JPS6185199A - ストレプトマイセスに機能的ポリペプチドを製造させるためのバクテリオフアージプロモーター - Google Patents
ストレプトマイセスに機能的ポリペプチドを製造させるためのバクテリオフアージプロモーターInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ）内で、機能的ポリペプチドを生産するために、バ
クテリオファージ・ラムダ（λ）ＰＬプロモーターを用
いる方法に関するものである。更に詳しくは、ストレプ
トマイセス宿主細胞を、１）バクテリオファージ・ラム
ダＰＬプロモーター−オペレーター転写活性化配列、２
）翻訳活性化配列、および３）機能的ポリペプチドをコ
ードしているＤ Ｎ Ａ配列を含んでいる選択可能かつ
自己複製可能な組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換す
ることに関するものである。上記の発現ベクターは、転
写時に、翻訳可能なＩｎλＮＡ転写物を生成する様、組
立てられている。本発明はまた、上記の方法を実施する
のに必要な形質転換体に関するものである。
ｅｓ）内で、機能的ポリペプチドを生産するために、バ
クテリオファージ・ラムダ（λ）ＰＬプロモーターを用
いる方法に関するものである。更に詳しくは、ストレプ
トマイセス宿主細胞を、１）バクテリオファージ・ラム
ダＰＬプロモーター−オペレーター転写活性化配列、２
）翻訳活性化配列、および３）機能的ポリペプチドをコ
ードしているＤ Ｎ Ａ配列を含んでいる選択可能かつ
自己複製可能な組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換す
ることに関するものである。上記の発現ベクターは、転
写時に、翻訳可能なＩｎλＮＡ転写物を生成する様、組
立てられている。本発明はまた、上記の方法を実施する
のに必要な形質転換体に関するものである。
従来技術
本発明は、組換えＤＮＡ技術を用いてストレプトマイセ
ス宿主細胞内で、機能的ポリペプチドを発現させる方法
を提供するものである。本発明より以前には、特性化さ
れたストレプトマイセス・プロモーターが一般的に欠如
していたため、該微生物における組換えＤＮＡ技術の発
展と開発は遅れており、時間のかかる問題であった。他
方、数多（の大腸菌（Ｅｓｃｌｌｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ）プロモーター系に関しては特性化がなされて
いる。例えばバクテリオファージ・ラムダＰＬプロモー
ター（λ左側プロモーター）は、い（つかの発現ベクタ
ーに一般的に用いられている、強く、充分に制御された
プロモーターである。λＰＬプロモーターにおける転写
の開始は、ファージ遺伝子ＣＩの顔物によって、検出限
界以下のレベル（こ抑制されることか分っている。温度
感受性レプレッサーをコードしているｃｌ遺伝子の突然
変異体を得ることかでき〔リーブ（Ｌｉｅｂ、Ｍ、）、
１９６６、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジイ（Ｊ 、 Ｍｏｌ。
ス宿主細胞内で、機能的ポリペプチドを発現させる方法
を提供するものである。本発明より以前には、特性化さ
れたストレプトマイセス・プロモーターが一般的に欠如
していたため、該微生物における組換えＤＮＡ技術の発
展と開発は遅れており、時間のかかる問題であった。他
方、数多（の大腸菌（Ｅｓｃｌｌｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ）プロモーター系に関しては特性化がなされて
いる。例えばバクテリオファージ・ラムダＰＬプロモー
ター（λ左側プロモーター）は、い（つかの発現ベクタ
ーに一般的に用いられている、強く、充分に制御された
プロモーターである。λＰＬプロモーターにおける転写
の開始は、ファージ遺伝子ＣＩの顔物によって、検出限
界以下のレベル（こ抑制されることか分っている。温度
感受性レプレッサーをコードしているｃｌ遺伝子の突然
変異体を得ることかでき〔リーブ（Ｌｉｅｂ、Ｍ、）、
１９６６、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジイ（Ｊ 、 Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ 、 ） １６ ： １４９）、これによって
、ＰＬによる転写が低温では抑制され、高温で開始され
る様にすることができる。この様に、このプロモーター
は大腸菌内でコントロール可能である、という明確な利
点を有し、この特性は、大規模な微生物発酵生産にとっ
て極めて望ましいことである。このλＣ１遺伝子かλＰ
Ｌプロモーターと同じプラスミドベクター、または別の
ベクター上に存在しているが、あるいは染色体に祖述ま
れていてストレプトマイセス内で発現される限り、この
λＰＬプロモーターはストレプトマイセス内でもフント
ロールすることができる。λｃｒｏ遺伝子産物（Ｃ「０
リフレツナー）ヲ用いても、ストレプトマイセス内での
λＰＬ発現をコントロールすることができる。
、ＰＬによる転写が低温では抑制され、高温で開始され
る様にすることができる。この様に、このプロモーター
は大腸菌内でコントロール可能である、という明確な利
点を有し、この特性は、大規模な微生物発酵生産にとっ
て極めて望ましいことである。このλＣ１遺伝子かλＰ
Ｌプロモーターと同じプラスミドベクター、または別の
ベクター上に存在しているが、あるいは染色体に祖述ま
れていてストレプトマイセス内で発現される限り、この
λＰＬプロモーターはストレプトマイセス内でもフント
ロールすることができる。λｃｒｏ遺伝子産物（Ｃ「０
リフレツナー）ヲ用いても、ストレプトマイセス内での
λＰＬ発現をコントロールすることができる。
ストレプトマイセスにおける・転写および翻訳信号に関
する知識が一般的に大知しでいるために、ストレプトマ
イセス内で機能する代替信号の開発か要求されている。
する知識が一般的に大知しでいるために、ストレプトマ
イセス内で機能する代替信号の開発か要求されている。
発明の構成および目的
本発明は、λＰＬプロモーター転写活性化配列を、事実
上、あらゆるポリペプチドをストレプトマイセス内で発
現させる目的で用いる方法に関するものである。このス
トレプトマイセス内でポリペプチドを発現させる方法は
、工業技術面での意義ある進歩、並びにグラム陽性微生
物における組換えＤＮＡ技術の適用範囲を大いに拡張す
るものである。
上、あらゆるポリペプチドをストレプトマイセス内で発
現させる目的で用いる方法に関するものである。このス
トレプトマイセス内でポリペプチドを発現させる方法は
、工業技術面での意義ある進歩、並びにグラム陽性微生
物における組換えＤＮＡ技術の適用範囲を大いに拡張す
るものである。
ストレプトマイセス内での遺伝子のクローニングおよび
生成物の発現は、該微生物が実質上、非病りル性であり
、一般的に内毒素を産生じないことから極めて有益であ
る。加えて、ストレプトマイセスは、抗生［′−１質並
びに光［（４惜界で広・ｊａ団に研究され、良（知られ
ており、理解されている。本発明方法並びにそれに関連
する発現ベクターおよび形質転換体は、それらによって
Ｌ記の！１ｌＩＩＩ要な利点を商業的に活用することか
できるという戟において、特に重要である。
生成物の発現は、該微生物が実質上、非病りル性であり
、一般的に内毒素を産生じないことから極めて有益であ
る。加えて、ストレプトマイセスは、抗生［′−１質並
びに光［（４惜界で広・ｊａ団に研究され、良（知られ
ており、理解されている。本発明方法並びにそれに関連
する発現ベクターおよび形質転換体は、それらによって
Ｌ記の！１ｌＩＩＩ要な利点を商業的に活用することか
できるという戟において、特に重要である。
本明細ａ中に記載した発明の理解を助けるために、以下
に用語を定義する。
に用語を定義する。
組換えＤ Ｎ Ａクローニングベクター：１またはそれ
以上のＤＮＡセグメントを付加することのできる、もし
くはそれらか既に付加されたＤＮＡ分子からなる自律的
複製本であって、プラスミドを含むがこれ番こ限定され
ない。
以上のＤＮＡセグメントを付加することのできる、もし
くはそれらか既に付加されたＤＮＡ分子からなる自律的
複製本であって、プラスミドを含むがこれ番こ限定され
ない。
組換えＤＮＡ発現ベクター＝１またはそれ以上の転写お
よび翻訳活性化配列か挿入された組換えＤＮＡクローニ
ングベクター。
よび翻訳活性化配列か挿入された組換えＤＮＡクローニ
ングベクター。
転写活性化配列：ＤＮＡのＩｎλＮ 、Ａ転写物への転
写を指令し、または転写を与えるＤＮＡ配列。
写を指令し、または転写を与えるＤＮＡ配列。
翻訳活性化配列：ｍにＮＡ転写物のペプチドまたはポリ
ペプチドへの翻訳を指令し、または与えるＤ Ｎ Ａ配
列。
ペプチドへの翻訳を指令し、または与えるＤ Ｎ Ａ配
列。
ａｔＥ的ポリペプチド：回収可能な、生物活性を有する
ヘテロローガスなポリペプチドまたはその前駆物質、ヘ
テロローガスなポリペプチドとホモローガスなポリペプ
チドの一部または全部から成る回収可能で生物学的に活
性なポリペプチド、あるいはヘテロローガスなポリペプ
チドと生物学的に不活化されている、特異的に開裂され
得るポリペプチドＸ１ｌ）ら成る回収可能で、生物学的
に非活性な融合ポリペプチド。
ヘテロローガスなポリペプチドまたはその前駆物質、ヘ
テロローガスなポリペプチドとホモローガスなポリペプ
チドの一部または全部から成る回収可能で生物学的に活
性なポリペプチド、あるいはヘテロローガスなポリペプ
チドと生物学的に不活化されている、特異的に開裂され
得るポリペプチドＸ１ｌ）ら成る回収可能で、生物学的
に非活性な融合ポリペプチド。
制限フラグメント：１または１以上の制限酵素の作用に
より生成した線状ＤＮＡ。
より生成した線状ＤＮＡ。
感受性宿主細胞：ある特定の抗生物質に対する耐性を付
与するＤＮＡセグメントなしでは該抗生物質の存在下で
増殖し得ない宿主細胞。
与するＤＮＡセグメントなしでは該抗生物質の存在下で
増殖し得ない宿主細胞。
形質転換：宿主細胞にＤＮＡを導入し、逍伝型を変化さ
せ、結果的に宿主細胞に変化をもたらすこと。
せ、結果的に宿主細胞に変化をもたらすこと。
形質転換体：形質転換を受けた宿主受容細胞。
大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌ ｉ ）の復′、！′！起源（レ
プリコン）：大腸菌内Ｉこ於けるプラスミド、あるいは
他のベクターの複うりを制御したり、許容したりするＤ
Ｎへ配列。
プリコン）：大腸菌内Ｉこ於けるプラスミド、あるいは
他のベクターの複うりを制御したり、許容したりするＤ
Ｎへ配列。
ストレプトマイセスの’ＩＵ＝ｔＱ＜レプリコン）：ス
トレプトマイセスにおいて、プラスミドまたは他のベク
ターの複製を制御したり、許容したりするＤＮへ配列。
トレプトマイセスにおいて、プラスミドまたは他のベク
ターの複製を制御したり、許容したりするＤＮへ配列。
本発明は、ストレプトマイセス内で、機能的ポリペプチ
ドを生産する方法であって、 リ ストレプトマイセス宿主細胞を、１）バクテリオフ
ァージλＰＬプロモーター−オペレーター転写活性化配
列、２）翻訳活性化配列、および３）は能的ポリペプチ
ドをコードしているＤＮ Ａ配列、を含育している選択
可能かつ自己復製ＩＪＴ！Ｅな棺換えＤＮＡ発現ベク舛
により形′ｆｉ転換し、Ｉ））該形質転換細胞を該ポリ
ペプチドの発現に適した条トド下で培養することからな
る方法を提供するものである（ただし、翻訳可能なｍ
ＲＮ Ｘ転写物が１該機能的ポリペプチドをコードする
様に、１該発現ベクターは該λＰＬプロモーター−オペ
レーター転写活性化配列、該謝訳活性化配列および・澄
詣的ポリペプチドをコードしている該Ｄ Ｎ Ａ配列を
連続して含有していることを条件とする）。
ドを生産する方法であって、 リ ストレプトマイセス宿主細胞を、１）バクテリオフ
ァージλＰＬプロモーター−オペレーター転写活性化配
列、２）翻訳活性化配列、および３）は能的ポリペプチ
ドをコードしているＤＮ Ａ配列、を含育している選択
可能かつ自己復製ＩＪＴ！Ｅな棺換えＤＮＡ発現ベク舛
により形′ｆｉ転換し、Ｉ））該形質転換細胞を該ポリ
ペプチドの発現に適した条トド下で培養することからな
る方法を提供するものである（ただし、翻訳可能なｍ
ＲＮ Ｘ転写物が１該機能的ポリペプチドをコードする
様に、１該発現ベクターは該λＰＬプロモーター−オペ
レーター転写活性化配列、該謝訳活性化配列および・澄
詣的ポリペプチドをコードしている該Ｄ Ｎ Ａ配列を
連続して含有していることを条件とする）。
λ■）Ｌプロモーターは、例えばｌ） −Ｌバイオケミ
カルス、インフーポレーテ゛ンド（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ５Ｉｎｃ、 ）（１０３７ウエスト・マツキンリ
イ・アベニュー、ミルウオーキー、ライスコンシン５３
２０５ ）等の業とを通して入手するが、あるいはプラ
スミドＰＫＣ２８３の酵素消化により、得ることかでき
る。プラスミドｐ Ｋ Ｃ２８３から単離されたフラグ
メントはλＰＬプロモーターを含存している〜１３７塩
基対（ｂｐ）のＢｇｌ［ｌ制限フラグメントである。
カルス、インフーポレーテ゛ンド（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ５Ｉｎｃ、 ）（１０３７ウエスト・マツキンリ
イ・アベニュー、ミルウオーキー、ライスコンシン５３
２０５ ）等の業とを通して入手するが、あるいはプラ
スミドＰＫＣ２８３の酵素消化により、得ることかでき
る。プラスミドｐ Ｋ Ｃ２８３から単離されたフラグ
メントはλＰＬプロモーターを含存している〜１３７塩
基対（ｂｐ）のＢｇｌ［ｌ制限フラグメントである。
プラスミドＰ Ｋ Ｃ２８３は〜９キロベース（ｋｂ）
であり、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラト
リイ、ペオリア、イリノイス（ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｃｇ
ｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、 Ｐｅｏｒｉａｌｌｌｌｉｎｏｉｓ ）６１６０４
に寄託され、そのパーマネント・ストック・カルチ
ャー・コレクションの一部となっている菌株、大腸菌Ｋ
１２ ＢＥ １２０１ ／ｐＫＣ２８３から常法通
り）ｌｉ Ｉｎすることができる。この菌株は寄託番号
ＮＲＩＬＬ Ｂ−１５８３０ノ下、プラスミドＰ Ｋ
Ｃ２８３の好ましい供給源および保管体として誰でも
入手することかできる。大腸菌に１２ＢＥ１２０１ ／
ｐＫＣ２８３は２つの異るプラスミドを担っており、
それらは制限部位のサイズおよびパターンに基き、常法
通り単離し、分取することができる。
であり、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラト
リイ、ペオリア、イリノイス（ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｃｇ
ｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、 Ｐｅｏｒｉａｌｌｌｌｉｎｏｉｓ ）６１６０４
に寄託され、そのパーマネント・ストック・カルチ
ャー・コレクションの一部となっている菌株、大腸菌Ｋ
１２ ＢＥ １２０１ ／ｐＫＣ２８３から常法通
り）ｌｉ Ｉｎすることができる。この菌株は寄託番号
ＮＲＩＬＬ Ｂ−１５８３０ノ下、プラスミドＰ Ｋ
Ｃ２８３の好ましい供給源および保管体として誰でも
入手することかできる。大腸菌に１２ＢＥ１２０１ ／
ｐＫＣ２８３は２つの異るプラスミドを担っており、
それらは制限部位のサイズおよびパターンに基き、常法
通り単離し、分取することができる。
翻訳活性化配列は実質上、イタクラら、１９７７、サイ
エンス（５ｃｉｅｎｃｅ） １９８ ： １０５６およ
びタレ７ （Ｃｒｅａ）う、１９７８ 、プロシーディ
ンゲス・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ
ンスイズ（プロナス、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ）ＵＳＡ７５ ： ５７６５の方法に従い
、完全に保護されたデオキシリボタクレオチド構築ブロ
ックを用いて改良ホスホトリエステル法により、常法通
り組立てることかできる。別法として、機能的なポリペ
プチドをコードしているＤ Ｎ 、Ａ配列が、例えばプ
ラスミドｐＫＣ３５６内に含まれているネオマイシン・
ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の如く、小モロ−ガス
な翻訳活性化配列を含有していてもよい。
エンス（５ｃｉｅｎｃｅ） １９８ ： １０５６およ
びタレ７ （Ｃｒｅａ）う、１９７８ 、プロシーディ
ンゲス・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ
ンスイズ（プロナス、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ）ＵＳＡ７５ ： ５７６５の方法に従い
、完全に保護されたデオキシリボタクレオチド構築ブロ
ックを用いて改良ホスホトリエステル法により、常法通
り組立てることかできる。別法として、機能的なポリペ
プチドをコードしているＤ Ｎ 、Ａ配列が、例えばプ
ラスミドｐＫＣ３５６内に含まれているネオマイシン・
ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の如く、小モロ−ガス
な翻訳活性化配列を含有していてもよい。
本発明のプラスミドＰＫＣ４１７は、λＰＬプロモータ
ーのコントロール下でネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子を発現させる様、工夫をこらして組立てら
れた。従って、プラスミドＰＫＣ４１７は、プラスミド
Ｐ Ｋ Ｃ３５６のユニーク（特異）なりｇｌｌｌ制限
部位に〜１３７ｂｐ Ｂｇｌ ［１λＰＬプロモー
ター含有制限フラグメントを挿入することにより、組立
てられた。ユニークなりｇｌ■制限部位はプラスミドｐ
ＫＣ３５６のプロモーターを人（ネオマイシン・ホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子の直ぐ上流番こ位置している
。従って、λＰＬプロモーターと、プロモーター大知ネ
オマインン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子とのライ
ゲーションにより、機能的なポリペプチドを発現させる
様、完全に機能し得る、転写および翻訳可能な暗号配列
が生成することになる。
ーのコントロール下でネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子を発現させる様、工夫をこらして組立てら
れた。従って、プラスミドＰＫＣ４１７は、プラスミド
Ｐ Ｋ Ｃ３５６のユニーク（特異）なりｇｌｌｌ制限
部位に〜１３７ｂｐ Ｂｇｌ ［１λＰＬプロモー
ター含有制限フラグメントを挿入することにより、組立
てられた。ユニークなりｇｌ■制限部位はプラスミドｐ
ＫＣ３５６のプロモーターを人（ネオマイシン・ホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子の直ぐ上流番こ位置している
。従って、λＰＬプロモーターと、プロモーター大知ネ
オマインン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子とのライ
ゲーションにより、機能的なポリペプチドを発現させる
様、完全に機能し得る、転写および翻訳可能な暗号配列
が生成することになる。
ＲｔｒＥ的ポリペプチドをストレプトマイセス内で発現
させるための本発明方法は著しい技術進歩を示すもので
ある。上に述べたλＰＬプロモーターＤＮＡ配ν１］は
、あらゆるポリペプチドの暗号遺伝子をストレプトマイ
セス内で芹遍的；こ発現させるのに用いることかできる
。本明細書中では特定の態様を示し、それについて記述
しているが、多くの変型を採用し得る。例えは、本発明
の機１氾性にとって特定の配列の選択は臨界的な事柄で
ないので、本発明は、その使用を特定のポリペプチドの
暗号遺伝子に限定されるものではない。以上で例示した
ネオマイシン・小スホトランスフエラーゼ暗号配列に代
えて、別の機能的なポリペプチドの暗号配列を用いるこ
とができる。その様な暗号配列には、ヒト成長ホルモン
、ヒトプレー成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、哺乳類
成長ホルモン、鳥類成長ホルモン、成長ホルモン放出因
子、ヒトインシュリンＡ鎖、ヒトインンユリンＢ３ｆｉ
、ヒトプロインツユリン、ヒトプレープロインシュリン
、ヒトおよび非−ヒトインターフェロン、ウィルス抗原
、つＯキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化物質、イ
ンターロイキンロ、あらゆるペプチドホルモン、あらゆ
る酵素、あるいは研究または商業上価値ある事実上全て
の他のポリペプチドの暗号配（／ｌＪ （ただし、これ
らに限定されない）か含まれる。
させるための本発明方法は著しい技術進歩を示すもので
ある。上に述べたλＰＬプロモーターＤＮＡ配ν１］は
、あらゆるポリペプチドの暗号遺伝子をストレプトマイ
セス内で芹遍的；こ発現させるのに用いることかできる
。本明細書中では特定の態様を示し、それについて記述
しているが、多くの変型を採用し得る。例えは、本発明
の機１氾性にとって特定の配列の選択は臨界的な事柄で
ないので、本発明は、その使用を特定のポリペプチドの
暗号遺伝子に限定されるものではない。以上で例示した
ネオマイシン・小スホトランスフエラーゼ暗号配列に代
えて、別の機能的なポリペプチドの暗号配列を用いるこ
とができる。その様な暗号配列には、ヒト成長ホルモン
、ヒトプレー成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、哺乳類
成長ホルモン、鳥類成長ホルモン、成長ホルモン放出因
子、ヒトインシュリンＡ鎖、ヒトインンユリンＢ３ｆｉ
、ヒトプロインツユリン、ヒトプレープロインシュリン
、ヒトおよび非−ヒトインターフェロン、ウィルス抗原
、つＯキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化物質、イ
ンターロイキンロ、あらゆるペプチドホルモン、あらゆ
る酵素、あるいは研究または商業上価値ある事実上全て
の他のポリペプチドの暗号配（／ｌＪ （ただし、これ
らに限定されない）か含まれる。
組立ての容易性並ひ；こ便宜さのｉ現点から、以下に例
示する一連の出発物質および中間体からプラスミドｐＫ
ｃ４１７かｉ１立てられた。ストレプトマイセスプラス
ミドＰＥＬ１０３の復製Ｊｅ Ｉｅ含有〜２．９ｋｂ
Ｂａｍ Ｉ−１１フラクメントをＢｃｌ ｌ消化ｐ
ＫＣ３０９に挿入し、ｐＫＣ３２６と命名された三機能
性ベクターを得た。プラスミドｐ Ｋ Ｃ３２６の組立
て（こおける出発物質であるプラスミドＰＥＬ１０３は
、常法１１ リ、ストレプトマイセス・クラニュロルー
ハ（Ｓ−ｇｒａ”’０ｒｕｂｅ’ ） ＮｏＡ３９９１
２．１３ ／ｐ Ｅ Ｌ １０３から単離される。プラ
スミドｐＫＣ３Ｑ９は〜７ ｋｂ であり、大腸菌内で
機能的な複製起源と、アンピシリンおよびアブラマイシ
ン耐性遺伝子を含有している。プラスミドｐ Ｋ Ｃ３
０９は、大腸菌＋＜ｘ２Ｂａ １０４１ ／ＰＫＣ３０
９から常法通り単離し得る。上記の菌株はいずれもノー
ザン・リサーチ・ラボラトリイ、ペオリア、イリノイス
６１６０４に寄託され、そのパーマネント・ストック・
カルチャー・コレクションの一部となっている。これら
の菌株は寄託番号ＮＲＲＬ １２５４９ およびＮＲＲ
ＬＢ−１５８２７のＦ、プラスミドｐ Ｅ Ｌ １０３
およびｐ Ｋ Ｃ３０９の好ましい供給僚並ひに保管体
として、誰でも入手することかできる。
示する一連の出発物質および中間体からプラスミドｐＫ
ｃ４１７かｉ１立てられた。ストレプトマイセスプラス
ミドＰＥＬ１０３の復製Ｊｅ Ｉｅ含有〜２．９ｋｂ
Ｂａｍ Ｉ−１１フラクメントをＢｃｌ ｌ消化ｐ
ＫＣ３０９に挿入し、ｐＫＣ３２６と命名された三機能
性ベクターを得た。プラスミドｐ Ｋ Ｃ３２６の組立
て（こおける出発物質であるプラスミドＰＥＬ１０３は
、常法１１ リ、ストレプトマイセス・クラニュロルー
ハ（Ｓ−ｇｒａ”’０ｒｕｂｅ’ ） ＮｏＡ３９９１
２．１３ ／ｐ Ｅ Ｌ １０３から単離される。プラ
スミドｐＫＣ３Ｑ９は〜７ ｋｂ であり、大腸菌内で
機能的な複製起源と、アンピシリンおよびアブラマイシ
ン耐性遺伝子を含有している。プラスミドｐ Ｋ Ｃ３
０９は、大腸菌＋＜ｘ２Ｂａ １０４１ ／ＰＫＣ３０
９から常法通り単離し得る。上記の菌株はいずれもノー
ザン・リサーチ・ラボラトリイ、ペオリア、イリノイス
６１６０４に寄託され、そのパーマネント・ストック・
カルチャー・コレクションの一部となっている。これら
の菌株は寄託番号ＮＲＲＬ １２５４９ およびＮＲＲ
ＬＢ−１５８２７のＦ、プラスミドｐ Ｅ Ｌ １０３
およびｐ Ｋ Ｃ３０９の好ましい供給僚並ひに保管体
として、誰でも入手することかできる。
得−られたベクターｐＫＣ３２６を引き、涜きＢａｍｌ
１ｌ制限ｔ：ｒ素で消化し、プラスミドｐ Ｉ Ｊ ７
０２のチオストレプトン耐性含１Ｂｃｌｌフラグメノト
にライゲートすることにより、プラスミドｐＫＣ３４５
を形成させる。プラスミドｐ Ｋ Ｃ３４５の出発物質
として用いるプラスミドｐ Ｉ Ｊ ７０２は〜５．６
ｋｂ であり、アメリカン・タイプ・カルチＶ−・コレ
クション、（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１
ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ）、１２３０１ パ
ークローンドライブ、口７クビレ、メアリーランド（Ｐ
ａｒｋｌａｗｎ Ｉ）ｒｉｖｅＲＯＣｋｖｉｌｌｃ １
Ｍａｒｙｌａｎｄ ） ２０８５２ ；コ寄託され、
そのパーマネントストック・カルチャー・コレクション
の一部となっている菌株、ストレプトマイセス・リビダ
７ ス（Ｉ １ｖｉｄａｎｓ ） ／ ｐｉ Ｊ ７０
２ から常法通り単離することができる。この菌株は、
該プラスミドの好ましい供給源および保管体として、寄
託番号ＡＴＣＣ３９１５５の下、誰でも入手し得る。
１ｌ制限ｔ：ｒ素で消化し、プラスミドｐ Ｉ Ｊ ７
０２のチオストレプトン耐性含１Ｂｃｌｌフラグメノト
にライゲートすることにより、プラスミドｐＫＣ３４５
を形成させる。プラスミドｐ Ｋ Ｃ３４５の出発物質
として用いるプラスミドｐ Ｉ Ｊ ７０２は〜５．６
ｋｂ であり、アメリカン・タイプ・カルチＶ−・コレ
クション、（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１
ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ）、１２３０１ パ
ークローンドライブ、口７クビレ、メアリーランド（Ｐ
ａｒｋｌａｗｎ Ｉ）ｒｉｖｅＲＯＣｋｖｉｌｌｃ １
Ｍａｒｙｌａｎｄ ） ２０８５２ ；コ寄託され、
そのパーマネントストック・カルチャー・コレクション
の一部となっている菌株、ストレプトマイセス・リビダ
７ ス（Ｉ １ｖｉｄａｎｓ ） ／ ｐｉ Ｊ ７０
２ から常法通り単離することができる。この菌株は、
該プラスミドの好ましい供給源および保管体として、寄
託番号ＡＴＣＣ３９１５５の下、誰でも入手し得る。
プラスミドｐ Ｋ Ｃ３５４はプラスミドｐ Ｋ Ｃ３
２２の〜２．１ ｋｂ Ａｖａｊ制限フラグメントを５
ａｃ）消化プラスミドＰＫＣ３４５にライゲートするこ
とにより組立てられる。ライゲーション工程に移る前に
両フラグメントをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、平
滑末端化する。得られた三機能性ベクターは、大腸菌と
ストレプトマイセスの両方で機能的なアブラマイシン耐
性遺伝子と、ストレプトマイセス内で機能的なチオスト
レプトン耐性遺伝子、並びにプロモーター欠如（プロモ
ーターレス）ハイグロマイシン、およびプロモーター大
知ネオマイノン耐性遺伝子を含有している。プラスミド
ｐＫＣ３５４の組立てにおける出発物質であるプラスミ
ドＰＫ Ｃ３２２はノーザン・リージョナル・リサーチ
・ラボラトリイに寄託され、そのパーマネント・ストッ
ク・カルチャー・コレクションの一部となっている菌株
、Ｅ、 ｃｏｌｉ ／ ｐ Ｋ Ｃ３２２から常法通り
（１離することかできる。この菌株は、該プラスミドの
好ましい供給源並ひ（こ保管体として受託番号ＮＲＲＬ
Ｂ −１５８２９の下、誰でも入手し得る・誘ｊ１ｐ
体プラスミドｐ Ｋ Ｃ３５６は、プラスミドＩＡ＜
Ｃ３５４から〜１．５ ｋｂ Ｅｃｏ旧制限フラグメン
トを′、（失させることにより、組立てられた。このＥ
ｃｏ Ｒ１欠失により、実質上全てのハ・イグロマイン
ン遺伝子を除くことに成功した。プラスミドｐ Ｋ Ｃ
３５６は大腸菌およびストレプトマイセスの両方でａ
ｆｒＥ的であり、どちらの宿主内ても機能的な１物耐性
を有し、λＰＬプロモーター転写活性化配列の挿入に利
用し得る２個の特異な制限部位の直く下流に位置してい
るプロモーター欠如ネオマイノンホス小トランスフエラ
ービ遺伝子を含有しているために、本発明のベクターを
ａＬ立てるのに有用である。
２２の〜２．１ ｋｂ Ａｖａｊ制限フラグメントを５
ａｃ）消化プラスミドＰＫＣ３４５にライゲートするこ
とにより組立てられる。ライゲーション工程に移る前に
両フラグメントをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、平
滑末端化する。得られた三機能性ベクターは、大腸菌と
ストレプトマイセスの両方で機能的なアブラマイシン耐
性遺伝子と、ストレプトマイセス内で機能的なチオスト
レプトン耐性遺伝子、並びにプロモーター欠如（プロモ
ーターレス）ハイグロマイシン、およびプロモーター大
知ネオマイノン耐性遺伝子を含有している。プラスミド
ｐＫＣ３５４の組立てにおける出発物質であるプラスミ
ドＰＫ Ｃ３２２はノーザン・リージョナル・リサーチ
・ラボラトリイに寄託され、そのパーマネント・ストッ
ク・カルチャー・コレクションの一部となっている菌株
、Ｅ、 ｃｏｌｉ ／ ｐ Ｋ Ｃ３２２から常法通り
（１離することかできる。この菌株は、該プラスミドの
好ましい供給源並ひ（こ保管体として受託番号ＮＲＲＬ
Ｂ −１５８２９の下、誰でも入手し得る・誘ｊ１ｐ
体プラスミドｐ Ｋ Ｃ３５６は、プラスミドＩＡ＜
Ｃ３５４から〜１．５ ｋｂ Ｅｃｏ旧制限フラグメン
トを′、（失させることにより、組立てられた。このＥ
ｃｏ Ｒ１欠失により、実質上全てのハ・イグロマイン
ン遺伝子を除くことに成功した。プラスミドｐ Ｋ Ｃ
３５６は大腸菌およびストレプトマイセスの両方でａ
ｆｒＥ的であり、どちらの宿主内ても機能的な１物耐性
を有し、λＰＬプロモーター転写活性化配列の挿入に利
用し得る２個の特異な制限部位の直く下流に位置してい
るプロモーター欠如ネオマイノンホス小トランスフエラ
ービ遺伝子を含有しているために、本発明のベクターを
ａＬ立てるのに有用である。
外来性の大腸菌プロモーターのコントロールの下でヘテ
ロローガスなａ （Ｅｂ子産物をストレプトマイセス内
で発現させるためにプラスミドｐＫｃ４１７を組立てた
。即ち、前述の、プラスミドＰＫＣ２８３の〜１３７
ｂｐ Ｂｇｌ １．１制限フラグメントをＢｇｌ ｌ
］消化プラスミドｐＫＣ３５６にライゲートすることに
より、プラスミドｐＫｃ４１７を組立てた。プラスミ）
’ＰＫＣ４１７は大腸菌およびストレプトマイセスの両
方て機能的てあり、λＰＬプロモーター転写活性化配ｐ
６、ホモローガスなりボゾーム結合部位を含んでいるネ
オマイシンホスホトランスフェラービ遺伝子、並びに翻
訳活住化配りすを含有している。プラスミドｐＫｃ４１
７はストレプトマイセスにネオマイシン耐性を付与し得
る遺伝子産物を発現するので、本発明を例示するのに有
用である。
ロローガスなａ （Ｅｂ子産物をストレプトマイセス内
で発現させるためにプラスミドｐＫｃ４１７を組立てた
。即ち、前述の、プラスミドＰＫＣ２８３の〜１３７
ｂｐ Ｂｇｌ １．１制限フラグメントをＢｇｌ ｌ
］消化プラスミドｐＫＣ３５６にライゲートすることに
より、プラスミドｐＫｃ４１７を組立てた。プラスミ）
’ＰＫＣ４１７は大腸菌およびストレプトマイセスの両
方て機能的てあり、λＰＬプロモーター転写活性化配ｐ
６、ホモローガスなりボゾーム結合部位を含んでいるネ
オマイシンホスホトランスフェラービ遺伝子、並びに翻
訳活住化配りすを含有している。プラスミドｐＫｃ４１
７はストレプトマイセスにネオマイシン耐性を付与し得
る遺伝子産物を発現するので、本発明を例示するのに有
用である。
更に、このネオマイシン耐性を選択マーカーとして用い
ることかできるので、該ベクターは一般的な分）クロー
ニングビヒクルとして有用である。
ることかできるので、該ベクターは一般的な分）クロー
ニングビヒクルとして有用である。
プラスミドＰＫＣ４１７の制限サイトおよび機能地図を
添付の第４図に示す。
添付の第４図に示す。
本発明に係るＲｆＥ的ポリペプチドをストレプトマイセ
ス内で発現させる方法は、その用途をストレプトマイセ
スの単一の種または菌株に限るものではないつ逆Ｉこ、
本発明は広範囲の適用が可能で、多くのストレプトマイ
セス類の宿主に（ＩＩ胞、１．１にその非制限菌株に適
用することかできる。こうした非制限菌株は、当業者周
知の常法〔Ｏモフスカヤ（Ｌｏｍｏ ｖｓｋａｙａ ）
等、１９８０ 、？イクロバイオロジカルレビュース゛
（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
）４４ ： ２０６ ）により、ストレプトマイセス
類から容易に選択、分＋１ｉされる。非制限菌株の宿主
ｆｆ１１胞は制限酵素を人くため、形質転換の茅プラス
ミドＤＮＡを切断したり劣化させることかない。本発明
においては、本発明に係るベクターのいかなる制限サイ
トも切断しない制限酵素を含んでいる宿主細胞もまた非
制限性とみなすこととする。
ス内で発現させる方法は、その用途をストレプトマイセ
スの単一の種または菌株に限るものではないつ逆Ｉこ、
本発明は広範囲の適用が可能で、多くのストレプトマイ
セス類の宿主に（ＩＩ胞、１．１にその非制限菌株に適
用することかできる。こうした非制限菌株は、当業者周
知の常法〔Ｏモフスカヤ（Ｌｏｍｏ ｖｓｋａｙａ ）
等、１９８０ 、？イクロバイオロジカルレビュース゛
（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
）４４ ： ２０６ ）により、ストレプトマイセス
類から容易に選択、分＋１ｉされる。非制限菌株の宿主
ｆｆ１１胞は制限酵素を人くため、形質転換の茅プラス
ミドＤＮＡを切断したり劣化させることかない。本発明
においては、本発明に係るベクターのいかなる制限サイ
トも切断しない制限酵素を含んでいる宿主細胞もまた非
制限性とみなすこととする。
アミノグリコンド抗生物質を産生じ、本発明に係るベク
ターを特に有用に使用でき、形質転換できるストレプト
マイセス類の非制限的な菌株の好ましい宿主細胞には、
例えば以下の菌株に由来する非制限細胞か含まれる。
ターを特に有用に使用でき、形質転換できるストレプト
マイセス類の非制限的な菌株の好ましい宿主細胞には、
例えば以下の菌株に由来する非制限細胞か含まれる。
ストレプトマイセス・クレストマイセチカス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｉ ｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅｔｉｃｕ
ａ） （アミノシジン）、Ｓ、グリーｆｒオフ ラハス
（Ｓ６ｇｒｉｓｅ。
ｐｔｏｍｙｃｅｉ ｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅｔｉｃｕ
ａ） （アミノシジン）、Ｓ、グリーｆｒオフ ラハス
（Ｓ６ｇｒｉｓｅ。
ｒｌａｖｕｇ ） （抗生物’ＲＭＡｚ２ｅ＋７ ）、
Ｓ、ミクロスボレウス（Ｓ、 ｍ１ｃｒｏｓｐｏｒｃｕ
＠）（抗生物質５Ｆ−７６７）、Ｓ、リボシジフイカス
（Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ）（抗生物質Ｓ Ｆ
７３３ ）、Ｓ、フラポペルシカス（Ｓ、［Ｉａｖｏ
ｐｅｒｓｉｃｕｓ ） （スペクチノマイシン）、Ｓ、
スペクタビリス（Ｓ、 ５ｐｅｃＬａｂｉｌｉｓ ）
（アクチノスペクタシン）、Ｓ、リモサス・ホルマ・パ
ロモマイシナス（Ｓ、ｒｉｔｎｏｓｕｓイＯｒｍａ ｐ
ａｒＯＩｎＯ−＋ｎｙｃｉｎｕｓ）（パＯ％フィシン類
、カテヌリ７ ） 、 Ｓ。
Ｓ、ミクロスボレウス（Ｓ、 ｍ１ｃｒｏｓｐｏｒｃｕ
＠）（抗生物質５Ｆ−７６７）、Ｓ、リボシジフイカス
（Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ）（抗生物質Ｓ Ｆ
７３３ ）、Ｓ、フラポペルシカス（Ｓ、［Ｉａｖｏ
ｐｅｒｓｉｃｕｓ ） （スペクチノマイシン）、Ｓ、
スペクタビリス（Ｓ、 ５ｐｅｃＬａｂｉｌｉｓ ）
（アクチノスペクタシン）、Ｓ、リモサス・ホルマ・パ
ロモマイシナス（Ｓ、ｒｉｔｎｏｓｕｓイＯｒｍａ ｐ
ａｒＯＩｎＯ−＋ｎｙｃｉｎｕｓ）（パＯ％フィシン類
、カテヌリ７ ） 、 Ｓ。
フラデイエ・バー・イタリヵス（Ｓ、 ｆｒａｄｉａｅ
ｖａｒ、１ｔａｌｉ（ｕｓ ） （アミノシジン）、
Ｓ、プルエンシス・バー・プルエンシフ、 （Ｓ、１）
ｌｕｅｎｓｉｓ ｖａｒ。
ｖａｒ、１ｔａｌｉ（ｕｓ ） （アミノシジン）、
Ｓ、プルエンシス・バー・プルエンシフ、 （Ｓ、１）
ｌｕｅｎｓｉｓ ｖａｒ。
ｂｌｕｅｎｓｉａ ） （ブ／Ｌ／ Ｘ ７ ’／ フ
ィシン）、Ｓ、カテニューレ（Ｓ、 ｃａｔｃｎｕｌａ
ｃ ） （カテヌリン）、Ｓ、オリボレテイキユリ・バ
ー・セルロフィラス（Ｓ。
ィシン）、Ｓ、カテニューレ（Ｓ、 ｃａｔｃｎｕｌａ
ｃ ） （カテヌリン）、Ｓ、オリボレテイキユリ・バ
ー・セルロフィラス（Ｓ。
ｏｌｉｖｏｒｃＬｉｃｕｌｉ ｖａｒ ｃｅｌｌｕ
ｌｏｐｈｉｌｕｓ ＸデストマイシンＡ）、Ｓ、アル
プス・バー・メタマイシヌス（Ｓ、ａｌｂｕｓ ｖａ
ｒ、 ｍｃｔａｍｙｃｉｎｕｓ ） （メクマインン
）、Ｓ、バイグロスコピカス・バー・サガミエ７ ソｙ
、 （Ｓ、 ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ、
ｓａｇａ＋ｎ１−ｅｎｓｉｓ）（スペクチノマイシン）
、Ｓ、ビキニエンシス（Ｓ、ｂｉｋｉｎｉｅｎｉｉｉ）
（ストレプトマイシン）、Ｓ、グリセウス（Ｓ、 ｇ
ｒｉｓｅｕも）（ストレプトマイシン）、Ｓ、エリスロ
クロモケネス・バー・ナルトエンシス（Ｓ、ｅｒｙｔｈ
ｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａｒ。
ｌｏｐｈｉｌｕｓ ＸデストマイシンＡ）、Ｓ、アル
プス・バー・メタマイシヌス（Ｓ、ａｌｂｕｓ ｖａ
ｒ、 ｍｃｔａｍｙｃｉｎｕｓ ） （メクマインン
）、Ｓ、バイグロスコピカス・バー・サガミエ７ ソｙ
、 （Ｓ、 ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ、
ｓａｇａ＋ｎ１−ｅｎｓｉｓ）（スペクチノマイシン）
、Ｓ、ビキニエンシス（Ｓ、ｂｉｋｉｎｉｅｎｉｉｉ）
（ストレプトマイシン）、Ｓ、グリセウス（Ｓ、 ｇ
ｒｉｓｅｕも）（ストレプトマイシン）、Ｓ、エリスロ
クロモケネス・バー・ナルトエンシス（Ｓ、ｅｒｙｔｈ
ｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａｒ。
ｎａｒｕｔｏｅｎｓｉｓ ） （ストレプトマイシン
）、Ｓ、ブールエフ シス（Ｓ、 ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ
） （ストレプトマイシン）、Ｓ、ガルブス（Ｓｏｇ
ａｌｂｕｓ） （ストレプトマイシン）、Ｓ、ラメラ７
． （Ｓ、 ｒａｍｅｕｓ ） （ストレプトマイシン
）、Ｓ、オリバセウス（Ｓ、ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）（ス
トレプトマイシン）、Ｓ、マノユエンシス（Ｓ。
）、Ｓ、ブールエフ シス（Ｓ、 ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ
） （ストレプトマイシン）、Ｓ、ガルブス（Ｓｏｇ
ａｌｂｕｓ） （ストレプトマイシン）、Ｓ、ラメラ７
． （Ｓ、 ｒａｍｅｕｓ ） （ストレプトマイシン
）、Ｓ、オリバセウス（Ｓ、ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）（ス
トレプトマイシン）、Ｓ、マノユエンシス（Ｓ。
ｍａｓｈｕｅｎｓ口）（ストレプトマイシン）、Ｓ、バ
イグロスコピカス・バー・リモネウス（Ｓ、 ｈｙｇｒ
ｏ−ｓｃｏｐｉｃｕａ ｖａｒ、ｌｉｍｏｎｅｕｓ）
（バリダマイシン類）、Ｓ、リモ７７ ソｘ シス（
Ｓ、 ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ ）（デストマインン）
、Ｓ、バイグロスコピカス・ホル７−グレボサス（Ｓ、
ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ［ｏｒｍａｇｌｅｂｏｓ
ｕｓ ） （ダレボマイシン）、Ｓ、フラデイエ（Ｓ、
ｆｒａｄｉａｃ） （ハイブリマイシン類、ネオマイ
シン類）、Ｓ、ユーロシジカス（Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄｉ
ｃｕｓ）（抗生物質Ａ１６３１６−Ｃ）、Ｓ、アクアカ
ナス（Ｓ。
イグロスコピカス・バー・リモネウス（Ｓ、 ｈｙｇｒ
ｏ−ｓｃｏｐｉｃｕａ ｖａｒ、ｌｉｍｏｎｅｕｓ）
（バリダマイシン類）、Ｓ、リモ７７ ソｘ シス（
Ｓ、 ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ ）（デストマインン）
、Ｓ、バイグロスコピカス・ホル７−グレボサス（Ｓ、
ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ［ｏｒｍａｇｌｅｂｏｓ
ｕｓ ） （ダレボマイシン）、Ｓ、フラデイエ（Ｓ、
ｆｒａｄｉａｃ） （ハイブリマイシン類、ネオマイ
シン類）、Ｓ、ユーロシジカス（Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄｉ
ｃｕｓ）（抗生物質Ａ１６３１６−Ｃ）、Ｓ、アクアカ
ナス（Ｓ。
ａｑｕａｃａｎｕｓ ）（Ｎ−メチルハイグ０フィシン
Ｂ）、Ｓ、クリスタリｘ ７． （Ｓ、 ｃｒｙｉｔａ
ｌｌｉｎｕｓ）（ハイグロマイシンＡ）、Ｓ、ノボリト
エンシス（Ｓ。
Ｂ）、Ｓ、クリスタリｘ ７． （Ｓ、 ｃｒｙｉｔａ
ｌｌｉｎｕｓ）（ハイグロマイシンＡ）、Ｓ、ノボリト
エンシス（Ｓ。
ｎｏｂｏｒｉｔｏｅｎｉｉｉ ） （ハイグロマイシン
）、５．バイグロスコピカス（Ｓ、 ｈｙｇｒｏｓｃｏ
ｐｉｃｕｓ） （ハイグロフィシン２ｆｌ）、Ｓ、
アトロファソエシス（Ｓ。
）、５．バイグロスコピカス（Ｓ、 ｈｙｇｒｏｓｃｏ
ｐｉｃｕｓ） （ハイグロフィシン２ｆｌ）、Ｓ、
アトロファソエシス（Ｓ。
ａｃｒｏｆａｃｉｅｎｓ ） （ハイグロフィシン）
、Ｓ、カスガスビナｘ （Ｓ、ｋａｓｕｇａｉｐｉｎｕ
ｓ ）（カルボマイシン）、Ｓ、カスガエン：７ ス（
Ｓ、ｋａｓｕｇａｅｎｓ口）（カルボマイシン類）、Ｓ
、ネトロブシス（Ｓ、 ｎｅｔｒｏｐ＠ｉｉ ）（抗生
物質ＬＬ−ＡＭ３１ ）、Ｓ、リビダス（Ｓ、ｌ１ｖｉ
ｄｕｓ）（リビドマイシンｉ）、Ｓ、ホフエンシス（Ｓ
。
、Ｓ、カスガスビナｘ （Ｓ、ｋａｓｕｇａｉｐｉｎｕ
ｓ ）（カルボマイシン）、Ｓ、カスガエン：７ ス（
Ｓ、ｋａｓｕｇａｅｎｓ口）（カルボマイシン類）、Ｓ
、ネトロブシス（Ｓ、 ｎｅｔｒｏｐ＠ｉｉ ）（抗生
物質ＬＬ−ＡＭ３１ ）、Ｓ、リビダス（Ｓ、ｌ１ｖｉ
ｄｕｓ）（リビドマイシンｉ）、Ｓ、ホフエンシス（Ｓ
。
ｈｏｆｕｅｎｓｉｓ ） （セルドマイシン複合体）、
およびＳ、カナメ（Ｓ、ｃａｎｕｓ ） （リボンル
パロマミン）。
およびＳ、カナメ（Ｓ、ｃａｎｕｓ ） （リボンル
パロマミン）。
マクロライド抗生物質を産生じ、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主Ａ［Ｉ胞には、例えば
以下のような微生物の非制限細胞が含まれる：ストレプ
トマイシス・ケレステイス（Ｓｔｒｃｐｔｏｍｙｃｃｓ
ｃａｅｌｅｉｔｉｓ ）、（抗生物５９Ｍ１８８）
、Ｓ、プラテンシス（Ｓ、 ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ）
（プラテンマイシン）、Ｓ、ロツチェイ・バー・ボルビ
リス（Ｓ、ｒｏｃｂｃｉ ｗａｒ、ｖｏｌｕｂｉｌｉ
ｓ ） （抗生物質’ｒ２６３６ ）、Ｓ、ヘネズエ
レ、（Ｓ、ｖｃｎｅｚｕｅ！ａｅ）（メチマイシン類）
、Ｓ、グリセオフスカス（Ｓ。
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主Ａ［Ｉ胞には、例えば
以下のような微生物の非制限細胞が含まれる：ストレプ
トマイシス・ケレステイス（Ｓｔｒｃｐｔｏｍｙｃｃｓ
ｃａｅｌｅｉｔｉｓ ）、（抗生物５９Ｍ１８８）
、Ｓ、プラテンシス（Ｓ、 ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ）
（プラテンマイシン）、Ｓ、ロツチェイ・バー・ボルビ
リス（Ｓ、ｒｏｃｂｃｉ ｗａｒ、ｖｏｌｕｂｉｌｉ
ｓ ） （抗生物質’ｒ２６３６ ）、Ｓ、ヘネズエ
レ、（Ｓ、ｖｃｎｅｚｕｅ！ａｅ）（メチマイシン類）
、Ｓ、グリセオフスカス（Ｓ。
ｇｒｉｓｃｏ［ｕｓｃｕｇ ） （プントリン）、Ｓ、
ナルポジ、ンシス（Ｓ、 ｎａｒｂｏｎｃｎｓｉｓ ）
（ジョサマイシン、ナルポマイシン）、５．７７ジン
ジカス（Ｓ、ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）（抗生４Ｍ？
ＮＡ−１８１）、Ｓ、グリセオファンエシス（Ｓｏｇ
ｒｉｓｃｏｆａｃｉｃｎａ ） （抗生物質１’Ａｌ３
３Ａ。
ナルポジ、ンシス（Ｓ、 ｎａｒｂｏｎｃｎｓｉｓ ）
（ジョサマイシン、ナルポマイシン）、５．７７ジン
ジカス（Ｓ、ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）（抗生４Ｍ？
ＮＡ−１８１）、Ｓ、グリセオファンエシス（Ｓｏｇ
ｒｉｓｃｏｆａｃｉｃｎａ ） （抗生物質１’Ａｌ３
３Ａ。
Ｂ）、Ｓ、ｏゼオシトレウス（Ｓ、ｒｏｓｅｏｃｉｔｒ
ｅｕｓ）（アイボ丈イクリン）、Ｓ、プルネオグリセウ
ス（Ｓ、 ｂｒｕｎｅｏｇｒｉｓｃｅｕｓ ） （７
ルポサイクリン）、Ｓ、。
ｅｕｓ）（アイボ丈イクリン）、Ｓ、プルネオグリセウ
ス（Ｓ、 ｂｒｕｎｅｏｇｒｉｓｃｅｕｓ ） （７
ルポサイクリン）、Ｓ、。
ゼオクロモゲネス（Ｓ、 ｒｏｓｅｏｅｈｒｏｍｏｇｅ
ｎｅｓ ） （アルボサイタリン）、Ｓ、シネロクロモ
ゲイ・ス（Ｓ。
ｎｅｓ ） （アルボサイタリン）、Ｓ、シネロクロモ
ゲイ・ス（Ｓ。
ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｃｉ ） （シネＯ？
イシンＢ）、Ｓ、アルプス（Ｓ、ａｌｂｕｓ ） （
フル：ｉ−：フイ＊ｆ７）、Ｓ、７ 工Ｌ／つｘ （Ｓ
、（ｅｌｌｅｕｉ） （７ルゴマイシン、ヒクロマイシ
ン）、Ｓ、ロツチェイ（Ｓ、ｒｏｃｂｅｉ ）（ランカ
シジン、ボレリジン）、Ｓ、ビオラセオユゲ／ｌ／（Ｓ
、ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ ） （ランカシジン）
、Ｓ、グリセウス（Ｓｏｇｒｉｓｅｕｓ） （ｆ、レリ
ジン）、Ｓ。
イシンＢ）、Ｓ、アルプス（Ｓ、ａｌｂｕｓ ） （
フル：ｉ−：フイ＊ｆ７）、Ｓ、７ 工Ｌ／つｘ （Ｓ
、（ｅｌｌｅｕｉ） （７ルゴマイシン、ヒクロマイシ
ン）、Ｓ、ロツチェイ（Ｓ、ｒｏｃｂｅｉ ）（ランカ
シジン、ボレリジン）、Ｓ、ビオラセオユゲ／ｌ／（Ｓ
、ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ ） （ランカシジン）
、Ｓ、グリセウス（Ｓｏｇｒｉｓｅｕｓ） （ｆ、レリ
ジン）、Ｓ。
メゼウス（Ｓｏｍａｉｚｅｕｓ ） （１７グラマイシ
ン）、Ｓ、アルプス・バー舎コイルマイセチカス（Ｓ、
ａｌｂｕｓｖａｒ、ｃｏｉｌｍｃｅｔｉｃｕｓ ） （
：１７ Ｌ／イマイシン）、Ｓ。
ン）、Ｓ、アルプス・バー舎コイルマイセチカス（Ｓ、
ａｌｂｕｓｖａｒ、ｃｏｉｌｍｃｅｔｉｃｕｓ ） （
：１７ Ｌ／イマイシン）、Ｓ。
ミカロファシエ７７． （Ｓ、ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅ
ｎｉ ） （アセチルロイコマイシン、ニスピノマイシ
ン）、Ｓ。
ｎｉ ） （アセチルロイコマイシン、ニスピノマイシ
ン）、Ｓ。
ハイグｏｘ−ｘピカス（Ｓ、 ｈｙｇｒｏｉｃｏｐｉｃ
ｕｓ ） （ツリマイノン、レロマイシン、マリドマイ
シン、タイロシン、カルボマイシン）、５．クリセオス
ピラリス（Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｉｐｉｒａｌｉｓ） （し
０フイシン）、Ｓ、ラヘンジュＬ／ （Ｓ、 １ａｖｅ
ｎｄｕｌａｃ） （アルトガマイシン）、Ｓ、リモサス
（Ｓ、ｒｉｍｏｉｕｉ ） （ニュートラマイシン）、
Ｓ、デルタ、＝ｃ （Ｓ、 ｄｅｌｔａｅ） （７’ル
タマイシンｍ）、Ｓ、ファンジシジ力スーパー・エスピ
ノマイセチカス（Ｓ、Ｅｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｉ ｖ
ａｒ。
ｕｓ ） （ツリマイノン、レロマイシン、マリドマイ
シン、タイロシン、カルボマイシン）、５．クリセオス
ピラリス（Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｉｐｉｒａｌｉｓ） （し
０フイシン）、Ｓ、ラヘンジュＬ／ （Ｓ、 １ａｖｅ
ｎｄｕｌａｃ） （アルトガマイシン）、Ｓ、リモサス
（Ｓ、ｒｉｍｏｉｕｉ ） （ニュートラマイシン）、
Ｓ、デルタ、＝ｃ （Ｓ、 ｄｅｌｔａｅ） （７’ル
タマイシンｍ）、Ｓ、ファンジシジ力スーパー・エスピ
ノマイセチカス（Ｓ、Ｅｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｉ ｖ
ａｒ。
ｃｓｐｉｎｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ） （ニスピノマイ
シン類）、５．７／Ｌ／ジンジカス（Ｓ、ｆｕｒｄｉｃ
ｉｄｉｃｕ＠）（ミデカマインン）、ｓ、７７ ホ７７
シェフ ：ｘ、 （Ｓ、ａｔｎｂｏｆａｃｉ−ｃｎｓ
） （フオロマノジンＩ））、Ｓ、ニーロンティカス
（Ｓ、 ｅｎｒｏｃｉｄｉｃｕｓ ） （メチマイジン
）、Ｓ、グリセオラス（Ｓ、 ｇｒｉｓｅｏｌｕａ ）
（グリセオマイシン）、Ｓ、フラホクロモゲネス（Ｓ
、 Ｆｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｃす（アマロマイシ
ン、シンコマイシン５ｊＪ）、Ｓ＋フイムブリアタス（
Ｓ、ｆｉｍｌ）ｒｉａｔｕＱ （７７口フィシン）、Ｓ
、ファンキュラス（Ｓ、［ａｓｃｉｃｕｌｕｓ ） （
ア７０ フィシン）、Ｓ、エリスレウス（Ｓ、ｅｒｙＬ
ｈｒｃｕｓ）（エリスロ′フィシンＭ）、Ｓ、アンチビ
オチカス（Ｓ、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ） （オ
レアンドマイシン）、Ｓ、オリポクｏ−ｖ−ゲネス（Ｓ
、ｏｌｉｖｏｃｈｒｏ＋ｎｏｇｃｎｃｓ）（オレアンド
マイシン）、Ｓ、スピニクロモゲ不ス・バー−ス５ガオ
エ７ シス（Ｓ、 ％ｐｉｎｉｃｈｒｏ＋ｎｏｇｅｎｃ
ｓｖａｒ、ｓｕｒａｇａｏｃｎｓｉｓ ） （クジマイ
シン類）、Ｓ。
シン類）、５．７／Ｌ／ジンジカス（Ｓ、ｆｕｒｄｉｃ
ｉｄｉｃｕ＠）（ミデカマインン）、ｓ、７７ ホ７７
シェフ ：ｘ、 （Ｓ、ａｔｎｂｏｆａｃｉ−ｃｎｓ
） （フオロマノジンＩ））、Ｓ、ニーロンティカス
（Ｓ、 ｅｎｒｏｃｉｄｉｃｕｓ ） （メチマイジン
）、Ｓ、グリセオラス（Ｓ、 ｇｒｉｓｅｏｌｕａ ）
（グリセオマイシン）、Ｓ、フラホクロモゲネス（Ｓ
、 Ｆｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｃす（アマロマイシ
ン、シンコマイシン５ｊＪ）、Ｓ＋フイムブリアタス（
Ｓ、ｆｉｍｌ）ｒｉａｔｕＱ （７７口フィシン）、Ｓ
、ファンキュラス（Ｓ、［ａｓｃｉｃｕｌｕｓ ） （
ア７０ フィシン）、Ｓ、エリスレウス（Ｓ、ｅｒｙＬ
ｈｒｃｕｓ）（エリスロ′フィシンＭ）、Ｓ、アンチビ
オチカス（Ｓ、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ） （オ
レアンドマイシン）、Ｓ、オリポクｏ−ｖ−ゲネス（Ｓ
、ｏｌｉｖｏｃｈｒｏ＋ｎｏｇｃｎｃｓ）（オレアンド
マイシン）、Ｓ、スピニクロモゲ不ス・バー−ス５ガオ
エ７ シス（Ｓ、 ％ｐｉｎｉｃｈｒｏ＋ｎｏｇｅｎｃ
ｓｖａｒ、ｓｕｒａｇａｏｃｎｓｉｓ ） （クジマイ
シン類）、Ｓ。
キタサトエ７ シス（Ｓ、 ｋｉｔａｓａｃｏｅｎｓｉ
ｓ） （、ｏイフマイシン）、Ｓ、ナルボネンシス・バ
ー・ジョブマイセチカス（Ｓ、ｎａｒｂｏｎｃｒ＋ｓｉ
ｓ ｖａｒ。
ｓ） （、ｏイフマイシン）、Ｓ、ナルボネンシス・バ
ー・ジョブマイセチカス（Ｓ、ｎａｒｂｏｎｃｒ＋ｓｉ
ｓ ｖａｒ。
ｊｏｓａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ） （ｏイコマイシン１
へ３、ジョサマイシン）、Ｓ、アルボグリセオラス（Ｓ
。
へ３、ジョサマイシン）、Ｓ、アルボグリセオラス（Ｓ
。
ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ ） （ミコノマイシン）
、Ｓ、ビキニエ：／ シス（Ｓ、ｂｉｋｉｎｉｅｎｉｉ
ｓ）（ｆヤルコマイノン）、Ｓ、サーラタス（Ｓ、ｃｉ
ｒｒａｔｕｉ ） （）５マイ／ン）、Ｓ、ジャカル７
−ン／ス（Ｓ、ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉ５）にダマイ７
ン）、Ｓ、ユーリサーマス（Ｓ。
、Ｓ、ビキニエ：／ シス（Ｓ、ｂｉｋｉｎｉｅｎｉｉ
ｓ）（ｆヤルコマイノン）、Ｓ、サーラタス（Ｓ、ｃｉ
ｒｒａｔｕｉ ） （）５マイ／ン）、Ｓ、ジャカル７
−ン／ス（Ｓ、ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉ５）にダマイ７
ン）、Ｓ、ユーリサーマス（Ｓ。
ｃｕｒｙＬｈｃｒｍｕｓ ） （アンゴラマイノン）、
Ｓ、フラデイエ（Ｓ、ｆｒａｄｉａｅ ） （９イロ
ンン、ラクテノンノ、マクロノン）、Ｓ、ゴンキエンシ
ス（Ｓ。
Ｓ、フラデイエ（Ｓ、ｆｒａｄｉａｅ ） （９イロ
ンン、ラクテノンノ、マクロノン）、Ｓ、ゴンキエンシ
ス（Ｓ。
ｇｏｓｈｉｋｉｃｎｓｉｉ ） （パンダマイノン）、
Ｓ、グリセオフラプス（Ｓ、 ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕ
ｅ ）（７キュマＩ ’ｉ ７）、Ｓ、ハルｘテンイ（
Ｓ、ｈａｌｓＬｃｄｉｉ） （カルボマイシン）、Ｓ、
テンダニ（Ｓ、 ｔｅｎｄａｅ ） （カルボマイシン
）、Ｓ、７クロスボレウｘ （Ｓ、＋ｎａｃｒｏｓｐｏ
ｒｅｕｓ ）（カルボマイノン）、Ｓ、サーモトレラン
ス（Ｓ。
Ｓ、グリセオフラプス（Ｓ、 ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕ
ｅ ）（７キュマＩ ’ｉ ７）、Ｓ、ハルｘテンイ（
Ｓ、ｈａｌｓＬｃｄｉｉ） （カルボマイシン）、Ｓ、
テンダニ（Ｓ、 ｔｅｎｄａｅ ） （カルボマイシン
）、Ｓ、７クロスボレウｘ （Ｓ、＋ｎａｃｒｏｓｐｏ
ｒｅｕｓ ）（カルボマイノン）、Ｓ、サーモトレラン
ス（Ｓ。
ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ） （カルボマイシン）
、およびＳ、７／Ｌ／ビレチキユリ（Ｓ、 ａｌｂｉｒ
ｅｔｉｃｕｌｉ ） （カルボマイシン）。
、およびＳ、７／Ｌ／ビレチキユリ（Ｓ、 ａｌｂｉｒ
ｅｔｉｃｕｌｉ ） （カルボマイシン）。
β−ラクタム抗生物質を産生し、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主；４１１胞には、例え
ば以下のような微生物の非制限細！ｌＪｑか含まれる：
ストレプトマイセス・リップマニ（Ｓｔｒｃｐｔｏｍγ
ｃｃｓ ｌｉｐｍａｎｉｉ）（Ａ１５８８４、Ｍ〜■
４５５０ 、 ＭＭ １３９０２ ）、Ｓ、クラブ’）
ケ５ス（Ｓ−ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｉ ） （Ａ１５
８８５Ｂ 、クラプラン＠）、５．５ り９ ムテュ５
シス（Ｓ、Ｉａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ ） （セフ
ァマイシンＣ）、Ｓ、グリセウス（Ｓ、 ｇｒｉ ｓｅ
ｕ％）（セファマイシンＡ、Ｂ）、Ｓ、ハイグロスコピ
カフ、 （Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ） （デ
アセトキンセファロスボリンＣ）、Ｓ、ワダヤ７ エフ
シス（ＳｏｗａｄａｙａｍａＣ旧１ｓ）（ＷＳ−３４
４２−Ｄ ）、Ｓ、チャートレランス（Ｓ、ｃｈａｒｔ
ｒｅｕｓｉｉ ）（ＳＦ１６２３ ）、ｓ、ヘテロ％
ルア ７７． （Ｓ、 ｈｅｔｅｒｏｍｏｌｐｈｕｓ
）およびＳ、パナエ７ シス（Ｓ、ｐａｎａｙｅｎｓ
ｉｓ ） （Ｃ２０８１Ｘ） ； ５．シナモネンシス
； （Ｓ、ｃｉｎｎａｔｎｏｎｅｎｓｉｓ ）、Ｓ、フ
ィンブリアタｘ （Ｓ、［ｉｍｂｒｉａｔｕａ ）、Ｓ
、ハルステジ（Ｓ、ｈａｔｓｔｅｄｉｉ）、Ｓ、ロツチ
ェイ（Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ ）およびＳ、ビリドクロモ
ゲネｘ （Ｓ、 ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ
）（セフ７フイシンＡＳＢ）Ｓ、カトレｑ （Ｓ、ｃａ
ｔｔｌｅｙａ）（チェナマイシン）；およびＳ、オリバ
セウス（Ｓ。
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主；４１１胞には、例え
ば以下のような微生物の非制限細！ｌＪｑか含まれる：
ストレプトマイセス・リップマニ（Ｓｔｒｃｐｔｏｍγ
ｃｃｓ ｌｉｐｍａｎｉｉ）（Ａ１５８８４、Ｍ〜■
４５５０ 、 ＭＭ １３９０２ ）、Ｓ、クラブ’）
ケ５ス（Ｓ−ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｉ ） （Ａ１５
８８５Ｂ 、クラプラン＠）、５．５ り９ ムテュ５
シス（Ｓ、Ｉａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ ） （セフ
ァマイシンＣ）、Ｓ、グリセウス（Ｓ、 ｇｒｉ ｓｅ
ｕ％）（セファマイシンＡ、Ｂ）、Ｓ、ハイグロスコピ
カフ、 （Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ） （デ
アセトキンセファロスボリンＣ）、Ｓ、ワダヤ７ エフ
シス（ＳｏｗａｄａｙａｍａＣ旧１ｓ）（ＷＳ−３４
４２−Ｄ ）、Ｓ、チャートレランス（Ｓ、ｃｈａｒｔ
ｒｅｕｓｉｉ ）（ＳＦ１６２３ ）、ｓ、ヘテロ％
ルア ７７． （Ｓ、 ｈｅｔｅｒｏｍｏｌｐｈｕｓ
）およびＳ、パナエ７ シス（Ｓ、ｐａｎａｙｅｎｓ
ｉｓ ） （Ｃ２０８１Ｘ） ； ５．シナモネンシス
； （Ｓ、ｃｉｎｎａｔｎｏｎｅｎｓｉｓ ）、Ｓ、フ
ィンブリアタｘ （Ｓ、［ｉｍｂｒｉａｔｕａ ）、Ｓ
、ハルステジ（Ｓ、ｈａｔｓｔｅｄｉｉ）、Ｓ、ロツチ
ェイ（Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ ）およびＳ、ビリドクロモ
ゲネｘ （Ｓ、 ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ
）（セフ７フイシンＡＳＢ）Ｓ、カトレｑ （Ｓ、ｃａ
ｔｔｌｅｙａ）（チェナマイシン）；およびＳ、オリバ
セウス（Ｓ。
ｏｆ １ｖａｃｃｕｓ→、Ｓ、７ラボビレンス（Ｓ、［
Ｉａｖｏｖｉｒｃｎｓ）、Ｓ、７ラバス（Ｓ、ｆｌａｖ
ｕｉ ）、５．フルボビリシス（Ｓ。
Ｉａｖｏｖｉｒｃｎｓ）、Ｓ、７ラバス（Ｓ、ｆｌａｖ
ｕｉ ）、５．フルボビリシス（Ｓ。
［ｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉｓ ）、Ｓ、アルゲンチオラス
（Ｓ。
（Ｓ。
ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ ）およびＳ、シオヤエンシ
ス（Ｓ。
ス（Ｓ。
ｑｉｏｙａｅｎｓｉｉ ） （ｘｉＭ４５５０ および
ＭＭ１３９０２ ）。
ＭＭ１３９０２ ）。
ポリエーテル抗生物質を産生し、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には、例えば以下
のような微生物の非制限細胞か含まれる：ストレオマイ
セスアルプス（Ｓｔｒｅｏ−ｍｙｃｅｓａｌｂｕｓ ）
（Ａ２０４、Ａ２８６９５ＡおよびＢ１サリノマイシン
）、Ｓ、ハイグロスコピカフ（Ｓ。
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には、例えば以下
のような微生物の非制限細胞か含まれる：ストレオマイ
セスアルプス（Ｓｔｒｅｏ−ｍｙｃｅｓａｌｂｕｓ ）
（Ａ２０４、Ａ２８６９５ＡおよびＢ１サリノマイシン
）、Ｓ、ハイグロスコピカフ（Ｓ。
ｈｙｇｒｏｉｅｏｐｉｃｕｓ ）（Ａ２１８、エメリ
シト、ＤＥ３９３６、）〜１２ＯＡ、Ａ２８６９５Ａお
よびＢ、エテロマインン、ンアネマイシン）、Ｓ、グリ
セウス（Ｓ。
シト、ＤＥ３９３６、）〜１２ＯＡ、Ａ２８６９５Ａお
よびＢ、エテロマインン、ンアネマイシン）、Ｓ、グリ
セウス（Ｓ。
ｇｒｉｓｃｕｓ） （クリツリキシン）、Ｓ、コングロ
バタス（Ｓ、ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕｓ）（イオ／フィシ
ン）、Ｓ、ニーロッジカス・バー・アステロシジカス（
Ｓ。
バタス（Ｓ、ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕｓ）（イオ／フィシ
ン）、Ｓ、ニーロッジカス・バー・アステロシジカス（
Ｓ。
ｃｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ、ａｓｔｅｒｏｃｉｄ
ｉｃｕｓ ） （ライドロマイノン゛）、Ｓ、ラサリ
ｘ ７ シス（Ｓ、１ａｓａｌｉｃｎｓｉｓ（ラナロン
ド）、Ｓ、リポンジフイカス（Ｓ。
ｉｃｕｓ ） （ライドロマイノン゛）、Ｓ、ラサリ
ｘ ７ シス（Ｓ、１ａｓａｌｉｃｎｓｉｓ（ラナロン
ド）、Ｓ、リポンジフイカス（Ｓ。
ｒｉｂｏｉｉｄｉｆｉｃｕｓ ） （口／ フィシン）
、Ｓ、カカオ・バー・了りエンシス（Ｓ、ｃａｃａｏｉ
ｖａｒ、ａｓｏｅｎｓｉｉ）（ライソセリン）、Ｓ、
ンナモネンシス（Ｓ、 ｃｉｎａ＋ｎｏ−ｎｅｎｓｉｓ
） （モネンシン）、Ｓ、オーレオファシェンス（Ｓ
、ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ ）（ナラジン）、Ｓ、ガ
リナリウス（Ｓｏｇａｌｌｉｎａｒｉｕｉ）（ＲＰ３０
５０４ ）、Ｓ。
、Ｓ、カカオ・バー・了りエンシス（Ｓ、ｃａｃａｏｉ
ｖａｒ、ａｓｏｅｎｓｉｉ）（ライソセリン）、Ｓ、
ンナモネンシス（Ｓ、 ｃｉｎａ＋ｎｏ−ｎｅｎｓｉｓ
） （モネンシン）、Ｓ、オーレオファシェンス（Ｓ
、ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ ）（ナラジン）、Ｓ、ガ
リナリウス（Ｓｏｇａｌｌｉｎａｒｉｕｉ）（ＲＰ３０
５０４ ）、Ｓ。
ロングウツデンシ７． （Ｓ、ｌｏｎｇｗｏｏｄｅｎｉ
ｉｉ ） （ライ’／−１ｙリン）、Ｓ、７ラベオラｘ
（Ｓ、ｆｌａｖｅｏｌｕｓ）（ＣＰ３８９３６ ）、
Ｓ、ムタビリス（Ｓ、ｍｕｔａｂｉｌｉｓ ）（Ｓ−１
１７４３１）、およびＳ、ヒオラセオニケル（Ｓ、ｖｉ
ｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ ） （ニゲリシン）。
ｉｉ ） （ライ’／−１ｙリン）、Ｓ、７ラベオラｘ
（Ｓ、ｆｌａｖｅｏｌｕｓ）（ＣＰ３８９３６ ）、
Ｓ、ムタビリス（Ｓ、ｍｕｔａｂｉｌｉｓ ）（Ｓ−１
１７４３１）、およびＳ、ヒオラセオニケル（Ｓ、ｖｉ
ｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ ） （ニゲリシン）。
グリコペプチド抗生物質を産生じ、本発明に係るベクタ
ーを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいスト
レプトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には、例えば以
下のような微生物の非制限細胞が含まれる＝５．オリエ
ンタリス（Ｓ、ｏｒｉｅｎｔａ−ｌｉｓ ）およびＳ、
ハラ／ ７ シｘ ７ シｘ （Ｓ、１ｕｒａｎｏ＋ｎ
ａ−ｃｈｉｅｎＳｉｓ ） （ハフ −ｙ フィシン）
、Ｓ、カンジダス（Ｓ、ｃａｎｄｉｄｕｉ ） （Ａ−
３５５１２、アボパルシン）、およびＳ、ｘブロスボレ
ウス（Ｓ、ｃｂｕｒｏｓｐｏｒｃｕｔ ） （ＬＬ−Ａ
〜１３７４ ）。
ーを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいスト
レプトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には、例えば以
下のような微生物の非制限細胞が含まれる＝５．オリエ
ンタリス（Ｓ、ｏｒｉｅｎｔａ−ｌｉｓ ）およびＳ、
ハラ／ ７ シｘ ７ シｘ （Ｓ、１ｕｒａｎｏ＋ｎ
ａ−ｃｈｉｅｎＳｉｓ ） （ハフ −ｙ フィシン）
、Ｓ、カンジダス（Ｓ、ｃａｎｄｉｄｕｉ ） （Ａ−
３５５１２、アボパルシン）、およびＳ、ｘブロスボレ
ウス（Ｓ、ｃｂｕｒｏｓｐｏｒｃｕｔ ） （ＬＬ−Ａ
〜１３７４ ）。
本発明に係るベクターを特番こ有用に使用でき、形質転
換できる。その他の好ましいストレプトマイセスの非制
限菌株宿主細胞には、例えば以下のような微生物の非制
限細胞か含まれる＝５．コエリカラー（Ｓ、ｃｏｅｌｉ
ｃｏｌｏｒ ）、Ｓ、グラニュロル−バ−（Ｓ、ｇｒａ
ｎｕｌｏｒｕｂｅｒ ）、Ｓ、ｏゼオスポーラス（Ｓ、
ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ ）、Ｓ、リビダンス（Ｓ、
ｌ１ｖｉｄａｎｓ ）およびＳ、ニスピノサス（Ｓ、
ｅａｐｉｎｏ＠ｕｓ）。
換できる。その他の好ましいストレプトマイセスの非制
限菌株宿主細胞には、例えば以下のような微生物の非制
限細胞か含まれる＝５．コエリカラー（Ｓ、ｃｏｅｌｉ
ｃｏｌｏｒ ）、Ｓ、グラニュロル−バ−（Ｓ、ｇｒａ
ｎｕｌｏｒｕｂｅｒ ）、Ｓ、ｏゼオスポーラス（Ｓ、
ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ ）、Ｓ、リビダンス（Ｓ、
ｌ１ｖｉｄａｎｓ ）およびＳ、ニスピノサス（Ｓ、
ｅａｐｉｎｏ＠ｕｓ）。
本発明で明らかにした全ての態様が有用であるが、本発
明方法を適用するには、その内いくつかの発現ベクター
および形質転換体が特に好ましい。
明方法を適用するには、その内いくつかの発現ベクター
および形質転換体が特に好ましい。
即ち、好ましいベクターとしては、プラスミドＰ Ｋ
Ｃ４１７、好ましいノヒ質転換体としてはストレプトマ
イセス・アンポファンエシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓａｍｂｏ［ａｃｉｅｎｓ ）／ ｐ Ｋ Ｃ４１７を
挙げることができる。
Ｃ４１７、好ましいノヒ質転換体としてはストレプトマ
イセス・アンポファンエシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓａｍｂｏ［ａｃｉｅｎｓ ）／ ｐ Ｋ Ｃ４１７を
挙げることができる。
機能的ポリペプチドを発現する本発明方法は広範な用途
を有し、ストレプトマイセス内で用い得る発現ビヒクル
の欠乏を補充するものである。このように、本発明方法
番こよれば、現在大腸菌内で生産されているヒ（！物の
遺伝子発現を、ストレプトマイセス内で行なうことかで
きる。このことは、大腸菌よりもストレプトマイセスの
方７７）大規模発酵に関してよく知られ、理解されてい
るので、特１こ有益である。実際、大腸菌の営利的な発
酵産業は依然実間【段階にあり困難に直面している。本
発明は、例えばヒトインシュリン、ヒトプロインツユリ
ン、グルカコ゛ン、インターフェロン、ヒト成長ホルモ
ンおよびラン成長ホルモンなどの現在大腸菌内で生合成
されている化合物を、ストレプトマイセス内で生産する
代替手段を提供することにより、上記の問題点を解決す
るものである。このことは、本発明方法に有用なベクタ
ーか極めて広範な適用性を有すると共に、前述の生産物
をコードしているＤＮＡ配列を導入（収容）することか
出来ることによるものである。すなわち、本発明方法は
宿主細胞の選択に融通性を与えると共に、ポリペプチド
または他の遺伝的所産物の生合成にストレプトマイセス
を用いる方法を提供するものである。
を有し、ストレプトマイセス内で用い得る発現ビヒクル
の欠乏を補充するものである。このように、本発明方法
番こよれば、現在大腸菌内で生産されているヒ（！物の
遺伝子発現を、ストレプトマイセス内で行なうことかで
きる。このことは、大腸菌よりもストレプトマイセスの
方７７）大規模発酵に関してよく知られ、理解されてい
るので、特１こ有益である。実際、大腸菌の営利的な発
酵産業は依然実間【段階にあり困難に直面している。本
発明は、例えばヒトインシュリン、ヒトプロインツユリ
ン、グルカコ゛ン、インターフェロン、ヒト成長ホルモ
ンおよびラン成長ホルモンなどの現在大腸菌内で生合成
されている化合物を、ストレプトマイセス内で生産する
代替手段を提供することにより、上記の問題点を解決す
るものである。このことは、本発明方法に有用なベクタ
ーか極めて広範な適用性を有すると共に、前述の生産物
をコードしているＤＮＡ配列を導入（収容）することか
出来ることによるものである。すなわち、本発明方法は
宿主細胞の選択に融通性を与えると共に、ポリペプチド
または他の遺伝的所産物の生合成にストレプトマイセス
を用いる方法を提供するものである。
即ち、ストレプトマイセス内で機能的なポリペプチドの
遺伝子発現のためにλＰＬ転写活性化配列を用いること
により、この工業的に重要な微生物群における組換えＤ
ＮＡ技術を最大限に発展させることができる。
遺伝子発現のためにλＰＬ転写活性化配列を用いること
により、この工業的に重要な微生物群における組換えＤ
ＮＡ技術を最大限に発展させることができる。
プラスミドＰＥＬ１０３、ｐ Ｉ Ｊ ７０２、ｐＫｃ
３０９、Ｐ Ｋ Ｃ３２２およびｐ Ｋ Ｃ２８３のそ
れぞれの供給源であるストレプトマイセス・グラニュロ
ルーバー慮Ａ ３９９１２．１３ ／ ｐ Ｅ Ｌ １
０３、ストレプトマイセス・リビダンス／ＰＩＪ７０２
、大腸菌に１２ＢＥ１０４１／ｐＫｃ３ｏｃ＋、大腸菌
に１２ ＢＥ １２９５ ／ Ｐ Ｋ Ｃ３２２および
大腸菌に１２ ＢＥ １２０１ ／ ｐ Ｋ Ｃ２８３
、並びにストレプトマイセス・アンボファシエンスは、
いくつかの異る培地の内、任意のものを用いて様々な方
法で培養することができる。培地中に加える好ましい炭
水化物源には、例えば糖蜜、ブドウ糖、デキストリンお
よびグリセリン、窒素源には、例えば大豆粉末、アミノ
酸混合物およびペプトン類か含まれる。栄養成分である
無機塩も又加えられるが、それには、マグネ７ウム、ナ
トリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン
酸、塩酸および硫酸イオン等のイオンを生成し得る通常
の塩類が挙げられる。他の微生物の成長および発育に必
要であるように、必須微猾元素も添加される。それらの
微逼元素は、通常池の培地成分に付随する不純物の形で
供給される。
３０９、Ｐ Ｋ Ｃ３２２およびｐ Ｋ Ｃ２８３のそ
れぞれの供給源であるストレプトマイセス・グラニュロ
ルーバー慮Ａ ３９９１２．１３ ／ ｐ Ｅ Ｌ １
０３、ストレプトマイセス・リビダンス／ＰＩＪ７０２
、大腸菌に１２ＢＥ１０４１／ｐＫｃ３ｏｃ＋、大腸菌
に１２ ＢＥ １２９５ ／ Ｐ Ｋ Ｃ３２２および
大腸菌に１２ ＢＥ １２０１ ／ ｐ Ｋ Ｃ２８３
、並びにストレプトマイセス・アンボファシエンスは、
いくつかの異る培地の内、任意のものを用いて様々な方
法で培養することができる。培地中に加える好ましい炭
水化物源には、例えば糖蜜、ブドウ糖、デキストリンお
よびグリセリン、窒素源には、例えば大豆粉末、アミノ
酸混合物およびペプトン類か含まれる。栄養成分である
無機塩も又加えられるが、それには、マグネ７ウム、ナ
トリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン
酸、塩酸および硫酸イオン等のイオンを生成し得る通常
の塩類が挙げられる。他の微生物の成長および発育に必
要であるように、必須微猾元素も添加される。それらの
微逼元素は、通常池の培地成分に付随する不純物の形で
供給される。
ストレプトマイセス・グラニュロルーバー陥Ａ３９９１
２．１３／ＰＥＬ１０３ およびストレプトマイセス
・リビダンス／ＰＩＪ７０２は、各々、ｐＨ約５〜９の
比較的広いｐＨ域で、温度約１５〜４０℃の範囲におい
て好気性条件下に培養される。しかしながら、プラスミ
ドｐ Ｅ Ｌ １０３およびｐ Ｉ Ｊ ７０２を最大
収電で得るためには、培地のｐＨを約７．２カら開始す
ると共に培養温度を約３０゛Ｃに維持することが望まし
い。これらリストレプトマイセス５＋＋胞を上記の条件
で培養することにより、当該技術者周知の方法で常法通
りそれぞれのプラスミドを分雛することのできる細胞の
保有体を冑るこきかできる。
２．１３／ＰＥＬ１０３ およびストレプトマイセス
・リビダンス／ＰＩＪ７０２は、各々、ｐＨ約５〜９の
比較的広いｐＨ域で、温度約１５〜４０℃の範囲におい
て好気性条件下に培養される。しかしながら、プラスミ
ドｐ Ｅ Ｌ １０３およびｐ Ｉ Ｊ ７０２を最大
収電で得るためには、培地のｐＨを約７．２カら開始す
ると共に培養温度を約３０゛Ｃに維持することが望まし
い。これらリストレプトマイセス５＋＋胞を上記の条件
で培養することにより、当該技術者周知の方法で常法通
りそれぞれのプラスミドを分雛することのできる細胞の
保有体を冑るこきかできる。
大・陽画に１２ＢＥ１０４１／’ＰＫＣ３０９、大＠菌
に１２ＢＥ１２９５／ｐＫＣ３２２、および大腸菌に１
２ＢＥ１２０１／’ＰＫＣ２８３はそれぞれ ｐＨ約６
．５〜８の比較的去いｐＨ域で、温度約２５〜４０℃の
範囲において好気性条件下に培養される。しかしなから
、プラｙ、 ミｌ’ｐＫｃ３０９．ｐＫＣ３２２および
ＰＫＣ２８３を最大収量で４るためには、培地のｐＨを
約７．４から開始すると共に、培養温度を約３０℃に維
持することが好ましい。大腸菌細胞を上記の条件下で培
養することにより、当該技術者周知の方法で常法通りそ
れぞれのプラスミドを分離することのできる細胞の保有
体を得ることができる。
に１２ＢＥ１２９５／ｐＫＣ３２２、および大腸菌に１
２ＢＥ１２０１／’ＰＫＣ２８３はそれぞれ ｐＨ約６
．５〜８の比較的去いｐＨ域で、温度約２５〜４０℃の
範囲において好気性条件下に培養される。しかしなから
、プラｙ、 ミｌ’ｐＫｃ３０９．ｐＫＣ３２２および
ＰＫＣ２８３を最大収量で４るためには、培地のｐＨを
約７．４から開始すると共に、培養温度を約３０℃に維
持することが好ましい。大腸菌細胞を上記の条件下で培
養することにより、当該技術者周知の方法で常法通りそ
れぞれのプラスミドを分離することのできる細胞の保有
体を得ることができる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の説明および本発明を構成する実際の手法を適宜
記載した。
記載した。
実施例１．大腸菌に１２ＢＥ１２８１／ｐＫｃ３０９の
培養およびプラスミドｐＫｃ３０９の単離Ａ、培養 約５ｍｅの大腸菌に１２ＢＥ１０４１／ｐＫｃ３０９（
ＮＲＲＬＢ−１５８２７）の培養物をＴＹ培地（１％ト
リプトン１，５％醇母エキス１，５％塩化ナトリウム、
ｐｉ−１７，４）中、選択的な条件下において微生物学
上の常法に従って増殖させた。細胞をテーブル・トップ
遠心機にかけ、得られたペレットを０．３Ｍシュクロー
ス、２５ ｍ Ｍ Ｅ Ｉ） Ｔ 、八（エチレンジア
ミン四酢酸）および２５ｍＭ）リスー塩駿ｐＨ８（ｍ液
Ｉ ） １ｍｅに懸濁した。エッベンドル７チューブＩ
こ移して約１分間遠心した後、ペレットを０．５ ｍｅ
の溶液Ｉに懸濁した。調製したてのりゾチーム（水中、
２０■／ｍｅ）約５ｏμｅを加え、３７°Ｃで１０分間
インキュベートした。
培養およびプラスミドｐＫｃ３０９の単離Ａ、培養 約５ｍｅの大腸菌に１２ＢＥ１０４１／ｐＫｃ３０９（
ＮＲＲＬＢ−１５８２７）の培養物をＴＹ培地（１％ト
リプトン１，５％醇母エキス１，５％塩化ナトリウム、
ｐｉ−１７，４）中、選択的な条件下において微生物学
上の常法に従って増殖させた。細胞をテーブル・トップ
遠心機にかけ、得られたペレットを０．３Ｍシュクロー
ス、２５ ｍ Ｍ Ｅ Ｉ） Ｔ 、八（エチレンジア
ミン四酢酸）および２５ｍＭ）リスー塩駿ｐＨ８（ｍ液
Ｉ ） １ｍｅに懸濁した。エッベンドル７チューブＩ
こ移して約１分間遠心した後、ペレットを０．５ ｍｅ
の溶液Ｉに懸濁した。調製したてのりゾチーム（水中、
２０■／ｍｅ）約５ｏμｅを加え、３７°Ｃで１０分間
インキュベートした。
調製したでの溶菌ミックス（２％ドデシル硫酸ナトリ’
７ムおよびＱ、３ ＮＮａ０Ｈ） ２５０ ｉｌｌ！を
加え、即座に細胞を完全にポルテックス（攪拌）処理し
た。次いで、この細胞を７０℃で１０分間インキユヘー
ヒトシタ後冷却し、フェノールーセバーク（フエ／−ル
ークロロホルム−イソアミルアルコール、２５ ： ２
４ ： １ ）約１００μｌに加えた。この物質をポル
テックス処理して完全に混合した。エツペンドルフ遠心
分離機で２分間、ＤＮＡを遠心した後、上清をデカント
し、該上清からＤＮ Ａを沈殿させるために、非−緩衝
化３Ｍ酢酸ナトリウム７０μｌとインプロパツール５０
０μｌの混液に加えた。この溶液を室温で５分間インキ
ュベートした後、５分間遠心した。上清を静かに、かつ
完全にデカントして余剰の液体全てを除いた。
７ムおよびＱ、３ ＮＮａ０Ｈ） ２５０ ｉｌｌ！を
加え、即座に細胞を完全にポルテックス（攪拌）処理し
た。次いで、この細胞を７０℃で１０分間インキユヘー
ヒトシタ後冷却し、フェノールーセバーク（フエ／−ル
ークロロホルム−イソアミルアルコール、２５ ： ２
４ ： １ ）約１００μｌに加えた。この物質をポル
テックス処理して完全に混合した。エツペンドルフ遠心
分離機で２分間、ＤＮＡを遠心した後、上清をデカント
し、該上清からＤＮ Ａを沈殿させるために、非−緩衝
化３Ｍ酢酸ナトリウム７０μｌとインプロパツール５０
０μｌの混液に加えた。この溶液を室温で５分間インキ
ュベートした後、５分間遠心した。上清を静かに、かつ
完全にデカントして余剰の液体全てを除いた。
１） Ｎ Ａ沈殿をＴＥ （１０ｍＭ ト’Ｊ ス−Ｈ
Ｃ１！ｐｔＩ８および１，１１ＭＥＤＴＡ）５００１？
に溶かし。
Ｃ１！ｐｔＩ８および１，１１ＭＥＤＴＡ）５００１？
に溶かし。
１００ｍＭスペルミンＨＣ／２５μｌ を加えた。
この混合物をポルテックスし、室温で５分間インキュベ
ートした後、エッペンドルフ遠心機で５分間遠心した。
ートした後、エッペンドルフ遠心機で５分間遠心した。
再度、上清を完全にデカントして捨て、碍られたＤＮＡ
ペレットを７５％エタノール、０．３Ｍ酢酸ナトリウム
および１０ｍＭ酢酸マグネシウム１＋＋＋Ｃて洗浄した
。この溶液を室温で５分間インキュベートした後、上記
と同様にしてＤＮＡを集めた。１尋られたペレットをＴ
ＥＩＱμｊに溶かし、クローニングビヒクルの調製に用
いた。
ペレットを７５％エタノール、０．３Ｍ酢酸ナトリウム
および１０ｍＭ酢酸マグネシウム１＋＋＋Ｃて洗浄した
。この溶液を室温で５分間インキュベートした後、上記
と同様にしてＤＮＡを集めた。１尋られたペレットをＴ
ＥＩＱμｊに溶かし、クローニングビヒクルの調製に用
いた。
実施例２． プラスミドｐＫＣ３４５の組立てＡ、プラ
スミドＰＫＣ３０９のＢｃｆＩ消化―吻騨１−−
１”−曜−−一−―−−馳一一一、１１．。
スミドＰＫＣ３０９のＢｃｆＩ消化―吻騨１−−
１”−曜−−一−―−−馳一一一、１１．。
実施例１で１等だプラスミドｐＫｃ３０９ＤＮＡ 約
１０ｔｔｌをＩ Ｘ Ｂｃｅ Ｉ ハラ７７ （７５
ｍＭ Ｉ＜Ｃｅ、１０ｍＭ） リ ス ｐＨ７，４、
ｌ Ｑ ｍ Ｍ Ｍ ９ Ｃｅ ２ 、 および
１０ｍＭＤＴＴ）中、全ｆ１５０μｌて、１３ （（Ｉ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼ ２（１位［ニュー・イング
ランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ ａｎｄＢｉｏ
ｌａｂ）］ で消化した。この混合物を５０℃で約１時
間半インキュベートした。次いで３Ｍ酢酸ナトリウム（
ＮａＯＡｃ）０．１容量を加え、更に９５％エタノール
３倍量を加えることにより、ＤＮＡを沈殿させた。ドラ
イアイス−イソプロパツール浴中で、このエタノール沈
殿を迅速に進行させた。
１０ｔｔｌをＩ Ｘ Ｂｃｅ Ｉ ハラ７７ （７５
ｍＭ Ｉ＜Ｃｅ、１０ｍＭ） リ ス ｐＨ７，４、
ｌ Ｑ ｍ Ｍ Ｍ ９ Ｃｅ ２ 、 および
１０ｍＭＤＴＴ）中、全ｆ１５０μｌて、１３ （（Ｉ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼ ２（１位［ニュー・イング
ランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ ａｎｄＢｉｏ
ｌａｂ）］ で消化した。この混合物を５０℃で約１時
間半インキュベートした。次いで３Ｍ酢酸ナトリウム（
ＮａＯＡｃ）０．１容量を加え、更に９５％エタノール
３倍量を加えることにより、ＤＮＡを沈殿させた。ドラ
イアイス−イソプロパツール浴中で、このエタノール沈
殿を迅速に進行させた。
明記しない限り、以後の実施例においては、上記のエタ
ノール沈殿法を行うものとする。エツペンドルフ微量遠
心機（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ） 中で５分間遠心してＤ
ＮＡ沈殿を集めた。このＤＮＡペレットをエタ／−ルで
洗浄し、真空乾燥した後、約ｌＯμｌの水に懸濁し、次
のライゲーションに供した。
ノール沈殿法を行うものとする。エツペンドルフ微量遠
心機（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ） 中で５分間遠心してＤ
ＮＡ沈殿を集めた。このＤＮＡペレットをエタ／−ルで
洗浄し、真空乾燥した後、約ｌＯμｌの水に懸濁し、次
のライゲーションに供した。
・ヒ 制限酵素類および指針は以下の供給者から得た。
二ニー・イングランド・バイオラボス、インココ−ボレ
ーテッド、３２トザー・ロード、ベバリー、マサチュー
セッツ０１９１５ （Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ
Ｌａｂｓ、、 Ｉｎｃ、、 ３２ Ｔｏｚｅｒ Ｒ
ｏａｄ、 Ｂｅｖｅｒｌｙ。
ーテッド、３２トザー・ロード、ベバリー、マサチュー
セッツ０１９１５ （Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ
Ｌａｂｓ、、 Ｉｎｃ、、 ３２ Ｔｏｚｅｒ Ｒ
ｏａｄ、 Ｂｅｖｅｒｌｙ。
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０１９１５ ）。
ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイズ、インコーホレー
テッド、Ｐ、０．Ｂｏｘ ５７７ 、ガイザースバーグ
、メアリーランド２０７６０ （ＢｅｔｈｅｓｄａＲ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ
、、 Ｐ、０． Ｂｏｘ５７７、 Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０７６０）。
テッド、Ｐ、０．Ｂｏｘ ５７７ 、ガイザースバーグ
、メアリーランド２０７６０ （ＢｅｔｈｅｓｄａＲ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ
、、 Ｐ、０． Ｂｏｘ５７７、 Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０７６０）。
ベーリンガーーマンハイム・バイオケミカルス、７９４
１ キャッスルウェイ・ドライ７’、ｐ、ｏ。
１ キャッスルウェイ・ドライ７’、ｐ、ｏ。
Ｂｏｘ ５０８１６、インディアナポリス、インディア
ナ４６２５０ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 ７９４１ Ｃａ５ｔ
！ｅｗａｙ Ｄｒｉｖｅ。
ナ４６２５０ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 ７９４１ Ｃａ５ｔ
！ｅｗａｙ Ｄｒｉｖｅ。
Ｐ、０． Ｂｏｘ ５０８１６． Ｉｎｄｉａｎａｐ
ｏｌｉｓ、 Ｉｎｄｉａｎａ４６２５０ ）。
ｏｌｉｓ、 Ｉｎｄｉａｎａ４６２５０ ）。
１、 ストレプトマイセス・グラニュロルーバー雁スト
レプトマイセス・グラニュロルーバー高Ａ３９９１２．
１３／ｐＥＬ１０３（ＮＲＲＬ１２５４９）を。
レプトマイセス・グラニュロルーバー高Ａ３９９１２．
１３／ｐＥＬ１０３（ＮＲＲＬ１２５４９）を。
滅菌トリブチカーゼ・ソイ・ブロア、 ” ３５９ ／
ｔ！脱脱イオン水中混合円内増殖させ、該菌株の栄養
接種物を常法通り調製した。
ｔ！脱脱イオン水中混合円内増殖させ、該菌株の栄養
接種物を常法通り調製した。
このトリブチカーゼ・ソイ・ブロス接種物を３゜°Ｃの
温度下で４８時間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、この接種物的１０ｍｅを滅菌ブロス５００ｍｅ
中に移し、３０℃で約２０時間インキュベートした。イ
ンキュベーション後、該接種物的１０ｍ１’を滅菌ブロ
ス５００＋＋＋ｅ中に移し、３０℃で約２０時間インキ
ュベートした。ｐＨ調節は行わない。インキュベーショ
ン終丁後、ストレプトマイセス・グラニュロルーバ−Ａ
Ａ３９９１２．１３／ＰＥＬ１０３ 細胞を収穫し、
次いてプラスミド１）ＮＡを単離する。
温度下で４８時間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、この接種物的１０ｍｅを滅菌ブロス５００ｍｅ
中に移し、３０℃で約２０時間インキュベートした。イ
ンキュベーション後、該接種物的１０ｍ１’を滅菌ブロ
ス５００＋＋＋ｅ中に移し、３０℃で約２０時間インキ
ュベートした。ｐＨ調節は行わない。インキュベーショ
ン終丁後、ストレプトマイセス・グラニュロルーバ−Ａ
Ａ３９９１２．１３／ＰＥＬ１０３ 細胞を収穫し、
次いてプラスミド１）ＮＡを単離する。
＊ トリブチカーゼ・ソイ・ブロスはＲＢ Ｌ ティビ
ジョン、ベクトンーディッキンノン＆カンパニー、コツ
キイスビレ、メアリーランド２１０３０（ＢＢＬ Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎ、 Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
ｇ：Ｃｏｍｐａｎｙ、 Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、
Ｍａｒｙｌａｎｄ ２１０３０）から入手可能である。
ジョン、ベクトンーディッキンノン＆カンパニー、コツ
キイスビレ、メアリーランド２１０３０（ＢＢＬ Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎ、 Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
ｇ：Ｃｏｍｐａｎｙ、 Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、
Ｍａｒｙｌａｎｄ ２１０３０）から入手可能である。
ストレプトマイセス・グラニュロルーバー屋Ａ ３９９
１２．１３／ＰＥＬ１０３約１２ｇＩ（湿重量）を遠心
しく４°Ｃ１１０，０００ｒｐｍ Ｘ １０分）、 １
０％グリセリンで洗浄した後、上記条件下で遠心して収
穫した。ＴＢＳバッファー（，０１Ｍトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ ）１．００１ＭＥ
ＤＴＡ、３４％シュ’ｙｒｙ−ｘ、ｐＨ８）約５０ｍｅ
を１尋られた細胞に加えた後、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ
１０ｒｎｅ中リゾチーム約０．２５ｙを加えた。この混
合物を３７°Ｃで約１５分間インキュベートした後、Ｔ
Ｅバッフ７ （，０１Ｍトリス１，００１Ｍ ＥＤＴ
Ａ。
１２．１３／ＰＥＬ１０３約１２ｇＩ（湿重量）を遠心
しく４°Ｃ１１０，０００ｒｐｍ Ｘ １０分）、 １
０％グリセリンで洗浄した後、上記条件下で遠心して収
穫した。ＴＢＳバッファー（，０１Ｍトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ ）１．００１ＭＥ
ＤＴＡ、３４％シュ’ｙｒｙ−ｘ、ｐＨ８）約５０ｍｅ
を１尋られた細胞に加えた後、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ
１０ｒｎｅ中リゾチーム約０．２５ｙを加えた。この混
合物を３７°Ｃで約１５分間インキュベートした後、Ｔ
Ｅバッフ７ （，０１Ｍトリス１，００１Ｍ ＥＤＴ
Ａ。
ｐｌ−１８） 中、 １０ ％ ト リ ト ンＸ−１
００約０．５ ｍｅを加えた二次いで、得られた混合物
を６５℃で約１５分間インキュベートした。リゼイト（
溶菌液）を遠心（４°Ｃ１１８，０００ｒＰｍ Ｘ ４
５分）した後、上清をイソアミルアルコールで４回、ク
ロロポルム−イソアミルアルコール溶液（２４：１）で
１回抽出した。次いで、水層に、３ Ｍ酢酸ナトリウム
０．１ 容ｉ、 川に一２０℃の冷９５％エタノール３
倍肴を加えた。ドライアイス−エタノール浴中でＤＮＡ
を迅速に沈殿させた後、遠心（４℃、１０、ＯＯＯｒｐ
ｍ Ｘ １５分）して集めた。この沈殿を真空乾燥した
後、ＳＴＥバッファー（，０１Ｍトリス１．ＱＱＩＭＥ
ＤＴＡｌ、０１Ｍ塩化ナトリウム）１、１ ｍｅに懸濁
させた。エチジウムプロミドの、塩化セシウムグラデイ
エントを用いて遠心することｌこより、プラスミドＤＮ
Ａを精製した。遠心後、所望のプラスミドｐＥＬＩＱ３
ＤＮＡのバンドを除き、常法通りエチジウムプロミド抽
出を行った。
００約０．５ ｍｅを加えた二次いで、得られた混合物
を６５℃で約１５分間インキュベートした。リゼイト（
溶菌液）を遠心（４°Ｃ１１８，０００ｒＰｍ Ｘ ４
５分）した後、上清をイソアミルアルコールで４回、ク
ロロポルム−イソアミルアルコール溶液（２４：１）で
１回抽出した。次いで、水層に、３ Ｍ酢酸ナトリウム
０．１ 容ｉ、 川に一２０℃の冷９５％エタノール３
倍肴を加えた。ドライアイス−エタノール浴中でＤＮＡ
を迅速に沈殿させた後、遠心（４℃、１０、ＯＯＯｒｐ
ｍ Ｘ １５分）して集めた。この沈殿を真空乾燥した
後、ＳＴＥバッファー（，０１Ｍトリス１．ＱＱＩＭＥ
ＤＴＡｌ、０１Ｍ塩化ナトリウム）１、１ ｍｅに懸濁
させた。エチジウムプロミドの、塩化セシウムグラデイ
エントを用いて遠心することｌこより、プラスミドＤＮ
Ａを精製した。遠心後、所望のプラスミドｐＥＬＩＱ３
ＤＮＡのバンドを除き、常法通りエチジウムプロミド抽
出を行った。
ＤＮＡを３倍量のエタノール中で沈殿させた後、単離し
たこのプラスミドＰＥＬ１０３ ＤＮＡを１０倍希釈
Ｔ Ｅ ハラ７７ １ ｍｅ ニ溶かし、−２０’Ｃで
保存した。
たこのプラスミドＰＥＬ１０３ ＤＮＡを１０倍希釈
Ｔ Ｅ ハラ７７ １ ｍｅ ニ溶かし、−２０’Ｃで
保存した。
３、 プラスミドＰＥＬ１０３のＢａｍＨＩ 消化、
およトの単離 プラスミドｐＥＬＩＱ３ＤＮＡ（実施例２Ｂて調製）約
２ｔｔ９をＩＸＢａｍｆ（Ｉバッファー（１５０ｍｋｌ
Ｎ ａ Ｃｌ、 １０ｍＭ ト リ ス ｐｌ−１
８、１０ｍＭＭｙ Ｃｌ２）中、総合Ｑ５０ｔｉｅで、
Ｂａｍ ｌ−１１制限工ンドヌクレアーゼ１６単位（二
ニー・イングランド・バイオラボ）により、消化した。
およトの単離 プラスミドｐＥＬＩＱ３ＤＮＡ（実施例２Ｂて調製）約
２ｔｔ９をＩＸＢａｍｆ（Ｉバッファー（１５０ｍｋｌ
Ｎ ａ Ｃｌ、 １０ｍＭ ト リ ス ｐｌ−１
８、１０ｍＭＭｙ Ｃｌ２）中、総合Ｑ５０ｔｉｅで、
Ｂａｍ ｌ−１１制限工ンドヌクレアーゼ１６単位（二
ニー・イングランド・バイオラボ）により、消化した。
この混合物を３７°Ｃて３Ｃ１間インキュベートした。
実施例２人の方法に従い、ＤＮＡをエタノール沈殿に付
した。次いで、このＤＮＡを０．５％アガロ−′スゲル
ミ気泳動にかけ、所望の〜２．９ ｋｂＢａｍｆ（Ｉフ
ラグメントが他のフラグメントから分離するまで泳動さ
せた。単離された〜２．９ｋｂ フラグメントをゲルか
ら除去し、これを０．５μ９／ｍｅエチジウムプロミド
および１００μ９７ｍｅＢｓｋを補充したトリス−酢酸
バッファー０．５ ｍｅの入った半透膜の袋に入れ、５
Ｏ−１００ｖにおいて、ＤＮＡがゲルから溶離する°ま
で、電気溶離を行った。次いで、バッファーをとり出し
、セバーグ（Ｓｅｖａｇ）によってＤＮＡを抽出した。
した。次いで、このＤＮＡを０．５％アガロ−′スゲル
ミ気泳動にかけ、所望の〜２．９ ｋｂＢａｍｆ（Ｉフ
ラグメントが他のフラグメントから分離するまで泳動さ
せた。単離された〜２．９ｋｂ フラグメントをゲルか
ら除去し、これを０．５μ９／ｍｅエチジウムプロミド
および１００μ９７ｍｅＢｓｋを補充したトリス−酢酸
バッファー０．５ ｍｅの入った半透膜の袋に入れ、５
Ｏ−１００ｖにおいて、ＤＮＡがゲルから溶離する°ま
で、電気溶離を行った。次いで、バッファーをとり出し
、セバーグ（Ｓｅｖａｇ）によってＤＮＡを抽出した。
所望の〜２．９ ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フラグメント
をエタノール沈殿に付し、ＴＥバッファーに溶カして以
後のライゲーションに供した。
をエタノール沈殿に付し、ＴＥバッファーに溶カして以
後のライゲーションに供した。
１０４１／ρＫＣ３２６の組立て
Ｉ′５（Ｊｌ−消化プラスミドｐＫＣ３Ｑ ９ Ｄ Ｎ
Ａおヨヒ〜２．９ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩストレプトマ
イセスｆｆｌ’ｌＪ起源含有フラグメント約２μｙづつ
を、１×リガーゼバツフアー（５０ｍＭトリスｐＨ７，
８，１０ｍＭＭｙＣｅ２．２０ｍνＩＤＴＴ、および１
ｍＭＡＴＰ）２０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ＊４００
単位により、１６℃で１夜ライゲートさせた。ＤＮＡを
エタノール沈殿に付し、乾燥後ＴＥ５μｇに再溶解して
以後の形質転換に用いた。
Ａおヨヒ〜２．９ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩストレプトマ
イセスｆｆｌ’ｌＪ起源含有フラグメント約２μｙづつ
を、１×リガーゼバツフアー（５０ｍＭトリスｐＨ７，
８，１０ｍＭＭｙＣｅ２．２０ｍνＩＤＴＴ、および１
ｍＭＡＴＰ）２０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ＊４００
単位により、１６℃で１夜ライゲートさせた。ＤＮＡを
エタノール沈殿に付し、乾燥後ＴＥ５μｇに再溶解して
以後の形質転換に用いた。
得られたプラスミドＤＮＡを用い、実質上、マニアテイ
スらの方法（１９８２，モレキュラー・クローニング、
コールドスプリングハーバ−・ラホラトリイ、コールド
スプリングハーバ−、ニューヨーク） （Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ ｅｔ ａｔ、、 １９８２゜Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒＬａ、ｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｓ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮｅｗＹｏｒｋ ）に従って
大腸菌に１２ ＢＥＩＱ４１（ＮＲＲＬ＋３−１５０
２１）を形質転換した。所望の形質転換体の同定は、
ｐｓｔ Ｉ 部位を獲得したかどうかをスクリーニン
グすることにより、常法通り行った。
スらの方法（１９８２，モレキュラー・クローニング、
コールドスプリングハーバ−・ラホラトリイ、コールド
スプリングハーバ−、ニューヨーク） （Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ ｅｔ ａｔ、、 １９８２゜Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒＬａ、ｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｓ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮｅｗＹｏｒｋ ）に従って
大腸菌に１２ ＢＥＩＱ４１（ＮＲＲＬ＋３−１５０
２１）を形質転換した。所望の形質転換体の同定は、
ｐｓｔ Ｉ 部位を獲得したかどうかをスクリーニン
グすることにより、常法通り行った。
得られた大１湯菌に１２ ＢＥ１０４１／ＰＫＣ３２
６形質転換体を、以後のプラスミドｐＫＣ３２６の生産
および単離のために常法通り培養した。プラスミドＰＫ
Ｃ３２６の制限サイトおよび機能地図を添付の第２図に
示す。
６形質転換体を、以後のプラスミドｐＫＣ３２６の生産
および単離のために常法通り培養した。プラスミドＰＫ
Ｃ３２６の制限サイトおよび機能地図を添付の第２図に
示す。
−ｋ Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ リガーゼは、制限酵素珊
に関して示したと同じ供給者から得ることができる。
に関して示したと同じ供給者から得ることができる。
１、 プラスミドＰ＋ｃＣ３２６のＢａｍ１−１１消化
消化を１時間行う外は実質上、実施例２（Ｂ）（３１の
方法に従い、プラスミドｐＫＣ３２６ＤＮＡ約２／ｌり
をＢａｍＩＩＩ 制限酵素で消化した。Ｄ Ｎ Ａをエ
タノール沈殿ｌこ付し、乾燥した後、ＴＥバッファー５
ｔｔｅ に溶かし、以後のプラスミドｐｌＪ７０２から
単離したチオストレプトン耐性遺伝子とのライゲーショ
ンに供した。
消化を１時間行う外は実質上、実施例２（Ｂ）（３１の
方法に従い、プラスミドｐＫＣ３２６ＤＮＡ約２／ｌり
をＢａｍＩＩＩ 制限酵素で消化した。Ｄ Ｎ Ａをエ
タノール沈殿ｌこ付し、乾燥した後、ＴＥバッファー５
ｔｔｅ に溶かし、以後のプラスミドｐｌＪ７０２から
単離したチオストレプトン耐性遺伝子とのライゲーショ
ンに供した。
２、 プラスミド１）ＩＪ７０２のＢＣＪＩ消化および
〜ｌｋｂチオストレプトン耐性付与’５１ ｆｉ子の単
離実質上、実施例２人の方法に従い、プラスミドｐ ｌ
Ｊ ＤＮＡ （ＡＴＣＣ３９１５５）約５μｙ をＲ
ｃｌ Ｉ制限酵素で消化した。ＤＮＡをエタノール沈
殿に付し、乾燥後、ＴＥバッファー５μｇに溶かした。
〜ｌｋｂチオストレプトン耐性付与’５１ ｆｉ子の単
離実質上、実施例２人の方法に従い、プラスミドｐ ｌ
Ｊ ＤＮＡ （ＡＴＣＣ３９１５５）約５μｙ をＲ
ｃｌ Ｉ制限酵素で消化した。ＤＮＡをエタノール沈
殿に付し、乾燥後、ＴＥバッファー５μｇに溶かした。
このＤＮＡを０．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、
所望の〜１ｋｂＢ（ｊ’Ｊ フラグメントを他のフラ
グメントから分離した。エチジウム・プロミドで染色し
て所望のフラグメントのゲル上の位置を決定し、該所望
のＤＮＡバンドの前方にスリットを設け、このスリット
の部分にワットマン（ｗｈａｔｍａｎ）ＤＥＡＥセルロ
ーフ、ｐ紙ヲ収め、該ＤＮＡをこのＤ Ｅ Ａ Ｅ Ｆ
紙に向けて泳動させた。この戸紙をＴ Ｅ １ ｍｅで
洗浄し、適量のＮａＣ１を加えてＩＭＩこ調節したＴＥ
４００μｌでＤ Ｎ Ａを溶離した。溶離したＤＮＡを
エタノール沈殿に付し、最後に、ＴＥ５／７ｅに溶かし
た。
所望の〜１ｋｂＢ（ｊ’Ｊ フラグメントを他のフラ
グメントから分離した。エチジウム・プロミドで染色し
て所望のフラグメントのゲル上の位置を決定し、該所望
のＤＮＡバンドの前方にスリットを設け、このスリット
の部分にワットマン（ｗｈａｔｍａｎ）ＤＥＡＥセルロ
ーフ、ｐ紙ヲ収め、該ＤＮＡをこのＤ Ｅ Ａ Ｅ Ｆ
紙に向けて泳動させた。この戸紙をＴ Ｅ １ ｍｅで
洗浄し、適量のＮａＣ１を加えてＩＭＩこ調節したＴＥ
４００μｌでＤ Ｎ Ａを溶離した。溶離したＤＮＡを
エタノール沈殿に付し、最後に、ＴＥ５／７ｅに溶かし
た。
ｐＫＣ３４５の組立て
実質上、実施例２Ｃの方法に従い、ＢａｍＨＩ消化プラ
スミドＰ’Ｃ３２６ＤＮ Ａ約２μｙと、プラスミドＰ
’ Ｊ ７０２Ｄ Ｎ Ａの〜１ｋｂＢｃｅ■制限フ
ラグメント〜５μりとをライゲートした。エタノール沈
殿に付し、このＤＮＡを再びＢａｍ１〜ＩＩ 制限酵
素で消化し、親プラスミドの数を減じた。得られたＤＮ
Ａを用い、マニアティスら（１９８２）の方法に従って
大腸菌に１２ＢＥ１０４１を形質転換した。所望の形質
転換体の同定は、アンピシリン耐性、テトラサイクリン
感受性、およびＳａｌ■部位のｉｌｌに関してスクリー
ニングすることにより、常法通り行った。以後のプラス
ミドｐＫＣ３４５の生産および単離のためにコンピテン
トな細胞ヲ常法通り培養した。プラスミドｐＫＣ３４５
の制限サイトおよび機能地図を添付の第２図に示す。
スミドＰ’Ｃ３２６ＤＮ Ａ約２μｙと、プラスミドＰ
’ Ｊ ７０２Ｄ Ｎ Ａの〜１ｋｂＢｃｅ■制限フ
ラグメント〜５μりとをライゲートした。エタノール沈
殿に付し、このＤＮＡを再びＢａｍ１〜ＩＩ 制限酵
素で消化し、親プラスミドの数を減じた。得られたＤＮ
Ａを用い、マニアティスら（１９８２）の方法に従って
大腸菌に１２ＢＥ１０４１を形質転換した。所望の形質
転換体の同定は、アンピシリン耐性、テトラサイクリン
感受性、およびＳａｌ■部位のｉｌｌに関してスクリー
ニングすることにより、常法通り行った。以後のプラス
ミドｐＫＣ３４５の生産および単離のためにコンピテン
トな細胞ヲ常法通り培養した。プラスミドｐＫＣ３４５
の制限サイトおよび機能地図を添付の第２図に示す。
実施例３ ＰＫＣ３５４および大腸菌に１２ＢＥ１０
４１／ＰＫＣ３５４の組立て プラスミドＰＫＣ３２２ＤＮＡ （ＮＲλＬ−Ｂ−１５
８２９）約１５０ ｔｔ７を、１×ＡｖａＩバツフアー
（６０ｍＭＮ ａ Ｃ／ 、 １０ｍＭ ト
リ ス、 ｐｌ−１８、ｌ ＯｍＮＩ ＤＴＴおよび
１０ ｍ Ｍ Ｍ９Ｃｉ ２ ）中、全Ｑ、 ｌ ｍｅ
て１．〜ｖａ■制限酵素１５単位にニュー・イングラン
ド・バイオラボ）を用いて３７°Ｃて７時間消化した。
４１／ＰＫＣ３５４の組立て プラスミドＰＫＣ３２２ＤＮＡ （ＮＲλＬ−Ｂ−１５
８２９）約１５０ ｔｔ７を、１×ＡｖａＩバツフアー
（６０ｍＭＮ ａ Ｃ／ 、 １０ｍＭ ト
リ ス、 ｐｌ−１８、ｌ ＯｍＮＩ ＤＴＴおよび
１０ ｍ Ｍ Ｍ９Ｃｉ ２ ）中、全Ｑ、 ｌ ｍｅ
て１．〜ｖａ■制限酵素１５単位にニュー・イングラン
ド・バイオラボ）を用いて３７°Ｃて７時間消化した。
川に２０単位のＡｖａｌ制限酵素を追加し、−夜反応を
続けた。消化バッファー中にｉ与られたｌ） Ｎ Ａを
、実質上マニアテイスら（１９８２）の方法に従い、５
０Ｖで一夜１％アガロースゲル電気泳動にかけた。
続けた。消化バッファー中にｉ与られたｌ） Ｎ Ａを
、実質上マニアテイスら（１９８２）の方法に従い、５
０Ｖで一夜１％アガロースゲル電気泳動にかけた。
ゲルから〜２．１ｋｂバンドを単離し、実質上、実施例
２ （Ｂ） ＋３１ の方法と同様にしてゲルからＤ
ＮＡを溶離した。ＤＮＡをフェノールで２回、セバーク
（クロロホルム−イソアミルアルコール、２４：１）で
２回抽出した。Ｅｌ！ｕｔｉｐ−ｄカラム〔シライヒヤ
ー・アンド・シュエル；インコーポレーテツド、ケーン
、ニューハンプシャー０３４３１（５ｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ ａｎｄ ５ｃｈｕｅｌｌ、 Ｉｎｃ、、 Ｋｅｅ
ｎｅ。
２ （Ｂ） ＋３１ の方法と同様にしてゲルからＤ
ＮＡを溶離した。ＤＮＡをフェノールで２回、セバーク
（クロロホルム−イソアミルアルコール、２４：１）で
２回抽出した。Ｅｌ！ｕｔｉｐ−ｄカラム〔シライヒヤ
ー・アンド・シュエル；インコーポレーテツド、ケーン
、ニューハンプシャー０３４３１（５ｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ ａｎｄ ５ｃｈｕｅｌｌ、 Ｉｎｃ、、 Ｋｅｅ
ｎｅ。
ＮｅｗＨａｍｐｓｈｉｒｅ ）］ を用いて〜２．１
ｋｂ Ａｖａ■７ラグメントを精製した後、エタノール
沈殿に付し、ＴＥ２０μｌに溶かした。あるいは、ＤＮ
Ａを０．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、所望の７
ラグメントが他のフラグメントから分離するまで泳動さ
せる、という同等のＤＮＡフラグメント晴製法に依って
も良い。次いで、ワットマンＤＥＡ Ｅセルロースを所
望のＤＮＡバンドの前方に設けたスリット内におき、Ｄ
ＮＡをＤＥＡＥＰ紙上に電気泳動させる。次いで、ｐ紙
をＴ Ｅ １ ｍｅで洗浄した後、適当量のＮａＣ１を
加えてＩＭに調節したＴＥ４００μｊで溶離する。溶離
したＤＮＡをエタノール沈殿に付し、以後のライゲーシ
ョンに用いるためにｒＥ５μｌに溶かす。
ｋｂ Ａｖａ■７ラグメントを精製した後、エタノール
沈殿に付し、ＴＥ２０μｌに溶かした。あるいは、ＤＮ
Ａを０．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、所望の７
ラグメントが他のフラグメントから分離するまで泳動さ
せる、という同等のＤＮＡフラグメント晴製法に依って
も良い。次いで、ワットマンＤＥＡ Ｅセルロースを所
望のＤＮＡバンドの前方に設けたスリット内におき、Ｄ
ＮＡをＤＥＡＥＰ紙上に電気泳動させる。次いで、ｐ紙
をＴ Ｅ １ ｍｅで洗浄した後、適当量のＮａＣ１を
加えてＩＭに調節したＴＥ４００μｊで溶離する。溶離
したＤＮＡをエタノール沈殿に付し、以後のライゲーシ
ョンに用いるためにｒＥ５μｌに溶かす。
プラスミドＰＫＣ３４５Ｄ Ｎ Ａ約１０μ２ を１×
５ａ（ｌバッファー（１０ｍ〜Ｉ Ｍ９ Ｃｅ ２．
１０ ｍ Ｍ トリスｐ８７．４および１０ｍＭＤＴＴ
）中、総合計１０μｅで、５ａｃＩ制限工ンドヌクレア
ーゼ５単位にニュー・イングランド・バイオラボ）を用
いて３７”Ｃで１時間消化した。ＬｒＡＷを５分間、７
０°Ｃにすることによって反応を停止させた。
５ａ（ｌバッファー（１０ｍ〜Ｉ Ｍ９ Ｃｅ ２．
１０ ｍ Ｍ トリスｐ８７．４および１０ｍＭＤＴＴ
）中、総合計１０μｅで、５ａｃＩ制限工ンドヌクレア
ーゼ５単位にニュー・イングランド・バイオラボ）を用
いて３７”Ｃで１時間消化した。ＬｒＡＷを５分間、７
０°Ｃにすることによって反応を停止させた。
ゲーション
約５μ１つつの精製〜２．１ ｋｂ Ａｖａ Ｌ制限フ
ラグメントとＳａｃ Ｉ消化ｐＫＣ３４５とを１０ＸＴ
４ポリメラーゼバツフアー（６７ｍＭ酢酸カリウム、３
３ｍＭ１−リス−酢酸ｐ Ｈ７，８および１０ｍ５＋酢
酸マグネシウム）２μｌに加えた。次いで、２０×デオ
キシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＩ’ 、ｄＣＴＰ
、ｄＴＴＩ’；最終濃度１０μＶ１）１μｌを加え、水
で全量２０μｇに調節した。後者の工程はフラグメント
を平滑末端にするために行った。Ｔ４１） Ｎ Ａポリ
メラーゼ１μｇを加えた後、混合物を３７°Ｃで５分間
インキュベートした。この最後の工程を繰返し行った後
、５０ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ２μｇを加え。
ラグメントとＳａｃ Ｉ消化ｐＫＣ３４５とを１０ＸＴ
４ポリメラーゼバツフアー（６７ｍＭ酢酸カリウム、３
３ｍＭ１−リス−酢酸ｐ Ｈ７，８および１０ｍ５＋酢
酸マグネシウム）２μｌに加えた。次いで、２０×デオ
キシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＩ’ 、ｄＣＴＰ
、ｄＴＴＩ’；最終濃度１０μＶ１）１μｌを加え、水
で全量２０μｇに調節した。後者の工程はフラグメント
を平滑末端にするために行った。Ｔ４１） Ｎ Ａポリ
メラーゼ１μｇを加えた後、混合物を３７°Ｃで５分間
インキュベートした。この最後の工程を繰返し行った後
、５０ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ２μｇを加え。
温度を５分間、７０°Ｃにすることにより、反応を止め
た。１度セバーグ（Ｓｅｖａｇ ）でＤ Ｎ Ａ を抽
出し、水で容量５０μｌに増量した後、ＤＮ、＋〜をエ
タノール沈殿に付すことによりＴ４ポリメラーゼ塩珀を
除去した。ＤＮＡ沈殿を、Ｔ ４１） Ｎ Ａ ＩＪガ
ーゼ（ＮＥＢ）＋００単位を含ンｆｆＴ ４ Ｄ Ｎ
Ａリガーゼバッファー２０ｔｔｅに懸？蜀し、１６°Ｃ
て４ ｓ 時間、ライゲーションを行った。
た。１度セバーグ（Ｓｅｖａｇ ）でＤ Ｎ Ａ を抽
出し、水で容量５０μｌに増量した後、ＤＮ、＋〜をエ
タノール沈殿に付すことによりＴ４ポリメラーゼ塩珀を
除去した。ＤＮＡ沈殿を、Ｔ ４１） Ｎ Ａ ＩＪガ
ーゼ（ＮＥＢ）＋００単位を含ンｆｆＴ ４ Ｄ Ｎ
Ａリガーゼバッファー２０ｔｔｅに懸？蜀し、１６°Ｃ
て４ ｓ 時間、ライゲーションを行った。
１）、形質転換および大腸菌に１２ＢＥ１０４１／ｐＫ
Ｃ３５４の組立て ライゲートしたＤ Ｎ Ａ約１／ｌｌを用い、実質上マ
ニアテイスら（１９８２）の方法に従って大腸菌に１２
ＢＥ１０４１を形質転換した。形質転換体は、ＷＪ”Ｊ
Ｉした〜２．１ ｋｂ Ａｖａ ■ 制限フラグメン
ト２μ〆をニックトランスレーションすることにより調
製したプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン法で常法通りスクリーンした。所望の形質転換体の
同定は、アンピシリン耐性並びに、ＥｃｏＲ１部位、Ｂ
ａｍｔ−１１部位およびＢＬ？／Ｅ１部位の辿得に関し
てスクリーンすることにより、常法通り行った。以後の
プラスミドｐＫＣ３５４の生産と単離のために、コンピ
テント細胞を常法通り培養した。プラスミドｐＫＣ３５
４の制限サイトおよび機能地図を添付の第３図に示す。
Ｃ３５４の組立て ライゲートしたＤ Ｎ Ａ約１／ｌｌを用い、実質上マ
ニアテイスら（１９８２）の方法に従って大腸菌に１２
ＢＥ１０４１を形質転換した。形質転換体は、ＷＪ”Ｊ
Ｉした〜２．１ ｋｂ Ａｖａ ■ 制限フラグメン
ト２μ〆をニックトランスレーションすることにより調
製したプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン法で常法通りスクリーンした。所望の形質転換体の
同定は、アンピシリン耐性並びに、ＥｃｏＲ１部位、Ｂ
ａｍｔ−１１部位およびＢＬ？／Ｅ１部位の辿得に関し
てスクリーンすることにより、常法通り行った。以後の
プラスミドｐＫＣ３５４の生産と単離のために、コンピ
テント細胞を常法通り培養した。プラスミドｐＫＣ３５
４の制限サイトおよび機能地図を添付の第３図に示す。
実施例４．プラスミドｐＫＣ３５６および大喝菌に１２
］５Ｅ１０４１／ＰＫＣ３５６の組立てプラスミドｐｉ
＜Ｃ３５４から〜１．５ ｋｂ ＥｃｏＲｉフラグメン
トを欠失させ、プラスミドｐＫＣ３５６を組立てた。ｐ
ＫＣ３５４ＤＮＡ約１０μｙ をＩＸＥｃｏＲＩバッフ
ァー（１００ｍＭトリｘ ｐＨ７，５５０ｍ Ｍ Ｎａ
Ｃ／および１０ ｍ Ｍ ＭｙＣ１！ ２ ）中、全量
２０μＩでＥｃｏＪ制限酵素２４単位にュー・イングラ
ンド・バイオラボ）により、３７°Ｃで１時間消化した
。得られたフラグメントをアガロースゲル電気泳動にか
けて単離し、〜１１ ｋｂＥｃｏＲＩＭＪ限フラグメン
トをフェノールおよびセバーグで抽出し、Ｅｌ！ｕｔ
ｉｐ −ｄ カラムで精製した後、エタノール沈殿に
付した。以後のライゲーションのために、このＤＮＡ沈
殿をＴＥＩＱμｅに溶かした。
］５Ｅ１０４１／ＰＫＣ３５６の組立てプラスミドｐｉ
＜Ｃ３５４から〜１．５ ｋｂ ＥｃｏＲｉフラグメン
トを欠失させ、プラスミドｐＫＣ３５６を組立てた。ｐ
ＫＣ３５４ＤＮＡ約１０μｙ をＩＸＥｃｏＲＩバッフ
ァー（１００ｍＭトリｘ ｐＨ７，５５０ｍ Ｍ Ｎａ
Ｃ／および１０ ｍ Ｍ ＭｙＣ１！ ２ ）中、全量
２０μＩでＥｃｏＪ制限酵素２４単位にュー・イングラ
ンド・バイオラボ）により、３７°Ｃで１時間消化した
。得られたフラグメントをアガロースゲル電気泳動にか
けて単離し、〜１１ ｋｂＥｃｏＲＩＭＪ限フラグメン
トをフェノールおよびセバーグで抽出し、Ｅｌ！ｕｔ
ｉｐ −ｄ カラムで精製した後、エタノール沈殿に
付した。以後のライゲーションのために、このＤＮＡ沈
殿をＴＥＩＱμｅに溶かした。
Ｂ、ライゲーションおよび形質転換
得られたＤＮＡを実質上、実施例２Ｃの方法に従ってラ
イゲートし、１６℃で一夜インキユベートすることによ
り、自己−閉環を行わせた。インキュベーション後、Ｄ
ＮＡをエタノール沈殿に付し、ＴＥＩＱμｌに溶かした
。
イゲートし、１６℃で一夜インキユベートすることによ
り、自己−閉環を行わせた。インキュベーション後、Ｄ
ＮＡをエタノール沈殿に付し、ＴＥＩＱμｌに溶かした
。
得られたＤＮＡ約２μｇを用い、実質上マニアテイスら
（１９８０）の方法と同様にして大腸菌に１２１ＳＥ１
０４１を形質転換した。所望の形質転換体の同定は、ア
ンピシリン耐性、並びにＥＣ０Ｊ制限部位の欠失に関し
てスクリーンすることにより、常法通り行った。以後の
プラスミドＰ１（Ｃ３５６の生産と単離のためにコンピ
テント細胞を常法通り培養した。プラスミドｐＫＣ３５
６の制限サイトおよび機能地図を添付の第４図に示す。
（１９８０）の方法と同様にして大腸菌に１２１ＳＥ１
０４１を形質転換した。所望の形質転換体の同定は、ア
ンピシリン耐性、並びにＥＣ０Ｊ制限部位の欠失に関し
てスクリーンすることにより、常法通り行った。以後の
プラスミドＰ１（Ｃ３５６の生産と単離のためにコンピ
テント細胞を常法通り培養した。プラスミドｐＫＣ３５
６の制限サイトおよび機能地図を添付の第４図に示す。
実施例５． プラスミドｐＫＣ４１７の組立てプラスミ
ドｐＫＣ２８３ＤＮＡ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５８３０）
約５．４ ｎ ヲ、Ｉ ＸＸｈｏ ［１ハラ７７−（１
０ｍ〜■トリスｐＨ７，５，１０ｍＭＭｙｃ１２．１０
ｍ ＞Ｉ Ｄ ’ＦＴ 、 ０．０１ ％ ト リ
ト ンＸ−１００） 中、全量２０μｌで、Ｘｈｏｒ
ｌ 制限エンドヌクレアーゼ５．６単位にュー・イン
グランド・バイオラボ）により消化した。この混合物を
３７℃で１時間半インキュベートした後、７Ｍ度を５分
間７０゛Ｃにすることにより反応を止めた。このＸｈｏ
ロ 消化により、相補的なＸｈｏ［または８９１口末端
を持ったフラグメントが生成する。このＤＮＡをエタノ
ール沈殿に付した後、さらに２つの異る制限酵素で消化
し、該ＤＮＡを多数の７ラグメン）＋こ切断した。しか
しながら、これらの消化は、λｌ）Ｌ プロモーター配
列を含む特定の〜１３７ ｂＰＢ！ｌ ｔｌフラグメン
トの完全無欠さには何ら影響を及ぼさない。即ち、次に
Ｐ’Ｃ２８３ＤＮＡをバッファー（６０ｍＭＮａＣ／、
ｌ ０ｍＭ１−リスｐＨ７，５，１０ｍＭｒＱｃｌ！２
およびｌＱｍＭＤＴＴ）中、ｐｖｕ ［制限エンドヌク
レアーゼ１０単位により、３７℃で１時間半消化した後
、バッファー（２０ｍλｌＫＣｌ、１０ｍＭ）リスｐＨ
８，０，１０ｍ Ｍ Ｍｉｃｅ ２およびｌＱｍＭＤＴ
Ｔ）中、Ｓｍ２１制限エンドヌクレアーゼ１０単位によ
り、３７°Ｃで１時間消化した。エタノール沈殿に付し
た後、以後のライゲーションのためにＤＮＡをＴＥ５μ
ｅに溶かした。
ドｐＫＣ２８３ＤＮＡ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５８３０）
約５．４ ｎ ヲ、Ｉ ＸＸｈｏ ［１ハラ７７−（１
０ｍ〜■トリスｐＨ７，５，１０ｍＭＭｙｃ１２．１０
ｍ ＞Ｉ Ｄ ’ＦＴ 、 ０．０１ ％ ト リ
ト ンＸ−１００） 中、全量２０μｌで、Ｘｈｏｒ
ｌ 制限エンドヌクレアーゼ５．６単位にュー・イン
グランド・バイオラボ）により消化した。この混合物を
３７℃で１時間半インキュベートした後、７Ｍ度を５分
間７０゛Ｃにすることにより反応を止めた。このＸｈｏ
ロ 消化により、相補的なＸｈｏ［または８９１口末端
を持ったフラグメントが生成する。このＤＮＡをエタノ
ール沈殿に付した後、さらに２つの異る制限酵素で消化
し、該ＤＮＡを多数の７ラグメン）＋こ切断した。しか
しながら、これらの消化は、λｌ）Ｌ プロモーター配
列を含む特定の〜１３７ ｂＰＢ！ｌ ｔｌフラグメン
トの完全無欠さには何ら影響を及ぼさない。即ち、次に
Ｐ’Ｃ２８３ＤＮＡをバッファー（６０ｍＭＮａＣ／、
ｌ ０ｍＭ１−リスｐＨ７，５，１０ｍＭｒＱｃｌ！２
およびｌＱｍＭＤＴＴ）中、ｐｖｕ ［制限エンドヌク
レアーゼ１０単位により、３７℃で１時間半消化した後
、バッファー（２０ｍλｌＫＣｌ、１０ｍＭ）リスｐＨ
８，０，１０ｍ Ｍ Ｍｉｃｅ ２およびｌＱｍＭＤＴ
Ｔ）中、Ｓｍ２１制限エンドヌクレアーゼ１０単位によ
り、３７°Ｃで１時間消化した。エタノール沈殿に付し
た後、以後のライゲーションのためにＤＮＡをＴＥ５μ
ｅに溶かした。
ＢａｍＨ）制限酵素とバッファーの代りにＢｙ／：口制
限酵素とバッファーを用いる外は実質上実施例２（Ｂ）
（３１の方法に従って所望の消化を行った。
限酵素とバッファーを用いる外は実質上実施例２（Ｂ）
（３１の方法に従って所望の消化を行った。
なお、プラスミドＰＥＬ１０３ の代り（こプラスミド
ｐＫｃ３５６を用いた。ＤＮＡをエタノール沈殿に付し
、ＴＥＩＱμｌに溶かした。
ｐＫｃ３５６を用いた。ＤＮＡをエタノール沈殿に付し
、ＴＥＩＱμｌに溶かした。
この実験には、λｃＩ８５７遺伝子を有する全ての大１
楊菌の菌株が宿主として適格性を有する。その様な菌株
には、Ｋ１２△Ｈ１△ｔｒｐ ［キャステラジイら、１
９７２、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテ
ツクス１１７：２１１；パーナートら、１９７９、ジー
ン５ ： ５９ （Ｃａ５ｔｅｌ １ａｚｚｉｅｔ ａ
ｌ 、、 １９７２． Ｍｏ１． Ｇｅｎ、Ｇｅｎ
ｅｔ、１１７ ：２１１； Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ
ａｌ、、１９７９．Ｇｅｎｅ５：５９）） か含
まれる。所望の、ライゲーション並びに以後の大腸菌に
１２ＢＥ１３１５の形質転換は、細胞に対する熱衝撃を
加えずに行う外は、実質上実施例２Ｃと同様にして行っ
た。ライゲーションの結果、プラスミドＰＫＣ２８３の
〜１３７ｂｐＢｙｌ！■消化フラグメントがプロモータ
ー欠如ネオマイシンホスホトラシスフェラーゼ遺云子の
直ぐ上流のユニークなりｙＪ［部位に挿入されている組
換えプラスミドを生産することに成功した。所望の形質
転換体の同定は、ネオマイシン耐性およびアンピシリン
耐性に関してスクリーニングすることにより、常法通り
行った。また、追加の１′３ｙｅ口部位の巡得に関して
も細胞をスクリーニングした。
楊菌の菌株が宿主として適格性を有する。その様な菌株
には、Ｋ１２△Ｈ１△ｔｒｐ ［キャステラジイら、１
９７２、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテ
ツクス１１７：２１１；パーナートら、１９７９、ジー
ン５ ： ５９ （Ｃａ５ｔｅｌ １ａｚｚｉｅｔ ａ
ｌ 、、 １９７２． Ｍｏ１． Ｇｅｎ、Ｇｅｎ
ｅｔ、１１７ ：２１１； Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ
ａｌ、、１９７９．Ｇｅｎｅ５：５９）） か含
まれる。所望の、ライゲーション並びに以後の大腸菌に
１２ＢＥ１３１５の形質転換は、細胞に対する熱衝撃を
加えずに行う外は、実質上実施例２Ｃと同様にして行っ
た。ライゲーションの結果、プラスミドＰＫＣ２８３の
〜１３７ｂｐＢｙｌ！■消化フラグメントがプロモータ
ー欠如ネオマイシンホスホトラシスフェラーゼ遺云子の
直ぐ上流のユニークなりｙＪ［部位に挿入されている組
換えプラスミドを生産することに成功した。所望の形質
転換体の同定は、ネオマイシン耐性およびアンピシリン
耐性に関してスクリーニングすることにより、常法通り
行った。また、追加の１′３ｙｅ口部位の巡得に関して
も細胞をスクリーニングした。
得られた形質転換体を、以後のプラスミドｐＫＣ４１７
の生産および単離のために常法通り培養した。プラスミ
ドｐＫｃ４１７ の制限サイトおよび機能地図を添付の
第４図に示す。
の生産および単離のために常法通り培養した。プラスミ
ドｐＫｃ４１７ の制限サイトおよび機能地図を添付の
第４図に示す。
実施例６ ストレプトマイセス・アンボファシエンス／
ＰＫＣ３５６およびＳ、アンボファシエンス／ｐＫｃ４
１７の組立て 実施例４および５で調製したＤ Ｎ Ａ各ｌβ および
、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリイズ
；ペオリア、イリノイスに寄託され、ソノパーマネント
・ストック・カルチャー・コレクションの一部となって
おり、寄託番号ＮＲＲＬ２４２０の下、誰でも入手し得
る菌株であるストレプトマイセス・アンボファシエンス
のプロトプラスト２００μｌを、Ｐ培地〔ホップウッド
およびライト（Ｈｏｐｗｏｏｄ ａｎｄ〜Ｖｒｉｇｈｔ
） １９７８、モレキュラー・アンド・ジエネラルジ
エネテツクス〕中、５５％ポリエチレングリコール（シ
グマ）５００μｅと静かに混合し、次いで一部（２５μ
ｌおよび２Ｆｊ、０１１１）をとり、Ｒ２ＹＥ）ツブア
ガー３ｍｅのＲ２ＹＥ＊プレート上においだ。プレート
を３０゛Ｃで１８時間インキュベートした後、ネオマイ
シンおよびチオストレプト／ を最終濃度がそれぞれ
１０μｙ／ｍｅおよび２５μｙ／ｍｅとなるのに充分な
量含有せしめたＲ２ＹＥトップアガー３ｍｅを重層（上
掛け）した。次に、このプレートを３０°Ｃで３日間、
インキュベートした。得られたＳ。
ＰＫＣ３５６およびＳ、アンボファシエンス／ｐＫｃ４
１７の組立て 実施例４および５で調製したＤ Ｎ Ａ各ｌβ および
、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリイズ
；ペオリア、イリノイスに寄託され、ソノパーマネント
・ストック・カルチャー・コレクションの一部となって
おり、寄託番号ＮＲＲＬ２４２０の下、誰でも入手し得
る菌株であるストレプトマイセス・アンボファシエンス
のプロトプラスト２００μｌを、Ｐ培地〔ホップウッド
およびライト（Ｈｏｐｗｏｏｄ ａｎｄ〜Ｖｒｉｇｈｔ
） １９７８、モレキュラー・アンド・ジエネラルジ
エネテツクス〕中、５５％ポリエチレングリコール（シ
グマ）５００μｅと静かに混合し、次いで一部（２５μ
ｌおよび２Ｆｊ、０１１１）をとり、Ｒ２ＹＥ）ツブア
ガー３ｍｅのＲ２ＹＥ＊プレート上においだ。プレート
を３０゛Ｃで１８時間インキュベートした後、ネオマイ
シンおよびチオストレプト／ を最終濃度がそれぞれ
１０μｙ／ｍｅおよび２５μｙ／ｍｅとなるのに充分な
量含有せしめたＲ２ＹＥトップアガー３ｍｅを重層（上
掛け）した。次に、このプレートを３０°Ｃで３日間、
インキュベートした。得られたＳ。
アンボファシエンス／ＰＫＣ３５６チオストレプトン耐
性コロニーおよびＳ、アンボファシエンス／ｐＫＣ４１
７ネオマイシンおよびチオストレプトン耐性コロニーを
既知の方法で単離して培養した後、制限酵素分析および
アガロースゲル電気泳動法（マニアテイスら、１９８２
）により、プラスミド構造を常法通り確認した。
性コロニーおよびＳ、アンボファシエンス／ｐＫＣ４１
７ネオマイシンおよびチオストレプトン耐性コロニーを
既知の方法で単離して培養した後、制限酵素分析および
アガロースゲル電気泳動法（マニアテイスら、１９８２
）により、プラスミド構造を常法通り確認した。
＊ Ｒ２ＹＥ培地は、１１！中に以下の成分を含有さ
せて調製した： シュクｏ−ス１０３ｙ、２．５％に２Ｓｏ４１０ｍ／、
Ｍ９Ｃ１２１０，１ｆ；’、グルコース１０ｙ、カザミ
ノ酸０．１ｙ、寒天２２ｙ、微量元素ミックス２ｍｅ、
０．５％に０２ Ｐ ０４１０ ｍｅ、ＩＭＣａＣｆ
２２０ ｍｅ、 プロリ ン ３ ｙ 、 ０．２ ５
ＭＴＥＳ （ｐＨ７，２） １ ００ｒｎｅ、
１０％酵母エキス５０ｍｅ０ ＊・１抗生物質ネオマイノンは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）
セント・ルイス、ミズリーから大手可能である。
せて調製した： シュクｏ−ス１０３ｙ、２．５％に２Ｓｏ４１０ｍ／、
Ｍ９Ｃ１２１０，１ｆ；’、グルコース１０ｙ、カザミ
ノ酸０．１ｙ、寒天２２ｙ、微量元素ミックス２ｍｅ、
０．５％に０２ Ｐ ０４１０ ｍｅ、ＩＭＣａＣｆ
２２０ ｍｅ、 プロリ ン ３ ｙ 、 ０．２ ５
ＭＴＥＳ （ｐＨ７，２） １ ００ｒｎｅ、
１０％酵母エキス５０ｍｅ０ ＊・１抗生物質ネオマイノンは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）
セント・ルイス、ミズリーから大手可能である。
抗生物質チオストレプトンはＥ、ｌスクイーゾ・アンド
・サンズ、インコーホレーテッド（Ｅ、Ｒ。
・サンズ、インコーホレーテッド（Ｅ、Ｒ。
５ｑｕｉｂｂ ａｎｄ ５ｏｎｓ、Ｉｎｃ、）プリ
ントン、ニュージャーシイ０８５４０から入手可能であ
る。
ントン、ニュージャーシイ０８５４０から入手可能であ
る。
実施例７ ストレプトマイセス・アンボファノエシス内
でのネオマイシンの発現 プラスミドｐＫＣ３５６およびｐＫｃ４１７の各々を担
っている形質転換ストレプトマイセス陪従を、抗生物質
チオストレプトン（２５μ９／ｍｅ’）を補充したトリ
ブチツク・ソイ・プロス（ＴｒｙｐＬｉＣ５ｏｙ ｂｒ
ｏｔｈ ）２５０ｍｅ中で一夜増殖させた。 遠心（１
０，０００ｒｐｍＸ１０分）して細り包を東め、碍られ
たペレットを１０ｍＭ）リス（ｐｌ−１８，０）１００
ｉｆｆ’で洗浄した。再度、遠心および洗浄工程を行っ
た後、遠心を繰返し、得られた細胞ペレットを１０ｍλ
■トリス（ｐｉ−１ｓ、ｏ ）、Ｑ、 ５ ｍＭ Ｍｙ
Ｃｌ ２ 、 ０．１ｍＭＥＤＴＡおよび１（ＩＭＤＴ
Ｔを含有している溶液５ｍｔ’中に懸濁した。音波処理
して細胞を破壊した後、５ｓ３４０−ターで遠心した（
４℃、１６，０００ｒｐｍＸ３０分）。上清を取りＤＮ
Ａ５ｅ を終濃度４μ！／ｍｅとなる様に加えた。この
溶液を７５Ｔｉローターで遠心しく４℃、４５．ＯＯＯ
ｒｐｍＸ ２時間）、上清を取った。タンパク質濃度
を測定した後、約４０μ９のタンパク質をホスホトラン
スフェラーゼアッセイの反応ミックス ５０μｌに加え
、ポルテックスした後、３０℃で１５分間インキュベー
１−Ｌ、た。次いで、この溶液的２５μｌをワットマン
Ｐ−８１フィルター上にピペット注加し、〜８０℃の水
浴中に５分間置いた。このフィルターを洗浄し、乾燥し
た後、ホスホトランスフェラーゼ活性を測定した。その
結果を表１番こ示す。同様にして調製した大腸菌抽出物
もこの表に示した。
でのネオマイシンの発現 プラスミドｐＫＣ３５６およびｐＫｃ４１７の各々を担
っている形質転換ストレプトマイセス陪従を、抗生物質
チオストレプトン（２５μ９／ｍｅ’）を補充したトリ
ブチツク・ソイ・プロス（ＴｒｙｐＬｉＣ５ｏｙ ｂｒ
ｏｔｈ ）２５０ｍｅ中で一夜増殖させた。 遠心（１
０，０００ｒｐｍＸ１０分）して細り包を東め、碍られ
たペレットを１０ｍＭ）リス（ｐｌ−１８，０）１００
ｉｆｆ’で洗浄した。再度、遠心および洗浄工程を行っ
た後、遠心を繰返し、得られた細胞ペレットを１０ｍλ
■トリス（ｐｉ−１ｓ、ｏ ）、Ｑ、 ５ ｍＭ Ｍｙ
Ｃｌ ２ 、 ０．１ｍＭＥＤＴＡおよび１（ＩＭＤＴ
Ｔを含有している溶液５ｍｔ’中に懸濁した。音波処理
して細胞を破壊した後、５ｓ３４０−ターで遠心した（
４℃、１６，０００ｒｐｍＸ３０分）。上清を取りＤＮ
Ａ５ｅ を終濃度４μ！／ｍｅとなる様に加えた。この
溶液を７５Ｔｉローターで遠心しく４℃、４５．ＯＯＯ
ｒｐｍＸ ２時間）、上清を取った。タンパク質濃度
を測定した後、約４０μ９のタンパク質をホスホトラン
スフェラーゼアッセイの反応ミックス ５０μｌに加え
、ポルテックスした後、３０℃で１５分間インキュベー
１−Ｌ、た。次いで、この溶液的２５μｌをワットマン
Ｐ−８１フィルター上にピペット注加し、〜８０℃の水
浴中に５分間置いた。このフィルターを洗浄し、乾燥し
た後、ホスホトランスフェラーゼ活性を測定した。その
結果を表１番こ示す。同様にして調製した大腸菌抽出物
もこの表に示した。
七 ホスホトランスフェラーゼアッセイ反応ミックスは
以下の成分から調製した２ ４ｍＭネオマイシン、１３ｍＳｉトリス（Ｐ Ｉ（８，
０）、８．４ ｍ 〜１〜１ｙＣ〆 ８０ｍ
ＮＩ ＮＨｉ、Ｃｅ 、 ２ ｍ ＭＤ
ＴＴ２・ および２ｍＭＡＴＰ （（７−３２Ｐ ］ −ＡＴＰを
、最終比活性が９−１０μＣｉ／μｍｏｌ となる様に
含有している尤 表１ 大、ＱＭｍおよび′ストレプトマイセス・アン
ボファシエシス内でのネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ活性の発現 形質転換体 表現型１ 酵素活性５３、
対照 ６８ｃｐｍリガンド ａ、大腸菌細胞の表現型はネオマイシン２５μり／ｒｎ
ｅを補充したトリプトン酵母エキスプレート〔ラオおよ
びロジャース（Ｒａｏ ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ）、１９
７９ジーン（Ｇｅｎｅ） ７ ： ７９ ８２：ｌ上
で計数した。
以下の成分から調製した２ ４ｍＭネオマイシン、１３ｍＳｉトリス（Ｐ Ｉ（８，
０）、８．４ ｍ 〜１〜１ｙＣ〆 ８０ｍ
ＮＩ ＮＨｉ、Ｃｅ 、 ２ ｍ ＭＤ
ＴＴ２・ および２ｍＭＡＴＰ （（７−３２Ｐ ］ −ＡＴＰを
、最終比活性が９−１０μＣｉ／μｍｏｌ となる様に
含有している尤 表１ 大、ＱＭｍおよび′ストレプトマイセス・アン
ボファシエシス内でのネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ活性の発現 形質転換体 表現型１ 酵素活性５３、
対照 ６８ｃｐｍリガンド ａ、大腸菌細胞の表現型はネオマイシン２５μり／ｒｎ
ｅを補充したトリプトン酵母エキスプレート〔ラオおよ
びロジャース（Ｒａｏ ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ）、１９
７９ジーン（Ｇｅｎｅ） ７ ： ７９ ８２：ｌ上
で計数した。
ストレプトマイセス・アンボファシエシス細；泡の表現
型はネオマイシン１μ９／ｍｅを補充したトリブチカー
ゼ・ソイ・アガー・プレート〔クーストスおよびラオ（
ｋｕｈｓｔｏｓｓ ａｎｄ Ｒａｏ ） １９８３゜
ジーン２６ ： ２９５−２９９］上で計数した。
型はネオマイシン１μ９／ｍｅを補充したトリブチカー
ゼ・ソイ・アガー・プレート〔クーストスおよびラオ（
ｋｕｈｓｔｏｓｓ ａｎｄ Ｒａｏ ） １９８３゜
ジーン２６ ： ２９５−２９９］上で計数した。
Ｓ：感受性、艮：耐性。
ｂ、酵素活性は、反応混合物２５μ１１こおける１分当
りのカウント数〔セレンコツ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ）放射
〕を表す。
りのカウント数〔セレンコツ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ）放射
〕を表す。
Ｃ８細胞は絶えず４２°Ｃ（λｃＩ レプレッサーは
不活化される）で増殖させた。
不活化される）で増殖させた。
ｄ、細胞を３０°Ｃで増殖させた後、５時間、４２°Ｃ
で親制御した。
で親制御した。
第１図はプラスミドｐＫｃ３０９ の制限サイトおよび
機能地図を示す模式図、第２図はプラスミドｐＫＣ：３
２６ 、 ｐｌＪ７０２ およびｐＫｃ３４５ の制限
サイトおよび機能地図を示す模式図、並びにプラスミド
ｐＫＣ３４５の組立て模式図、第３図はプラスミドｐＫ
Ｃ３２２およびｐＫｃ３５４ の制限サイトおよび機能
地図を示す模式図、並びにプラスミドｐＫＣ３５４の組
立て模式図、第４図はプラスミドｐＫＣ２８３、ＰＫＣ
３５６およびｐＫＣ４１７の制限サイトおよび機能地図
を示す模式図並びにプラスミドｐＫｃ４１７ の組立て
模式図である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンパニ
ー 代理人 弁理士 青 山 葆 （外１名）Ｆ
ＩＧ、Ｉ Ｓａｌ Ｉ ＦＩＧ、２ Ｓａｌ ｌ 門１ｎｏ ｌ ｌ １ＦＩＧ
、３ ｐＫＣ３４５ｐＫＣ３２２
機能地図を示す模式図、第２図はプラスミドｐＫＣ：３
２６ 、 ｐｌＪ７０２ およびｐＫｃ３４５ の制限
サイトおよび機能地図を示す模式図、並びにプラスミド
ｐＫＣ３４５の組立て模式図、第３図はプラスミドｐＫ
Ｃ３２２およびｐＫｃ３５４ の制限サイトおよび機能
地図を示す模式図、並びにプラスミドｐＫＣ３５４の組
立て模式図、第４図はプラスミドｐＫＣ２８３、ＰＫＣ
３５６およびｐＫＣ４１７の制限サイトおよび機能地図
を示す模式図並びにプラスミドｐＫｃ４１７ の組立て
模式図である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンパニ
ー 代理人 弁理士 青 山 葆 （外１名）Ｆ
ＩＧ、Ｉ Ｓａｌ Ｉ ＦＩＧ、２ Ｓａｌ ｌ 門１ｎｏ ｌ ｌ １ＦＩＧ
、３ ｐＫＣ３４５ｐＫＣ３２２
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ストレプトマイセス内で、機能的ポリペプチドを生
産する方法であって、 ａ）ストレプトマイセス宿主細胞を、１）バクテリオフ
ァージλＰ＿Ｌプロモーター−オペレーター転写活性化
配列、２）翻訳活性化配列、および３）機能的ポリペプ
チドをコードしているＤＮＡ配列、を含有している選択
可能かつ自己複製可能な組換えＤＮＡ発現ベクターによ
り形質転換し、 ｂ）該形質転換細胞を該ポリペプチドの発現に適した条
件下で培養することからなる方法（ただし、翻訳可能な
ｍＲＮＡ転写物が該機能的ポリペプチドをコードする様
に、該発現ベクターは該λＰ＿Ｌプロモーター−オペレ
ーター転写活性化配列、該翻訳活性化配列、および機能
的ポリペプチドをコードしている該ＤＮＡ配列を連続し
て含有していることを条件とする）。 ２、発現ベクターがプラスミドである第１項記載の方法
。 ３、発現ベクターがプラスミドｐＫＣ４１７である第１
項または第２項のいずれかに記載の方法。 ４、形質転換されたストレプトマイセス宿主細胞がスト
レプトマイセス・アンボファシエンス、ストレプトマイ
セス・オーレオファシエンス、ストレプトマイセス・シ
ナモネンシス、ストレプトマイセス・フラディアエ、ス
トレプトマイセス・グラニュロルーバー、ストレプトマ
イセス・グリセオフスカスおよびストレプトマイセス・
リビダンスからなる群から選択されるものである第３項
記載の方法。 ５、形質転換されたストレプトマイセス宿主細胞がスト
レプトマイセス・アンボファシエンス、ストレプトマイ
セス・フラディアエまたはストレプトマイセス・リビダ
ンスである第４項記載の方法。 ６、機能的ポリペプチドをコードしている遺伝子が、ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒトプレープロ
インシュリン、ヒトプロインシュリン、ヒトインシュリ
ンＡ鎖、ヒトインシュリンＢ鎖、非−ヒトインシュリン
、ヒト成長ホルモン、非−ヒト成長ホルモン、ウシ成長
ホルモン、ブタ成長ホルモン、ヒトインターフェロン、
非−ヒトインターフェロン、ウィルス抗原、ウロキナー
ゼ、ペプチドホルモン類および酵素類からなる群から選
択されるものである第１〜５項のいずれかに記載の方法
。 ７、バクテリオファージλＰ＿Ｌプロモーター−オペレ
ーター転写活性化配列がプラスミドｐＫＣ２８３に由来
するものである第６項記載の方法。 ８、第１項記載の方法に使用される形質転換されたスト
レプトマイセス宿主細胞。 ９、ストレプトマイセス・アンボファシエンス／ｐＫＣ
４１７。 １０、ストレプトマイセス宿主細胞を形質転換するため
の選択可能かつ自己複製可能な組換えＤＮＡ発現ベクタ
ーであって、ａ）バクテリオファージλＰ＿Ｌプロモー
ター−オペレーター転写活性化配列、ｂ）翻訳活性化配
列、およびｃ）機能的ポリペプチドをコードしているＤ
ＮＡ配列を含有しているベクター（ただし、翻訳可能な
ｍＲＮＡ転写物が該機能的ポリペプチドをコードする様
に、該発現ベクターは該λＰ＿Ｌプロモーター−オペレ
ーター転写活性化配列、該翻訳活性化配列および機能的
ポリペプチドをコードしている該ＤＮＡ配列を連続して
含有していることを条件とする）。 １１、プラスミドｐＫＣ４１７。 １２、プラスミドｐＫＣ３０９、ｐＫＣ３２２、ｐＫＣ
２８３、ｐＫＣ３２６、ｐＫＣ３４５、ｐＫＣ３５４ま
たはｐＫＣ３５６。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US655181 | 1984-09-27 | ||
| US06/655,181 US4766066A (en) | 1984-09-27 | 1984-09-27 | Method of using bacteriophage lambda p1 promoter to produce a functional polypeptide in streptomyces |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6185199A true JPS6185199A (ja) | 1986-04-30 |
Family
ID=24627860
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60214458A Pending JPS6185199A (ja) | 1984-09-27 | 1985-09-26 | ストレプトマイセスに機能的ポリペプチドを製造させるためのバクテリオフアージプロモーター |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4766066A (ja) |
| EP (1) | EP0177228B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6185199A (ja) |
| CA (1) | CA1271436A (ja) |
| DE (1) | DE3586767T2 (ja) |
| DK (1) | DK429485A (ja) |
| IL (1) | IL76419A0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02107191A (ja) * | 1988-05-18 | 1990-04-19 | Dr Karl Thomae Gmbh | 化合物製造生合成法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0154539A3 (en) * | 1984-03-06 | 1986-12-30 | Eli Lilly And Company | Recombinant dna expression vectors and method for gene expression |
| US5541099A (en) * | 1989-08-10 | 1996-07-30 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expression of T5 DNA polymerase reduced in 3'-to-5' exonuclease activity |
| US5270179A (en) * | 1989-08-10 | 1993-12-14 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expression of T5 DNA polymerase reduced in 3'- to-5' exonuclease activity |
| US5047342A (en) * | 1989-08-10 | 1991-09-10 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expression of T5 DNA polymerase |
| ZA929284B (en) * | 1991-12-12 | 1993-06-02 | Serono Lab | P0438, an new calcium-regulated promoter. |
| US6068993A (en) * | 1997-07-02 | 2000-05-30 | Biobras Sa | Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin |
| US6967159B2 (en) * | 2002-08-28 | 2005-11-22 | Micron Technology, Inc. | Systems and methods for forming refractory metal nitride layers using organic amines |
| US6995081B2 (en) * | 2002-08-28 | 2006-02-07 | Micron Technology, Inc. | Systems and methods for forming tantalum silicide layers |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0041767B1 (en) * | 1980-06-06 | 1993-03-03 | Biogen, Inc. | Improved vectors and methods for making such vectors and for expressing cloned genes |
| US4506013A (en) * | 1980-10-03 | 1985-03-19 | Eli Lilly And Company | Stabilizing and selecting recombinant DNA host cells |
| US4495280A (en) * | 1981-05-20 | 1985-01-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Cloned high signal strength promoters |
| US4436815A (en) * | 1981-11-27 | 1984-03-13 | Eli Lilly And Company | Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cells |
| US4460689A (en) * | 1982-04-15 | 1984-07-17 | Merck & Co., Inc. | DNA Cloning vector TG1, derivatives, and processes of making |
| US4508826A (en) * | 1982-04-15 | 1985-04-02 | Merck & Co., Inc. | Bacteriophage DNA cloning vector TG1 and microorganisms containing TG1 |
| US4559302A (en) * | 1982-11-01 | 1985-12-17 | Eli Lilly And Company | DNA for directing transcription and expression of structural genes |
| US4559300A (en) * | 1983-01-18 | 1985-12-17 | Eli Lilly And Company | Method for using an homologous bacillus promoter and associated natural or modified ribosome binding site-containing DNA sequence in streptomyces |
| WO1984002918A1 (fr) * | 1983-01-21 | 1984-08-02 | Transgene Sa | NOUVEAUX VECTEURS D'EXPRESSION ET LEUR APPLICATION A LA PREPARATION D'UNE PROTEINE AYANT L'ACTIVITE DE L'ANTITRYPSINE-alpha1 HUMAINE |
-
1984
- 1984-09-27 US US06/655,181 patent/US4766066A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-09-19 DE DE8585306666T patent/DE3586767T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-09-19 CA CA000491094A patent/CA1271436A/en not_active Expired
- 1985-09-19 IL IL76419A patent/IL76419A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-09-19 EP EP85306666A patent/EP0177228B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-23 DK DK429485A patent/DK429485A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-09-26 JP JP60214458A patent/JPS6185199A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02107191A (ja) * | 1988-05-18 | 1990-04-19 | Dr Karl Thomae Gmbh | 化合物製造生合成法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1271436A (en) | 1990-07-10 |
| US4766066A (en) | 1988-08-23 |
| DK429485A (da) | 1986-03-28 |
| EP0177228B1 (en) | 1992-10-21 |
| IL76419A0 (en) | 1986-01-31 |
| DE3586767T2 (de) | 1993-03-18 |
| EP0177228A1 (en) | 1986-04-09 |
| DE3586767D1 (de) | 1992-11-26 |
| DK429485D0 (da) | 1985-09-23 |
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