) "The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination" .
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BAD ORIGINAL
- yr - ■-
Tabelle V
Ausnutzung von Kohlenstoffverbindungen durch Streptomycesespinosus-Kulturen in dem künstlichen Medium nach Shirling
und Gottlieb*
Streptomyces Streptomyces.esespinosus pinosus, Biotype (NRRL 3890) 23724a (DSM )
Blindprobe
negatives Basalmedium - -
positives Basalmedium + +
plus D-Glukose
Kohlenstoffverbindungen
L-Arabinose ++ +
Saccharose
D-XyIose ++ +
Inosit ++ +
D-Mannit ++ +
D-Fruktose ++ +
Rhamnose ++ +
Raffinose £ +
Cellulose
++ starke Ausnutzung i Ausnutzung zweifelhaft + positive Ausnutzung - Ausnutzung negativ
* E.B. Shirling und D. Gottlieb in "Int. J. Syst. Bacteriol.", Band 16, Seiten 313 bis 340 (1966) »Methods for characterization of Streptomyces species".
Charakterisierung von Plasmid pUC6:
Molekulargewicht: etwa 6,0 Megadalton
Anzahl Kopien pro Zelle: 20 bis 40
030 0 38/0632
30Ü5226
Empfindlichkeit gegenüber Restriktionsendonuklease:
Das Plasmid pUC6 besitzt folgende Empfindlichkeitseigenschaften gegenüber Restriktionsendonukleasen (vgl. das in der Zeichnung dargestellte Restriktionsendonuklease-Spaltungsbild für das Plasmid pUC6):
Plasmidempfindlichkeitseigenschaften gegenüber Restriktionsendonukleasen:
Spaltstellen Spaltstellen
Enzym Plasmid pUC6 Enzym Plasmid pUC6
BgI I >7
BamHI O
Hpa II zahlreiche
EcoRI O
Pst I O
Mbo II >5
Xba I O
Sal I 5-6
Hinc II >7
BgI II 1
Hpa I O
Hind III O
Κρη Ι O
Pvu II 4
Ava I >7
Xho I 2
Sma I >5
Diese Ergebnisse wurden durch Digerieren von pUC6-DNS in Gegenwart eines Überschusses an Restriktionsendonuklease erhalten. Die Anzahl der Restriktionsstellen wurde aus der Anzahl der in 0,7- bzw. 1,0%igen Agarosegelen auflösbaren Fragmente bestimmt.
pUC6 kann zur Schaffung rekombinanter Plasmide, die durch Transformation in Wirtbakterien eingefügt werden können, herangezogen werden. Es ist bekannt, wie rekombinante
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Plasmide geschaffen werden können. Bei einem solchen Verfahren erfolgt eine Spaltung des isolierten Vektorplasmids, beispielsweise pUC6, an spezifischer (spezifischen) Stelle(n) mit Hilfe einer Restriktionsendonuklease, beispielsweise BgI II, Xho I und dergleichen. Das Plasmid, bei dem es sich um ein ringförmiges DNS-Molekül handelt, wird dabei durch das Enzym, das die beiden DNS-Stränge an einer speziellen Stelle zerschneidet, in ein lineares DNS-Molekül überführt. Eine andere Nicht-Vektor-DNS wird mit demselben Enzym in ähnlicher Weise gespalten. Beim Vermischen des linearen Vektors oder von Teilen desselben mit Nicht-Vektor-DNS'en, können sich ihre einsträngigen oder stumpfen Enden miteinander paaren und in Gegenwart eines als Polynukleotidligase bekannten zweiten Enzyms unter Bildung eines einzigen DNS-Rings kovalent vereinigen.
Die geschilderten Maßnahmen können auch zum Einbau einer bestimmten DNS-Länge aus einem höheren Tier in pUC6 herangezogen werden. So kann beispielsweise die DNS, die bei Fröschen für eine Ribosomen-RNS-Codierung verantwortlich ist, mit der gespaltenen pUC6-DNS gemischt werden. Die erhaltenen ringförmigen DNS-Moleküle bestehen aus PlasmidpUC6 mit einer eingefügten Länge Frosch-rDNS.
Die unter Verwendung von pUC6 erhaltenen, ein gewünschtes genetisches Element enthaltenden rekombinierten Plasmide können zu Abdruckzwecken in einen Wirtsorganismus eingeschleust werden. Beispiele für wertvolle Gene, die in der geschilderten Weise in WirtsOrganismen eingeschleust werden können, sind Gene mit Somatostatin-, Rattenproinsulin- und Proteasencodierung.
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Der Nutzen des Plasmids pUC6 beruht auf seiner Fähigkeit zur Wirkung als Plasmidvektor bei industriell bedeutenden Mikroorganismen, z.B. Streptomyces. So erhält man durch Klonung einer genetischen Information aus Streptomyces in pUC6 eine Möglichkeit zur Steigerung industriell wertvoller Produkte aus diesen Organismen, z.B. von Antibiotika.
Dieser Versuch ist dem Konzept einer Klonung von Genen für Antibiotikumproduktion in das gut charakterisierte Escherichia-coli-K-12-Wirt/Vektor-System vergleichbar. Das E.-coli-System hat den Nachteil, daß Gene aus einigen gram-positiven Organismen, z.B. Bacillus, in dem gramnegativen E,-coli-Wirt nicht gut abklatschbar sind (do not express well). In gleicher Weise verbleiben Plasmide aus gram-negativen Organismen nicht in gram-positiven Wirten, so daß in grampositiven Wirten gram-negative genetische Information entweder schlecht oder überhaupt nicht abgeklatscht (expressed) wird. Dies veranschaulicht klar und deutlich den Vorteil eines gram-positiven Wirt/Vektor-Systems und den Nutzen von Plasmid pUC6 in einem solchen System.
In der Regel erfordert die Verwendung eines Wirt/Vektor-Systems zur Herstellung eines für den Wirt fremden Produkts die Einschleusung von Genen für den gesamten biosynthetischen Weg des Produkts in den neuen Wirt. Wie bereits ausgeführt, kann dies zu Problemen beim genetischen Abklatsch (genetic expression) führen. Ferner können auch neue und/ oder verstärkte Probleme bei der Züchtung der Mikroorganismen und bei der Extraktion und Reinigung des Produkts auftreten. Ein vielleicht brauchbarerer Versuch besteht darin, einen Plasmidvektor, z.B. pUC6, in einen normalerweise das Produkt liefernden Wirt einzuschleusen und auf das
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Plasmid die Gene für die Biosynthese des Produkts zu klonen. Zumindest sollten sich dadurch die Probleme bei der Züchtung und Produktextraktion und -reinigung auf ein Mindestmaß senken lassen. Darüber hinaus dürfte es bei diesem KIonungssystem nicht erforderlich sein, sämtliche Gene des Biosyntheseweges zu klonen und zu verstärken, vielmehr dürfte es lediglich erforderlich sein, Steuergene (regulatory genes) oder Gene mit Codierung für die Geschwindigkeit der Produktbiosynthese begrenzende Enzyme zu klonen. Da das Plasmid pUC6 ein Streptomycetenplasmid darstellt, ist es in dieser Hinsicht für die Gattung Streptomyces ideal geeignet. Da ferner das Plasmid pUC6 ein Plasmid aus einem gram-positiven Organismus darstellt, kann es in einer Reihe anderer Mikroorganismen, z.B. Bacillus, Arthrobacter und dergleichen, als Vektor dienen.
Streptomyces espinosus, Biotype 23724a (DSM ) läßt sich in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen züchten. Die Züchtung kann beispielsweise in einem Nährmedium mit einem assimilierbaren Kohlenhydrat als Kohlenstoffquelle, einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen oder -haltigen Material als Stickstoffquelle wachsen gelassen werden. Bevorzugte Kohlenstoff lief eranten sind Glucose, brauner Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Casein, Fischmehl, Destillationsfeststoffe, Tierpeptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle und dergleichen. Zweckmäßigerweise werden Kombinationen dieser Kohlenstoff-
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und Stickstoffquellen verwendet. Spurenmetalle, wie Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, brauchen nicht zugesetzt werden, da als Bestandteile des Mediums vor seiner Sterilisierung Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile verwendet werden.
Das beimpfte Medium kann bei jeder Temperatur, bei der ein akzeptables Wachstum des Mikroorganismus möglich ist, beispielsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 18° und 50°, vorzugsweise zwischen etwa 20° und 370C, inkubiert werden. Üblicherweise erreicht man ein optimales Wachstum des Mikroorganismus in etwa 3 bis 15 Tagen. Das Medium bleibt während des Wachstumszyklus üblicherweise sauer. Der End-pH-Wert hängt teilweise von den gegebenenfalls vorhandenen Puffern und teilweise vom Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums ab.
Wenn das Wachstum bzw. die Züchtung in großen Kesseln und Tanks durchgeführt wird, bedient man sich vorzugsweise der vegetativen Form und nicht der Sporenform des Mikroorganismus zum Beimpfen, um eine deutliche Verzögerung des Mikroorganismuswachstums und eine darauf zurückzuführende ineffiziente Ausnutzung der Vorrichtung zu vermeiden.
Folglich ist es zweckmäßig, in einer Nährbrühe durch Beimpfen derselben mit einem aliquoten Teil aus einem Boden/ Flüssiger Np-Agarpfropfen oder einer geneigten Kultur ein vegetatives Inokulat zu schaffen. Wenn ein junges, aktives, vegetatives Inokulat gebildet ist, wird es aseptisch in große Gefäße oder Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetative Inokulat erzeugt wird, kann aus demselben oder einem anderen (als es zur Züchtung der Mikroorganismen verwendet wird) Medium bestehen, solange nur ein gutes Mikroorganismuswachstum gewährleistet ist.
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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nichts anderes angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben "Gew.-%" und sämtliche Verhältnisangaben bei Lösungsmittelgemischen "Volumenangaben".
Beispiel 1
Isolierung des Plasmids pUC6 aus einer biologisch reinen Kultur von Streptomyces espinosus, Biotype 23724a (DSM
Die Sporen einer biologisch reinen Kultur von Streptomyces espinosus, Biotype 23724a (DSM ) werden in 10 ml einer handelsüblichen Nährbrühe (Difco Antibiotic Medium No. 3 Broth) mit 0,15% Rindfleischextrakt, 0,15% Hefeextrakt, 0,5% Pepton, 0,1% Glucose, 0,35% NaCl, 0,368% K2HPO4 und 0,132% KH2PO4 inokuliert.
Das Medium war vorher in einem 50 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben sterilisiert worden. Nach der Beimpfung wird der Kolben etwa 36 bis 48 h lang auf einem mit 100 bis 250 Upm umlaufenden Drehrüttler bei einer Temperatur von 37°C inkubiert. Nach beendeter Inkubation wird die Mycel/Brühe-Suspension im Kolben unter sterilen Bedingungen homogenisiert und dann in einem sterilen 125 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben mit 10 ml des beschriebenen Mediums und ferner zweckmäßigerweise 68% Saccharose und 1% Glycin gemischt. Der Saccharose- und Glycinzusatz erleichtert das anschließende Lysieren der Zellen. Die Saccharose- und Glycinmengen im Medium können im Hinblick darauf, daß das anschließende Lysieren der Zellen erleichtert werden soll, routinemäßig eingestellt werden. Danach wird der Kolben nochmals 36 bis 48 h lang bei einer Temperatur von 37°C auf dem ange-
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gebenen Drehrüttler inkubiert. Nach Beendigung dieser Inkubation wird das Mycel durch Zentrifugieren mit niedriger Geschwindigkeit (beispielsweise 15 min lang bei einer Temperatur von 40C mit 6000 χ g) von der Brühe abgetrennt. Danach wird die überstehende Flüssigkeit von dem Mycelpellet abgegossen.
Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen, während das Pellet in 1,5 ml einer isotonischen Pufferlösung mit Äthylendiamintetraessigsäure und Saccharose, beispielsweise TES-Puffer (0,03m-Tris- (hydroxynTe^yl)-aminomethan), 0,005m-Ä'thylendiamintetraessigsäure und 0,05m-NaCl, pH: 8,0) mit 20% Saccharose, resuspendiert. Danach werden 1,5 ml einer 5 mg/ml-Lösung von Lysozym in demselben Puffer zugegeben, worauf das Gemisch unter gelegentlichem Vermischen 30 min lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert wird. Nach Zugabe von 1,5 ml O,25m-Äthylendiamintetraessigsäure (pH-Wert: 8,0) wird das erhaltene Gemisch 15 min lang bei einer Temperatur von 370C inkubiert. Schließlich wird die Zellensuspension durch Zusatz von 2,5 ml eines lysierenden Gemischs, beispielsweise 1,0 Gew.-% eines handelsüblichen Wasch- oder Reinigungsmittels, 0,4 Gew.-% Desoxycholsäure, 0,05m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (pH-Wert: 8,0) und 0,06m-Ä"thylendiamintetraessigsäure, lysiert und 20 min lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert. Danach wird das Lysat einer Scherkraft unterworfen, indem es 5- bis 10-mal durch eine 1O-ml-Pipette laufen gelassen wird. Das der Scherkraft unterworfene (und dabei gespaltene) Lysat wird weitere 20 min bei einer Temperatur von 370C mit 140 jx g/ml Ribonuklease und 300 ug/ml Pronase verdaut. Andererseits kann das Zellen/Lysozym/Äthylendiamintetraessigsäure-Gemisch auch vor dem Lysieren mit einem lysie-
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- .29" -
renden Mittel, z.B. 2% Natriumdodecylsulfat in Wasser, mit Ribonuklease und Pronase verdaut werden.
Das erhaltene Rohlysat wird dann mit einem Salz, z.B. Cäsiumchlorid (bevorzugt) oder Cäsiumsulfat, und dem einschiebenden (intercalating) Farbstoff Athidiumbromid gemischt, wobei eine Lösung einer Dichte von 1,550 erhalten wird. Diese Lösung wird bis zum Gleichgewicht bei 145000 χ g (isopyknisches Dichtegradientenzentrifugieren) zentrifugiert. Die kovalent geschlossene ringförmige Plasmid-DNS wird dann im Zentrifugenrohr bei Belichtung mit langwelligem Ultraviolett (320 mn) als schwacher fluoreszierender Streifen unter dem intensiv fluoreszierenden Streifen der linearen Chromosomen- und Plasmid-DNS'en sichtbar.
Zur Kennzeichnung wird kovalent geschlossene ringförmige Plasmid-DNS dargestellt, indem sie von den isopyknischen Gradienten entfernt, das Äthidiumbromid durch zwei Behandlungen mit einem Drittel Volumen Isopropanol extrahiert und schließlich die wäßrige Phase gegen einen geeigneten Puffer, beispielsweise 0,1 X SSC-Puffer (0-,01Sm-NaCl, 0,001Sm-Na3CgH5O7.2H2O, pH-Wert: 7,4), dialysiert wird. Hierbei erhält man im wesentlichen reines Plasmid pUC6.
Maßnahmen zur Kennzeichnung und Isolierung von pUC6:
Die Größe des Plasmids pUC6 wird durch Sedimentation in neutralen und alkalischen Saccharosegradienten unter Verwendung einer internen Marker-Plasmid-DNS eines Molekulargewichts von etwa 9,0 Megadalton und einem entsprechenden Sedimentationswert von etwa 34S bestimmt. Aus den neutralen Saccharosegradienten ergibt sich der Sedimentations-
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wert des Plasmids pUC6 mit 28,5S. Das Molekulargewicht des pUC6 errechnet sich aus den Gleichungen nach Hudson und Mitarbeitern (vgl. B. Hudson, D.A. Clayton und J. Vinograd in "Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.", Band 33, Seiten 435 bis 442 (1968) "Complex mitochondrial DNA"). Dieses Molekulargewicht stimmt gut mit dem aus den alkalischen Saccharosegradienten geschätzten Molekulargewicht überein.
Eine Schätzung des pUC6-Molekulargewichts ist auch aufgrund elektronenmikroskopischer Untersuchungen einzelner DNS-Moleküle möglich (vgl. A.K. Kleinschmidt (1968) "Monolayer techniques in electron microscopy of nucleic acid molecules" "Method in Enzymology", Herausgeber S.P. Colowick und N.O. Kaplan, Band 12B, Seiten 361 bis 377, Verlag Academic Press, New York). Es hat sich gezeigt, daß das Plasmid pUC6 eine durchschnittliche Umrißlänge von 3,05 x 10" m und ein entsprechendes Molekulargewicht von 6,0 Megadalton aufweist.
Die prozentuale Plasmid-DNS in Streptomyces espinosus, Biotype 23724a (DSM ) wird durch Markieren der Kultur mit [Methyl- H]-thymidin, Herstellen von Rohlysaten und Zentrifugieren der Lysate in Cäsiumchlorid/Äthidiumbromid-Dichtegradienten ermittelt. Die Gradienten werden fraktioniert, worauf eine Isotopenzählung erfolgt. Die prozentuale Radioaktivität im Plasmidstreifen dient zur Ermittlung der Menge der Plasmid-DNS und zur Berechnung der Plasmid-Kopienzahl (R. Radioff, W. Bauer und J. Vinograd (1967) "A dye-buoyant density method for detection and isolation of closed circular duplex DNA: The closed circular DNA in HeLa cells" in "Proc. Nat. Acad. Sei. USA», Band 57, Seiten 1514 bis 1520).
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Restriktionsendonuklease-Verdauung und Agarosegelelektrophorese:
Als Restriktionsendonukleasen werden Handelsprodukte verwendet. Die Enzymverdauungspräparate werden entsprechend den Vorschriften des jeweiligen Herstellers zubereitet, wobei mindestens ein zweifacher Überschuß an Endonuklease verwendet wird.
Bei einigen Versuchen wird Plasmid-DNS mit mehr als einer Endonuklease verdaut. Bei diesen Versuchen bedient man sich zweier Methoden. Bei der ersten Methode wird die Plas mid-DNS zunächst mit dem Enzym, das eine geringere Ionenstärke erfordert, und dann mit dem Enzym, das eine höhere Ionenstärke erfordert, nach Zusatz eines gleichen Volumens 2XPuffer zu dem zweiten Enzym verdaut. Bei der zweiten Methode werden Restriktionsfragmente einer Enzymverdauung gemäß den Vorschriften von Tanaka und Weisblum aus einem präparativen Agarosegel isoliert (vgl. T. Tanaka und B. Weisblum in "J. Bacteriol.", Band 121, Seiten 354 bis 362 (1975) "Construction of a colicin El-R factor composite plasmid in vitro: Means for amplification of deoxyribonucleic acid."). Die isolierten Restriktionsfragmente werden durch Äthanolfällung konzentriert und dann mit anderen Restriktionsenzymen verdaut. Doppelverdauungsversuche werden mit Einzelverdauungsversuchen 'verglichen, um sicherzustellen, daß keine unnormalen Restriktbnsmuster erhalten werden, d.h. daß keine nicht-spezifische DNS-Spaltung durch ein Enzym erfolgt, nachdem die Ionenstärke des Verdauungspräparats bzw. -gemischs geändert wird.
Die verdauten Proben werden auf 0,7- bis 1%ige Agarosegele appliziert und 2 h lang bei konstanter Spannung von 10
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bis 15 V/cm Gelhöhe einer Elektrophorese unterworfen (vgl. P.A. Sharp, J. Sugden und J. Sambrook in "Biochemistry",
Band 12, Seiten 3055 bis 3063 (1973) "Detection of two
restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis."). Die Molekulargewichte der Restriktionsfragmente werden, bezogen auf die Standardwanderungsmuster von mit dem Enzym Hind III verdauter Bakteriophagen-lambda-DNS, bestimmt (vgl. K. Murray und N.E. Murray in "J. Mol. Biol.", Band 98, Seiten 551 bis 564 (1975) "Ehage lambda receptor chromosomes for DNA fragments made with restriction endonuclease III of Haemophilus influenzae and restriction endonuclease I of Escherichia coli."). Als weiteres Enzym
eignet sich hierbei EcoRI (vgl. R.B. Helling, H.M. Goodman und H.W. Boyer in "J. Virology", Band 14, Seiten 1235 bis 1244 (1974) "Analysis of endonuclease R.EcoRI fragments of DNA form lambdoid bacteriophages and other viruses by
agarose-gel electrophoresis.").
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ι 3° T
Leerseite

Claims (5)

1. Im wesentlichen reines Plasmid pUC6, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 6,0 Megadalton und ein Restriktionsendonuklease-Spaltbild entsprechend der Zeichnung.
2. Biologisch reine Kultur von Streptomyces espinosus, Biotype 23724a (DSM ) mit etwa 20 bis etwa AO PlasmidpUC6-Kopien pro Zelle.
3. Verfahren zum Isolieren von im wesentlichen reinem Plasmid pUC6 aus Streptomyces espinosus, Biotype 23724a (DSM ), dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) Streptomyces espinosus, Biotype 23724a (DSM ) auf einem für Streptomyces espinosus geeigneten Kulturmedium bis zu einem ausreichenden Mycelwachstum wachsen läßt;
(b) das Mycel fragmentiert;
(c) das fragmentierte Mycel in einem geeigneten Kulturmedium (vgl. Stufe (a)) inkubiert;
(d) die Kultur nach einer geeigneten Zeit erntet;
(e) das geerntete Mycel lysiert und
(f) aus dem Lysat im wesentlichen reines Plasmid pUC6 isoliert.
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4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces espinosus, Biotype 23724a (DSM ) 36 bis 48 h lang bei einer Temperatur von etwa 37°C in einem Nährmedium züchtet.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das fragmentierte Mycel in einem Saccharose und Glycin enthaltenden Kulturmedium züchtet.
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