JPS6181787A - 新規なプラスミドベクタ− - Google Patents
新規なプラスミドベクタ−Info
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- JPS6181787A JPS6181787A JP59201860A JP20186084A JPS6181787A JP S6181787 A JPS6181787 A JP S6181787A JP 59201860 A JP59201860 A JP 59201860A JP 20186084 A JP20186084 A JP 20186084A JP S6181787 A JPS6181787 A JP S6181787A
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- Japan
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- plasmid
- plasmid vector
- gene
- streptomyces
- scissored
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規なプラスミドベクターに関する。
近年遺伝子操作技術が開発され、大腸菌をはじめ種々の
、菌株が工業的あるいは遺伝生化学的研究のため利用さ
れている。
、菌株が工業的あるいは遺伝生化学的研究のため利用さ
れている。
放線菌、特にストレプトミセス層は現在知られている抗
生物質の約６０％を生産する工業的に極めて有用な微生
物である。これらのストレプトミセス層に遺伝子操作技
術を応用し、抗生物質の生産を増〃Ｄさせたり、新規な
抗生物質を生産させることが可能であると考えられる。
生物質の約６０％を生産する工業的に極めて有用な微生
物である。これらのストレプトミセス層に遺伝子操作技
術を応用し、抗生物質の生産を増〃Ｄさせたり、新規な
抗生物質を生産させることが可能であると考えられる。
そのためには、抗生物質生産菌内で安定に保持発現でき
るクローニングベクターが必要である。放線菌内で発現
するプラスミドは、今までに幾つか発見され遺伝子クロ
ーニング用ベクターとしての改良がなされている。〔例
えば、トンプソンｅシー・ジェイ、他、ジーン２０巻、
５１−６２頁、 １９８２ （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ。
るクローニングベクターが必要である。放線菌内で発現
するプラスミドは、今までに幾つか発見され遺伝子クロ
ーニング用ベクターとしての改良がなされている。〔例
えば、トンプソンｅシー・ジェイ、他、ジーン２０巻、
５１−６２頁、 １９８２ （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ。
Ｃ−Ｊ、 ｅｔ、 ａｌ、 Ｑｃｎｃ Ｖｏｉ ２０、
ｐｐ５１−６２．１９８２）、カソッΦイー他ジャーナ
ルオプゼネラルマイクロバイオロジ−１１２９巻２７０
３−２７１４頁１９８３年（Ｋａｔｚ、 Ｅ ｅｔ、
ａｌ−Ｊ、 Ｑｅｎｅ−ｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
Ｖｏｌ １２９− ｐｐ２７０３−２７１４ 。
ｐｐ５１−６２．１９８２）、カソッΦイー他ジャーナ
ルオプゼネラルマイクロバイオロジ−１１２９巻２７０
３−２７１４頁１９８３年（Ｋａｔｚ、 Ｅ ｅｔ、
ａｌ−Ｊ、 Ｑｅｎｅ−ｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
Ｖｏｌ １２９− ｐｐ２７０３−２７１４ 。
しかし、従来知られているプラスミドベクターは、その
ほとんどがもっばら抗生物質非生産株のストレプトミセ
ス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌ１ｖｉ
ｄａｎｓ ）を宿主としていたりごく少数の宿主でしか
発現しないなど、宿主領域が狭いという欠点を有する。
ほとんどがもっばら抗生物質非生産株のストレプトミセ
ス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌ１ｖｉ
ｄａｎｓ ）を宿主としていたりごく少数の宿主でしか
発現しないなど、宿主領域が狭いという欠点を有する。
Ｃ問題点解決のための手段〕
そこで本発明者らは上記欠点のない放線菌用プラスミド
ベクターを得るため種々検討した結果、ストレプトミセ
ス・カスタネオグロピスポラスＨＵＴ ６２０２ （Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔａｎｅ−ｏｇｌｏｂ
ｉｓｐｏｒｕｓ ＨＵＴ ６２０２広島大学工学部醗酵
工学科保存株）より得たプラスミドｐＨＹ６２０２のＢ
ａｍ１〜ＩＩ切断部位にチオストレプトン耐性遺伝子を
挿入したプラスミドを作製したところ、種々の広い範囲
の抗生物質生産放線菌に本プラスミドが発現することを
見い出した。さらにこのプラスミドを小型化したプラス
ミド及びこの放線菌プラスミドと大腸菌プラスミドとの
複合プラスミドを作製し、これらすべてのプラスミドが
広範囲の抗生物質生産放線菌に発現することを見い出し
、本発明を完成した。
ベクターを得るため種々検討した結果、ストレプトミセ
ス・カスタネオグロピスポラスＨＵＴ ６２０２ （Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔａｎｅ−ｏｇｌｏｂ
ｉｓｐｏｒｕｓ ＨＵＴ ６２０２広島大学工学部醗酵
工学科保存株）より得たプラスミドｐＨＹ６２０２のＢ
ａｍ１〜ＩＩ切断部位にチオストレプトン耐性遺伝子を
挿入したプラスミドを作製したところ、種々の広い範囲
の抗生物質生産放線菌に本プラスミドが発現することを
見い出した。さらにこのプラスミドを小型化したプラス
ミド及びこの放線菌プラスミドと大腸菌プラスミドとの
複合プラスミドを作製し、これらすべてのプラスミドが
広範囲の抗生物質生産放線菌に発現することを見い出し
、本発明を完成した。
即ち、本発明は、（ａｔストレグトミセス・カスタネオ
グロビスポラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔ
ａｎｅ−ｏｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ ） ＨＵＴ ６２
０２のプラスミドｐＨＹ６２０２のＢａｍ１−ＩＩ切断
部位にチオストレプトン耐性遺伝子を挿入した約５．６
メガダルトンのグラスミドベクター、（ｂｌ該プラスミ
ドベクターからＢＣ１１制限酵素により約０．５メガダ
ルトンの遺伝子を除去した。ＢＣＩＩ切断点を１ケ所有
する約５．１メガダルトンのプラスミドベクター、及び
（ｃｌ、上記（ａｌのプラスミドベクターのＸｈｏＩ切
断部位に、大腸菌プラスミドｐＢＲ，３２８をＳａｌ
Ｉ切断部位で切断した遺伝子を挿入（、た約８．８メガ
ダルトンのプラスミドベクターに関する。
グロビスポラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔ
ａｎｅ−ｏｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ ） ＨＵＴ ６２
０２のプラスミドｐＨＹ６２０２のＢａｍ１−ＩＩ切断
部位にチオストレプトン耐性遺伝子を挿入した約５．６
メガダルトンのグラスミドベクター、（ｂｌ該プラスミ
ドベクターからＢＣ１１制限酵素により約０．５メガダ
ルトンの遺伝子を除去した。ＢＣＩＩ切断点を１ケ所有
する約５．１メガダルトンのプラスミドベクター、及び
（ｃｌ、上記（ａｌのプラスミドベクターのＸｈｏＩ切
断部位に、大腸菌プラスミドｐＢＲ，３２８をＳａｌ
Ｉ切断部位で切断した遺伝子を挿入（、た約８．８メガ
ダルトンのプラスミドベクターに関する。
本発明の新規プラスミドとしてはｐＨＹ１２、ｐＨＹ
１３、ｐＨＹ １４及びｐｓＭ ３３２などがあげられ
る。
１３、ｐＨＹ １４及びｐｓＭ ３３２などがあげられ
る。
ｐＨＹ １２及びｐＩ−ＩＹ １３は前記（ａｔのプラ
スミドベクターの１ ｆ！ｉＩ！ｌであり、チオストレ
プトン耐性領域及びｐＨＹ ６２０２ 白米の複製開始
領域を有する。これらのプラスミドはプラスミドｐＩ−
ＩＹ ６２０２のＢａｍＨｉ切断部位にプラスミドｐＩ
Ｊ７０２から切り出されたチオストレプトン耐性を示す
２３Ｓリボリームメチラーゼ遺伝子をＴ４ ｖガーゼを
用いて挿入することにより製造したもので９両者はチオ
ストレプトン耐性の遺伝子が第１図、第２図のごとく逆
になったものであり、実質上は何ら差異がない。
スミドベクターの１ ｆ！ｉＩ！ｌであり、チオストレ
プトン耐性領域及びｐＨＹ ６２０２ 白米の複製開始
領域を有する。これらのプラスミドはプラスミドｐＩ−
ＩＹ ６２０２のＢａｍＨｉ切断部位にプラスミドｐＩ
Ｊ７０２から切り出されたチオストレプトン耐性を示す
２３Ｓリボリームメチラーゼ遺伝子をＴ４ ｖガーゼを
用いて挿入することにより製造したもので９両者はチオ
ストレプトン耐性の遺伝子が第１図、第２図のごとく逆
になったものであり、実質上は何ら差異がない。
ｐＩ（ｙ ｌ ４は前記（ｂｌのプラスミドベクターの
１例であり、ｐＨＹ１２にＢｃｌ ｉ制限酵素を作用さ
せてｐＨＹ １２から分子量約０．５ ｍｄの遺伝子部
分（第１図の２部分）を除去したもので、ｐＨＹ １２
と同様にチオストレプトン耐性領域及びｐＨＹ ６２０
２由米の複製開始領域を有する。
１例であり、ｐＨＹ１２にＢｃｌ ｉ制限酵素を作用さ
せてｐＨＹ １２から分子量約０．５ ｍｄの遺伝子部
分（第１図の２部分）を除去したもので、ｐＨＹ １２
と同様にチオストレプトン耐性領域及びｐＨＹ ６２０
２由米の複製開始領域を有する。
又、ｐｓＭ３３２は前記（ｃｌのプラスミドベクターの
１例である。このベクターはｐＨＹ １２のＸｈＯＩ切
断部位に、大腸菌ベクタープラスミドｐＢＲ３２８に５
ａｌＩ制限酵素を作用させて、線状化した遺伝子（複製
開始領域、アンピシリン耐性領域及びクロラムフェニコ
ール耐性領域を有する）を、Ｔ４ＤＮｈｖガーゼにより
挿入したもので、ｐｉ３２８由来の上記領域の他、チオ
ストレプトン耐性領域及びｐＨＹ６２０２由米の複製開
始領域を有する。
１例である。このベクターはｐＨＹ １２のＸｈＯＩ切
断部位に、大腸菌ベクタープラスミドｐＢＲ３２８に５
ａｌＩ制限酵素を作用させて、線状化した遺伝子（複製
開始領域、アンピシリン耐性領域及びクロラムフェニコ
ール耐性領域を有する）を、Ｔ４ＤＮｈｖガーゼにより
挿入したもので、ｐｉ３２８由来の上記領域の他、チオ
ストレプトン耐性領域及びｐＨＹ６２０２由米の複製開
始領域を有する。
これらのプラスミドの制限酵素地図を第１図〜第４図に
示した。図中、Ｔｈ１ｏｒはチオストレプトン耐性遺伝
子の、Ｃｍｒはクロラムフェ二：７− ＃ 耐性遺伝子
の、Ａｐｒはアンピシリン耐性遺伝子の存在部位を示し
たものである。
示した。図中、Ｔｈ１ｏｒはチオストレプトン耐性遺伝
子の、Ｃｍｒはクロラムフェ二：７− ＃ 耐性遺伝子
の、Ａｐｒはアンピシリン耐性遺伝子の存在部位を示し
たものである。
又、（）中の数字は各プラスミド中の制限酵素による切
断部位の位置関係を示したものである。これらのプラス
ミドのうち、 ｐＨＹ １２は微工研菌寄第７８５１号
として、又ｐＨＹ １３は微工研菌寄第７８５２号とし
てそれぞれ寄託されている。
断部位の位置関係を示したものである。これらのプラス
ミドのうち、 ｐＨＹ １２は微工研菌寄第７８５１号
として、又ｐＨＹ １３は微工研菌寄第７８５２号とし
てそれぞれ寄託されている。
次に本発明のプラスミドの特性を表１及び表２に示す。
表１
Ｔｈｉｏｒ チオストレプトン耐性
Ａｐｒ アンピシリン耐性
Ｃｍ’ クロラムフェニコール耐性分子量は、入フ
ァージＤＮＡの）ｌｉｎｄ、［消化物を対照とする電気
泳動法により求めた。
ァージＤＮＡの）ｌｉｎｄ、［消化物を対照とする電気
泳動法により求めた。
各制限酵素による切断数は、過剰の制限エンドヌクレア
ーゼの存在下に各々ｐＨＹ １２ 、 ｐＨＹｌ ３
、 ｐＩ−ＩＹ １４ 、 ｐ８Ｍ ３３２のプラスミ
ドを消化させて、１．０又は２．０％のいずれかのアガ
ロースゲル中で分離可能な断片の数から決定された。又
、コピー数の測定は抗生物質生産放線菌のストレプトミ
セスの対数増殖期後期の培養液から菌糸体を集め、溶菌
後温和なシェアリング（断片化）を行った。この試料を
１％アガロースゲルで電気泳動後写真撮影を行いそのネ
ガをデンシトメーターで測定することによって行った。
ーゼの存在下に各々ｐＨＹ １２ 、 ｐＨＹｌ ３
、 ｐＩ−ＩＹ １４ 、 ｐ８Ｍ ３３２のプラスミ
ドを消化させて、１．０又は２．０％のいずれかのアガ
ロースゲル中で分離可能な断片の数から決定された。又
、コピー数の測定は抗生物質生産放線菌のストレプトミ
セスの対数増殖期後期の培養液から菌糸体を集め、溶菌
後温和なシェアリング（断片化）を行った。この試料を
１％アガロースゲルで電気泳動後写真撮影を行いそのネ
ガをデンシトメーターで測定することによって行った。
本発明のプラスミドは例えば次のようにして製造される
。
。
まずプラスミドｐＨＹ６２０２をＢａｍＨＴ制限酵素で
切断し線状ＤＮＡとする。次いでこのプラスミドにチオ
ストレプトン耐性コードを有するＤＮＡを’Ｉ”４ＤＮ
ＡＩＪガーゼを用い常法によりリゲーションしてｐＨＹ
１２及びｐＨＹｌ３を作製した後。プロトプラスト化
法により放線菌を形質転換し、チオストレプトン耐性を
選択マーカーとして形質転換株を得、それからｐＨＹ
１２及びｐＨＹ １３を単離すればよい。
切断し線状ＤＮＡとする。次いでこのプラスミドにチオ
ストレプトン耐性コードを有するＤＮＡを’Ｉ”４ＤＮ
ＡＩＪガーゼを用い常法によりリゲーションしてｐＨＹ
１２及びｐＨＹｌ３を作製した後。プロトプラスト化
法により放線菌を形質転換し、チオストレプトン耐性を
選択マーカーとして形質転換株を得、それからｐＨＹ
１２及びｐＨＹ １３を単離すればよい。
ここでｐＨＹ ６２０２はストレプトミセス・カスタネ
オグロビスポラスＨＵＴ ６２０２ （Ｓｔｒｅ−ｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂｉｓｐｏｒｏ
ｕｓ ＨＵＴ ６２０２ ：広島大学工学部醗酵工学科
保存株）を適当な液体培地で培養し、培養液より菌糸体
を収穫し、そして菌糸体を溶菌させ、次いで密度勾配遠
心法により容易に得ることが出来る。
オグロビスポラスＨＵＴ ６２０２ （Ｓｔｒｅ−ｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂｉｓｐｏｒｏ
ｕｓ ＨＵＴ ６２０２ ：広島大学工学部醗酵工学科
保存株）を適当な液体培地で培養し、培養液より菌糸体
を収穫し、そして菌糸体を溶菌させ、次いで密度勾配遠
心法により容易に得ることが出来る。
又、チオストレプトン耐性コードを有するＤＮＡは例え
ばストレプトミセス・リビｐ−ｙス３１３１ （Ｓｔｒ
ｅｐｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ ３１３１ ）の
有するプラスミドｐＩＪ７０２をＢｃｌＩ制限酵素によ
り切断することにより得ることができる。
ばストレプトミセス・リビｐ−ｙス３１３１ （Ｓｔｒ
ｅｐｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ ３１３１ ）の
有するプラスミドｐＩＪ７０２をＢｃｌＩ制限酵素によ
り切断することにより得ることができる。
得られたプラスミドｐ）ｉＹ１２をＢｃｌ Ｉ制限酵素
で切断して２つのＤＮＡ断片とした後、大きい方の約５
．１ ｍｄのＤ Ｎ Ａ断片をＴ４ Ｄ Ｎ Ａリガー
ゼを用い常法によりリゲーシゴンするとプラスミドｐＨ
Ｙ１４が得られる。
で切断して２つのＤＮＡ断片とした後、大きい方の約５
．１ ｍｄのＤ Ｎ Ａ断片をＴ４ Ｄ Ｎ Ａリガー
ゼを用い常法によりリゲーシゴンするとプラスミドｐＨ
Ｙ１４が得られる。
又、プラスミドＩ）ＩＩＹ １２をＸｈｏｒ制限酵素で
、又、プラスミドｐＢＩ（、３２８をＳａｌ Ｔ制限酵
素でそれぞれ切断して線状ＤＮＡとした後１両者をＴ４
ＤＮＡＩＪガーゼで常法によりリゲーションすることに
よりプラスミドｐＲＭ ３３２が得られる。ここで使用
するプラスミドｐＢＲ３２８はイー・コリー−１１３１
０１（Ｅ、Ｃｏ１１Ｉ−ＩＢＩＯＩ）から単離される。
、又、プラスミドｐＢＩ（、３２８をＳａｌ Ｔ制限酵
素でそれぞれ切断して線状ＤＮＡとした後１両者をＴ４
ＤＮＡＩＪガーゼで常法によりリゲーションすることに
よりプラスミドｐＲＭ ３３２が得られる。ここで使用
するプラスミドｐＢＲ３２８はイー・コリー−１１３１
０１（Ｅ、Ｃｏ１１Ｉ−ＩＢＩＯＩ）から単離される。
以上の方法により得られた各種プラスミドがｐＨＹ ６
２０２由米の複製開始領域を有すること、及びｐｓＭ３
３２には、さらにｐＢＲ３２８由米の複製開始領域を有
することは、本発明のプラスミドを有する放線菌にはチ
オストレプトン耐性が付与され、又、Ｉ）８Ｍ３３２を
有する大腸菌にはアンビンリン耐性が付与され、いずれ
も本発明のプラスミドの性質が発現していること（後記
実症例及び効果の欄参照）かられかる。
２０２由米の複製開始領域を有すること、及びｐｓＭ３
３２には、さらにｐＢＲ３２８由米の複製開始領域を有
することは、本発明のプラスミドを有する放線菌にはチ
オストレプトン耐性が付与され、又、Ｉ）８Ｍ３３２を
有する大腸菌にはアンビンリン耐性が付与され、いずれ
も本発明のプラスミドの性質が発現していること（後記
実症例及び効果の欄参照）かられかる。
次に本発明のプラスミドの製法を実施例により説明する
。なお、本実症例では全酒造（作製の制限酵素を利用し
た。
。なお、本実症例では全酒造（作製の制限酵素を利用し
た。
実施例１． ｐＩ−ＩＹ １２及びｐｉ−ＩＹ １３
の製造法（１１原料プラスミドｐＨＹ ６２０２の線状
化プラスミドｐＨＹ６２０２ＤＮＡは、ＴＥ緩衝液（０
，０１Ｍトリス１１ＨＣＬ、 ０．００１ Ｍ ＥＤ
ＴＡ−Ｎａｚ。
の製造法（１１原料プラスミドｐＨＹ ６２０２の線状
化プラスミドｐＨＹ６２０２ＤＮＡは、ＴＥ緩衝液（０
，０１Ｍトリス１１ＨＣＬ、 ０．００１ Ｍ ＥＤ
ＴＡ−Ｎａｚ。
ｐＨ８，５）中のＤＮＡ（〜１０μｇ）溶液〜４５μｌ
を１０×制限緩衝液５μ【及びＢａｍＦ１１酵素調製剤
１５単位と混合することによって、ＢａｍＨＩ制限酵素
で消化される。この混合物を３７℃で１時間反応する。
を１０×制限緩衝液５μ【及びＢａｍＦ１１酵素調製剤
１５単位と混合することによって、ＢａｍＨＩ制限酵素
で消化される。この混合物を３７℃で１時間反応する。
次に等容量のフェノール（ＴＥ緩衝液で飽和）を加え、
酵素反応を停止させる。
酵素反応を停止させる。
次に、１２，０００ＸｇＳ分間の遠心分離を行（・、上
澄液をピペットで注意深く回収する。ＴＥ緩衝液で二回
目のフェノール抽出を行う。二つの上澄液を一緒に取っ
ておき、エーテルによりフェノールを除去した後−２０
℃で酢酸ナトリウムｏ、を容ｉｔと９５％エタノール２
容量の添加によってエタノール沈殿させる。ＤＮＡ沈殿
物を４℃、１２．ＯＯＯＸｇで１０分の遠心分離によっ
て集める。沈殿物をＴｒｉｌｉ緩衝液１７μｌ甲に再溶
解する。この試料をリゲーション（連結）に用いろ。
澄液をピペットで注意深く回収する。ＴＥ緩衝液で二回
目のフェノール抽出を行う。二つの上澄液を一緒に取っ
ておき、エーテルによりフェノールを除去した後−２０
℃で酢酸ナトリウムｏ、を容ｉｔと９５％エタノール２
容量の添加によってエタノール沈殿させる。ＤＮＡ沈殿
物を４℃、１２．ＯＯＯＸｇで１０分の遠心分離によっ
て集める。沈殿物をＴｒｉｌｉ緩衝液１７μｌ甲に再溶
解する。この試料をリゲーション（連結）に用いろ。
（２） プラスミドｐＩＪ ７０２よりチオストレプ
トン耐性コードを有するＤＮＡの取得 ＴＥ緩衝液中のｐＩＪ ７０２ ＤＮＡ （〜１５μｇ
）溶液４５μｍと１０ＸＢｃｉＪ制限緩衝液５μｍとＢ
ｃｌＩ制限酵素７５単位を含有する反応混合物中でプラ
スミドｐＩＪ７０２をＢｃｌ Ｊ 消化にかける。この
混合物を５０°Ｃで１時間反応する。次に消化物を臭化
エチジウム（０，５μｇ／ｒｎｌ）を含む１％アガロー
スゲルにかけ１５０■で電気泳動させた。
トン耐性コードを有するＤＮＡの取得 ＴＥ緩衝液中のｐＩＪ ７０２ ＤＮＡ （〜１５μｇ
）溶液４５μｍと１０ＸＢｃｉＪ制限緩衝液５μｍとＢ
ｃｌＩ制限酵素７５単位を含有する反応混合物中でプラ
スミドｐＩＪ７０２をＢｃｌ Ｊ 消化にかける。この
混合物を５０°Ｃで１時間反応する。次に消化物を臭化
エチジウム（０，５μｇ／ｒｎｌ）を含む１％アガロー
スゲルにかけ１５０■で電気泳動させた。
長波長紫外線照明によって４つのＤＮＡ断片が確認され
る。約０．７ ｍｄのチオストレプトン抵抗性のコード
をもつＤＮＡ断片をＤＥＡＥメンブレンフィルターに吸
着させてとり出し、次に溶出予力 衝液 （２０ｍＭ
ト リ ス −ＨＣＩ、 １ ｍＭＥＤＴＡ −
Ｎａｚ。
る。約０．７ ｍｄのチオストレプトン抵抗性のコード
をもつＤＮＡ断片をＤＥＡＥメンブレンフィルターに吸
着させてとり出し、次に溶出予力 衝液 （２０ｍＭ
ト リ ス −ＨＣＩ、 １ ｍＭＥＤＴＡ −
Ｎａｚ。
１、’５ ＭＮａＣＩ、 ｐＨ７，５） ４００ μｌ
でＤＮＡを溶出させる。前浴出液を一２０℃で９５％エ
タノール２倍容量の添刀日によってエタノール沈殿させ
る。
でＤＮＡを溶出させる。前浴出液を一２０℃で９５％エ
タノール２倍容量の添刀日によってエタノール沈殿させ
る。
ＤＮＡ沈殿物を４℃、１２．ＯＯＯＸｇ、１０分の遠心
分離によって集める。沈殿物をＴＥ緩衝液１４μｍに再
溶解する。
分離によって集める。沈殿物をＴＥ緩衝液１４μｍに再
溶解する。
（３１ｐＨＹ １２及びｐＨ’Ｙ １３の作製上記（１
）で得られたｐＨＹ ６２０２の線状化ＤＮＡ溶液１７
μム及び上記（２１で得られたチオストレプトン耐性コ
ードを有するＤＮＡ溶ｉ１４μＩ及び１０ ｘ ＴｒＤ
Ｎ Ａリガーゼ用緩衝液（６６０ｍＭ トリス−ＨＣ
Ｉ、 ６６ｍＭＮｇＣ１２，ｐＨ７，６） ５ μｍ、
、１００ｍＭＤＴＴ ５ μｌ、 １０ ｍＭＡＴＰ
５ μｌを一緒にする。
）で得られたｐＨＹ ６２０２の線状化ＤＮＡ溶液１７
μム及び上記（２１で得られたチオストレプトン耐性コ
ードを有するＤＮＡ溶ｉ１４μＩ及び１０ ｘ ＴｒＤ
Ｎ Ａリガーゼ用緩衝液（６６０ｍＭ トリス−ＨＣ
Ｉ、 ６６ｍＭＮｇＣ１２，ｐＨ７，６） ５ μｍ、
、１００ｍＭＤＴＴ ５ μｌ、 １０ ｍＭＡＴＰ
５ μｌを一緒にする。
最後にＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ１．０単位を加え、反応液
を１５℃、１〜２日間保持し、以後の形質転換に用いる
リゲーション混合液とする。
を１５℃、１〜２日間保持し、以後の形質転換に用いる
リゲーション混合液とする。
（４１ｐＨＹ １２及びｐＨＹ１３の単離ストレプトミ
セス・グリセウス（Ｓｔｒｃｐｔｏｍｙｃｃｓｇｒｉｓ
ｃｕｓ ） Ｉ−ＪＵＴ ６０３７ （広島大学工学部
醗酵工学科保存株）を表３の成分からなる培地中で２８
℃、３０時間生育させろ。
セス・グリセウス（Ｓｔｒｃｐｔｏｍｙｃｃｓｇｒｉｓ
ｃｕｓ ） Ｉ−ＪＵＴ ６０３７ （広島大学工学部
醗酵工学科保存株）を表３の成分からなる培地中で２８
℃、３０時間生育させろ。
ブドウ糖 １ ％
酵母エキス ０．２
ペプトン ０．４ ％
牛肉エキス ０．２
Ｎａ ＣＩ ０１５
Ｍｇ Ｓ ０４・７Ｈ２００，０２５
グリシン ０．５
ｐＨ７，０
次いでその菌株をプロドプラ・スト化した後、（３）で
得られたリゲーショ／混合液を添加してｐＩ−ＩＹ １
２あるｔ・はｐｉ（Ｙ １３を保持する形質転換株を得
た。
得られたリゲーショ／混合液を添加してｐＩ−ＩＹ １
２あるｔ・はｐｉ（Ｙ １３を保持する形質転換株を得
た。
形質転換及び再住方法はトンプソン等の方法によった〔
トンプソン他、ジャーナルオプバクテリオロジー（Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎ、 Ｃ，Ｊ、 ｅｔ、 ａｌ、 ＪｊＢａ
ｃｔｅｒｉＯｌ）１５１巻、６６８−６７７ ページ、
１９８２年〕即ち、形質転換後のプロトプラストは、Ｒ
２ＹＥ再生培地（Ｒ２培地に酵母エキス０．５％添加し
たもの）に扁平培養する。２８℃で２４時間培養後、チ
オストレプトンを含む０．４％１）ｉｆｃ。
トンプソン他、ジャーナルオプバクテリオロジー（Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎ、 Ｃ，Ｊ、 ｅｔ、 ａｌ、 ＪｊＢａ
ｃｔｅｒｉＯｌ）１５１巻、６６８−６７７ ページ、
１９８２年〕即ち、形質転換後のプロトプラストは、Ｒ
２ＹＥ再生培地（Ｒ２培地に酵母エキス０．５％添加し
たもの）に扁平培養する。２８℃で２４時間培養後、チ
オストレプトンを含む０．４％１）ｉｆｃ。
ＮＡ、Ｊｇａｒ培地２．５ｍｌを重層し、さらに２８℃
で培養を続ける。生育したコロニーから菌をとり、表３
の組成の培地で培養し、集菌、洗浄する。
で培養を続ける。生育したコロニーから菌をとり、表３
の組成の培地で培養し、集菌、洗浄する。
洗浄した菌体はリゾチーム（１ｍ９／ｍｅ）で処理され
た後、２５％ＳＤＳにより溶菌される。次いで、０．３
６ Ｎ ＮａＯＨでアルカリ処理した後。
た後、２５％ＳＤＳにより溶菌される。次いで、０．３
６ Ｎ ＮａＯＨでアルカリ処理した後。
フェノールにより除タンパクし、その後エタノールを用
いてＤＮＡを沈澱させる。得られた沈澱をＴＥ緩衝液（
Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ−ＥＤＴＡ緩衝液）に溶解し、それ
にエチジウムブロマイドと塩化セシウムを加え、密度勾
配遠心法によりプラスミドを単離した。単離したプラス
ミドＤＮＡに制限エンドヌクレアーゼを作用させて得ら
れたＤＮＡ断片を調食した結果、ｐｉ−ＩＹ １２とｐ
ｌ−ＩＹ １３が別のコロニーから確認された。
いてＤＮＡを沈澱させる。得られた沈澱をＴＥ緩衝液（
Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ−ＥＤＴＡ緩衝液）に溶解し、それ
にエチジウムブロマイドと塩化セシウムを加え、密度勾
配遠心法によりプラスミドを単離した。単離したプラス
ミドＤＮＡに制限エンドヌクレアーゼを作用させて得ら
れたＤＮＡ断片を調食した結果、ｐｉ−ＩＹ １２とｐ
ｌ−ＩＹ １３が別のコロニーから確認された。
なお、本実施例における原料プラスミドであるｐ）ＩＹ
６２０２及びｐＩＪ７０２はそれを保有する菌株より、
オオムラ等の方法により単離した〔オオムラ・Ｓ他、ジ
ャーナルオプアンチビオチクス（Ｑｍｕｒａ、 Ｓ、
ｅｔ、 ａｌ、 Ｊ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ） ３４
巻、４７８−４８２ページ、１９８１年〕 ｐＩＪ ７０２はストレプトミセス・リビダンス３１３
１ （ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌ１ｖｉｄａｎｓ
３１３１ ）の保有するプラスミドである〔カツツ・イ
ー他、ジャーナルオプジーンマイクロバイオロジー（Ｋ
ａｔｚ。
６２０２及びｐＩＪ７０２はそれを保有する菌株より、
オオムラ等の方法により単離した〔オオムラ・Ｓ他、ジ
ャーナルオプアンチビオチクス（Ｑｍｕｒａ、 Ｓ、
ｅｔ、 ａｌ、 Ｊ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ） ３４
巻、４７８−４８２ページ、１９８１年〕 ｐＩＪ ７０２はストレプトミセス・リビダンス３１３
１ （ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌ１ｖｉｄａｎｓ
３１３１ ）の保有するプラスミドである〔カツツ・イ
ー他、ジャーナルオプジーンマイクロバイオロジー（Ｋ
ａｔｚ。
Ｅ、 ｅｔ、 ａｌ、 Ｊ、 Ｑｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ） １２９巻、２７０３−２７１４ページ、１９８
３年〕。
ｏｌ） １２９巻、２７０３−２７１４ページ、１９８
３年〕。
実施例２． ｐＨＹ １４の製造方法上記実施例１の
方法で製造単離されたプラスミドｐｈｙ １２ を制限
エンドヌクレアーゼＢｃｌ Ｉ での消化により２つに
断片化する。大きいほうの約５．１メガダルトンのＤＮ
Ａ断片を実砲例１（２）に述べた方法でアガロースゲル
から単離する。この約５．１メガダルトンの線型ＤＮＡ
は上記の実施例１（３）のとおりにＴ４ＤＮＡＩＪガー
ゼで連結し、次いで実姉例１（４）の方法によりストレ
プトミセス・グリウ セ索スＨＵＴ ６０３７のプロトプラストに導入し、再
生し、単離した。その結果ｐＨＹ１２の欠失プラスミド
ｐＨＹ１４が得られた。
方法で製造単離されたプラスミドｐｈｙ １２ を制限
エンドヌクレアーゼＢｃｌ Ｉ での消化により２つに
断片化する。大きいほうの約５．１メガダルトンのＤＮ
Ａ断片を実砲例１（２）に述べた方法でアガロースゲル
から単離する。この約５．１メガダルトンの線型ＤＮＡ
は上記の実施例１（３）のとおりにＴ４ＤＮＡＩＪガー
ゼで連結し、次いで実姉例１（４）の方法によりストレ
プトミセス・グリウ セ索スＨＵＴ ６０３７のプロトプラストに導入し、再
生し、単離した。その結果ｐＨＹ１２の欠失プラスミド
ｐＨＹ１４が得られた。
実姉例３゜
（１） プラスミドｐＳＭ３３２の作成７” ラスミ
ドｐＨＹ１２ 、！：、 ｐＢＲ３２８（ヘ−ＩＪ ン
ガー社製）をそれぞれ制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ
■及びＳａｌ ７での消化によって線状にする。
ドｐＨＹ１２ 、！：、 ｐＢＲ３２８（ヘ−ＩＪ ン
ガー社製）をそれぞれ制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ
■及びＳａｌ ７での消化によって線状にする。
即ち、プラスミドｐＨ１２ＤＮＡはＴＥ緩衝液中のＤＮ
Ａ （〜１μｇ）溶液〜４５μｍを１０×制限緩衝液５
μ！及びＸｈｏ Ｔ酵素調製剤６単位と混合することに
よってＸｈｏ Ｔ制限酵素で消化されろ。
Ａ （〜１μｇ）溶液〜４５μｍを１０×制限緩衝液５
μ！及びＸｈｏ Ｔ酵素調製剤６単位と混合することに
よってＸｈｏ Ｔ制限酵素で消化されろ。
この混合物を３７℃で１時間反応する。
一方、プラスミドｐＢＲ３２８ＤＮＡは、ＴＥ緩衝液中
のＤＮＡ（〜０，５μｇ）ｉｌ＃液〜ノｌ ５ ＩＩＩ
と１０×制限緩衝液５μ■とＳａｌ Ｔ酵素６単位を含
有する反応混合物中で、プラスミドｐｎｒｔ ：＋ ２
８をＳ；＋Ｉ Ｊ消化にかける。この混合物を３７℃で
１時間反応する。
のＤＮＡ（〜０，５μｇ）ｉｌ＃液〜ノｌ ５ ＩＩＩ
と１０×制限緩衝液５μ■とＳａｌ Ｔ酵素６単位を含
有する反応混合物中で、プラスミドｐｎｒｔ ：＋ ２
８をＳ；＋Ｉ Ｊ消化にかける。この混合物を３７℃で
１時間反応する。
ｐＨＹ１２ ＸｈｏＪ消化物とｐＢ几３２８ＳａｌＪ
消化物は実施例１（１１に示したようにフェノール処理
を行った後、エタノール沈澱される。このようにして得
られたｐＨＹ１２の線状物とｐＢＲ３２８の線状物を実
施例１（３）に示したようにＴ４ＤＮＡＩＪガーゼによ
りリゲーションし、次の工程に用いるリゲーション混合
液を得た。
消化物は実施例１（１１に示したようにフェノール処理
を行った後、エタノール沈澱される。このようにして得
られたｐＨＹ１２の線状物とｐＢＲ３２８の線状物を実
施例１（３）に示したようにＴ４ＤＮＡＩＪガーゼによ
りリゲーションし、次の工程に用いるリゲーション混合
液を得た。
（２） プラスミドｐｓＭ３３２の単離イー・コリ（
Ｅ、 ｃｏｌｉ） Ｉ−ＩＢ １０１ （コールドスフ
ＩＪ ７ クハ−バー （ｃｏｌｄ Ｊｍｇ Ｈａｒｂ
ｅｒ ）研究新製〕を２０ｍ１のＳ ＯｍＭ Ｃａ Ｃ
１２水＃液に０℃で２０分間懸濁してＣａＣｌ２処理を
おこなった後集菌し再度ＣａＣ１ｚ処理をおこなりた菌
含有液２００μｌに水浴上で上記リゲーション混合液１
００μｌと０、１ Ｍ ）リス・塩酸（ｐＨ７，２）２
００μｍを加えた後、１０分間静置し、次に３７℃の水
浴上で２分間静置した後ＩＩｎＩ！のＩ、Ｂ培地（１％
ディフコトリプトファン、０．５％ディフコ酵母エキス
０．５％ＮａＣ１）をＷえ３７℃で２０分間培養する。
Ｅ、 ｃｏｌｉ） Ｉ−ＩＢ １０１ （コールドスフ
ＩＪ ７ クハ−バー （ｃｏｌｄ Ｊｍｇ Ｈａｒｂ
ｅｒ ）研究新製〕を２０ｍ１のＳ ＯｍＭ Ｃａ Ｃ
１２水＃液に０℃で２０分間懸濁してＣａＣｌ２処理を
おこなった後集菌し再度ＣａＣ１ｚ処理をおこなりた菌
含有液２００μｌに水浴上で上記リゲーション混合液１
００μｌと０、１ Ｍ ）リス・塩酸（ｐＨ７，２）２
００μｍを加えた後、１０分間静置し、次に３７℃の水
浴上で２分間静置した後ＩＩｎＩ！のＩ、Ｂ培地（１％
ディフコトリプトファン、０．５％ディフコ酵母エキス
０．５％ＮａＣ１）をＷえ３７℃で２０分間培養する。
次いでこの培養液０．１ ｍｌをアンピシリン５０μｇ
／ｍｅを含むＬＢ寒天培地に接種し、３７℃で培養する
とコロニーが発生する。
／ｍｅを含むＬＢ寒天培地に接種し、３７℃で培養する
とコロニーが発生する。
発生したコロニーから菌を採取し、アンピシリン５０μ
ｇ／ｒｎ１３を含むＬＢ培地で一晩培養した後、その培
養液から菌体を遠心分離し、溶液■（５０ｍＭグルコー
ス、１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ Ｎａ、 ２５
ｍＭ）リス塩酸緩衝液、ｐＨ８，０）で遠心洗浄後、再
び溶液ｌ８ｒｎｌＫ懸濁する。次に２０■のリゾチーム
を含む２ ｍｌの溶ｉｆを加え水浴にて３０分間静置す
る。次に２０ｎＬｅの溶液ｆｌ （０，２Ｎ ＮａＯ
Ｈ，１％５ＤＳ）を塀え５分間静置後１５ｍＡ！の溶液
ＩＩＴ（３Ｍ酢酸す） ＩＪウム。
ｇ／ｒｎ１３を含むＬＢ培地で一晩培養した後、その培
養液から菌体を遠心分離し、溶液■（５０ｍＭグルコー
ス、１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ Ｎａ、 ２５
ｍＭ）リス塩酸緩衝液、ｐＨ８，０）で遠心洗浄後、再
び溶液ｌ８ｒｎｌＫ懸濁する。次に２０■のリゾチーム
を含む２ ｍｌの溶ｉｆを加え水浴にて３０分間静置す
る。次に２０ｎＬｅの溶液ｆｌ （０，２Ｎ ＮａＯ
Ｈ，１％５ＤＳ）を塀え５分間静置後１５ｍＡ！の溶液
ＩＩＴ（３Ｍ酢酸す） ＩＪウム。
ｐＨ４，８）加え水浴で６０分間静置する。次いで０℃
で１５分間遠心し、得られた上清液に２倍量のエタノー
ルを加え、−２０℃で３０分静置後、遠心によりＤＮＡ
沈殿を得る。得られた沈澱を適当量のＴＢ緩衝液（’ｌ
’ｒｉｓ−ＨＣ１５０ｍＭ 。
で１５分間遠心し、得られた上清液に２倍量のエタノー
ルを加え、−２０℃で３０分静置後、遠心によりＤＮＡ
沈殿を得る。得られた沈澱を適当量のＴＢ緩衝液（’ｌ
’ｒｉｓ−ＨＣ１５０ｍＭ 。
ＥＤＴＡ−Ｎａ ２．１０ ｍＭ、 ｐＨ８，０）に溶
解後、エチジウムプロミド−塩化セシウム密度勾配遠心
法によりプラスミドｐｓＭ３３２を単離した。
解後、エチジウムプロミド−塩化セシウム密度勾配遠心
法によりプラスミドｐｓＭ３３２を単離した。
上記方法で作成された９８）（３３２は、ストレプトミ
セス・グリセウスＨＵＴ ６０３７のプロトプラストに
形質転換される。形質転換体は宿主にチオストレグトン
抵抗性を与える。
セス・グリセウスＨＵＴ ６０３７のプロトプラストに
形質転換される。形質転換体は宿主にチオストレグトン
抵抗性を与える。
本発明のプラスミドは表３に示す如く広い範囲の抗生物
質生産菌を形質転換できろ。
質生産菌を形質転換できろ。
（至）形質転換はプラスミド５μｇを用い実施例１に示
したトンプリン等の方法によりおこなった。表中の結果
は、チオストレプトン５０μｇ／ ｍｌの培地に出限し
たコロニー数を示したものである。なお、出現したコロ
ニー中の菌より得られたプラスミドを電気泳動法により
調べた結果、本発明のプラスミドの泳動位置と同じ位置
にバンドが確認された。又、形質転換前の菌株はチオス
トレプトン５μｇ／解を含む培地では生育しなかツＩＳ
。
したトンプリン等の方法によりおこなった。表中の結果
は、チオストレプトン５０μｇ／ ｍｌの培地に出限し
たコロニー数を示したものである。なお、出現したコロ
ニー中の菌より得られたプラスミドを電気泳動法により
調べた結果、本発明のプラスミドの泳動位置と同じ位置
にバンドが確認された。又、形質転換前の菌株はチオス
トレプトン５μｇ／解を含む培地では生育しなかツＩＳ
。
表４から明らかなように本発明のプラスミドは広い範囲
の抗生物質生産菌を形質転換できるので、これら工業的
に重要な抗生物質の生産を増大させたり、又新規抗生物
質を作り出すためのベクターとして非常に有利である。
の抗生物質生産菌を形質転換できるので、これら工業的
に重要な抗生物質の生産を増大させたり、又新規抗生物
質を作り出すためのベクターとして非常に有利である。
そして［）ＨＹ１２、ｐＨＹ１３は選択マーカーとして
チオストレプトン遺伝子を保有しているので、これらプ
ラスミドが宿主内に存在していることを容易に調べるこ
とが出来る点で有利である。
チオストレプトン遺伝子を保有しているので、これらプ
ラスミドが宿主内に存在していることを容易に調べるこ
とが出来る点で有利である。
又、その分子量は５．６メガダルトンと小さく第１図、
第２図からも明らかなようにＢｇｌ［。
第２図からも明らかなようにＢｇｌ［。
Ｘｈｏ Ｔ 、 Ｃ１ａ １などの制限酵素によ（よる
開裂部位を特定のしかも限られた位置に有しているため
ベクターとして利用する際に、挿入すべき異種遺伝子の
導入部位を有意に保持出来るとい５点で有利である。
開裂部位を特定のしかも限られた位置に有しているため
ベクターとして利用する際に、挿入すべき異種遺伝子の
導入部位を有意に保持出来るとい５点で有利である。
プラスミドｐＨＹ１４もｐＨＹ １２ 、 ｐＨＹ １
３と同様な有利な点をもつとともにｐ）ＩＹ１２の遺伝
子の余分な部分を取り除き小型化したので、ベクターと
し利用する際より大きな異種遺伝子の挿入を可能とした
点でより有利であり、又、制限酵素による開裂部位が特
定のしかも限られた位置をもつ制限酵素は、Ｂｇｌ Ｉ
Ｉ、 Ｘｈ。
３と同様な有利な点をもつとともにｐ）ＩＹ１２の遺伝
子の余分な部分を取り除き小型化したので、ベクターと
し利用する際より大きな異種遺伝子の挿入を可能とした
点でより有利であり、又、制限酵素による開裂部位が特
定のしかも限られた位置をもつ制限酵素は、Ｂｇｌ Ｉ
Ｉ、 Ｘｈ。
１、Ｃ１ａＪ に茄えＢＣＩＴでも特定出来る点で更に
有利である。
有利である。
プラスミドｐｓＭ３３２は放線菌のプラスミドと大腸菌
のプラスミドを結合させたものなので、放線菌と大腸菌
の双方を形質転換できるとい５特徴をもち、放線菌には
チオストレプトン耐性を与え、大腸菌にはアンピシリン
耐性及びクロラムフェニコール耐性を与える。
のプラスミドを結合させたものなので、放線菌と大腸菌
の双方を形質転換できるとい５特徴をもち、放線菌には
チオストレプトン耐性を与え、大腸菌にはアンピシリン
耐性及びクロラムフェニコール耐性を与える。
【図面の簡単な説明】
第１図へ第４図は本発明のプラスミドの制限酵素地図で
ある。 第１図：ｐ）ＩＹ１２ 第２図：ｐ）（Ｙ１３ 第３図：ｐＨＹ１４ 第４図 ：９８Ｍ３３２ 第５図は原料プラスミドであるｐＨＹ６２０２の制限酵
素地図である。
ある。 第１図：ｐ）ＩＹ１２ 第２図：ｐ）（Ｙ１３ 第３図：ｐＨＹ１４ 第４図 ：９８Ｍ３３２ 第５図は原料プラスミドであるｐＨＹ６２０２の制限酵
素地図である。
Claims (3)
- （１）ストレプトミセス・カスタネオグロビスポラス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂ
ｉｓｐｏｒｕｓ）ＨＵＴ６２０２のプラスミドｐＨＹ６
２０２のＢａｍＨ I 切断部位にチオストレプトン耐性
遺伝子を挿入した約５．６メガダルトンのプラスミドベ
クター。 - （２）ストレプトミセス・カスタネオグロビスポラス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂ
ｉｓｐｏｒｕｓ）ＨＵＴ６２０２のプラスミドｐＨＹ６
２０２のＢａｍＨ I 切断部位にチオストレプトン耐性
遺伝子を挿入し、かつＢｃｌ I 制限酵素により約０．
５メガダルトンの遺伝子を除去した、Ｂｃｌ I 切断点
を１ケ所有する約５．１メガダルトンのプラスミドベク
ター。 - （３）ストレプトミセス・カスタネオグロビスポラス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂ
ｉｓｐｏｒｕｓ）ＨＵＴ６２０２のプラスミドｐＨＹ６
２０２のＢａｍＨ I 切断部位にチオストレプトン耐性
遺伝子を、又、Ｘｈｏ I 切断部位に、大腸菌プラスミ
ドｐＢＲ３２８をＳａｌ I 切断部位で切断した遺伝子
を挿入した約８．８メガダルトンのプラスミドベクター
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59201860A JPS6181787A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | 新規なプラスミドベクタ− |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59201860A JPS6181787A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | 新規なプラスミドベクタ− |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6181787A true JPS6181787A (ja) | 1986-04-25 |
Family
ID=16448084
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59201860A Pending JPS6181787A (ja) | 1984-09-28 | 1984-09-28 | 新規なプラスミドベクタ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6181787A (ja) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5877897A (ja) * | 1981-10-15 | 1983-05-11 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | ストレプトマイセス属およびその類縁菌に使用するクロ−ニング・ベクタ− |
| JPS5879997A (ja) * | 1981-10-19 | 1983-05-13 | イ−ライ・リリ−・アンド・カンパニ− | ストレプトマイセス属およびその類縁菌に使用するプラスミドｐＥＬ７および関連クロ−ニング・ベクタ− |
| JPS59166088A (ja) * | 1982-12-22 | 1984-09-19 | イ−ライ・リリ−・アンド・カンパニ− | ストレプトマイセスへのクロ−ニング用ベクタ− |
-
1984
- 1984-09-28 JP JP59201860A patent/JPS6181787A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5877897A (ja) * | 1981-10-15 | 1983-05-11 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | ストレプトマイセス属およびその類縁菌に使用するクロ−ニング・ベクタ− |
| JPS5879997A (ja) * | 1981-10-19 | 1983-05-13 | イ−ライ・リリ−・アンド・カンパニ− | ストレプトマイセス属およびその類縁菌に使用するプラスミドｐＥＬ７および関連クロ−ニング・ベクタ− |
| JPS59166088A (ja) * | 1982-12-22 | 1984-09-19 | イ−ライ・リリ−・アンド・カンパニ− | ストレプトマイセスへのクロ−ニング用ベクタ− |
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