JPS59166088A - ストレプトマイセスへのクロ−ニング用ベクタ− - Google Patents
ストレプトマイセスへのクロ−ニング用ベクタ−Info
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- JPS59166088A JPS59166088A JP58241807A JP24180783A JPS59166088A JP S59166088 A JPS59166088 A JP S59166088A JP 58241807 A JP58241807 A JP 58241807A JP 24180783 A JP24180783 A JP 24180783A JP S59166088 A JPS59166088 A JP S59166088A
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- cloning vector
- dna
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、プラスミドＰＮＭ］、ＯＯの機能的複製起源
含有制限フラグメントおよび抗生物質耐性を付与する１
もしくはそれ以上のＤＮＡセグメントからなる、新規な
組換えＤＮＡクローニングベクターに関する。本発明は
また、この様なベクターの形質転換体に関する。
含有制限フラグメントおよび抗生物質耐性を付与する１
もしくはそれ以上のＤＮＡセグメントからなる、新規な
組換えＤＮＡクローニングベクターに関する。本発明は
また、この様なベクターの形質転換体に関する。
選択に用い得るクローニングベクター上の遺伝的マーカ
ーか一般的に欠損していることから、従来Ｓ ｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓおよび関連微生物における組換えＩＪＮ
Ａ技術の開発と発展は遅れており、特に困難とされてき
た。本発明に係るベクターは、ＳＬｒｅｐＬｏ７ｍｙｃ
ｅｓおよびその他の’＋６主菌株の両方で機能的であり
、かつ選択１」能であるため、この技術分野における著
しい進歩を示すものである。
ーか一般的に欠損していることから、従来Ｓ ｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓおよび関連微生物における組換えＩＪＮ
Ａ技術の開発と発展は遅れており、特に困難とされてき
た。本発明に係るベクターは、ＳＬｒｅｐＬｏ７ｍｙｃ
ｅｓおよびその他の’＋６主菌株の両方で機能的であり
、かつ選択１」能であるため、この技術分野における著
しい進歩を示すものである。
本発明Ｑこ係るベクターは、小さく、多方面に渡って利
用でき、それに対する耐性が付与される抗生物質に対し
て感受性である全てのＳ Ｌｒｅｐｔｍｙｃｅｓ細胞中
に導入でき、かつ選択できるということから、極めて有
用である。臨ｊ禾」二重要な抗生物質の半数以」二かＳ
ｔ ｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ菌株によって生産されるた
め、この工業的に重要な微生物に適用できるクローニン
グ系およびベクターの開発が望まれている。本発明は、
かかるベクターを提供し、これにより、既知の抗生物質
の収量を上けるため、また新規抗生物質および抗生物質
誘導体を生産するために、遺伝子をＳ ｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ中ヘクローンすること中旬クローンものである
。
用でき、それに対する耐性が付与される抗生物質に対し
て感受性である全てのＳ Ｌｒｅｐｔｍｙｃｅｓ細胞中
に導入でき、かつ選択できるということから、極めて有
用である。臨ｊ禾」二重要な抗生物質の半数以」二かＳ
ｔ ｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ菌株によって生産されるた
め、この工業的に重要な微生物に適用できるクローニン
グ系およびベクターの開発が望まれている。本発明は、
かかるベクターを提供し、これにより、既知の抗生物質
の収量を上けるため、また新規抗生物質および抗生物質
誘導体を生産するために、遺伝子をＳ ｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ中ヘクローンすること中旬クローンものである
。
本発明は、ＳｔｒｅｐＬｏｍｙｃｃｓ宿−”Ｅ−ｉ＋ｌ
Ｉ ＋何へＤ Ｎ Ａをクローンするためのベクターを
提供するものであり、かつ形質転換体の簡便な選択を可
能とするものである。形質転換は極めて低い確率で起こ
る現象であるので、何百万もの細胞のうちからプラスミ
ドｌ） Ｎ Ａをうφ得した細胞を決定するためには、
このような機能試験が実際上必須である。該ベクタ−に
は非選択性ＤＮＡ配列を挿入することができ、形質転換
により、このベクターと、所望の特定のＤＮＡ配列とを
含有する細胞を、適当な抗生物質による選択を用いて分
離することができるので、上記のことは重要となる。
Ｉ ＋何へＤ Ｎ Ａをクローンするためのベクターを
提供するものであり、かつ形質転換体の簡便な選択を可
能とするものである。形質転換は極めて低い確率で起こ
る現象であるので、何百万もの細胞のうちからプラスミ
ドｌ） Ｎ Ａをうφ得した細胞を決定するためには、
このような機能試験が実際上必須である。該ベクタ−に
は非選択性ＤＮＡ配列を挿入することができ、形質転換
により、このベクターと、所望の特定のＤＮＡ配列とを
含有する細胞を、適当な抗生物質による選択を用いて分
離することができるので、上記のことは重要となる。
本明細書中に記載した発明の理解を助けるために、以下
に用語を定義する。
に用語を定義する。
組換えＤＮＡクローニングベクター：１またはそれ以上
のＩ） Ｎ Ａセグメントを付加することのできる、も
しくはそれらが既に付加された、自律的複製媒体であっ
て、プラスミドを含むかこれに限定されない。
のＩ） Ｎ Ａセグメントを付加することのできる、も
しくはそれらが既に付加された、自律的複製媒体であっ
て、プラスミドを含むかこれに限定されない。
形質転換、ＤＮＡを宿主受容細胞中に導入し、遺伝型を
変化させ、その結果該受容細胞を変化させること。
変化させ、その結果該受容細胞を変化させること。
感受性イ占主細胞：耐性を付与するＤ Ｎ Ａセグメン
トなしでは、ある特定の抗生物質の存在下には生育でき
ない宿主細胞。
トなしでは、ある特定の抗生物質の存在下には生育でき
ない宿主細胞。
挿入異性体：ＤＮＡフラグメントが受容体ＤＮＡの２ま
たはそれ以上の適合部位のうちの１箇所に挿入されるこ
とにより生成する可能性のある２種またはそれ以上の組
換えＤ Ｎ’ Ａ分子のうちの１個。
たはそれ以上の適合部位のうちの１箇所に挿入されるこ
とにより生成する可能性のある２種またはそれ以上の組
換えＤ Ｎ’ Ａ分子のうちの１個。
プラスミドｐＬＲ２〜１．６ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ制限
フラグメント：プラスミドｐｌＪ６に含まれる〜１．５
ｋｂＢａｍＨＪチオストレプトン耐性付与フラグメント
と木質的に同等のもの。
フラグメント：プラスミドｐｌＪ６に含まれる〜１．５
ｋｂＢａｍＨＪチオストレプトン耐性付与フラグメント
と木質的に同等のもの。
プラスミドｐＬＲ１またはｐ ＬＲ４〜３．４ ｋｂ
ＢａｍＨ■制限フラグメント：プラスミドｐｌＪ２に含
まれる、〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨ■ネオマイシン耐性
付与フラグメントと同等のもの。
ＢａｍＨ■制限フラグメント：プラスミドｐｌＪ２に含
まれる、〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨ■ネオマイシン耐性
付与フラグメントと同等のもの。
Ａ１１１ｐＲ：アンピシリン耐性表現型。
Ｔｅｔ”’ ：テトラサイクリン感受性表現型。
ｒｈｉＯＲ：チオストレプトン耐性表現型。
ＮｅＯＲ：ネオマイシン耐性表現型。
本発明に係る組換え］）ＮＡクローニングベクターは、
ａ）プラスミドｐＮＭ１００の機能的複製起源含有制限
フラグメント、および ｂ）形質転換、細胞分裂および培養可能な感受性宿主細
胞中に導入（形質転換）した時、少なくとも１つの抗生
物質に対する耐性を付与する１さたはそれ以上のＤＮＡ
セグメント、 からなる。
フラグメント、および ｂ）形質転換、細胞分裂および培養可能な感受性宿主細
胞中に導入（形質転換）した時、少なくとも１つの抗生
物質に対する耐性を付与する１さたはそれ以上のＤＮＡ
セグメント、 からなる。
本発明に係るベクターは、プラスミドＰＮＩ〜’１１０
０の機能的複製起源を含有する制限フラグメントと、形
質転換、細胞分裂および培養可能な感受性宿主細胞中に
形質転換した時、少なくとも１つの抗生物質番こ対する
耐性を付与する、１またはそれ以上のＤＮＡセグメント
とをライゲーション（結紮）することにより゛、組み立
てられる。
０の機能的複製起源を含有する制限フラグメントと、形
質転換、細胞分裂および培養可能な感受性宿主細胞中に
形質転換した時、少なくとも１つの抗生物質番こ対する
耐性を付与する、１またはそれ以上のＤＮＡセグメント
とをライゲーション（結紮）することにより゛、組み立
てられる。
複製起源を含有するフラグメントの組み立てに使用する
プラスミドｐＮＭ１００ は、〜９． ｌ ｋｂであり
、分子クローニングに有利な数個の制限サイトを有する
。プラスミドｐＮＭ１００の複製起源は〜３．８ｋｂ
ＢａｍＨ：［制限フラグメント内に存在するので、この
プラスミドを〜３．８ｋｂ ＢａｍＨ■部位の外側で切
断する制限酵素で消化することにより、種々の異なった
複製起源含有フラグメントか生成する。さらに他のｐＮ
Ｍ １００複製起源含有フラグメントを得ることのでき
る〜４ ｋｂ ＰＮＭ １００誘導体であるプラスミド
ｐＦＪ１４３ もまた、本発明の構成に使用すること
ができる。プラスミドｐＮＭ、ｌＱ。
プラスミドｐＮＭ１００ は、〜９． ｌ ｋｂであり
、分子クローニングに有利な数個の制限サイトを有する
。プラスミドｐＮＭ１００の複製起源は〜３．８ｋｂ
ＢａｍＨ：［制限フラグメント内に存在するので、この
プラスミドを〜３．８ｋｂ ＢａｍＨ■部位の外側で切
断する制限酵素で消化することにより、種々の異なった
複製起源含有フラグメントか生成する。さらに他のｐＮ
Ｍ １００複製起源含有フラグメントを得ることのでき
る〜４ ｋｂ ＰＮＭ １００誘導体であるプラスミド
ｐＦＪ１４３ もまた、本発明の構成に使用すること
ができる。プラスミドｐＮＭ、ｌＱ。
およびｐＦＪ１４．３の詳細な制限サイト地図を添付の
第１図に示す。本発明の目的からして、第１図およびこ
れに続く図面は等縮尺で描かれてはいない。
第１図に示す。本発明の目的からして、第１図およびこ
れに続く図面は等縮尺で描かれてはいない。
プラスミドｐＮＭ１００は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇ
ｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒγ（
Ｐｅｏｒｉａ ５ＩＩＩ １ｎｏｉｓ在）に受理番号Ｎ
ＲＲＬ１５１５６の下に寄託され、その永久ストックカ
ルチャーコレクションの一部となっている菌株Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｅ ／ｐＮＭ Ｉ
Ｑ Ｑから常法番こより分離できる。プラスミドｐＦ
Ｊ１４３は、同じく受理番号ＮＲＲＬ１５１１４の下に
寄託されている菌株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｒｎ
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ ｐＦ Ｊ １４３から常法によ
り分離できる。両菌株は、各々のプラスミドの好ましい
供給源および保管源として誰でも入手可能である。
ｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒγ（
Ｐｅｏｒｉａ ５ＩＩＩ １ｎｏｉｓ在）に受理番号Ｎ
ＲＲＬ１５１５６の下に寄託され、その永久ストックカ
ルチャーコレクションの一部となっている菌株Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｅ ／ｐＮＭ Ｉ
Ｑ Ｑから常法番こより分離できる。プラスミドｐＦ
Ｊ１４３は、同じく受理番号ＮＲＲＬ１５１１４の下に
寄託されている菌株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｒｎ
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ ｐＦ Ｊ １４３から常法によ
り分離できる。両菌株は、各々のプラスミドの好ましい
供給源および保管源として誰でも入手可能である。
プラスミドｐＮＭ１０Ｑの数多くの異なった複製起源含
有フラグメントが組み立てられるが、本明細書中ではｐ
ＮＭｌｏｏの〜３８ｋｂ １３ａｍＨＩ制限フラグメン
トおよびｐＦＪｌ、４３の〜４ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ制
限フラグメントを例示の目的のためにとりあげる。
有フラグメントが組み立てられるが、本明細書中ではｐ
ＮＭｌｏｏの〜３８ｋｂ １３ａｍＨＩ制限フラグメン
トおよびｐＦＪｌ、４３の〜４ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ制
限フラグメントを例示の目的のためにとりあげる。
これらのフラグメントはそれぞれ、］またはそれ以上の
抗生物質耐性付与ＤＮＡセグメント、例えはプラスミド
ＰＬＲ２のチオストレプトン耐性付与〜１６ｋｂ ｆ３
ａｍＨＩ制限フラグメント、プラスミドｐＬＲ１または
プラスミドｐ Ｌ Ｒ４のネオマイシン耐性付与〜３．
４ ｋｂ Ｂａｍ ｆ（Ｉ制限フラグメント、およびプ
ラスミドＰｉＪ４３のエリスロマイシン耐性付与〜２．
５ ｋｌ） Ｓａｌ Ｉ −１３ａｍ ｒ−（工’ ７
ラクメントなどと個別にライゲーションして、本発明
の代表的なベクターを形成することかできる。
抗生物質耐性付与ＤＮＡセグメント、例えはプラスミド
ＰＬＲ２のチオストレプトン耐性付与〜１６ｋｂ ｆ３
ａｍＨＩ制限フラグメント、プラスミドｐＬＲ１または
プラスミドｐ Ｌ Ｒ４のネオマイシン耐性付与〜３．
４ ｋｂ Ｂａｍ ｆ（Ｉ制限フラグメント、およびプ
ラスミドＰｉＪ４３のエリスロマイシン耐性付与〜２．
５ ｋｌ） Ｓａｌ Ｉ −１３ａｍ ｒ−（工’ ７
ラクメントなどと個別にライゲーションして、本発明
の代表的なベクターを形成することかできる。
チオストレプトン耐性付与フラグメントの供給源である
プラスミドｐ Ｌ Ｒ２は、〜ｌ ３，７ ｋｌ）であ
り、Ｈｉｎｄ ］［処理したプラスミドｐ ｉ Ｊ ５
（Ｔｈｏｍｐｓ ｏｎ等、１９８０、Ｔ＼ａｔｕｒｅ
２８６ ： ５２５に記載）を、Ｈｉｎｄ Ｊ［処理
したプラスミドｐＢＲ３２２にライゲーションすること
により組み立てられる。ネオマイシン耐性付与フラグメ
ントの供給源であるプラスミｌ＜’ ｐ ＬＲｌは、〜
］−４，８ｋｂであり、プラスミドｐＩＪ６の代わりに
プラスミドｐ ｉ Ｊ ２ （Ｔｈｏｍｐ ｓｏｎ等、
１９８０に記載）を用いることを除けは、同様にして組
み立てられる。プラスミドｐ Ｉ−Ｒ４を導く類似の組
み立ては、ＢａｍＨ：［処理したプラスミドｐＢＲ３２
２をＢａｍＨＩ処理したプラスミドｐＬＲ１にライゲー
ションすることによって行なう。プラスミドｐＬＲ２、
ｐＬＲｌおよびｐ Ｉ−Ｒ４はＥ、ｃｏｌｉ 中で機能
的であり、したかつてそれＪａｌＱの操作のために増幅
させ、簡便に単１２ｉＩすることができる。
プラスミドｐ Ｌ Ｒ２は、〜ｌ ３，７ ｋｌ）であ
り、Ｈｉｎｄ ］［処理したプラスミドｐ ｉ Ｊ ５
（Ｔｈｏｍｐｓ ｏｎ等、１９８０、Ｔ＼ａｔｕｒｅ
２８６ ： ５２５に記載）を、Ｈｉｎｄ Ｊ［処理
したプラスミドｐＢＲ３２２にライゲーションすること
により組み立てられる。ネオマイシン耐性付与フラグメ
ントの供給源であるプラスミｌ＜’ ｐ ＬＲｌは、〜
］−４，８ｋｂであり、プラスミドｐＩＪ６の代わりに
プラスミドｐ ｉ Ｊ ２ （Ｔｈｏｍｐ ｓｏｎ等、
１９８０に記載）を用いることを除けは、同様にして組
み立てられる。プラスミドｐ Ｉ−Ｒ４を導く類似の組
み立ては、ＢａｍＨ：［処理したプラスミドｐＢＲ３２
２をＢａｍＨＩ処理したプラスミドｐＬＲ１にライゲー
ションすることによって行なう。プラスミドｐＬＲ２、
ｐＬＲｌおよびｐ Ｉ−Ｒ４はＥ、ｃｏｌｉ 中で機能
的であり、したかつてそれＪａｌＱの操作のために増幅
させ、簡便に単１２ｉＩすることができる。
エリスロマイシン耐性付与フラグメントの供給）原であ
るプラスミドｐｌＪ４３は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ （Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌ、Ｍａｒｙｌａｎｄ在）に寄託され永久ストッ
クカルチャーコレクションの一部となっている菌、；朱
１！：、 ｃｏｌｉ ８０３／Ｐ’Ｊ ４３ より得る
ことかできる。これは、受理番号ＡＴＣＣ３９１５６の
下で、該プラスミドの好ましい供給源および保管源とし
て、誰でも利用できる。プラスミドｐＬ’Ｒ１、ｐＬ技
２およびｐ Ｊ−Ｒ４の制限サイト並びに機能地図を、
添付の第２図に示す。
るプラスミドｐｌＪ４３は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ （Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌ、Ｍａｒｙｌａｎｄ在）に寄託され永久ストッ
クカルチャーコレクションの一部となっている菌、；朱
１！：、 ｃｏｌｉ ８０３／Ｐ’Ｊ ４３ より得る
ことかできる。これは、受理番号ＡＴＣＣ３９１５６の
下で、該プラスミドの好ましい供給源および保管源とし
て、誰でも利用できる。プラスミドｐＬ’Ｒ１、ｐＬ技
２およびｐ Ｊ−Ｒ４の制限サイト並びに機能地図を、
添付の第２図に示す。
組み立ての便宜と簡便のため、チオストレプトン耐性付
与〜ｌ、 ５ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩフラグメント、ネオ
マイシン耐性付与〜３．４ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ フ
ラグメント、およびエリスロマイシン耐性付与〜２，５
ｋｌ）Ｓａｔ ：［−ＢａｍＨＩフラクメントを、プラ
スミドｐＮＭ１００の〜３．Ｂｋｂ複製起源含荷Ｂａｍ
Ｈエフ ７ クメントまたはプラスミドＰＦＪ１４３
の〜４ｋｂ複製起源含有ＢａｍＨ４フラクメント（こ
ライゲーションする。次いて生成した組換えＤＮＡをラ
イゲーションして本発明の代表的なプラスミドを生産す
る。ある特定の配性付与ＤＮＡフラグメントの方向性に
依存して、二方向の組使えプラスミドか生成すル。即チ
、プラスミドＰＬＲ２の〜１６ｋｌ）Ｂａｍ１−Ｉ Ｉ
フラグメントをプラスミドｐＮＭＩＱＯの〜３．８ｋｂ
Ｂａｍｌ−１１フラグメントにライゲーションするこ
とにより、例示プラスミドｐＦＪ２０４ およびｐＦＪ
２０５ が、プラスミドｐ Ｉ−Ｒｌまたはプラスミド
ｐＬＲ４の〜３．４ ｋｂ Ｂａｍ１−ＩＩ ７ ラ
グメン１へのライゲーション番こより、例示プラスミド
ｐＦＪ２０６およびｐＦＪ２０７ が、そしてこの両フ
ラクメントのライゲーションにより、例示プラスミドｐ
ＦＪ２０８およびｐＦＪ２０９が生成する。同様にして
、〜１．６． ｋｂ Ｂａｍ Ｈ’Ｉ フラグメントを
プラスミドｐＦＪ１４３ の〜４ ｋｂ Ｂａｍｆ（
Ｉ７ラクメ７ ’−ニライゲーションすることにより、
例示プラスミドｐＦＪ１７０ およびｐＦ’Ｊ２１０が
、〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨＩフラクメントの♂ゲーシ
ョンにより例示フラスミ△ ドｐｌ”Ｊ２１１ およびｐＦＪ ２１２が、〜１，６
ｋｂ および〜３．４． ｋｂ ＢａｍＨＩ両フラグメ
ントのライゲーションにより、例示プラスミドｐＦ’Ｊ
２１３およびｐＦ、）２１４ が、そして適当なリンカ
−と共に〜２．５ｋｂ Ｓａｌ Ｉ−ＢａｍＨＩフラク
メントをライゲーションすることにより、例示プラスミ
ドｐｌ・Ｊ２］５およびｐ Ｆ Ｊ ２１６が生成する
。
与〜ｌ、 ５ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩフラグメント、ネオ
マイシン耐性付与〜３．４ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ フ
ラグメント、およびエリスロマイシン耐性付与〜２，５
ｋｌ）Ｓａｔ ：［−ＢａｍＨＩフラクメントを、プラ
スミドｐＮＭ１００の〜３．Ｂｋｂ複製起源含荷Ｂａｍ
Ｈエフ ７ クメントまたはプラスミドＰＦＪ１４３
の〜４ｋｂ複製起源含有ＢａｍＨ４フラクメント（こ
ライゲーションする。次いて生成した組換えＤＮＡをラ
イゲーションして本発明の代表的なプラスミドを生産す
る。ある特定の配性付与ＤＮＡフラグメントの方向性に
依存して、二方向の組使えプラスミドか生成すル。即チ
、プラスミドＰＬＲ２の〜１６ｋｌ）Ｂａｍ１−Ｉ Ｉ
フラグメントをプラスミドｐＮＭＩＱＯの〜３．８ｋｂ
Ｂａｍｌ−１１フラグメントにライゲーションするこ
とにより、例示プラスミドｐＦＪ２０４ およびｐＦＪ
２０５ が、プラスミドｐ Ｉ−Ｒｌまたはプラスミド
ｐＬＲ４の〜３．４ ｋｂ Ｂａｍ１−ＩＩ ７ ラ
グメン１へのライゲーション番こより、例示プラスミド
ｐＦＪ２０６およびｐＦＪ２０７ が、そしてこの両フ
ラクメントのライゲーションにより、例示プラスミドｐ
ＦＪ２０８およびｐＦＪ２０９が生成する。同様にして
、〜１．６． ｋｂ Ｂａｍ Ｈ’Ｉ フラグメントを
プラスミドｐＦＪ１４３ の〜４ ｋｂ Ｂａｍｆ（
Ｉ７ラクメ７ ’−ニライゲーションすることにより、
例示プラスミドｐＦＪ１７０ およびｐＦ’Ｊ２１０が
、〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨＩフラクメントの♂ゲーシ
ョンにより例示フラスミ△ ドｐｌ”Ｊ２１１ およびｐＦＪ ２１２が、〜１，６
ｋｂ および〜３．４． ｋｂ ＢａｍＨＩ両フラグメ
ントのライゲーションにより、例示プラスミドｐＦ’Ｊ
２１３およびｐＦ、）２１４ が、そして適当なリンカ
−と共に〜２．５ｋｂ Ｓａｌ Ｉ−ＢａｍＨＩフラク
メントをライゲーションすることにより、例示プラスミ
ドｐｌ・Ｊ２］５およびｐ Ｆ Ｊ ２１６が生成する
。
〜３． Ｂ ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フラクメント中に含
まれる復製起源が存在する限り、種々のプラスミドｐＮ
Ｍ１００制限フラグメントを、抗生物質耐性付与ＤＮＡ
セグメントとのライゲーションに使用することかできる
。かかるプラスミドｐＮＭ１００制限フラグメントには
、〜９． ｌ ｋｂ ＢａｍＨ：［、〜８．４ｋｌ）Ｂ
ａｍＨＩ 、〜４．７ ｋｂ １３ａｍＨＩ 、Ｎ９
．１ ｋｂＳａｃＩ 、〜５．４ ｋｂ Ｓｍａ Ｉ
、および〜４．４ ｋｂ Ｐｖｕ■フラクメント等が含
まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、
ある抗生物質耐性付与ＩＪＮＡセグメントは、複製起源
または他の重要なプラスミド支配の生理的機能が崩壊し
ない限り、プラスミドＰＮＭ１００またはＰＦＪ １４
３の単一の部位に限らす、多くの箇所にライゲーション
または挿入することができる。特定のＤＮＡセグメント
のライゲーションまたは挿入の隙、どの部位が有利であ
るかは、当業者には理解できるか、または容易に決定で
きる。
まれる復製起源が存在する限り、種々のプラスミドｐＮ
Ｍ１００制限フラグメントを、抗生物質耐性付与ＤＮＡ
セグメントとのライゲーションに使用することかできる
。かかるプラスミドｐＮＭ１００制限フラグメントには
、〜９． ｌ ｋｂ ＢａｍＨ：［、〜８．４ｋｌ）Ｂ
ａｍＨＩ 、〜４．７ ｋｂ １３ａｍＨＩ 、Ｎ９
．１ ｋｂＳａｃＩ 、〜５．４ ｋｂ Ｓｍａ Ｉ
、および〜４．４ ｋｂ Ｐｖｕ■フラクメント等が含
まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、
ある抗生物質耐性付与ＩＪＮＡセグメントは、複製起源
または他の重要なプラスミド支配の生理的機能が崩壊し
ない限り、プラスミドＰＮＭ１００またはＰＦＪ １４
３の単一の部位に限らす、多くの箇所にライゲーション
または挿入することができる。特定のＤＮＡセグメント
のライゲーションまたは挿入の隙、どの部位が有利であ
るかは、当業者には理解できるか、または容易に決定で
きる。
抗生物質チオストレプトン、ネオマイノン、おヨヒエリ
スロマイシン耐性付与ＤＮＡセグメントは、それぞれプ
ラスミドｐＬＲ２、ｐＬＲｌおよびＰＩＪ４３の、、
１．６ ｋｂ ＢａｍＨＩ、〜３．４１＜ｂ ＢａｍＨ
Ｉ、および〜２．５ ｋｂ Ｓａｔ Ｉ −Ｂａｍｌ（
Ｉ ｌ１ｌｌ限フラグメントによって例示しているか、
当業者には、上記抗生物質に対する耐性を付与する他の
ＤＮＡセグメントを組み立て、個別に、または組み合わ
せて使用することができるであろう。プラスミドｐＬＲ
２の他のチオストレプトン耐性付与ＤＮＡセグメントに
は、例えば〜ｌ ３ ｋｂ Ｐｓｔ 工制限フラグメン
トおよび〜１．５ ｋｂ ＢａｍＨ■制限フラグメント
の〜、８ｋｂ Ｂｃｌ エサブフラグメントがある。プ
ラスミドＴ）ＬＲＩの他のネオマイシン耐性付与ＤＮＡ
セグメントには、例えは〜３．５ ｋｂ Ｐｓｔ 工制
限フラグメントおよび〜３．４ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ制
限フラクメントの５ＳＬＩ−Ｋｐｎエサフフラクメント
のうちの大きい方かある。エリスロマイシン耐性を付与
する他のフラクメン］・とじては、例えばプラスミドＰ
ＩＪ４３の〜２．８ ｋｌ〕Ｓａｌ Ｉ 、〜２．７
ｋｂＳａｌ Ｉ −Ｂｇｌ Ｔｌ、〜３．Ｑ ｋｂ Ｈ
ｉｎｄｌｉ １．−２，８ ｋｂＸｈｏ ■−Ｂｇｌ
ｆ（、およヒ〜４．１ ｋｂ Ｅｃｏ Ｒ■−ＢａｍＨ
■制限フラグメントが挙げられる。
スロマイシン耐性付与ＤＮＡセグメントは、それぞれプ
ラスミドｐＬＲ２、ｐＬＲｌおよびＰＩＪ４３の、、
１．６ ｋｂ ＢａｍＨＩ、〜３．４１＜ｂ ＢａｍＨ
Ｉ、および〜２．５ ｋｂ Ｓａｔ Ｉ −Ｂａｍｌ（
Ｉ ｌ１ｌｌ限フラグメントによって例示しているか、
当業者には、上記抗生物質に対する耐性を付与する他の
ＤＮＡセグメントを組み立て、個別に、または組み合わ
せて使用することができるであろう。プラスミドｐＬＲ
２の他のチオストレプトン耐性付与ＤＮＡセグメントに
は、例えば〜ｌ ３ ｋｂ Ｐｓｔ 工制限フラグメン
トおよび〜１．５ ｋｂ ＢａｍＨ■制限フラグメント
の〜、８ｋｂ Ｂｃｌ エサブフラグメントがある。プ
ラスミドＴ）ＬＲＩの他のネオマイシン耐性付与ＤＮＡ
セグメントには、例えは〜３．５ ｋｂ Ｐｓｔ 工制
限フラグメントおよび〜３．４ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ制
限フラクメントの５ＳＬＩ−Ｋｐｎエサフフラクメント
のうちの大きい方かある。エリスロマイシン耐性を付与
する他のフラクメン］・とじては、例えばプラスミドＰ
ＩＪ４３の〜２．８ ｋｌ〕Ｓａｌ Ｉ 、〜２．７
ｋｂＳａｌ Ｉ −Ｂｇｌ Ｔｌ、〜３．Ｑ ｋｂ Ｈ
ｉｎｄｌｉ １．−２，８ ｋｂＸｈｏ ■−Ｂｇｌ
ｆ（、およヒ〜４．１ ｋｂ Ｅｃｏ Ｒ■−ＢａｍＨ
■制限フラグメントが挙げられる。
さら（こ、上記のまたは上記とは異なる抗生物質、例え
ばクロラムフェニコール、ストレプトマイシン、ハイク
ロマイシン、ビオマイシン、タイロシンといった抗生物
質に対する耐性を付与するその他のＤＮＡセグメントも
、当業者により組み立てられ、使用することができる。
ばクロラムフェニコール、ストレプトマイシン、ハイク
ロマイシン、ビオマイシン、タイロシンといった抗生物
質に対する耐性を付与するその他のＤＮＡセグメントも
、当業者により組み立てられ、使用することができる。
加えて、これらのまたは本明細暑中に記載した以外の抗
生物質耐性付与１） Ｎ Ａセグメントの機能的誘導体
も、遺伝的暗号に従って、あるヌクレオチドを付加、脱
離または＠侯することによって組み立てることかできる
。当業者には、これら誘導体もしくはこれら以外の抗生
物質耐性付与ＤＮＡセグメントを、ｐＮＭ Ｉ Ｑ Ｑ
またはｐＦＪ１４−３の複製起源含有フラグメントにラ
イゲーションすることによって、これもまた本発明の一
部を構成するベクターか生成することが理解されるであ
ろう。
生物質耐性付与１） Ｎ Ａセグメントの機能的誘導体
も、遺伝的暗号に従って、あるヌクレオチドを付加、脱
離または＠侯することによって組み立てることかできる
。当業者には、これら誘導体もしくはこれら以外の抗生
物質耐性付与ＤＮＡセグメントを、ｐＮＭ Ｉ Ｑ Ｑ
またはｐＦＪ１４−３の複製起源含有フラグメントにラ
イゲーションすることによって、これもまた本発明の一
部を構成するベクターか生成することが理解されるであ
ろう。
プラスミドｐＮＭ １００およびｐＦＪ１４３ の制限
フラグメントならひに種々の抗生物質耐性付与ＤＮＡフ
ラグメントは、ライゲーションを容易にするため、修飾
することができる。例えは、プラスミドｐＮＭ’ １０
０またはｌ） Ｆ Ｊ １４３ のある特定の制限フラ
グメント、およびある特定の抗生物質耐性付与ＤＮＡセ
グメントのうちの一方または両者に、分子リンカ−を供
給することができる。そうすることにより、これに続く
ライゲーションのための特異的サイトを簡単に作ること
ができる。また、複製起源含有制限フラグメントも、あ
る種のヌクレオチドを付加、脱離または置換することに
より修飾して、ＤＮＡのライゲーションのための種々の
制限サイトを設けることができる。当業者は、ヌクレオ
チド化学および遺伝暗号を理解しているので、どのヌク
レオチドが交換石１能か、そしてどのＤＮＡ修飾か特定
の目的にとって望ましいかが理解できるはずである。
フラグメントならひに種々の抗生物質耐性付与ＤＮＡフ
ラグメントは、ライゲーションを容易にするため、修飾
することができる。例えは、プラスミドｐＮＭ’ １０
０またはｌ） Ｆ Ｊ １４３ のある特定の制限フラ
グメント、およびある特定の抗生物質耐性付与ＤＮＡセ
グメントのうちの一方または両者に、分子リンカ−を供
給することができる。そうすることにより、これに続く
ライゲーションのための特異的サイトを簡単に作ること
ができる。また、複製起源含有制限フラグメントも、あ
る種のヌクレオチドを付加、脱離または置換することに
より修飾して、ＤＮＡのライゲーションのための種々の
制限サイトを設けることができる。当業者は、ヌクレオ
チド化学および遺伝暗号を理解しているので、どのヌク
レオチドが交換石１能か、そしてどのＤＮＡ修飾か特定
の目的にとって望ましいかが理解できるはずである。
本発明に係るＳ ｔｒｅｐｃｏｍｙｃｅｓ−機能性ベク
ターは、例えはｐ １３ Ｒ３２２、ＰＢＲ３２４、ｐ
１３技３２５、ｐ Ｂ Ｒ３２８といったＥ、ｃｏｌ
ｉプラスミドの制限フラグメントとライゲーションして
、Ｅ、ｃｏｌｉおよび５ｔｒｅｐｃｏ−ｆｆｌ）ＩＣｅ
Ｓの両者において選択可能な自己複製ベクターを作り出
すこともできる。この三機能性の組み立て物は、ＰＮＭ
ｌｏｏの複製起源、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中で抗生
物質耐性を付与するＤＮＡセグメント、Ｅ 、 ｃｏｌ
ｉ中で機能するレプリコン、およびＬｃｏｌ ｉ中で
抗生物質耐性を付与するＤＮＡセグメントからなる。本
明細書中、プラスミドＩ） Ｆ Ｊ ２１９とｐｌ・Ｊ
２２０により例示している二機能性組み立て物は、プラ
スミドの増幅および操作がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中
でよりもＥ、ｃｏｌｉ中で、より速やかにかつ簡便にで
きるという理由で、特に有利である。従って、Ｅ。
ターは、例えはｐ １３ Ｒ３２２、ＰＢＲ３２４、ｐ
１３技３２５、ｐ Ｂ Ｒ３２８といったＥ、ｃｏｌ
ｉプラスミドの制限フラグメントとライゲーションして
、Ｅ、ｃｏｌｉおよび５ｔｒｅｐｃｏ−ｆｆｌ）ＩＣｅ
Ｓの両者において選択可能な自己複製ベクターを作り出
すこともできる。この三機能性の組み立て物は、ＰＮＭ
ｌｏｏの複製起源、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中で抗生
物質耐性を付与するＤＮＡセグメント、Ｅ 、 ｃｏｌ
ｉ中で機能するレプリコン、およびＬｃｏｌ ｉ中で
抗生物質耐性を付与するＤＮＡセグメントからなる。本
明細書中、プラスミドＩ） Ｆ Ｊ ２１９とｐｌ・Ｊ
２２０により例示している二機能性組み立て物は、プラ
スミドの増幅および操作がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中
でよりもＥ、ｃｏｌｉ中で、より速やかにかつ簡便にで
きるという理由で、特に有利である。従って、Ｅ。
ｃｏｌ ｉ宿主系の中で所望の組換えＤＮＡ操作を行な
った後に、このプラスミド全体もしくは特定のＳｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｄ Ｎ Ａをとり出し、プラスミド
の形に再組み立てしく必要ならば）、次いでＳｔｒｅｐ
ｔｏ−ｍｙｃｅｓまたは関連宿主細胞中に形質転換する
ことができる。
った後に、このプラスミド全体もしくは特定のＳｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｄ Ｎ Ａをとり出し、プラスミド
の形に再組み立てしく必要ならば）、次いでＳｔｒｅｐ
ｔｏ−ｍｙｃｅｓまたは関連宿主細胞中に形質転換する
ことができる。
本発明に係る組換えＤ Ｎ Ａクローニングベクターは
、その用途をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの単一の種また
は菌株に限るものではない。逆に、本ベクターは広範囲
の適用が可能で、多くの別ｒｅｐＬＯＩｎｙｃｅｓ類の
宿主細胞、特にアミノグリコシド、マクロライド、β−
ラクタム、ポリエーテルおよびクリコペブチドのような
抗生物質を産生ずる経済的重要性のある非制限菌株に導
入（トランスフオーム）することができる。こうした非
制限菌株は、文献（Ｌｏｍｏ ｖｓｋａｙａ等、１９８
０、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類から容易に選択、分離され
る。非制限菌株の宿主細胞は制限酵素を欠くため、形質
転換の際プラスミドＤＮＡを切断したり劣化させること
がない。本発明においては、本発明に係るベクターのい
かなる制限ザイトも切断しない制限酵素を含んでいる宿
主細胞もまた非制限性とみなすこととする。
、その用途をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの単一の種また
は菌株に限るものではない。逆に、本ベクターは広範囲
の適用が可能で、多くの別ｒｅｐＬＯＩｎｙｃｅｓ類の
宿主細胞、特にアミノグリコシド、マクロライド、β−
ラクタム、ポリエーテルおよびクリコペブチドのような
抗生物質を産生ずる経済的重要性のある非制限菌株に導
入（トランスフオーム）することができる。こうした非
制限菌株は、文献（Ｌｏｍｏ ｖｓｋａｙａ等、１９８
０、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類から容易に選択、分離され
る。非制限菌株の宿主細胞は制限酵素を欠くため、形質
転換の際プラスミドＤＮＡを切断したり劣化させること
がない。本発明においては、本発明に係るベクターのい
かなる制限ザイトも切断しない制限酵素を含んでいる宿
主細胞もまた非制限性とみなすこととする。
アミ／グリコシド抗生物質を産生じ、本発明に係るベク
ターを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましい別
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株の宿主細胞には、
例えば以下のような微生物の非制限細胞か含まれる： Ｓ、ｋａｎａ ｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（カナマイシン類）
、Ｓ、 ｃｌｌｒｅｓｔｏ−ｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（７
ミノシジン） 、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏ［１ａｖｕｓ（抗生
物質Ａ／１Ａ１２６７）、５１ｍ１ｃｒｏｓｐｏｒｅｕ
ｓ （抗生物質５Ｆ−７６７） 、Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄ
ｉｆｉｃｕｓ （抗生物質５Ｆ７３３）、Ｓ 、 ｆｌ
ａｖｏｐｅｒｓｉｃｕｓ （スペクチノマイシン） 、
ｓ、 ５ｐｅｃｔ−ａｌ）ｉｌｉｓ （アクチノスベ
クタシン）、Ｓ、 ｒｉｍｏｓｕｓｆｏｒｍａ ｐａｒ
ｏｍｏｍｙｃｉｎｕｓ （パロモマイシン類、カテヌリ
ン）、Ｓ、 ｆｒａｄｉａｅ ｖａｒ、１ｔａｌｉｃｕ
ｓ （アミノシジン）、Ｓ、 ｂｌｕｅｎｓｉｓ ｖ
ａｒ、 ｂｌｕｅｎｓｉｓ （プルエンソマイシン）、
Ｓ、 ｃａｔｅｎｕｌａｅ（カテヌリ７ ） 、Ｓ、ｏ
ｌｉｖｏｒｃｔｉ−ｃｕｌｉ ｖａｒ、 ｃｅｌｌｕｌ
ｏｐｈｉｌｕｓ（テストマイシンＡ）、Ｓ。
ターを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましい別
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株の宿主細胞には、
例えば以下のような微生物の非制限細胞か含まれる： Ｓ、ｋａｎａ ｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（カナマイシン類）
、Ｓ、 ｃｌｌｒｅｓｔｏ−ｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（７
ミノシジン） 、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏ［１ａｖｕｓ（抗生
物質Ａ／１Ａ１２６７）、５１ｍ１ｃｒｏｓｐｏｒｅｕ
ｓ （抗生物質５Ｆ−７６７） 、Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄ
ｉｆｉｃｕｓ （抗生物質５Ｆ７３３）、Ｓ 、 ｆｌ
ａｖｏｐｅｒｓｉｃｕｓ （スペクチノマイシン） 、
ｓ、 ５ｐｅｃｔ−ａｌ）ｉｌｉｓ （アクチノスベ
クタシン）、Ｓ、 ｒｉｍｏｓｕｓｆｏｒｍａ ｐａｒ
ｏｍｏｍｙｃｉｎｕｓ （パロモマイシン類、カテヌリ
ン）、Ｓ、 ｆｒａｄｉａｅ ｖａｒ、１ｔａｌｉｃｕ
ｓ （アミノシジン）、Ｓ、 ｂｌｕｅｎｓｉｓ ｖ
ａｒ、 ｂｌｕｅｎｓｉｓ （プルエンソマイシン）、
Ｓ、 ｃａｔｅｎｕｌａｅ（カテヌリ７ ） 、Ｓ、ｏ
ｌｉｖｏｒｃｔｉ−ｃｕｌｉ ｖａｒ、 ｃｅｌｌｕｌ
ｏｐｈｉｌｕｓ（テストマイシンＡ）、Ｓ。
ｔｃｎｅｂｒａｒｉｕｓ （１−ブラマイシン、アブラ
マイシン）、Ｓ、 Ｉａｖｃｎｄｕｌａｅ （ネオマイ
’Ｊ ７ ） 、Ｓ、ａｌｂｏｇｒｉｓｃｏｌｕｓ（ネ
オマイシン類）、Ｓ、 ａｌｂｕｓ ｖａｒ、ｍｃｔａ
ｍｙｃｉｎｕｓ（メタマイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃ
ｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ、 ｓａｇａｍｉ −ｅｎｓｉｓ
（スペクチノマイシン）、Ｓ、 ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉ
ｓ（ストレプトマイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ （
ストレプトマイシン）、Ｓ、 ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏ
ｍｏｇｅｎｅｓ ｖａｒ、ｎａｒｕｔｏ −ｅｎｓｉｓ
、 （ストレプトマイシン）、Ｓ、 ｐｏｏｌｅｎｓｉ
ｓ （ストレプトマイシン） 、Ｓ、 ｇａｌｂｕｓ
（ストレプトマイシン）、Ｓ、 ｒａｍｅｕｓ（ストレ
プトマイシン）、Ｓ。
マイシン）、Ｓ、 Ｉａｖｃｎｄｕｌａｅ （ネオマイ
’Ｊ ７ ） 、Ｓ、ａｌｂｏｇｒｉｓｃｏｌｕｓ（ネ
オマイシン類）、Ｓ、 ａｌｂｕｓ ｖａｒ、ｍｃｔａ
ｍｙｃｉｎｕｓ（メタマイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃ
ｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ、 ｓａｇａｍｉ −ｅｎｓｉｓ
（スペクチノマイシン）、Ｓ、 ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉ
ｓ（ストレプトマイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ （
ストレプトマイシン）、Ｓ、 ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏ
ｍｏｇｅｎｅｓ ｖａｒ、ｎａｒｕｔｏ −ｅｎｓｉｓ
、 （ストレプトマイシン）、Ｓ、 ｐｏｏｌｅｎｓｉ
ｓ （ストレプトマイシン） 、Ｓ、 ｇａｌｂｕｓ
（ストレプトマイシン）、Ｓ、 ｒａｍｅｕｓ（ストレ
プトマイシン）、Ｓ。
ｏｌ １ｖａｃｅｕｓ （７，トレプトマイシ７ ）
、Ｓ、 ｍａｓｈｕｅｎｓｉｓ（ストレプトマイシン）
、Ｓ、 ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ。
、Ｓ、 ｍａｓｈｕｅｎｓｉｓ（ストレプトマイシン）
、Ｓ、 ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ。
１ｉｍｏｎｅｕｓ（バリダマイシン類） 、Ｓ、 ｒｉ
ｍｏｆａｃｉｅｎｓ（テストマイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒ
ｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｆｏｒｍａ ｇｌｃｌ〕ｏ−５ｕ
ｓ （ダレポマイシン）、Ｓ、 ｆｒａｄｉａｅ（ハイ
フリマイシン類、ネオマイシン類）、Ｓ、 ｅｕｒｏｃ
ｉｄｉｃｕｓ（抗生物質Ａｌ５３１５−Ｃ） 、Ｓ、
ａｑｕａｃａｎｕｓ（Ｎ−メｆルハイグ０フィシンＢ）
、Ｓ、 ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｓ （）＼イプロマイ
シンＡ）、Ｓ、ｎｏｂｏｒｉｔｏｅｎｓｉｓ （ハイク
ロマイシン）、Ｓ、 ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （
ハイグロマイシン類）、Ｓ、 ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ
（ハイグロマイシン） 、 Ｓ、ｋａｓｕｇａ−ｓｐ
ｉｎｕｓ （カナマイシン）、Ｓ 、 ｋａｓｕｇａｅ
ｎｓ ｉｓ （カナマイシン類）、Ｓ、ｎｅｔｒｏｐｓ
ｉｓ（抗生物質ＬＬ−ＡＭ３１ ）、５．１ｉｖｉｄｕ
ｓ （リビドマイシン類）、Ｓ。
ｍｏｆａｃｉｅｎｓ（テストマイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒ
ｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｆｏｒｍａ ｇｌｃｌ〕ｏ−５ｕ
ｓ （ダレポマイシン）、Ｓ、 ｆｒａｄｉａｅ（ハイ
フリマイシン類、ネオマイシン類）、Ｓ、 ｅｕｒｏｃ
ｉｄｉｃｕｓ（抗生物質Ａｌ５３１５−Ｃ） 、Ｓ、
ａｑｕａｃａｎｕｓ（Ｎ−メｆルハイグ０フィシンＢ）
、Ｓ、 ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｓ （）＼イプロマイ
シンＡ）、Ｓ、ｎｏｂｏｒｉｔｏｅｎｓｉｓ （ハイク
ロマイシン）、Ｓ、 ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （
ハイグロマイシン類）、Ｓ、 ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ
（ハイグロマイシン） 、 Ｓ、ｋａｓｕｇａ−ｓｐ
ｉｎｕｓ （カナマイシン）、Ｓ 、 ｋａｓｕｇａｅ
ｎｓ ｉｓ （カナマイシン類）、Ｓ、ｎｅｔｒｏｐｓ
ｉｓ（抗生物質ＬＬ−ＡＭ３１ ）、５．１ｉｖｉｄｕ
ｓ （リビドマイシン類）、Ｓ。
Ｔｈｏｆｕｅｎｓ ｉ ｓ （セルドマイシン複合体）
、およびＳ。
、およびＳ。
ｃａｎｕｓ （リポシルパロマミン）。
マクロライド抗生物質を産生じ、本発明に係るベクター
を特に有用番こ使用でき、形質転換できる好ましいＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例
えは以下のような微生物の非制限細胞が含まれ７． ：
Ｓ、 ｃａｅｌｅｓｔｉｓ （抗生物質Ｍ １８８
）、Ｓ。
を特に有用番こ使用でき、形質転換できる好ましいＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例
えは以下のような微生物の非制限細胞が含まれ７． ：
Ｓ、 ｃａｅｌｅｓｔｉｓ （抗生物質Ｍ １８８
）、Ｓ。
ｐｌａｔｅｎｓ ｉｓ （プラテノマイシン）、Ｓ、
ｒｏｃｌｌｃｉ ｖａｒ。
ｒｏｃｌｌｃｉ ｖａｒ。
ｖｏｌｕｂｉｌｉｓ（抗生物質−ｒ２６３６）、Ｓ、
ｖｅｎｅｚｕｃｌａｅ （メチマイシン−１Ｓ、ｇｒｉ
ｓｅｏｆｕｓｃｕｓ （フンドリン）、Ｓ 、 ｎａｒ
ｂｏｎｅｎｓ ｉｓ （ジョサマイシン、ナルホマイシ
ン）、Ｓ、 ｆ ｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ（抗生物質Ｎ
Ａ−１８１） 、Ｓ。
ｖｅｎｅｚｕｃｌａｅ （メチマイシン−１Ｓ、ｇｒｉ
ｓｅｏｆｕｓｃｕｓ （フンドリン）、Ｓ 、 ｎａｒ
ｂｏｎｅｎｓ ｉｓ （ジョサマイシン、ナルホマイシ
ン）、Ｓ、 ｆ ｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ（抗生物質Ｎ
Ａ−１８１） 、Ｓ。
ｇｒｉｓｅｏｆａｃｉｅｎｓ （抗生物質ＰＡ１３３Ａ
１Ｂ）、Ｓ、ｒｏｓｅｏ−ｃｉｔｒｅｕｓ（アルボサイ
クリン） 、Ｓ 、ｂｒｕｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ （ア
ルボサイクリン）、Ｓ、 ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅ
ｎｅｓ （アルボサイクリン）、Ｓ、ｃｉｎｅｒｏｃｂ
ｒｏｍｏｇｃｎｅｓ （シネ０フイ’ｚ７Ｂ）、Ｓ、ａ
ｌｂｕｓ （アルコマイシン７）、Ｓ。
１Ｂ）、Ｓ、ｒｏｓｅｏ−ｃｉｔｒｅｕｓ（アルボサイ
クリン） 、Ｓ 、ｂｒｕｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ （ア
ルボサイクリン）、Ｓ、 ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅ
ｎｅｓ （アルボサイクリン）、Ｓ、ｃｉｎｅｒｏｃｂ
ｒｏｍｏｇｃｎｅｓ （シネ０フイ’ｚ７Ｂ）、Ｓ、ａ
ｌｂｕｓ （アルコマイシン７）、Ｓ。
ｆｅｌｌｅｕｓ’ （アルコマイシン、ピクロマイシン
）、Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ （ランカシジン、ホレリジ７
） 、’ Ｓ、 ｖｉｏｌａ−ＣｅＯｎｌｇｅｒ （ラ
ンカシジン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ （ホレリジン）
、Ｓ 、 ｍａｉ ｚｅｕｓ （インゲラマイシン）、
Ｓ。
）、Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ （ランカシジン、ホレリジ７
） 、’ Ｓ、 ｖｉｏｌａ−ＣｅＯｎｌｇｅｒ （ラ
ンカシジン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ （ホレリジン）
、Ｓ 、 ｍａｉ ｚｅｕｓ （インゲラマイシン）、
Ｓ。
ａｌｉ）ｕｓ ｖａｒ、 ｃｏｉｌｍｙｃｅｔｉｃｕｓ
（コＬ／イマイシ７）、Ｓ。
（コＬ／イマイシ７）、Ｓ。
ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ （アセチ／ｌｚｏイコマ
イシン、ニスピノマイシン）、Ｓ、 ｈｙｇｒｏｓｃｏ
ｐｉｃｕｓ （ツリマイシン、レロマイシン、マリドマ
イシン、タイロシン、カルボマイシン）、Ｓ、 ｇｒｉ
ｓｅｏｓｐｉｒａｌｉｓ （Ｌ／ ０７ （シン）、
Ｓ、Ｉａｖｅｎｄｕｌａｃ （７／ｌ／トガマイシン）
、５゜、 ｒｉｍｏｓｕｓ （＝ ：ｙ−−１−ラ
フイシン）、Ｓ、ｄｅｌｔａｅ （デルタマイシン）
、Ｓ、 ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ、ｅｓｐｉ
ｎｏ −ｍｙｃｅｔｉｃｕｓ （ニスピノマイシン類
） 、Ｓ、ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ（ミデカマイシン
）、５． ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ （７オ０７シジ
ンＤ）、Ｓ、 ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ （メチマイシ
ン）、Ｓ。
イシン、ニスピノマイシン）、Ｓ、 ｈｙｇｒｏｓｃｏ
ｐｉｃｕｓ （ツリマイシン、レロマイシン、マリドマ
イシン、タイロシン、カルボマイシン）、Ｓ、 ｇｒｉ
ｓｅｏｓｐｉｒａｌｉｓ （Ｌ／ ０７ （シン）、
Ｓ、Ｉａｖｅｎｄｕｌａｃ （７／ｌ／トガマイシン）
、５゜、 ｒｉｍｏｓｕｓ （＝ ：ｙ−−１−ラ
フイシン）、Ｓ、ｄｅｌｔａｅ （デルタマイシン）
、Ｓ、 ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ、ｅｓｐｉ
ｎｏ −ｍｙｃｅｔｉｃｕｓ （ニスピノマイシン類
） 、Ｓ、ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ（ミデカマイシン
）、５． ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ （７オ０７シジ
ンＤ）、Ｓ、 ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ （メチマイシ
ン）、Ｓ。
ｒｏｌ’ｌｌθｇｅｎｅｓ （アルコマイシン、シリ
コマイシン類）、Ｓ、ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ （７７Ｃ
１フィシ７ ） 、Ｓ、ｆａｓｃｉ −ｃｕｌｕｓ
（ア？ ロフイシン）、Ｓ、 ｅｒｙｔｂｒｅｕｓ（エ
クス０フイシン類）、Ｓ、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ
（オレアンドマイシン）、Ｓ、ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏ
ｇｅｎｅｓ （オレアンドマイシン）、Ｓ、 ｓｐｉｎ
ｉｃｂｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａｒ、 ｓｕｒａｇａｏ
ｅｎｓｉｓ （クジマイシン類）、Ｓ、 ｋｉｔａｓ
ａｔｏｅｎｓｉｓ （ｏイコマイシン）、Ｓ、 ｎａｒ
ｂｏｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｊｏｓａｍｙｃｅＬｉｃ
ｕｓ （ｏイオマイシンＡ３、ジョサマイシン）、Ｓ、
ａｌｂｏ−ｇｒｉ ５ｅｏｌ ｕｓ （ミコノマイ’ｙ
７ ） 、Ｓ、ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ （チェナマ
イシン）、Ｓ、 ｃｉｒｒａｔｕｓ （シラマイシン）
Ｓ、 ｄｊａｋａｒＬｅｎｓｉｓ （＝ダ７ イ’ｙ
７ ） 、Ｓ、ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ（アンゴラマイ
シン）、Ｓ、ｆｒａｄｉａｅ （クイロジン、ラクテノ
シン、マクロシン）、Ｓ 、 ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉ
ｓ（パンダマイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕ
ｓ （アルコマイシン）、Ｓ、ｈａｌｓｔｅｄｉｉ
（カルボマイシン）、５゜Ｌｅｎｄａｅ （カルボマイ
シン）、Ｓｏｍａｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ （カルボマイ
シン）、Ｓ、 ｔＴｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ （カ
ルボマイシン）、およびＳ、ａｌｂｉｒｅｔｉｃｕｌｉ
（カルボマイシン）。
コマイシン類）、Ｓ、ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ （７７Ｃ
１フィシ７ ） 、Ｓ、ｆａｓｃｉ −ｃｕｌｕｓ
（ア？ ロフイシン）、Ｓ、 ｅｒｙｔｂｒｅｕｓ（エ
クス０フイシン類）、Ｓ、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ
（オレアンドマイシン）、Ｓ、ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏ
ｇｅｎｅｓ （オレアンドマイシン）、Ｓ、 ｓｐｉｎ
ｉｃｂｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａｒ、 ｓｕｒａｇａｏ
ｅｎｓｉｓ （クジマイシン類）、Ｓ、 ｋｉｔａｓ
ａｔｏｅｎｓｉｓ （ｏイコマイシン）、Ｓ、 ｎａｒ
ｂｏｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｊｏｓａｍｙｃｅＬｉｃ
ｕｓ （ｏイオマイシンＡ３、ジョサマイシン）、Ｓ、
ａｌｂｏ−ｇｒｉ ５ｅｏｌ ｕｓ （ミコノマイ’ｙ
７ ） 、Ｓ、ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ （チェナマ
イシン）、Ｓ、 ｃｉｒｒａｔｕｓ （シラマイシン）
Ｓ、 ｄｊａｋａｒＬｅｎｓｉｓ （＝ダ７ イ’ｙ
７ ） 、Ｓ、ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ（アンゴラマイ
シン）、Ｓ、ｆｒａｄｉａｅ （クイロジン、ラクテノ
シン、マクロシン）、Ｓ 、 ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉ
ｓ（パンダマイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕ
ｓ （アルコマイシン）、Ｓ、ｈａｌｓｔｅｄｉｉ
（カルボマイシン）、５゜Ｌｅｎｄａｅ （カルボマイ
シン）、Ｓｏｍａｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ （カルボマイ
シン）、Ｓ、 ｔＴｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ （カ
ルボマイシン）、およびＳ、ａｌｂｉｒｅｔｉｃｕｌｉ
（カルボマイシン）。
β−ラクタム抗生物質を産生じ、本発明暑こ係るベクタ
ーを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例
えば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる： Ｓ
、ｌｉｐｍａｎｉｉ （Ａ １６８８４、ＭＭ４５５０
、ｌｖ１Ｍ１３９０２）、Ｓ、ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕ
ｓ （Ａ１６８８６Ｂ、クラフラン酸）、Ｓ、 ｌａｃ
ｔａｍｄｕｒａｎｓ （セフ ７７（シフ Ｃ）Ｓ、ｇ
ｒｉｓｅｕｓ （セファマイ’ｉ ７ ＡｌＢ ） 、
Ｓ、ｈｙｇｒｏ−ｓｃｏｐｉｃｕｓ （デアセトキシセ
ファロスポリンＣ）、Ｓ、 ｗａａａｙａｍｅｎｓｉｓ
（ＷＳ −３４４２−１） ）、Ｓ、 ｃｈａｒｔｒ
ｃｕｓｉｓ（ＳＦ１６２３）、Ｓ、ｈｅｔｅｒｏｍｏｒ
ｐｈｕｓおよびＳ、ｐａｎａｙ−ｅｎｓｉｓ （Ｃ２
Ｑ８１人） ； Ｓ、 ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ
ＳＳ、 ｆｉｍｂｒｉ −ａｔｕｓ、 Ｓ、ｈａｌｓｔ
ｅｄｉｉ、 Ｓ、 ｒｏｃｈｅｉおよびＳ、ｖｉｒｉｄ
ｏ −ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （セファマイシフＡ、
Ｂ ） ；Ｓ、ｃａｔｔｌｃｙａ（チェナマイシン）
；およびＳ、ｏｌｉｖａｃｅｕｓ ＳＳ。
ーを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例
えば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる： Ｓ
、ｌｉｐｍａｎｉｉ （Ａ １６８８４、ＭＭ４５５０
、ｌｖ１Ｍ１３９０２）、Ｓ、ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕ
ｓ （Ａ１６８８６Ｂ、クラフラン酸）、Ｓ、 ｌａｃ
ｔａｍｄｕｒａｎｓ （セフ ７７（シフ Ｃ）Ｓ、ｇ
ｒｉｓｅｕｓ （セファマイ’ｉ ７ ＡｌＢ ） 、
Ｓ、ｈｙｇｒｏ−ｓｃｏｐｉｃｕｓ （デアセトキシセ
ファロスポリンＣ）、Ｓ、 ｗａａａｙａｍｅｎｓｉｓ
（ＷＳ −３４４２−１） ）、Ｓ、 ｃｈａｒｔｒ
ｃｕｓｉｓ（ＳＦ１６２３）、Ｓ、ｈｅｔｅｒｏｍｏｒ
ｐｈｕｓおよびＳ、ｐａｎａｙ−ｅｎｓｉｓ （Ｃ２
Ｑ８１人） ； Ｓ、 ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ
ＳＳ、 ｆｉｍｂｒｉ −ａｔｕｓ、 Ｓ、ｈａｌｓｔ
ｅｄｉｉ、 Ｓ、 ｒｏｃｈｅｉおよびＳ、ｖｉｒｉｄ
ｏ −ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （セファマイシフＡ、
Ｂ ） ；Ｓ、ｃａｔｔｌｃｙａ（チェナマイシン）
；およびＳ、ｏｌｉｖａｃｅｕｓ ＳＳ。
ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎｓｌＳ、ｆｌａｖｕｓ、 Ｓ、ｆ
ｕｌｖｏｖｉｒｉｃｉｉｓｌＳ、ａ＋°ｇｅ１１−【ｅ
ｏｌｕｓおよびＳ、５ｉｏｙａｅｎｓｉ ｓ （ＭＭ
４５５ ＱおよびＩｖｉＭ１３９０２ ）。
ｕｌｖｏｖｉｒｉｃｉｉｓｌＳ、ａ＋°ｇｅ１１−【ｅ
ｏｌｕｓおよびＳ、５ｉｏｙａｅｎｓｉ ｓ （ＭＭ
４５５ ＱおよびＩｖｉＭ１３９０２ ）。
ポリエーテル抗生物質を産生じ、本発明（こ係るベクタ
ーを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔ
ｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例
えば以、下のような微生物の非制限細胞が含まれる：
Ｓ、 ａｌｂｕｓ （Ａ２０４、Ａ２８６９５Ａおよび
Ｂ、サリノマイシン）、Ｓ 、１１ｙｇｒｏｓｃｏｐｉ
ｃｕｓ （Ａ ２１８、エメリシト、ＤＥ３９３６、Ａ
１２０Ａ、Ａ２８６９５Ａ おヨヒ１５、エテロマイシ
ン、ジョサマイシン）、Ｓ。
ーを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔ
ｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例
えば以、下のような微生物の非制限細胞が含まれる：
Ｓ、 ａｌｂｕｓ （Ａ２０４、Ａ２８６９５Ａおよび
Ｂ、サリノマイシン）、Ｓ 、１１ｙｇｒｏｓｃｏｐｉ
ｃｕｓ （Ａ ２１８、エメリシト、ＤＥ３９３６、Ａ
１２０Ａ、Ａ２８６９５Ａ おヨヒ１５、エテロマイシ
ン、ジョサマイシン）、Ｓ。
ｇｒｉｓｅｕｓ（グリツリキシン）、Ｓ、 ｃｏｎｇｌ
ｏｂａｔｕｓ（イオノマイシン）、Ｓ、 ｅｕｒｏｃｉ
ｄｉｃｕｓ ｖａｒ 、 ａｓｃｅｒｏｃｉｄｉｃｕｓ
（ライド０フイシン）、Ｓ、 Ｉａｓａｌｉｅｎｓｉｓ
（ラサロシド）、Ｓ、 ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ
（ロノマイシン） 、Ｓ＋ｃａｃａｏｉｖａｒ、ａｓｏ
ｅｎｓｉｓ （ラインセリフ ） 、Ｓ、ｃｉｎｎａｍ
ｏｎｅｎｓｉｓ（モネンシン）、Ｓ、 ａｕｒｅｏｆａ
ｃｉｅｎｓ （ナラジン）、Ｓ、 ｇａｌｌｉｎａｒｉ
ｕｓ （ＲＰ３０５０４ ）、Ｓ、ｌｏｎｇｗｏｏｄｅ
ｎｓｉｓ （ラインセリン）、Ｓ、 ｆｌａｖｅｏｌｕ
ｓ （ＣＰ ３８９３６ ）、Ｓ。
ｏｂａｔｕｓ（イオノマイシン）、Ｓ、 ｅｕｒｏｃｉ
ｄｉｃｕｓ ｖａｒ 、 ａｓｃｅｒｏｃｉｄｉｃｕｓ
（ライド０フイシン）、Ｓ、 Ｉａｓａｌｉｅｎｓｉｓ
（ラサロシド）、Ｓ、 ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ
（ロノマイシン） 、Ｓ＋ｃａｃａｏｉｖａｒ、ａｓｏ
ｅｎｓｉｓ （ラインセリフ ） 、Ｓ、ｃｉｎｎａｍ
ｏｎｅｎｓｉｓ（モネンシン）、Ｓ、 ａｕｒｅｏｆａ
ｃｉｅｎｓ （ナラジン）、Ｓ、 ｇａｌｌｉｎａｒｉ
ｕｓ （ＲＰ３０５０４ ）、Ｓ、ｌｏｎｇｗｏｏｄｅ
ｎｓｉｓ （ラインセリン）、Ｓ、 ｆｌａｖｅｏｌｕ
ｓ （ＣＰ ３８９３６ ）、Ｓ。
ｍｕｔａｂｉｌｌｉｓ （Ｓ−１１７４３ａ）、および
Ｓ、 ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒにケリシン）。
Ｓ、 ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒにケリシン）。
グリコペプチド抗生物質を産生じ、本発明に係るベクタ
ーを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株イ５主細胞には、
例えば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる：
Ｓ、 ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓおよびＳ、 ｈａｒａｎｏ
ｍａｃｈｉｅｎｓｉｓ（バンコマイシン）、Ｓ、 ｃａ
ｎｄｉｄｕｓ （Ａ −３５５１２、アホハルシン）、
およびＳ、 ｅｂｕｒｏｓｐｏｒｅｕｓ（ＬＬ −Ａ、
１ｖ１３７４）。
ーを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株イ５主細胞には、
例えば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる：
Ｓ、 ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓおよびＳ、 ｈａｒａｎｏ
ｍａｃｈｉｅｎｓｉｓ（バンコマイシン）、Ｓ、 ｃａ
ｎｄｉｄｕｓ （Ａ −３５５１２、アホハルシン）、
およびＳ、 ｅｂｕｒｏｓｐｏｒｅｕｓ（ＬＬ −Ａ、
１ｖ１３７４）。
本発明に係るベクターを特に有用に使用でき、形質転換
できる、その他の好ましい５ｃｒｃｐＬｏ＋ｎｙｃｅｓ
の非制限菌株宿主細胞には、例えは以下のような微生物
の非制限細胞が含まれる： Ｓ、 ｃｏｅｌｉｃｏｌｏ
ｒ、Ｓ、 ｇｒａｎｕｌｏｒｕｌ〕ｅｒ、 Ｓ、 ｒｏ
ｓｅｏｓｐｏｒｕｓ 、 Ｓ、Ｉ １ｖｉｃｈａｎｓ、
Ｓ。
できる、その他の好ましい５ｃｒｃｐＬｏ＋ｎｙｃｅｓ
の非制限菌株宿主細胞には、例えは以下のような微生物
の非制限細胞が含まれる： Ｓ、 ｃｏｅｌｉｃｏｌｏ
ｒ、Ｓ、 ｇｒａｎｕｌｏｒｕｌ〕ｅｒ、 Ｓ、 ｒｏ
ｓｅｏｓｐｏｒｕｓ 、 Ｓ、Ｉ １ｖｉｃｈａｎｓ、
Ｓ。
ｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ、 Ｓ、 ｅｓｐｉｎｏｓｕｓ
、 Ｓ、 ａｃｒｉｍｙｃｉｎｓ、 Ｓ。
、 Ｓ、 ａｃｒｉｍｙｃｉｎｓ、 Ｓ。
ｇｌａｕｃｅｓｃｃｎｓ、 Ｓ、１）ａｒｖｉｌｉｎ、
Ｓ、ｐｒｉｓｃｉｎａｃｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓ、ｖｉ
ｏｌａｃｅＯｒｕｂｃｒ 、 Ｓ、ｖｉｎａｃｅｕｓ、
Ｓ、 ｖｉｒｇｉｎｉａｅおよびＳ、 ａｚｕｒｃ
ｕｓ 。
Ｓ、ｐｒｉｓｃｉｎａｃｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓ、ｖｉ
ｏｌａｃｅＯｒｕｂｃｒ 、 Ｓ、ｖｉｎａｃｅｕｓ、
Ｓ、 ｖｉｒｇｉｎｉａｅおよびＳ、 ａｚｕｒｃ
ｕｓ 。
」二記の代表的なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞に
加えて、本発明に係るベクターは、例えは以下のような
その他の種類の非制限菌株（・こ有用に使用でき、かつ
細胞中に形質転換できる： Ｂａｃｉｌｌｕｓ、 ５ｔ
ａｐｂｙｌｏ −ｃｏｃｃｕｓｌおよびＳｔｒｅｐｔｏ
ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ 、 Ａｃｔ １ｎｏｐｌ ａｎ
ｅｓ 。
加えて、本発明に係るベクターは、例えは以下のような
その他の種類の非制限菌株（・こ有用に使用でき、かつ
細胞中に形質転換できる： Ｂａｃｉｌｌｕｓ、 ５ｔ
ａｐｂｙｌｏ −ｃｏｃｃｕｓｌおよびＳｔｒｅｐｔｏ
ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ 、 Ａｃｔ １ｎｏｐｌ ａｎ
ｅｓ 。
Ｎ ｏｃａ ｒｄ ｉ ａおよびＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓ
ｐｏｒａを含むＡｃｔ ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ関連菌株
。このように本発明に係るベクターは広範囲に適用可能
であり、有用でかつ数多くの微生物宿主細胞に形質転換
できる。
ｐｏｒａを含むＡｃｔ ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ関連菌株
。このように本発明に係るベクターは広範囲に適用可能
であり、有用でかつ数多くの微生物宿主細胞に形質転換
できる。
本発明の実施態様は全て有用であるが、中でも幾つかの
本発明に係る組換えＤＮＡクローニングベクターおよび
形質転換体がより好ましい。即ち好適なベクターは、プ
ラスミドｐＮＭ １００、ｐ Ｆ Ｊ２０４、ｐ ］’
、Ｊ ２０７、ｐＦＪ２０８、ｐＦＪ１４３、ｐＦＪ
１７０ｐＦＪ２１２、ｐＦＪ２１４、ｐＦＪ２１５およ
びｐＦＪ２２０であり、好適な形質転換体は、５ｔｒｅ
ｐｔｏ＋ｎｙｃｅｓ ａｍｂｏ−ｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ
ＮＭＩ ＯＯｌＳ、 ａｍｌ）ＯｆａＣｉｅｎＳ ７ｐ
ｐ Ｊ ２０４、Ｓ。
本発明に係る組換えＤＮＡクローニングベクターおよび
形質転換体がより好ましい。即ち好適なベクターは、プ
ラスミドｐＮＭ １００、ｐ Ｆ Ｊ２０４、ｐ ］’
、Ｊ ２０７、ｐＦＪ２０８、ｐＦＪ１４３、ｐＦＪ
１７０ｐＦＪ２１２、ｐＦＪ２１４、ｐＦＪ２１５およ
びｐＦＪ２２０であり、好適な形質転換体は、５ｔｒｅ
ｐｔｏ＋ｎｙｃｅｓ ａｍｂｏ−ｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ
ＮＭＩ ＯＯｌＳ、 ａｍｌ）ＯｆａＣｉｅｎＳ ７ｐ
ｐ Ｊ ２０４、Ｓ。
Ｉ １ｖｉｄａｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２０４、 Ｓ、ａ
ｒｒ＋ｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐ ＦＪ ２０７、Ｓ、ａ
ｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ ＦＪ ２０８、Ｓ、ａｍ
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｉ’Ｊ１４３、Ｓ 、 ａ
ｍｂｏｌ、’ａｃ １ｅｎｓ ／Ｉ） ｊ＋’ Ｊ １
７ Ｑ、Ｓ、Ｉ １ｖｉｃｌａｎｓ ／ｐＪ’″Ｊ１７
０、Ｓ 、 ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ
２１２、Ｓ、 ａｍｂｏ−ｆａｃ １ｅｎｓ ／ｐ Ｆ
、ｉ ２１４、Ｓ 、 ａｍｂｏ［ａｃｉｅｎｓ ／
ｐ Ｆ Ｊ ２１５、Ｓ、 ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ｐ Ｆ Ｊ ２２０および１″−、ｃｏｌｉＫ１２Ｈ
Ｂ１０１／ＰＦＪ２２０ である。さらに、これら好
適な群の中でもプラスミドＰＮＭ１００、ｐＦ目４３、
ｐＦＪ１７０、ｐＦＪ２０４、ＰＦＪ２０７ および
ＰＦＪ２０８並びに形質転換体Ｓ、 ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ ／ｐＮＭ １００． Ｓ。
ｒｒ＋ｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐ ＦＪ ２０７、Ｓ、ａ
ｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ ＦＪ ２０８、Ｓ、ａｍ
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｉ’Ｊ１４３、Ｓ 、 ａ
ｍｂｏｌ、’ａｃ １ｅｎｓ ／Ｉ） ｊ＋’ Ｊ １
７ Ｑ、Ｓ、Ｉ １ｖｉｃｌａｎｓ ／ｐＪ’″Ｊ１７
０、Ｓ 、 ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ
２１２、Ｓ、 ａｍｂｏ−ｆａｃ １ｅｎｓ ／ｐ Ｆ
、ｉ ２１４、Ｓ 、 ａｍｂｏ［ａｃｉｅｎｓ ／
ｐ Ｆ Ｊ ２１５、Ｓ、 ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ｐ Ｆ Ｊ ２２０および１″−、ｃｏｌｉＫ１２Ｈ
Ｂ１０１／ＰＦＪ２２０ である。さらに、これら好
適な群の中でもプラスミドＰＮＭ１００、ｐＦ目４３、
ｐＦＪ１７０、ｐＦＪ２０４、ＰＦＪ２０７ および
ＰＦＪ２０８並びに形質転換体Ｓ、 ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ ／ｐＮＭ １００． Ｓ。
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ １４３、Ｓ、 ａｍ
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ １７０、Ｓ、 １
ｉｖｉｄａｎｓ ／ｐＦ Ｊ １７ ＱｌＳ、ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ ／ｐＦ Ｊ２０４、Ｓ 、 ａｍｂｏ
ｆａｃｉ ｅｎｓ ／Ｉ） Ｆ Ｊ ２０７およびＳ、
ａｍｂｏ−ｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２０８ が
最も好ましい。
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ １７０、Ｓ、 １
ｉｖｉｄａｎｓ ／ｐＦ Ｊ １７ ＱｌＳ、ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ ／ｐＦ Ｊ２０４、Ｓ 、 ａｍｂｏ
ｆａｃｉ ｅｎｓ ／Ｉ） Ｆ Ｊ ２０７およびＳ、
ａｍｂｏ−ｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２０８ が
最も好ましい。
本発明に係る組換え］） Ｎ Ａクローニングベクター
および形質転換体は、広範囲な効用を有し、５ｔｒｅｐ
ｃωｎｙｃｅｓおよび関連微生物に使用するための好適
なりローニング媒体の必要性を瀾たずものである。その
上、非形質転換宿主細胞（こは有毒な抗生物質に対する
耐性を付与する本発明に係るベクターの能力は、同時に
、形質転換体を選択Ｊる機能的手段を提供することとな
る。このことは、ベクター１） Ｎ Ａを獲得した特定
の細胞を決定し選択することが実際上必要であるが故（
こ重要である。
および形質転換体は、広範囲な効用を有し、５ｔｒｅｐ
ｃωｎｙｃｅｓおよび関連微生物に使用するための好適
なりローニング媒体の必要性を瀾たずものである。その
上、非形質転換宿主細胞（こは有毒な抗生物質に対する
耐性を付与する本発明に係るベクターの能力は、同時に
、形質転換体を選択Ｊる機能的手段を提供することとな
る。このことは、ベクター１） Ｎ Ａを獲得した特定
の細胞を決定し選択することが実際上必要であるが故（
こ重要である。
その存在をｉ＋１８ｇするための機能的な試験法のない
他のＤ Ｎ Ａセグメントを、さらに本発明に係るベク
ター上に挿入することもでき、この非選択性ＤＮ Ａを
含有する形質転換体を、適当な抗生物質による選択によ
り分離できる。このような非選択性Ｄ Ｎ Ａセグメン
トは、プラスミドの機能と複製に必要な領域の内部以外
ならどのザイトへも挿入することかできる。これには、
抗生物質修飾酵素を指定する遺伝子およびあらゆる型の
調節遺伝子か含まれるか、これらに限定される訳ではな
い。
他のＤ Ｎ Ａセグメントを、さらに本発明に係るベク
ター上に挿入することもでき、この非選択性ＤＮ Ａを
含有する形質転換体を、適当な抗生物質による選択によ
り分離できる。このような非選択性Ｄ Ｎ Ａセグメン
トは、プラスミドの機能と複製に必要な領域の内部以外
ならどのザイトへも挿入することかできる。これには、
抗生物質修飾酵素を指定する遺伝子およびあらゆる型の
調節遺伝子か含まれるか、これらに限定される訳ではな
い。
さらに詳細には、ある遺伝子を含イイする非選択性ＤＮ
Ａセグメントは、例えば、例示プラスミドＰＦＪ２０８
＋７）、〜１．６ ｋｂ ＢａｍＨＩ 耐性付与フ
ラグメントの中央のＳａｌ ：［制限ザイト（こ挿入さ
れる。かかる挿入によってチオストレプトン耐性遺伝子
が不活性化されるので、組換えプラスミドを含む形質転
換体を容易に同定することができる。即ち、この場合ま
ずネオマイシン耐性によって選択し、次にチオストレプ
トン耐性でないネオマイシン耐性形質転換体を同定する
。同様に、所望の１〕ＮＡセグメントを例えば〜３．４
ｋｂ １３ａｍＨＩ耐性付与フラグメントの内側の１
３ ａｍ ）−Ｉ Ｉ制限ザイトに挿入すれば、ネオマ
イシン耐性遺伝子が不活性化する。従って、この組換え
プラスミドを持つ形質転換体もまた、まずチオストレプ
トン耐性て選択し、次にネオマイシン１１ｍ１性でない
チオストレプトン耐性形質転換体を同定することによっ
て、容易に同定できる。エリスロマイシン耐性遺伝子へ
の挿入不活性化を含む同様の選択もまた可能である。以
上のように、Ｓｔｒｅｐｃｏｍｙｃｃｓおよび関連細胞
における抗生物質耐性による選択能力によって、目的と
する特定の非選択性ＤＮＡを含有するごく少数の細胞を
効率的に分離できるようになる。
Ａセグメントは、例えば、例示プラスミドＰＦＪ２０８
＋７）、〜１．６ ｋｂ ＢａｍＨＩ 耐性付与フ
ラグメントの中央のＳａｌ ：［制限ザイト（こ挿入さ
れる。かかる挿入によってチオストレプトン耐性遺伝子
が不活性化されるので、組換えプラスミドを含む形質転
換体を容易に同定することができる。即ち、この場合ま
ずネオマイシン耐性によって選択し、次にチオストレプ
トン耐性でないネオマイシン耐性形質転換体を同定する
。同様に、所望の１〕ＮＡセグメントを例えば〜３．４
ｋｂ １３ａｍＨＩ耐性付与フラグメントの内側の１
３ ａｍ ）−Ｉ Ｉ制限ザイトに挿入すれば、ネオマ
イシン耐性遺伝子が不活性化する。従って、この組換え
プラスミドを持つ形質転換体もまた、まずチオストレプ
トン耐性て選択し、次にネオマイシン１１ｍ１性でない
チオストレプトン耐性形質転換体を同定することによっ
て、容易に同定できる。エリスロマイシン耐性遺伝子へ
の挿入不活性化を含む同様の選択もまた可能である。以
上のように、Ｓｔｒｅｐｃｏｍｙｃｃｓおよび関連細胞
における抗生物質耐性による選択能力によって、目的と
する特定の非選択性ＤＮＡを含有するごく少数の細胞を
効率的に分離できるようになる。
」一連の抗生物質耐性についての機能試験は、さらに、
制御（コン［・ロール）因子として作用し個々の抗生物
質耐性遺伝子の発現を支配するＤＮＡセグメントの位置
決定にも使用される。プロモーター、アテニュエーター
、リプレッサ−、インテユーサ−、リポゾーム結合サイ
ト等を含む（これらに限定される訳ではない）上記セフ
メンｌ−は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓおよび関連微生
物の細胞におけるイｍの遺伝子の発現の制御に使用され
る。
制御（コン［・ロール）因子として作用し個々の抗生物
質耐性遺伝子の発現を支配するＤＮＡセグメントの位置
決定にも使用される。プロモーター、アテニュエーター
、リプレッサ−、インテユーサ−、リポゾーム結合サイ
ト等を含む（これらに限定される訳ではない）上記セフ
メンｌ−は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓおよび関連微生
物の細胞におけるイｍの遺伝子の発現の制御に使用され
る。
チオストレプトン、ネオマイシンおよびエリスロマイシ
ンの耐性を付与する本発明に係るベクターは、結合した
Ｄ Ｎ Ａセフメン１へかイｄ主細胞中で幾世代にも渡
って安定に維持されることを保証すルタメにも有用であ
る。チオストレプトン、エリスロマイシンまたはネオマ
イシン耐性付与フラクメントと共有結合し、ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓまたは関連微生物の細胞中で増殖するこ
れら遺伝子あるいはＩ）ＮＡフラクメントは、非形質転
換細胞にとっては有４’ａｍ度のチオストレプ［・ン、
エリスロマイシンまたはネオマイシンにこの形質転換体
をさらすことによって維持できる。そうすることにより
、ベクターを失い従って共有結合したＤ Ｎ−Ａをも失
った形質転換体は生育できす、培地から除去される。以
」二のようにして本発明に係るベクターは、所望のいか
なるＤ Ｎ Ａ配列をも安定化し維持する。
ンの耐性を付与する本発明に係るベクターは、結合した
Ｄ Ｎ Ａセフメン１へかイｄ主細胞中で幾世代にも渡
って安定に維持されることを保証すルタメにも有用であ
る。チオストレプトン、エリスロマイシンまたはネオマ
イシン耐性付与フラクメントと共有結合し、ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓまたは関連微生物の細胞中で増殖するこ
れら遺伝子あるいはＩ）ＮＡフラクメントは、非形質転
換細胞にとっては有４’ａｍ度のチオストレプ［・ン、
エリスロマイシンまたはネオマイシンにこの形質転換体
をさらすことによって維持できる。そうすることにより
、ベクターを失い従って共有結合したＤ Ｎ−Ａをも失
った形質転換体は生育できす、培地から除去される。以
」二のようにして本発明に係るベクターは、所望のいか
なるＤ Ｎ Ａ配列をも安定化し維持する。
ことができる。
本発明に係るクローニンクベクターおよび形質転換体に
よって、Ｓｃｒｅｐｃｏｍｙｃｅｓおよび関連細胞にお
いて現在産生されている数多くの生成物の収量を向」ニ
させる遺伝子をクローン１−ることかできる。こうした
生成物の例として、ストレプトマイシン、タイロシン、
セファロスポリン頒、アクタプラニン、ナラジン、モネ
ンシン、アブラマイシン、トブラマイシン、エリスロマ
イシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等が
挙けられるが、これらに限定される訳ではない。さらに
本発明は、商業的に重要な蛋白、例えばヒトインシュリ
ン、ヒトプロインシュリン、クルカコン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン、中成長ホルモン等；商業的に
重要な工程および物質につながる代謝経路における酵素
機能；まだ（］遺伝子の発現を改善する制御因子、を暗
号化しているＤ Ｎ Ａ配列をクローンし、特徴付け、
再構成するのに有用な選択可能なベクターを提供する。
よって、Ｓｃｒｅｐｃｏｍｙｃｅｓおよび関連細胞にお
いて現在産生されている数多くの生成物の収量を向」ニ
させる遺伝子をクローン１−ることかできる。こうした
生成物の例として、ストレプトマイシン、タイロシン、
セファロスポリン頒、アクタプラニン、ナラジン、モネ
ンシン、アブラマイシン、トブラマイシン、エリスロマ
イシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等が
挙けられるが、これらに限定される訳ではない。さらに
本発明は、商業的に重要な蛋白、例えばヒトインシュリ
ン、ヒトプロインシュリン、クルカコン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン、中成長ホルモン等；商業的に
重要な工程および物質につながる代謝経路における酵素
機能；まだ（］遺伝子の発現を改善する制御因子、を暗
号化しているＤ Ｎ Ａ配列をクローンし、特徴付け、
再構成するのに有用な選択可能なベクターを提供する。
これらの望ましいＤ Ｎ Ａ 配列とは、例えばストレ
プトマイシン、セファロスポリン、タイロシン、アクタ
プラニン、ナラジン、モネンシン、アブラマイシン、ト
ブラマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコー
ルおよびエリスロマイシン誘導体等の誘導抗生物質の合
成を触媒する酵素、または抗生物質もしくは他の生成物
の生合成を仲介し増強させる酵素を暗号化しているＤＮ
Ａを含むが、これらに限定される訳ではない。このよう
にＤＮＡセグメントの」１を人および安定化か可能なこ
とから、５ｃｒｅｐｔ叶ｍｙｃｅｓおよび関連微生物の
産生ずる抗生物質の収量と利用性を増加させることがで
きる。
プトマイシン、セファロスポリン、タイロシン、アクタ
プラニン、ナラジン、モネンシン、アブラマイシン、ト
ブラマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコー
ルおよびエリスロマイシン誘導体等の誘導抗生物質の合
成を触媒する酵素、または抗生物質もしくは他の生成物
の生合成を仲介し増強させる酵素を暗号化しているＤＮ
Ａを含むが、これらに限定される訳ではない。このよう
にＤＮＡセグメントの」１を人および安定化か可能なこ
とから、５ｃｒｅｐｔ叶ｍｙｃｅｓおよび関連微生物の
産生ずる抗生物質の収量と利用性を増加させることがで
きる。
プラスミドｐ ＮＭ １００およびｐＦＪ、１４３ の
供給源となるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｇｉｎ
ｉａｅ ／ｐＮＭ Ｉ ＯＱおよヒＳ、 ａｍｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ ／ ｐ Ｆ Ｊ １４３は、幾つかの異な
る培地のどれかを用いて種々の方法で培養できる。
供給源となるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｇｉｎ
ｉａｅ ／ｐＮＭ Ｉ ＯＱおよヒＳ、 ａｍｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ ／ ｐ Ｆ Ｊ １４３は、幾つかの異な
る培地のどれかを用いて種々の方法で培養できる。
培地中の好ましい炭水化物源としては、例えば糖蜜、グ
ルコース、テキストリンおよびクリセロ−ルが含まれ、
窒素源としては例えば大豆粉、アミノ酸混合物およびペ
プトン類が含まれる。栄養無機塩類もまた添加され、こ
れにはナトリウム、カリウム、アンモニア、カルシウム
、リン酸、塩酸、硫酸等のイオンを放出し得る通常の塩
類が含まれる。他の微生物の発育と増殖に必要であるよ
うに、必須微量元素もまた添加する。こうした微量元素
は、通常、他の培地成分の添加に付随する不純物の形で
供給される。
ルコース、テキストリンおよびクリセロ−ルが含まれ、
窒素源としては例えば大豆粉、アミノ酸混合物およびペ
プトン類が含まれる。栄養無機塩類もまた添加され、こ
れにはナトリウム、カリウム、アンモニア、カルシウム
、リン酸、塩酸、硫酸等のイオンを放出し得る通常の塩
類が含まれる。他の微生物の発育と増殖に必要であるよ
うに、必須微量元素もまた添加する。こうした微量元素
は、通常、他の培地成分の添加に付随する不純物の形で
供給される。
５ｔｒｃｐＬｏ＋ｎｙｃｃｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｅ／ｐ
ＮＭ Ｉ Ｑ ＱおよびＳ。
ＮＭ Ｉ Ｑ ＱおよびＳ。
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ １４３ は、
約５〜９という比較的広いｐＨ領域に渡って約１５°Ｃ
〜４０℃の温度範囲において好気的培養条件下に発育す
る。しかしながらプラスミドＰＮＭ１００およびｐＦＪ
１４３を最大量生産するため（こは、培地のｐＨを約７
２で培養を開始し、約３０℃の温度に維持するのが望ま
しい。上記の条件でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒ
ｇｉｎｉａｅ／ｐ、ＮＭ Ｉ Ｑ ＯおよびＳ 、 ａ
ｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ １４３を培養す
れは、プラスミドＰＮＭ １００およびｐｉ”Ｊ１４３
を常套の技術によって分離することができる貯蔵体とし
ての細胞か得られる。
約５〜９という比較的広いｐＨ領域に渡って約１５°Ｃ
〜４０℃の温度範囲において好気的培養条件下に発育す
る。しかしながらプラスミドＰＮＭ１００およびｐＦＪ
１４３を最大量生産するため（こは、培地のｐＨを約７
２で培養を開始し、約３０℃の温度に維持するのが望ま
しい。上記の条件でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒ
ｇｉｎｉａｅ／ｐ、ＮＭ Ｉ Ｑ ＯおよびＳ 、 ａ
ｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ １４３を培養す
れは、プラスミドＰＮＭ １００およびｐｉ”Ｊ１４３
を常套の技術によって分離することができる貯蔵体とし
ての細胞か得られる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の説明および本発明を構成する実際の手法を適宜
述べた。
述べた。
実施例１ プラスミドＰＮＭ １００の分離Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｅ ／ｐＮＭ Ｉ
Ｑ Ｑ （Ｎ ＲＲＬ１５１５６）の栄養接種物を、脱
イオン水１１当り３５ｇの滅菌トリブチカーゼ大豆フロ
ス５０ｍ！中、液中好気的条件下に発育させることによ
り、常法のごとく調製する。
ｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｅ ／ｐＮＭ Ｉ
Ｑ Ｑ （Ｎ ＲＲＬ１５１５６）の栄養接種物を、脱
イオン水１１当り３５ｇの滅菌トリブチカーゼ大豆フロ
ス５０ｍ！中、液中好気的条件下に発育させることによ
り、常法のごとく調製する。
米トリブチカーゼ犬豆７” ｏ スはＤｉｆｃｏ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈｉｇ
ａｎ在）より入手。
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈｉｇ
ａｎ在）より入手。
このトリブチカーゼ大豆ブロス接種物を３０℃で４８時
間インキュベートする。インキュベートした接種物約Ｉ
Ｑｍ６を５００ ｍｌの滅菌ブロスに移し、３０℃で、
約２０時間インキュベートする。
間インキュベートする。インキュベートした接種物約Ｉ
Ｑｍ６を５００ ｍｌの滅菌ブロスに移し、３０℃で、
約２０時間インキュベートする。
ｐＨは調節しない。インキュベーション後のＳｔｒｅｐ
Ｌｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｃ ／ｐＮＭ １０
０細胞は、収穫し、引き続きプラスミドＤＮＡを分離で
きる状態をこある。
Ｌｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｃ ／ｐＮＭ １０
０細胞は、収穫し、引き続きプラスミドＤＮＡを分離で
きる状態をこある。
ｉ３．プラスミドの分離
約１０ｇ（？！型重量のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖ
ｉｒｇｉｎｉａｅ／ｐＮＩＶｉｌｏｏの細胞を遠心沈降
（１０分間、５℃、１０、ＯＯＯｒＰｍ ）により収穫
する。この細胞を組織磨砕器を用いてホモゲナイズし、
Ｔ Ｅ Ｓ緩衝液（０，０５Ｍトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン〔トリス〕、０．００５ＭのＥ Ｄ
ＴＡ 、および０．０５Ｎ１へａｃｔＳｐＨ８，０）中
で洗浄し、２５％シュクロースを含′０′１”ｌｉ Ｓ
緩衝液中に懸濁する。２０ｍ１の’ｒＥｓ−２５％シュ
クロース緩衝液中のリゾチーム約１２０２〃９を添加後
、この懸濁液を３５〜３７０Ｃで約２０分間インキュベ
ートし、次いで０２５ＭのＥ Ｄ Ｔ Ａ （ｐｉ（８
，０） ４０ｍ６を添加して、再度３５℃で１０分間イ
ンキュベートする。引き続き゛ｒＥ緩衝液（０，ＯＬＭ
ｌ−リス、０．００１ＭのＥ Ｄ Ｔ Ａ 、 ｐＦ
ｉ８．０）中の５％ＳＤＳ （ドデシル硫酸ナトリウム
）約４Ｑｄを加え、得られた混合物を再び３５〜３７℃
で２０分間インキュベートし、脱イオン水中の５ Ｍ
Ｎａｃ＋約５Ｑｍｊ！を加える。この混合物を拐二拌し
、水浴上に４時間保った後、遠心沈降させる（３０分間
、４℃、１０，０ＯＯｒＰＩｎ ） 、脱イオン水中の
４２％ポリエチレングリコール約、３１３容量をこのＮ
ａＣｌ上澄液に加え、得られた混合物を４°Ｃで約１８
時間冷却する。Ｉ） Ｎ Ａの沈殿を遠心沈降（５分間
、４℃、３０００ｒＰｍ）により集め、Ｔ Ｉ！、 Ｓ
緩衝液（ｐＨ８，０） に溶解する。塩化セシウムお
よびエチジウムクロリド勾配法を使って遠心沈降（４０
時間、１５℃、３５，０ＯＯｒＰＩｎ ）すると、ＤＮ
Ａは２個の良好に識別できる／＼ベンド分かれた。低い
方のバンドが所望のプラスミドＰ工〜Ｍ１００ を構
成していた。別法として、塩化セシウム４．１４ ｇを
Ｓ ＴＥ （ｌ Ｑ ｍＭ、 ｌ−リフ、 ｆ−ＩＣＩ
、 ｐＨ８、ｌＱｍＭＮａｃＩ １ｍＭのＥ Ｄ
−ｉ’ Ａ 、 ｐＨ８） １．８４ｍｌおよびＥＤＴ
Ａ（，２５Ｍ、ＰＨ８）、５ｍｌこ溶解してもよい。Ｄ
Ｎ Ａ 懸濁成約１ ｍｌおよびエチジウム７’ ｏ
ミド（５ｍｇ ／ ｍｌ ） 、 ８ｍｌを添加すると
、塩化セシウム１．６ Ｑ ／ ｍｌおよびエチジウム
プロミド８００μｑ ７ｍｌの勾配５． ｌ ｍｅか生
成する。Ｂｅｃｋｍａｎ■−１６５のことき垂直ロータ
ーを備えた超遠心器（こよる遠心沈降（５時曲、２０℃
、６０．ＯＯＯｒｐｍ ）後、急（こ停止させず〜１．
３時間かけて減速すると、良好に識別できる）＼ンドを
得る。低い方の／ベンドか所望のプラスミドｐＮＭ１０
０を構成する。常套の操作に従ってプラスミドのノ＼ン
ドを分離し、イソアミルアルコールで２回洗浄し、−ｒ
Ｅ緩衝液（ｐＨｓ、ｏ ）で透析し、エタノール沈殿
（こかけた。以上のようにして分離したプラスミドｐＮ
Ｍ１００ の１）ＮＡを一１’ Ｅ緩衝液（ｐＨ８，０
）、 ４ ｍｌ！に溶解し、貯蔵のため一２０℃で凍結
させた。
ｉｒｇｉｎｉａｅ／ｐＮＩＶｉｌｏｏの細胞を遠心沈降
（１０分間、５℃、１０、ＯＯＯｒＰｍ ）により収穫
する。この細胞を組織磨砕器を用いてホモゲナイズし、
Ｔ Ｅ Ｓ緩衝液（０，０５Ｍトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン〔トリス〕、０．００５ＭのＥ Ｄ
ＴＡ 、および０．０５Ｎ１へａｃｔＳｐＨ８，０）中
で洗浄し、２５％シュクロースを含′０′１”ｌｉ Ｓ
緩衝液中に懸濁する。２０ｍ１の’ｒＥｓ−２５％シュ
クロース緩衝液中のリゾチーム約１２０２〃９を添加後
、この懸濁液を３５〜３７０Ｃで約２０分間インキュベ
ートし、次いで０２５ＭのＥ Ｄ Ｔ Ａ （ｐｉ（８
，０） ４０ｍ６を添加して、再度３５℃で１０分間イ
ンキュベートする。引き続き゛ｒＥ緩衝液（０，ＯＬＭ
ｌ−リス、０．００１ＭのＥ Ｄ Ｔ Ａ 、 ｐＦ
ｉ８．０）中の５％ＳＤＳ （ドデシル硫酸ナトリウム
）約４Ｑｄを加え、得られた混合物を再び３５〜３７℃
で２０分間インキュベートし、脱イオン水中の５ Ｍ
Ｎａｃ＋約５Ｑｍｊ！を加える。この混合物を拐二拌し
、水浴上に４時間保った後、遠心沈降させる（３０分間
、４℃、１０，０ＯＯｒＰＩｎ ） 、脱イオン水中の
４２％ポリエチレングリコール約、３１３容量をこのＮ
ａＣｌ上澄液に加え、得られた混合物を４°Ｃで約１８
時間冷却する。Ｉ） Ｎ Ａの沈殿を遠心沈降（５分間
、４℃、３０００ｒＰｍ）により集め、Ｔ Ｉ！、 Ｓ
緩衝液（ｐＨ８，０） に溶解する。塩化セシウムお
よびエチジウムクロリド勾配法を使って遠心沈降（４０
時間、１５℃、３５，０ＯＯｒＰＩｎ ）すると、ＤＮ
Ａは２個の良好に識別できる／＼ベンド分かれた。低い
方のバンドが所望のプラスミドＰ工〜Ｍ１００ を構
成していた。別法として、塩化セシウム４．１４ ｇを
Ｓ ＴＥ （ｌ Ｑ ｍＭ、 ｌ−リフ、 ｆ−ＩＣＩ
、 ｐＨ８、ｌＱｍＭＮａｃＩ １ｍＭのＥ Ｄ
−ｉ’ Ａ 、 ｐＨ８） １．８４ｍｌおよびＥＤＴ
Ａ（，２５Ｍ、ＰＨ８）、５ｍｌこ溶解してもよい。Ｄ
Ｎ Ａ 懸濁成約１ ｍｌおよびエチジウム７’ ｏ
ミド（５ｍｇ ／ ｍｌ ） 、 ８ｍｌを添加すると
、塩化セシウム１．６ Ｑ ／ ｍｌおよびエチジウム
プロミド８００μｑ ７ｍｌの勾配５． ｌ ｍｅか生
成する。Ｂｅｃｋｍａｎ■−１６５のことき垂直ロータ
ーを備えた超遠心器（こよる遠心沈降（５時曲、２０℃
、６０．ＯＯＯｒｐｍ ）後、急（こ停止させず〜１．
３時間かけて減速すると、良好に識別できる）＼ンドを
得る。低い方の／ベンドか所望のプラスミドｐＮＭ１０
０を構成する。常套の操作に従ってプラスミドのノ＼ン
ドを分離し、イソアミルアルコールで２回洗浄し、−ｒ
Ｅ緩衝液（ｐＨｓ、ｏ ）で透析し、エタノール沈殿
（こかけた。以上のようにして分離したプラスミドｐＮ
Ｍ１００ の１）ＮＡを一１’ Ｅ緩衝液（ｐＨ８，０
）、 ４ ｍｌ！に溶解し、貯蔵のため一２０℃で凍結
させた。
実施例２ プラスミドＰＬＲ２の組立てＡ、プラスミド
ｐＩＪ６のＨｉｎｄ ＪＩＩ消化プラスミドｐＩＪ６の
Ｉ） Ｎ Ａ （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９８０、Ｎａ
ｔｕｒｅ、２８６：５２５Ｌこ開示）約２０μＩ！ （
２０μｇ）、ＢＳＡ （牛血清アルフミン、１ ｍｙ
／ ｍｌ！ ）や ５μで、水１９ μｌ、山ｎｄ■制限酵素 （３Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ 単位を含Ｗ’）
１μｌおよび反応※（ ミックス ５μｌを、３７℃で２時間インキュベート
する。４ Ｍの酢酸アンモニウム約５０μｌおよび９５
％エタノール２００μｌを添加して反応を停止させる。
ｐＩＪ６のＨｉｎｄ ＪＩＩ消化プラスミドｐＩＪ６の
Ｉ） Ｎ Ａ （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９８０、Ｎａ
ｔｕｒｅ、２８６：５２５Ｌこ開示）約２０μＩ！ （
２０μｇ）、ＢＳＡ （牛血清アルフミン、１ ｍｙ
／ ｍｌ！ ）や ５μで、水１９ μｌ、山ｎｄ■制限酵素 （３Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ 単位を含Ｗ’）
１μｌおよび反応※（ ミックス ５μｌを、３７℃で２時間インキュベート
する。４ Ｍの酢酸アンモニウム約５０μｌおよび９５
％エタノール２００μｌを添加して反応を停止させる。
得られたＩ） Ｎ Ａ沈殿を７０％エタノールで２回洗
浄し、減圧下で乾燥し、”ｔ−Ｅ緩衝液２０μｌに懸濁
後、貯蔵のため一２０℃で凍結させた。
浄し、減圧下で乾燥し、”ｔ−Ｅ緩衝液２０μｌに懸濁
後、貯蔵のため一２０℃で凍結させた。
母制限酵素は以下の供給源より入手できる：Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ、、 Ｉｎｃ、
（３２丁ｏｚｅｒ ＲｏａｄｌＢｅｖｅｒｌｙ、１ｖｌ
ａｓｓａｃ］１ｕｓｅＬｔｓ Ｑ １９ ｌ ５在）、
１３ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂ ｉｏ
ｃｂｅｍｉｃａｌ ｓ （７９４ｌ ＣａｓＬｌｅｗａ
ｙ ＤｒｉｖｅＩｎｄｉａｎａｐｏｌ ｉｓ 、 Ｉｎ
ｄｉａｎａ ４６２５０在）、およびＢｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅ５ｅａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ
、（Ｐ、０．Ｂｏｘ ５７７、Ｇａｉｔｈｃｒｂｕｒｇ
、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０’７６０在）。
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ、、 Ｉｎｃ、
（３２丁ｏｚｅｒ ＲｏａｄｌＢｅｖｅｒｌｙ、１ｖｌ
ａｓｓａｃ］１ｕｓｅＬｔｓ Ｑ １９ ｌ ５在）、
１３ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂ ｉｏ
ｃｂｅｍｉｃａｌ ｓ （７９４ｌ ＣａｓＬｌｅｗａ
ｙ ＤｒｉｖｅＩｎｄｉａｎａｐｏｌ ｉｓ 、 Ｉｎ
ｄｉａｎａ ４６２５０在）、およびＢｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅ５ｅａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ
、（Ｐ、０．Ｂｏｘ ５７７、Ｇａｉｔｈｃｒｂｕｒｇ
、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０’７６０在）。
霧出ｎｃｉ ＩＩＩ制限酵素用の反応ミックスは以下の
成分より調製した。
成分より調製した。
６Ｑ Ｑ ｍＭ ＮａＣＪ
１０□ｍ１ｖｉｌ−リス塩酸（ｐＨ７，９）７０ｍＭ
ＭｇＣ，ｇ２ １ＱｍＭ ジチオトレイトール Ｂ、プラスミドｐＢＲ３２２の）−１ｉｎｄ Ｉｆｆ消
化プラスミドｐＢＲ３２２のｌ） Ｎ Ａ約８μＪ （
４μｌ）、ｌＸ応ミ’７ クス５ Ａ（３，ＢＳＡ（１
〜／ｍｅ） ５ ｐｌ、水３１μｌおよび１４ｉｎｄ
］ｌ［毎ｊｌｐ艮酔素１ ｐｌ を３７℃で２時間イ
ンキュベートする。６０℃で１０分間インキュベートす
ること番こより反応を停止させた後、４Ｎ１の酢敏アン
モニウム約５０ｔｔｅおよび９５％エタノール２００μ
ｌを添加する。得られたｏ Ｎ Ａ沈殿を７０％エタノ
ールで２回洗浄し、減圧乾燥し、水４５μｌに懸濁させ
る。
ＭｇＣ，ｇ２ １ＱｍＭ ジチオトレイトール Ｂ、プラスミドｐＢＲ３２２の）−１ｉｎｄ Ｉｆｆ消
化プラスミドｐＢＲ３２２のｌ） Ｎ Ａ約８μＪ （
４μｌ）、ｌＸ応ミ’７ クス５ Ａ（３，ＢＳＡ（１
〜／ｍｅ） ５ ｐｌ、水３１μｌおよび１４ｉｎｄ
］ｌ［毎ｊｌｐ艮酔素１ ｐｌ を３７℃で２時間イ
ンキュベートする。６０℃で１０分間インキュベートす
ること番こより反応を停止させた後、４Ｎ１の酢敏アン
モニウム約５０ｔｔｅおよび９５％エタノール２００μ
ｌを添加する。得られたｏ Ｎ Ａ沈殿を７０％エタノ
ールで２回洗浄し、減圧乾燥し、水４５μｌに懸濁させ
る。
Ｈｉｎｄｌｌｌ、処理プラスミドｐＩＪ６ （実施例２
Ａで調製）約２０ μｌ 、Ｉ−（ｉｎｄ ｍ処理プラ
スミドｐＢＲ３２２（実施例２Ｂで調製）２０μｚ、
ＢＳＡ （ｉ １ｒｒｙ／、※ ｍｊ！ ） ５ ｆｉ１３ 、’ｆ：”４ＤＮＡ リガ
ーセ １μＥおよびライゲーションミックス※※５μｌ
を１６℃で４時間インキュベートスる。４Ｍの酢酸アン
モニ’７ム約５０μｌおよび９５％エタノール２００μ
ｌを加えて反応を停止させる。得られたＤＮＡ沈殿を７
０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液
に懸濁する。この懸濁ＤＮＡは所望のプラスミドＰＬＲ
２を構成していた。
Ａで調製）約２０ μｌ 、Ｉ−（ｉｎｄ ｍ処理プラ
スミドｐＢＲ３２２（実施例２Ｂで調製）２０μｚ、
ＢＳＡ （ｉ １ｒｒｙ／、※ ｍｊ！ ） ５ ｆｉ１３ 、’ｆ：”４ＤＮＡ リガ
ーセ １μＥおよびライゲーションミックス※※５μｌ
を１６℃で４時間インキュベートスる。４Ｍの酢酸アン
モニ’７ム約５０μｌおよび９５％エタノール２００μ
ｌを加えて反応を停止させる。得られたＤＮＡ沈殿を７
０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液
に懸濁する。この懸濁ＤＮＡは所望のプラスミドＰＬＲ
２を構成していた。
※１．’ ４１） Ｎ Ａ ＩＪガーゼは以下の供給源
より入手できる： Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｄ Ｂｉｏ Ｌ
ａｂｓ、、 Ｉｎｃ、 （３２−１”ｏｚｅｒＲｄ、
ＢｅｖｃｒｌｙｌＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０１９
１５在）※※ライゲーションミックスは以下の成分より
ｓ周製した。
より入手できる： Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｄ Ｂｉｏ Ｌ
ａｂｓ、、 Ｉｎｃ、 （３２−１”ｏｚｅｒＲｄ、
ＢｅｖｃｒｌｙｌＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０１９
１５在）※※ライゲーションミックスは以下の成分より
ｓ周製した。
５００ｍＭトリスＨ（Ｊ４（ＰＨ７８）２Ｑ□ｍＭジチ
オトレイトール １００ ｍＭ ＭｇＣｌ２ １ Ｑ ｍ Ｍ Ａ −１−、Ｐ 実施例３ Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２８１３１０１．
／ＰＬＲ２の組み立て コンピテントな凍結Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ″＋ｌＢ１
０１細胞（Ｂｏｌ １ｖａｒ等、１ｇ７７、Ｇｅｎｅ、
２ ： ７５〜９３ ）約１０ｍ１を遠心にかけてペ
レット化し、０．０１Ｍ塩化ナトリウム約ＩＱｍ／に）
巳濁する。次いでこの細胞を再びペレット化し、０．０
３Ｍの塩化カルシウム溶液約１０ｍ１に再懸濁し、氷上
で２０分間インキュベートした後再度ペレット化し、最
後に０．０３Ｍの塩化カルシウム溶液１．２５ ｍｌに
）圀濁する。得られた細胞懸濁液は、次に行なう形質転
換（こ対シてコンピテントである。
オトレイトール １００ ｍＭ ＭｇＣｌ２ １ Ｑ ｍ Ｍ Ａ −１−、Ｐ 実施例３ Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２８１３１０１．
／ＰＬＲ２の組み立て コンピテントな凍結Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ″＋ｌＢ１
０１細胞（Ｂｏｌ １ｖａｒ等、１ｇ７７、Ｇｅｎｅ、
２ ： ７５〜９３ ）約１０ｍ１を遠心にかけてペ
レット化し、０．０１Ｍ塩化ナトリウム約ＩＱｍ／に）
巳濁する。次いでこの細胞を再びペレット化し、０．０
３Ｍの塩化カルシウム溶液約１０ｍ１に再懸濁し、氷上
で２０分間インキュベートした後再度ペレット化し、最
後に０．０３Ｍの塩化カルシウム溶液１．２５ ｍｌに
）圀濁する。得られた細胞懸濁液は、次に行なう形質転
換（こ対シてコンピテントである。
ＴＥ緩衝液中のプラスミドＰＬＲ２（実施例２Ｃで調製
）をエタノール沈殿（こ付し、３ＱｍＭの塩化カルシウ
ム溶液１５０μｌに懸濁後、試験雷門でコンビテンｌ−
Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ ）−ＩＢＩＯＩ細胞約２００
μｌと穏やかに混合する。得られた混合物を氷上で約４
５分間、次いで４２℃で約１分間インキュベートする。
）をエタノール沈殿（こ付し、３ＱｍＭの塩化カルシウ
ム溶液１５０μｌに懸濁後、試験雷門でコンビテンｌ−
Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ ）−ＩＢＩＯＩ細胞約２００
μｌと穏やかに混合する。得られた混合物を氷上で約４
５分間、次いで４２℃で約１分間インキュベートする。
次にアンピシリン５０μｇ／ｍｅを含有するＬブ０ ス
（Ｂｅｒｔａｎｉ 、 １９５１、Ｊ、１３ａｃｔｅｒ
ｉｏ１ｏｇｙ６２：２９３）約３ ｍｌを加える。混合
物を３７℃で１時間振とうしながらインキュベートした
後、アンピシリンを含有するＬ寒天（Ｍｉ １ｌｅｒ、
１９７２、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、’ Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）上に蒔く。生
き残ったコロニーを選択して所望の表現型（ＡｍＰＲ，
Ｔｅｔｓ）について試験したところ、このコロニーは目
的とするＥ、ｃｏｌｉ Ｋ ］ ２ Ｉ−ＩＢ ］−Ｑ
ｌ／ｐＬＲ２形質転換体を構成していた。
（Ｂｅｒｔａｎｉ 、 １９５１、Ｊ、１３ａｃｔｅｒ
ｉｏ１ｏｇｙ６２：２９３）約３ ｍｌを加える。混合
物を３７℃で１時間振とうしながらインキュベートした
後、アンピシリンを含有するＬ寒天（Ｍｉ １ｌｅｒ、
１９７２、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、’ Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）上に蒔く。生
き残ったコロニーを選択して所望の表現型（ＡｍＰＲ，
Ｔｅｔｓ）について試験したところ、このコロニーは目
的とするＥ、ｃｏｌｉ Ｋ ］ ２ Ｉ−ＩＢ ］−Ｑ
ｌ／ｐＬＲ２形質転換体を構成していた。
実施例４ プラスミドｐＬＲ１の組み立てプラスミドｐ
ＩＪ６の代わりにプラスミドｌ） Ｉ Ｊ ２（Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎ等、１９８０、Ｎａｔｕｒｅ ２８６
：５２５に開示）を使用する以外は実施例２Ａ〜Ｃの教
示するところに実質的に従ってプラスミドｐＬＲ１を調
製する。目的プラスミドｐＬＲ１はＴ Ｅ緩衝液に）′
邑濁する。
ＩＪ６の代わりにプラスミドｌ） Ｉ Ｊ ２（Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎ等、１９８０、Ｎａｔｕｒｅ ２８６
：５２５に開示）を使用する以外は実施例２Ａ〜Ｃの教
示するところに実質的に従ってプラスミドｐＬＲ１を調
製する。目的プラスミドｐＬＲ１はＴ Ｅ緩衝液に）′
邑濁する。
実施例５ Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｉ（８１０１／
ＰＬＲＩの組み立て プラスミドＰＬＩＲ２ではなくプラスミドｐ Ｌ Ｒｌ
を形質転換に使用する以外は、実施例３に実質的に従っ
て目的とする組み立てを行なう。生存コロニーを選択し
て所望の表現型（ＡｍｐＲ，Ｔｅｔ ８）につぃて試験
したところ、このコロニーは目的とするＥ。
ＰＬＲＩの組み立て プラスミドＰＬＩＲ２ではなくプラスミドｐ Ｌ Ｒｌ
を形質転換に使用する以外は、実施例３に実質的に従っ
て目的とする組み立てを行なう。生存コロニーを選択し
て所望の表現型（ＡｍｐＲ，Ｔｅｔ ８）につぃて試験
したところ、このコロニーは目的とするＥ。
ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＬＲＩ形質転換体を
構成していた。
構成していた。
実施例６ プラスミドｐＬＲ４の組み立てＡ、プラスミ
ドｐＬＲ１のＢ ａｍ ＨＩ部分消化プラスミドｐＬＲ
１約１．０μＪ（１０μＬ）、ＢＳＡ（１）Ｉｒｙ ７
ｍｅ ） ５ ／−ｔｌ、水２９μβ、Ｂａｍト■■
制限酵素（水で１：４に希釈）１μ召および反応ミッ
クス※５μβを３７℃で１５分間インキュベートする。
ドｐＬＲ１のＢ ａｍ ＨＩ部分消化プラスミドｐＬＲ
１約１．０μＪ（１０μＬ）、ＢＳＡ（１）Ｉｒｙ ７
ｍｅ ） ５ ／−ｔｌ、水２９μβ、Ｂａｍト■■
制限酵素（水で１：４に希釈）１μ召および反応ミッ
クス※５μβを３７℃で１５分間インキュベートする。
４Ｍの酢酸アンモニウム約５ｏμ召および９５％エク／
−ル２００μｅを添加して反応を停止させる。得られた
ＤＮＡ沈殿を７０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥
後、水２０ｔＪに）（至）、濁する。
−ル２００μｅを添加して反応を停止させる。得られた
ＤＮＡ沈殿を７０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥
後、水２０ｔＪに）（至）、濁する。
※Ｂ ａｍ ｉ（Ｉ制限酵素用反応ミックスは以下の成
分より調製した。
分より調製した。
１、５ Ｍ ＮａＣｇ
６０ ｍＭ ト リ ストＩＣｇ （ｐＨ７，９）５
Ｑ ｍＭ Ｍｇｃ１２ Ｂ、プラスミドＰＢＲ３２２のＢａｍＨ■消化Ｈｉｎｄ
■制限酵素の代わりにＢａｍＩ−（、Ｉ制限酵素を用い
る以外は実施例２Ｂと実質的に同様にして目的とする消
化を行なう。消化したプラスミドｐＢＲ３２２は水２９
μβに懸濁する。
Ｑ ｍＭ Ｍｇｃ１２ Ｂ、プラスミドＰＢＲ３２２のＢａｍＨ■消化Ｈｉｎｄ
■制限酵素の代わりにＢａｍＩ−（、Ｉ制限酵素を用い
る以外は実施例２Ｂと実質的に同様にして目的とする消
化を行なう。消化したプラスミドｐＢＲ３２２は水２９
μβに懸濁する。
ヨン
所望のライゲーションを実施例２Ｃと実質的に同様にし
て行なう。得られた結合ＤＮＡはＴＥ緩衝液に懸濁した
。これは目的とするプラスミドｐＬＲ４を構成していた
。
て行なう。得られた結合ＤＮＡはＴＥ緩衝液に懸濁した
。これは目的とするプラスミドｐＬＲ４を構成していた
。
実施例７ Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＬ
Ｉ支４の組み立て プラスミドＰＬＲ２ではなくプラスミドｐＬＲ４を形質
転換に使用する以外は実施例３と実質的に同様にして所
望の組み立てを行なう。生存コロニーを選択して所望の
表現型（Ａｍｐ 、Ｔｅｔ ）について試験したところ
、目的とするＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｆ１Ｂ１０１／ｐ
ＬＲ４形質転換体を構成していた。
Ｉ支４の組み立て プラスミドＰＬＲ２ではなくプラスミドｐＬＲ４を形質
転換に使用する以外は実施例３と実質的に同様にして所
望の組み立てを行なう。生存コロニーを選択して所望の
表現型（Ａｍｐ 、Ｔｅｔ ）について試験したところ
、目的とするＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｆ１Ｂ１０１／ｐ
ＬＲ４形質転換体を構成していた。
実施例８ プラスミドＰＦＪ２０４およびＰＦＪ２０５
の組み立て Ａ、プラスミドＰＬＲ２のＢａｍＨ１消化および〜１．
５ｋｂ チオストレプトン耐性付与フラグメントの分離 プラスミドｐＬＲ２のＩ） Ｎ Ａ約５０μｇ、反応ミ
ックス１０μβ、Ｂ Ｓ Ａ （１”１１／ｍｅ ）
１０１１１、水２９μβおよびＢａｍＨＩ制限酵素１μ
ｌ（４単位／μβ）を３７℃で２時間インキュベー１・
する。同容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび２．５容量
の９５％エタノールを添加後、混合物を一２０℃で約１
８時間冷却してＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡ沈殿を遠心
して集め、１月り緩衝成約５０μβに懸濁する。
の組み立て Ａ、プラスミドＰＬＲ２のＢａｍＨ１消化および〜１．
５ｋｂ チオストレプトン耐性付与フラグメントの分離 プラスミドｐＬＲ２のＩ） Ｎ Ａ約５０μｇ、反応ミ
ックス１０μβ、Ｂ Ｓ Ａ （１”１１／ｍｅ ）
１０１１１、水２９μβおよびＢａｍＨＩ制限酵素１μ
ｌ（４単位／μβ）を３７℃で２時間インキュベー１・
する。同容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび２．５容量
の９５％エタノールを添加後、混合物を一２０℃で約１
８時間冷却してＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡ沈殿を遠心
して集め、１月り緩衝成約５０μβに懸濁する。
１）２ｖｉｓ 、 Ｒ，Ｗ、等、１９８０、Ａ Ｍａｎ
ｕａｌ Ｆｏｒ ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ、 Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｃｅｒｉｏｌ Ｇｅｎ
ｅｃｉｃｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｌ）ｏｒ。
ｕａｌ Ｆｏｒ ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ、 Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｃｅｒｉｏｌ Ｇｅｎ
ｅｃｉｃｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｌ）ｏｒ。
ＩＮｅｗ Ｙｏｒｋの教示するところに実質的に従って
、アガロースケル電気泳動により、ＤＮＡ懸濁液から所
望の〜１．６ ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フラグメントを常
法により分離する。分離後、このフラグメントを、次工
程のライゲーションのためにＴ Ｅ緩衝液約２０μｅに
再懸濁する。
、アガロースケル電気泳動により、ＤＮＡ懸濁液から所
望の〜１．６ ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フラグメントを常
法により分離する。分離後、このフラグメントを、次工
程のライゲーションのためにＴ Ｅ緩衝液約２０μｅに
再懸濁する。
プラスミドｐＬＲ２ではなく、プラスミドｐＮＭ１００
を使用する以外は、実施例８Ａと実質的に同様番こして
所望の消化および分離を行なう。分離に引き続き、この
〜３，８ｋｂフラグメントを次のライゲーションのため
にＴＥ緩衝液約５０μｇに＠ ｌｌａする。
を使用する以外は、実施例８Ａと実質的に同様番こして
所望の消化および分離を行なう。分離に引き続き、この
〜３，８ｋｂフラグメントを次のライゲーションのため
にＴＥ緩衝液約５０μｇに＠ ｌｌａする。
Ｃ，ライゲーション
プラスミドｐＮＭ１００のＮ３８ｋｂ Ｂａｍ Ｉ−１
］： ７ ラグメント約１μｇ、プラスミド １３ａｍＨＩ制限フラグメント１ μ９ 、Ｂ Ｓ Ａ
（ ］、 ｒｑ ７ｍ．ｌ ） ５μ召、ライゲー゛ジ
ョンミックス５μｅ１水２５μ召およびＴ ４ Ｄ Ｎ
Ａリカーゼ（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ Ｌａｂ
ｓ ） ５μ７’を約１６°Ｃで約４時間インキユヘー
トする。４Ｍの酢酸アンモニウム約５０μβおよび冷エ
タノール３００μβを加えた後、混合物を約−２０℃で
約１８時間冷却してＤＮＡを沈殿させる。Ｄ Ｎ Ａ
７ｚ殿を遠心して集め、７０％エタノールで洗浄し、再
ひ集め、次の形質転換のため媒ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６２：３０７ ）５０μ＃
に懸濁させる。
］： ７ ラグメント約１μｇ、プラスミド １３ａｍＨＩ制限フラグメント１ μ９ 、Ｂ Ｓ Ａ
（ ］、 ｒｑ ７ｍ．ｌ ） ５μ召、ライゲー゛ジ
ョンミックス５μｅ１水２５μ召およびＴ ４ Ｄ Ｎ
Ａリカーゼ（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ Ｌａｂ
ｓ ） ５μ７’を約１６°Ｃで約４時間インキユヘー
トする。４Ｍの酢酸アンモニウム約５０μβおよび冷エ
タノール３００μβを加えた後、混合物を約−２０℃で
約１８時間冷却してＤＮＡを沈殿させる。Ｄ Ｎ Ａ
７ｚ殿を遠心して集め、７０％エタノールで洗浄し、再
ひ集め、次の形質転換のため媒ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６２：３０７ ）５０μ＃
に懸濁させる。
〜１． ５ ｋｌ）１３ａｍＨ工耐性付与フラグメント
はとちらの方向性もとり得るため、２方向の組換えプラ
スミドが生じる。得られたプラスミドｐＦＪ２０４およ
びｐＦＪ２０５ は適当な箔主細胞中に形質転換し、次
いて制限酵素およびアガロースゲル電気７ｙｋ動（ １
）ａｖｉｓ 、 Ｒ．Ｗ，等、１９８０）ｉこよって常
套のことく同定できる。各々のプラスミドｐ １” Ｊ
２ ０ ４ およびＰＦ’Ｊ２０５ の制限サイトお
よび機能地図を添伺の第３図（こ示した。
はとちらの方向性もとり得るため、２方向の組換えプラ
スミドが生じる。得られたプラスミドｐＦＪ２０４およ
びｐＦＪ２０５ は適当な箔主細胞中に形質転換し、次
いて制限酵素およびアガロースゲル電気７ｙｋ動（ １
）ａｖｉｓ 、 Ｒ．Ｗ，等、１９８０）ｉこよって常
套のことく同定できる。各々のプラスミドｐ １” Ｊ
２ ０ ４ およびＰＦ’Ｊ２０５ の制限サイトお
よび機能地図を添伺の第３図（こ示した。
実施例ｇ ＳＬｒｅｐｃｏｍｙｃｃｓ ａｍｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ’ ２ ０ ４およびＳ，
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ ｐ Ｆ Ｊ ２ ０ ５
の組み立て実施例８Ｃから）Ｄ Ｎ Ａ約１μｇおよび
Ｓｔｒｅｐｃｏ−ｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｂＬａｂｏｒａｔｏｒｙ （Ｐｅｏｒｉａ， Ｉｌｌ
ｉｎｏｉｓ在）に寄託されストックカルチャーコレクシ
ョンの一部となっており、受理番号ＮＲＲＪ４２０の下
で一般（こ入手可能な菌株〕のプロトプラスト１×１０
８を用いて、国際公開１／（ｙ．’Ｗ０ ７ ９１０１
１６ ９ （国際特許出願７ｆ’， Ｐ ＣＴ／ＧＢ７
９１０ＯＯ９５）明細書の実施例２に記載の方法と実質
的に同様にして所望の組み立てを行なう。平板中の最終
濃度が５０μ！／ ／ｍｌとなるに十分なチオストレプ
トンを含有するトップアガーのＹ（２培地（ Ｈｏｐｗ
ｏｏｄおよびＷｒｉｇｈｔ、１ ｇ ７ Ｂ、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａ＋ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅ［ｉｃｓ
ｌ ６２ ： ３ ０ ）を再生したプロトプラスト
に積層することにより、目的とする形質転侯体をチオス
トレプトン耐性について選択する。得られたＳｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ２０
４およびＳ．ａｍｌ）ｏ［ａｃｉｃｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ
２ ０ ５ チオストレプトン耐性コロニーを既知の
手法で分離、培養し、次いで常法に従って構成プラスミ
ドの制限酵素分析および構成プラスミドのアガロースゲ
ル電気泳動分析により同定を行なう（ Ｄａｖｉ ｓ
、 Ｒ， Ｗ．ら、１、 ９ ８ ０ ）。この形質転
換培養体は、引き続きそれぞれのプラスミドの生産およ
び分離に使用する。
ｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ’ ２ ０ ４およびＳ，
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ ｐ Ｆ Ｊ ２ ０ ５
の組み立て実施例８Ｃから）Ｄ Ｎ Ａ約１μｇおよび
Ｓｔｒｅｐｃｏ−ｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｂＬａｂｏｒａｔｏｒｙ （Ｐｅｏｒｉａ， Ｉｌｌ
ｉｎｏｉｓ在）に寄託されストックカルチャーコレクシ
ョンの一部となっており、受理番号ＮＲＲＪ４２０の下
で一般（こ入手可能な菌株〕のプロトプラスト１×１０
８を用いて、国際公開１／（ｙ．’Ｗ０ ７ ９１０１
１６ ９ （国際特許出願７ｆ’， Ｐ ＣＴ／ＧＢ７
９１０ＯＯ９５）明細書の実施例２に記載の方法と実質
的に同様にして所望の組み立てを行なう。平板中の最終
濃度が５０μ！／ ／ｍｌとなるに十分なチオストレプ
トンを含有するトップアガーのＹ（２培地（ Ｈｏｐｗ
ｏｏｄおよびＷｒｉｇｈｔ、１ ｇ ７ Ｂ、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａ＋ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅ［ｉｃｓ
ｌ ６２ ： ３ ０ ）を再生したプロトプラスト
に積層することにより、目的とする形質転侯体をチオス
トレプトン耐性について選択する。得られたＳｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ２０
４およびＳ．ａｍｌ）ｏ［ａｃｉｃｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ
２ ０ ５ チオストレプトン耐性コロニーを既知の
手法で分離、培養し、次いで常法に従って構成プラスミ
ドの制限酵素分析および構成プラスミドのアガロースゲ
ル電気泳動分析により同定を行なう（ Ｄａｖｉ ｓ
、 Ｒ， Ｗ．ら、１、 ９ ８ ０ ）。この形質転
換培養体は、引き続きそれぞれのプラスミドの生産およ
び分離に使用する。
実施例１０ プラスミドｐＦＪ ２０６ およびｐ Ｆ
Ｊ２０７の組み立て ３、４ｋｂネオマイシン耐性付与フラクメントの分離 実施例８Ａの教示するところに従って所望の消化および
分離を行なう。〜３．４ ｋｂ． ＢａｍＨ 工制限フ
ラグメントは次のライゲーションのために゛ｒＥ緩衝液
約２０μβにｊひ濁する。
Ｊ２０７の組み立て ３、４ｋｂネオマイシン耐性付与フラクメントの分離 実施例８Ａの教示するところに従って所望の消化および
分離を行なう。〜３．４ ｋｂ． ＢａｍＨ 工制限フ
ラグメントは次のライゲーションのために゛ｒＥ緩衝液
約２０μβにｊひ濁する。
実施例８Ｃと実質的（こ同様にして、〜３，４ｋｂＢａ
ｍトＢネオマイシン耐性付与フラグメントを、プラスミ
ドｐＮＭ１００ の〜３．１３ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉフ
ラクメント（実施例８Ｂで調製）にライゲーションする
。〜３． ４ ｋｂ Ｂａｍ Ｈ Ｉ耐性付与フラグメ
ントはどぢらの方向性もとり得るため、２つの方向性の
異なる糾換えプラスミドが生成する。得られたプラスミ
ドｐＦＪ２ｏ６およびｐＦＪ２０７ は適当な福生細
胞中に形質転換し、次いで制限酵素およびアガロースゲ
ル電気泳動によって常套の方法で向足テきる（ Ｄａｖ
ｉｓ 、 Ｒ， Ｗ，等、１９８０） 。各々のプラス
ミドＰ’Ｊ２０６ およびＰＦＪ２０７の制限サイトお
よび機能地図を添付の第３図に示した。
ｍトＢネオマイシン耐性付与フラグメントを、プラスミ
ドｐＮＭ１００ の〜３．１３ ｋｂ ＢａｍＨ Ｉフ
ラクメント（実施例８Ｂで調製）にライゲーションする
。〜３． ４ ｋｂ Ｂａｍ Ｈ Ｉ耐性付与フラグメ
ントはどぢらの方向性もとり得るため、２つの方向性の
異なる糾換えプラスミドが生成する。得られたプラスミ
ドｐＦＪ２ｏ６およびｐＦＪ２０７ は適当な福生細
胞中に形質転換し、次いで制限酵素およびアガロースゲ
ル電気泳動によって常套の方法で向足テきる（ Ｄａｖ
ｉｓ 、 Ｒ， Ｗ，等、１９８０） 。各々のプラス
ミドＰ’Ｊ２０６ およびＰＦＪ２０７の制限サイトお
よび機能地図を添付の第３図に示した。
実施例１１ Ｓｔｒｅｐｃｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ２．０６オヨ（Ｊ Ｓ、 ａｍｂ
ｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２０７の組み立て実
施例１０からの］） Ｎ Ａ約１μｇおよびＳｔｒｅｐ
ｔｏ−ｍｙｃｃｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ （ＮＲ
ＲＬ７９２４２Ｑ’）のプロトプラスト１×１０８を用
いて、国際公開ｊ６． ＷＯ７９１０１１６９（国際特
許出願／／ｈ、ＰＣＴ／ＧＢ７９１０００９５）の実施
例２と実質１′Ｊ′・］に同様にして所望の組み立てを
行なう。平板中の最終濃度が１μＱ／ｍｅとなるに十分
なネオマイシン７を含ηするＲ２培地を再生したプロト
プラストに積層することにより、目的とする形質転換体
をネオマイシン耐性について選択する。
ａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ２．０６オヨ（Ｊ Ｓ、 ａｍｂ
ｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２０７の組み立て実
施例１０からの］） Ｎ Ａ約１μｇおよびＳｔｒｅｐ
ｔｏ−ｍｙｃｃｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ （ＮＲ
ＲＬ７９２４２Ｑ’）のプロトプラスト１×１０８を用
いて、国際公開ｊ６． ＷＯ７９１０１１６９（国際特
許出願／／ｈ、ＰＣＴ／ＧＢ７９１０００９５）の実施
例２と実質１′Ｊ′・］に同様にして所望の組み立てを
行なう。平板中の最終濃度が１μＱ／ｍｅとなるに十分
なネオマイシン７を含ηするＲ２培地を再生したプロト
プラストに積層することにより、目的とする形質転換体
をネオマイシン耐性について選択する。
得られたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏ［ａ、ｃ
ｉｅｎｓ ／ｐ ＦＪ ２０５オヨびＳ、 ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２０７ネオマイシン耐性
コロニーを既知の手法で分離し、次いて常法（こ従って
構成プラスミドを制限酵素および電気泳動分析ｉコヨリ
同定すル（Ｄａｖｉｓ 、 Ｒ，Ｗ、等、１．．９８０
）。
ｉｅｎｓ ／ｐ ＦＪ ２０５オヨびＳ、 ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２０７ネオマイシン耐性
コロニーを既知の手法で分離し、次いて常法（こ従って
構成プラスミドを制限酵素および電気泳動分析ｉコヨリ
同定すル（Ｄａｖｉｓ 、 Ｒ，Ｗ、等、１．．９８０
）。
米抗生物質ネオマイシンはＳｉｇｍａ （Ｓｔ、 Ｌｏ
ｕｉｓ。
ｕｉｓ。
Ｍｉｓｓｏｕｒｉ社）より入手できる。
実施例１２ プラスミドＰＦＪ ２０８およびｐＦＪ実
施例１の方法に従ってＳｃｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ
ｍｂｏ −ｆａｃｉｅｎｓ ／ ｐ Ｆ Ｊ ２０４か
ら分離したプラスミドｐ）−Ｊ２０４を、Ｂａｍ Ｈ■
制限酵素により部分消化する。
施例１の方法に従ってＳｃｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ
ｍｂｏ −ｆａｃｉｅｎｓ ／ ｐ Ｆ Ｊ ２０４か
ら分離したプラスミドｐ）−Ｊ２０４を、Ｂａｍ Ｈ■
制限酵素により部分消化する。
この消化は、プラスミドＰＦＪ２０４ のｒＪＮＡ約２
０μｌ、反Ｒ５ミックス１０ μｇ 、ＢＳＡ（１１ｒ
ｆ／／ｍｌり１０μβ、水３９μβおよび１３ａｍＨ工
制限酵素（酵素２μａを水８μβで希釈して調製する）
１ｐｌを周囲温度で１５分間インキュベートすることに
より行なう。
０μｌ、反Ｒ５ミックス１０ μｇ 、ＢＳＡ（１１ｒ
ｆ／／ｍｌり１０μβ、水３９μβおよび１３ａｍＨ工
制限酵素（酵素２μａを水８μβで希釈して調製する）
１ｐｌを周囲温度で１５分間インキュベートすることに
より行なう。
同容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび５容量の９５％エ
タノールを加えた後、混合物を−２０“Ｃで約１８時間
冷却してｌ） Ｎ Ａを沈ｊ般させる。このＤＮＡ沈殿
を遠心して集め、７０％エタノールで洗浄し、減圧乾燥
後ＴＥ緩衝液成約０μβに懸濁する。
タノールを加えた後、混合物を−２０“Ｃで約１８時間
冷却してｌ） Ｎ Ａを沈ｊ般させる。このＤＮＡ沈殿
を遠心して集め、７０％エタノールで洗浄し、減圧乾燥
後ＴＥ緩衝液成約０μβに懸濁する。
次（こ、実施例８Ｃに実質的に従って、このＢａｍＨＩ
部分消化物を、プラスミドｐＬＲ１の〜３．４ｋｂネオ
マイシン耐性付与ＢａｍＨエフラグメント（実施例１０
Ａで調製）とライゲーションして所望のプラスミドを得
る。プラスミドＰＦＪ２０４ はネオマイシン耐性フ
ラグメントの挿入に使われるＢａｍ制限サイトを２個有
するため、プラスミドｐｌ“Ｊ２０８およびＰＦＪ２０
９ の挿入異性体か生成する。
部分消化物を、プラスミドｐＬＲ１の〜３．４ｋｂネオ
マイシン耐性付与ＢａｍＨエフラグメント（実施例１０
Ａで調製）とライゲーションして所望のプラスミドを得
る。プラスミドＰＦＪ２０４ はネオマイシン耐性フ
ラグメントの挿入に使われるＢａｍ制限サイトを２個有
するため、プラスミドｐｌ“Ｊ２０８およびＰＦＪ２０
９ の挿入異性体か生成する。
〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨＩ ネオマイシン耐性付与フ
ラグメントはどちらの方向性もとり得るため、２つの方
向性の異なる組換えプラスミドが生成する。得られたプ
ラスミドｐＦＪ２０８ およびｐＦＪ２０９ は適当な
宿主細服中に形質転換し、次いで制限酵素およびアガロ
ースゲル電気泳動分析によって常套の方法で同定できる
（ Ｄａｖｉｓ 、 ＲｏＷｏ等、１９８０）。
ラグメントはどちらの方向性もとり得るため、２つの方
向性の異なる組換えプラスミドが生成する。得られたプ
ラスミドｐＦＪ２０８ およびｐＦＪ２０９ は適当な
宿主細服中に形質転換し、次いで制限酵素およびアガロ
ースゲル電気泳動分析によって常套の方法で同定できる
（ Ｄａｖｉｓ 、 ＲｏＷｏ等、１９８０）。
各々のプラスミドＰＦＪ２０８および１）ＦＪ２０９の
制限サイトおよび機能地図を添付の第４図に示す。
制限サイトおよび機能地図を添付の第４図に示す。
実施例１３ ＳＬｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｏｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ／ ｐＦＪ２０８およびＳ、 ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２ Ｑ ９の組み立て
実施例１２からのＤＮＡ約１ｔｔｙおよびＳｔｒｅｐｔ
ｏ−ｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ （Ｎ Ｒｒ
（Ｌ、７５．２４２Ｑ ）のプロトプラスト１×１０８
を用いて、国際公開Ａ、 Ｗ ０７９１０１１６９ （
国際特許用１１ｉｆｉ Ａ、 Ｐ Ｃ’ｆ ／Ｇ Ｂ
７９／ Ｏ００９５）の実施例２と実質的に同様にして
所望の組み立てを行なう。目的とする形質転換体を前述
の実施例９および１１の方法により、まずチオストレプ
トン耐性について、次いてネオマイシン耐性にツイテ選
択する。得られたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏ
−ｆａｃｉｅｎｓ ／ ｐ Ｆ Ｊ ２０８およびＳ
、 ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ ｐＦ Ｊ ２０
ｇチオストレプトンおよびネオマイシン耐性コロニーを
、構成プラスミドの制限酵素および電気泳動分析（こよ
り、常法通り（こ同定する（ Ｄａｖｉｓ、 Ｒ，Ｗ。
ｆａｃｉｅｎｓ／ ｐＦＪ２０８およびＳ、 ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２ Ｑ ９の組み立て
実施例１２からのＤＮＡ約１ｔｔｙおよびＳｔｒｅｐｔ
ｏ−ｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ （Ｎ Ｒｒ
（Ｌ、７５．２４２Ｑ ）のプロトプラスト１×１０８
を用いて、国際公開Ａ、 Ｗ ０７９１０１１６９ （
国際特許用１１ｉｆｉ Ａ、 Ｐ Ｃ’ｆ ／Ｇ Ｂ
７９／ Ｏ００９５）の実施例２と実質的に同様にして
所望の組み立てを行なう。目的とする形質転換体を前述
の実施例９および１１の方法により、まずチオストレプ
トン耐性について、次いてネオマイシン耐性にツイテ選
択する。得られたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏ
−ｆａｃｉｅｎｓ ／ ｐ Ｆ Ｊ ２０８およびＳ
、 ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ ｐＦ Ｊ ２０
ｇチオストレプトンおよびネオマイシン耐性コロニーを
、構成プラスミドの制限酵素および電気泳動分析（こよ
り、常法通り（こ同定する（ Ｄａｖｉｓ、 Ｒ，Ｗ。
等、１９８０）。この形質転換培養体を以降の工程での
各々のプラスミドの生産および分離に使用する。
各々のプラスミドの生産および分離に使用する。
実施例１４ プラスミドｐＦＪ］４３ の分離Ａ 、Ｓ
ｔｒｅｐｃｏｍｙｃｃｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／
ｐ Ｆ Ｊ １４３の培養実施例ＩＡと実質的に同様に
してＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ｐＦＪ１４３（Ｉ’ＪＲＲＬ１５１１４）の栄養接種
物を常套のごとく調製する。
ｔｒｅｐｃｏｍｙｃｃｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／
ｐ Ｆ Ｊ １４３の培養実施例ＩＡと実質的に同様に
してＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ｐＦＪ１４３（Ｉ’ＪＲＲＬ１５１１４）の栄養接種
物を常套のごとく調製する。
実施例ＩＡの接種物の代わりに実施例１４Ａの接種物を
使用する以外は、実施例ＩＢと実質的（こ同様にして、
所望の分離を行なう。分離したプラスミドＰＦＪ１４３
のＤＮＡは１０倍希釈した］゛Ｅ緩衝液１ ｍｌに溶解
し、保存のため一２０℃で凍結させる。
使用する以外は、実施例ＩＢと実質的（こ同様にして、
所望の分離を行なう。分離したプラスミドＰＦＪ１４３
のＤＮＡは１０倍希釈した］゛Ｅ緩衝液１ ｍｌに溶解
し、保存のため一２０℃で凍結させる。
実施例１５ プラスミドｐＦＪ１７０およびｐＦＪ ２
１０の組み立て プラスミド１）ＬＲ２ではなくプラスミドｐＦＪ１４３
を使用するほかは実施例８Ａと実質的に同様（こして目
的とする消化を行なう。Ｉ） Ｎ Ａ沈ノ般を遠心して
集め、７０％エタノールで洗浄し、減圧乾燥後、−Ｊ″
Ｅ緩衝液約５０μ蔚こ）ヒ濁する。
１０の組み立て プラスミド１）ＬＲ２ではなくプラスミドｐＦＪ１４３
を使用するほかは実施例８Ａと実質的に同様（こして目
的とする消化を行なう。Ｉ） Ｎ Ａ沈ノ般を遠心して
集め、７０％エタノールで洗浄し、減圧乾燥後、−Ｊ″
Ｅ緩衝液約５０μ蔚こ）ヒ濁する。
１３、 ライゲーション
実施例８Ｃと実質的に同様（こして、ＢａｍＨ■消化プ
ラスミドｐＦＪ１４３約１μｇおよびプラスミドｐＬＲ
２の〜１．６ ｋｂ Ｂａｍ’ＨＩ制限フラグメント（
実施例８Ａで調製）をライゲーションする。〜１．６ｋ
ｂ Ｂａｍ１−Ｉ Ｉ 耐性付与フラグメントはとちら
の方向性もとり衝るため、２つの方向性の異なる組換え
プラスミドが生成する。得られたプラスミドＰｆ″Ｊ１
７０およびｐＦ″Ｊ２１０ は適当な宿主細胞中に形
質転換し、次いで制限酵素およびアガロースゲル電気泳
動によって常法通り（こ同定できる（Ｄａｖｉｓ。
ラスミドｐＦＪ１４３約１μｇおよびプラスミドｐＬＲ
２の〜１．６ ｋｂ Ｂａｍ’ＨＩ制限フラグメント（
実施例８Ａで調製）をライゲーションする。〜１．６ｋ
ｂ Ｂａｍ１−Ｉ Ｉ 耐性付与フラグメントはとちら
の方向性もとり衝るため、２つの方向性の異なる組換え
プラスミドが生成する。得られたプラスミドＰｆ″Ｊ１
７０およびｐＦ″Ｊ２１０ は適当な宿主細胞中に形
質転換し、次いで制限酵素およびアガロースゲル電気泳
動によって常法通り（こ同定できる（Ｄａｖｉｓ。
およびｐＦＪ２１０の制限サイトおよび機能地図を添付
の第５図に示す。
の第５図に示す。
実施例１６ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｓ ／ｐＦＪ’ １７０およびＳ 、 ａｍ
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２１０の組み立て
実施例１５Ｇで得られるＤＮＡを使用する以外は実施例
９の教示するところに実質的に従って所望の組み立てを
行ない、常法に従って同定し、その後のプラスミドｐＦ
Ｊ１７０ およびｐＦＪ２１０ の生産および分離ζこ
使用する。
ａｃｉｅｎｓ ／ｐＦＪ’ １７０およびＳ 、 ａｍ
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２１０の組み立て
実施例１５Ｇで得られるＤＮＡを使用する以外は実施例
９の教示するところに実質的に従って所望の組み立てを
行ない、常法に従って同定し、その後のプラスミドｐＦ
Ｊ１７０ およびｐＦＪ２１０ の生産および分離ζこ
使用する。
実施例１７ プラスミドＰＦＪ２１１ およびプラスミ
ド１）ＦＪ２１２の組み立て プラスミドｐｌ’ＪＭＩＱＱの〜３．８ｋｂ Ｂａｍｆ
−１工７ラグメントではな（Ｂａｍ１（Ｉ消化プラスミ
ドｐＦＪ１４３ を使用する以外は実施例１０と実質的
に同様にして所望の組み立てを行ない、かつ常套の方法
で同定する。各々のプラスミドｐＦＪ ２１ ］ およ
びｐＦＪ２１２の制限サイトおよび機能地図を添付の第
５図に示す。
ド１）ＦＪ２１２の組み立て プラスミドｐｌ’ＪＭＩＱＱの〜３．８ｋｂ Ｂａｍｆ
−１工７ラグメントではな（Ｂａｍ１（Ｉ消化プラスミ
ドｐＦＪ１４３ を使用する以外は実施例１０と実質的
に同様にして所望の組み立てを行ない、かつ常套の方法
で同定する。各々のプラスミドｐＦＪ ２１ ］ およ
びｐＦＪ２１２の制限サイトおよび機能地図を添付の第
５図に示す。
実施例Ｉ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ ／ＰＦＪ ２１１およびＳ、ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ２１２の組み立て実施例１７か
らのＤＮＡを使用する以外は実施例１１と実質的Ｇこ同
様にして所望の組み立てを行ない、常套の方法で同定し
、プラスミドｐＦＪ’２１１およびｐＦＪ２１２の生産
および分離に使用する。
ｆａｃｉｅｎｓ ／ＰＦＪ ２１１およびＳ、ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ２１２の組み立て実施例１７か
らのＤＮＡを使用する以外は実施例１１と実質的Ｇこ同
様にして所望の組み立てを行ない、常套の方法で同定し
、プラスミドｐＦＪ’２１１およびｐＦＪ２１２の生産
および分離に使用する。
実施例１９ プラスミドｐＦＪ２１３およびｐＦＪ２１
４の組み立て プラスミドＰＦＪ２０４ ではなくプラスミドｐＦＪ１
７０を使用する以外は実施例１２と実質的に同様にして
所望の組み立てを行ない、常套の方法で同定する。プラ
スミドｐＦＪ１７０ はネオマイシン耐性フラグメント
の挿入のためのＢａｍｔｌ■制限サイトを２個有するの
で、この場合もまたプラスミドｐｌ”Ｊ２１３ および
ｐＦＪ２１４の挿入異性体か生成する。〜３．４ ｋｂ
Ｂａｍ）ｉ ■ ネオマイシン耐性付与フラグメント
はどちらの方向性もとり得るため、２つの方向性の異な
る組換えプラスミドか生成する。各々のプラスミドＰＦ
’Ｊ２１３およびｐ Ｆ Ｊ２１４ の制限サイトｑよ
ひ機能地図を添付の第６図に示す。
４の組み立て プラスミドＰＦＪ２０４ ではなくプラスミドｐＦＪ１
７０を使用する以外は実施例１２と実質的に同様にして
所望の組み立てを行ない、常套の方法で同定する。プラ
スミドｐＦＪ１７０ はネオマイシン耐性フラグメント
の挿入のためのＢａｍｔｌ■制限サイトを２個有するの
で、この場合もまたプラスミドｐｌ”Ｊ２１３ および
ｐＦＪ２１４の挿入異性体か生成する。〜３．４ ｋｂ
Ｂａｍ）ｉ ■ ネオマイシン耐性付与フラグメント
はどちらの方向性もとり得るため、２つの方向性の異な
る組換えプラスミドか生成する。各々のプラスミドＰＦ
’Ｊ２１３およびｐ Ｆ Ｊ２１４ の制限サイトｑよ
ひ機能地図を添付の第６図に示す。
実施例２ Ｑ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ２１３およびＳ 、 ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２１４の組み立て実施
例１９からのＤＮＡを使用する以外は実施例１３と実質
的に同様にして所望の組み立てを行ない、常套の方法で
同定し、プラスミドｐＦＪ２１３およびｐＦＪ２１４
の生産および分離に使用する。
ｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ２１３およびＳ 、 ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２１４の組み立て実施
例１９からのＤＮＡを使用する以外は実施例１３と実質
的に同様にして所望の組み立てを行ない、常套の方法で
同定し、プラスミドｐＦＪ２１３およびｐＦＪ２１４
の生産および分離に使用する。
実施例２１ プラスミドｐＦＪ２１５ およびｐ Ｆ’
Ｊ２１６の組み立て ドｐｌＪ４３の分離 Ｄ ａｖ ｉ ｓ 、 Ｒ０’Ｗ、等、１９８０、（７
）教示スルトコロニ実質的に従って、目的とするＥ、
ｃｏｌ ｉ ８０３／Ｐ’Ｊ ４３（ＡＴＣＣ３９１５
６）の培養およびこれに続くプラスミドｐＩＪ４３の分
離を行なう。ｐＩＪ４３のＤＮＡは常法のこと（ＴＥ緩
衝液に懸濁した後、保存のため一２０℃に冷却する。
Ｊ２１６の組み立て ドｐｌＪ４３の分離 Ｄ ａｖ ｉ ｓ 、 Ｒ０’Ｗ、等、１９８０、（７
）教示スルトコロニ実質的に従って、目的とするＥ、
ｃｏｌ ｉ ８０３／Ｐ’Ｊ ４３（ＡＴＣＣ３９１５
６）の培養およびこれに続くプラスミドｐＩＪ４３の分
離を行なう。ｐＩＪ４３のＤＮＡは常法のこと（ＴＥ緩
衝液に懸濁した後、保存のため一２０℃に冷却する。
Ｂ、プラスミドｐＩＪ４３の〜２．５ ｋｂ Ｓａｌ
Ｉ −ＢａｍプラスミドｐｌＪ４３のＤＮＡ約２０μダ
、反応ミックス※Ｉ Ｑ ｐｇ 、ＢＳＡ （１２１１
ｐ、’ｍｌ？ ） １０１’（Ｊ、水３９μｌおよびＳ
ａｌ Ｉ制限酵素１μ召（１μβが約５Ｑ、ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ 単位を含有すルヨウ
ニ希釈シて調製する）を、周囲温度で約１５分間インキ
ュベ−１・する。４Ｍの酢酸アンモニウム同容量および
９５％エタノール２容量を添加した後、混合物を約１８
時間−２０℃に冷却してＤＮＡを沈殿させる。こ（７）
ＤＮＡ沈殿を遠心して採取し、７０％エタノールで洗浄
後減圧乾燥して１゛Ｅ緩衝液約２゜μｌに息濁する。次
いてＢ ａｍ ）ｌ ■反応ミックス約５μ５ＳＢＳＡ
（１）〃ｇ／ ｍｌ ） ５ μ（ｌ ｓ水３９廊およ
びＢ ａｍ Ｉ−１■制限酵素（過剰のＮｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂ単位を含有）１μ召を添加し
、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。４Ｍ
の酢酸アンモニウム同容量および９５％エタノール２容
量を添加した後、混合物を約１８時間−２０℃に冷却し
てＤＮＡを沈殿させる。このＤＮＡ沈殿を遠心して採取
する。目的とする〜２．５ ｋｂ Ｓａｌ ■−Ｂａｍ
Ｈ■７ラグメントをアガロースゲル電気泳動（Ｄａｖｉ
ｓ。
Ｉ −ＢａｍプラスミドｐｌＪ４３のＤＮＡ約２０μダ
、反応ミックス※Ｉ Ｑ ｐｇ 、ＢＳＡ （１２１１
ｐ、’ｍｌ？ ） １０１’（Ｊ、水３９μｌおよびＳ
ａｌ Ｉ制限酵素１μ召（１μβが約５Ｑ、ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ 単位を含有すルヨウ
ニ希釈シて調製する）を、周囲温度で約１５分間インキ
ュベ−１・する。４Ｍの酢酸アンモニウム同容量および
９５％エタノール２容量を添加した後、混合物を約１８
時間−２０℃に冷却してＤＮＡを沈殿させる。こ（７）
ＤＮＡ沈殿を遠心して採取し、７０％エタノールで洗浄
後減圧乾燥して１゛Ｅ緩衝液約２゜μｌに息濁する。次
いてＢ ａｍ ）ｌ ■反応ミックス約５μ５ＳＢＳＡ
（１）〃ｇ／ ｍｌ ） ５ μ（ｌ ｓ水３９廊およ
びＢ ａｍ Ｉ−１■制限酵素（過剰のＮｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂ単位を含有）１μ召を添加し
、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。４Ｍ
の酢酸アンモニウム同容量および９５％エタノール２容
量を添加した後、混合物を約１８時間−２０℃に冷却し
てＤＮＡを沈殿させる。このＤＮＡ沈殿を遠心して採取
する。目的とする〜２．５ ｋｂ Ｓａｌ ■−Ｂａｍ
Ｈ■７ラグメントをアガロースゲル電気泳動（Ｄａｖｉ
ｓ。
Ｒ，Ｗ、等、１９８０ ）によって分離、取得する。
※Ｓａｌ 工制限酵素用反応ミックスは以下の成分１、
５ ＭＮ’ａＣ１ ６０ｍＭトリスｘ−ｘｃ（４（ｐｒｉ ７．９ ）６０
ｍＭ ＭｇＣｊ＋２ ６０ｍＭ２〜メルカプトエタノール ＨエフラグメントへのＢａｍＦｉ■リンカ−の付加 Ｂａｍ Ｉ−Ｉ ■ リンカ−※の付加は、［ＪＪＩｒ
ｉｃｈ等、１９７７Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６ ：１３１
３の方法と実質的に同様にして行なう。得られたフラグ
メントをＢａｍＨＩ制限酵素で処理し、所望のＢａｍ’
Ｈ■粘着末端を形成させる。この〜２．５ ｋｂ Ｂａ
ｍＨＩ フラグメントを既知の方法に従って分離し、
続くライゲーションのために保存する。
５ ＭＮ’ａＣ１ ６０ｍＭトリスｘ−ｘｃ（４（ｐｒｉ ７．９ ）６０
ｍＭ ＭｇＣｊ＋２ ６０ｍＭ２〜メルカプトエタノール ＨエフラグメントへのＢａｍＦｉ■リンカ−の付加 Ｂａｍ Ｉ−Ｉ ■ リンカ−※の付加は、［ＪＪＩｒ
ｉｃｈ等、１９７７Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６ ：１３１
３の方法と実質的に同様にして行なう。得られたフラグ
メントをＢａｍＨＩ制限酵素で処理し、所望のＢａｍ’
Ｈ■粘着末端を形成させる。この〜２．５ ｋｂ Ｂａ
ｍＨＩ フラグメントを既知の方法に従って分離し、
続くライゲーションのために保存する。
※ＢａｍＨ，Ｉ 〔ｄ（ＣＧＧＡＴＣＣＧ））およびそ
の他のリンカ−は、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ Ｉｎｃ、（１２Ｂ Ｓｐｒｉｎｇ ５ｔ
ｒｅｅｔ ＳＬｅｘｉｎｇｔｏｎ、 Ｍａｓｓａｃｈｕ
ｓｅｔｔｓ０２１７３ ｇ）より容易に入手できる。
の他のリンカ−は、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ Ｉｎｃ、（１２Ｂ Ｓｐｒｉｎｇ ５ｔ
ｒｅｅｔ ＳＬｅｘｉｎｇｔｏｎ、 Ｍａｓｓａｃｈｕ
ｓｅｔｔｓ０２１７３ ｇ）より容易に入手できる。
１３ａｍＩ（１消化プラスミドＰＦＪ１４３ （実施
例１５Ａで調製）約１μｇをプラスミドｐＩＪ４３の〜
２．５ｋｂ フラグメント（実施例２１ＢおよびＣで
調製）１μｇ と、実施例８Ｃと実質的に同様にしてラ
イゲーションする。〜２．５ ｋｂ ＢａｍＨＩ フ
ラグメントはどちらの方向性もとり得るため、２つの方
向性の異なる組換えプラスミドが生成する。得られたプ
ラスミドｐＦＪ２１．５およびｐＦＪ２１６ は適当な
宿主細胞中に形質転換し、次いで制限酵素およびアガロ
ースゲル電気泳動（こよって常套の方法で同定できる（
Ｄａｖｉ ｓ 、 Ｒ，Ｗ、等、１９８０’） 。各
々のプラスミドｐＦ’Ｊ２１５およびｐＦＪ２１６の缶
１１ ｊ８艮サイトおよび機能地図を添付の第６図に示
した。
例１５Ａで調製）約１μｇをプラスミドｐＩＪ４３の〜
２．５ｋｂ フラグメント（実施例２１ＢおよびＣで
調製）１μｇ と、実施例８Ｃと実質的に同様にしてラ
イゲーションする。〜２．５ ｋｂ ＢａｍＨＩ フ
ラグメントはどちらの方向性もとり得るため、２つの方
向性の異なる組換えプラスミドが生成する。得られたプ
ラスミドｐＦＪ２１．５およびｐＦＪ２１６ は適当な
宿主細胞中に形質転換し、次いで制限酵素およびアガロ
ースゲル電気泳動（こよって常套の方法で同定できる（
Ｄａｖｉ ｓ 、 Ｒ，Ｗ、等、１９８０’） 。各
々のプラスミドｐＦ’Ｊ２１５およびｐＦＪ２１６の缶
１１ ｊ８艮サイトおよび機能地図を添付の第６図に示
した。
実施例２２ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｓ／ｐＦ’Ｊ２１５およびＳ、 ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｓ ／ｐＦ Ｊ２１６の組み立て実施例８Ｃ
からのＤＮＡではなくプラスミドＰ１・Ｊ２１５および
ｐ Ｆ” Ｊ ２１６ のＤ Ｎ Ａを使用する以外は
、実施例９と実質的に同様にして所望の組み立てを行な
う。目的とする形質転換体は、培養プレートの濃度か５
０μ９７ｍ１となるに十分なエリスロマイシンを含有す
るに２培地積層（ｔｏｐ）寒天を再生したプロトプラス
トに積層することにより、エリスロマイシン耐性につい
て選択を行なう。
ａｃｉｅｎｓ／ｐＦ’Ｊ２１５およびＳ、 ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｓ ／ｐＦ Ｊ２１６の組み立て実施例８Ｃ
からのＤＮＡではなくプラスミドＰ１・Ｊ２１５および
ｐ Ｆ” Ｊ ２１６ のＤ Ｎ Ａを使用する以外は
、実施例９と実質的に同様にして所望の組み立てを行な
う。目的とする形質転換体は、培養プレートの濃度か５
０μ９７ｍ１となるに十分なエリスロマイシンを含有す
るに２培地積層（ｔｏｐ）寒天を再生したプロトプラス
トに積層することにより、エリスロマイシン耐性につい
て選択を行なう。
得られたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２１５およびＳ、ａｍｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ ２１６ｘ ＩＪ スｏ ７ イシ
７耐性コロニーを既知の方法で分１雌、培養し、チオス
トレプトン耐性について試験し、次いで常法により構成
プラスミドの制限酵素分析とアガロースゲル電気泳動分
析により同定する（ Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ、１９７９
）。所望の形質転換体は、続いて各々のプラスミド））
ＦＪ２１５ およびＰＦＪ２１６ の生産および分Ｓ！
ｌのため培養する。
ｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２１５およびＳ、ａｍｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ ２１６ｘ ＩＪ スｏ ７ イシ
７耐性コロニーを既知の方法で分１雌、培養し、チオス
トレプトン耐性について試験し、次いで常法により構成
プラスミドの制限酵素分析とアガロースゲル電気泳動分
析により同定する（ Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ、１９７９
）。所望の形質転換体は、続いて各々のプラスミド））
ＦＪ２１５ およびＰＦＪ２１６ の生産および分Ｓ！
ｌのため培養する。
実施例２３ キメラプラスミドｐＦＪ２１９ および１
）ＦＪ２２０ の子且み立て 実施例２のライゲーション法と実質的（こ同様にして、
プラスミドＰＦＪ１７０ のＢ ａｍ Ｈ、［：部分消
化物（実施例１９に従って調製）とＢａｍ、Ｉ’ｌ Ｉ
消化プラスミドＰＢＲ３２２（実施例６Ｂで調製）とを
ライゲーションすることにより、所望のキメラプラスミ
ドを得る。所望のキメラプラスミドＤＮＡを遠心して集
め、７０％エタノールで洗浄し、減圧乾燥後ＴＥｉ衝液
５０μｌに懸濁する。制限プラスミドＰＢＲ３２２はど
ちらの方向性もとり得るため、２つの方向性の異なる組
換えプラスミドが生成する。各々のプラスミドＩ）ＦＪ
２］９ およびｐＦＪ２２０ の制限サイトおよび機能
地図を添付の＄７図に示した。
）ＦＪ２２０ の子且み立て 実施例２のライゲーション法と実質的（こ同様にして、
プラスミドＰＦＪ１７０ のＢ ａｍ Ｈ、［：部分消
化物（実施例１９に従って調製）とＢａｍ、Ｉ’ｌ Ｉ
消化プラスミドＰＢＲ３２２（実施例６Ｂで調製）とを
ライゲーションすることにより、所望のキメラプラスミ
ドを得る。所望のキメラプラスミドＤＮＡを遠心して集
め、７０％エタノールで洗浄し、減圧乾燥後ＴＥｉ衝液
５０μｌに懸濁する。制限プラスミドＰＢＲ３２２はど
ちらの方向性もとり得るため、２つの方向性の異なる組
換えプラスミドが生成する。各々のプラスミドＩ）ＦＪ
２］９ およびｐＦＪ２２０ の制限サイトおよび機能
地図を添付の＄７図に示した。
実施例２４ Ｅ、 ｃｏｌｉＫ１２ Ｉ（ＢＩＯＩ／
ＰＦＪ２１９およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２１−（ＢＩＯ
Ｉ／ＰＦＪ２２０の組み立てプラスミドＰＬＲ２ではな
く、実施例２３からのプラスミドＤＮＡを形質転換に使
用する以外は、実施例３と実質的に同様にして、所望の
組み立てを行なう。生き残ったコロニーを、まず選択し
、期待される表現型（ＡｍｐＲ，Ｔｅｔ” ） Ｌこ
ついての試験を行ない、次いで構成プラスミドの制限酵
素分析とアカロースケル電気泳動分析（Ｄａｖｉ ｓ
、 Ｒ，Ｗ。
ＰＦＪ２１９およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２１−（ＢＩＯ
Ｉ／ＰＦＪ２２０の組み立てプラスミドＰＬＲ２ではな
く、実施例２３からのプラスミドＤＮＡを形質転換に使
用する以外は、実施例３と実質的に同様にして、所望の
組み立てを行なう。生き残ったコロニーを、まず選択し
、期待される表現型（ＡｍｐＲ，Ｔｅｔ” ） Ｌこ
ついての試験を行ない、次いで構成プラスミドの制限酵
素分析とアカロースケル電気泳動分析（Ｄａｖｉ ｓ
、 Ｒ，Ｗ。
等、１．９８０ ）により、所望のＥ、 ｃｏｌｉ Ｉ
ぐ１２ＨＢ１．０１／Ｐｌ″’Ｊ２１９ およびＥｊ
ｏｌｉ Ｋ１２． ＨＢＩＯＩ／ＰＦＪ２２０形質転換
体であることを常法により同定する。
ぐ１２ＨＢ１．０１／Ｐｌ″’Ｊ２１９ およびＥｊ
ｏｌｉ Ｋ１２． ＨＢＩＯＩ／ＰＦＪ２２０形質転換
体であることを常法により同定する。
およびＳ、 ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ
２２０の組み立てプラスミｔ’ｐＦＪ２０４ おヨｉＪ
’ ｐ Ｆ Ｊ ２０５ テハｆｉく、プラスミドｐＦ
Ｊ２１９ およびｐＦＪ２２０ を形質転換に使用する
以外は、実施例９と実質的に同様にして所望の組み立て
を行なう。得られた形質転換体は、前述の実施例９に記
載の方法を用いて、チオストレプトン耐性について選択
する。こうして組み立てられたチオストレプトン耐性Ｓ
ｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ｐ Ｆ Ｊ ｌ ｌ ９およびＳ、 ａｍｂｏ −ｆ
ａｃｉｅｎｓ ／ｐＦＪ ２２０ の：ｌＯ’−−ｙ；
；：、既知の方法で分離し、次いで構成プラスミドの制
限酵素分析および電気泳動分析（こより、常法に従って
同定する。
２２０の組み立てプラスミｔ’ｐＦＪ２０４ おヨｉＪ
’ ｐ Ｆ Ｊ ２０５ テハｆｉく、プラスミドｐＦ
Ｊ２１９ およびｐＦＪ２２０ を形質転換に使用する
以外は、実施例９と実質的に同様にして所望の組み立て
を行なう。得られた形質転換体は、前述の実施例９に記
載の方法を用いて、チオストレプトン耐性について選択
する。こうして組み立てられたチオストレプトン耐性Ｓ
ｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ｐ Ｆ Ｊ ｌ ｌ ９およびＳ、 ａｍｂｏ −ｆ
ａｃｉｅｎｓ ／ｐＦＪ ２２０ の：ｌＯ’−−ｙ；
；：、既知の方法で分離し、次いで構成プラスミドの制
限酵素分析および電気泳動分析（こより、常法に従って
同定する。
既に述べた方法（こ従って組み立てることのできる代表
的なプラスミドを以下の表１に挙ける。
的なプラスミドを以下の表１に挙ける。
第１図はプラスミドｐＮＭ１００およびｐＦＪ １４３
の制限サイト地図、第２図はプラスミドｐＬＲ１、ＰＬ
Ｒ２およびｐＬＲ４の制限サイト地図、第３図はプラス
ミドｐＦＪ２０４、ＰＦＪ２０５、ｐＦＪ２０６および
ｐＦＪ２０７の制限サイト地図、第４図はプラスミドｐ
ＦＪ２０８ および１）ＦＪ２０９ の制限サイト地図
、第５図はプラスミドｐＦＪ１７０、ｐＦＪ２１０、Ｐ
ＦＪ２１１およびｐＦＪ２１２の制限サイト地図、第６
図はプラスミドＰＦＪ２１３、ｐＦＪ２１４、ｐ Ｆ
Ｊ２１５′およびｐＦＪ ２１６の制限サイト地図、第
７図はプラスミドＰＦＪ ２１９ およびｐＦＪ２２０
の制限サイト地図である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンパニー代
理 人 弁理士 青白 葆 外１名４８６一 ＦＩＧ、 ＋ ｐＮＭｌｏｏ ５涸Ｉ ＦＩＧ、 ２ ＦＩＧ、 ３ ｐｎ １ ３、ｐＦＪ ２０６ （〜７．２ ｋｂ）４、ｐＦＪ
２０７ （〜７．２ ｋｂ）ＦＩＧ、４ １、 ｐＦＪ ２０８ （〜８．８ ｋｂ）２、 ｐＦ
Ｊ ２０９ （〜８．８ ｋｂ）ＦＩＧ、 ５ １． ｐＦＪ １７０ （〜５．６ ｋｂ）２、 ｐＦ
Ｊ ２１０ （〜５．６ ｋｂ）３、 ｐＦＪ ２１１
（〜７．４ ｋｂ）４、 ｐＦＪ ２１２ （〜７．
４ ｋｂ）１、 ｐＦＪ ２ｊ３ （〜９ ｋｂ）２、
ｐＦＪ ２ｊ４ （〜９ ｋｂ） １、 ｐＦＪ２１５ （〜６．５ ｋｂ）２、ｐＦＪ
２１６ （〜６．５ ｋｂ）ＦＩＧ、７ ２、 ｐＦＪ ２２０ （〜１０ｋｂ）アメリカ合衆国
インディアナ４６ ２０５インデイアナポリス・ノー ス・パーク・アベニュー４３１５番 ０発 明 者 ジエイムズ・アルバート・メイツ アメリカ合衆国インディアナ４６ ２５９インデイアナポリス・リト ル・オーク・レイン７４１０番 （□□□発 明 暑 ワルター”・ミツオ・ナカツカサ
アメリカ合衆国インディアナ４６ ２２フインデイアナポリス・クロ スマン・ドライブ２１１８番
の制限サイト地図、第２図はプラスミドｐＬＲ１、ＰＬ
Ｒ２およびｐＬＲ４の制限サイト地図、第３図はプラス
ミドｐＦＪ２０４、ＰＦＪ２０５、ｐＦＪ２０６および
ｐＦＪ２０７の制限サイト地図、第４図はプラスミドｐ
ＦＪ２０８ および１）ＦＪ２０９ の制限サイト地図
、第５図はプラスミドｐＦＪ１７０、ｐＦＪ２１０、Ｐ
ＦＪ２１１およびｐＦＪ２１２の制限サイト地図、第６
図はプラスミドＰＦＪ２１３、ｐＦＪ２１４、ｐ Ｆ
Ｊ２１５′およびｐＦＪ ２１６の制限サイト地図、第
７図はプラスミドＰＦＪ ２１９ およびｐＦＪ２２０
の制限サイト地図である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンパニー代
理 人 弁理士 青白 葆 外１名４８６一 ＦＩＧ、 ＋ ｐＮＭｌｏｏ ５涸Ｉ ＦＩＧ、 ２ ＦＩＧ、 ３ ｐｎ １ ３、ｐＦＪ ２０６ （〜７．２ ｋｂ）４、ｐＦＪ
２０７ （〜７．２ ｋｂ）ＦＩＧ、４ １、 ｐＦＪ ２０８ （〜８．８ ｋｂ）２、 ｐＦ
Ｊ ２０９ （〜８．８ ｋｂ）ＦＩＧ、 ５ １． ｐＦＪ １７０ （〜５．６ ｋｂ）２、 ｐＦ
Ｊ ２１０ （〜５．６ ｋｂ）３、 ｐＦＪ ２１１
（〜７．４ ｋｂ）４、 ｐＦＪ ２１２ （〜７．
４ ｋｂ）１、 ｐＦＪ ２ｊ３ （〜９ ｋｂ）２、
ｐＦＪ ２ｊ４ （〜９ ｋｂ） １、 ｐＦＪ２１５ （〜６．５ ｋｂ）２、ｐＦＪ
２１６ （〜６．５ ｋｂ）ＦＩＧ、７ ２、 ｐＦＪ ２２０ （〜１０ｋｂ）アメリカ合衆国
インディアナ４６ ２０５インデイアナポリス・ノー ス・パーク・アベニュー４３１５番 ０発 明 者 ジエイムズ・アルバート・メイツ アメリカ合衆国インディアナ４６ ２５９インデイアナポリス・リト ル・オーク・レイン７４１０番 （□□□発 明 暑 ワルター”・ミツオ・ナカツカサ
アメリカ合衆国インディアナ４６ ２２フインデイアナポリス・クロ スマン・ドライブ２１１８番
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ａ）プラスミドｐＮＭ１００の機能的複製起源含有
制限フラグメント、および １））形質転換、細胞分裂および培養可能な感受性宿主
細胞中（こ導入した時、少なくとも１つの抗生物質に対
する耐性を付与する１またはそれａ、上のＤＮＡセグメ
ント、 からなる組換えＤＮＡクローニングベクター。 ２、 ｐＮＭ １００の制限フラグメントが〜３８ｋｂ
ＢａｍＨＩ制限フラクメントである第１項記載のクロー
ニングベクター。 ３、ＰＮＭｌｏｏの制限フラグメントがプラスミドｐＦ
Ｊ１４３ の〜４ ｋ ｂ Ｂａｍ ＨＩ 制限フラ
グメントである第１項記載のクローニングベクター。 ４．１個のＤ Ｎ ＡセグメントがチオスＩ・レプトン
に対する抗生物質耐性を付与する第１項記載のクローニ
ングベクター。 ５、１ 個のＤＮＡセグメントかネオマイシンに対する
抗生物質耐性を付与する第１項記載のクローニングベク
ター。 ６１個のＤＮＡセグメントがエリスロマイシンに対する
抗生物質耐性を付与する第１項記載のクローニングベク
ター。 ７．１個のｉ） Ｎ Ａセグメントがプラスミドｐ’
Ｉ−Ｒ２の〜１．６ｋｂ Ｂａｍ Ｈ：［制限フラグメ
ントである第４項記載のクローニングベクター。 ８．１個のＤＮＡセグメントがプラスミドｐ Ｌ Ｒｌ
の〜３．４ ｋｂ １３ａｍ ＨＩ制限フラクメントで
ある第５項記載のクローニングベクター。 ９．１個のＤＮＡセグメントが、プラスミドｐｌＪ４３
の〜２．８ ｋｂ Ｓａｌ Ｉ 、〜２．７ ｋｂ Ｓ
ａｌ ｌ−１３ｇ１ ■、〜３，０ｋｂＨ１ｎｄ■、〜
２．５ ｋｂ Ｓａｌ Ｉ−１ｌ−１３ａ 。 〜２．８ｋｂ ＸｈｏＩ −Ｂｇｌ Ｔｌ、または〜４
．１ｋｂＥｃ。 技■−ＢａｍＨＩ制限フラグメントである第６項記載の
クローニングベクター。 １０、プラスミドｐＦＪ２０４ 、ＰＦＪ２０５、ｐＦ
Ｊ２０６、ＰＦＪ２０７、ｐＦＪ２０８、ｐＦＪ２０９
、ｐＦＪ１７０、ｐＦＪ２１０、ＰＦＪ２１１、ＰＦＪ
２１２、ｐＦＪ２１３、ＰＦＪ２１４、ｐＦＪ２１５、
ＰＦＪ２１６、ＰＦＪ２２１、ｐＦＪ２２２、ＰＦＪ２
２３、ＰＦＪ２２４、ｐＦＪ２２５、ＰＦＪ２２６、Ｐ
ＦＪ２２７、ＰＦＪ２２８、ｐＦＪ２２９、ＰＦＪ２３
０．ＰＦＪ２３１、ＰＦＪ２３２、ｐＦＪ２３３、ＰＦ
Ｊ２３４、ＰＦＪ２３５、ｐ ＦＪ ２３６、ｐＦＪ２
３７、ｐＦＪ２３８、ｐＮＭｌｏｌ、ｐＮＭ］、Ｑ２、
ｐＮＭ１０３、ｐ ＮＭ １０４、ＰＦＪ２６５、また
はｐＦＪ ２６６である第１項記載のクローニングベク
ター。 １１、 Ｅ、ｃ：ｏｌｉ中でイ幾能的なレプリコン、
Ｅ、 ｃｏｌｉ中での抗生物質耐性を付与する１）ＮＡ
セクメント、および第１項記載のプラスミドを含む制限
フラグメントからなる組換えＤＮＡクローニングベクタ
ー。 １２、 Ｅｏ、 ｃｏｌ ｉ中で］諷能的なレプリコン
およびＥ。 ｃｏｌ ｉ中での抗生物質耐性を付与するＤＮＡセグメ
ントがプラスミドＰＢＲ’３２２ 、ＰＢＲ３２４、Ｐ
ＢＲ３２５、またはＰＢＲ３２８からなる第１１項記載
のクローニングベクター。 １３、プラスミドＰＦＪ２１９ 、ＰＦＪ２２０ 、Ｐ
ＦＪ２３９、ＰＦＪ２４０ 、ＰＦＪ２４２、ＰＦＪ２
４３．ｐＦＪ２４４、ｐＦＪ２４５、ｐＦＪ２４６、Ｐ
ＦＪ２４７、ｐＦＪ２４８、ＰＦＪ２４９、ＰＦＪ２５
０、ＰＦＪ２５１、ｐＦＪ２５２、またはｐＦＪ２５３
である第１１項または第１２項記載のクローニングベク
ター。 １４、プラスミドＰＮＭ１００またはプラスミドｐＦＪ
１４３ 。 １５、第１項〜第１４項のいずれかに記載の組換えＤＮ
Ａクローニングベクターを含む形質転換された宿主細胞
。 １６ クローニングベクターがプラスミドである第１
５項記載の宿主細胞。 １７、 Ｓ ｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ 、好ましくは
その種がａｍｂｏ −ｆａｃｉｅｎｓ ａｕｒｅｏｆ
ａｃｉｅｎｓ 、 ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ ｆｒ
ａｄｉａｅＩ １ｖｉｄａｎｓ 、 ｇｒａｎｕｌｏｒ
ｕｂｅｒ 、 ｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ 、またはｃｉ
ｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓである第１６項記載の宿主細胞
。 １８、第１１項、第１２項または第１３項のいずれかに
記載の組換えＤＮＡクローニングベクターを含む形質転
換された宿主細胞。 １９、 Ｅ、 ｃｏｌ ｉである第１８項記載の宿主細
胞。 ２０、 プラスミドｐＮＭ１００の〜３８ｋｂ Ｂａ
ｍ Ｈ■制限フラグメント。 ２１、プラスミドＰＦＪ１４３ の〜４ ｋｌ〕Ｂａｍ
Ｈ■市１１ｉ≦艮フラグメント。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US452168 | 1982-12-22 | ||
| US06/452,168 US4468462A (en) | 1982-12-22 | 1982-12-22 | Vectors for cloning in streptomyces |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59166088A true JPS59166088A (ja) | 1984-09-19 |
Family
ID=23795344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58241807A Pending JPS59166088A (ja) | 1982-12-22 | 1983-12-20 | ストレプトマイセスへのクロ−ニング用ベクタ− |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4468462A (ja) |
| EP (1) | EP0115173A3 (ja) |
| JP (1) | JPS59166088A (ja) |
| AU (1) | AU2256183A (ja) |
| CA (1) | CA1207252A (ja) |
| DD (1) | DD219796A5 (ja) |
| DK (1) | DK586683A (ja) |
| FI (1) | FI834671A (ja) |
| GB (1) | GB2132208B (ja) |
| GR (1) | GR81508B (ja) |
| IL (1) | IL70494A0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6181787A (ja) * | 1984-09-28 | 1986-04-25 | Nippon Kayaku Co Ltd | 新規なプラスミドベクタ− |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4663285A (en) * | 1981-01-06 | 1987-05-05 | The Public Health Laboratory Service Board | Chimeric plasmids |
| US4667024A (en) * | 1983-07-13 | 1987-05-19 | Smithkline Beckman Corporation | Process for the preparation of purified vancomycin class antibiotics |
| US4643975A (en) * | 1984-01-05 | 1987-02-17 | Eli Lilly And Company | Novel cloning vectors for use in streptomyces, escherichia coli and related organisms |
| US4666846A (en) * | 1984-02-17 | 1987-05-19 | Eli Lilly And Company | Novel cloning vectors containing selectable genetic markers for use in streptomyces and related organisms |
| US4752577A (en) * | 1984-09-13 | 1988-06-21 | Eli Lilly And Company | Method for using a novel transcriptional- and translational-activating sequence in streptomyces |
| US4680265A (en) * | 1984-09-25 | 1987-07-14 | Eli Lilly And Company | Method of selecting recombinant DNA-containing streptomyces |
| USRE34875E (en) * | 1984-09-25 | 1995-03-14 | Eli Lilly And Company | Method of selecting recombinant DNA-containing streptomyces |
| US4898828A (en) * | 1985-08-07 | 1990-02-06 | Eli Lilly And Company | Ultrahigh copy number streptomycetes plasmids |
| US4994389A (en) * | 1987-03-10 | 1991-02-19 | American Cyanamid Company | Promoter-probe plasmid for analysis of transcriptional regulation |
| US5002891A (en) * | 1987-07-02 | 1991-03-26 | American Cyanamid Company | Multifunctional plasmid vectors from Actinomadura and Escherichia coli |
| US4983525A (en) * | 1987-07-02 | 1991-01-08 | American Cyanamid Company | Plasmids derived from actinomadura species |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4273875A (en) * | 1979-03-05 | 1981-06-16 | The Upjohn Company | Plasmid and process of isolating same |
| GB2048894A (en) * | 1979-05-11 | 1980-12-17 | Gist Brocades Nv | Plasmid |
| US4332900A (en) * | 1980-10-01 | 1982-06-01 | The Upjohn Company | Construction of co-integrate plasmids from plasmids of Streptomyces and Escherichia |
| EP0058002A3 (en) * | 1981-01-26 | 1983-06-29 | The Upjohn Company | Process for stabilising potential plasmid vectors and novel plasmids |
| JPS57188600A (en) * | 1981-05-15 | 1982-11-19 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Novel actinomycetic plasmid |
| JPS57193497A (en) * | 1981-05-23 | 1982-11-27 | Hiroshi Ogawara | Recombinant plasmid |
| US4513086A (en) * | 1981-10-15 | 1985-04-23 | Eli Lilly And Company | Cloning vectors for use in streptomyces and related organisms |
| US4416994A (en) * | 1981-10-19 | 1983-11-22 | Eli Lilly And Company | Plasmid pEL7 and related cloning vectors for use in streptomyces and related organisms |
| US4503155A (en) * | 1982-02-01 | 1985-03-05 | Eli Lilly And Company | Multifunctional, cloning vectors for use in Streptomyces, Bacillus, and E. coli |
| ZA832526B (en) * | 1982-04-16 | 1984-11-28 | Lilly Co Eli | Chimeric cloning vectors for use in streptomyces and e.coli |
| EP0092388B2 (en) * | 1982-04-16 | 1994-10-26 | Eli Lilly And Company | Cloning vectors |
| GB2107717B (en) * | 1982-10-14 | 1985-01-30 | Lilly Co Eli | Cloning vectors |
-
1982
- 1982-12-22 US US06/452,168 patent/US4468462A/en not_active Expired - Fee Related
-
1983
- 1983-12-19 FI FI834671A patent/FI834671A/fi not_active Application Discontinuation
- 1983-12-20 DD DD83258233A patent/DD219796A5/de unknown
- 1983-12-20 GR GR73286A patent/GR81508B/el unknown
- 1983-12-20 IL IL70494A patent/IL70494A0/xx unknown
- 1983-12-20 CA CA000443735A patent/CA1207252A/en not_active Expired
- 1983-12-20 DK DK586683A patent/DK586683A/da not_active Application Discontinuation
- 1983-12-20 JP JP58241807A patent/JPS59166088A/ja active Pending
- 1983-12-20 AU AU22561/83A patent/AU2256183A/en not_active Abandoned
- 1983-12-21 EP EP83307817A patent/EP0115173A3/en not_active Ceased
- 1983-12-21 GB GB08334097A patent/GB2132208B/en not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.BACTERIOL=1981 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6181787A (ja) * | 1984-09-28 | 1986-04-25 | Nippon Kayaku Co Ltd | 新規なプラスミドベクタ− |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI834671A (fi) | 1984-06-23 |
| US4468462A (en) | 1984-08-28 |
| DK586683D0 (da) | 1983-12-20 |
| CA1207252A (en) | 1986-07-08 |
| GB2132208A (en) | 1984-07-04 |
| FI834671A0 (fi) | 1983-12-19 |
| EP0115173A2 (en) | 1984-08-08 |
| IL70494A0 (en) | 1984-03-30 |
| GB2132208B (en) | 1987-03-18 |
| DD219796A5 (de) | 1985-03-13 |
| DK586683A (da) | 1984-06-23 |
| GR81508B (ja) | 1984-12-11 |
| EP0115173A3 (en) | 1985-08-07 |
| AU2256183A (en) | 1984-06-28 |
| GB8334097D0 (en) | 1984-02-01 |
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