DE3011995A1 - Plasmid puc7 und verfahren zum isolieren von plasmid puc7 aus streptomyces espinosus subsp. acanthus - Google Patents
Plasmid puc7 und verfahren zum isolieren von plasmid puc7 aus streptomyces espinosus subsp. acanthusInfo
- Publication number
- DE3011995A1 DE3011995A1 DE19803011995 DE3011995A DE3011995A1 DE 3011995 A1 DE3011995 A1 DE 3011995A1 DE 19803011995 DE19803011995 DE 19803011995 DE 3011995 A DE3011995 A DE 3011995A DE 3011995 A1 DE3011995 A1 DE 3011995A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- plasmid
- puc7
- acanthus
- subsp
- streptomyces
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
- C12R2001/54—Streptomyces fradiae
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
# Registered Representatives
^ before the
European Patent Office
Möhlstraße 37 D-8000 München 80
Tel.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkl d Telegramme: ellipsoid
TUC 3567 - Dr.F/rm
THE UPJOHN COMPANY
Kalamazoo, Mich., V.St.A.
Kalamazoo, Mich., V.St.A.
Plasmid pUC7 und Verfahren zum Isolieren von Plasmid pUC7
aus Streptomyces espinosus subsp. acanthus
130008/0591
Die Entwicklung von Plasmidvektoren für rekombinante DNS-Gentechnologie
bei Mikroorganismen ist "bekannt. Eine ausführliche Zusammenfassung über die DNS-Forschung findet
sich in "Science", Band 196, April 1977.
Ähnliche DNS-Arbeiten sind derzeit bei industriell wichtigen
Mikroorganismen der Gattung Streptomyces im Gange (vgl. M.J. Bibb, J.M. Ward und D.A. Hopwood in "Nature", Band 274,
Seiten 398 bis A-OO (1978) "Transformation of plasmid DNA into Streptomyces at high frequency"). Obwohl in verschiedenen
Streptomyceten Plasmid-DNS'en nachgewiesen wurden
(vgl. M.L.B. Huber und 0. Godfrey in "Can, J. Microbiol.", Band 24, Seiten 631 und 632 (1978) "A general method for
lysis of Streptomyces species"; H. Schrempf, H. Bujard, D.A.
Hopwood und ¥. Goebel in "J. Bacteriol."., Band 121, Seiten 416 bis 421 (1975) "Isolation of covalently closed circular
deoxy-ribonucleic acid from Streptomyces coelicolor A3(2)"; H. Umezawa in "Biomedicine", Band 26, Seiten 236 bis 249
(1977) "Microbial secondary metabolities with potential use
in cancer treatment (Plasmid involvement in biosynthesis and compounds)" und V.S. Malik in "J. Antibiotics", Band
30, Seiten 897 bis 899 (1977) "Preparative Method for the
isolation of super-coiled DNA from a chloramphenicol producing Streptomycete"), wurde lediglich ein Streptomyceten-Plasmid
physikalisch isoliert und ausführlich in der Literatur beschrieben (vgl. Schrempf aaO). Das Vorliegen anderer
Plasmide in der Gattung Streptomyces wurde aus den in den folgenden Veröffentlichungen veröffentlichten genetischen
Daten geschlossen:
1 30008/0581
• ε-
(1) H. Akagawa, M. Okanishi und H. Umezawa in "J. Gen.
Microbiol.", Band 90, Seiten 336 bis 346 (1975)
"A plasmid involved in chloramphenicol production in Streptomyces venezuelae: Evidence from genetic
mapping";
(2) R.F. Freeman und D.A. Hopwood in "J. Gen. Microbiol.",
Band 106, Seiten 377 bis 381 (1978) "Unstable naturally occurring resistance to antibiotics in Streptomyces";
(3) E.J. Friend, M. Warren und D.A. Hopwood in "J. Gen.
Microbiol.", Band 106, Seiten 201 bis 206 (1978) "Genetic evidence for a plasmid controlling fertility
in an industrial strain of Streptomyces rimosus";
(4) D.A. Hopwood und H.M. Wright in "J. Gen. Microbiol.",
Band 79, Seiten 331 bis 342 (1973) "A plasmid of Streptomyces coelicolor carrying a chromosomal locus
and its inter-specific transfer";
(5) K. Hotta, Y. Okami und H. Umezawa in "J. Antibiotics",
Band 30, Seiten 1146 bis 1149 (1977) "Elimination
of the ability of a kanamycin-producing strain to biosynthesize deoxystreptamine moiety by acriflavine";
(6) R. Kirby, L.F. Wright und D.A. Hopwood in "Nature",
Band 254, Seiten 265 bis 267 (1975) "Plasmiddetermined antibiotic synthesis and resistance in
Streptomyces coelicolor";
(7) R. Kirby und D.A. Hopwood in "J. Gen. Microbiol.",
130008/OS91
• 6-
Band 98, Seiten 239 bis 252 (1977) "Genetic determination
of methylenomycin synthesis by the SCPI plasmid of Streptomyces coelicolor A3(2)" und
(8) M. Okanishi, T. Ohta und H. Umezawa in "J. Antibiotics",
Band 33, Seiten 45 bis 47 (1969) "Possible control of formation of aerial mycelium and antibiotic
production in Streptomyces by episomic factors".
Das Plasmid pUC7 erhält man aus dem Mikroorganismus Streptomyces espinosus subsp. acanthus (DSM 4Z^S ). Dieses Plasmid
erhält man aus dem Mikroorganismus Streptomyces espinosus subsp. acanthus (DSM 4Zm?) durch Züchten der Kultur auf
einem geeigneten Medium, Fragmentieren des Mycels, Inkubieren des fragmentierten Mycels, Ernten der Kultur nach einer
geeigneten Zeit und anschließendes Lysieren des Mycels. Aus dem erhaltenen Lysat läßt sich im wesentlichen reines Plasmid
pUC7 isolieren. Das Plasmid pUC7 ist in vorteilhafter Weise klein und für eine Spaltung durch die verschiedensten
Restriktionsendonukleasen empfänglich. Diese Eigenschaften sollten es auf einfache Weise Modifizierungen zugänglich
machen und an eine Reihe von Wirtvektor systemen anpassen.
Das Plasmid pUC7 wird durch Standardkennzeichnungstests, z.B. sein Molekulargewicht von etwa 10 bis 11 Megadalton,
ein Restriktionsbild bzw. eine Restriktionskarte entsprechend der Zeichnung und die Anwesenheit von 2 bis 4 Kopien
pro Streptomyces-espinosus-subsp. -acanthus- (DSM -^fE )-Zelle,
gekennzeichnet.
Das Plasmid pUC7 eignet sich als Klonungsvektor bei DNS-Arbeiten,
bei welchen dem Plasmid die gewünschten Gene
1 30000/0591
einverleibt werden und dann eine TraiöTormierung des Plasmids
in einen geeigneten Wirt erfolgt.
In der Zeichnung ist das Restriktionsendonuklease-Spaltungsbild
für das Plasmid pUC7 dargestellt. Das Bild ist auf der Basis eines Plasmids pUC7 eines Molekulargewichts von
etwa 10,7 Megadalton bzw. einer Moleküllänge von ca.
16,2 Kilobasen konstruiert. Die Bildpositionen der verschiedenen Restriktionsstellen sind als Kilobasekoordinaten
relativ zu der BgI-II-Restriktionsstelle bei O,O/16,2
Kilobasen angegeben. Für die Restriktionsendonukleasen werden
folgende Abkürzungen benutzt:
(1) BgI II ist ein Enzym aus Bacillus globigii;
(2) Bam HI ist ein Enzym aus Bacillus amyloliquefaciens
HI;
(3) Pst I ist ein Enzym aus Providencia stuartiii64;
(4) Kpn I ist ein Enzym aus Klebsiella pneumoniae und
(5) Xho I ist ein Enzym aus Xanthomonas holcicola.
Bei der Betrachtung der Zeichnung sollte darauf geachtet werden, daß zwei Interpretationsmöglichkeiten existieren.
Einmal läßt sich die Orientierung der Bam-HI- und Pst-1-Restriktionsstellen,
die bei 14,5 Kilobasen aufgetragen sind, nicht bestimmen. Andererseits ist aus Symmetrieerwägungen
eine der beiden Kpn-I-Restriktionsstellen bei 0,7 bzw. 3,7 Kilobase(n) aufgetragen. Letztere Interpretation
ist in der Zeichnung durch gestrichelte Linien dargestellt.
130008/0591
Beschreibungspassage (ersetzt den 1. Absatz von Seite 7)
Wie bereits erwähnt, erhält man das Plasmid pUC7 aus Streptomyces espinosus subsp. acanthus
(DSM 1248).
Die biologisch reine Kultur ist bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen der Gesellschaft für
Strahlen- und Umweltforschung mbH München.
Grisebachstraße 8, J4oo Göttingen, unter der Hinterlegungsnummer DSM 1248 hinterlegt
130008/0591
Wie De]TeI1Cs orwoJcint, erhält iftstft stets—Pl&smid—pUC7
tomyces espinosus subsp. acanthus (NRRL 11081^-HBie"biologisch
reine Kultur ist in der DaußE^saffimiung der Northern
Regional Research^JLafeoj?ajfc6fy7u.S. Department of Agriculture,
Pesr-ierj-^lliinois, USA, unter der Hinterlegungsnummer
e·
Charakterisierung von Plasmid pUC7:
Molekulargewicht: etwa 10 bis 11 Megadalton Anzahl Kopien pro Zelle: 2 bis 4
Empfindlichkeit gegenüber Restriktionsendonukleasen:
Das Plasmid pUC7 besitzt folgende Empfindlichkeitseigenschaften gegenüber Restriktionsendonukleasen (vgl. das
in der Zeichnung dargestellte Restriktionsendonuklease-Spaltungsbild für das Plasmid pUC7):
Plasmidempfindlichkeitseigenschaften gegenüber Restriktionsendonukleasen
:
Spaltstellen
Spaltstellen
| Enzym | Plasmid pUC7 | Enzym | Plasmid pUC7 |
| BgI I | >7 | BgI II | 2 |
| Bam HI | 4 | Hpa I | 0 |
| Hpa II | zahlreiche | Hind III | 2 bis 3 |
| EcoRI | 0 | Kpn I | 2 |
| Pst I | 2 | Pvu II | >5 |
| Mbo II | >6 | Ava I | >8 |
| Xba I | 3 | Xho I | 3 |
| Sal I | >7 | Sma I | zahlreiche |
| Hinc II | zahlreiche | Bei I | zahlreiche |
130008/0591
- 40-
Diese Ergebnisse wurden durch Digerieren von pUC7-DNS in Gegenwart eines Überschusses an Restriktionsendonuklease
erhalten. Die Anzahl der Restriktionsstellen wurde aus der Anzahl der in 0,7- bzw. 1,Obigen Agarosegelen auflösbaren
Fragmente bestimmt.
pUC7 kann zur Schaffung rekombinanter Plasmide, die durch Transformation in Wirtbakterien eingefügt werden können,
herangezogen werden. Es ist bekannt, wie rekombinante Plasmide geschaffen werden können. Bei einem solchen Verfahren
erfolgt eineSpaltung des isolierten Vektorplasmids, beispielsweise pUC7, an spezifischer (spezifischen) Stelle(n)
mit Hilfe einer Restriktionsendonuklease, beispielsweise BgI II, Pst I und dergleichen. Das Plasmid, bei dem es sich
um ein ringförmiges DNS-Molekül handelt, wird dabei durch das Enzym, das die beiden DNS-Stränge an einer speziellen
Stelle zerschneidet, in ein lineares DNS-Molekül überführt. Eine andere Nicht-Vektor-DNS wird mit demselben Enzym in
ähnlicher Weise gespalten. Beim Vermischen des linearen Vektors oder von Teilen desselben mit Nicht-Vektor-DNS'en,
können sich ihre einsträngigen oder stumpfen Enden miteinander paaren und in Gegenwart eines als Polynukleotidligase
bekannten zweiten Enzyms unter Bildung eines einzigen DNS-Rings kovalent vereinigen.
Die geschilderten Maßnahmen können auch zum Einbau einer bestimmten DNS-Länge aus einem höheren Tier in pUC7 herangezogen
werden. So kann beispielsweise die DNS, die bei Fröschen für eine Ribosomen-RNS-Codierung verantwortlich
ist, mit der gespaltenen pUC7-DNS gemischt werden. Die erhaltenen ringförmigen DNS-Moleküle bestehen aus PlasmidpUC7
mit einer eingefügten Länge Frosch-rDNS.
130008/0591
Die unter Verwendung von pUC7 erhaltenen, ein gewünschtes genetisches Element enthaltenden rekombinierten Plasmide
können zu Abdruckzwecken in einen Wirtsorganismus eingeschleust werden. Beispiele für wertvolle Gene, die in der
geschilderten Weise in Wirtsorganismen eingeschleust werden können, sind Gene mit Somatostatin-, Rattenproinsulin-
und Proteasencodierung.
Der Nutzen des Plasmids pUC7 beruht auf seiner Fähigkeit
zur Wirkung als Plasmidvektor bei industriell bedeutenden Mikroorganismen, z.B. Streptomyces. So erhält man durch
Klonung einer genetischen Information aus Streptomyces in pUC7 eine Möglichkeit zur Steigerung industriell wertvoller
Produkte aus diesen Organismen, z.B. von Antibiotika.
Dieser Versuch ist dem Konzept einer Klonung von Genen für Antibiotikumproduktion in das gut charakterisierte Escherichia-coli-K-12-Wirt/Vektor-System
vergleichbar. Das E.-coli-System hat den Nachteil, daß Gene aus einigen gram-positiven
Organismen, z.B. Bacillus, in dem gram-negativen E.-coli-Wirt nicht gut abklatschbar sind (do not express well).
In gleicher Weise verbleiben Plasmide aus gram-negativen Organismen nicht in gram-positiven Wirten, so daß in grampositiven Wirten gram-negative genetische Information entweder
schlecht oder überhaupt nicht abgeklatscht (expressed) wird. Dies veranschaulicht klar und deutlich den Vorteil
eines gram-positiven Wirt/Vektor-Systems und den Nutzen von Plasmid pUC7 in einem solchen System.
In der Regel erfordert die Verwendung eines Wirt/Vektor-Systems zur Herstellung eines für den Wirt fremden Produkts
die Einschleusung von Genen für den gesamten biosyntheti-
130008/0591
•/12
sehen Weg des Produkts in den neuen Wirt. Wie bereits ausgeführt,
kann dies zu Problemen beim genetischen Abklatsch (genetic expression) führen. Ferner können auch neue und/
oder verstärkte Probleme bei der Züchtung der Mikroorganismen und bei der Extraktion und Reinigung des Produkts auftreten.
Ein vielleicht brauchbarerer Versuch besteht darin, einen Plasmidvektor, z.B. pUC7, in einen normalerweise
das Produkt liefernden Wirt einzuschleusen und auf das Plasmid die Gene für die Biosynthese des Produkts zu klonen.
Zumindest sollten sich dadurch die Probleme bei der Züchtung und Produktextraktion und -reinigung auf ein Mindestmaß
senken lassen. Darüber hinaus dürfte es bei diesem Klonungssystem
nicht erforderlich sein, sämtliche Gene des Biosyntheseweges zu klonen und zu verstärken, vielmehr dürfte
es lediglich erforderlich sein, Steuergene (regulatory genes) oder Gene mit Codierung für die Geschwindigkeit der
Produktbiosynthese begrenzende Enzyme zu klonen. Da das Plasmid pUC7 ein Streptomycetenplasmid darstellt, ist es in
dieser Hinsicht für die Gattung Streptomyces ideal geeignet. Da ferner das Plasmid pUC7 ein Plasmid aus einem gram-positiven
Organismus darstellt, kann es in einer Reihe anderer Mikroorganismen, z.B. Bacillus, Arthrobacter und dergleichen,
als Vektor dienen.
Streptomyces espinosus subsp. acanthus (DSM 42-^8) läßt
sich in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen züchten. Die Züchtung kann beispielsweise in
einem Nährmedium mit einem assimilierbaren Kohlenhydrat als Kohlenstoffquelle, einer assimilierbaren Stickstoffverbindung
oder einem eiweißartigen oder -haltigen Material als Stickstoffquelle wachsen gelassen werden. Bevorzugte Kohlenstoff
lief eranten sind Glucose, brauner Zucker, Saccha-
130008/0591
■fll-
rose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind
Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sooabohnenmehl, Baumwollsaatmehl,
Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Casein, Fischmehl, Destillationsfeststoffe, Tierpeptonflüssigkeiten,
Fleisch- und Knochenabfälle und dergleichen. Zweckmäßigerweise werden Kombinationen dieser Kohlenstoff-
und Stickstoffqullen verwendet. Spurenmetalle, wie Zink,
Magnesium, Mangan, Kobalt und Eisen und dergleichen, müssen nicht zugesetzt werden, da als Bestandteile des Mediums
vor seiner Sterilisierung Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile verwendet werden.
Das beimpfte Medium kann bei 3eder Temperatur, bei der ein
akzeptables Wachstum des Mikroorganismus möglich ist, beispielsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 18° und 50°,
vorzugsweise zwischen etwa 20° und 37°C, inkubiert werden. Üblicherweise erreicht man ein optimales Wachstum des Mikroorganismus
in etwa 3 bis 15 Tagen. Das Medium bleibt während des Wachstumszyklus üblicherweise sauer. Der End-pH-Wert
hängt teilweise von den gegebenenfalls vorhandenen Puffern und teilweise vom Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums ab.
Wenn das Wachstum bzw. die Züchtung in großen Kesseln und Tanks durchgeführt wird, bedient man sich vorzugsweise der
vegetativen Form und nicht der Sporenform des Mikroorganismus zum Beimpfen, um eine deutliche Verzögerung des Mikroorganismuswachstums
und eine darauf zurückzuführende ineffiziente Ausnutzung der Vorrichtung zu vermeiden.
Folglich ist es zweckmäßig, in einer Nährbrühe durch Beimpfen derselben mit einem aliquoten Teil aus einem Boden/
130008/OB91
- yt -
Flüssiger N^-Agarpfropfen oder einer geneigten Kultur ein
vegetatives Inokulat zu schaffen. Wenn ein junges, aktives, vegetatives Inokulat gebildet ist, wird es aseptisch in
große Gefäße oder Tanks überführt. Das Medium, in dem das vegetative Inokulat erzeugt wird, kann aus demselben oder
einem anderen (als es zur Züchtung der Mikroorganismen verwendet wird) Medium bestehen, solange nur ein gutes
Mikroorganismuswachstum gewährleistet ist.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nichts anderes angegeben, bedeuten sämtliche
Prozentangaben "Gew.-%" und sämtliche Verhältnisangaben
bei Lösungsmittelgemischen ''Volumenangaben".
Beispiel
Isolierung des Plasmids pUC7 aus einer büogisch reinen
Kultur von Streptomyces espinosus subsp. acanthus (DSM 42-9%)
Die Sporen einer biologisch reinen Kultur von Streptomyces espinosus subsp. acanthus (DSM ΛΖ-ΗΖ ) werden in 10 ml einer
handelsüblichen Nährbrühe (Difco Antibiotic Medium No. 3
Broth) mit 0,15$ Rindfleischextrakt, 0,15% Hefeextrakt,
0,5% Pepton, 0,1% Glucose, 0,35% NaCl, 0,368% K2HPO4 und
0,132% KH2PO4 inokuliert.
Das Medium war vorher in einem 50 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben sterilisiert worden. Nach der Beimpfung wird der
Kolben etwa 36 bis 48 h lang auf einem mit 100 bis 250 Upm umlaufenden Drehrüttler bei einer Temperatur von 37°C inkubiert.
Nach beendeter Inkubation wird die Mycel/Brühe-Suspension im Kolben unter sterilen Bedingungen homogeni-
130008/0591
- ή - -AS-
siert und dann in einem sterilen 125 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben
mit 10 ml des beschriebenen Mediums und ferner zweckmäßigerweise 68% Saccharose und 1% Glycin gemischt.
Der Saccharose- und Glycinzusatz erleichtert das anschließende Lysieren der Zellen. Die Saccharose- und Glycinmengen
im Medium können im Hinblick darauf, daß das anschließende Lysieren der Zellen erleichtert werden soll, routinemäßig
eingestellt werden. Danach wird der Kolben nochmals 36 bis 48 h lang bei einer Temperatur von 370C auf dem angegebenen
Drehrüttler inkubiert. Nach Beendigung dieser Inkubation wird das Mycel durch Zentrifugieren mit niedriger
Geschwindigkeit (beispielsweise 15 min lang bei einer Temperatur von 4°C mit 6000 χ g) von der Brühe abgetrennt. Danach
wird die überstehende Flüssigkeit von dem Mycelpellet abgegossen.
Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen, während das Pellet in 1,5 ml einer isotonischen Pufferlösung mit Äthylendiamintetraessigsäure
und Saccharose, beispielsweise TES-Puffer (0,03m-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan), 0,005m-Äthylendiamintetraessigsäure
und 0,05m-NaCl, pH: 8,0) mit 20% Saccharose, resuspendiert. Danach werden 1,5 ml einer
5 mg/ml-Lösung von Lysozym in demselben Puffer zugegeben, worauf das Gemisch unter gelegentlichem Vermischen 30 min
lang bei einer Temperatur von 370C inkubiert wird. Nach
Zugabe von 1,5 ml O,25m-Äthylendiamintetraessigsäure (pH-Wert: 8,0) wird das erhaltene Gemisch 15 min lang bei einer
Temperatur von 37°C inkubiert. Schließlich wird die Zellensuspension durch Zusatz von 2,5 ml eines lysierenden Gemischs,
beispielsweise 1,0 Gew.-% eines handelsüblichen Wasch- oder Reinigungsmittels, 0,4 Gew.-% Desoxycholsäure,
130008/0591
■Ab-
0,05m-Tris-(liydroxymethyl)-aminomethan (pH-Wert: 8,0) und
O^öm-Äthylendiamintetraessigsäure, lysiert und 20 min
lang bei einer Temperatur von 37° C inkuMert. Danach wird
das Lysat einer Scherkraft unterworfen, indem es 5- bis
10-mal durch eine 1O-ml-Pipette laufen gelassen wird. Das
der Scherkraft unterworfene (und dabei gespaltene) Lysat wird weitere 20 min bei einer Temperatur von 37°C mit
140 ug/ml Ribonuklease und 300 11 g/ml Pronase verdaut.
Andererseits kann das Zellen/Lysozym/Äthylendiamintetraessigsäure-Gemisch
auch vor dem Lysieren mit einem lysierenden Mittel, z.B. 2% Natriumdodecylsulfat in Wasser, mit
Ribonuklease und Pronase verdaut werden.
Das erhaltene Rohlysat wird dann mit einem Salz, z.B. Cäsiumchlorid
(bevorzugt) oder Cäsiumsulfat, und dem einschiebenden (intercalating) Farbstoff Äthidiumbromid gemischt,
wobei eine Lösung einer Dichte von 1,550 erhalten wird. Diese Lösung wird bis zum Gleichgewicht bei 145000 χ g
(isopyknisches Dichtegradientenzentrifugieren) zentrifugiert.
Die kovalent geschlossene ringförmige Plasmid-DNS wird dann im Zentrifugenrohr bei Belichtung mit langwelligem
Ultraviolett (320 nm) als schwacher fluoreszierender Streifen unter dem intensiv fluoreszierenden Streifen der
linearen Chromosomen- und Plasmid-DNS'en sichtbar.
Zur Kennzeichnung wird kovalent geschlossene ringförmige Plasmid-DNS dargestellt, indem sie von den isopyknischen
Gradienten entfernt, das Äthidiumbromid durch zwei Behandlungen mit einem Drittel Volumen Isopropanol extrahiert
und schließlich die wäßrige Phase gegen einen geeigneten Puffer, beispielsweise 0,1 X SSC-Puffer (0,015m-NaCl,
0,0015Ea-Na3C6H5O7.2K2O, pH-Wert: 7,4), dialysiert wird.
Hierbei erhält man im wesentlichen reines Plasmid pUC7.
130008/0591
Maßnahmen zur Kennzeichnimg und Isolierung von pUC7:
Die Größe des Plasmids pUC7 wird durch Sedimentation in
neutralen und alkalischen Saccharosegradienten unter Verwendung einer internen Marker-Plasmid-DNS eines Molekulargewichts
von etwa 9,0 Megadalton und einem entsprechenden Sedimentationsert von etwa 34S bestimmt. Aus den neutralen
Saccharosegradienten ergibt sich der Sedimentationswert des Plasmids pUC7 mit 35 bis 37S. Das Molekulargewicht
des pUC7 errechnet sich aus den Gleichungen von Hudson und Mitarbeitern (vgl. B. Hudson, D.A. Clayton und
J. Vinograd in "Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.",
Band 33, Seiten 435 bis 442 (1968) "Complex mitochondrial DNS"). Dieses Molekulargewicht stimmt gut mit dem aus den
alkalischen Saccharosegradienten geschätzten Molekulargewicht überein.
Eine Schätzung des pUC7-Molekulargewichts ist auch aufgrund elektronenmikroskopischer Untersuchungen einzelner DNS-Moleküle
möglich (vgl. A.K. Kleinschmidt (1968) »Monomer
techniques in electron microscopy of nucleic acid molecules" "Method in Enzymology", Herausgeber S.P. Colowick und N.O.
Kaplan, Band 12B, Seiten 361 bis 377, Verlag Academic Press,
New York). Es hat sich gezeigt, daß das Plasmid pUC7 eine durchschnittliche Umrißlänge von 5,43 x 1Cr5 m und ein entsprechendes
Molekulargewicht von 10,7 Megadalton aufweist.
c/ Die prozentuale Plasmid-DNS in Streptomyces espinosus,
subsp. acanthus (DSM Λ2#$, ) wird durch Markieren der Kultur
mit [Methyl-%]-thymidin, Herstellen von Rohlysaten und
Zentrifugieren der Lysate in Cäsiumchlorid/Äthidiumbromid-Dichtegradienten
ermittelt. Die Gradienten werden fraktio-
130008/05Θ1
··'-■ ye -
niert, worauf eine Isotopenzählung erfolgt. Die prozentuale Radioaktivität im Plasmidstreifen dient zur Ermittlung
der Menge der Plasmid-DNS und zur Berechnung der Plasmid-Kopienzahl
(R. Radioff, W. Bauer und J. Vinograd (1967) "A dye-buoyant density method for detection and isolation
of closed circular duplex DNA: The closed circular DNA in HeLa cells" in "Proc. Nat. Acad. Sei. USA", Band 57,
Seiten 1514 Ms 1520).
Restriktionsendonuklease-Verdauung und Agarosegelelektrophorese:
Als Restriktionsendonukleasen werden Handelsprodukte verwendet. Die Enzymverdauungspräparate werden entsprechend
den Vorschriften des jeweiligen Herstellers zubereitet, wobei mindestens ein zweifacher Überschuß an Endonuklease
verwendet wird.
Bei einigen Versuchen wird Plasmid-DNS mit mehr als einer Endonuklease verdaut. Bei diesen Versuchen bedient man
sich zweier Methoden. Bei der ersten Methode wird die Plasmid-DNS zunächst mit dem Enzym, das eine geringere Ionenstärke
erfordert, und dann mit dem Enzym, das eine höhere Ionenstärke erfordert, nach Zusatz eines gleichen Volumens
2XPuffer zu dem zweiten Enzym verdaut. Bei der zweiten Methode
werden Restriktionsfragmente einer Enzymverdauung gemäß den Vorschriften von Tanaka und Weisblum aus einem
präparativen Agarosegel isoliert (vgl. T. Tanaka und B. Weisblum in "J. Bacteriol", Band 121, Seiten 354 bis 362
(1975) "Construction of a colicin El-R factor composite plasmid in vitro; Means for amplification of deoxyribonucleic
acid."). Die isolierten Restriktionsfragmente wer-
130008/0S91
den durch Äthanolfällung konzentriert und dann mit anderen Restriktionsenzymen verdaut. Doppelverdauungsversuche
werden mit ^inzelVerdauungsversuchen verglichen, um sicherzustellen,
daß keine unnormalen Restriktionsmuster erhalten werden, d.h. daß keine nicht-spezifische DNS-Spaltung
durch ein Enzym erfolgt, nachdem die Ionenstärke des Verdauungspräparats bzw. -gemischs geändert wird.
Die verdauten Proben werden auf 0,7- bis 1%ige Agarosegele
appliziert und 2 h lang bei konstanter Spannung von 10 bis 15 V/cm Gelhöhe einer Elektrophorese unterworfen (vgl.
P.A. Sharp, J. Sugden und J. Sambrook in "Biochemistry", Band 12, Seiten 3055 bis 3063 (1973) "Detection of two
restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis
."). Die Molekulargewichte der Restriktionsfragmente
werden, bezogen auf die Standardwanderungsmuster von mit dem Enzym Hind III verdauter Bakteriophagen-lambda-DNS,
bestimmt (vgl. K. Murray und N.E. Murray in "J. Mol. Biol.",
Band 98, Seiten 551 bis 564 (1975) "Phage lambda receptor chromosomes for DNA fragments made with restriction endonuclease
III of Haemophilus influenzae and restriction endonuclease I of Escherichia coll."). Als weiteres Enzym
eignet sich hierbei EcoRI (vgl. R.B. Helling, H.M. Goodman
und H.W. Boyer in "J. Virology", Band 14, Seiten 1235 bis 1244 (1974) "Analysis of endonuclease R.EcoRI fragments of
DNA form lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.").
130008/0591
Leerseite
Claims (4)
1. Im wesentlichen reines Plasmid pUC7, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 10 bis 11 Megadalton
und ein Restriktionsendonuklease-Spaltbild entsprechend der Zeichnung.
2. Verfahren zum Isolieren von im wesentlichen reinem
Plasmid pUC7 aus Streptomyces espinosus subsp. acanthus (DSM --/2^, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) Streptomyces espinosus subsp. acanthus (DSM Ί2.(/-8 )
auf einem für Streptomyces espinosus geeigneten Kulturmedium bis zu einem ausreichenden Mycelwachstum
wachsen läßt;
(b) das Mycel fragmentiert;
(c) das fragmentierte Mycel in einem geeigneten Kultur medium (vgl. Stufe (a)) inkubiert;
(d) die Kultur nach einer geeigneten Zeit erntet;
(e) das geerntete Mycel lysiert und
(f) aus dem Lysat im wesentlichen reines Plasmid pUC7
isoliert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces espinosus subsp. acanthus (DSM JZkS
etwa 36 bis 48 h lang bei einer Temperatur von etwa 370C in einem Nährmedium züchtet.
13ÖQÖ8/O591
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das fragmentierte Mycel in einem Saccharose und
Glycin enthaltenden Kulturmedium züchtet.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2826879A | 1979-04-09 | 1979-04-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3011995A1 true DE3011995A1 (de) | 1981-02-19 |
Family
ID=21842482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19803011995 Withdrawn DE3011995A1 (de) | 1979-04-09 | 1980-03-27 | Plasmid puc7 und verfahren zum isolieren von plasmid puc7 aus streptomyces espinosus subsp. acanthus |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS55141500A (de) |
| DE (1) | DE3011995A1 (de) |
| FR (1) | FR2453894A1 (de) |
| GB (1) | GB2046272B (de) |
| IT (1) | IT8021179A0 (de) |
| NL (1) | NL8001676A (de) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4508826A (en) * | 1982-04-15 | 1985-04-02 | Merck & Co., Inc. | Bacteriophage DNA cloning vector TG1 and microorganisms containing TG1 |
| US4460689A (en) * | 1982-04-15 | 1984-07-17 | Merck & Co., Inc. | DNA Cloning vector TG1, derivatives, and processes of making |
| FR2528069B1 (fr) * | 1982-06-02 | 1985-07-12 | Elf Bio Rech | Nouveau vecteur de clonage et d'expression, levure transformee par ce vecteur |
| US4703009A (en) * | 1983-03-08 | 1987-10-27 | Merck & Co., Inc. | RDNA cloning vector pVE1, deletion and hybrid mutants and recombinant derivatives thereof products and processes |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4259450A (en) * | 1977-02-28 | 1981-03-31 | The Upjohn Company | Antibiotic acanthomycin and process for preparing |
-
1980
- 1980-03-21 NL NL8001676A patent/NL8001676A/nl not_active Application Discontinuation
- 1980-03-27 DE DE19803011995 patent/DE3011995A1/de not_active Withdrawn
- 1980-04-02 GB GB8011000A patent/GB2046272B/en not_active Expired
- 1980-04-03 IT IT8021179A patent/IT8021179A0/it unknown
- 1980-04-07 JP JP4477880A patent/JPS55141500A/ja active Pending
- 1980-04-08 FR FR8007839A patent/FR2453894A1/fr active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2046272B (en) | 1982-11-17 |
| IT8021179A0 (it) | 1980-04-03 |
| JPS55141500A (en) | 1980-11-05 |
| FR2453894A1 (fr) | 1980-11-07 |
| GB2046272A (en) | 1980-11-12 |
| NL8001676A (nl) | 1980-10-13 |
| FR2453894B1 (de) | 1984-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3005226A1 (de) | Plasmid puc6, dieses enthaltende kultur von streptomyces espinosus und verfahren zum isolieren von plasmid puc6 aus streptomyces espinosus | |
| EP0472869A2 (de) | Neue Plasmide aus Corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete Plasmidvektoren | |
| DD216044A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines rekombinierenden dna-klonierungsvektors | |
| DD208823A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines plasmids | |
| DD204265A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines rekombinanten dna klonierungsvektors | |
| US4332898A (en) | Hybrid plasmid and process of making same | |
| DD219796A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines rekombinanten dna-klonierungsvektors | |
| DD215579A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines funktionell unabhaengigen rekombinanten dna-klonierungsvektors | |
| DE3011995A1 (de) | Plasmid puc7 und verfahren zum isolieren von plasmid puc7 aus streptomyces espinosus subsp. acanthus | |
| EP0070522B1 (de) | Plasmid p SVH 1 und seine Verwendung | |
| DE3008647A1 (de) | Plasmid puc1 und verfahren zum isolieren von plasmid puc1 aus streptomyces fradiae | |
| DE3735379A1 (de) | Rna-polymerase-gen, verfahren zu seiner herstellung und mikroorganismus mit diesem gen | |
| EP0066701B1 (de) | Plasmid p SG 2 und Verfahren zu seiner Gewinnung | |
| DE3008645A1 (de) | Plasmid puc2 und verfahren zum isolieren von plasmid puc2 aus streptomyces fradiae | |
| DD211360A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines rekombinierenden dna-klonierungsvektors | |
| DE3005225A1 (de) | Plasmid puc3 und verfahren zu seiner isolierung | |
| DE3008646A1 (de) | Plasmid puc8 und verfahren zum isolieren von plasmid puc8 aus streptomyces fradiae | |
| DE3008648A1 (de) | Plasmid puc9 und verfahren zum isolieren von plasmid puc9 aus streptomyces fradiae | |
| DE3105757A1 (de) | Plasmid puc2 und verfahren zum isolieren von plasmid puc2 aus streptomyces fradiae | |
| EP0187138B1 (de) | Mikroorganismus und Plasmid für konstitutive Creatinamidino-hydrolase-Bildung sowie Verfahren zur Herstellung derselben | |
| DE69929745T9 (de) | Neuer Bakteriophage, Verfahren zur Isolierung und dafür geeignetes universales Wachstumsmedium | |
| EP1636389B1 (de) | Plasmidfreier klon des e. coli-stammes dsm 6601 | |
| DE69633993T2 (de) | Zirkuläre Plasmide aus Rhodococcus | |
| EP0098967B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von obligat methylotrophen, Fremd-DNA exprimierenden Bakterien und dafür geeignete Plasmide und Wirtsorganismen | |
| US4460691A (en) | Streptomyces plasmid prophage pUC13 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: HENKEL, G., DR.PHIL. FEILER, L., DR.RER.NAT. HAENZ |
|
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |