NL8001676A - Plasmide dna en werkwijze voor het verkrijgen daarvan. - Google Patents

Description

tf " >

Plasmide DM en werkwijze voor het verkrijgen daarvan.

Het is bekend, dat bacteriële plasmiden worden gebruikt voor recombinant DM onderzoek. Voor een goed overzicht van de ontwikkeling op dit gebied wordt verwezen naar Science, vol. 196, april 1977· Recombinant DM onderzoek aan industrieel belangrijke 5 mieroorganismen van het genus Streptomyces is beschreven door

Bibb, M.J., Ward, J.M., en Hopwood, D.A., 1978: "Transformation of plasmid DNA into Streptomyces at high frequency”, Nature 271+, 398-1*00.

Aan verscheidene Streptomyceten is vastgesteld, 10 dat deze DNA plasmiden bevatten. Zie Huber, M.L.B. en Godfrey, 0.

1978 : "A general method for lysis of Streptomyces species”, Can.

J. Microbiol. 2^, 631-632; Schrempf, H., Bufard, H., Hopwood, D.A. en Goebel, W., 1975·* "Isolation of covalently closed circular deoxyribonucleic acid from Streptomyces coelicolor A3(2)", 15 J. Bacterid. 121, 1+16-1+21; Umezawa, H, 1977: "Microbial secondary metabolities with potential use in cancer treatment (Plasmid involvement in biosynthesis and compounds)", Biomedicine 26, 236-21+9; en Malik, V.S. 1977: Preparative Method for the isolation of supercoiled DNA from a chloramphenicol producing Streptomycete, 20 J. Antibiotics 30, 897-899. Niettemin is tot nog toe slechts êén Streptomyceet plasmide geïsoleerd en beschreven door Schrempf supra. Dat in het genus Streptomyces nog andere plasmiden voorkomen, kan worden afgeleid uit resultaten van genetisch onderzoek beschreven door: 25 (t) Akagawa, H., Okanishi, M. en Umezawa, H. , 1975: "A plasmid involved in chloramphenicol production in Streptomyces venezuelae: Evidence from genetic mapping", J. Gen. Microbiol. 90, 336-31+6 8 0 0 1 6 76 2 (2) Freeman, R.F. en ïïopwood, D.A., 1978: "Unstable naturally occurring resistance to antibiotics in Streptomyces”, J. Gen, Microbiol. 106, 377-381.

5 (3) Friend, E.J., Warren, M. en Hopvood, D.A., 1978: "Genetic evidence for a plasmid controlling fertility in an industrial strain of Streptomyces rimosus", J. Gen. Microbiol. J06, 201-206.

10 (U) Hopvood, D.A. en Wright, H.M. 1973: "A plasmid of Streptomyces coelicolor carrying a chromosomal locus and its inter-specific transfer", J. Gen. Microbiol. 79, 331-3^2.

(5) Hotta, K., Okami, Y. en Umezava, H. 1977: 15 "Elimination of the ability of a kanamycin- producing strain to biosynthesize deoxystrepta-- mine moiety bij acriflavine", J. Antibiotics 30, 11U6-11U9.

(6) Kirby, R., Wright, L.F. en Hopvood, D.A., 1975: 20 "Plasmid-determined antibiotic synthesis and resistance in Streptomyces coelicolor", Nature 25k, 265-267.

(7) Kirby, R. en Hopvood, D.A. 1977: "Genetic determination, of methylenomycin synthesis bij 25 the SCPI plasmid of Streptomyces coelicolor A3(2)", J. Gen. Microbiol. 98, 239-252.

(8) Okanishi, M., Ohta, T. en Umezava, H. 1969: "Possible control of formation of aerial mycelium and antibiotic production in 30 Streptomyces bij episomic factors", J. Anti biotics 33, l*5-VT.

Gevonden is, dat het micro-organisme Streptomyces espinosus subsp.acanthus NRRL 11081 een niet eerder beschreven plasmide bevat. Dit plasmide, dat de code p UC7 kreeg, bezit een 35 molekuulgevicht van ongeveer 10-11 megadalton, vordt door restrictie 800 1 6 76 3 endonuleasen afgebroken volgens het fragmentatiepatroon zoals weergegeven in het diagram en komt in 2-b copien per cel S.espinus subsp.acanthus NRRL 11081 voor. Het diagram is gebaseerd op plasmide p UC7 met een molekuulgewicht van ongeveer 10,7 megadalton en een 5 molekuullengte van ongeveer 16,2 kilóbasen. De restrictieplaatsen zijn aangegeven als kilobase coördinaten ten opzichte van de Bgl II restrictieplaats bij 0,0/16,2 kilóbasen. De gebruikte afkortingen voor de restrictie endonucleasen zijn: (1) Bgl II, een enzym uit Bacillus globigii; (2) Bam Hl, een enzym uit Bacillus amylolique-10 faciens Hl; (3) Pst I, een enzym uit Providencia stuartii 16^; (k)

Kpn I, een enzym uit Klebsiella pneumoniae; (5)Xho I, een enzym uit Xanthomonas holcicola.

Ten aanzien van het diagram wordt opgemerkt, dat voor de restrictieplaats bij ongeveer 14,5 kilobase niet ondubbelzinnig 15 kon worden vastgesteld of deze geldt voor Bam MI of voor Pst I.. Verder kon uit overwegingen van symmetrie niet ondubbelzinnig worden vastgesteld of êén van de twee Κηρ I restrictieplaatsen bij ongeveer 0,7 of bij ongeveer 3,7 kilobase moet worden aangegeven.

Deze laatste dubbelzinnigheid is uitgedrukt met de streepjeslijnen.

20 p UC7 wordt uit Streptomyees espinosus subsp.

acanthus NRRL 11081 geïsoleerd door het mycelium van een cultuur te fragmenteren, de fragmenten te incuberen, de cultuur te oogsten, het mycelium te lyseren en het plasmide uit het lysaat te isoleren. Het plasmide is praktisch zuiver.

25 Omdat p UC7 betrekkelijk klein is en door verschillende restrictie endonucleasen wordt afgebroken of "geknipt", kan het gemakkelijk worden gerecombineerd en aangepast voor een aantal gastheervektoren. p UC7 kan ook worden gebruikt als een klonerende vektor bij recombinant DNA onderzoek waarbij gekozen genen in het plasmide worden 30 ingebouwd waarna het plasmide in een gastheerorganisme wordt ingébracht .

Karakteristieken van p UC7 Molekuulgewicht: ongeveer 10-11 megadalton.

Aantal copien per cel: 2-k 35 Restrictie endonuclease plaatsen (zie het diagram).

800 1 6 76

Jt • 1 k

Aantal restrictieplaatsen Aantal restrictieplaatsen

Enzym püC7 Enzym pUC7

Bgl I >7 Bgl II 2

Bam HI H Hpa I O

5 Hpa II veel Hind III 2-3

EcoRI 0 Κρη I 2

Pst I 2 Pvu II >5

Mbo II >6 Ava I >8

Xba I 3 Xho I 3 10 Sal I >7 Sma I veel

Hinc II veel Bel I veel

Deze waarden werden verkregen door p UC7 DNA te fragmenteren bij aanwezigheid van een overmaat restrictie endonuclease en het aantal 15- in 0,7 en 1,0^-ige agarose gelen oplosbare fragmenten te bepalen.

pUC7 kan worden gebruikt voor het verkrijgen van recombinant plasmiden die in gastheerbacteriën kunnen worden ingébracht. Daarbij wordt het DNA van het circulaire vectoriële plasmide met restrictie endonuclease, bijvoorbeeld Bgl II of Pst I op 20 specifieke plaatsen opengeknipt waarbij lineair DNA ontstaat.

Tussen de uiteinden daarvan wordt een stukje vreemd niet-vectorieel DNA geplakt onder ringsluiting door de lineaire vektor of stukjes daarvan, en de niet-lineaire vektor te mengen bij aanwezigheid van een polynucleotide ligase.

25 Het vreemde DNA, verkregen met hetzelfde enzym, kan afkomstig zijn van hogere microorganismen. Zo kan bijvoorbeeld uit-kikkers afkomstig DNA dat codeert voor ribosomaal RNA in pUC7 worden ingebouwd. Het circulaire recombinant plasmide bestaat dan uit pUC7 en een stukje kikker rDNA.

30 Het recombinant plasmide kan in een gastheerorganis- me worden ingebracht en daarin tot expressie komen. Voorbeelden van waardevolle genen zijn die welke coderen voor somatostatine, ratte-proinsuline en proteasen.

pUC7 ontleent zijn betekenis daaraan dat het in 35 staat is om als plasmide veötor te functioneren in microorganismen 800 1 6 76 5 die voor industriële toepassingen van "belang zijn zoals Streptomyces. Kloneren van DM uit Streptomyces in pUC7 "biedt de mogelijkheid om de vorming van economisch "belangrijke produkten uit deze organismen, zoals antibiotica, te verhogen. Dit voorstel kan worden vergeleken 5 met het kloneren van genen voor antibiotica in Escherichia coli K-12. Deze Gram-negatieve bacterie heeft echter het bezwaar, dat genen uit bepaalde Gram-positieve bacteriën zoals Baccillus daarin niet goed tot expressie komen. Evenzo komen genen uit Gram-negatieve bacteriën slecht of in het geheel niet tot expressie in Gram-posi-10 tieve gastheren. Hiermee wordt het voordeel van een Gram-positief gastheervectorsysteem en daarmee de bruikbaarheid van pUC7 in een dergelijk systeem onderstreept.

Behalve bovengeschetste moeilijkheden van genexpressie, kunnen zich ook moeilijkheden voordoen bij het kweken van het 15 micro-organisme en met de extractie en zuiverheid van het product.

Aan deze moeilijkheden zou tegemoet kunnen worden gekomen door een plasmide vector bijvoorbeeld pUC7 in te brengen in een gastheer die het product vormt en de genen voor het betreffende produkt in het plasmide te kloneren. Aldus zouden de moeilijkheden met fermen-20 tatie, extractie en zuivering in elk geval worden verkleind. Bovendien zou het in een dergelijk systeem niet noodzakelijk zijn om al de genen voor de biosynthese te kloneren en te vermenigvuldigen maar alleen de regulerende genen of genen die coderen voor de enzymen die de productiesnelheid besturen. Omdat pUC7 een streptomyceet 25 plasmide is, leent het zich voor deze doeleinden bij uitstek in

Streptomyces. Omdat pUC7 verder een plasmide uit een Gram-positief micro-organisme is, kan het bovendien dienen als vector in een aantal andere micro-organismen zoals Bacillus en Arthrobacter.

Streptomyces espinosus subsp. acanthus NRRL 11081, 30 gedeponeerd in de permanente collectie van het Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, Amerika en taxSmisch be-schrevén in het Belgisch octrooischrift 861(-.1(-01, kan in een waterig voedingsmedium onder submerse aerobe omstandigheden worden gekweekt. Het voedingsmedium kan een koolstofbron bijvoorbeeld een assimileer-35 bare koolhydraat bevatten en een stikstofbron bijvoorbeeld een assi- 800 1 β 75 cfl 6 mileerbare stikstofverbinding of een proteïne. Koolstofbronnen die de voorkeur hebben omvatten glucose, bruine suiker, sucrose, glycerol, zetmeel, maïszetmeel, lactose, dextrine en molasse. Sdkstof-bronnen die de voorkeur hebben omvatten maisweekvloeistof, gist, 5 geautolyseerde brouwersgist met vaste melkbestanddelen, soyaboon-meel, katoenzaadmeel, maïsmeel, vaste melkbestanddelen, pancreaties verteerd caseïne, gistmeel, vaste destillateurs bestanddelen, dierlijke pepton vloeistoffen en vlees- en beender afval. Combinaties van voornoemde koolstof- en stikstofbronnen komen eveneens in 10 aanmerking. Omdat verder kraanwater en ongezuiverde bestanddelen worden gebruikt alvorens het medium te steriliseren, is het niet nodig om spore-metalen zoals zink, magnesium, mangaan, kobalt en ijzer, toe te voegen.

Het geente medium wordt bij een temperatuur van onge-15 veer 18-50°C en bij voorkeur 20-37°C geincubeerd. Ha ongeveer 3-15 dagen is de groei van het micro-organisme optimaal. Het medium blijft tijdens de groeicyclus zuur. De eind pH is gedeeltelijk afhankelijk van eventueel aanwezige buffer en gedeeltelijk van de begin pH van het medium.

20 Warneer het kweken wordt uigevóerd in grote vaten of tanks, verdient het voorkeur om in plaats van de spore-vorm de vegetatieve vorm van het micro-organisme te gebruiken voor het enten om een al te grote lag in de groei van het micro-organisme te vermijden en daarmee ondoelmatig gebruik van de apparatuur. Om 25 een vegetatieve ent te vormen wordt een voedingsbouillon geent met een passend gekozen hoeveelheid van een kweek in een vloeibare agar, of een kweek in een schuine buis. De jonge en actieve vegetatieve ent wordt dan onder aseptische omstandigheden in een kweekvat of kweektank gebracht. Het medium waarin de vegetatieve ent wordt 30 gevormd kan hetzelfde zijn als wordt gebruikt voor de groei van het micro-organisme.

Voorbeeld - Isolatie van pUC7 uit een zuivere cultuur van

Streptomyces espinosus subs, acanthus HERL 11081 35 Sporen van een zuivere cultuur van Streptomyces 800 1 6 76 * 7 w espinos subsp. acanthus KRRL 11081 werden geent in 10 ml Difco Antibiotic Medium no.3 Broth van Difco Labs., Detroit, Michigan, dat 0,15 gev.# vleesextrakt, 0,15 gew.$ gistextrakt, 0,5 gew./» pepton, 0,1 gew.# glucose, 0,35 gew.# NaCl, 0,368 gew.# KgHPO^ en 5 0,132 gew.# KHgPO^ bevat. Het medium was tevoren gesteriliseerd in een 50 ml Erlenmeyerkolf. Na het enten werd de inhoud van de kolf ongeveer 36*48 uren geincubeerd bij 37°C in een Gump of New Brunswick rotatie-schudinrichting bij een snelheid van 100-250 omw./min.

Na afloop werd de mycelium-bouillon suspensie onder 10 steriele omstandigheden gehomogeniseerd en daarna in een 125 ml Erlenmeyerkolf gemengd met 10 ml van bovengenoemd medium waaraan 68 gew./vol.# sucrose en 1 gew./vol.# glycine waren toegevoegd. De aanwezigheid van sucrose en glycine is niet noodzakelijk maar bevordert de lysis van de cellen. De hoeveelheid sucrose en glycine in 15 het medium kan overigen variëren maar wordt gewoonlijk zodanig gekozen dat de lysis van de cellen erdoor wordt bevorderd. De inhoud van de kolf werd nog eens 36-^8 uren geincubeerdbij 37°C in een Gump rotatieschudinrichting. Na afloop werd het mycelium van de cultuurvloeistof gescheiden door centrifugeren bij lage snelheid 20 zoals 6000 x g gedurende 15 min. bij U°C gevolgd door afschenken van de bovenstaande vloeistof. Hierna werd het mycelium gesuspendeerd in 1,5 ml isotone TES buffer (0,03 M tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris), 0,005 M EDTA en 0,05 M NaCl, pH 8,0) waaraan 20 gew./vol.# sucrose was toegevoegd. Na toevoegen van 1,5 ml van 25 een 5 mg/ml oplossing van lysozym in dezelfde buffer werd het mengsel 30 min. geincubeerd bij 37°C onder tussentijds roeren. Na toevoegen van 1,5 ml 0,25 M EDTA (pH 8,0) werd het incuberen bij 37 °C nog 15 min wordt voortgezet. Na afloop werd de celsuspensie gelyseerd door toevoegen van 2,5 ml van een lytisch mengsel (1,0 gew./vol.# 30 Brij-58 (een detergens van Pierce Chem. Co., Rockford, Illinois),

0,i+ gew./vol.# deoxycholzuur, 0,05 M Tris (pH 8,0) en 0,06 M EDTA) en werd 20 min. geincubeerd bij 37°C. Het lysaat werd daarna afgeschoven door het 5-10 keer door een 10 ml pipet te halen. Het ruwe lysaat werd daarna verteerd met ribonuclease (1H0 ^ug/ml) en pro-35 nase (300 yug/ml) gedurende 20 min. bij 37°C. Het cel-lysozym-EDTA

800 1 6 76 ï* 8- mengsel kan echter ook eerst worden verteerd met rihonuclease en pronase alvorens te worden gelyseerd met een lytisch middel zoals een 2 gew.$ oplossing van natriumdodecylsulfaat in water.

Het ruwe lysaat werd vervolgens gemengd met een zout 5 bijvoorbeeld cesiumsulfaat en bij voorkeur cesiumchloride, en de ingevoegde kleurstof ethidiumbromide om een oplossing met een dichtheid van 1,550 te verkrijgen. De oplossing werd gecentrifugeerd tot evenwicht bij 11*5 *000 x g (isopyknische dichtheidsgradient).

Het covalent gesloten circulaire plasmide DNA was in de centrifu-10 geerbuis onder langgolvige ultraviolette straling (320 nm) waarneembaar als een flauwe fluorescerende band onder de intens fluorescerende band van lineaire chromosomale en plasmide DNA's.

Het plasmide DNA werd uit de isopyknische gradiënten verwijderd en het ethidiumbromide wordt geextraheerd door twee 15 keer behandelen met 1/3 volume isopropanol waarna de waterige fase werd gedialyseerd tegen een buffer zoals een 0,1 X SSC buffer (0,015 M NaCl, 0,0015 M Na 0^0^.2^0 pH » 7,*0 waarbij praktisch zuiver pUC7 wordt verkregen.

Karakterisering van pUC7 20 De grootte van pUC7 werd bepaald door sedimentatie in neutrale en basische sucrose gradiënten onder gebruikmaking van een intern markeur plasmide DNA met een molekuulgewicht van ongeveer 9,0 megadalton en een overeenkomstige sedimentatiewaarde van ongeveer 3^S. Uit de neutrale sucrose gradiënten werd de sedimen-25 tatie waarde van het geïsoleerde pUC7 bepaald op 35-37 S. Het molekuulgewicht werd berekend uit de vergelijkingen van Hudson et al (Hudson, B, Clayton, D.A. en Vinograd, J., 1978) "Complex mitochondrial DNA", Cold Spring Harbor Symp. Quant, Biol. 33, l*35-^2) en was in goede overeenstemming met de bepaling op grond van de 30 basische sucrose gradiënten.

Het molekuulgewicht van pUC7 werd ook bepaald door electronenmieroscopie van afzonderlijke DNA molekulen (Kleinschmidt, A.K. (1968): Monolayer techniques in electron microscopy of nucleic acid molecules, "Method in Enzymology" (S.P. Colowick en N.O. Kaplan 35 eds.) Vol. 12B, biz. 361-377, Academic Press, New York).

800 1 6 76 TTr 9

Voor de gemiddelde contour lengte werd een waarde van 5.^3-10~^m gevonden en een overeenkomstig molekuulgewicht van 10,7 megadalton.

Het percentage plasmide DNA in Streptomyces espinosus 5 subsp. acanthus NRRL 11081 werd bepaald door de cultuur te merken met (methyl-^H)-thymidine, prepareren van de ruwe lysaten, en monsters van de lysaten te centrifugeren in cesiumchloride ethium-bromide dichtheidsgradienten. De gradiënten werden gefractioneerd en de radioactiviteit werd gemeten waarna uit het percentage radio-10 activiteit in de plasmideband het percentage plasmide DNA en het aantal piasmidecopiën werden berekend (Radloff, R., Bauer, W. en Vinograd, J. 1967: "A dye-buoyant density method for detection and isolation of closed circular duplex DNA: The closed circular DNA in HeLa cells", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 57, 151^-1520).

15 Restrictie endonuclease fragmentering en agarosegel electroforese.

Restrictie endonucleasen werden als handelprepara-ten verkregen van Miles Laboratories en New England Biolabs die 00k de specifikaties verschaften voor het fragmenteren met ten minste een tweevoudige overmaat endonuclease. Bij sommige bepalingen werd 20 het plasmide DNA gefragmenteerd met meer dan ëén endonuclease. De bepalingen werden uitgevoerd volgens twee methoden. Volgens de eerste werd het plasmide DNA eerst gefragmenteerd met het enzym dat een lagere ionische sterkte behoeft en daarna met het enzym dat een hogere ionische sterkte behoeft na toevoeging van een gelijk 25 volume 2X buffer van het tweede enzym. Volgens de tweede methode werden restrictiefragmenten van ëén enzym geïsoleerd uit een pre-paratieve agarosegel zoals beschreven door Tanaka en Weisblum (Tanaka, T., en Weisblum, B. 1975: Construction of a colicin El-R factor composite plasmid in vitro: Means for amplification of 30 deoxyribonucleic acid, J. Bacteriol. 121, 35^-3^2).

De geïsoleerde restrictiefragmenten werden geconcentreerd door ethanol precipitatie en daarna gefragmenteerd met andere restrictie enzymen. In duplo uitgevoerde fragmentaties werden vergeleken met enkelvoudig uitgevoerde fragmentaties om er zeker van 35 te zijn dat geen abnormale restrictiepatronen werden verkregen, dat 80 0 1 6 76 'vy * 10 vil zeggen dat er niet een niet-specifieke splitsing van DNA optreedt na verandering van de ionische sterkte van het voor de fragmentering gebruikte mengsel.

De gefragmenteerde monsters werden opgebracht op 5 0,7 en 1 gev.% agarose gelen en 2 uren onderworpen aan electroforese bij een constante spanning van 10-15 V/cm gel hoogte (Sharp, P.A., Sugden, J. en Sambrook, J., 1973: Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis, Biochemistry 12, 305-3063). 10 De molekuulgewichten van de fragmenten werden bepaald ten opzichte van de standaardmigratiepatronen van bacteriofaag λ DNA gefragmenteerd met Hind III (Murray, K. en Murray, N.E. 1975: Phage lambda receptor chromosomes for DNA fragments made with restriction endonuclease III of Haemophilus influenzae and restriction endonuclease 15 I of Escherichia coli J. Mol. Biol. 98, 551-56¾) of EcoRI (Helling, R.B. Goodman, H.M. en Boyer, H.W. 197^: Analysis of endonuclease R.EcoRI fragments of DNA form lambdiod bacteriophages and other viruses bij agarose-gel electrophoresis, J. Virology 1¾^ 1235-12¾¾).

Al de beschreven proefen en bepalingen werden uit-20 gevoerd volgens de specifikaties in de NIH Guidelines.

800 1 6 76

Claims (7)

1. Plasmide DNA met het kenmerk, dat plasmide DNA met de code pUC7 in zuivere of praktisch zuivere toestand een mole-kuulgewicht "bezit van ongeveer 10-11 megadalton en een restrictie endonuclease fragmenteringspatroon zoals weergegeven in het diagram.

2. Werkwijze voor het isoleren van plasmide DNA uit een micro-organisme, met het kenmerk, zuiver of praktisch zuiver pUC7 zoals omschreven in conclusie 1 wordt geïsoleerd uit Strepto-myces espinosus subsp. acanthus NRR1 11081 waarbij (a) S.espinosus subs, acanthus NRRL 11081 wordt ge- 10 kweekt tot het mycelium voldoende is gegroeid, (b) het mycelium wordt gefragmenteerd, (c) het gefragmenteerde mycelium wordt geincubeerd, (d) de cultuur wordt geoogst, (e) het geoogste mycelium wordt gelyseerd, en 15 (f) uit het lysaat zuiver of praktisch zuiver pUC7 wordt geïsoleerd.

3. Werkwijze volgens conclusie 3, met ‘het kenmerk, dat het micro-organisme ongeveer 36-48 uren wordt gekweekt bij een temperatuur van ongeveer 37°C.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het gefragmenteerde mycelium wordt geincubeerd in een sucrose en glycine bevattend groeimedium.

5. Plasmide pUC7 verkrijgbaar met de werkwijze zoals beschrevenen de beschrijving en het voorbeeld.

6. Produkten en werkwijzen zoals beschreven in de beschrijving en het voorbeeld. 800 1 6 76. \ (14.5) Bam HI (15.5) Pst Jj®* * Bgl II (0/16.2) ,Κρη I (0.7) / \ Xho I (1.9) / Α^Κρη I (2.2) “O-Xho I (2.4) pUC7 (10.1) Xho I -V / 'Kpn I (3.7) (9.7) Bam Hry \/ N\' HI (4.6) (8.5) Bam Hl^"^--- ^Bgl II (5.3)

80. T 6 76 Th· ϋρjoha Co*p*ny# t· Kaluaxoo, Michigan, Ver.St.v.Aaerlka