DD219796A5 - Verfahren zur herstellung eines rekombinanten dna-klonierungsvektors - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Klonierungsvektors, das darin besteht, dass man (a) ein einen funktionellen Replikationsursprung enthaltendes Restriktionsfragment des Plasmids pNM100 und (b) ein oder mehr DNA-Segmente, die eine Resistenz gegenueber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in eine sensitive Wirtszelle transformiert sind, wobei diese Wirtszelle gegenueber einer Transformation, Zellteilung und Zuechtung suszeptibel ist, miteinander verknuepft.

Description

Verfahren zur Herstellung recombinanter DNA-Klonierungsvektoren . - : .'

¹^ Anwendungsgebiete der Erfindung:

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung heuer rekombinanter DNA-Klonierungsvektoren,-rdie ein einen funktionell en Repli'katiohsur sprung enthaltendes Restriktionsfragment des Plasmids pNMiOO und ein.oder mehr DNA-.20 ' - ' ' ' ' -

Segmente enthalten, welche eine Resistenz gegenüber Antibiotika verleihen. ' . .

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen und Ziel'der Erfindung: , . , , , ~

Die Entwicklung und Ausnutzung der rekombinanten DNA-Technologie in Streptomyces und verwandten Organismen hat sich ~ infolge des allgemeinen Fehlens selektierbarer genetischer Marker an Klonierungsvektoren yerzögert und schwierig ge-

30 '

staltet. Ziel der Erfindung ist daher die Schaffung neuer-Vektoren, die sowohl in Streptomyces als auch anderen Wirtsstämmen funktionell und selektierbar sind, so daß sie einen beachtlichen technischen Fortschritt darstellen.

-''

Die erfindungsgemäß herstellbaren Vektoren sind besonders brauchbar, weil sie klein, versatil und in jeder Zelle

von Streptomyces transformierbar und selektierbar sind, die gegenüber einem Antibiotikum sensitiv ist, für welches eine Resistenz verliehen wird. Mehr als die-Hälfte der klinisch wichtigen Antibiotika wird durch Stämme von Strep-· ' ' " ' ·.

tomyces produziert, so daß die Entwicklung von Klonierungs- systemen und Klonierungsvektoren wünschenswert ist, die sich auf diese industriell wichtige Gruppe anwenden lassen. Durch das erfindungsgemäße Verfahren lassen sich nun solche Vektoren herstellen und Gene in Streptomyces klonieren, wo-

durch sich sowohl die Ausbeuten an bekannten Antibiotika erhöhen als auch neue Antibiotika und Antibiotikaderivate herstellen lassen. -,. ' .

Die erfindungsgemäß erhältlichen Vektoren eignen sich zur

15 , . '

Klonierung von DNA in Wirtszellen von Streptomyces, wobei auch eine^; bequeme Selektion von Transformanten ermöglicht wird. Eine Transformation ist ein Ereignis mit sehr niedri- - ger Häufigkeit, so daß ein solcher^;Funktionstest eine praktische Notwendigkeit; zur Bestimmung darstellt,, welche ZeI-

len aus den Millionen Zellen die Plasmid-DNA aufgenommen haben. Dies ist wichtig, weil DNA-Sequenzen, die nicht selektierbar sind,, in die Vektoren inseriert werden können und sich nach erfolgter Transformation dann die Zellen, die

' ι ·.' ' . '/

den Vektor, und die jeweils interessierende besondere DNA-Sequenz enthalten, durch geeignete antibiotische Selektion isoliert werden können. , ' ' ,

Im Zusammenhang mit der Beschreibung der' Erfindung werden einige'Spezialbegriffe verwendet, die die im folgenden¹ an-

gegebenen Bedeutungen haben: ; . .

Rekombinanter DNA-Klonierungsvektor':

' . Hierunter versteht man jedes sich autonom replizierende Mittel, wozu unter anderem auch Plasmide gehören, das ein .

DNA-Molekül enthält, an welches ein.oder mehr'weitere DNA-Segmente gebunden sein oder gebunden worden sein können.

Transformation': \ ,....,

Hierunter versteht.man die Einführung von DNA in eine Emp-

.1 fängerwirtszelle, die den Genotypus verändert und somit zu einer Veränderung der Empfängerzelle führt. . ·

Sensitive Wirtszelle: - .

5.' Hierunter wird eine Wirtszelle verstanden, die in Anwesenheit eines bestimmten Antibiotikums nicht ohne ein DNA-Segment wachsen kann, das ihm eine Resistenz verleiht.

- insertionsisomeres: " . , .

10. Hierunter versteht man eines von zwei -oder mehr möglichen rekombinanten DNA-Molekülen, die durch Insertion eines DNA-Fragments in einer von zwei oder mehr verträglichen Stellen an der Empfänger-DNA gebildet werden.

Plasmid-pLR2 etwa 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragment:

Hierunter versteht man praktisch das gleiche etwa 1,6 kb BamHI^Thiostreptonresistenz verleihende, !fragment, das im-Plasmid pIJ6 enthalten.

20 · Plasmid-pLRl oder pLR4 etwa 3 ,.4 kb BamHI-Restriktions--.

fragment: ' '' , .' ,

Hierunter versteht man das gleiche etwa 3,4 k'b BamHI-Neomycinresistenz verleihende Fragment, das im Plasmid pIJ2 enthalten ist. '

Amp :_ ..' . _

Hierunter versteht man den gegenüber Ampicillin resistente'-n Phenotypus'. . ...·

Hierunter versteht man den gegenüber Tetracyclin sensitiven Phenotypus.

; Thio^R: ' , ^:

Hierunter versteht man den gegenüber Thiostrepton resistenten Phenotypus. ' '. .'. '

Hierunter, versteht man den gegenüber Neomycin resistenten Phenotypüs. .-,--· , .

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die Erfindung ist nun auf ein Verfahren zur Herstellung von 'rekombinanten DNA-Klonierungsvektoren gerichtet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ; .

a) ein einen funktionellen Replikationsursprung ent- < haltendes Restrikt'ionsfragment des Plasmids pNMIOO

und . " ; '

b). ein oder mehr DNA-Segmente, die eine Resistenz gegenüber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in eine sensitive Wirtszelle transformiert sind, wobei diese Wirtszelle gegenüber einer Transformation, Zellteilung und Züchtung suszeptibel ist," miteinander verknüpft. ; .

Das Plasmid pNMIOO, aus dem ReplikationsurSprünge enthaltende Fragmente konstruiert werden, ist etwa 9,1 kb groß, und enthält mehrere Restriktionsstellen, die für. eine' Molekularklonierung von Vorteil sind. Der Replikationsur-•sprung des Plasmids pNMIOO ist innerhalb des etwa 3,8 kb « BamHI-Restriktionsfragments lokalisiert, und durch Verdauung des Plasmids mit Restriktionsenzymen., die den ungefähr 3,8 kb BamHI-Bereich herausschneiden, läßt sich daher eine Vielfalt unterschiedlicher ReplikationsurSprünge enthaltender Fragmente bilden. Das Plasmid pFJ143, nämlich . ein etwa 4 kb pNM1OO-Derivat, aus dem sich weitere Fragmente erhalten lassen, die ReplikationsurSprünge von

pNMlOO enthalten, kann auch zur Konstruktion der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Ein detaillierter Re-Striktionsstellenplan für jedes der Plasmide pNMl00 und·/ pFJ143 geht aus Fig. 1 der Zeichnung hervor. Die Fig. 1 und alle sich daran anschließenden Figuren sind für die erfindungsgemäßen Zwecke nicht maßstabsgetreu gezeichnet-

Das Plasmid pNMlOO läßt sich in herkömmlicher Weise aus Streptomyces virginiae/pNMIOO Isolieren, nämlich einem beim ,Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, . V.St.A. hinterlegten und' Teil der dortigen ständigen Kulturensammlung bildenden Stamm, der die Nummer NRRL 15156 trägt. Das Plasmid pFJ143 kann in üblicher Weise aus Streptomyces ambofaciens/pFJ143 isoliert werden, nämlich einem in ähnlicher Weise hinterlegten Stamm, der die Hinterlegungsnummer NRRL 15114 trägt. Beide Stämme sind von dort frei beziehbar und stellen bevorzugte Quellen und

Grundvorräte für ihre jeweiligen Plasmide dar.

' . ' . . "·- '.

Es lassen sich zwar viele Fragmente des Plasmids-. pNMl00 '· konstruieren, die einen unterschiedlichen.Replications-· Ursprung enthalten, und zu den hierin beispielsmäßig erläuterten Fragmenten gehören da« etwa 3,8 kb BamHI-Restriktionsfragment von pNMlOO und das'etwa 4 kb BamHI-Restrik-

25' tionsfragment von pFJ143. Diese Fragmente können unabhängig an ein oder mehr, eine Antibiotikumresistenz verleihen-. de DNA-Segmente geknüpft werden, beispielsweise an das die Thiostreptonresistenz verleihende ungefähr 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLR2, das die Neomycinresistenz verleihende etwa 3,4 kb BamHI-RestriCtionsfragment des Plasmids pLRl oder¹ des Plasmids pLR4 und das die Erythromycinresistenz verleihende etwa 2,5 kb SaII-BamHI-Fragment-.des Plasmids pIJ43, um so Beispiele für erfindungsgemäße Vektoren zu.bilden. - ·'

35. . ζ ' ..: ^; Das Plasmid pLR2, nämlich die Quelle für das die Thiostreptonresistenz verleihende Fragment, ist etwa 18,7 kb groß

und wird konstruiert durch Verknüpfung -des mit.: Hindlll Behandelten Plasmids pIJ6 (Nature 286, 525 (.1980)) mit dem mit HindiII behandelten Plasmid pBR322. Das Plasmid pLRl,. . . nämlich die Quelle für das die Neomycinresistenz verleihende Fragment, ist etwa 14,8 kb groß und wird in ähnlieher Weise konstruiert, mit der Ausnahme, daß^ man hierzu das in Nature 286, 525,(1980) beschriebene Plasmid pIJ2 anstelle des Plasmids pIJ6 verwendet. Eine analoge Konstruktion, die zum Plasmid pLR4 führt, wird durchgeführt " durch Verknüpfung des mit BamHI behandelten Plasmids pBR322 mit dem mit BamHI behandelten Plasmid pLRl. Die Plasmide . pLR2, .pLRl und pLR4 sind in Escherichia coIi funktionell, und sie können daher für eine anschließende Manipulation bequem amplifiziert und isoliert werden.

15 . . .; '.. : ' ...' .

Das Plasmid pIJ43, nämlich die Quelle für das die Erythromycinresistenz verleihende Fragment, läßt sich aus Escherichia coli 803/pIJ43/ erhalten, nämlich einem bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St,.A. hinterlegten und Teil der dortigen ständigen Kulturensammlung bildenden Stamm. Dieser Stamm ist von- dort als bevorzugte Quelle und Reservoir für das Plasmid unter der Nummer ATCC 39156 frei beziehbar. Ein Restriktiönsstellenplan und Funktionsplan für jedes der Plasmide pLRl,

25 pLR2 und. pLR4 geht aus Fig. 2 der Zeichnung hervor.

Zur bequemen und leichten Konstruktion verknüpft man das die Thiostreptonresistenz verleihende etwa 1,6 kb BamHI-Fragment, das die Neomycinresistenz verleihende etwa . 3 , 4'kb -BamHI-Fragment und das die Erythromycinresisteriz verleihende etwa 2,5 kb Sall-BamHI-Fragment mit dem einen Replikationsursprung enthaltenden etwa 3,8 kb BamHI-Fragment des Plasmids pNMIOO oder dem einen Replikationsursprung enthaltenden etwa 4 kb BamHI-Fragment des- Plasmids

35. PFJ143. Die erhaltene rekombinante DNA unterzieht man

. dann einer Verknüpfung, um so Beispiele für erfindungsgemäße Plasmide zu bilden. Je nach der Orientierung des je-

v;eiligen resistenzverleihenden-DNA-Fragments ergeben sich .'. rekcmbinante Plasmide mit zwei Orientierungen; Durch Ver-. . . knüpfung des etwa 1,6 kb BamHI-Fragments des Plasmids pLR2 ..'

mit dem etwa 3,8 kb BamHI-Fragment des ..Plasmids pNMlOO. er- ^Q ,' geben sich daher beispielsweise- die Plasmide pFJ204 und

DFJ205. Durch Verknüpfung des etwa 3,4 kb BamHI-Fragments . . des Plasmids pLRl oder des Plasmids pLR4 erhält man beispielsweise die Plasmide.pFJ206 und pFJ207. Durch Verknüpfung beider dieser Fragmente gelangt man beispielsweise zu den Plasmiden pFJ208 und pFJ209. In ähnlicher.Weise erhält ^-- '^: " man durch Verknüpf ung . des etwa 1,6 kb BamHI -Fragments mit

dem etwa 4 kb ,Barrül-Fragment des Plasmids pFJ143 beispielsweise die Plasmide pFJ170 und pFJ21Ö. Durch Verknüpfung des · . etwa 3,4 kb BamHI-Fragments gelängt man beispielsweise-zu den Plasmiden pFJ211 und pFJ21,2 .Durch Verknüpfung von so-. 'wohl dem etwa 1,6 kb BamHI -Fragment als auch, dem 'etwa . ·. 3,4 kb BamHI-Fragment gelangt man zu den beispielsmäßigen Plasmiden pFJ213 und pFJ214„ Durch Verknüpfung des etwa 2,5 kb Sa1I-BamHI-Fragments mit einem geeigneten. Linker erhält man beispielsweise die Plasmide pFJ215 und pFJ2L6..

' Zur Verknüpfung der die Antibiotikumresistenz verleihenden / -* ;-; ' DNA-Segmente lassen sich verschiedene Restriktionsfragmen- ·' te des Plasmids pNMIOO verwenden/ sofern der im,etwa 3,8 kb ;BamHI-Restriktionsfragment enthaltene Replikationsursprung

vorhanden ist. Zu solchen Restriktionsfragmenten- des. Plasmids pNMIOO gehören unter anderem die Fragmente etwa 9,1 kb· BamHI, etwa 8,4 kb BamHI,' etwa 4,7 >kb BamHI,-etwa 9,1 kb ' , Sacl, etwa 5,4' kb Srnal und etwa 4,4 kbPvuII. Darüber hinaus ist ein besonderes "Antibiotikumresistenz y verleihendes DNA-Segment nicht auf eine einzelne Stellung beschränkt, sondern kann an unterschiedlichen Stellen der plasmide pNMIOO oder pFJ143 gebunden oder'inseriert werden, sofern es hierdurch zu keiner Störung des Reolikationsur- 35' Sprungs oder sonstiger kritischer plasrnidgest.euerter physiologischer .'Funktionen kommt. Der Fachmann weiß oder kann ohne-,weiteres ermitteln, welche Stellen für die Verknüpfung

ⁿ 1 T; Γ

oder Insertion eines bestimmten DNA-Segments von Vorteil sind. '

Die eine Resistenz gegenüber den Antibiotika -Thiostrepton,

! Neomycin und Erythromycin verleihenden DNA-Segmente sind zwar jeweils beispielsmäßig belegt durch das etwa 1,6 kb ·. BamHI-Restriktionsf ragment des Plasmids pLR2, das etwa 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLRL und das etwa 2,5 kb SaII-BamHI-Restriktionsfragment des Pias-.

mids pIJ43, doch kann der Fachmann entweder einzeln oder in Kombination zusätzliche· DNA-Segmente, konstruieren und' verwenden, die ebenfalls, eine Resistenz gegenüber den oben erwähnten Antibiotika verleihen. Zu weiteren, eine Thiostreptonresistenz verleihenden DNA-Segmenten des Plasmids ^:

pLR2 gehören beispielsweise das etwa 13 kb Pstl-Restrik-, .'· tionsfragment und ferner auch das etwa 0,8 kb Bcll-Sub- ... fragment des etwa 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragments. Zu weiteren, eine :Neomycinresistenz verleihenden DNA-Segmenten des Plasmids pLRl gehören beispielsweise das etwa 3,5 kb Pstl-Restriktionsfragment und ferner auch das größe-re der Sstl-Kpnl-Subfragmente des etwa 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragments. Zu weiteren Fragmenten, die eine Resi-. stenz gegenüber Erythromycin verleihen, gehören beispielsweise die Restriktionsfragmente etwa 2,8 kb Sail, etwa 2-, 7 kb Sal.I-Bglll, etwa 3,0 kb Hindi II, etwa 2,8, kb . .

Xhol-Bqlll und etwa 4,1 kb EcoRI-BamHI des Plasmids pIJ43.

Es'lassen ..sich auch noch andere DNA-Segmente, die eine Resistenz gegenüber den gleichen oder anderen Antibiotika 'verleihen, wie beispielsweise gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin, Hygromycin, Viomycin, Tylosin und derglei-. chen, in dem Fachmann geläufiger Weise konstruieren und "verwenden.,Ferner können auch fuhktionelle Derivate dieser oder.irgendwelcher anderer hierin beschriebener, Antibio-

35, tikaresistenz verleihender. DNA-Segmente durch Addition,. .. Elimination oder Substitution bestimmter Nucleotide in Übereinstimmung mit dem genetischen Code konstruiert wer-'.

. . den. Der Fachmann weiß, daß sich durch Verknüpfung dieser.

· ' " · . , . ' . . - 9 - ' '

Derivate oder irgendeines sonstigen, Antibiotikumresistenz verleihenden DNA-Segments mit Fragmenten, die einen Replikationsursprung für die .Plasmide pNMIOO oder pFJ1.43 enthalten, Vektoren ergeben, die ebenfalls im Rahmen der Erfin-

. , ° dung liegen. , . - · .

Die Restriktionsfragmente der Plasmide· pNMIOO und pFJ143 und ferner auch die verschiedenen, Antibiotikumresistenz verleihenden DNA-Segmente lassen sich zur Erleichterung IQ ' der Verknüpfung entsprechend modifizieren. So lassen sich beispielsweise entweder an einem bestimmten Restriktionsfragment der Plasmide pNMIOO oder·pFJl43 oder an einem bestimmten Antibiotikumresistenz verleihenden DNA-Segment ^; ... oder an beiden diesen Teilen Molekularlinker anordnen. Auf diese Weise lassen sich bequem spezielle Stellen für eine . . · · anschließende Verknüpfung konstruieren. Zusätzlich, .können auch die den Replikationsursprung enthaltenden Restriktionsfragmente durch Addition, Elimination oder Substitu-. tion bestimmter Nucleotide modifiziert werden, wodurch·. sich eine Vielfalt an Restriktionsstellen für eine Verknüp-. . . ·.. fung von DNA ergibt. Der mit der Nucleotidchemie. und dem genetischen Code vertraute Fachmann weiß nämlich, welche Nucleotide gegenseitig austauschbar und welche DNA-Modifikationen für einen bestimmten Zweck wünschenswert sind. .

Die vorliegenden und in Streptomyces funktioneilen Vekto-. ren können auch an ein Restriktionsfragment eines Plasmids von Escherichia coli, gebunden werden, wie beispielsweise· an die Plasmide- pBR322, pBR324, pBR325, pBR328 und der-^{1 0}^ gleichen, wodurch selbstreplizierende Vektoren gebildet

werden, die sowohl in Escherichia coli als auch Streptomy-. ' ces selektierbar sind. Diese bifunktionellen Konstruktio-· nen enthalten den Replikationsursprung von pNMIOO, ein DNA-Segment, das eine Antibiotikumr.esistenz in Streptomy_ces verleiht, ein Replikon, das in. Escheric£hia coli funktionell ist, und auch ein DNA-Segment, das in Escherichia coli eine Antibiotikumresistenz verleiht. Bifunktionelle

Konstruktionen, für die hierin als Beispiele die Plasmide pFJ219 und pFJ220 angegeben sind, sind'besonders von Vorteil, weil sich eine· Ampl,if ikati'on und Manipulation von ·., Plasmiden in Escherichia coli 'schneller und bequemer durchführen läßt als in streptomyces. Nach erfolgter Durch- ' führung, der gewünschten rekomb.inanten DNA-Verfahren im Wirtssystem aus Escherichia coli kann man daher das gesamte Plasmid oder die jeweilige Streptomyces-DNA entfernen ' und wieder zur Plasmidform (falls erforderlich) umkonstru-. ieren und dann in eine Wirtszeile von Streptomyces oder eine damit verwandte Zelle transformieren. '/:

Die erf indungsgemäße.n rekombinanten DNA-Klonieriingsvektoren sind nicht auf eine Anwendung in einer einzelnen Art oder . einem einzelnen Stamm von Streptomyces beschränkt-. .Die Vektoren lassen sich vielmehr breit anwenden.und in Wirtszel- ,lefi vieler Taxa von Streptomyces transformieren, insbesondere iri restriktionslose Stämme wirtschaftlich wichtiger Taxa, cj^ie Antibiotika produzieren,-wie Aminoglykosid-,

2Q .Makrolid-, ß-Lactamr, Polyether- und Glykopeptidantibiotika. Solche, restriktionslose Stämme lassen sich aus Taxa von Streptomyces unter Anwendung,herkömmlicher Verfahren (Microbiological Reviews 44, 206 .(1980)) ohne weiteres selektieren und isolieren. Wirtszellen restriktionsloser Stäm-

2g me'.fehlen Restriktionsenzyme, so daß sie nach Transformation Plasmid-DNÄ nicht schneiden oder abbauen. Wirtszellen, die Restriktionsenzyme enthalten, welche keine der · Restriktionsstellen der vorliegenden Vektoren schneiden, · werden daher auch als restriktionslos angesehen.

Bevorzugte Wirtszellen restriktionsloser Stämme von Taxa "von Streptomyces, die Aminoglykosidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden , t ' Vekto-

. ren besonders' brauchbar sind und transformiert werden können,. "sind beispielsweise folgende restriktionslose Zellen: Streptomyces. kanamyceticus (Kanamycine), Streptomyces chrestomyceticus (Aminosidin), Streptomyces gfiseoflavus (Antibiotikum MA 1267), Streptomyces microsporeus (Antibioti-

kum -SF.-767), Streptomyces ribosidif.icus (Antibiotikum SF733) , Streptomyces flavopersicus (Spectinomycin), Streptomyces spectabilis (Actinospectacin), Streptomyces rimosus forma paromomycinus (Paromomycine, Catenulin), Streptomyces .5 fradiae var. italicus (Aminosidin), Streptomyces bluensis var. bluensis (Bluensomycin), Streptomyces catenulae (CatenuTin), Streptomyces olivoreticuli var. eellulophilus (Destomycin A), Streptomyces tenebrarius (Tobramycin, Apra-'mycin) ,', Streptomyces lavendulae (Neomycin), Streptomyces albogriseolus (Neomycine), Streptomyces albus var. meta-

mycinus (Metamycin), Streptomyces hygroscopicus var. saga-'^l miensis (Spectinomycin), Streptomyces. bikiniensis (-Streptomycin), Streptomyces griseus (Streptomycin), Streptomyces erythrochromogenes var. narutoensis (Streptomycin), Streptomyces poolensis (Streptomycin), Streptomyces galb.us (Streptomycin)¹, Streptomyces rameus (Streptomycin), Streptomyces. olivaceus (Streptomycin), Streptomyces mashuensis , {Streptomycin), Streptomyces hygroscopicus var. limoneus (Validamycine), Streptomyces rimofaciens (Destomycine),. Streptomyces hygroscopicus forma glebosus (Glebomycin),

Streptomyces fradiae (Hybrimycine, Neomycine), Streptomy-, ces eurocidicus (Antibiotikum A16316-C), Streptomyces . aquacanus (N-Methylhygromycin B), Streptomyces crystalli-.nus (Hygromycin A), Streptomyces noboritoensis (Hygromy-'Cin), Streptomyces hygroscopicus (Hygromycine), Streptomyces atrofaciens (Hygromycin), Streptomyces kasugaspinus (Kasugamycin.e), Streptomyces kasugaensis (Kasugamycine), Streptomyces netropsis (Antibiotikum LL-AM31), Streptoiriyces lividüs (Lividomycine), Streptomyces hofuensis (Seldo- QQ mycin-Komplex) und Streptomyces canus (Ribosylparomamin).

Bevorzugte Wirtszellen restriktionsloser Stämme von Taxa von Streptomyces, die Makrolidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden Vektoren

og besonders brauchbar sind und transformiert werden können, sind beispielsweise folgende restriktionslose Zellen:

Streptomyces caelestis (Antibiotikum M188), Streptomyces

.'. '

platensis (Platenomycin), Streptomyces rochei var. völubi-

,. 1 Ils (Antibiotikum Τ2 6 36 ) , Streptomyces vene'zuelae (Methymycine ),'Streptomyces griseof.uscus ( Bundli-n ), Streptomyces .narbonensis (Josamycin, Narbomycin), Streptomyces fungicidicus (Antibiotikum NÄ-181) .·, 'Streptomyces griseofaciens (Antibiotikum PA133A,, B), Streptomyces roseocitreus(Albocyclin) , Streptomyces bruneogriseus (Albocycl'in.) , Streptomyces roseochromogenes (Albocyclin)., Strep-tomyces cinerochromogenes (Cineromycin- B),. Streptomyces albus (Albomycetin), Streptomyces felleus (Argomycin,

10, Picromycin), Streptomyces rochei (Lankacidin, Borrelidin), , Streptomyces violaceoniger"(Lankacidin), Streptomyces

griseus (Borrelidin), Streptomyces maizeus (Ingramycin), ' Streptomyces" albus var. coilmyceticus (Coleimycin), Streptomyces mycarofaciens (Acetylieukomycin, Espinomycin), Streptomyces hygroscopicus (Turimycin, Relomycin, Maridomycin, Tylosin, Carbomycin), Streptomyces griseospiralis (Relomycin),Streptomyces lavenduläe (Aldgamycin), Streptomyces rimosus (Neutramycin), Streptomyces deltae (Deltamycine), Streptomyces, fungicidicus var. espinomyceticus ·'··- (Espinomycine), Streptomyces für/dicidicus (Mydecamycin), Streptomyces ambofaciens (Foromacidin D), Streptomyces . eurocidicus (Methymycin), Streptomyces, griseölus (Griseomycin)', Streptomyces flavochromogenes (Amaromycin, Shinco- ^mycine),, Streptomyces fimbriatus (Amaromycin), Streptomyces fasciculus (Amaromycin), Streptomyces erythreus (Ery-' thromycine),Streptomyces antibioticus (Oleandomycin), Streptomyces olivochromogenes (Oleandomycin), Streptomyces - spinichromogenes var. suragaoensis_(Kujimycine), Streptomyces kitasatoensis (Leucomycin), Streptomyces narbonensis var. josa-

3Q ' myceticus (Leucomycin A3, Josamycin), Streptomyces albo-. griseolus (Mikonomycin), Streptomyces bikiniensis (Chalcomycin), Streptomyces cirratus (Cirramycin), Streptomyces djakartensis¹ (Niddamycin) , Streptomyces eurythermus '(An-" golamycin) , Streptomyces fradiae (,Tylosin,. Lactenocin,

g.g Macrocin) , Streptomyces goshikiensis (Bandamycin) ,- Streptomyces griseoflavus (Acumycin), Streptomyces halstedii (Carbomycin), Streptomyces tendae (.Carbomycin), Streptomyces macrosporeus (Carbomycin), Streptomyces thermotolera'ns

-' · - ¹³ - ' .'

(Carbomycin) und Streptomyces albireticuli (Carbomycin).

Bevorzugte Wirtszellen restriktionsloser Stämme von Taxa von Streptomyces, die ß-Lactamantibiotika bilden und in denen die. vorliegenden Vektoren

besonders brauchbar sind und transformiert werden können, sind beispielsweise folgende restfiktionslose Zellen: Streptomyces lipmanii (A16884, MM4550, MMl3902), Strepto- ' rnycas clavuligerüs (A16886B, Clavulansäure), Streptomyces "lactamdurans. (Cephamycin C), Streptomyces griseus. (Cepha-. mycine A, B), Streptomyces hygroscopicus (Desacetoxycephalosporin C), Streptomyces wadayamensis (WS-3442-D) ·, Streptomyces chartreusis (SF . 1623), Streptomyces heteromorphus und Streptomyces panayensis (C2081X), Streptomyces cinnamonens'is,, Streptomyces fimbriatus,. Streptomyces halstedii, Streptomyces roch'ei und Streptomyces 'viridochromogenes (Cephamycine A, B), Streptomyces cattleya (Thienamycin), und Streptomyces olivaceus, Streptomyces flavovirens, Streptomyces flavus, Streptomyces fulvoviridis', Streptomy-' 'ces argenteolus .und Streptomyces sioyaensis (MM 4550 und ; , MM 13902) . , , . ' . ' ' ; ; '/

Bevorzug-te Wirtszellen restriktionsloser. Stämme von Taxa ,. . von Streptomyces,,die Polyetherantibiotika bilden und in, denen die vorliegenden " . · '. ; Vektoren

' besonders brauchbar, sind und transformiert werden können, sind beispielsweise folgende restriktionslose Zellen: . Streptomyces albus (A204, A28695A und B, Salinomycin), ^: Streptomyces hygjfoscopicus;, (A218, Emericid, DE3936,· A120A, QQ A2869-5A und -B, Etheromycin, DianemycinO , Streptomyces -. g-riseus, (G'risorixin) ,. Streptomyces conglobatus (lonomycin),

Streptomyces eurocidicus yar. asterocidicus (Laidlomycin), ' ' Streptomyces. lasaliensis. (Las'alocid) , Streptomyces ribosi-

dificus (Lonomycin), Streptomyces cacaoi var. asoensis ok (Lysocellin), Streptomyces cinnamonensis (Monensin), Streptomyces aureofaciens (Narasin), Streptomyces gallinarius (RP 30504), Streptomyces'iongwoodensis (Lysocellin), Streptomyces flavebl'us (CP38936), Streptomyces mutabi.li5 '

(S-.11743'a) und, Streptomyces violaceoniger (Nigericin).

Bevorzugte Wirtszellen restriktionsloser Stämme von Ta'xa · von Streptomyces, die Glykopeptidantibiotika bilden und δ:.' in denen die vorliegenden ' . Vektoren besonders brauchbar sind, und transformiert werden können, sind beispielsweise folgende restriktionslose Zellen; . '· Streptomyces örientalis und Streptomyces haranomachiensis (Vancomycin ) , Streptomyces candidus (A-35512, Avoparcin) und Streptomyces eburosporeus (LL'-AM 374).

Bevorzugte Wirtszellen anderer restriktionsloser, Stämme von Streptomyces, in denen die vorliegenden

Vektoren besonders brauchbar sind und trans-formiert werden können, sind beispielsweise folgende restriktionslose Zellen: ' '

Streptomyces cöelicolor, 2Q Streptomyces granuloruber,. Streptomyces roseosporus, Streptomyces lividans, Streptomyces tenebrarius, Strepto- .-myces espinosus, Streptomyces acrimycin's, Streptomyces glaucescens, Streptomyces parvilin, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces violaceoruber, Streptomyces vina-5 ce us, Streptomyces virginiae und Streptomyces azureus.

Zusätzlich zu den oben beschriebenen-Beispielen von Wirts-.zellen von ,Streptomyces können die vorliegenden

Vektoren auch.verwendet und in,Zellen 'restriktionsloser Stämme anderer Taxa transformiert wer-den, wie beispielsweise Bacillus, Staphylococcus und verwandten Actinomycetes unter Einschluß von Streptosporang'ium, Actinoplanes, Nocardia und Micromonospora. Die erfindungsg.emäßen Vektoren sind daheT breit anwendbar und brauchbar, und sie lassen sich in Wirtszellen einer Viel-, falt von Organismen transformieren. .

·;.· - is - . .

¹V-Es sind zwar alle Ausführungsformen der Erfindung .brauchbar, wobei jedoch einige der vorliegenden rekombinanten DNA-Klonierungsvekto,ren und Tränsforman.ten bevorzugt sind. ^: Bevorzugte Vektoren sind demnach die Plasmide pNMIOO, ., δ OFJ2O4., pFJ207, pFJ208, pFJ14 3,* pFJ170, pFJ212, pFJ214,

pFJ215 und pFJ220. Bevorzugte Transformanten sind Strepto-. myces ambof aciens/pNMlQO ,. Streptomyces air.bofaciens/pFJ204, Streptomyces lividans/pFJ20 4, Streptomyces ambofaciens/ pFJ207,' Streptomyces ambofaciens/pFJ208, Streptomyces am-· IC bofaciens/pFJ143, Streptomyces ambofaciens/pFJl70, Streptomyces lividans/pFJ170, Streptomyces ambof aciens/pFJ'212 , Streptomyces ambofaciens/pFJ214, Streptomyces ambofaciens/ pFJ215, Streptomyces ambofaciens/pFJ220 und Escherichia coli Kl2 HBl01/pFJ220.Von dieser bevorzugten Gruppe sind die. Plasmide pNMIOO, pFJ143, pFJ170, pFJ204, pFJ207 und pFJ208 und die Transformanten Streptomyces ambofaciens/ pNMLOÖ, Streptomyces ambofaciens/pFJ143, Streptomyces ambof acien-s/pFJ17 0 , Streptomyces lividans/pFJ17Q , Strepto-. . myces ambofaciens/pFJ204, Streptomyces ambofaciens/pFJ207 2C und Streptomyces ambofaciens/pFJ208 am meisten bevorzugt.

Die erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Klonierungsvektoiren.und Transformanten lassen sich breit anwenden und.tragen zu einer Auffüllung de,s Bedarfs an geeigneten Klonierungsträgern bei, die in Streptomyces und damit verwandten Organismen eingesetzt werden können. Die Fähigkeit der vorliegenden Vektoren zur Verleihung einer Resistenz gegen-, über Antibiotika, welche für nichttrar.sformierte· Wirtszellen toxisch sind, eröffnet weiter auch ein funktionelles

3G- Mittel zur Selektion von Transformanten. Dies ist wichtig wegen der praktischen Notwendigkeit' zur Bestimmung und Selek-χοη der besonderen Zellen, die. Vektor-DNA aufgenommen haben. Weitere DNA-Segmente, für deren Anwesenheit es keine funktionellen Tests gibt, können ebenfalls in die vorliegenden Vektoren inseriert werden, wodurch sich durch geeignete Antibiotikumseiektion Transformanten isolieren lassen, die die. nichtselektierbare DNA enthalten. Solche

' 1 . n'ichtselektierbare DNA-Segmente können an jeder. Stelle in-¹ seriert werden, mit Ausnahme der Bereiche, die 'für- eine Plasmidfunktion und Replikation erforderlich sind, und hierzu gehören unter anderem Gene, die für .Ant'ibioti'kamo-. difikationsenzyme spezifizieren, und Regulationsgene: aller-Arten. , , ' . ' ' . \ _ : '

' Ein. nichtselektierbares DNA-Segment,. das ein. Gen enthält,

wird insbesondere in ein Plasmid, beispielsweise das Pias- ^O mid pFJ208, an der zentralen SjQI-Restriktionsstelle . ·

. \ · des Resistenz "-

,verleihenden ungefähr 1,6 kb BamHI-Fragments inseriert. Eine solche Insertion ergibt eine Inaktivierung des Gens • für die Thiostreptonresistenz 'und ermöglicht .somit eine. ¹S leichte Identifizierung von Transformanten,. die das rekom-. binante Plasmid enthalten. Dies wird.erreicht, indem man zuerst eine Selektion bezüglich Neomycinresistenz durch·^ • '· führt und dann diejenigen neomycinresistenten Transformanten identifiziert, die gegenüber Thiostrepton nicht resistent sind. In ähnlicher Weise ergibt eine Insertion eines

. ' '· ' · . ' ' ' - ' ' Ϊ

jeweils interessierenden DNA~Segments beispielsweise an der

'.· " inneren BamHI-Restriktionsstelle des Resistenz verleihenden ungefähr 3,4 kb BamHI-Fragments eine Inaktivierung des Gens ' für die Neomycinresistenz. Transformanten, die- dieses rekombinante Plasmid enthalten, lassen sich daher ebenfalls leicht identifizieren,· indem man zuerst eine Selek-' tion bezüglich Thiostreptonresistenz vornimmt und dann' .diejenigen thiostreptonresistenten Transforman-ten.identifiziert, die gegenüber Neomycin nicht resistent sind.' Eine ähnliche Selektion unter, rlnsertionsinaktivierung des Gens , für die Erythromycinresistenz läßt sich ebenfalls durch-, ' führen. .· Die Fähigkeit zur¹ Selektion bezüglich Antibiotikaresistenz in Streptomyces und damit verwandten-Zellen ermöglicht daher eine effiziente Isolierung,der äußerst seltenen 'Zellen, die.die jeweils interessierende nichtselek- -: tierbare DNA enthalten. , , . · .: . .-...

Der oben beschriebene funktioneile Test für eine Antibiotikaresistenz läßt sich; auch zur Lokalisierung'" von DNA-Segmenten verwenden, die als Kontrollelemente, wirken und eine. . Expression eines individuellen. Gens für eine Antibiotika-5-resistenz lenken. Solche Segmente, zu denen unter anderem Promotoren, Abschwächer, Repressoren, Induktoren und ribosomale Bindestellen gehören, werden zur Steuerung der Expression anderer Gene in Zellen von Streptomyces. und da- ^: mit verwandten Organismen verwendet.,

Die erfindungsgemäßen· Vektoren,

die eine Resistenz gegenüber"Thiostrepton, Neomycin und Erythromycin verleihen, sind auch)zur Sicherung dafür brauchbar, daß verknüpfte DNA-Segmente in Wirtszellen über viele. Generationen stabil gehalten werden. Diese Ge-' ' ne oder DNA-Fragmente, die an das eine Resistenz gegenüber Thiostrepton, Neomycin oder Erythromycin verleihende Fragment koval.ent gebunden sind und die entweder in Streptomyces oder in den Zellen verwandter Organismen propagiert werden, werden dadurch aufrechterhalten, daß man die'Transformer! ten solchen Konzentrationen an Thiostrepton, Neomycin oder Erythromycin aussetzt, die für 'nichttransformierte Zellen toxisch sind. Transformanten, die den Vektor und infolgedessen jegliche kovalent gebundene DNA verlierendes können daher nicht wachsen und werden aus der Kultur eli-· miniert. Durch die erfindungsgemäßen Vektoren läßt¹ sich daher jede gewünschte DNA-Sequenz stabilisieren und auf-

:. ' rechterhalten. .

Die erfindungsgemäßen , Klonierungs-

vektoren und Transformanten ermöglichen eine Klonierung . von Genen unter Verbesserung.der- Ausbeuten an verschiedenen Produkten, die gegenwärtig in Streptomyces und damit verwandten Zellen gebildet werden. Zu Beispielen für solehe Produkte gehören unter anderem Streptomycin, Tylosin,. Cephalosporine,, Actaplanin, Narasin, -Monensin, Apramycin, ' Tobramycin, Erythromycin, Tetracyclin, Chloramphenicol und dergleichen. Ferner werden durch die vorliegende Er-

- Ii

findung auch' selektierbare Vektoren geschaffen, die brauchbar sind für eine Klonierung, Charakterisierung und Rekonstruktion von DNA-Sequenzen, welche für wirtschaftlich. ·. . wichtige Proteine kodieren,wie beispielsweise für Hu.man- ^ insulin, Humanproinsulin, Glucagon, Interferon, Humanwachstumshormon, Rinderwachstumshormon und dergleichen, für enzymatische Funktionen in Stoffwechselwegen,, die. zu wirtschaftlich wichtigen Verfahren und Verbindungen führen, oder als Kontrollelemente, die eine Genexpression verbessern. Zu diesen gewünschten DNA-Sequenzen gehört unter anderem DNA, die für Enzyme kodiert, welche eine Synthese .. von Antibiotikaderivaten katalysieren, wie beispielsweise von Derviaten von Streptomycin, Cephalosporin, Tylosin, Actaplanin, Narasin, Monensin, Apramycin, Tobramycin, Tetracyclin, Chloramphenicol und Erythromycin, oder die für Enzyme kodiert, die eine Bioproduktion von Antibiotika und . anderen.Produkten vermitteln und verbessern. Die Möglichkeit zur Insertion und Stabilisierung solcher DNA-Segmente ergibt daher eine Erhöhung der Ausbeute und Verfügbarkeit an Antibiotika, die durch Streptomyces und damit verwandte Organismen produziert werden. -_r . .

Streptomyces virginiae/pNMlOO.und Streptomyces ambofaciens/ pFJ143, welche jeweils Quellen für die Plasmide pNMlOO und pFJ143 sind, können auf verschiedene Art und Weise unter

Einsatz irgendeines von mehreren unterschiedlichen Medien . gezüchtet werden. Zu Kohlenhydratquellen, die in "einem

..,' Kulturmedium bevorzugt sind, gehören beispielsweise Melasse, Glucose, Dextrin' und Glycerin, während zu Stickstoff-' quellen unter anderem beispielsweise Sojabohnenmehl, Aminosäuregemische und Peptone gehören. Es werden auch anorganische· Nährsalze zugesetzt, und hierzu gehören die üblichen Salze, welche zur Bildung von Ionen von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Phosphat, Chlorid, Sulfat und ähnlichen Ionen befähigt sind. Weiter müssen auch noch essentielle'· Spurenelemente zugesetzt werden, wie sie für'das Wachstum ^ und die Entwicklung anderer Mikroorganismen ebenfalls notwendig sind. Solche Spurenelemente werden normalerweise

in Form von Verunreinigungen zugeführt, die in den.anderen bestandteilen des Mediums zufällig vorhanden sind.

Streptomyces virginiae/pNMl0 0 und Streptomyces ambofaciens/ pFJ14 3 wachsen unter aeroben Züchtungsbedingungen über einen verhältnismäßig breiten pH-Bereich von etwa 5 bis 9 bei Temperaturen zwischen etwa 15'⁰C und 4O⁰C. Zur Produktion der Plasmide pNMlOO und pFJ143 in größter Menge

geht man zweckmäßigerweise von -einem Kulturmedium mit einem pH-Wert von etwa 7,2 aus und führt die Züchtung in diesem Medium dann bei einer Temperatur von etwa 3O⁰C durch. Durch Züchtung von Streptomyces virginiae/pNMlOO • und¹ Streptomyces ambofaciens/pFJl43 unter den oben erwähnten Bedingungen erhält man einen Zellvorrat, aus dem.sich die Plasmide pNMlOO und pFJ143 unter· Anwendung bekannter Techniken isolieren lassen. ·

Ausführungsbeispiele.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele im einzel- ^: nen weiter erläutert. Darin werden, falls angebracht, so'-, wohl Erklärungen als auch tatsächliche Verfahren zur Konstruktion der Erfindung beschrieben.

2 5 B e i s ρ 1 e 1 1 ' .

Isolierung des Plasmids pNMlOQ . . .. '..

A. Züchtung von Streptomyces virginiae/pNMIOO 30 . .

Ein vegetatives Impfgut von Streptomyces virginiae/pNMIOO (NRRL 15156) wird in herkömmlicher Welse hergestellt, indem man'den Stamm unter submersen aeroben Bedingungen in 50 ml sterilisierter Trypticase-Sojabrühe* unter einer. Konzentration von 35 g/l in deionisiertem Wasser wachsen

läßt. ' .· .' - ;

* Trypticase-Sojabrühe von Difco Laboratories, Detroit, Michigan, V.St.A.

Das Impfgut auf Basis von Trypticase-Sojabrühe wird 48

Stunden bei einer Temperatur von 3O⁰C bebrütet. Man über-. trägt etwa' 10 ml des bebrüteten Impfguts zuerst in 500 ml sterilisierte Brühe und bebrütet das Ganze dann etwa 20

Stunden bei 30⁰G. Der pH wird nicht eingestellt. Nach Bebrütung sind die Z.ellen von Streptomyces virginiae/pNMl.OO fertig zur Ernte und anschließenden Isolierung der P,las-

j mid-DNA. ₍ , - .

B. Isolierung des Plasmids . . .

Etwa 10 g (Naßgewicht) Zellen von Streptomyces virginiae/ ν pNMl00 werden durch Zentrifugation (10 Minuten, 5⁰C, 10000 U/min) geerntef . Die Zellen werden unter Verwendung eines Gewebemahlwerks 'homogenisiert, in TES-Puffer (0,05 Mol

Tris(hydroxymethyl)aminomethan /Tris/ 0_y005 Mol EDTA und ,0,05 Mol NaCl, pH 8,0) gewaschen und dann in TES-Puffer suspendiert, der 25 % Saccharose enthält. Nach Zusatz von etwa 120 mg Lysozym in 20 ml eines Puffer aus TES und 25 % Saccharose'wird die Suspension etwa 20 Minuten bei 35 .bis 37⁰C bebrütet, worauf man sie mit 40 ml 0,25 molarem EDTA mit einem pH-Wert von 8,0 versetzt und dann erneut 10 Minuten bei 35°C bebrütet. Hierauf gibt man etwa 40 ml 5 %-iges SDS (Na.triumdodecylsulfat) in TE-Pufferi (0,01 Mol

Tris, 0,001 MoΓ EDTA., pH 8,0) zu und bebrütet das erhaltene Gemisch dann erneut 20. Minuten bei 3.5 bis 37⁰C, worauf ' man 50 ml 5-molares NaCl in deionisiertem Wasser zusetzt. Das Gemisch wird gerührt, etwa 4 Stunden in ein Eisbad gestellt und dann zentrifugiert C 30 Minuten, 4°C,_ 10000 U/

OQ min). Die NaCl enthaltende überstehende Flüssigkeit wird mit. etwa. 0,313 Volumina an 42 %-igem Polyethylenglykol in deionisiertem Wasser versetzt und das erhaltene Gemisch etwa 18 Stunden auf 4⁰C gekühlt. Der DNA-Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt (5 Minuten, 4°C, 3000 U/

-min) und" dann in TES-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 gelöst. Durch Zentrifugation (4 Stunden, 15°C, 35000 U/min) unter Anwendung eines Gradienten aus Caes.iumchlorid und

Ethidiumchlorid trennt sich die DNA zu zwei sauber de.fi- nierten Banden auf, wobei die untere Bande das gewünschte --Plasmid pNMIOO darstellt. Alternativ dazu kann man auch-..

4,14 g Caesiumchlorid in 1,^:84 ml STE ( 10 rnMol Tris-HCl, pH 8, ,10 mMol NaCl, 1 mMol EDTA, pH 8) und 0,5 ml EDTA : (0,25 Mol, pH 8) lösen. Durch Zusatz von etwa 1 ml DNA-Suspension und 0,8 ml Ethidiumbromid (5 mg/ml) ergibt sich ein Gradient von 5,1 ml mit 1,6 g/ml_: Caesiumchlorid'und 800 μg/ml Ethidiumbromid. Durch Zentrifugation ('5 Stunden, 2O⁰C, 60000' ü/min) in einer Ultrazentrifuge mit einem

senkrechten Rotor, wie dem Gerät.VTi65 von Beckman, unter anschließender Geschwindigkeitserniedrigung während etwa 1,3 Stunden ohne Unterbrechung- erhält man wohldefinierte Banden. Die untere Bande besteht aus dem gewünschten Plas-¹^ mid pNMIOO. Unter Anwendung herkömmlicher Verfahren wird die Plasmidbande entfernt, zweimal mit Isoamylalkohol gewaschen, über TE-Puffer.mit einem pH-Wert von 8,0 dialysiert und mit Ethanol ausgefällt'',.. Die so isolierte Plas-. mid-pNMlGÖ-DNA wird in 0,4 ml TE-Puffer bei einem pH-Wert von 8,0 gelöst und dann zur Aufbewahrung bei -20⁰C eingefroren.

B e i s ρ i e 1 2 / ' . ^l

Konstruktion des Plasmids pLR2 . ' _;

A. Verdauung des* Plasmids pIJ6 mit HindiII

Etwa 20 μΐ (20 μg) Plasmid-pIJ6-DNA (Natpre 286,. 525 3Ö (1980), 5 μΐ BSA (Rinderserumalbumin, 1 mg/ml), 19 μ 1 Wasser, 1 μΐ iiindlll (enthaltend 3 New England Bio Labs-Ein-, leiten) Restriktionsenzym* und 5 μΐ Reaktionsmischung** werden 2 Stunden bei 37⁰C bebrütet. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4-molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem ,Ethanol beendet. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet, in 20 μΐ TE-Puffer suspendiert und

. - Al -

¹ zur Aufbewahrung bei -20⁰C eingefroren.

*Solche Restriktionsenzyme¹ sind von folgenden Firmen erhältlich .: .,'. ,' . New England Bio Labs.,· Inc., 3 2 Tozer Road, Beverly, Massachusetts 01915,. V.St.A., " , \ ^:' . ' Boehringer-Mannheim Biochemicals,, 7941 Castleway Drive, Indianapolis, Indiana 46250, V.StvÄ., '. ·

Bethesda Research Laboratories Inc./. P.O. Box 577, Gaithersburg, Maryland 20760/ V.St.A.

**Diese Reaktionsmischung für das HindiII-Restriktionsenzym wird mit folgender Zusammensetzung hergestellt: 600 mMol NaCl . .

100 mMol Tris-HCl, pH 7,9 . ,

15 70 mMol MgCl₂ , .

10 mMol Dithiothreit _v ( '

B. Verdauung des Plasmids pBR322 mit HindiII -

Etwa 8 μΐ (4 ^g) Plasmid-pBR322-DNA, 5 μΐ Reäktionsmischung, 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 31 μΐ Wasser und 1 μI Hindll-I-Restriktionsenzym werden 2 Stunden bei 37°'C bebrütet-' Nach Beendigung der Reaktion durch 10 Minuten langes Bebrüten bei, 6O⁰C werden etwa 50 μΓ 4-molares Amm'oniumacetat und .200 μΐ 95 %-iges Ethanol zugesetzt. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird" zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 45 μΐ Wasser suspendiert.

C. Verknüpfung der mit Hindlll verdauten Plasmide pIJ6 und pBR322 ^ ·

Etwa 20 μΐ mit Hindi 11 verdautes Plasmid pIJ6 (.von Beispiel 2A), 20 μΐ mit HindiII behandeltes Plasmid pBR322 '(von Beispiel 2B), 5 μΐ BSA (1 mg/ml)·, 1. μΐ T4-DNA-Ligase* 3g und 5 μΐ Ligationsmischung** werden 4 Stunden bei 16⁰C bebrütet. Die Reaktion wird durch Zusatz von etwa 50 μΐ 4-mola.rem Ammoniumacetat und 200'μΐ 95 %-igem Ethanol beendet.

/ ν.. · . ·· . . ;. ; - 23 - · ·· . . .. . ' . ;

..... . Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem

Ethanol:gewaschen, unter Vakuum- getrocknet und in TE-Puf-. : :. ' fer suspendiert. Die suspendierte. DNA stellt das gewünsch-' . . te Plasmid pLR2 dar.

'. *'. Die T4-DNÄ-Ligase ist von folgender Firma erhältlich: . . .· . . . New England Bio-Labs., 'Inc., 32 Tozer Rd., Beverly, . ; Massachusetts ,01915, V.St.Ä. . _; . .

.'. : **. Die Ligationsmischung wird mit folgender Zusammenset-

10 ' ' · ' ' ." './ ·'

'. '' ·· , zung hergestellt: . . . . .

" ^v 500 mMol Tris-HCl, pH 7,8

\J... ·. " 200 mMol' Dithiothre.it. '-. .. ' * .

. ··.:" . .100 mMol MgCl₂ . ' .;..

' : . : . ' 10 mMol ATP

... :^: · 15. . . -.' : "' . ; . ; ' . .-. '^; ' · .· ' '. .-'Beispiel 3, '

··.' > Konstruktion von Escherichia coli KX2 HBl01/pLR2. .

; ^;. ^- Etwa 10 ml gefrorene leistungsfähige Zellen .von Escheri-

... chia coli K12 HBlOl ' (Gene, 2, 75. bis 93 (1977 )) werden . , : durch Zentrifugation pelletisiert und dann in etwa 10 ml 0,01 molarem Natriumchlorid suspendiert. Sodann werden , . ,'- ' . die Zellen erneut pelletisiert, in etwa .10 ml- 0,03 molarer *".' ^ Calciumchloridlösung resuspendiert, 20 Minuten auf Eis be- -.' -.. brütet, ein drittes Mal pelletisiert und schließlich in ,.'... ..: . 1/25, ml 0,03 molarer Calciumchloridlösung resuspendiert. . ' , . Die erhaltene Zellsuspension ist für eine anschließende . Transformation- leistungsfähig.. . . ·

'.so' -..'.· . ' -. ' . _i . . .

Plasmid-pLR2 in TE-Puffer (hergestellt gemäß Beispiel 2C) wird mit Ethanol gefällt, in 150 μΧ 30 mmolarer Cal.cium-.' Chiöridlösung suspendiert und' in einem Teströhrchen leicht

mit etwa 200 μΐ leistungsfähigen Zellen von Escherichia 35 coli K12'HBlOl vermischt. Das erhaltene Gemisch wird zuerst .etwa 45 Minuten auf Eis und dann etwa eine Minute ·. ' . bei 42⁰C bebrütet. Sodann gibt man etwa 3 ml L-Brühe zu

¹V HJ.^;Bacteriology 62, 293 (1951)), die 50 μς Ampicillin pro ml enthält. Das Gemisch wird unter Schütteln eine Stunde bei 37⁰G bebrütet und dann auf L-Agar ,(Miller 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs,.-' Cold Spring Harbor, New York, V.St.A.) aufgezogen, der Am-

' picillin enthält. Überlebende Kolonien werden selektiert

' RS

'' ;. und bezüglich des erwarteten Phenotype (Amp , Tet ) untersucht, und sie stellen die gewünschten Transformanten von .' ' Escherichia coli¹ K12 HBlQl/pLR2 dar. ' ^:

' B e i. s ρ i e 1 : 4 , , ' - '

Konstruktion des.Plasmids pLRl , _; ^:

Das Plasmid pLRl wird praktisch nach dem in,Beispiel 2A -.. bis,2C beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei man ab-'· weichend davon jedoch das Plasmid 'pIJ2 (Nature 286, 525 - (1980)) anstelle des Plasmids pIJ6_/verwendet. Das gewünschte Plasmid pLRl wird , in TE-Puffer.suspendiert.

Beispiel 5 _: - ·.'''.'-,' \ ' ". ; .Konstruktion von'Escherichia coli K12 HBlOl/pLRl _;

Die gewünschte Konstruktion wird praktisch.wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon'zur

, ' Transformation jedoch das Plasmid pLRl und nicht das Plasmid pLR2 verwendet. Überlebende Kolonien werden selektiert und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet J . unter-

30.. sucht, und sie stellen die gewünschten, Transf ormanten von Escherichia coli Kl2 HBlOl/pLRl dar. "

.-.· ^! ' ' -'²⁵ - ' > '. ·

1 B e i s ρ i e 1 6 .

· . : Konstruktion des Pl.asmids pLR4 . . -'

a. Teilverdauung des Plasmids pLRl mit BainHi. ' ' .

Etwa 10 μΐ (10 μg) Plasmid pLRl, 5 μΐ BSA. (1 mg/ml), 29 μΐ Wasser, 1 μΐ BamHI (mit Wasser auf 1:4 verdünnt). Restrik- ; tionsenzym und 5 μΐ Reaktionsmischung·* werden 15 Minuten bei 37⁰C bebrütet. Die Reaktion wird durch Zugabe _;von etwa 50 μΐ 4 molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ. 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zwei-. ' mal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 20. μΐ Wasser suspendiert. . "...

* Die Reaktionsmischung für das BamHI-Restri.ktionsenzym

wird mit folgender Zusammensetzung hergestellt: , .1,5 mMol NaCl . ^; .

60 mMol -,Tris-HCl·, pH 7,9 . . , / 60 mMol MgCl₂ .. .

B. Verdauung des Plasmids pBR322 mit BamHI .

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 2B - beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon jedoch das BamHI-Restriktionsenzym anstelle des Hindlll-Restriktionsenzyms verwendet. Das verdaute Plasmid' pBR322. λ wird in 29 μΐ Wasser suspendiert. , .

30. C. Verknüpfung des mit BamHI teilverdauten. Plasmids pLRl mit dem mit BamHI verdauten Plasmid pBR322 . ,-

, , Die gewünschte Verknüpfung wird praktisch wie in Beispiel 2C Beschrieben durchgeführt. Die erhaltene verknüpfte DNA· ,35 wird in \TE-Puf fer suspendiert .und stellt ias gewünschte Plasmid pLR4 dar.

· ' Beispiel 7 ^! . . . , ^ "

Konstruktion von -Escherichia coli K12 HS101/pLR4

° Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, wobei man zur Transformation jedoch das Plasmid pLR4 und nicht das Plasmid pLR2 verwendet. Überlebende Kolonien werden selektiert und bezüglich

R S des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht, und sie

¹^ ' stellen die gewünschten Transformanten von Escherichia coli k'12 HBl01/pLR4 dar.' ' ,

' B e i s ρ i e 1 8 · '

¹⁵ Konstruktion der Plasmide pFJ204 und DFJ2Q5 '

' A. Verdauung des Plasmids pLR2 mit 3arnHI und· Isolierung des die Thiostreptonresistenz verleihenden etv/a 1,6 kb-Fragments

Etwa 50 μg Plasmid-pLR2-DNA, IG μΐ Reaktionsmischung,. 10. μΐ BSA (1 mg/ml), 29 ul Wasser und 1 μΐ (4 Einheiten/μΐ) BamHI-Restriktion5enzym werden 2 Stunden bei 37⁰C bebrütet. Nach Zugabe eines gleichen Volumens an 4-molarem Ammonium-

25. " acetat und^: von 2,5 Volumina an 95 %-igem Ethanol wird das Gemisch, zur Ausfällung der DNA etwa 1x8 Stunden auf -2O⁰C gekühlt. Der DNA-Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt und dann in etwa 50 μΐ TE-Puffer suspendiert. Das' gewünschte etwa 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragment wird in. herkömmlicher Weise aus der DNA-Suspension durch Gelelektrophorese mit Agarose unter praktischer Anwendung des ,VerfahrÄis von R.W. Davis'.et al., 1980, A Manual For Genetic ' Engineering, Advanced Bacterial- Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, V.St.A.

isoliert. Nach erfolgter Isolierung wird das Fragment in .etwa 20 μΐ TE-Puffer für eine anschließende Verknüpfung resusoendiert. ' .. ·. -

. ·. - 27 -' . ''

B. Verdauung des Plasmids pNMlOO mit BamHI und Isolierung des den Replikationsursprung enthaltenden etwa ' 3-, 8 kb-Fragments

Die gewünschte^vVerdauung und Isolierung wird praktisch wiein Beispiel 8A beschrieben durchgeführt/ wobei man jedoch das Plasmid pNMIOO und.nicht das Plasmid pLR2 verwendet. Nach erfolgter Isolierung wird das etwa 3/8 kb-^Fragment , in etwa 50 μΐ TE-Puffer für eine anschließende Verknüpfung suspendiert. ' .

• _sC. Verknüpfung

Etwa 1 μg,des etwa 3/8 kb BarriHI-Fragments des Plasmids ' ρΝΜΙΟΟ,.1 μg des etwa 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragments des Plasmids pLR2, 5 μΐ Ligationsmischung, 5 μΐ BSA (l.mg/ ml), 25 μΐ Wasser und 5 μΐ T4-DNA-Ligase (New England Bio Labs): werden etwa 4 Stunden bei etwa 16⁰C bebrütet. Nach Zusatz von etwa 50;μΐ 4-molare-mAmmoniumacetat und etwa 300~μ1 kaltem Ethanol wird das Gemisch zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -20⁰C gekühlt. Der DNA-Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt, mit 70 %-igem ' Ethanol gewaschen,^: erneut gesammelt und dann in 50 μΐ Medium P {J. Molecular and General Genetics 162, 307 (1978)) zur anschließenden Transformation suspendiert.

Es ergebe'n sich rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen, da das resistenzverleihende etwa 1,6 kb BamHI-Fragment in eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die erhaltenen Plasmide pFJ204 und pFJ205 können in geeignete Wirtszelien¹ übertragen und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrcphorese mit. Agarose identifiziert werden (R.W. Davis et al., 1980,-¹A Manual For Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, V.St.A.).. Ein Restriktionsstellenplan und Funktionsplan für jedes der Plasmide pFJ204 und pFJ205 geht aus Fig. 3 der Zeichnung hervor.

/

Beispiel 9 . ' , '

Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pFJ204 und

' Streptomyces ambofaciens/pFJ205 '

Unter Verwendung von etwa 1 μ9 der DNA von Beispiel 8C

8 '

• und 1 χ 10 Protoplasten von Streptomyces ambofaciens, nämlich einem Stamm, der beim Northern ,'Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V.St.A'. hinterlegt und Teil der dortigen ständigen Kulturensammlung ist, von wo dieser Stamm unter der Nr. NRRL 2 420.frei bezogen werden kann, führt man die gewünschten Konstruktionen praktisch unter Anwendung des in Beispiel.2 der Internationalen Offenle-'· gungsschrift WO79/01169 (Internationale Patentanmeldung

^1& Nr. PCT/GB79/00095) beschriebenen Verfahrens durch. Die gewünschten Transformanten werden bezüglich einer Thiostreptonresistenz selektiert-, indem man die regenerierenden Protoplasten mit Spitzenägar auf Basis von R2.-Medium (Molecular and General Genetics 162, .3 0 (1978)) überdeckt, der so.viel Thiostrepton enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzentration yon 50 μς/χηΐ ergibt. Die erhaltenen und gegenüber Thiostrepton resistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pFJ20 4 und Streptomyces ambofaciens/pFJ205 werden nach bekannten Verfahren isoliert, gezüchtet und darin in üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese mit Agarose bezüglich der vorhandenen Plasmide untersucht (R.W. Davis et al., 1980, A Manual. For Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, V.,St.A.). Die Transf ormantenkulturen werden zur anschließenden Produktion und Isolierung der jeweiligen Plasmide verwendet. ' ·

. ' . . ' - 29 - ^; B e i s ρ i e 1 10 Konstruktion der Plasrnide pFJ206 und pFJ207

' · ' . ' ' ι . - ·

A. Verdauung des Plasmids pLRl mit BamH'I und Isolierung

'des die Neomycinresistenz verleihenden etwa 3,4 kb-Fragments ' .

Die gewünschte Verdauung und Isolierung führt man praktisch wie in Beispiel 8Ä beschrieben durch. Das erhaltene etwa 3,4 kb-BamHP-Restriktionsfragment wird in''etwa 2 0 μΐ TE-Puffer zur anschließenden Verknüpfung suspendiert.

B. Verknüpfung .

Das die Neomycinresistenz verleihende etwa 3,4:kb BamHI-Restriktionsfragment verknüpft 'man mit dem etwa 3,8 kb BamHI-Fragment des Plasmids pNMlOO (hergestellt gemäß Beispiel 8B) unter praktischer Anwendung des in Beispiel, 8C beschriebenen Verfahrens.

Es ergeben sich rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen, da das resistenzverleihende etwa 3,4 kb BamHI-Fragm'ent in eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Die .erhaltenen Plasmide pFJ206 und pFJ207 können in geeignete Wirtszellen übertragen und dann in herkömmlicher Weise durch¹ Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese ,mit Agarose identifiziert werden- (R.W. Davis et al., 1980, A Μβημαΐ For Genetic Engineering, Advanced Bacterial Gene-. tics, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring, Harbor, New York, V.St.A.). Ein Restrikt.ionsstellenplan und Funktionsplan für jedes der Plasmide pFJ206 und pFJ207 geht aus Fig. 3 der Zeichnung hervor.

Beispiel 11

Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pFJ206 und

Streptomyces ambofaciens/pFJ207

Unter Verwendung von etwa 1 μg der DNA von Beispiel 10 und

8 1x10 Protoplasten von Streptomyces amb.ofaciens (NRRL

2420) führt man die gewünschten Konstruktionen praktisch , unter Anwendung des in Beispiel 2 der Internationalen Offenlegungsschrift WO79/01169 (Internationale Patentanmeldung PCT/GB79/00095) beschriebenen Verfahrens durch. Die gewünschten Transformanten werden bezüglich einer Neomycinresistenz s.elektiert, indem man die regenerierenden , . Protoplasten mit Spitzenagar auf Basis von R2-Medium über-¹^ schichtet* das so viel Neomycin* enthält, daß sich auf der fertigen Platte eine Konzentration von 1^g/ml ergibt.

Die erhaltenen und gegenüber Neomycin resistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pFJ206 und Streptomyces ambo-· faciens/pFJ207 werden nach bekannten Verfahren isoliert und dann' in üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese mit Agarose bezüglich der vorhandenen Plasmide untersucht (R.W. Davis et al., 1980, A Manual For Genetic Engineering,.Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, V.St.A.). Die, Transformantenkulturen werden zur ,anschließenden Produktion und Isolierung der jeweiligen Plasmide verwendet. .

* Das Antibiotikum Neomycin ist v'on Sigma, .St. Louis, Missouri, V.St.A. erhältlich. · ^v :

B 'e i s ρ i e 1 ; 12

35 Konstruktion der Plasmide pFJ208 und pFJ2 09

Das Plasmid pFJ204, welches aus Streptomyces ambofaciens/

pFJ204 ,nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren isoliert worden ist, unterzieht man einer Teilverdauung mit . BamHI-Restriktionsenzym. Zur Durchführung dieser Verdauung bebrütet man etwa 20 μg Plasmid-pFJ204-DNA, 10 μΐ Reak- , tionsmischung, 10 μΐ BSA (1 mg/ml), 39 μΐ Wasser und 1 μΐ BamHI-Restriktionsenzym (hergestellt durch Verdünnung von 2 μΐ Enzym in 8 μΐ Wasser) etwa 15 Minuten bei Umgebungstemperatur. Nach Zugabe eines gleichen Volumens.an 4-molarem Ammoniumacetat:und von 5 Volumina an 95 %-igem Ethanol wird das Gemisch zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -2Q°C gekühlt.' Der DNA-Niederschlag wird durch Zentri-.fugation gesammelt, in 70 %-igem Ethanol gespült, unter Vakuum getrocknet und dann in etwa 50; μΐ TE-Puffer suspendiert. . - ^v

- / . .

Das BamHI-TeilVerdauungsprodukt verknüpft man dann unter praktischer Anwendung des in Beispiel 8C beschriebenen Verfahrens mit dem die Neomycinresistenz verleihenden etwa 3,4 kb BamHI-Fragment des Plasmids pLRl (hergestellt gemäß

20" Beispiel 10A), wodurch die gewünschten Plasmide gebildet werden. Es werden auch die Insertionsisomeren der Plasmide pFJ208 ,und pFJ209 gebildet, da das Plasmid pFJ204 zwei-i. BamHI-Restriktionsstellen für die Insertion des Fragments für die Neomycinresistenz hat. Es¹ ergeben sich rekombinante. Plasmide mit zwei Orientierungen, da das die, Neomycinresistenz verleihende etwa 3,4 kb BamHI-Fragment- in eine von zwei Richtungen orientiert, sein kann. Die erhaltenen Plasmide pFJ2O8 und pFJ209 lassen sich in geeignete Wirtszellen übertragen und dann durch herkömmliche Restriktions- enzymanalyse und Gelelektrophorese mit Agarose identifizieren (R.W. Davis et al., 1980, A Manual For Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, V.St.A.). Ein Restriktionsstellenplan und Funktionsplan für jedes der Plasmide pFJ208 und pFJ209 geht aus Fig. 4 der Zeichnung

hervor. '.-..-

B eis pie 113

. Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pFJ208 und

Streptomyces ambofaciens/pFJ209 '

Unter Verwendung yon'; 1 μg der DNA von Beispiel 12 und 1 x 10 Protoplasten von Streptomyces ambofaciens (NRRL-2420) führt ..man die gewünschten Konstruktionen praktisch unter Anwendung des in Beispiel 2 der.Internationalen Of-

¹^ fenlegungsschrift WO79/01169 (Internationale Patentanmeldung 'PCT/GB79/00095) beschriebenen Verfahrens durch. Die gewünschten Transformanteri werden zuerst bezüglich der Thiostreptonres.istenz und dann bezüglich der Neomycinresis.tenz nach den in den'Beispielen 9 und 11 beschriebenen

Methoden selektiert. , . ·

Die erhaltenen und gegenüber Thiostrepton 'und .'-Neomycin resistent'en Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pFJ208 und Streptomyces ambofaciens/pFJ209 werden nach bekannten Verfahren isoliert und dann in -üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse¹ und Gelelektrophorese mit' Agarose bezüglich der vorhandenen ,Plasmide untersucht (R.W. Davis et al., ,1980, A Manual For Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, -Cold Spring Harbor, New York, V.St.A.). Die Transformantenkulturen werden zur. anschließenden Produktion und Isolierung der jeweiligen P.lasmide verwendet. ,.

B. e i s ρ i- e 1 14 , V

Isolierung des Plasmids pFJ'1.4 3 . .

A. 'Züchtung von Streptomyces ambofaciens/pFJ143

Unter praktischer, Anwendung des in Beispiel IA beschriebenen Verfahrens wird in üblicher Weise ein vegetatives Impfgut von Streptomyces ambofaciens/pFJ143 (NRRL 15114) hergestellt. ' - ' ' ' · ·'. ' ' '

B. Isolierung des'Plasmids . . ^:

Die gewünschte Isolierung wird praktisch unter Anwendung .

des in Beispiel IB beschriebenen- Verfahrens durchgeführt, . . wobei man jedoch- das Impfgut von Beispiel 14A und nicht . das Impfgut von Beispiel IA verwendet. Die isolierte Plasmid-pFJl43-DNA wird in 1 ml 10-fach verdünntem TE-Puffer gelöst und dann zur Aufbewahrung auf -20°€ eingefroren.

B e i s ρ i e 1 15 ' . ' .

Konstruktion der Plasmide pFJ170 und pFJ210 ^;

A. Verdauung des Plasmids pFJl43 mit BamHI

. , , . .. _

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in. Beispiel 8A beschrieben durchgeführt, wobei man jedoch das Plasmid pFJ143 verwendet, und nicht das Plasmid pLR2. Der DNA-Nie-. derschlag wird durch Zentri-fugation gesammelt, in 70 %-igem Ethanol gespült,unter Vakuum getrocknet und dann in etwa 50 μΐ TE-Puffer suspendiert. .

B. . Verknüpfung . ; ' . . .

Etwa 1 μg des mit BamHI verdauten Plasmids pFJ143 u'nd 1 μg des etwa 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragments des Plasmids pLR2 (hergestellt gemäß Beispiel 8A) verknüpft man unter praktischer Anwendung des in Beispiel 8C beschriebenen Verfahrens. Es ergeben sich rekombinante Plasmide-mit zwei Orientierungen, da das. die Resistenz verleihende etwa

1,6 kb BamHI-Fragment in eine von zwei Richtungen orien- Γ tiert sein kann. Die erhaltenen Plasmide pFJ170 und pFJ210 können in geeignete Wirtszellen übertragen werden - und lassen sich dann in üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse unt3 Gelelektrophorese mit Agarose identifzieren (R.W. Davis et al., 1980, A Manual For Genetic Engineering-, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor, Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, V.St.A.). Ein

Restriktionsstellenplan und Funktionsplan für jedes der .Plasmide pFJl70 und pFJ210 geht aus Fig. 5 der Zeichnung hervor.. . . '

B e i s .p i e 1 16 '

Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pFJ170 und Streptomyces ambofaciens/pFJ210 ' .- '

Unter praktischer Anwendung des in Beispiel 9 beschriebenen Verfahrens, jedoch unter'Einsatz der DNA von Beispiel 15C, werden die gewünschten Konstruktionen durchgeführt, in üblicher Weise identifiziert und zur anschließenden . Bildung und Isolierung der Plasmide pFJ170 und pFJ210 verwendet. ', ' ' .

Beispiel¹ 17 .^₁

Konstruktion, der Plasirtide pFJ211 und pFJ212

-\ ' · ' ',· ^;; ν ' .' '

Man führt die gewünschten Konstruktionen durch und identi-. :· fiziert in üblicher Weise unter praktischer Anwendung des in Beispiel 10 beschriebenen Verfahrens, jedoch unter Verwendung des mit BamHI verdauten Plasmids pFJ143 anstelle ²^ des etwa 3,8 kb BamHI-Fragments des Plasmids pNMlOO.. Ein Restriktionsstellenplan und Funkt^Jionsplan für jedes der Plasmide pFJ211 und pFJ212 geht aus Fig. 5 der Zeichnung s hervor. '" _ - . ' · .

30' Beispiel 18 , '

Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pFJ211 und Streptomyces' ambofaciens/pFJ212

Unter praktischer Anwendung des. in Beispiel 11.beschriebe-ηen Verfahrens, jedoch unter Einsatz der DNA von Beispiel 17, werden die gewünschten Konstruktionen durchgeführt,

- 35 - .

in üblicher Weise identifiziert und zur anschließenden \ Bildung und Isolierung der Plasmide pFJ211 und pFJ212 verwendet. . ... '.". ' '·

B ei s ρ i.e 1 19 .

Konstruktion der Plasmide pFJ2'13 und pFJ214

Man führt die gewünschten Konstruktionen durch und identi- *-0 fiziert in üblicher Weise unter praktischer Anwendung des in Beispiel 12 beschriebenen Verfahrens, wobei jedoch das Plasmid pFJ'170 verwendet wird und nicht das Plasmid pFJ204. Es werden audh die Insertionsisomeren der Plasmide pFJ213 und pFJ214 gebildet, da das Plasmid pFJ1.70 zwei ^ ^ BamHI-Restriktionsstellen für die Insertion des Fragments 'für die Neomycinresistenz aufweist. Es ergeben sich re,kombinante Plasmide mit zwei Orientierungen, da das die Neomycinresistenz verleihende etwa 3,4 kb BamHI-Fragment in eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Ein Restrik-20¹^ tionsstellenplan und Funktionsplan für jedes der Plasmide pFJ213 und pFJ214 geht'aus Fig. 6 der Zeichnung hervor. ,

B e i s ρ i e 1 20

...' ' . ' .'. '. ( ' .

Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pFJ213 und

Streptomyces ambofaciens/pFJ214 ' .

Unter praktischer Anwendung des in Beispiel 13 beschriebenen Verfahrens, jedoch unter Einsatz der DNA von Beispiel 19, werden die gewünschten Konstruktionen durchgeführt, in üblicher Weise identifiziert und zur anschließenden BiI-dung und Isolierung der"Plasmide pFJ213 und pFJ214 verwendet. ' ' .

¹ B e i.s ρ i · e 1 21 ' . , ' '

Konstruktion der Plasmide PFJ215 und pFJ216 ;

•° ' A. Züchtung von Escherichia col.i 8Ö3/pIJ43 und Isolie

. - . ' f

rung des Plasmids pIJ43 -' :'·

Man führt die gewünschte Züchtung von Escherichia

pIJ43 (ATCC 391.56) und die anschließende Isolierung des ,

^ Q Plasmids pIJ43 jeweils unter praktischer ..Anwendung des in

R.W. Davis et al., 1980, A Manual For Genetic Engineering, , ' Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laborato- -.. ries, Cold Spring Harbor, New York, V.St.A. 'beschriebenen Verfahrens durch. Die erhaltene-pIJ43-DNA wird in üblicher Weise in TE-Puffer. suspendiert und·zur Aufbewahrung dann ^; auf -30⁰C gekühlt. .> - .. . . >

-,- B. · Verdauung und Isolierung -des etwa 2,5 kb Sall-BamHI- - Fragments des· Plasmids pIJ43 . . '.' '

.. * . "\ ":^; " ' ' ' ; · ' ' '^;·' ',v .'.' ' ' ."

Etwa 20 μg Plasmid-plJ43-DNA, 10 μΐ Reaktionsmischung*, 10 μΐ BSA ^:(1 mg/ml), 39 μΐ Wasser und 1 μΐ Sall-Restrik-. . tionsenzym (hergestellt durch solche Verdünnung, daß 1 μΐ ^: hiervon 60 New England Bio Labs-Einheiten enthält) werden etwa 15'Minuten bei Umgebungstemperatur bebrütet. NaCh¹Zu-. satz eines gleichen Volumens an 4-molarem Ammoniumacetat und von 2 Volumina an 95 %-igem Ethanol wird das Gemisch zur Ausfällung;, der: DNA etwa 18^; Stunden auf -20⁰C- gekühlt. , Der DNA-Niederschlag wird durch Zentr'ifugation gesammelt, in 70 %-^igem Ethanol gespült, unter Vakuum getrocknet und dann in etwa 20 μΐ TE-Puffer' suspendiert. Nach erfolgtem

' : ' ... ..' ·.. .; ΐ

Zusatz.von etwa 5 μΐ BamHI-Reaktionsmischung, 5' jj1 BSA (1 mg/ml), 39 μΐ Wasser und 1 μΐ BamHI-Restriktio'nsenzym (mit einem überschüssigen Gehalt an' New England Bio. La.b- ' Einheiten) .wird das Gemisch etwa 60 Minuten bei 37⁰C bebrütet. Man gibt ein gleiches Volumen an 4-molarem Ammonium-' acetat und 2 Volumina an 95' %-igem Ethanol zu und kühlt

"3 ~> _ J /

das Gemisch zur Ausfällung der DNA dann etwa 18 Stunden auf -20.⁰C. Der DNA-Niederschlag wird: durch Zentrifugation gesammelt. Die gewünschten etwa 2,5 kb SaII-BamHI-Fragmente werden abgetrennt und durch übliche Gelelektrophorese _mit Agarose isoliert (R.W. Davis et al., 1980, A Manual /

F,or Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold ... Spring Harbor Laboratories, Cold Spring .Harbor,, New York, V.St.A. )'. ; .. .

* Diese.Reaktionsmischung für das Sall-Restriktionsenzym . ...wird-mit folgender Zusammensetzung hergestellt: 1,5 Mol NaCl

60 mMol Tris-HCl, pH 7,9 ' . .,.

60 mMol MgCl₂

15/ 60 mMol 2-Mercaptoethanol

C. Addition von BamHI-Linkern an das etwa 2,5 kb SaIiI-BamHI-Fragment des Plasmids pIJ43 .

Die Addition von BamHI-Linkern* wird praktisch wie in Science 196, 1313 (1977) beschrieben durchgeführt. Das erhaltene Fragment wird mit BamHI-RestFiktionsenzym behandelt, um so die gewünschten klebrigen BamHI-Enden zu bilden. Das etwa 2,5 kb BamHI-Fragment wird dann in üblicher Weise isoliert und bis zur anschließenden Verknüpfung aufbewahrt. . : .

* Die Verknüpfer BamHI /d(CGGATCCG)/ und andere Verknüpfer sind von folgender Firma erhältlich: Collaborative Research Inc., 128 Spring Street, .

Lexington, Massachusetts 02173, V.St.A. . ·' .,

D. Verknüpfung . .. .

Etwa 1 μ9 des mit BamHI verdauten Plasmids pFJ143 (herge-' . stellt gemäß, Beispiel 15A) und 1 μg des etwa 2,5 /kb-Frägments des Plasmids pIJ43 (hergestellt gemäß Beispiel 21B

und. 21C) verknüpft man praktisch nach dem in,Beispiel 8C beschriebenen Verfahren miteinander.· Es entstehen rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen, da das .etwa 2,5..kb

' ' 3amHI~Fragment in eine von zwei Richtungen orientiert seih kann/ Die' erhaltenen Plasmide pFJ215 und>pFJ216 können in

;..". geeignete Wirtszellen übertragen werden, und lassen'sich dann durch herkömmliche Restrxktions.enzymanalyse und Gelelektrophorese mit Agarose identifizieren (R.W. Davis et al., 1980, A Manual For Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor , New York , V¹. St .Ä. ). Ein Restriktipnsstellenplan und Funktionsplan für jedes der Plasmide .pFJ215 und pFJ216 geht aus Fig. 6 der Zeichnung hervor.

3 e, i- s- p' i e Ϊ , 22 . ' ' . .' ' .' '

Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pFJ21 5 und . ' Streptomyces ambofaciens/pFJ216 .

^, Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in¹ Beir-

spiel 9 beschrieben durchgeführt, wobei man jedoch die" ; .. ?lasmid-pFJ215-DNA und die Plasmid-p,FJ216-DNA verwendet und' 'nicht die DNA . von Beispiel 8C. Die gewünschten T-ransf orman-,ten werden bezüglich ,einer Erythromycinresistenz selektiert, indem man die regenerierenden Protoplasten mit Spitzenagar

,auf Basis von R2-Medium überschichtet, der so viel Erythro- ·. · rnycin enthält, daß sich auf der Platte e'ine. Konzentration : './on 5Ό .jag/iril ergibt. 'Die- erhaltenen erythromycinresistenten

Kolonien von Streptomyces amböfaciens/pFJ215,und Streptomy-. 30_ ces ambofaciens/pFJ216 werden uhter Anwendung bekannter

Verfahren isoliert, gezüchtet und dann in·herkömmlicher . Weise durch Restriktionsenzymanalyse'und .Gelelektrophorese mit Agarose bezüglich; der ' enthaltenen Plasmide ider.tifi- . ziert. Die gewünschten-Transformahten werden dann in herkomm1 icher Weise zur anschließenden Produktion und Iso- . . lierung. der Plasmide pFJ2-.15. und pFJ216 gezüchtet. '

B e i s ρ i e 1 23

^: . Konstruktion der chimeren Plasmide pFj219 und pFJ220

Die gewünschten chimeren Plasmide erhält man durch Ver- knüpfung des' mit BamHI teilverdauten Plasmids pFJ170.(her-. ..;· gestellt gemäß Beispiel 19) mit dem mit BamHI verdauten , '.. Plasmid pBR322 (hergestellt gemäß Beispiel.6B) unter prak-., ' . tischer Anwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Ver-' -. 10 knüpf ungsverf ahrens . Die gewünschte chimere Plasmid-DNA

wird durch Zentrifugation gesammelt, mit 70 %-iijem Etha- _^ nol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und dann/in 50 μΐ ^Λ-' . TΕ-Puffer suspendiert. Man erhält rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen, da das' restriktierte Plasmid pBR322 in eine von zwei Richtungen orientiert sein kann. Ein Restriktdonsstellenplan-und Funktionsplan für jedes der Plasmide pFJ219 und pFJ220 geht aus.. Fig. 7 der Zeichnung hervor.

. 2 0 B e i s ρ i e 1 2 4 . ^s ' . .

_v Konstruktion von Escherichia coli K12 HBl01/pFJ219 und Escherichia coli, K12 HBl01/pFJ220 ;

{~;\ 25 Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in

Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, wobei man zur Transformation jedoch die Plasmid-DNA von Beispiel 23 anstelle' ' des Plasmids pLR2 verwendet. Die überlebenden Kolonien " -.' ..' werden, zuerst selektiert, dann bezüglich des erwarteten

ι ' R S '

Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht und schließlich durch . · . übliche^: Restriktionsenzymanalyse und Gelelektr'ophorese

mit Agarose (R.W. Davis et al-, 198Ό, A Manual For Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring . Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, V.St.A.) bezüglich-der vorhandenen Plasmide als die gewünschten ⁽ . Transformanten von Escherichia coli Kl2' H3l01/pFJ219 und ^: : '' . -_:/ Escherichia coli 'Kl 2 HBl01/pFJ220 identifiziert. , '

1 B e i s ρ ± e 1 25

Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pFJ2i9 und . - , Streptomyces. ambofaciens/pFJ220 ,

. ; '.·' . ' . ^; ' ^;~\ ^J ...

Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in ; . Beispiel 9 'beschrieben durchgeführt, wobei man.··, zur-Transformation jedoch die Plasmide pFJ219 und pFJ220_i verwendet , und. nicht die Plasmide pFJ204 und pFJ205.. Die erhaltenen -j Transformanten werden nach dem.in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren -bezüglich.einer Thiostreptonresistenz. selektiert. Die so konstruierten .thiostreptonresistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pFJl19 und Streptomyces ambofabiens/pFJ.220 werden nach bekannten Verfahren isoliert und dann lh.üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese mit Agarose bezüglich der ' ' ' ' /' . ^!. ' ''.. ' - -* "enthaltenen Plasmide -identifiziert. . .

.Beispiele für Plasmide .und Transformanten,. die sich in der oben beschrieben-en Weise konstruieren lassen, gehen aus'

der folgenden Tabelle' 1 hervor.

ω cn

ω ο

Tabelle 1

la; s nii-d e

Beispiel Nr.

26

27 28

29 30

31 32

33

Name des Plasmids

P FJ 2.21

pF J2 2 2 pFJ2 2 3

pFJ2 2 4 pFJ2 2 5

PFJ2 26 PFJ2 27

pFJ2 28

Ungefähre. . Größe in kb

8,8

8,8 .9 ,0

9,0 10,7

10,7 12,5

12,5

Konstruktion

Verknüpfung dos mit Bajmlll, teilverdauten pFJ205 mit dem etwa 3,4 kb Bamlll-Fragment von pLRl. Insertionsstel 1 e und Orientierung sind so, daß dio PvuTI-StelIe und die -terminal e SaJTt-Stelle der Fragmente für die Thiostreptonresisteir/ und die Neomycinresistenz benachbart sind.

Umgekehrte Orientierung von pFJ221..

Verknüpfung des mit Bamlll teil verdauten pFJ210 mit dem etwa 3,4 kb BamHI-Fragment von pLRl. Insertionsstelle und Orientierung sind so, daß die PvuII-Stelle und die terminale SaJ₁I-Stelle der Fragmente für die Thiostreptonresistenz und die Neomycinresistenz benachbart sind.

Umgekehrte Orientierung von pFJ22 3.

Verknüpfung des mit JBamHI teilverdauten pNMlOO mit dem etwa 1,6 kb EamHI-Fragment von pLR2. Die Orientierung des etwa 1,6 kb-Fragments. ist gleich wie im pFJ204, die Insertion befindet sich an der in Fig. 1 gezeigten Stelle A. '

Umgekehrte Orientierung von pFJ225.

Verknüpfung des mit BamHI teilverdauten pNMIOO mit dem etwa 3,4 kb BamHI-Fragment von pLRl. Die Orientierung .des etwa 3,4 kb Fragments ist gleich wie im pFJ206, und die Insertion befindet sich aix^der. in Fig. 1 gezeigten Stelle A.

Umgekehrte Orientierung von pFJ227. ·. ' '.

ω ο

to O

cn

Le_JL (Fortsetzung)

Beispiel Nr.

Name ~des Plasmids	Ungefähre Größe in kb	Ko n, struktion
pFJ2 29	14,1	Verknüpfung des mit BamHI teilverdauten pFJ225 mit dem etwa 3,4 kb BamHI-Fragment von pLRl . Insertionsstelle und Orien tierung sind so, daß die PvuII-Stelle und die terminale Sall-Stelle der Fragmente für die Thiostreptonresistenz und. die Neomycinresistenz benachbart sind.
pFJ2 30	14,1	Umgekehrte Orientierung von pFJ229.
pFJ2 31	14,1	Verknüpfung des mit BamHI.teilverdauten pFJ226 mit dem etwa 3,4 kb BamHI-Fragment von pLR4. Insertionsstelle und Orien tierung sind so, daß die PvuII-Stelle und die terminale Pstl-Stelle der Fragmente für die Thiostrepttmresistenz und die Neomycinresistenz benachbart sind.
pFJ232	14,1. ,	Umgekehrte Orientierung von pFJ2 31.
pFJ233	11,9	Verknüpfung von mit BamHI teilverdautem pNMIOO-mit dem etwa 2,8 kb SaJLI-Fragment (das mit BamHI-Linkern versehen ist) von pTJ43. Die Orientierung des etwa 2,8 kb Fragments ist gleich wie im pFJ21r>, und die insertion befindet .sich wie in Fi f|. 1 gezeigt an der Stelle Λ.
pFJ2 34	11,9	Umgekehrte Orientierung von pFJ233.
pFJ2 3 5 )	11,5	Verknüpfung des mit BamHI teilverdauten pFJ208 mit dem etwa 2,7 kb Sa1T-BgI Τι-Fragment (das mit BamlU -Linkern versehen ist) von pIJ43. Insertionsstelle und Orientierunci sind so, daß die termi.nalen PstT-Stellen der Fragmente für die Neo mycinresistenz und die Erythromycinresistenz benachbart sind
PFJ2 36	11,5	Umgekehrte Orientierung von pFJ235. . . ... .

ω οι

ωο

to O

cn

Bcisμιei

Nr.

Name des Fl a sin ids

pPJ2 17

pFJ-238 pPJ230

pFJ2 4 0 pFJ241

pFJ2 4 2 pFJ24 3

pFJ2 4 4 pFJ2 4 5

Ungefähre Größe in kb

7 ,0

7,0 9,7

9,7 10,2

10,2 1 2,0

12,0 11,5

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Ko ns t r u k tion

Verknüpfung des etwa 4 kb BamllT-Pragments (das mit Ui_ntj TIΓ Linkern versehen ist) von pFJ143 mit dem etwa 3 kb HjL. η dl 11-' Fragwent von pIJ4 3. In-scrtionsstell.o und Orientierung dos Resistenzfrnqments sind gleich wie im pFJ2-15.

Umgekehrte Orientierung von pFJ237.

Verknüpfung des mit Ba ml II teilverdauten pFJ204 mit dem etwa 4,3 kb BamHl-Fragment von pBR322. Insertionsstelle und Orientierung des Resistenzfragments sind gleich wie im pFJ219.

Umgekehrte Orientierung von pFJ239 _t

Verknüpfung des mit BarnHI teilverdauten pFJ205 mit dem etwa 4,8.kb BamHI-Fragment von pBR328. Insertionsstelle und Orientierung des Resistenzfragments sind gleich wie im pFJ219.

Umgekehrte Orientierung von pFJ241.

Verknüpfung des.mit Baml 11 teil verdauten pFJ206 mit dem etwa 4,0 kb Bamlll-FrcigmenL von pBU320. Die Insertionsstelle von pBU320 ist zur terini-nu Leii PtiJ-I-S tel Ie des Fragments für die Neomycinresistenz benachbart, und die Orientierung ist gleich wie im pFJ219.

Umgekehrte Orientierung von pFJ243.

Verknüpfung des mit BamHI teilverdauten pFJ207 und des etwa 4,3 kb BamHI-Fragments von pBR322. Die Insertionsstelle von pBR322 ist zur terminalen Sa_ll-Stelle des Fragments für die Neomycinresistenz benachbart, und die Orientierung ist gleich wie im pFJ219. / '

Ol

ω O

to O

υι

Tabelle 1 '(Fortsetzung)

Beispiel

Nr.

Namen des !Ungefähre Plasmids · Größe in kb

PFJ24 6 pFJ2 47

pFJ24 8

pFJ2 4 9

pFJ2 5Ü pFJ2 51

pFJ252 PFJ2 5 3

11,5 13,6

1 3,6 10,4

9,9 1 ] ,8

11,8 17,3

k t

Umgekehrte Orientierung von pFJ245. ^

Verknüpfung des mit BamHI teilverdauten pFJ208 mit dem etwa 4,8 kb BamHI-Fragment von pB'R328. Die Insertionsstel Ie von pBR328 ist zur terminalen Pstl-Stelle des Fragments für die Neomycinresistenz benachbart u,nd die Orientierung ist gleich wie im pFJ219.

Umgekehrte Orientierung von pFJ2 47.

Verknüpfung des mit BamHI teilverdauten pFJ170 mit dem etwa 4,8 kb BamHI-Fragment von pBR328. InsertionsstelIe und Orientierung des Resistenzfragments sind gleich wie im pFJ2^s19.

Umgekehrte Orientierung von pFJ249.

Verknüpfung des mit BamHI teilverdauten p'FJ237 mit dem etwa 4,8 kb HindTTT-Fragmont von pBR328. Die InsertionsstelIo befindet sich an der IlindTTT-Stel1e, die zur SmaT-Stellö von pFJV43 benachbart ist. Die Orientierung ist gleich wie im pFJ219.

Umgekehrte Orientierung von pFJ251. / ,

Verknüpfung von mit JBamHI teilverdautem pFJ233 mit dem etwa 5,4 kb BamHI-Fragment von pBR325. Die InsertionsstelIe von pBR325 befindet sich an der in Fig. 1 gezeigten Stelle A, und die Orientierung ist gleich wie im pFJ219.

ω ο

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Beispiel Nr.

59

60 61

62 63

Name des Plasmids

pNMlOl

PNM10 2 pNMl0 3

P.NM10 4 pFJ265

pFJ266

Ungefähre Größe in kb

10,1

10,1 4,6

4,6 9,2

9,2

Verknüpfung des mit BamHI teilverdauten pNMlOO mit dem etwa 0,8 kb Bcll-Subfragment des etwa 1,6 kb BamHI-Fragments von\ pLR2. Die Orientierung des BcII-Fragments ist gleich wie im pFJ2Ö4, und die Insertion befindet sich an der in Fig. 1 gezeigten Stelle A.

Umgekehrte Orientierung von pNMIOl. -

Verknüpfung des etwa 3,8 kb BajnHI-Fragments von pNMIOl mit dem etwa 0,8 kb Bclil-Sübfragment des etwa 1,6 kb BamHI-Fragments von pLR2. Die Orientierung des BeiI-Fragments ist gleich wie im pNMIOl,. -

Umgekehrte Orientierung von pNM103.

Verknüpfung des mit Pstl teilverdauten pLR4 mit dem mit Psti verdauten Plasmid pNMl03. Die Orientierung ist so, daß die EcoRI-Stelle des pLR4-Fragments entgegengesetzt (und nicht benachbart und somit nächstliegend) zum die Thiostreptonresistenz verleihenden Segment von pNM103 angeordnet ist.

Umgekehrte Orientierung von pFJ265.

Claims (22)

1. b) ein oder mehr DNA-Segmente, die eine Resistenz gegenüber 'wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn ~ ' sie in eine sensitive Wirtszelle . transformiert sind, wobei diese Wirtszeile' gegenüber einer Transformation, Zellteilung und Züchtung suszeptibei ist, miteinander verknüpft. ^!

   ¹^ 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das.Restriktionsfragment von pNMIOO das etwa 3,8 kb BamHI-Restriktionsfragment ist.

   3. ^c Verfahren ,nach Punkt 1, dadurch g e k e η η - · zeichnet, daß das. Restriktionsfragment von pNMIOO das etwa 4 kb BamHI-Restriktionsfragment des Pläsmids pFJ143 . ist. ' . ' ' '.. , ' ^l ' ^; · '
2. 4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch g- e k e η η -

   zeichnet, daß ein DNA-Segment eine Antibiotikumresistenz gegenüber Th"iostrepton verleiht.
3. 5. Verfahren nach Punkt 1 , ,dadurch gekennzeichnet, daß ein DNA-Segment eine Antibiptikumre-

   30 sisteriz gegenüber Neomycin-verleiht.

   . 6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch c e""k e η η zeichnet , daß ein DNA-Segment eise Antibiotikumresis'üenz gegenüber Erythromycin verleiht. . ' · ί . . ' . - . .\ ' ' 7. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet , daß das eine DNA-Segment das etwa 1,-6 kb

   BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLR2 ist. :

   ' /) ' . - '.. .'-. .

   ..... 8. Verfahren nach Punkt 5, dadurch gekennzeichnet ,daß. das eine DNA-Segment das etwa 3,4 kb BamHI-Res-riktionsfragment des Plasmids pLRl ist.
4. 9. Verfahren"nach Punkt 6, dadurch g e k e η η -

   ζ e i c h η e't , daß-das eine DNA-Segment das etwa 2,8 kb Sail-, das etwa 2,7 kb SaJLI-BgIII-, das etwa 3,0 kb Hindlll-, das etwa 2,5 kb Sall-BamHI-, das etwa 2,8 kb Xhol-Bglll- : oder das etwa 4,1.kb EcoRI-BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pI.J4 3 ist.
5. 10. Verfahren nach einem der Punkte 1,2, 4 oder 7 ,zur Herstellung der Plasmide pFJ204: und pFJ205, dadurch g e -

   '.kennzeichnet, daß man das etwa 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLR2 mit dem etwa 3,8 kb BamHI-Res.~riktionsf ragment des Plasmids pNMl 00 verknüpft.

   .20 11. Verfahren- nach einem der Punkt 1,2, 5 oder 8 zur Herstellung der Plasmide. p'FJ206. und pFJ207, dadurch ge ken η ze i c h η e t , daß man das. etwa 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLRl mit dem etwa 3,8 kb BämHI-Restriktionsfragment des Pia-smids pNMIOO verknüpft.

   12. Verfahren nach einem der Punkte 1, 5 oder 8 zur Her-¹

   • stellung der Plasmide pFJ208 und pFJ209, dadurch g e k eη η ζ e i c-h η e t ,daß man das etwa 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmide pLRl mit.dem BamHI-Teil-

   verdäuungsprodukt des Plasmids pFJ204 verknüpft.
6. 13. Verfahren nach einem der Punkte 1,. 3, 4 oder Ί zur Herstellung der Plasmide pFJ170 und pFJ210, dadurch g e kennzeichnet, daß man das etwa 4 kb BamHI-Verdauungsprodukt des Plasmids pFJ143 mit dem etwa 1,6 kb BamHI-Res-riktionsfragment des Plasmids pLR2 verknüpft.

   ' ^ 14. ' Verfahren nach einem der Punk-ts 1, 3, 5 oder 8 zur

   Herstellung der Plasmide pFJ21T:und pFJ212, dadurch ge-. .- .'." k en η ζ e I-; c h net ., daß, man¹ -das etwa 4 kb BamHI-Verdauungsprodukt des Plasmids pFJI43 mit dem etwa 3,4 .kb . ° BamHI.-Restriktions'f ragment des Plasmids pLRl verknüpf t.
7. 15. Verfahren nach einem der Punkte \1, 5,oder 8 zur ^s Herstellung der Plasmide pFJ213 und pFJ214, dadurbh g.e k e. η' η ζ ei c~ h η e t , daß man das mit BamHI verdaute Plasmid pFJ17Ö mit dem etwa 3,4. kb BamHI-Restriktio.nsfragment des Plasmids pLRl verknüpft. '. ' ' \. '

   16·. Verfahren nach einem der Punkte 1, 3 oder 9· zur, Herstellung der Plasmide pFJ21.5. und pFJ216, dadurch . ge - ' 15' k e η η. ζ e i. c h η e t , daß man das mit BamHI verdaute Plasmid pFJ143 mit einer,DNA-Sequenz verknüpft,die das ; etwa 2,5 kb Sg. II -BamHI -Restrikt ions fragment des'Plasmids pIJ43 ist, an das BamHI-Linker addiert sind.
8. 17. Verfahren nach Punkt l· zur Herstellung der Plasmide ^;^pFJ219 und pFJ220, dadurch ^g ek en η ζ eic h η et ., daß man das mit' BamHI verdaute Plasmid pF*J170 mit dem. mit BamHI verdauten Plasmid ,pBR322 verknüpft. ' ι ' . .
9. 18. '. .Verfahren nach einem der Punkte 1,5, 8 oder 10 zur Herstellung der Plasmide pFJ221 und pFJ222, dadurch g e k en η',ζ ei c h η e t V daß man das BamHI-Te ilver-dauungsprodukt.des Plasmids pFJ205 mit dem etwa 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment ^ldes Plas'mids pLRl verknüpft. ·-·

   .19. Verfahren nach einem der Punkte 1, 5, ,8 oder 13 zur Herstellung der PLasmid'e pFJ223 und pFJ224, dadurch gekennzeichnet, daß man das BamHI-Teilverdauungsprodukt.des Plasmids pFJ210 mit-dem etwa 3,4 kb BamHI-Re- . striktionsf5agme,nt des Plasmids pLRl 'verknüpf t.
10. 20. , Verfahren nach einem der Punkte 1, 4 oder 7 zur Herstellung der Plasmide pFJ2 2 5 oder pFJ226, dadurch ge -

    * ' ' ... ..':

    ^ k e η η ζ e i c h η e t ,,, daß man das iBamHI-Teilverdau- '

    ungsprodukt des Plasmids pNMlOO mit dem etwa .1,6 kb BamHI- Restriktionsfragment des Plasmids pLR2.verknüpft.

    . 21. Verfahren nach einem der Punkte .1, 5 oder 8 zur Herstellung der Plasmide pFJ227 und pFJ228, dadurch g,,.e kennzeichnet, daß man. das BamHI^Teilverdauungsprodukt des Plasmids pNMIÖO mit dem etwa 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLRl. verknüpft. , ;

    10 . , „ ' . . ,' ·' . ·
11. 22. · Verfahren nach einem der Punkte .1, 5, 8 oder 20 zur Herstellung der Plasmide pFJ229 und pFJ230, dadurch ge -₍ kenn z' e i c h η e t , daß man das BamHI-Teilverdauungsprodukt des Plasmids pFJ225 mit dem etwa 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLRl verknüpft.

    . 23. Verfahren nach einem der Punkte 1, 5, 8- oder 20 zur Herstellung^: der Pläsmide pFJ231 und pFJ232, dadurch; gekennzeichnet, daß man das BamHI-Teilverdau- .

    2Q ungsprodukt des Plasmids pFJ226 mit dem etwa 3,4-kb BamHL· .Restriktionsfragment des Plasmids pLR4 verknüpft.
12. 24. _v Verfahren nach einem der Punkte 1, 6 oder 9 zur Herstellung der Plasmide pFJ233 und pFJ234, dadurch ' g e --

    .25 k ,e η η ze i c h η e t , daß man das BamHI-Teilverdau-

    . .

    ungsprodukt des Plasmids pNMIOO mit .dem etwa 2,8 kb SaII-Restriktionsfragment des Plasmids pIJ43 verknüpft, an das "BamHI-Linker addiert sind.

    2,5. Verfahren nach einem der Punkte 1,6, 9 oder 12 zur Herstellung'der Plasmide pFJ235 und pFJ236, dadurch g e ken η ζ e i c' h η e t -, daß man das BamHI-Te ilverdauungsprodukt des Plasmids pFJ208 mit dem etwa 2,7 kb SaII-Bglll-Restriktionsfragment des Plasmids pIJ43 verknüpft,

    an das BamHI-(Linker, addiert sind. : . -
13. 26. Verfahren nach'einem der Punkte 1, 3, 6 oder 9 zur

    Herstellung der Plasmide pFJ237 und pFJ238, dadurch g e ken. η' ζ e. i c h η e t , daß man das etwa 4 kb 'BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pFJ143, an- das Hj.ndl11-Linker addiert sind,- mit.dem etwa 3 kb Hindi11-Restriktions-.

    ¹ fragment des Plasmids pIJ43 verknüpft. ,
14. 27. , Verfahren nach Punkt 1 oder 10 zur Herstellung der P.lasmide pFJ2 39 und pFJ2 40, dadurch g e k e η η -

    '. zeichnet, daß man .das BamHI-TeilVerdauungsprodukt des Plasmids pFJ204 mit dem etwa 4,3 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pBR322 verknüpft.
15. 28. Verfahren nach Punkt. 1 oder 10 zur Herstellung der Plasmide pFJ241 und pFJ242, dadurch g e k e' η η ζ e,i'C.h η e t , daß man das,BamHI-Teilverdauungsprodukt des-Plasmids pFJ205 mit dem etwa 4,8 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pBR328 verknüpft.
16. 29. Verfahren nach Punkt 1 oder.11 zur Herstellung der Plasmide pFJ243 und-pFJ244, dadurch g e k e' η η — zeichnet , daß man das BamHI-Teilverdauungsprodukt des Plasmids. pFJ206 mit dem etwa 4,8 kb B_amHI-Restriktionsfragment des Plasmids pBR328 verknüpft.

    • 3.0. ' Verfahren nach Punkt 1 oder 11 zur Herstellung der Plasmide pFJ245 und pFJ246, dadurch g e k e η η ze i ch η e t , daß man das BamHI-Teilverdauungsprodukt . des Plasmids pFJ207 mit dem etwa 4,3' kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pBR322 verknüpft. '.'.<"
17. 31. Verfahren nach Punkt 1 oder 12 zur Herstellung der Plasmide pFJ247 und pFJ2,48/ dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t , daß man das BamHI-Teilverdauungsprodukt des Plasmids^pFJ208 mit dem etwa 4,8 kb BamHI-Restriktions-

    ' ν. ' .

    fragment des Plasmids pBR328'verknüpft. {

    ; . .' '. . . ''')...' ' '
18. 32. Verfahren nach Punkt 1 oder 13 zur Herstellung der

    ' - 51 -; ' . .

    Plasmide pFJ249 und pFJ250, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man das BamHI-Teilverdauungsprodukt des Plasmids pFJ170 mit deni etwa 4,3 kb BamHI-Restriktiönsfragment des Plasmids pBR328 verknüpft. '

    '-.' ' ' · . ' .-.' . .
19. 33. Verfahren nach Punkt 1 oder 26 zur Herstellung der PLasmide pFJ-25'1 und pFJ252, dadurch g e k e η η ζ e i c h n,e t , daß man das BamHI-TeilVerdauungsprodukt des Plasmids pFJ237 mit dem etwa 4,8 kb HindllI-Restriktionsfragment des Plasmids pBR328 verknüpft.
20. 34. Verfahren nach Punkt 1 oder 26 zur Herstellung des Plasmids pFJ25 3, dadurch gekenn zeichnet., daß man das BamHI-TeilVerdauungsprodukt des' Plasmids pFJ233

    ¹^ mit dem etwa 5,4 kb B_amHI-Restriktionsfragment 'des Pias-'-mids pBR325 verknüpft. '
21. 35. Verfahren nach einem der Punkte 1, 4 oder 7 zur Herstellung der Plasmide pNMIOl und pNM102, dadurch g e -

    ^^kennzeichne t , daß man das BamHI-Teilverdauungsprodukt des Plasmids pNMIOO mit dem etya 0,8 kb BcII-Subf ragment des etwa 1,6 kb BamHI-Res triktionsfraqments des Plasmids pLR2 verknüpft.

    35^ verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung der Plasmide pNM10 3 und pNM104, dadurch geke.n. nzeichnet, daß man das Psti-Teilverdauungsprodukt des Plasmids pLR4 mit dem mit Pstl verdauten Plasmid pNM103 verknüpft. , .

    30 · , .

    ! .·'
22. 37. Verfahren nach Punkt 1 oder 36 zur.Herstellung der Plasmide pFJ265 und pFJ266, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t , daß man das Pstl-Teilverdauunqsprodukt des Plasmids pLR4 mit dem mit Pstl verdauten Plasmid pNM103 verknüpft.

    ,Hierzu 7- Seiten -Zeichnungen