JPS60232093A - ストレプトマイセス、大腸菌、および関連微生物用クロ−ニングベクタ− - Google Patents
ストレプトマイセス、大腸菌、および関連微生物用クロ−ニングベクタ−Info
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- JPS60232093A JPS60232093A JP60000320A JP32085A JPS60232093A JP S60232093 A JPS60232093 A JP S60232093A JP 60000320 A JP60000320 A JP 60000320A JP 32085 A JP32085 A JP 32085A JP S60232093 A JPS60232093 A JP S60232093A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
起源含有制限フラグメントおよび抗生物質耐性を付与す
る１もしくはそれ以上のＤＮＡセグメントからなる、新
規な組換えＤＮＡクローニングベクターに関する。
る１もしくはそれ以上のＤＮＡセグメントからなる、新
規な組換えＤＮＡクローニングベクターに関する。
更に詳しくは、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
（ ストレプトマイセス）およびその関連宿主細胞中で
用いるための、抗生物質耐性付与クローニングベクター
に関する。
（ ストレプトマイセス）およびその関連宿主細胞中で
用いるための、抗生物質耐性付与クローニングベクター
に関する。
選択に用い得るクローニングベクター上の遺伝的マーカ
ーが一般的に欠損していることから、従来上記の微生物
における組換えＤＮＡ技術の開発と発展は遅れており、
特に困難とされてきた。本発明に係るベクターは、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびその他の宿主菌株の両方で
機能的であり、かつ選択可能であるため、この技術分野
における著しい進歩を示すものである。
ーが一般的に欠損していることから、従来上記の微生物
における組換えＤＮＡ技術の開発と発展は遅れており、
特に困難とされてきた。本発明に係るベクターは、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびその他の宿主菌株の両方で
機能的であり、かつ選択可能であるため、この技術分野
における著しい進歩を示すものである。
本発明に係るベクターは、比較的小さく、多方面に渡っ
て利用でき、それに対する耐性が付与される抗生物質に
対して感受性である全てのＳｔｒｅｐｔ−− ｍｙｃｅ
ｓ細胞中に導入でき、かつ選択できるということから、
極めて有用である。天然起源の抗生物質の７０％がＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ菌株によって生産されるため、こ
の工業的に重要な微生物に適用できるクローニング系お
よびベクター類の開発が望まれている。本発明は、かか
るベクターを提供し、これにより、既知の抗生物質の収
量を上けるために、または、新規抗生物質および抗生物
質誘導体を生産するために、遺伝子をＳｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ中ヘクローンすることを可能にするものである
。
て利用でき、それに対する耐性が付与される抗生物質に
対して感受性である全てのＳｔｒｅｐｔ−− ｍｙｃｅ
ｓ細胞中に導入でき、かつ選択できるということから、
極めて有用である。天然起源の抗生物質の７０％がＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ菌株によって生産されるため、こ
の工業的に重要な微生物に適用できるクローニング系お
よびベクター類の開発が望まれている。本発明は、かか
るベクターを提供し、これにより、既知の抗生物質の収
量を上けるために、または、新規抗生物質および抗生物
質誘導体を生産するために、遺伝子をＳｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ中ヘクローンすることを可能にするものである
。
本発明方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞ヘＤ
ＮＡをクローンするためのビヒクルを提供するものであ
り、かつ形質転換体の簡便な選択を可能とするものであ
る。形質転換は極めて低い確率で起こる現象であるので
、何十億もの細胞のうちからプラスミドＤＮＡを獲得し
た細胞を決定するためには、このような機能試験が実際
上必須である。該ベクターには非選択性ＤＮＡ配列を挿
入することができ、形質転換により、このベクターと、
所望の特定のＤＮＡ配列とを含有する細胞を、適当な抗
生物質による選択を用いて分離することができるので、
上記のことは極めて重要である。
ＮＡをクローンするためのビヒクルを提供するものであ
り、かつ形質転換体の簡便な選択を可能とするものであ
る。形質転換は極めて低い確率で起こる現象であるので
、何十億もの細胞のうちからプラスミドＤＮＡを獲得し
た細胞を決定するためには、このような機能試験が実際
上必須である。該ベクターには非選択性ＤＮＡ配列を挿
入することができ、形質転換により、このベクターと、
所望の特定のＤＮＡ配列とを含有する細胞を、適当な抗
生物質による選択を用いて分離することができるので、
上記のことは極めて重要である。
本明細書中に記載した発明の理解を助けるため に、以
下に用語を定義する。
下に用語を定義する。
組換えＤＮＡクローニングベクター：１またはそれ以上
のＤＮＡセグメントを付加することのできる、もしくは
それらが既に付加された、自律的複製体であって、プラ
スミドを含むがこれに限定されない。
のＤＮＡセグメントを付加することのできる、もしくは
それらが既に付加された、自律的複製体であって、プラ
スミドを含むがこれに限定されない。
形質転換： ＤＮＡを宿主受容細胞中に導入し、その遺
伝型を変化させ、その結果該受容細胞に安定な遺伝性の
変化をもたらすこと。
伝型を変化させ、その結果該受容細胞に安定な遺伝性の
変化をもたらすこと。
形質転換体：形質転換された宿主受容細胞。
感受性宿主細胞：耐性を付与するＤＮＡセグメントなし
では、ある特定の抗生物質の存在下には生育できない宿
主細胞。
では、ある特定の抗生物質の存在下には生育できない宿
主細胞。
制限フラグメント：１または１以上の制限酵素をプラス
ミドまたは染色体ＤＮＡに作用させることによって生成
した直線状ＤＮＡ０ プラスミドＰＬＲ２〜１．５ ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フ
ラ制限フラグ−プントミドＰＩＪ６に含まれる同じ〜１
．６ｋｂ ＢａｍＨエ チオストレプトン耐性付与フラ
グメント。
ミドまたは染色体ＤＮＡに作用させることによって生成
した直線状ＤＮＡ０ プラスミドＰＬＲ２〜１．５ ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フ
ラ制限フラグ−プントミドＰＩＪ６に含まれる同じ〜１
．６ｋｂ ＢａｍＨエ チオストレプトン耐性付与フラ
グメント。
プラスミドｐＬＲ２〜０．８ ｋｂ Ｂｃｌ Ｉ制限フ
ラグメント：プラスミドｐＩＪ６に含まれる同じ〜Ｑ、
８ｋｂＢｃｌ ■チオストレプトン耐性付与フラグメン
ト。
ラグメント：プラスミドｐＩＪ６に含まれる同じ〜Ｑ、
８ｋｂＢｃｌ ■チオストレプトン耐性付与フラグメン
ト。
プラスミドｐＬＲ１またはｐＬＲ４〜３．４ ｋｂ Ｂ
ａｍＨ工制限フラグメント：プラスミドＰＩＪ２に含、
ま゛れる、同じ〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨＩネオマイシ
ン耐性付与フラグメント。
ａｍＨ工制限フラグメント：プラスミドＰＩＪ２に含、
ま゛れる、同じ〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨＩネオマイシ
ン耐性付与フラグメント。
Ｔｂ ｉ ｏ Ｒまたはｔｓｒ ：チオストレプトン耐
性表現型（フェノタイプ）。
性表現型（フェノタイプ）。
Ｎｅｏ 、ネオマイシフｆｙｔ＃表現型。
特に本発明は、
ａ）プラスミドｐＦＪ２５８の機能的複製起源含有制限
フラグメントと、 ｂ）形質転換、細胞分裂および培養が可能な、感受性で
あり、かつ非制限的なＥ、ｃｏｌｉまたはＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ宿主細胞中に導入（形質転換）した時、少
なくとも１つの抗生物質に対する耐性を付与する１また
はそれ以上のＤＮＡセグメント、をライゲート（結合）
することからなる、組換えＤＮＡクロ−ニンクベクター
の製造方法を提供するものである。
フラグメントと、 ｂ）形質転換、細胞分裂および培養が可能な、感受性で
あり、かつ非制限的なＥ、ｃｏｌｉまたはＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ宿主細胞中に導入（形質転換）した時、少
なくとも１つの抗生物質に対する耐性を付与する１また
はそれ以上のＤＮＡセグメント、をライゲート（結合）
することからなる、組換えＤＮＡクロ−ニンクベクター
の製造方法を提供するものである。
本発明嘉こ係るベクターは、１または１以上の抗生物質
耐性付与ＤＮＡセグメントをプラスミドｐＦＪ２５８の
機能的複製起源を含有する制限フラグメントに、ライゲ
ートすることにより組み立てられる。複製起源を含有す
るフラグメントの組み立てに使用するプラスミドＰＦＪ
２５８は、約１ｏｋｂであり、分子クローニングに特に
有利な数個の制限サイト（部位）を有する。プラスミド
ｐＦＪ ２５８の複製起源は〜２．２３ｋｂＸｂａ■−
ＢＣＩＩ制限フラグメント内に存在するので、このプラ
スミドを〜２゜２３ｋｂ Ｘｂａ ■−Ｂｃｌ Ｉ領域
の外側で切断する制限酵素で消化することにより、種々
の異なった複製起源含有フラグメントを生成させること
ができる。
耐性付与ＤＮＡセグメントをプラスミドｐＦＪ２５８の
機能的複製起源を含有する制限フラグメントに、ライゲ
ートすることにより組み立てられる。複製起源を含有す
るフラグメントの組み立てに使用するプラスミドＰＦＪ
２５８は、約１ｏｋｂであり、分子クローニングに特に
有利な数個の制限サイト（部位）を有する。プラスミド
ｐＦＪ ２５８の複製起源は〜２．２３ｋｂＸｂａ■−
ＢＣＩＩ制限フラグメント内に存在するので、このプラ
スミドを〜２゜２３ｋｂ Ｘｂａ ■−Ｂｃｌ Ｉ領域
の外側で切断する制限酵素で消化することにより、種々
の異なった複製起源含有フラグメントを生成させること
ができる。
プラスミドｐＦＪ２５８の詳細な制限サイト地図を添付
の第１図に示す。本発明の目的からして、第１図および
これに続く全ての図面は等縮尺で描−かれていない。
の第１図に示す。本発明の目的からして、第１図および
これに続く全ての図面は等縮尺で描−かれていない。
プラスミドｐＦＪ２５８は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇ
ｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
（Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉｓ在）に寄託され、
その永久ストックカルチャーコレクションの一部となっ
ている菌株、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｋ１２
ＨＢＩＯＩ／ＰＦＪ２５８ から常法により分離でき
る。この菌株は、該プラスミドの好ましい供給源および
保管源として受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−’１５２６２の下
、誰でも入手可能である。
ｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
（Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉｓ在）に寄託され、
その永久ストックカルチャーコレクションの一部となっ
ている菌株、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｋ１２
ＨＢＩＯＩ／ＰＦＪ２５８ から常法により分離でき
る。この菌株は、該プラスミドの好ましい供給源および
保管源として受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−’１５２６２の下
、誰でも入手可能である。
プラスミドｐＦＪ２５８の数多くの異なった複製起源含
有フラグメントが組み立てられるが、本明細書中では〜
３．６４ ｋｂ Ｓａｌ Ｉ−Ｂｃｌ ■、〜２．２３
ｋｂＸｂａ Ｉ −Ｂｃｌ Ｉ、および〜２．Ｂ５ｋｂ
ＢａｍＨ■−ＢｃｌＩ制限フラグメントを例示の目的
のためにとりあげる。これらのフラグメントはそれぞれ
、１またはそれ以上の抗生物質耐性付与ＤＮＡフラグメ
ント、ブフラグメント、プラスミドｐＬＲ１またはプラ
スミドｐＬＲ４のネオマイシン耐性付与〜３．４ ｋｂ
ＢａｍＨＩ制限フラグメントなどと個別にライゲーシ
ョンして、本発明の代表的なベクターを形成させること
ができる。
有フラグメントが組み立てられるが、本明細書中では〜
３．６４ ｋｂ Ｓａｌ Ｉ−Ｂｃｌ ■、〜２．２３
ｋｂＸｂａ Ｉ −Ｂｃｌ Ｉ、および〜２．Ｂ５ｋｂ
ＢａｍＨ■−ＢｃｌＩ制限フラグメントを例示の目的
のためにとりあげる。これらのフラグメントはそれぞれ
、１またはそれ以上の抗生物質耐性付与ＤＮＡフラグメ
ント、ブフラグメント、プラスミドｐＬＲ１またはプラ
スミドｐＬＲ４のネオマイシン耐性付与〜３．４ ｋｂ
ＢａｍＨＩ制限フラグメントなどと個別にライゲーシ
ョンして、本発明の代表的なベクターを形成させること
ができる。
チオストレプトン耐性付与フラグメントの供給源である
プラスミドＰＬＲ２は、約１８．７ ｋｂであり、Ｈｉ
ｎｄｌＩ処理したプラスミドｐ Ｉ Ｊ ６ （Ｔｈｏ
ｍｐｓｏｎ等、１９８０、Ｎａｔｕｒｅ ２８６ ：
５２５４Ｃ記載）を、Ｈ４ｎｄ ｍ処理したプラスミド
ｐＢＲ３２２にライゲーションすることにより組み立て
られる。ネオマイシン耐性付与フラグメントの供給源で
あるプラスミドｐＬＲ１は、約１４．８ｋｂであり、プ
ラスミドｐｌＪ６の代わりにプラスミドｐ Ｉ Ｊ ２
（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９８０に記載）を用いるこ
とを除けば、同様にして組み立てられる。プラスミドＰ
ＬＲ２およびｐＬＲｌは共に、Ｅ、ｃｏｌｉ中で機能的
であり、したがってそれ以降の操作のために簡便に増幅
させ、単離することができる。プラスミドｐＬＲ４を導
く−類似の組み立ては、ＢａｍＨＩ処理したプラスミド
ｐＢＲ３２２をＢａｍＨ工処理したプラスミドｐＬＲ１
にライゲーションすることによって行なう。
プラスミドＰＬＲ２は、約１８．７ ｋｂであり、Ｈｉ
ｎｄｌＩ処理したプラスミドｐ Ｉ Ｊ ６ （Ｔｈｏ
ｍｐｓｏｎ等、１９８０、Ｎａｔｕｒｅ ２８６ ：
５２５４Ｃ記載）を、Ｈ４ｎｄ ｍ処理したプラスミド
ｐＢＲ３２２にライゲーションすることにより組み立て
られる。ネオマイシン耐性付与フラグメントの供給源で
あるプラスミドｐＬＲ１は、約１４．８ｋｂであり、プ
ラスミドｐｌＪ６の代わりにプラスミドｐ Ｉ Ｊ ２
（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９８０に記載）を用いるこ
とを除けば、同様にして組み立てられる。プラスミドＰ
ＬＲ２およびｐＬＲｌは共に、Ｅ、ｃｏｌｉ中で機能的
であり、したがってそれ以降の操作のために簡便に増幅
させ、単離することができる。プラスミドｐＬＲ４を導
く−類似の組み立ては、ＢａｍＨＩ処理したプラスミド
ｐＢＲ３２２をＢａｍＨ工処理したプラスミドｐＬＲ１
にライゲーションすることによって行なう。
−プラスミドＰＬＲ１、ｐ ＬＲ２およびｐＬＲ４の制
限サイト並びに機能地図を、添付の第２図に示す。
限サイト並びに機能地図を、添付の第２図に示す。
組み立ての便宜と簡便のため、チオストレプトン耐性付
与〜１．６ ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントとそのサブ
フラグメントおよびネオマイシン耐性付与〜３、４ ｋ
ｂ ＢａｍＨ：［７ラグメントを、プラスミドｐＦＪ２
５８の〜２．２３ ｋｂ Ｘｂａ Ｉ −Ｂｃｌ １複
製起源含有フラグメントにライゲーションする。次いで
生成し゛た組換えＤＮＡをライゲーションして本発明の
代表的なプラスミドを生産する。ある特定の耐性付与Ｄ
ＮＡフラグメントまたはサブフラグメントの方向性に依
存して、二方向の組換えプラスミドが生成する。即ち、
プラスミドＰＬＲ２またはプラスミドｐＦＪ１２７の〜
０．８ ｋｂ Ｂｃｌ Ｉフラグメントをプラスミドｐ
Ｆ Ｊ ２５８ （Ｄ 〜２．２３ ｋｂ Ｘｂａ Ｉ
−Ｂｃｌ Ｉフラグメントにライゲーションすること
により、例示プラスミドＰＦＪ２９５およびＰＦＪ２９
６が、プラスミドｐＬＲ１またはプラスミドｐＬＲ４の
〜３．４ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントのライゲーショ
ンにより、例示プラスミドｐＦＪ２９７およびｐＦＪ２
９８が、そしてこの両フラグメントのライゲーションに
より、例示プラスミドｐＦＪ２９９、ｐＦＪ３００Ｓｐ
ＦＪ３０３およびＰＦＪ３０４が生成する。
与〜１．６ ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントとそのサブ
フラグメントおよびネオマイシン耐性付与〜３、４ ｋ
ｂ ＢａｍＨ：［７ラグメントを、プラスミドｐＦＪ２
５８の〜２．２３ ｋｂ Ｘｂａ Ｉ −Ｂｃｌ １複
製起源含有フラグメントにライゲーションする。次いで
生成し゛た組換えＤＮＡをライゲーションして本発明の
代表的なプラスミドを生産する。ある特定の耐性付与Ｄ
ＮＡフラグメントまたはサブフラグメントの方向性に依
存して、二方向の組換えプラスミドが生成する。即ち、
プラスミドＰＬＲ２またはプラスミドｐＦＪ１２７の〜
０．８ ｋｂ Ｂｃｌ Ｉフラグメントをプラスミドｐ
Ｆ Ｊ ２５８ （Ｄ 〜２．２３ ｋｂ Ｘｂａ Ｉ
−Ｂｃｌ Ｉフラグメントにライゲーションすること
により、例示プラスミドＰＦＪ２９５およびＰＦＪ２９
６が、プラスミドｐＬＲ１またはプラスミドｐＬＲ４の
〜３．４ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントのライゲーショ
ンにより、例示プラスミドｐＦＪ２９７およびｐＦＪ２
９８が、そしてこの両フラグメントのライゲーションに
より、例示プラスミドｐＦＪ２９９、ｐＦＪ３００Ｓｐ
ＦＪ３０３およびＰＦＪ３０４が生成する。
例示のプラスミドｐＦＪ２９１およびｐＦＪ２９２を組
立てるためのライゲーションは、Ｂｃｌ ＩおよびＢａ
ｍＨＩ等の制限酵素が適合し得る粘着末端を生成させる
という事実によって可能となる。しかしながら、第１の
制限酵素によって生成されたフラグメントを、第２の制
限酵素によって生成されたフラグメントにライゲートす
ると、これらのもとの酵素のいずれによっても認識され
得ないハイブリッド（雑種）が形成される場合もある。
立てるためのライゲーションは、Ｂｃｌ ＩおよびＢａ
ｍＨＩ等の制限酵素が適合し得る粘着末端を生成させる
という事実によって可能となる。しかしながら、第１の
制限酵素によって生成されたフラグメントを、第２の制
限酵素によって生成されたフラグメントにライゲートす
ると、これらのもとの酵素のいずれによっても認識され
得ないハイブリッド（雑種）が形成される場合もある。
例えば、Ｂｃｌ 工によって生成されたフラグメント（
ＴＬＧＡＴＣＡ）をＢａｍＨＩ によって生成されたフ
ラグメント（ＧＩＧＡＴＣＧ）にライゲートすると、得
られたハイブリッドの標的部位（ｔａｒｇｅｔ ５ｉｔ
ｅｓ。
ＴＬＧＡＴＣＡ）をＢａｍＨＩ によって生成されたフ
ラグメント（ＧＩＧＡＴＣＧ）にライゲートすると、得
られたハイブリッドの標的部位（ｔａｒｇｅｔ ５ｉｔ
ｅｓ。
以下、ＣＢｃｌ Ｉ ／ ＢａｍＨＩ 〕という）は、
Ｂｃｌ Ｉまたは１３ａｍＨＩのいずれによっても切断
されない。
Ｂｃｌ Ｉまたは１３ａｍＨＩのいずれによっても切断
されない。
このハイブリッド形成は以下の式で示される。
５′・・・Ｔ ＋ ＧＡＴＣＧ ３
３’ ＝、ＡＣＴＡＧ Ｃ・５′
５′・・ＴＧＡＴＣＧ 、、、 ３’
３’、、、ＡＣＴＡＧＣ，、，５
これらの標的部位はその後の制限酵素処理に対して非機
能的であるが、この構造は親プラスミドに存在するユニ
ークなりａｍＨＩまたはＢｃｌ Ｉ制限部位を保存して
いる。
能的であるが、この構造は親プラスミドに存在するユニ
ークなりａｍＨＩまたはＢｃｌ Ｉ制限部位を保存して
いる。
〜２．２３ ｋｂ Ｘｂａ Ｉ −Ｂｃｌ Ｉ制限フラ
グメント中に含まれる複製起源が存在する限り、種々の
プラスミドｐＦＪ２５８制限フラグメントを、抗生物質
耐性付与Ｄ Ｎ Ａセグメントとのライゲーションに使
用することができる。本発明の範囲内に含まれる例示プ
ラスミドの組立てに有用な、その他のプラスミドｐＦＪ
２５８制限フラグメントには、ｘｂａＩおよびＢａｍ
ＨＩフラグメントが含まれるが、これらに限定されるも
のではない。プラスミドｐＦＪ２５８の〜２．２３ ｋ
ｂ Ｘｂａ Ｉ−Ｂｃｌ Ｉ ７ ラグメント内に含ま
れるＰｓｔＩ部位は複製に必要なので、クローニングに
利用することはできない。さらに、ある抗生物質耐性付
与ＤＮＡフラグメントは、複製起源または他の重要なプ
ラスミド支配の生理的機能が崩壊しない限り、プラスミ
ドｐＦＪ２５８フラグメントの単一の部位に限らず、多
くの箇所にライゲーションまたは挿入することができる
。特定のＤＮＡセグメントのライゲーションまたは挿入
の際、どの部位が有利であるかは、当業者には理解でき
るか、または容易に決定できる。
グメント中に含まれる複製起源が存在する限り、種々の
プラスミドｐＦＪ２５８制限フラグメントを、抗生物質
耐性付与Ｄ Ｎ Ａセグメントとのライゲーションに使
用することができる。本発明の範囲内に含まれる例示プ
ラスミドの組立てに有用な、その他のプラスミドｐＦＪ
２５８制限フラグメントには、ｘｂａＩおよびＢａｍ
ＨＩフラグメントが含まれるが、これらに限定されるも
のではない。プラスミドｐＦＪ２５８の〜２．２３ ｋ
ｂ Ｘｂａ Ｉ−Ｂｃｌ Ｉ ７ ラグメント内に含ま
れるＰｓｔＩ部位は複製に必要なので、クローニングに
利用することはできない。さらに、ある抗生物質耐性付
与ＤＮＡフラグメントは、複製起源または他の重要なプ
ラスミド支配の生理的機能が崩壊しない限り、プラスミ
ドｐＦＪ２５８フラグメントの単一の部位に限らず、多
くの箇所にライゲーションまたは挿入することができる
。特定のＤＮＡセグメントのライゲーションまたは挿入
の際、どの部位が有利であるかは、当業者には理解でき
るか、または容易に決定できる。
本明細書中に例示した抗生物質チオストレプトンおよび
ネオマイシン耐性付与ＤＮＡセグメントは、それぞれプ
ラスミドＰＬＲ２およびｐＬＲｌの〜１．６ｋｂおよび
〜３．４ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フラグメントおよび、プ
ラスミドＰＬＲ２の〜Ｑ、 ｆＪ ｋｂ Ｂｃｌ Ｔ制
限フラグメントであるが、当業者には、チオストレプト
ンおよびネオマイシンに対する耐性を付与する他のＤＮ
Ａセグメントを組み立て、個別に、または組み合わせて
使用することができるであろう。プラスミドＰＬＲ２の
他のチオストレプトン耐性付与ＤＮＡセグメントには、
例えば〜１３ ｋｂＰｓｔ Ｉ制限フラグメントがある
。プラスミドｐＬＲ１の他のネオマイシン耐性付与ＤＮ
Ａセグメントには、例えば〜３．５ ｋｂ Ｐｓｔ ■
制限フラグメントおよび〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨ■制
限フラグメントの５ｓｔｌ −Ｋｐｎ ■サブフラグメ
ントのうちの大きい方がある。
ネオマイシン耐性付与ＤＮＡセグメントは、それぞれプ
ラスミドＰＬＲ２およびｐＬＲｌの〜１．６ｋｂおよび
〜３．４ｋｂ ＢａｍＨＩ制限フラグメントおよび、プ
ラスミドＰＬＲ２の〜Ｑ、 ｆＪ ｋｂ Ｂｃｌ Ｔ制
限フラグメントであるが、当業者には、チオストレプト
ンおよびネオマイシンに対する耐性を付与する他のＤＮ
Ａセグメントを組み立て、個別に、または組み合わせて
使用することができるであろう。プラスミドＰＬＲ２の
他のチオストレプトン耐性付与ＤＮＡセグメントには、
例えば〜１３ ｋｂＰｓｔ Ｉ制限フラグメントがある
。プラスミドｐＬＲ１の他のネオマイシン耐性付与ＤＮ
Ａセグメントには、例えば〜３．５ ｋｂ Ｐｓｔ ■
制限フラグメントおよび〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨ■制
限フラグメントの５ｓｔｌ −Ｋｐｎ ■サブフラグメ
ントのうちの大きい方がある。
） さらに、上記のまたは上記とは異なる抗生物質、例
エバクロラムフェニコール、ストレプトマイシン、ハイ
グロマイシン、ピコーロマイシン、ビオマイシン、タイ
ロシン、エリスロマイシン、パンゴマイシン、アクタプ
ラニン等の抗生物質に対する耐性を付与するその他のＤ
ＮＡセグメントも、当業者により組み立てられ、使用す
ることができる。
エバクロラムフェニコール、ストレプトマイシン、ハイ
グロマイシン、ピコーロマイシン、ビオマイシン、タイ
ロシン、エリスロマイシン、パンゴマイシン、アクタプ
ラニン等の抗生物質に対する耐性を付与するその他のＤ
ＮＡセグメントも、当業者により組み立てられ、使用す
ることができる。
種々の抗生物質耐性付与ＤＮＡセグメントの機能的誘導
体も、遺伝暗号に従って、あるヌクレオチドを付加、脱
離または置換することによって組み立てることができる
。当業者には、これら修飾されたセグメントもしくはこ
れら以外の抗生物質耐性付与ＤＮＡセグメントを、プラ
スミドｐＦＪ２５８の複製起源含有フラグメントにライ
ゲーショ・ンすることによって、これもまた本発明の一
部を構成するベクターが生成することが理解されるであ
ろう。
体も、遺伝暗号に従って、あるヌクレオチドを付加、脱
離または置換することによって組み立てることができる
。当業者には、これら修飾されたセグメントもしくはこ
れら以外の抗生物質耐性付与ＤＮＡセグメントを、プラ
スミドｐＦＪ２５８の複製起源含有フラグメントにライ
ゲーショ・ンすることによって、これもまた本発明の一
部を構成するベクターが生成することが理解されるであ
ろう。
本発明を例示するその他の誘導体ベクター類も組立てる
ことができる。例えば、プラスミドｐＦＪ１２７のＸｂ
ａ■ 欠損によって例示のプラスミドｐＦＪ２ｇ２が得
られ、このプラスミドから、別の誘導体を組立てること
ができる。すなわち、プラスミドＰＦＪ２８２に、プラ
スミドｐＬＲ１またはｐ ＬＲ４（７） 〜３．４ ｋ
ｂ Ｒａｍ ＨＩネオマイシン耐性付与フラグメントを
挿入することにより、例示のプラスミドＰＦＪ２８３お
よびｐＦＪ２８４が得られる。上記の抗生物質耐性付与
誘導体プラスミドは、プラス；＋′ＰＦＪ２５８の複製
起源を有しており、従って本発明の範囲内に含まれるも
のである一プラスミドｐＦＪ２５８の制限フラグメント
および種々の抗生物質耐性付与ＤＮＡは、ライゲーショ
ンを容易にするため、修飾することができる。
ことができる。例えば、プラスミドｐＦＪ１２７のＸｂ
ａ■ 欠損によって例示のプラスミドｐＦＪ２ｇ２が得
られ、このプラスミドから、別の誘導体を組立てること
ができる。すなわち、プラスミドＰＦＪ２８２に、プラ
スミドｐＬＲ１またはｐ ＬＲ４（７） 〜３．４ ｋ
ｂ Ｒａｍ ＨＩネオマイシン耐性付与フラグメントを
挿入することにより、例示のプラスミドＰＦＪ２８３お
よびｐＦＪ２８４が得られる。上記の抗生物質耐性付与
誘導体プラスミドは、プラス；＋′ＰＦＪ２５８の複製
起源を有しており、従って本発明の範囲内に含まれるも
のである一プラスミドｐＦＪ２５８の制限フラグメント
および種々の抗生物質耐性付与ＤＮＡは、ライゲーショ
ンを容易にするため、修飾することができる。
例えば、あらかじめＰＬＲ２の〜０．Ｂ ｋｂ Ｂｃｌ
Ｉチオストレプトン耐性付与セグメントにライゲート
されたプラスミドＰＦＪ２５８の〜２．２３ ｋｂ Ｘ
ｂａ Ｉ −ＢＣ１工制限フラグメントにＸｂａ Ｉ−
Ｂｃｌ Ｉ分子リン−カーを供給し、次いで環状にライ
ゲートし、例示のプラスミドｐＦＪ２９９およびｐＦＪ
３００を作り出すことができる。合成リンカ−は、以後
の制限処理のために、ライゲーションした後も制限部位
の機能がそのまま残存するような仕方で供給することが
できる。かくして、プラスミドｐＦＪ２９９ およびＰ
ＦＪ３００は、機能的なＸｂａ ＩおよびＢｃｌ ■制
限部位を含んでいることになる。加えて、プラ。
Ｉチオストレプトン耐性付与セグメントにライゲート
されたプラスミドＰＦＪ２５８の〜２．２３ ｋｂ Ｘ
ｂａ Ｉ −ＢＣ１工制限フラグメントにＸｂａ Ｉ−
Ｂｃｌ Ｉ分子リン−カーを供給し、次いで環状にライ
ゲートし、例示のプラスミドｐＦＪ２９９およびｐＦＪ
３００を作り出すことができる。合成リンカ−は、以後
の制限処理のために、ライゲーションした後も制限部位
の機能がそのまま残存するような仕方で供給することが
できる。かくして、プラスミドｐＦＪ２９９ およびＰ
ＦＪ３００は、機能的なＸｂａ ＩおよびＢｃｌ ■制
限部位を含んでいることになる。加えて、プラ。
スミドｐＦＪ２５８およびｐＦＪ２５８の複製起源含有
制限フラグメントも、ある種のヌクレオチドを付加、脱
離または置換することにより修飾して、ＤＮＡのライゲ
ーションのための種々の制限サイトを設けることができ
る。当業者は、ヌクレオチド化学および遺伝暗号を理解
しているので、どのヌクレオチドが交換可能か、そして
どのＤＮＡ修怖が特定の目的にとって望ましいかを理解
できるはずである。
制限フラグメントも、ある種のヌクレオチドを付加、脱
離または置換することにより修飾して、ＤＮＡのライゲ
ーションのための種々の制限サイトを設けることができ
る。当業者は、ヌクレオチド化学および遺伝暗号を理解
しているので、どのヌクレオチドが交換可能か、そして
どのＤＮＡ修怖が特定の目的にとって望ましいかを理解
できるはずである。
本発明に係るＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ −機能性ベク
ター例えば、プラスミドＰＦＪ１２７、ｐＦＪ２７Ｂ、
ｐＦＪ２８２、ｐＦＪ２８３、ｐＦＪ２９１、ＰＦＪ２
９５、ｐＦＪ２９７、およびｐＦＪ２９９は、例えばｐ
ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２８といった種々
のＥ、ｃｏｌｉプラの スミ吹抗生物質耐性付与制限フラグメントとライゲーシ
ョンして、Ｅ、ｃａｌｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓの両者において選択可能な三機能性の自己複製ベクタ
ーを作り出すこともできる。
ター例えば、プラスミドＰＦＪ１２７、ｐＦＪ２７Ｂ、
ｐＦＪ２８２、ｐＦＪ２８３、ｐＦＪ２９１、ＰＦＪ２
９５、ｐＦＪ２９７、およびｐＦＪ２９９は、例えばｐ
ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２８といった種々
のＥ、ｃｏｌｉプラの スミ吹抗生物質耐性付与制限フラグメントとライゲーシ
ョンして、Ｅ、ｃａｌｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓの両者において選択可能な三機能性の自己複製ベクタ
ーを作り出すこともできる。
これら三機能性の組み立て物は、ｐＦＪ２５８の複製起
源、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中で抗生物質耐性を付与
するＤＮＡセグメント、Ｅ、ｃａｌｉ中で機能するレプ
リコン、およびＥ、 ｃａｌｉ中で抗生物質耐性を付与
するＤＮＡセグメントからなる。本明細書中、プラスミ
ドｐＦＪ１４１とｐＦＪ１４２により例示している二機
能性組み立て物は、プラスミドの増幅および操作がＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中でよりもＥ、ｃｏｌｉ中で、よ
り速やかにかつ簡便にできるという理由で、特に有利で
ある。従って、Ｅ、ｃｏｌｉ宿主系の中で所望の組換え
ＤＮＡ操作を行なった後に、このプラスミド全体もしく
は特定のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ＤＮＡをとり出し
、プラスミドの形に再組み立てしく必要ならば）、次い
でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓまたは関連宿主細胞中に導
入することができる。
源、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中で抗生物質耐性を付与
するＤＮＡセグメント、Ｅ、ｃａｌｉ中で機能するレプ
リコン、およびＥ、 ｃａｌｉ中で抗生物質耐性を付与
するＤＮＡセグメントからなる。本明細書中、プラスミ
ドｐＦＪ１４１とｐＦＪ１４２により例示している二機
能性組み立て物は、プラスミドの増幅および操作がＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中でよりもＥ、ｃｏｌｉ中で、よ
り速やかにかつ簡便にできるという理由で、特に有利で
ある。従って、Ｅ、ｃｏｌｉ宿主系の中で所望の組換え
ＤＮＡ操作を行なった後に、このプラスミド全体もしく
は特定のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ＤＮＡをとり出し
、プラスミドの形に再組み立てしく必要ならば）、次い
でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓまたは関連宿主細胞中に導
入することができる。
本発明に係る組換えＤＮＡクローニングベクターは、そ
の用途をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの単一の種または菌
株に限るものではない。逆に、本ベクターは広範囲の適
用が可能で、多くのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類ノ宿主
細胞、特にアミノグリコシド、マクロライド、β−ラク
タム、ポリエーテルおよびグリコペプチドのような抗生
物質を産生ずる経済的重要性のある非制限菌株に導入（
トランスフオーム）することができる。こうした非制限
菌株は、当業者周知の常法（Ｌｏｍｏｖｓｋａｙａ等、
１９８Ｑ １ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉ
ｅｗｓ ４４ ： ２０６ ）により、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ類から容易に選択、分離される。非制限菌株
の宿主細胞は制限酵素を欠くため、形質転換の際プラス
ミドＤＮＡを切断したり劣化させることがない。
の用途をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの単一の種または菌
株に限るものではない。逆に、本ベクターは広範囲の適
用が可能で、多くのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類ノ宿主
細胞、特にアミノグリコシド、マクロライド、β−ラク
タム、ポリエーテルおよびグリコペプチドのような抗生
物質を産生ずる経済的重要性のある非制限菌株に導入（
トランスフオーム）することができる。こうした非制限
菌株は、当業者周知の常法（Ｌｏｍｏｖｓｋａｙａ等、
１９８Ｑ １ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉ
ｅｗｓ ４４ ： ２０６ ）により、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ類から容易に選択、分離される。非制限菌株
の宿主細胞は制限酵素を欠くため、形質転換の際プラス
ミドＤＮＡを切断したり劣化させることがない。
本発明においては、本発明に係るベクターのいかなる制
限サイトも切断しない制限酵素を含んでいる宿主細胞も
また非制限性とみなすこととする。
限サイトも切断しない制限酵素を含んでいる宿主細胞も
また非制限性とみなすこととする。
アミノグリコシド抗生物質を産生じ、本発明に係るベク
ターを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳ
ｔ ｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ｓ類の非制限菌株の宿主細
胞には、例えば以下のような微生物の非制限細胞が含ま
れる： Ｓ、 ｋａｎａ歿町ｃｅｔｉｃｕ５ （カナマイシン類
）、Ｓ。
ターを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳ
ｔ ｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ｓ類の非制限菌株の宿主細
胞には、例えば以下のような微生物の非制限細胞が含ま
れる： Ｓ、 ｋａｎａ歿町ｃｅｔｉｃｕ５ （カナマイシン類
）、Ｓ。
ｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ （アミノシジン）
、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏ−ｆｌａｖｕｓ （抗生物質ＭＡ１
２６７）、Ｓ、 ｍ１ｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ（抗生物質
５Ｆ−７６７）、Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ （
抗生物質５Ｆ７３３）、Ｓ、 ｆｌａｖｏｐｅｒｓｉｃ
ｕｓ （：１．ペクチノマイシン）、Ｓ、５ｐｅｃｔａ
ｂｉｌｉｓ （アクチノスペクタシン）、Ｓ、ｒｉｍｏ
ｓｕｓ ｆｏｒｍａ ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎｕｓ （
パロモマイシン類、カテヌリン）、Ｓ、ｆｒａｄｉａｅ
ｖａｒ。
、Ｓ、ｇｒｉｓｅｏ−ｆｌａｖｕｓ （抗生物質ＭＡ１
２６７）、Ｓ、 ｍ１ｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ（抗生物質
５Ｆ−７６７）、Ｓ、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ （
抗生物質５Ｆ７３３）、Ｓ、 ｆｌａｖｏｐｅｒｓｉｃ
ｕｓ （：１．ペクチノマイシン）、Ｓ、５ｐｅｃｔａ
ｂｉｌｉｓ （アクチノスペクタシン）、Ｓ、ｒｉｍｏ
ｓｕｓ ｆｏｒｍａ ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎｕｓ （
パロモマイシン類、カテヌリン）、Ｓ、ｆｒａｄｉａｅ
ｖａｒ。
１ｔａｌｉｃｕｓ （アミノシジン）、Ｓ、ｂｌｕｅｎ
ｓｉｓ ｖａｒ。
ｓｉｓ ｖａｒ。
ｂｌｕｅｎｓｉｓ （プルエン７’フイシン）、Ｓ、ｃ
ａｃｅｎｕｌａｅ（カテヌリン）、Ｓ、ｏｌｉｖｏｒｅ
ｔｉｃｕｌｉ ｖａｒ、 ｃｅｌｌｕｌｏ−ｐｈｉｌｕ
ｓ（デストマイシ７Ａ）、Ｓ、ｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ
（トフ ラマイシン、アブラマイシン）、３．１ａｖ
ｅｎ−ｄｕｌａｅ （ネオマイシン）、Ｓ、ａｌｂｏｇ
ｒｉｓｅｏｌｕｓ （ネオマイシン類）、Ｓ、ａｌｂｕ
ｓ ｖａｒｏｍｅｔａｍｙｃｉｎｕｓ （メタマイシン
）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ、ｓａｇ
ａｍｉｅｎｓｉｓ（スペクチノマイシン）、Ｓ、ｂｉｋ
ｉｎｉｅｎｓｉｓ （ストーレブトマイシン） 、Ｓ、
ｇｒｉｓｅｕｓ （ストレプトマイシン）、Ｓ、ｅｒ
ｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａｒ、ｎａｒｕ
ｔｏｅｎｓｉｓ（ストレプトマイシン）、Ｓ、ｐｏｏｌ
ｅｎｓｉｓ （ストレプトマイシン） 、Ｓ、 ｇａｌ
ｂｕｓ （ストレプトマイシン）、Ｓ、ｒａｍｅｕｓ
（７，トレプトマイシン）、Ｓ、ｏｌｉｖａｃｅｕｓ（
ストレプトマイシン）、Ｓｏｍａｓｈｕｅｎｓｉｓ （
ストレプトマイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕ
ｓ ｖａｒ、ｌｉｍｏｎｅｕｓ（バリダマイシン類）、
Ｓ、ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ （デスドマイシン）、Ｓ
、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｆｏｒｍａ ｇｌｅｂ
ｏｓｕｓ（ダレボマイシン）、Ｓ、ｆｒａｄｉａｅ （
ハイブリマイシン類、ネオマイシン類）、Ｓ、ｅｕｒｏ
ｃｉｄｉｃｕｓ （抗生物質Ａ１６３１６−Ｃ）、Ｓ、
ａｑｕａｃａｎｕｓ （Ｎ−メチルハイグロマイシフＢ
）、Ｓ、ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｓ （ハイグロフィシ
ンＡ）、Ｓ、ｎｏｂｏｒｉｔｏｅｎｓｉｓ （ハイグロ
マイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （ハイ
グロマイシン類）、Ｓ、ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ （ハ
イグロフィシン）、Ｓ、ｋａｓｕｇａｓｐｉｎｕｓ （
カナマイシン）、Ｓ、ｋａｓｕｇａ−ｅｎｓｉｓ （カ
ナマイシン類）、Ｓ、ｎｅｔｒｏｐｓｉｓ （抗生物質
ｔｔ、−ＡＭ３１）、Ｓ、１ｉｖｉｄｕｓ （リビドマ
イシン類）、Ｓ、ｈｏｆｕｅｎｓｉｓ （セルドマイシ
ン複合体）、オヨびＳ、 ｃａｎｕｓ （リボシルパロ
マミン）。
ａｃｅｎｕｌａｅ（カテヌリン）、Ｓ、ｏｌｉｖｏｒｅ
ｔｉｃｕｌｉ ｖａｒ、 ｃｅｌｌｕｌｏ−ｐｈｉｌｕ
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（トフ ラマイシン、アブラマイシン）、３．１ａｖ
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ｒｉｓｅｏｌｕｓ （ネオマイシン類）、Ｓ、ａｌｂｕ
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）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ、ｓａｇ
ａｍｉｅｎｓｉｓ（スペクチノマイシン）、Ｓ、ｂｉｋ
ｉｎｉｅｎｓｉｓ （ストーレブトマイシン） 、Ｓ、
ｇｒｉｓｅｕｓ （ストレプトマイシン）、Ｓ、ｅｒ
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ｔｏｅｎｓｉｓ（ストレプトマイシン）、Ｓ、ｐｏｏｌ
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（７，トレプトマイシン）、Ｓ、ｏｌｉｖａｃｅｕｓ（
ストレプトマイシン）、Ｓｏｍａｓｈｕｅｎｓｉｓ （
ストレプトマイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕ
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、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｆｏｒｍａ ｇｌｅｂ
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ハイブリマイシン類、ネオマイシン類）、Ｓ、ｅｕｒｏ
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ａｑｕａｃａｎｕｓ （Ｎ−メチルハイグロマイシフＢ
）、Ｓ、ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｓ （ハイグロフィシ
ンＡ）、Ｓ、ｎｏｂｏｒｉｔｏｅｎｓｉｓ （ハイグロ
マイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ （ハイ
グロマイシン類）、Ｓ、ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ （ハ
イグロフィシン）、Ｓ、ｋａｓｕｇａｓｐｉｎｕｓ （
カナマイシン）、Ｓ、ｋａｓｕｇａ−ｅｎｓｉｓ （カ
ナマイシン類）、Ｓ、ｎｅｔｒｏｐｓｉｓ （抗生物質
ｔｔ、−ＡＭ３１）、Ｓ、１ｉｖｉｄｕｓ （リビドマ
イシン類）、Ｓ、ｈｏｆｕｅｎｓｉｓ （セルドマイシ
ン複合体）、オヨびＳ、 ｃａｎｕｓ （リボシルパロ
マミン）。
マクロライド抗生物質を産生じ、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例え
ば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる： Ｓ、
ｃａｅｌｅｓｔｉｓ （抗生物質Ｍ１８８）、Ｓ。
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例え
ば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる： Ｓ、
ｃａｅｌｅｓｔｉｓ （抗生物質Ｍ１８８）、Ｓ。
ｐｌａｔｅｎｓｉｓ （プラテノマイシン）、Ｓ、ｒｏ
ｃｈｅｉ ｖａｒ。
ｃｈｅｉ ｖａｒ。
ｖｏｌｕｂｉｌｉｓ （抗生物質Ｔ２６３６）、Ｓ、
ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ（メチマイシン類）、Ｓｏｇｒｉ
ｓｅｏｆｕｓｃｕｓ （プントリン）、Ｓ、ｎａｒｂｏ
ｎｅｎｓｉｓ （ジョサマイシン、ナルホマイシン）、
Ｓ、 ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ （抗生物質ＮＡ−１
８１）、Ｓｏｇｒｉｓｅｏｆａｃｉｅｎｓ （抗生物質
ＰＡ１３３Ａ、Ｂ）、Ｓ、ｒｏｓｅｏｃｉｔｒｅｕｓ
（アイボサイクリン）、Ｓ、ｂｒｕ−ｎｅｏｇｒｉｓｅ
ｕｓ （７ｙｖボサイクリン）、Ｓ、ｒｏｓｅｏｃｈｒ
ｏ−ｍｏｇｅｎｅｓ （７ルポサイクリン）、Ｓ 、
ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏ−ｇｅｎｅｓ （シラマイシ
ンＢ）、Ｓ、ａｌｂｕｓ （アルボマイセチン）、Ｓ、
ｆｅｌｌｅｕｓ （アルボマイシン、ピクロマイシン）
、Ｓ、 ｒｏｃｈｅｉ （ランカシジン、ボレリジン
）、Ｓ、ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ （ランカシジン
）、Ｓ９ｇｒｉｓｅｕｓ （ボレリジン）、Ｓ、ｍａｉ
ｚｅｕｓ （インゲラマイシン）、Ｓ、ａｌｂｕｓ ｖ
ａｒ、 ｃｏｉｌｍｙｃｅｔｉｃｕｓ （：ルイマイシ
ン）、Ｓｏｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ （アセチルロ
イコマイシン、ニスピノマイシン）、Ｓ 、 ｈｙｇｒ
ｏｓｃｏ−ｐｉｃｕｓ （ツリマイシン、レロマイシン
、マリドマイシン、タイロシン、カルボマイシン）、Ｓ
、ｇｒｉ−ｓｅｏｓｐｉｒａｌ ｉｓ （し０７ イン
７ ）、Ｓ、 １ａｖｅｎｄｕｌａｅ（アルトガマイシ
ン）、Ｓ、 ｒｉｍｏｓｕｓ （＝ ニー ） ラマイ
シン）、Ｓ、ｄｅｌｔａｅ（デルタマイシン類）、Ｓ。
ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ（メチマイシン類）、Ｓｏｇｒｉ
ｓｅｏｆｕｓｃｕｓ （プントリン）、Ｓ、ｎａｒｂｏ
ｎｅｎｓｉｓ （ジョサマイシン、ナルホマイシン）、
Ｓ、 ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ （抗生物質ＮＡ−１
８１）、Ｓｏｇｒｉｓｅｏｆａｃｉｅｎｓ （抗生物質
ＰＡ１３３Ａ、Ｂ）、Ｓ、ｒｏｓｅｏｃｉｔｒｅｕｓ
（アイボサイクリン）、Ｓ、ｂｒｕ−ｎｅｏｇｒｉｓｅ
ｕｓ （７ｙｖボサイクリン）、Ｓ、ｒｏｓｅｏｃｈｒ
ｏ−ｍｏｇｅｎｅｓ （７ルポサイクリン）、Ｓ 、
ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏ−ｇｅｎｅｓ （シラマイシ
ンＢ）、Ｓ、ａｌｂｕｓ （アルボマイセチン）、Ｓ、
ｆｅｌｌｅｕｓ （アルボマイシン、ピクロマイシン）
、Ｓ、 ｒｏｃｈｅｉ （ランカシジン、ボレリジン
）、Ｓ、ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ （ランカシジン
）、Ｓ９ｇｒｉｓｅｕｓ （ボレリジン）、Ｓ、ｍａｉ
ｚｅｕｓ （インゲラマイシン）、Ｓ、ａｌｂｕｓ ｖ
ａｒ、 ｃｏｉｌｍｙｃｅｔｉｃｕｓ （：ルイマイシ
ン）、Ｓｏｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ （アセチルロ
イコマイシン、ニスピノマイシン）、Ｓ 、 ｈｙｇｒ
ｏｓｃｏ−ｐｉｃｕｓ （ツリマイシン、レロマイシン
、マリドマイシン、タイロシン、カルボマイシン）、Ｓ
、ｇｒｉ−ｓｅｏｓｐｉｒａｌ ｉｓ （し０７ イン
７ ）、Ｓ、 １ａｖｅｎｄｕｌａｅ（アルトガマイシ
ン）、Ｓ、 ｒｉｍｏｓｕｓ （＝ ニー ） ラマイ
シン）、Ｓ、ｄｅｌｔａｅ（デルタマイシン類）、Ｓ。
ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ、 ｅｓｐｉｎｏｍ
ｙｃｅｔｉｃｕｓ （ｘ ｘピノマイシン類）、Ｓ、
ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ （ミ７” 力？ イン７）
、Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ （７オＣ１７シジンＤ
）、Ｓ。
ｙｃｅｔｉｃｕｓ （ｘ ｘピノマイシン類）、Ｓ、
ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ （ミ７” 力？ イン７）
、Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ （７オＣ１７シジンＤ
）、Ｓ。
ｅｎｒｏｃｉｄｉｃｕｓ （メチマイシン）、Ｓ９ｇｒ
ｉｓｅｏｌｕｓ （グリセオマイシンｌ Ｓ、ｆｌａｖ
ｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ（７マ０フイシン、シリコマ
イシン類）、Ｓ、 ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ（アマロマイ
シン）、Ｓ、 ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ （７７ロア イ
シン）、Ｓ、ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ （ｘリスロマイシン
類）、Ｓ、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ （オレアンドマ
イシン）、Ｓ。
ｉｓｅｏｌｕｓ （グリセオマイシンｌ Ｓ、ｆｌａｖ
ｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ（７マ０フイシン、シリコマ
イシン類）、Ｓ、 ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ（アマロマイ
シン）、Ｓ、 ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ （７７ロア イ
シン）、Ｓ、ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ （ｘリスロマイシン
類）、Ｓ、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ （オレアンドマ
イシン）、Ｓ。
ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （オレアンドマイ
シン）、Ｓ。
シン）、Ｓ。
ｓｐｉｎｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａｒ、 ｓｕｒ
ａｇａｏｅｎｓｉｓ （クジマイシン類）、Ｓ、ｋｉｔ
ａｓａｔｏｅｎｓｉｓ （ｏ イコ７ イン７ ）、Ｓ
、ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｊｏｓａｍｙｃｅ
ｔｉｃｕｓ （ｏイコマイシ７Ａ３、ジョサマイシン）
、Ｓ 、 ａｔ艷ｏｇｒｉ ５ｅｏｌｕｓ（ミコノマイ
シン）、Ｓ、 ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ （ｆヤルコマ
イシン）、Ｓ、ｃｉｒｒａｔｕｓ （シラマイシン）、
Ｓ。
ａｇａｏｅｎｓｉｓ （クジマイシン類）、Ｓ、ｋｉｔ
ａｓａｔｏｅｎｓｉｓ （ｏ イコ７ イン７ ）、Ｓ
、ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｊｏｓａｍｙｃｅ
ｔｉｃｕｓ （ｏイコマイシ７Ａ３、ジョサマイシン）
、Ｓ 、 ａｔ艷ｏｇｒｉ ５ｅｏｌｕｓ（ミコノマイ
シン）、Ｓ、 ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ （ｆヤルコマ
イシン）、Ｓ、ｃｉｒｒａｔｕｓ （シラマイシン）、
Ｓ。
ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓ （＝ダマイシン）、Ｓ 、
ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ（アンゴラマイシン）、Ｓ、
ｆｒａｄｉａｅ （タイロシン、ラクテノシン、マク
ロシン）、Ｓ、 ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ（パンダマ
イシン）、Ｓ、 ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ （アキュ
マイシン）、Ｓ、ｈａｌｓｔｅｄｉｉ （カルボ−ｚイ
シ７）、Ｓ。
ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ（アンゴラマイシン）、Ｓ、
ｆｒａｄｉａｅ （タイロシン、ラクテノシン、マク
ロシン）、Ｓ、 ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ（パンダマ
イシン）、Ｓ、 ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ （アキュ
マイシン）、Ｓ、ｈａｌｓｔｅｄｉｉ （カルボ−ｚイ
シ７）、Ｓ。
ｔｅｎｄａｅ （カルボマイシン）、Ｓｏｍａｃｒｏｓ
ｐｏｒｅｕｓ （カルボマイシン）、Ｓ、ｔｈｅｒｍｏ
ｔｏｌｅｒａｎｓ （カルボマイシン）、およびＳ、ａ
ｌｂｉｒｅｔｉｃｕｌｉ （カルボマイシン）。
ｐｏｒｅｕｓ （カルボマイシン）、Ｓ、ｔｈｅｒｍｏ
ｔｏｌｅｒａｎｓ （カルボマイシン）、およびＳ、ａ
ｌｂｉｒｅｔｉｃｕｌｉ （カルボマイシン）。
β−ラクタム抗生物質を産生じ、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例え
ば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる： Ｓ、
ｌｉｐｍａｎｉｉ （Ａ１６８Ｂ４、ＭＭ４５５０、Ｍ
Ｍ１３９０２） 、 Ｓ、ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ
（Ａ１５８８５Ｂ。
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例え
ば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる： Ｓ、
ｌｉｐｍａｎｉｉ （Ａ１６８Ｂ４、ＭＭ４５５０、Ｍ
Ｍ１３９０２） 、 Ｓ、ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ
（Ａ１５８８５Ｂ。
クラプラン酸）、Ｓ、 ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ （
セフ ７７ イン７Ｃ）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ （セフ
ァマイシンＡ１Ｂ）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ
（デアセトキシセファロスポリ７Ｃ）、Ｓｌｗａｄａ
ｙａｍｅｎｓｉｓ （ＷＳ−３４４２−Ｄ）、Ｓ。
セフ ７７ イン７Ｃ）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ （セフ
ァマイシンＡ１Ｂ）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ
（デアセトキシセファロスポリ７Ｃ）、Ｓｌｗａｄａ
ｙａｍｅｎｓｉｓ （ＷＳ−３４４２−Ｄ）、Ｓ。
ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ （Ｓ Ｆ １６２３ ）、Ｓ
、ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓおよびＳ、 ｐａｎａｙ
ｅｎｓｉｓ （Ｃ２０８１Ｘ ） ； Ｓ、ｃｉｎｎａ
ｍｏ−ｎｅｎｓｉｓ 、 Ｓ、ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ
、 Ｓ、ｈａｌｓｔｅｄｉｉ 、 Ｓ、ｒｏｃｈｅｉお
よびＳ、ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （セフ
７フイシンＡ１Ｂ ） ； Ｓ、ｃａｔｔｌｅｙａ （
チェナマイシン）；およびＳ、ｏｌｉｖａｃｅｕｓ 、
Ｓ、ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎｓ １Ｓ、ｆｌａｖｕｓ
１Ｓ。
、ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓおよびＳ、 ｐａｎａｙ
ｅｎｓｉｓ （Ｃ２０８１Ｘ ） ； Ｓ、ｃｉｎｎａ
ｍｏ−ｎｅｎｓｉｓ 、 Ｓ、ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ
、 Ｓ、ｈａｌｓｔｅｄｉｉ 、 Ｓ、ｒｏｃｈｅｉお
よびＳ、ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ （セフ
７フイシンＡ１Ｂ ） ； Ｓ、ｃａｔｔｌｅｙａ （
チェナマイシン）；およびＳ、ｏｌｉｖａｃｅｕｓ 、
Ｓ、ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎｓ １Ｓ、ｆｌａｖｕｓ
１Ｓ。
ｆｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉｓ 、 Ｓ、 ａｒｇｅｎｔｅ
ｏｌｕｓおよびＳ、５ｉｏｙａ−ｅｎｓｉｓ （ＭＭ４
５５０およびＭＭ１３９０２）。
ｏｌｕｓおよびＳ、５ｉｏｙａ−ｅｎｓｉｓ （ＭＭ４
５５０およびＭＭ１３９０２）。
ポリエーテル抗生物質を産生じ、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例え
ば以下のような微生物の非制限細胞が含まれル： Ｓ、
ａｌｂｕｓ （Ａ２０４、Ａ２８６９５ＡおよびＢ、−
）１−リノマイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕ
ｓ （Ａ２１８、エメリシト、ＤＥ３９３６、Ａｌ２０
Ａ、Ａ２８６９５ＡおよびＢ、エテロマイシン、ジヨサ
マイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ （クリツリキシン）
、Ｓ 、ｃｏｎｇｌｏ−ｂａｔｕｓ （イオノマイシン
）、Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ。
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例え
ば以下のような微生物の非制限細胞が含まれル： Ｓ、
ａｌｂｕｓ （Ａ２０４、Ａ２８６９５ＡおよびＢ、−
）１−リノマイシン）、Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕ
ｓ （Ａ２１８、エメリシト、ＤＥ３９３６、Ａｌ２０
Ａ、Ａ２８６９５ＡおよびＢ、エテロマイシン、ジヨサ
マイシン）、Ｓ、ｇｒｉｓｅｕｓ （クリツリキシン）
、Ｓ 、ｃｏｎｇｌｏ−ｂａｔｕｓ （イオノマイシン
）、Ｓ、ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ。
ａｓｔｅｒｏｃｉｄｉｃｕｓ （ライド０フイシン）、
Ｓ、１ａｓａ−１ｉｅｎｓｉｓ （ラサロシド）、Ｓ、
ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ （。
Ｓ、１ａｓａ−１ｉｅｎｓｉｓ （ラサロシド）、Ｓ、
ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ （。
ノマイシン）、Ｓ、ｃａｃａｏｉ ｖａｒ、ａｓｏｅｎ
ｓｉｓ （ライソセリン）、Ｓ、ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎ
ｓｉｓ （モネンシン）、Ｓ。
ｓｉｓ （ライソセリン）、Ｓ、ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎ
ｓｉｓ （モネンシン）、Ｓ。
ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ （ナラジン）、Ｓ、ｇａｌ
ｌｉｎａｒｉｕｓ （ＲＰ３０５０４）、Ｓ、ｌｏｎｇ
ｗｏｏｄｅｎｓｉｓ （ライソセリン）、Ｓ、 ｆｌａ
ｖｅｏｌｕｓ （ＣＰ ３８９３６ ）、Ｓ、ｍｕｔａ
ｂｉｌｌｉｓ （Ｓ−１１７４３ａ）、およびＳ、ｖｉ
ｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ （＝ケリシン）。
ｌｉｎａｒｉｕｓ （ＲＰ３０５０４）、Ｓ、ｌｏｎｇ
ｗｏｏｄｅｎｓｉｓ （ライソセリン）、Ｓ、 ｆｌａ
ｖｅｏｌｕｓ （ＣＰ ３８９３６ ）、Ｓ、ｍｕｔａ
ｂｉｌｌｉｓ （Ｓ−１１７４３ａ）、およびＳ、ｖｉ
ｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ （＝ケリシン）。
グリコペプチド抗生物質を産生じ、本発明に係るベクタ
ーを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例
えば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる： Ｓ
、ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓおよび５．ｈａｒａｎｏ−ｍａ
ｃｈｉｅｎｓｉｓ （バンコマイシン）、Ｓ、 ｃａｎ
ｄｉｄｕｓ（Ａ−３５５１２、アボパルシン）、および
Ｓ、ｅｂｕｒｏ−ｓｐｏｒｅｕｓ （ＬＬ−ＡＭ３７４
）およびＳ、ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ（Ａ４７９３４
）。
ーを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ類の非制限菌株宿主細胞には、例
えば以下のような微生物の非制限細胞が含まれる： Ｓ
、ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓおよび５．ｈａｒａｎｏ−ｍａ
ｃｈｉｅｎｓｉｓ （バンコマイシン）、Ｓ、 ｃａｎ
ｄｉｄｕｓ（Ａ−３５５１２、アボパルシン）、および
Ｓ、ｅｂｕｒｏ−ｓｐｏｒｅｕｓ （ＬＬ−ＡＭ３７４
）およびＳ、ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ（Ａ４７９３４
）。
本発明に係るベクターを特に有用に使用でき、形質転換
できる、その他の好ましいＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの
非制限菌株宿主細胞には、例えは以下のような微生物の
非制限細胞が含まれる： Ｓ、 ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ
、Ｓ、ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅｒＳＳ、ｒｏｓｅｏｓｐ
ｏｒｕｓ、 Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ。
できる、その他の好ましいＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの
非制限菌株宿主細胞には、例えは以下のような微生物の
非制限細胞が含まれる： Ｓ、 ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ
、Ｓ、ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｅｒＳＳ、ｒｏｓｅｏｓｐ
ｏｒｕｓ、 Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ。
Ｓ、ｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ、 Ｓ、ａｃｒｉｍｙｃｉ
ｎｓ％Ｓ、ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ。
ｎｓ％Ｓ、ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ。
Ｓ、ｐａｒｖｉｌｉｎ、 Ｓ、ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐ
ｉｒａｌｉｓｌＳ、ｖｉｏｌａ −ｃｅｏｒｕｂｅｒ、
Ｓ、ｖｉｎａｃｅｕｓ、 Ｓ、ｖｉｒｇｉｎｉａｅＳ
Ｓ、ｅｓｐｉ −ｎｏｓｕｓおよびＳ、 ａＺｕｒｅ、
ｕｓ ０上記の代表的なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主
細胞に加えて、本発明に係るベクターは、例えば以下の
ようなその他の種類の非制限菌株に有用に使用でき、か
つ細胞中に形質転換できる： Ｂａｃｉｌｌｕｓ、 ５
ｔａｐｈｙ−１０ｃｏｃｃｕｓ 、およびＳｔｒｅｐｔ
Ｏ８ｐＯｒａｎｇｉｕｍ、Ａ（ｔｉｎ□−ｐｌａｎｅｓ
、 ＮｏｃａｒｄｉａおよびＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐ
ｏｒａ を含むＡｃｔｉｏｎｏｍｙｃｅｔｅｓ関連菌株
。このように本発明に係るベクターは広範囲に適用可能
であり、有用でかつ数多くの微生物宿主細胞に形質転換
できる。
ｉｒａｌｉｓｌＳ、ｖｉｏｌａ −ｃｅｏｒｕｂｅｒ、
Ｓ、ｖｉｎａｃｅｕｓ、 Ｓ、ｖｉｒｇｉｎｉａｅＳ
Ｓ、ｅｓｐｉ −ｎｏｓｕｓおよびＳ、 ａＺｕｒｅ、
ｕｓ ０上記の代表的なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主
細胞に加えて、本発明に係るベクターは、例えば以下の
ようなその他の種類の非制限菌株に有用に使用でき、か
つ細胞中に形質転換できる： Ｂａｃｉｌｌｕｓ、 ５
ｔａｐｈｙ−１０ｃｏｃｃｕｓ 、およびＳｔｒｅｐｔ
Ｏ８ｐＯｒａｎｇｉｕｍ、Ａ（ｔｉｎ□−ｐｌａｎｅｓ
、 ＮｏｃａｒｄｉａおよびＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐ
ｏｒａ を含むＡｃｔｉｏｎｏｍｙｃｅｔｅｓ関連菌株
。このように本発明に係るベクターは広範囲に適用可能
であり、有用でかつ数多くの微生物宿主細胞に形質転換
できる。
本発明の実施態様は全て有用であるが、中でも幾つかの
本発明に係る組換えＤＮＡクローニングベクターおよび
形質転換体がより好ましい。即ち好適なベクターは、プ
ラスミドＰＦＪ１２７、ｐＦＪ２７７、ｐＦＪ１４１、
ＰＦＪ１４２、ＰＦＪ２７８、ｐＦＪ２８２、ｐＦＪ２
９１およびｐＦＪ２９５であり、好適な形質転換体は、
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ｐＦＪ１２７、Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ
２７７、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ＨＢＩＯＩ／ＰＦＪ１４１
、Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐＦＪ１４１、Ｅ、
ｃｏｌｉＫ１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＦＪ１４２、Ｓ、ａｍ
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ１４２、Ｓ、ａｍｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ ／ｐＦＪ２７８、Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅ
ｎｓ／ｐＦＪ２８２．５．ａｍｂｏ−ｆａｃｉｅｎｓ／
ｐＦＪ２９１およびＳ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ
ＦＪ２９５ である。さらに、これら好適な群の中でも
プラスミドｐＦＪ１２７、ｐＦＪ２７７、ＰＦＪ１４１
、ｐＦＪ１４２およびｐＦＪ２９５並びに形質転換体Ｓ
。
本発明に係る組換えＤＮＡクローニングベクターおよび
形質転換体がより好ましい。即ち好適なベクターは、プ
ラスミドＰＦＪ１２７、ｐＦＪ２７７、ｐＦＪ１４１、
ＰＦＪ１４２、ＰＦＪ２７８、ｐＦＪ２８２、ｐＦＪ２
９１およびｐＦＪ２９５であり、好適な形質転換体は、
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ｐＦＪ１２７、Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ
２７７、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ＨＢＩＯＩ／ＰＦＪ１４１
、Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐＦＪ１４１、Ｅ、
ｃｏｌｉＫ１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＦＪ１４２、Ｓ、ａｍ
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ１４２、Ｓ、ａｍｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ ／ｐＦＪ２７８、Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅ
ｎｓ／ｐＦＪ２８２．５．ａｍｂｏ−ｆａｃｉｅｎｓ／
ｐＦＪ２９１およびＳ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐ
ＦＪ２９５ である。さらに、これら好適な群の中でも
プラスミドｐＦＪ１２７、ｐＦＪ２７７、ＰＦＪ１４１
、ｐＦＪ１４２およびｐＦＪ２９５並びに形質転換体Ｓ
。
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ１２７、Ｓ、ａｍｂｏ
ｆａｃｉｅｎｓ ／ｐＦ Ｊ２７７、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ
１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＦＪ１４１．ｓ。
ｆａｃｉｅｎｓ ／ｐＦ Ｊ２７７、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ
１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＦＪ１４１．ｓ。
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐＦ Ｊ １４１、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＦＪ１４２、Ｓ、ａｍ
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ１４２ およびＳ、ａｍｂ
ｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ２９５ が最も好ましい。
ｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＦＪ１４２、Ｓ、ａｍ
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ１４２ およびＳ、ａｍｂ
ｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ２９５ が最も好ましい。
本発明に係る組換えＤＮＡクローニングベクターおよび
形質転換体は、広範囲な効用を有し、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓおよび関連微生物に使用するための好適なりロ
ーニング媒体の必要性を満たすものである。その上、非
形質転換宿主細胞には有毒な抗生物質に対する耐性を付
与する本発明に係るベクターの能力は、同時に、形質転
換体を選択する機能的手段を提供することとなる。この
ことは、ベクターＤＮＡを獲得した特定の細胞を決定し
選択することが実際上必要であるが故に重要である。
形質転換体は、広範囲な効用を有し、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓおよび関連微生物に使用するための好適なりロ
ーニング媒体の必要性を満たすものである。その上、非
形質転換宿主細胞には有毒な抗生物質に対する耐性を付
与する本発明に係るベクターの能力は、同時に、形質転
換体を選択する機能的手段を提供することとなる。この
ことは、ベクターＤＮＡを獲得した特定の細胞を決定し
選択することが実際上必要であるが故に重要である。
その存在を確認するための機能的な試験法のない他のＤ
ＮＡセグメントもまた、本発明に係るベクター上に挿入
することができ、この非選択性ＤＮＡを含有する形質転
換体を、適当な抗生物質による選択により分離できる。
ＮＡセグメントもまた、本発明に係るベクター上に挿入
することができ、この非選択性ＤＮＡを含有する形質転
換体を、適当な抗生物質による選択により分離できる。
このような非選択性ＤＮＡセグメントは、プラスミドの
機能、維持、並挿入することかできる。これには、抗生
物質修飾酵素、抗生物質耐性、抗生物質生合成を指定す
る遺伝子およびあらゆる型の調節遺伝子が含まれるか、
これらに限定される訳ではない。
機能、維持、並挿入することかできる。これには、抗生
物質修飾酵素、抗生物質耐性、抗生物質生合成を指定す
る遺伝子およびあらゆる型の調節遺伝子が含まれるか、
これらに限定される訳ではない。
さらに詳細には、形質転換体を選択するために用いる方
法によって、例えば、例示プラスミドｐＦＪ２７８の、
〜１．６ ｋｂ ＢａｍＨ■ 耐性付与フラグメントの
中央のＳａｌ Ｉ制限サイトに挿入されるような遺伝子
を含む非選択性ＤＮＡセグメントが得られる。かかる挿
入によってチオストレプトン耐性遺伝子が不活性化され
るので、組換えプラスミドを含む形質転換体を容易に同
定することができる。即ち、この場合まずネオマイシン
耐性によって選択し、次にチオストレプトン耐性でない
ネオマイシン耐性形質転換体を同定する。同様に、所望
のＤＮＡセグメントを例えば〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨ
Ｉ耐性付与フラグメントの内側のＢａｍＨＩ 制限サイ
トに挿入すれば、ネオマイシン耐性遺伝子が不活性化す
る。従って、この組換えプラスミドを持つ形質転換体も
また、まずチオストレプトン耐性で選択し、次にネオマ
イシン耐性でないチオストレプトン耐性形質転換体を同
定することによって、容易に同定できる。
法によって、例えば、例示プラスミドｐＦＪ２７８の、
〜１．６ ｋｂ ＢａｍＨ■ 耐性付与フラグメントの
中央のＳａｌ Ｉ制限サイトに挿入されるような遺伝子
を含む非選択性ＤＮＡセグメントが得られる。かかる挿
入によってチオストレプトン耐性遺伝子が不活性化され
るので、組換えプラスミドを含む形質転換体を容易に同
定することができる。即ち、この場合まずネオマイシン
耐性によって選択し、次にチオストレプトン耐性でない
ネオマイシン耐性形質転換体を同定する。同様に、所望
のＤＮＡセグメントを例えば〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨ
Ｉ耐性付与フラグメントの内側のＢａｍＨＩ 制限サイ
トに挿入すれば、ネオマイシン耐性遺伝子が不活性化す
る。従って、この組換えプラスミドを持つ形質転換体も
また、まずチオストレプトン耐性で選択し、次にネオマ
イシン耐性でないチオストレプトン耐性形質転換体を同
定することによって、容易に同定できる。
従って、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよび関連細胞にお
ける抗生物質耐性による選択能力によって、何十億も−
の細胞の中から目的とする特定の非選択性ＤＮＡを含有
するごく少数の細胞を効率的に分離できるようになる。
ける抗生物質耐性による選択能力によって、何十億も−
の細胞の中から目的とする特定の非選択性ＤＮＡを含有
するごく少数の細胞を効率的に分離できるようになる。
上述の抗生物質耐性についての機能試験は、さらに、制
御（コントロール）または生合成因子として作用し個々
の抗生物質耐性遺伝子の発現を支配するＤＮＡセグメン
トの位置決定にも使用される。プロモーター、アテニュ
エーター、リプレッサー、インデューサー、リボゾーム
結合す（ト等を含む（これらに限定される訳ではない）
上記セグメントは、ＳｔｒｅｐｔＯｍｙＣｅＳおよび関
連微生物の細胞における他の遺伝子の発現の制御に使用
される。
御（コントロール）または生合成因子として作用し個々
の抗生物質耐性遺伝子の発現を支配するＤＮＡセグメン
トの位置決定にも使用される。プロモーター、アテニュ
エーター、リプレッサー、インデューサー、リボゾーム
結合す（ト等を含む（これらに限定される訳ではない）
上記セグメントは、ＳｔｒｅｐｔＯｍｙＣｅＳおよび関
連微生物の細胞における他の遺伝子の発現の制御に使用
される。
チオストレプトンおよびネオマイシンの耐性を付与する
本発明に係るベクターは、結合したＤＮＡセグメントが
宿主細胞中で幾世代にも渡って安定に維持されることを
保証するためにも有用である。チオストレプトンまたは
ネオマイシン耐性付与フラグメントと共有結合し、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ または関連微生物の細胞中で増
殖するこれら遺伝子あるいはＤＮＡフラグメントは、非
形質転換細胞にとっては有毒な濃度のチオストレプトン
またはネオマイシンにこの形質転換体をさらすことによ
って維持できる。そうすることにより、ベクターを失い
、従って共有結合したＤＮＡをも失った形質転換体は生
育できず、培地から除去される。以上のようにして本発
明に係るベクターは、所望のいかなるＤＮＡ配列をも安
定化し維持することができる。
本発明に係るベクターは、結合したＤＮＡセグメントが
宿主細胞中で幾世代にも渡って安定に維持されることを
保証するためにも有用である。チオストレプトンまたは
ネオマイシン耐性付与フラグメントと共有結合し、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ または関連微生物の細胞中で増
殖するこれら遺伝子あるいはＤＮＡフラグメントは、非
形質転換細胞にとっては有毒な濃度のチオストレプトン
またはネオマイシンにこの形質転換体をさらすことによ
って維持できる。そうすることにより、ベクターを失い
、従って共有結合したＤＮＡをも失った形質転換体は生
育できず、培地から除去される。以上のようにして本発
明に係るベクターは、所望のいかなるＤＮＡ配列をも安
定化し維持することができる。
本発明に係るクローニングベクターおよび形質転換体に
よって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよび関連細胞にお
いて現在産生されている数多くの生成物の収量を向上さ
せる遺伝子をクローンすることができる。こうした生成
物の例として、ストレプトマイシン、タイロシン、セフ
ァロスポリン類、アクタプラニン、ナラジン、モネンシ
ン、アブラマイシン、トブラマイシン、エリスロマイシ
ン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールおよびバ
ンコマイシン等が挙げられるが、これらに限定される訳
ではない。さらに本発明は、商業的に重要な蛋白質類、
例えばヒトインシュリン、ヒトプロインシュリン、クル
カゴン、インターフェロン、ヒト成長ホルモン、鳥類成
長ホルモン、中成長ホルモン、豚成長ホルモンおよびイ
ンターロイキンエ等；商業的に重要な工程および物質に
つながる代謝経路における酵素機能；または遺伝子の発
現を改善する制御因子、を暗号化しているＤＮＡ配列を
クローンし、特性化し、再構成するのに有用な選択可能
なベクターを提供する。これらの望ましいＤＮＡ配列と
は、例えばストレプトマイシン、セファロスポリン、タ
イロシン、アクタプラニン、ナラジン、モネンシン、ア
ブラマイシン、トブラマイシン、テトラサイクリン、ク
ロラムフェニコール、エリスロマイシンおよびバンコマ
イシン誘導体等の誘導抗生物質の合成を触媒する酵素、
または抗生物質もしくは他の生成物の生合成を仲介し増
強させる酵素を暗号化しているＤＮＡを含むが、これら
に限定される訳ではない。このようにＤＮＡセグメント
の挿入および安定化が可能なことから、Ｓ ｔ ｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅ ｓおよび関連微生物の産生ずる抗生物質
の収量と利用性を増加させることができる。
よって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよび関連細胞にお
いて現在産生されている数多くの生成物の収量を向上さ
せる遺伝子をクローンすることができる。こうした生成
物の例として、ストレプトマイシン、タイロシン、セフ
ァロスポリン類、アクタプラニン、ナラジン、モネンシ
ン、アブラマイシン、トブラマイシン、エリスロマイシ
ン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールおよびバ
ンコマイシン等が挙げられるが、これらに限定される訳
ではない。さらに本発明は、商業的に重要な蛋白質類、
例えばヒトインシュリン、ヒトプロインシュリン、クル
カゴン、インターフェロン、ヒト成長ホルモン、鳥類成
長ホルモン、中成長ホルモン、豚成長ホルモンおよびイ
ンターロイキンエ等；商業的に重要な工程および物質に
つながる代謝経路における酵素機能；または遺伝子の発
現を改善する制御因子、を暗号化しているＤＮＡ配列を
クローンし、特性化し、再構成するのに有用な選択可能
なベクターを提供する。これらの望ましいＤＮＡ配列と
は、例えばストレプトマイシン、セファロスポリン、タ
イロシン、アクタプラニン、ナラジン、モネンシン、ア
ブラマイシン、トブラマイシン、テトラサイクリン、ク
ロラムフェニコール、エリスロマイシンおよびバンコマ
イシン誘導体等の誘導抗生物質の合成を触媒する酵素、
または抗生物質もしくは他の生成物の生合成を仲介し増
強させる酵素を暗号化しているＤＮＡを含むが、これら
に限定される訳ではない。このようにＤＮＡセグメント
の挿入および安定化が可能なことから、Ｓ ｔ ｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅ ｓおよび関連微生物の産生ずる抗生物質
の収量と利用性を増加させることができる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯ
Ｉ／ｐＦＪ２５８ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５２６２） は
、幾つかの異なる培地のどれかを用いて種々の方法で培
養できる。培地中の好ましい炭水化物源としては、例え
ば糖蜜、グルコース、デキストリンおよびグリセロール
が含まれ、窒素源としては例えば大豆粉、アミノ酸混合
物およびペプトン類が含まれる。栄養無機塩類もまた添
加され、これにはナトリウム、カリウム、アンモニア、
カルシウム、リン酸、塩酸、硫酸等のイオンを放出し得
る通常の塩類が含まれる。他の微生物の発育と増殖に必
要であるように、必須微量元素もまた添加する。こうし
た微量元素は、通常、他の培地成分の添加に付随する不
純物の形で供給される。
Ｉ／ｐＦＪ２５８ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５２６２） は
、幾つかの異なる培地のどれかを用いて種々の方法で培
養できる。培地中の好ましい炭水化物源としては、例え
ば糖蜜、グルコース、デキストリンおよびグリセロール
が含まれ、窒素源としては例えば大豆粉、アミノ酸混合
物およびペプトン類が含まれる。栄養無機塩類もまた添
加され、これにはナトリウム、カリウム、アンモニア、
カルシウム、リン酸、塩酸、硫酸等のイオンを放出し得
る通常の塩類が含まれる。他の微生物の発育と増殖に必
要であるように、必須微量元素もまた添加する。こうし
た微量元素は、通常、他の培地成分の添加に付随する不
純物の形で供給される。
Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢ１０１／ＰＦＪ２５８は、
約６５〜８という比較的広いｐＨ領域に渡って約２５°
Ｃ〜４０℃の温度範囲において好気的培養条件下に発育
させることができる。しかしながら、プラスミドｐＦＪ
２５８を最大量生産するためには、培地のｐＨを約７２
で培養を開始し、約３７°Ｃの温度に維持するのか望ま
しい。上記の条件てＥ、ｃｏｌｉ細胞を培養すれば、プ
ラスミドを常套の技術によって個別に単離することがで
きる貯蔵体としての細胞か得られる。
約６５〜８という比較的広いｐＨ領域に渡って約２５°
Ｃ〜４０℃の温度範囲において好気的培養条件下に発育
させることができる。しかしながら、プラスミドｐＦＪ
２５８を最大量生産するためには、培地のｐＨを約７２
で培養を開始し、約３７°Ｃの温度に維持するのか望ま
しい。上記の条件てＥ、ｃｏｌｉ細胞を培養すれば、プ
ラスミドを常套の技術によって個別に単離することがで
きる貯蔵体としての細胞か得られる。
以下に実施例を挙けて本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の説明および本発明を構成する実際の手法を適宜
述べた。
述べた。
実施例Ｉ Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ＨＢ１０１／ＰＦＪ２５
８の培養およびプラスミドＰＦＪ２５８の分離細菌、Ｅ
、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢ１０１／ｐＦＪ２５８ （
ＮＲＲＬ Ｂ−１５２６２）を、１１の水性溶液当たり
、バクト（Ｂａｃｔｏ） ）リプトン１０ｇ、バクト酵
母エキス５２およびＮａＣｚｌＯｙを含有しており（ｐ
Ｈ７５）、抗生物質アンピシリンおよびクロラムフェニ
コールをそれぞれ２５１ｔｙ ／ ｍｅを入れたＬＢ培
地中で通常の微生物学的手法に従って培養する。
８の培養およびプラスミドＰＦＪ２５８の分離細菌、Ｅ
、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢ１０１／ｐＦＪ２５８ （
ＮＲＲＬ Ｂ−１５２６２）を、１１の水性溶液当たり
、バクト（Ｂａｃｔｏ） ）リプトン１０ｇ、バクト酵
母エキス５２およびＮａＣｚｌＯｙを含有しており（ｐ
Ｈ７５）、抗生物質アンピシリンおよびクロラムフェニ
コールをそれぞれ２５１ｔｙ ／ ｍｅを入れたＬＢ培
地中で通常の微生物学的手法に従って培養する。
１８時間インキュベートした後、培地的０．５ ｍｅを
１．５ｍＣのエツベントルフチューフにとり、約１５秒
間遠心する。明記しない限り、全ての操作は周囲高度で
行なうものとする。得られた上清を先の細いアスピレー
クーで注意深く除き、細胞ペレットを２μｇ ／ ｍｅ
のりゾチーム、５ＱｍＭクルコース、１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａおよび２５ｍＭトリフ、−ＨＣ，！（ｐＩ−１８）を
含有する調製したはかりのリゾチーム溶液約１００μ？
中に懸濁する。０°Ｃで３０分間インキュベートした後
、約２００７１ｒのアルカリ性５ＤＳ（ドテシル硫酸ナ
トリウム）溶液（，２ＮＮａＯＨ１１％５ＤＳ）を加え
、静かにチューブを旋回させ、次いでＯ′Ｃに１５分間
保持する。次に、３Ｍ酢酸ナトリウム約１５０μｌを加
え、数秒間、静かに逆転させることにより、チューブの
内容物を混合する。
１．５ｍＣのエツベントルフチューフにとり、約１５秒
間遠心する。明記しない限り、全ての操作は周囲高度で
行なうものとする。得られた上清を先の細いアスピレー
クーで注意深く除き、細胞ペレットを２μｇ ／ ｍｅ
のりゾチーム、５ＱｍＭクルコース、１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａおよび２５ｍＭトリフ、−ＨＣ，！（ｐＩ−１８）を
含有する調製したはかりのリゾチーム溶液約１００μ？
中に懸濁する。０°Ｃで３０分間インキュベートした後
、約２００７１ｒのアルカリ性５ＤＳ（ドテシル硫酸ナ
トリウム）溶液（，２ＮＮａＯＨ１１％５ＤＳ）を加え
、静かにチューブを旋回させ、次いでＯ′Ｃに１５分間
保持する。次に、３Ｍ酢酸ナトリウム約１５０μｌを加
え、数秒間、静かに逆転させることにより、チューブの
内容物を混合する。
このチューブを０°Ｃで６０分間保ち、次いて１５００
０ｒｐｍて２０分間遠心し、殆んど澄明な上清を得る。
０ｒｐｍて２０分間遠心し、殆んど澄明な上清を得る。
この上清を第２の遠心用チューブに入れ、フェノール：
クロロホルム（２４：１）およびクロロホルムでＤＮＡ
を抽出する。次いて、水層に２容量の冷エタノールを加
えてＩ） Ｎ Ａを沈殿させる。このＤＮＡを１／ｌ０
ＴＥ （）リス−１４Ｇ／ ： ＥＤＴＡ ＝ １０
： １ ） ｌ ｍｅ中にとる。
クロロホルム（２４：１）およびクロロホルムでＤＮＡ
を抽出する。次いて、水層に２容量の冷エタノールを加
えてＩ） Ｎ Ａを沈殿させる。このＤＮＡを１／ｌ０
ＴＥ （）リス−１４Ｇ／ ： ＥＤＴＡ ＝ １０
： １ ） ｌ ｍｅ中にとる。
実施例２ プラスミドｐＬＲ２の組み立てＡ、プラスミ
ドＰＩＪ６（７）Ｈｉｎｄ■消化７’ ラスミドｐｌＪ
６ （７）ＤＮＡ （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９８０、
Ｎａｔｕｒｅ、２８６：５２５に開示）約２０ｔｉＩ！
（２０μｐ）、ＢＳＡ （牛血清アルブミン、１ ｍｇ
／ ｍ０５μｌ、水１９μ７．Ｈｉｎｄｌ［制限酵素
（３ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉ”ｏ Ｌａｂｓ単位
を含有）１１１１および反応ミックスｘｘ５１１１を、
３７°Ｃて２時間インキュベートする。４Ｍの酢酸アン
モニウム約５０μｌおよび９５％エタノール２００μｌ
を添加して反応を停止させる。得られたＤＮＡ沈殿を７
０％エタンールて２回洗浄し、減圧下で乾燥し、１／ｌ
０ＴＥ緩衝液２０μｌに懸濁後、貯蔵のため一２０°Ｃ
て凍結させた。
ドＰＩＪ６（７）Ｈｉｎｄ■消化７’ ラスミドｐｌＪ
６ （７）ＤＮＡ （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９８０、
Ｎａｔｕｒｅ、２８６：５２５に開示）約２０ｔｉＩ！
（２０μｐ）、ＢＳＡ （牛血清アルブミン、１ ｍｇ
／ ｍ０５μｌ、水１９μ７．Ｈｉｎｄｌ［制限酵素
（３ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉ”ｏ Ｌａｂｓ単位
を含有）１１１１および反応ミックスｘｘ５１１１を、
３７°Ｃて２時間インキュベートする。４Ｍの酢酸アン
モニウム約５０μｌおよび９５％エタノール２００μｌ
を添加して反応を停止させる。得られたＤＮＡ沈殿を７
０％エタンールて２回洗浄し、減圧下で乾燥し、１／ｌ
０ＴＥ緩衝液２０μｌに懸濁後、貯蔵のため一２０°Ｃ
て凍結させた。
×制限酵素は以下の供給源より入手てきる：Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ、、 Ｉｎｃ、（３２
Ｔｏｚｅｒ Ｒｏａｄ。
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ、、 Ｉｎｃ、（３２
Ｔｏｚｅｒ Ｒｏａｄ。
Ｂｅｖｅｒｌｙ 、 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｑ
１９１５在）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ （７９４１Ｃａｓ
ｔｌｅｗａｙ ＤｒｉｖｅＰ、０．Ｂｏｘ ５０８１６
、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、 Ｉｎｄｉａｎａ４６２
５０在）、およびＢｅｔｂｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｃｈ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ、 （８７１７Ｇｒｏ
ｖｅｍｏｎｔ Ｃ１ｒｃｌｅ１Ｐ、０．Ｂｏｘ５７７、
Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０７
６０在）。
１９１５在）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ （７９４１Ｃａｓ
ｔｌｅｗａｙ ＤｒｉｖｅＰ、０．Ｂｏｘ ５０８１６
、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、 Ｉｎｄｉａｎａ４６２
５０在）、およびＢｅｔｂｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｃｈ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ、 （８７１７Ｇｒｏ
ｖｅｍｏｎｔ Ｃ１ｒｃｌｅ１Ｐ、０．Ｂｏｘ５７７、
Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０７
６０在）。
／×Ｈｉｎｄ ■制限酵素用の反応ミックスは以下の成
分より調製した。
分より調製した。
５ Ｑ ＱｍＭ ＮａＣ１
１００ｍＭ ）リス塩酸（ｐＨ７，９）７０ｍＭＭｇＣ
１２ １（１ｍＭ ジチオトレイトール プラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡ約８μｅ（４ｐｙ）反
応ミックス５μｌ、ＢＳＡ（１ｍ９／ｍｅ）５μｌ、水
３１μｌおよびＨｉｎｄｌｉ制限酵素１μｌを３７℃で
２時間インキュベートする。６０℃で１０分間インキュ
ベートすることにより反応を停止させた後、４Ｍの酢酸
アンモニウム約５０μｌおよび９５％エタノール２００
μｌを添加する。得られたＤＮＡ沈殿を７０％エタノー
ルで２回洗浄し、減圧乾燥し、水４５μｌ に懸濁させ
る。
１２ １（１ｍＭ ジチオトレイトール プラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡ約８μｅ（４ｐｙ）反
応ミックス５μｌ、ＢＳＡ（１ｍ９／ｍｅ）５μｌ、水
３１μｌおよびＨｉｎｄｌｉ制限酵素１μｌを３７℃で
２時間インキュベートする。６０℃で１０分間インキュ
ベートすることにより反応を停止させた後、４Ｍの酢酸
アンモニウム約５０μｌおよび９５％エタノール２００
μｌを添加する。得られたＤＮＡ沈殿を７０％エタノー
ルで２回洗浄し、減圧乾燥し、水４５μｌ に懸濁させ
る。
Ｉ−Ｉｉｎｄｍ処理プラスミドｐＩＪ６ （実施例２Ａ
て調製）約２０ μｌ 、 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ処理プラ
スミドｐＢＲ３２２（実施例２Ｂて調製） ２０ｐｅ、
ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｅ）５／７１ Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼｘ１ ｔｔｉおよヒライゲーションミックスｘｘ５μ
ｌを１６°Ｃて４時間インキュベートする。４Ｍの酢酸
アンモニウム約５０μｌおよび９５％エタノール２００
１１１を加えて反応を停止させる。得られたＤＮＡ四殿
を７０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥し、１／１
０ＴＥ緩衝液に懸濁する。この懸濁ＤＮＡは所望のプラ
スミドＰＬＲ２を構成してい、た。
て調製）約２０ μｌ 、 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ処理プラ
スミドｐＢＲ３２２（実施例２Ｂて調製） ２０ｐｅ、
ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｅ）５／７１ Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼｘ１ ｔｔｉおよヒライゲーションミックスｘｘ５μ
ｌを１６°Ｃて４時間インキュベートする。４Ｍの酢酸
アンモニウム約５０μｌおよび９５％エタノール２００
１１１を加えて反応を停止させる。得られたＤＮＡ四殿
を７０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥し、１／１
０ＴＥ緩衝液に懸濁する。この懸濁ＤＮＡは所望のプラ
スミドＰＬＲ２を構成してい、た。
×Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼは以下の供給源より入手てきる
： Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ、、
Ｉｎｃ、（３２ＴｏｚｅｒＲｄ、、Ｂｅｖｅｒｌｙ、
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０１９１５在）、Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ （Ｐ、０．Ｂｏｘ５７７、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ 、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ２ Ｑ ７６ Ｑ在）×
×ライゲーションミックスは以下の成分より輻製した。
： Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ、、
Ｉｎｃ、（３２ＴｏｚｅｒＲｄ、、Ｂｅｖｅｒｌｙ、
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０１９１５在）、Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ （Ｐ、０．Ｂｏｘ５７７、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ 、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ２ Ｑ ７６ Ｑ在）×
×ライゲーションミックスは以下の成分より輻製した。
５００ｍＭ ト リ スＨＣ１（ｐＨ７，８）２００ｍ
Ｍ ジチオトレイトール １００ ｍＭ Ｎ１ｇ Ｃ１８２ １０ｍＭＡＴＰ 実施例３ Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ＨＢ１０１／ｐＬＲ２の
組み立て コンピテントな凍結Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ
細胞（Ｂｏｌｉｖａｒ等、１９７７、Ｇｅｎｅ、２ニア
５−９３）約１０ｍｅを遠心にかけてペレット化し、０
．０１Ｍ塩化す） ＩＪウム約ＩＱｍｌ！に懸濁する。
Ｍ ジチオトレイトール １００ ｍＭ Ｎ１ｇ Ｃ１８２ １０ｍＭＡＴＰ 実施例３ Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ＨＢ１０１／ｐＬＲ２の
組み立て コンピテントな凍結Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ
細胞（Ｂｏｌｉｖａｒ等、１９７７、Ｇｅｎｅ、２ニア
５−９３）約１０ｍｅを遠心にかけてペレット化し、０
．０１Ｍ塩化す） ＩＪウム約ＩＱｍｌ！に懸濁する。
次いてこの細胞を再びペレット化し、０．０３Ｍの塩化
カルシウム溶液約１０１１１１４に再懸濁し、氷上で２
０分間インキュベートした後再びペレット化し、最後に
００３Ｍの塩化カルシウム溶液１．２５ ｍｅに懸濁す
る。得られた細胞懸濁液は、次に行なう形質転換に対し
てコンピテントである。
カルシウム溶液約１０１１１１４に再懸濁し、氷上で２
０分間インキュベートした後再びペレット化し、最後に
００３Ｍの塩化カルシウム溶液１．２５ ｍｅに懸濁す
る。得られた細胞懸濁液は、次に行なう形質転換に対し
てコンピテントである。
ＴＥ緩衝液中のプラスミドＰＬＲ２（実施例２Ｃで調製
）をエタノール沈殿に付し、３ＱｍＭの塩化カルシウム
溶液１５０μｌに懸濁後、試験管内でコンピテントＥ、
ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｉ（ＢＩＯＩ細胞約２００μｌ
と穏やかに混合する。得られた混合物を氷上で約４５分
間、次いで４２℃で約１分間インキュベートスル。次に
アンピシリン５０μ９ ／ｍｌ’を含りするＬブＯス’
（Ｂｅｒｔａｎｉ 、 １９５１、Ｊ 、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ６２：２９３）約３ ｍｅを加える。
）をエタノール沈殿に付し、３ＱｍＭの塩化カルシウム
溶液１５０μｌに懸濁後、試験管内でコンピテントＥ、
ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｉ（ＢＩＯＩ細胞約２００μｌ
と穏やかに混合する。得られた混合物を氷上で約４５分
間、次いで４２℃で約１分間インキュベートスル。次に
アンピシリン５０μ９ ／ｍｌ’を含りするＬブＯス’
（Ｂｅｒｔａｎｉ 、 １９５１、Ｊ 、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ６２：２９３）約３ ｍｅを加える。
混合物を３７°Ｃで１時間振とうしながらインキュベー
トした後、アンピシリンを含有するＬ寒天（Ｍｉｌｌｅ
ｒ、１９７２、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ）上に蒔
く。生き残ったコロニーを選択して所望の表現型（Ａｍ
ｐＲ，Ｔｅ ｔ” ）について試験したところ、このコ
ロニーは目的とするＥ、ｃｏｌｉＫ１２ ＨＢＩＯＩ／
ＰＬＲ２形質転換体を構成していた。
トした後、アンピシリンを含有するＬ寒天（Ｍｉｌｌｅ
ｒ、１９７２、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ）上に蒔
く。生き残ったコロニーを選択して所望の表現型（Ａｍ
ｐＲ，Ｔｅ ｔ” ）について試験したところ、このコ
ロニーは目的とするＥ、ｃｏｌｉＫ１２ ＨＢＩＯＩ／
ＰＬＲ２形質転換体を構成していた。
実施例４ プラスミドｐＬｋ１の組み立てプラスミドｐ
ＩＪ６の代りにプラスミドｐＩＪ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ
等、１９８０、Ｎａｔｕｒｅ ２８６ ：５２５に開示
）を使用する以外は実施例２Ａ、Ｃの教示するところに
実質的に従ってプラスミドｐＬＲ１を調製する。目的プ
ラスミドｐＬＲ１は１／１０ＴＥ２．衝液に懸濁する。
ＩＪ６の代りにプラスミドｐＩＪ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ
等、１９８０、Ｎａｔｕｒｅ ２８６ ：５２５に開示
）を使用する以外は実施例２Ａ、Ｃの教示するところに
実質的に従ってプラスミドｐＬＲ１を調製する。目的プ
ラスミドｐＬＲ１は１／１０ＴＥ２．衝液に懸濁する。
実施例５ Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ＰＬ
ＲＩの組み立て プラスミドＰＬＲ２てはなくプラスミドｐＬＲ１を形質
転換に使用する以外は、実施例３に実質的に従って目的
とする糺み立てを行なう。生存コロニーを選択して所望
の表現型（Ａｍｐ 、 Ｔｅｔ ）について試験したと
ころ、このコロニーは目的とするＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２
ＨＢＩＯＩ／ＰＬＲＩ形質転換体を構成していた。
ＲＩの組み立て プラスミドＰＬＲ２てはなくプラスミドｐＬＲ１を形質
転換に使用する以外は、実施例３に実質的に従って目的
とする糺み立てを行なう。生存コロニーを選択して所望
の表現型（Ａｍｐ 、 Ｔｅｔ ）について試験したと
ころ、このコロニーは目的とするＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２
ＨＢＩＯＩ／ＰＬＲＩ形質転換体を構成していた。
実施例６ プラスミドｐＬＲ４の糺み立てプラスミドｐ
ＬＲ１約１０μ１（１０μり、ＢＳＡ（１ｍｓ／ｍｅ
） ５ ｕｐ、水２９ μｉ 、 ＢａｍＨＩ制限酵素
（水で１：４に希釈）１μｌおよび反応ミックス８５μ
ｌを３７°Ｃで１５分間インキュベートする。４Ｍの酢
酸アンモニウム約５０μｌおよび９５％エタノール２０
０μｌを添加して反応を停止させる。得られたＤＮＡ沈
殿を７０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥後、水２
０μｌに懸濁する。
ＬＲ１約１０μ１（１０μり、ＢＳＡ（１ｍｓ／ｍｅ
） ５ ｕｐ、水２９ μｉ 、 ＢａｍＨＩ制限酵素
（水で１：４に希釈）１μｌおよび反応ミックス８５μ
ｌを３７°Ｃで１５分間インキュベートする。４Ｍの酢
酸アンモニウム約５０μｌおよび９５％エタノール２０
０μｌを添加して反応を停止させる。得られたＤＮＡ沈
殿を７０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥後、水２
０μｌに懸濁する。
×ＢａｍＨ■制限酵素用反応ミックスは以下の成分より
調製した。
調製した。
１、５ Ｍ Ｎ、ｌ Ｃ１
６０ｍＭ トリスＨＣｚ（ｐＨ７，９）６０ ｒｎ Ｍ
Ｍｇ Ｃｌ ２ ＨｉｎｄｌＩ制限酵素の代わりにＢａｍＨＩ制限酵素を
用いる以外は実施例２Ｂと実質的に同様にして目的とす
る消化を行なう。消化したプラスミドｐＢＲ３２２は水
２９μｌに懸濁する。
Ｍｇ Ｃｌ ２ ＨｉｎｄｌＩ制限酵素の代わりにＢａｍＨＩ制限酵素を
用いる以外は実施例２Ｂと実質的に同様にして目的とす
る消化を行なう。消化したプラスミドｐＢＲ３２２は水
２９μｌに懸濁する。
−ジョン
所望のライゲーションを実施例２Ｃと実質的に同様にし
て行なう。得られた結合ＤＮＡは］’Ｅｉ衝液に懸濁し
た。これは目的とするプラスミドｐＬＲ４を構成してい
た。
て行なう。得られた結合ＤＮＡは］’Ｅｉ衝液に懸濁し
た。これは目的とするプラスミドｐＬＲ４を構成してい
た。
実施例７ Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＬ
Ｒ４の組み立て プラスミドＰＬＲ２ではなくプラスミドｐＬＲ４を形質
転換に使用する以外は実施例３と実質的に同様にして所
望の組み立て番付なう。生存コロニーを選択して所望の
表現型（ＡｍｐＲ，Ｔｅ ｔ ” ）について試験した
ところ、目的とするＩ巳、 ｃｏｌ ｉ Ｋｌ ２）（
Ｂ１０１／ｐＬＲ４形質転換体を構成していた。
Ｒ４の組み立て プラスミドＰＬＲ２ではなくプラスミドｐＬＲ４を形質
転換に使用する以外は実施例３と実質的に同様にして所
望の組み立て番付なう。生存コロニーを選択して所望の
表現型（ＡｍｐＲ，Ｔｅ ｔ ” ）について試験した
ところ、目的とするＩ巳、 ｃｏｌ ｉ Ｋｌ ２）（
Ｂ１０１／ｐＬＲ４形質転換体を構成していた。
実施例８ プラスミドＰＦＪ１２７の糾み立てトの分離
プラスミドＰＦＪ２５８のＤＮＡ約２０／１．り、反応
ミックス１０／７１ 、ＢＳＡＣ１ｍｌ／ｍｌり１０μ
１１ 水３９１１１およびＳａｌ ■制限酵素１ ｐｌ
（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ Ｌａｂ単位以上を
含有）を３７℃で約１５分間インキ：Ｌ ヘ−）する。
ミックス１０／７１ 、ＢＳＡＣ１ｍｌ／ｍｌり１０μ
１１ 水３９１１１およびＳａｌ ■制限酵素１ ｐｌ
（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ Ｌａｂ単位以上を
含有）を３７℃で約１５分間インキ：Ｌ ヘ−）する。
同容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容量の９５％エ
タノールを添加後、混合物を一２０°Ｃで約１８時間冷
却してＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡ沈殿を遠心して集め
、７０％エタノール中で洗浄、減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液
約２０μｌに懸濁する。Ｃ１ａ■反応ミックスｘｘ約１
０／１１． ＢｓＡ（１ｍｙ／ｎ＋ｅ）１０１１１、水
９１１１およびＣ１ａＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂ 単位以上を、 含有）Ｉｌｌｌ
を加えた後、混合物を３７°Ｃて約６０分間インキュベ
ートする。同容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび５容量
の９５％エタノールを加えた後、混合物を一２０°Ｃて
約１８時間冷却してＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡの沈殿
を遠心して集め、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｃｏ
１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
）の教示するところに実質的に従って、アガロースゲ
ル電気泳動により所望のＳａｌ ｉ −Ｃ１ａ ■ フ
ラグメントを常法により分離し、単離する。単離後、こ
のフラグメントを、次工程のライゲーションのために１
／１０ＴＥ緩衝液約２０μｔに再懸濁する。
タノールを添加後、混合物を一２０°Ｃで約１８時間冷
却してＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡ沈殿を遠心して集め
、７０％エタノール中で洗浄、減圧乾燥し、ＴＥ緩衝液
約２０μｌに懸濁する。Ｃ１ａ■反応ミックスｘｘ約１
０／１１． ＢｓＡ（１ｍｙ／ｎ＋ｅ）１０１１１、水
９１１１およびＣ１ａＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂ 単位以上を、 含有）Ｉｌｌｌ
を加えた後、混合物を３７°Ｃて約６０分間インキュベ
ートする。同容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび５容量
の９５％エタノールを加えた後、混合物を一２０°Ｃて
約１８時間冷却してＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡの沈殿
を遠心して集め、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｃｏ
１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
）の教示するところに実質的に従って、アガロースゲ
ル電気泳動により所望のＳａｌ ｉ −Ｃ１ａ ■ フ
ラグメントを常法により分離し、単離する。単離後、こ
のフラグメントを、次工程のライゲーションのために１
／１０ＴＥ緩衝液約２０μｔに再懸濁する。
×Ｓａ１■制限酵素用反応ミックスは以下の成分により
調製した。
調製した。
１、５ ｍＭ Ｎａ Ｃ１
６Ｃ１６Ｏリス−Ｉ（Ｃ４（ｐＨ７，９）６０ ｍＭ
ＭｇＣｒ２ ６０ｍＭ ２−メルカプトエタノール ××Ｃ１ａ■制限酵素用反応ミックスは以下の成分によ
り調製した。
ＭｇＣｒ２ ６０ｍＭ ２−メルカプトエタノール ××Ｃ１ａ■制限酵素用反応ミックスは以下の成分によ
り調製した。
５００ｍ１ｖｉ Ｎａ（、：ｚ
６０ｍＭ トリフ、−ＨＣｌ（ｐＨ７，９）６０ ｒｎ
Ｍ Ｍ ｇ （Ｌ ／２ プラスミドｐＦＪ２５８ではなく、プラスミドｐＬＲ２
を使用する以外は、実施例８Ａと実質的に同様１こして
所望の消化を行なう。得られたＳａｌ ■−Ｃ１ａエフ
ラグメントをアガロースゲル電気泳動性により、常法通
り分離し、単離する（ Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２
）。
Ｍ Ｍ ｇ （Ｌ ／２ プラスミドｐＦＪ２５８ではなく、プラスミドｐＬＲ２
を使用する以外は、実施例８Ａと実質的に同様１こして
所望の消化を行なう。得られたＳａｌ ■−Ｃ１ａエフ
ラグメントをアガロースゲル電気泳動性により、常法通
り分離し、単離する（ Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２
）。
Ｓａｌ 、Ｉ −Ｃ１ａ Ｉ処理したプラスミドｐＦＪ
２５８ （実施例８Ａで調製）約２０ ／ｌｌ、 Ｓａ
ｌ ■−Ｃ１ａ ■処理したプラスミドＰＬＲ２（実施
例８Ｂで調製）２０μ１１Ｂ Ｓ Ａ （１−ｙ ／
ｍｅ ） ５ ｐ ｉ １Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａリガーゼ
ＩＩｔｌ、” ライゲーションミックス８５μｌを１６
°Ｃで４時間インキュベートする。４Ｍの酢酸アンモニ
ウム約５０μｌおよび９５％エタノール約２００μｌを
加えて反応を終了させる。混合物を一２０℃で約１８時
間冷却してＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡ沈殿を７０％エ
タノールで２回洗浄し、真空乾燥して次の形質転換のた
めにＰ培地（ＨｏｐｗｏｏｄおよびＷｒｉｇｈｔ １１
９７８、Ｊ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅ
ｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ ｌ ６２ ： ３０７ ）約
５０μｌに懸濁させる。
２５８ （実施例８Ａで調製）約２０ ／ｌｌ、 Ｓａ
ｌ ■−Ｃ１ａ ■処理したプラスミドＰＬＲ２（実施
例８Ｂで調製）２０μ１１Ｂ Ｓ Ａ （１−ｙ ／
ｍｅ ） ５ ｐ ｉ １Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａリガーゼ
ＩＩｔｌ、” ライゲーションミックス８５μｌを１６
°Ｃで４時間インキュベートする。４Ｍの酢酸アンモニ
ウム約５０μｌおよび９５％エタノール約２００μｌを
加えて反応を終了させる。混合物を一２０℃で約１８時
間冷却してＤＮＡを沈殿させる。ＤＮＡ沈殿を７０％エ
タノールで２回洗浄し、真空乾燥して次の形質転換のた
めにＰ培地（ＨｏｐｗｏｏｄおよびＷｒｉｇｈｔ １１
９７８、Ｊ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅ
ｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ ｌ ６２ ： ３０７ ）約
５０μｌに懸濁させる。
懸濁させたＤＮＡは、所望のプラスミドＰＦＪ１２７を
構成している。
構成している。
×ライゲーションミックスは以下の成分ｌこより調製し
た。
た。
５００ｍＭ ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，８）２００ｍＭ
ジチオトレイトール １００ ｍＭ Ｍ ｇ Ｃｉ ２ １ ＱｍＭ Ａ ＴＰ 当業者には理解されるであろうか、チオストレプトン耐
性付与フラグメントが反対方向であるＰＦＪ１２７の誘
導体フラグメントを組み立てることかできる。プラスミ
ドＰＦＪ２７７は、ｐＦＪ１２７をＢｃｌ’Ｉ制限酵素
で消化し、次いでＢｃｌ ｌ：消化フラグメントとライ
ゲートすることにより組み立てることができるが、プラ
スミドＰＦＪ２７７とｐＦＪ１２７ か−緒に生成する
。プラスミドｐＦＪ １２７およびＰＦＪ２７７の制限
サイト地図を添付の第３図に示す。
ジチオトレイトール １００ ｍＭ Ｍ ｇ Ｃｉ ２ １ ＱｍＭ Ａ ＴＰ 当業者には理解されるであろうか、チオストレプトン耐
性付与フラグメントが反対方向であるＰＦＪ１２７の誘
導体フラグメントを組み立てることかできる。プラスミ
ドＰＦＪ２７７は、ｐＦＪ１２７をＢｃｌ’Ｉ制限酵素
で消化し、次いでＢｃｌ ｌ：消化フラグメントとライ
ゲートすることにより組み立てることができるが、プラ
スミドＰＦＪ２７７とｐＦＪ１２７ か−緒に生成する
。プラスミドｐＦＪ １２７およびＰＦＪ２７７の制限
サイト地図を添付の第３図に示す。
て
実施例８ＣからのＤＮＡ約１μｙおよびＳｔｒｅｐｔｏ
−ｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ［Ｎｏｒｔｈｅ
ｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ （Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉｓ在〕
に寄託されストックカルチャーコレクションの一部とな
っており、受理番号ＮＲＲＬ２４２０の下で一般に入手
可能な菌株〕のプロトプラス）１００７ｚｚをＰ培地中
て２０％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）Ｑ、５μｌ
と混合する。周囲温度で２〜３分放置後、この混合物に
Ｐ培地４ｍｌを加え、遠心する（４℃、１５０００ｒＰ
ｍ、約５分間）。得られたペレットをＰ培地１ｒｒ＋ｅ
に再懸濁し、この懸濁液１００／／ｚを調製したばかり
の、あるいは乾燥したに２プレート（平板）上に置き、
３０’Ｃで１６−２４時間イー ンキュベートする。
−ｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ［Ｎｏｒｔｈｅ
ｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ （Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉｓ在〕
に寄託されストックカルチャーコレクションの一部とな
っており、受理番号ＮＲＲＬ２４２０の下で一般に入手
可能な菌株〕のプロトプラス）１００７ｚｚをＰ培地中
て２０％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）Ｑ、５μｌ
と混合する。周囲温度で２〜３分放置後、この混合物に
Ｐ培地４ｍｌを加え、遠心する（４℃、１５０００ｒＰ
ｍ、約５分間）。得られたペレットをＰ培地１ｒｒ＋ｅ
に再懸濁し、この懸濁液１００／／ｚを調製したばかり
の、あるいは乾燥したに２プレート（平板）上に置き、
３０’Ｃで１６−２４時間イー ンキュベートする。
平板中の最終謡度が５０μ！ ／ ｍｅとなるに十分な
チオストレプトンを含有するトップアガーのＲ２培地（
Ｈｏｐｗｏｏｄら、１９７８）を、再生したプロトプラ
ストに積層することにより、目的とする形質転換体をチ
オストレプトン耐性について選択する。
チオストレプトンを含有するトップアガーのＲ２培地（
Ｈｏｐｗｏｏｄら、１９７８）を、再生したプロトプラ
ストに積層することにより、目的とする形質転換体をチ
オストレプトン耐性について選択する。
得られたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＦ’Ｊ１２７およびＳ、 ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＦＪ２７７ チオストレプトン耐性コロニー
を既知の手法で分離、培養し、次いで常法に従って構成
プラスミドの制限酵素分析および構成プラスミドのアガ
ロースゲル電気泳動分析により同定を行なう（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら、１９８２）。この形質転換培養体は、引き
続きそれぞれのプラスミドの生産および分離に使用する
。
ｅｎｓ／ｐＦ’Ｊ１２７およびＳ、 ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＦＪ２７７ チオストレプトン耐性コロニー
を既知の手法で分離、培養し、次いで常法に従って構成
プラスミドの制限酵素分析および構成プラスミドのアガ
ロースゲル電気泳動分析により同定を行なう（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら、１９８２）。この形質転換培養体は、引き
続きそれぞれのプラスミドの生産および分離に使用する
。
実施例１０ プラスミドｐＦＪ２７８およびｐＦＪ２７
９ の組み立て 瀧 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素とプラスミドｐＢＲ３２２の
代りにＢａｍ Ｉ−１１制限酵素とプラスミドｐＬＲ４
とを使用する以外は、実質的に実施例２Ｂの教示すると
ころに従って所望の消化を行なう。所望の〜３．４ｋｂ
Ｂａｍ Ｉ（■ ネオマイシン耐性付与制限フラグメ
ントをアガロースゲル亀気体動法（Ｍａｎｎｉａｔｉｓ
ら、１９８２）により、ＤＮＡ懸濁液から常法通り単離
する。単離後、このフラグメントを次のライゲーション
に備えて１／１０１’ Ｅ 浸衝液約２０μｌに再懸濁
する。
９ の組み立て 瀧 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素とプラスミドｐＢＲ３２２の
代りにＢａｍ Ｉ−１１制限酵素とプラスミドｐＬＲ４
とを使用する以外は、実質的に実施例２Ｂの教示すると
ころに従って所望の消化を行なう。所望の〜３．４ｋｂ
Ｂａｍ Ｉ（■ ネオマイシン耐性付与制限フラグメ
ントをアガロースゲル亀気体動法（Ｍａｎｎｉａｔｉｓ
ら、１９８２）により、ＤＮＡ懸濁液から常法通り単離
する。単離後、このフラグメントを次のライゲーション
に備えて１／１０１’ Ｅ 浸衝液約２０μｌに再懸濁
する。
この消化もまた、ＨｉｎｄｌＩＩ制限酵素とプラスミド
ｐ Ｂ Ｒ３２２の代りにＢａｍＨＩ制限酵素とプラス
ミドｐＦＪ１２７を使用する以外は実質的に、実施例２
Ｂの方法に従って行なう。〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨｉ
フラグメント（上で単離したもの）を、実質的に実施例
８Ｃと同様にしてプラスミドＰＦＪ１２７のＢａｍＨ■
消化制限フラグメントにライゲートする。
ｐ Ｂ Ｒ３２２の代りにＢａｍＨＩ制限酵素とプラス
ミドｐＦＪ１２７を使用する以外は実質的に、実施例２
Ｂの方法に従って行なう。〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨｉ
フラグメント（上で単離したもの）を、実質的に実施例
８Ｃと同様にしてプラスミドＰＦＪ１２７のＢａｍＨ■
消化制限フラグメントにライゲートする。
〜３．４ ｋｂ Ｂａｍ Ｈ■ 耐性付与フラグメント
はとちらの方向性もとり得るため、２方向性の組換え一
プラスミドが得られる。プラスミドｐＦＪ２７８および
プラスミドｐＦＪ２７９の制限サイトおよび機能地図を
添付の第４図に示した。当業者には理解されるであろう
が、上記の方法によって〜２２３ｋｂ Ｘｂａ ：［−
Ｂｃｌ ■複製起源含有フラグメントを含んでいるその
他の組換えプラスミドを生成させることができる。これ
らのプラスミドは機能的であり、従ってこれらもまた本
発明を例示するものである。前述のプラスミド類は常法
通り、形質転換させ、次いで制限酵素およびゲル泳動分
析にかけることによって同定できる。
はとちらの方向性もとり得るため、２方向性の組換え一
プラスミドが得られる。プラスミドｐＦＪ２７８および
プラスミドｐＦＪ２７９の制限サイトおよび機能地図を
添付の第４図に示した。当業者には理解されるであろう
が、上記の方法によって〜２２３ｋｂ Ｘｂａ ：［−
Ｂｃｌ ■複製起源含有フラグメントを含んでいるその
他の組換えプラスミドを生成させることができる。これ
らのプラスミドは機能的であり、従ってこれらもまた本
発明を例示するものである。前述のプラスミド類は常法
通り、形質転換させ、次いで制限酵素およびゲル泳動分
析にかけることによって同定できる。
実施例１１ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ／ＰＦＪ２７８およびＳ、 ａｍｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２７９の組み立て プラスミドｐＦＪ１２７およびｐＦＪ２７７の代りにプ
ラスミドＰＦＪ２７８およびｐＦＪ２７９を、また、抗
生物質チオストレプトンの代りにネオマイシンゞを形質
転換に使用する以外は実質的に実施例９の教示に従って
所望の組み立てを行なう。得られた形質転換体を、ネオ
マイシン耐性を１μ２／ｍｅで選択すること以外は上の
実施例９て述べた方法に従って、ネオマイシン耐性に関
して選択する。
ｃｉｅｎｓ／ＰＦＪ２７８およびＳ、 ａｍｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ ／ｐ Ｆ Ｊ ２７９の組み立て プラスミドｐＦＪ１２７およびｐＦＪ２７７の代りにプ
ラスミドＰＦＪ２７８およびｐＦＪ２７９を、また、抗
生物質チオストレプトンの代りにネオマイシンゞを形質
転換に使用する以外は実質的に実施例９の教示に従って
所望の組み立てを行なう。得られた形質転換体を、ネオ
マイシン耐性を１μ２／ｍｅで選択すること以外は上の
実施例９て述べた方法に従って、ネオマイシン耐性に関
して選択する。
得られたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＦＪ２７８およびＳ、 ａｍｂｏｆａｃｉｅ
ｎｓ／ｐＦＪ２７９ネオマイシン耐性コロニーを既知の
手法で分離し、次いで常法に従って構成プラスミドを制
限酵素および電気泳動分析により同定する。
ｅｎｓ／ｐＦＪ２７８およびＳ、 ａｍｂｏｆａｃｉｅ
ｎｓ／ｐＦＪ２７９ネオマイシン耐性コロニーを既知の
手法で分離し、次いで常法に従って構成プラスミドを制
限酵素および電気泳動分析により同定する。
×抗生物質ネオマイシンはＳｉｇｍａ（Ｓｔ、 Ｌｏｕ
ｉｓ 。
ｉｓ 。
Ｍｉｓｓｏｕｒｉ在）より入手できる。
実施例１２ プラスミドｐＦＪ２８２およびＳｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐＦ Ｊ
２８２の組み立てＡ、プラスミドｐＦＪ１２７のＸｂ
ａ■消化プラスミドＰＦＪ２５８、Ｓａｌ ■およびＣ
１ａＩ制限酵素並びに反応ミックスの代りにプラスミド
ｐＦＪ１２７、ＸｂａＪ制限酵素′および反応ミックス
ｘｘを用いる以外は実質的に実施例８Ａの教示に従って
所望の消化を行なう。得られたＸｂａ■フラグメントを
常法通りアガロースゲル電気泳動によって分離して単離
する。単離後、このフラグメントを、次のライゲーショ
ンに備えて１／１０ Ｔ Ｅ緩衝液約、２０μｌに再懸
濁する。
ｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ／ｐＦ Ｊ
２８２の組み立てＡ、プラスミドｐＦＪ１２７のＸｂ
ａ■消化プラスミドＰＦＪ２５８、Ｓａｌ ■およびＣ
１ａＩ制限酵素並びに反応ミックスの代りにプラスミド
ｐＦＪ１２７、ＸｂａＪ制限酵素′および反応ミックス
ｘｘを用いる以外は実質的に実施例８Ａの教示に従って
所望の消化を行なう。得られたＸｂａ■フラグメントを
常法通りアガロースゲル電気泳動によって分離して単離
する。単離後、このフラグメントを、次のライゲーショ
ンに備えて１／１０ Ｔ Ｅ緩衝液約、２０μｌに再懸
濁する。
Ｂ、ライゲーションおよび形質転換
実質的に実施例８Ｃの教示に従って所望のライゲーショ
ンを行なう。得られたプラスミドｐＦＪ２８２は唯１個
のＸｂａ工制限サイトを持っており、そしてこれは、プ
ラスミドｐＦＪ２５８の〜２．２３ ｋｂＸｂａ ニー
Ｂｃｌ ■複製起源含有フラグメントを有しているので
、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ内で機能的である。
ンを行なう。得られたプラスミドｐＦＪ２８２は唯１個
のＸｂａ工制限サイトを持っており、そしてこれは、プ
ラスミドｐＦＪ２５８の〜２．２３ ｋｂＸｂａ ニー
Ｂｃｌ ■複製起源含有フラグメントを有しているので
、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ内で機能的である。
プラスミドｐＦＪ２８２の制限サイトおよび機能地図を
添付の第５図に示す。
添付の第５図に示す。
形質転換体Ｓ、 ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ ２
８２は、形質転換にプラスミドｐＦＪ１２７およびｐＦ
Ｊ２７７の代りにプラスミドｐＦＪ ２８２を用いる以
外は、実質的に実施例９の教示に従って調製される。平
板中の最終カウント濃度が５０μｙ／ｒｎｌとなるに充
分なチオストレプトンを含有するトップアガーのに２培
地を、再生プロトプラストに積層することにより、所望
の形質転換体をチオストレプトン耐性について選択する
。得られたＳｔｒｅｐｔｏｍγｃｅｓａｍｂｏｆａｃ
１ｅｎｓ ／ ｐ Ｆ Ｊ ２８２チオストレプトン耐
性コロニーを既知の手法で単離し、常法に従って構成プ
ラスミドの制限酵素分析および電気泳動分析により同定
する。
８２は、形質転換にプラスミドｐＦＪ１２７およびｐＦ
Ｊ２７７の代りにプラスミドｐＦＪ ２８２を用いる以
外は、実質的に実施例９の教示に従って調製される。平
板中の最終カウント濃度が５０μｙ／ｒｎｌとなるに充
分なチオストレプトンを含有するトップアガーのに２培
地を、再生プロトプラストに積層することにより、所望
の形質転換体をチオストレプトン耐性について選択する
。得られたＳｔｒｅｐｔｏｍγｃｅｓａｍｂｏｆａｃ
１ｅｎｓ ／ ｐ Ｆ Ｊ ２８２チオストレプトン耐
性コロニーを既知の手法で単離し、常法に従って構成プ
ラスミドの制限酵素分析および電気泳動分析により同定
する。
×Ｘｂａ工制限酵素およびそれに関する情報は実質例２
に記載の供給源から得ることかできる。
に記載の供給源から得ることかできる。
×ＸＸｂａ■制限酵素用反応ミックスは以下の成分より
調製した。
調製した。
５（ｌＱｍＭ ＮａＣ１
６０ｍＭ トリス−Ｈｃｌ（ｐＨ７，９）６０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２ 実施例１３ 三機能性プラスミドｐＦＪ１４１およびｐ
ＦＪ １４２の組み立て プラスミドｐＦＪ１２７のＤＮＡ約４ｏｔｉｔ（〜４０
μｙ）、ＢＳＡ（１〜／＋ｖ）１０μｌ、水３９μｚ、
ＢｃｌＩ制限酵素（水で１＝３に希釈）１μｌおよび反
応ミックス １０μｌを５０°Ｃで１５分間インキュベ
ートする。同容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび５容量
の９５％エタノールを加えて反応を終了させる。この混
合物を一２０°Ｃで約１８時間冷却−し、ＤＮＡを沈殿
させる。ＤＮＡの沈殿を遠心して集め、７０％エタノー
ルで洗浄し、真空乾燥した後、１／ｌ０ＴＥ緩衝液約５
０μｌ中に御懸濁した。
ｇＣｌ２ 実施例１３ 三機能性プラスミドｐＦＪ１４１およびｐ
ＦＪ １４２の組み立て プラスミドｐＦＪ１２７のＤＮＡ約４ｏｔｉｔ（〜４０
μｙ）、ＢＳＡ（１〜／＋ｖ）１０μｌ、水３９μｚ、
ＢｃｌＩ制限酵素（水で１＝３に希釈）１μｌおよび反
応ミックス １０μｌを５０°Ｃで１５分間インキュベ
ートする。同容量の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび５容量
の９５％エタノールを加えて反応を終了させる。この混
合物を一２０°Ｃで約１８時間冷却−し、ＤＮＡを沈殿
させる。ＤＮＡの沈殿を遠心して集め、７０％エタノー
ルで洗浄し、真空乾燥した後、１／ｌ０ＴＥ緩衝液約５
０μｌ中に御懸濁した。
ｙ； Ｂｃｌ ■制限酵素用の反応ミックスは以下の成
分より調製した ７ ５ ＱｍＭ ＫＣｚ ６０ｍＭ ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，４）１００ ｍＭ
Ｍｇ Ｃ１Ｃ １２１Ｑ ジチオトレイトール Ｂ、プラスミドｐＢＲ３２８のＢａｍＨ■消化プラスミ
ドｐＢＲ３２８のＤＮＡ約２μｌ（〜２μｙ）、ＢＳＡ
（１＋ｎｙ／ ｍｅ ） ２．５μｌ、水１６ μＩ
、 ＢａｍＨ■制限酵素２μｌおよび反応ミックス２−
Ｗμｌを３７℃で２時間インキュベートする。６０℃で
１０分間インキュベートして反応を終了させた後、４Ｍ
酢酸アンモニウム約２５μｌおよび９５％エタノール約
１００μｌを加える。得られたＤＮＡの沈殿を７０％エ
タノール中で２回洗浄し、真空乾燥した後、水約１０μ
ｌに懸濁させた。
分より調製した ７ ５ ＱｍＭ ＫＣｚ ６０ｍＭ ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，４）１００ ｍＭ
Ｍｇ Ｃ１Ｃ １２１Ｑ ジチオトレイトール Ｂ、プラスミドｐＢＲ３２８のＢａｍＨ■消化プラスミ
ドｐＢＲ３２８のＤＮＡ約２μｌ（〜２μｙ）、ＢＳＡ
（１＋ｎｙ／ ｍｅ ） ２．５μｌ、水１６ μＩ
、 ＢａｍＨ■制限酵素２μｌおよび反応ミックス２−
Ｗμｌを３７℃で２時間インキュベートする。６０℃で
１０分間インキュベートして反応を終了させた後、４Ｍ
酢酸アンモニウム約２５μｌおよび９５％エタノール約
１００μｌを加える。得られたＤＮＡの沈殿を７０％エ
タノール中で２回洗浄し、真空乾燥した後、水約１０μ
ｌに懸濁させた。
Ｂｃｌ ■部分的処理プラスミドｐＦＪ１２７ （実施
例１３Ａで調製）約２０ ｐｌ 、 ＢａｍＨ工処理プ
ラスミドｐＢＲ３２８（実施例１３Ｂで調製）２０μ１
１ＢＳＡ（１〜／−）５μｌ、水１５μｌ、Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼ４μｌおよびライゲーションミックス５μｌ
を１６°Ｃで一夜インキユベートする。４Ｍ酢酸アンモ
ニウム約５０μｌと９５％エタノール２００μｌを加え
て反応を終了させる。得られたＤＮＡの沈殿を７０％エ
タノールで２回洗浄し、真空乾燥して１／１０ Ｔ Ｅ
緩衝液中に懸濁する。こあ懸濁したＤＮＡは所望のプラ
スミドＰＦＪ１４１およびｐＦＪ１４２を構成していた
。制限プラスミドｐＢＲ３２８はどちらの方向性をもと
り得るので、二方向の組換えプラスミドが得られること
になる。プラスミドＰＦＪ１４１およびＰＦＪ１４２の
各々の制限サイトおよび機能地図を添付の第６図に示す
。
例１３Ａで調製）約２０ ｐｌ 、 ＢａｍＨ工処理プ
ラスミドｐＢＲ３２８（実施例１３Ｂで調製）２０μ１
１ＢＳＡ（１〜／−）５μｌ、水１５μｌ、Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼ４μｌおよびライゲーションミックス５μｌ
を１６°Ｃで一夜インキユベートする。４Ｍ酢酸アンモ
ニウム約５０μｌと９５％エタノール２００μｌを加え
て反応を終了させる。得られたＤＮＡの沈殿を７０％エ
タノールで２回洗浄し、真空乾燥して１／１０ Ｔ Ｅ
緩衝液中に懸濁する。こあ懸濁したＤＮＡは所望のプラ
スミドＰＦＪ１４１およびｐＦＪ１４２を構成していた
。制限プラスミドｐＢＲ３２８はどちらの方向性をもと
り得るので、二方向の組換えプラスミドが得られること
になる。プラスミドＰＦＪ１４１およびＰＦＪ１４２の
各々の制限サイトおよび機能地図を添付の第６図に示す
。
実施例１４ Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／Ｐ
ＦＪ１４１およびＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ
／ＰＦＪ１４２の組み立て 、 形質転換にプラスミドＰＬＲ２の代りにプラスミド
ｐＦＪ１４１およびＰＦＪ１４２を用いる以外は実質的
に実施例３の教示に従って所望の組み立てを行なう。ま
ず生き残ったコロニーを選択して所望の表現型（Ａｍｐ
Ｒ１ＣｍＲ％Ｔｅ ｔ ” ）にライて試験し、次いで
構成プラスミドの制限酵素分析およびアガロースゲル電
気泳動分析によって所望のＥ、ｃｏｌｉＫ１２ ＨＢＩ
ＯＩ／ＰＦＪ１４１およびＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｈ
ＢＩＯＩ／ＰＦＪ１４２形質転換体であることを同定し
た。
ＦＪ１４１およびＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ
／ＰＦＪ１４２の組み立て 、 形質転換にプラスミドＰＬＲ２の代りにプラスミド
ｐＦＪ１４１およびＰＦＪ１４２を用いる以外は実質的
に実施例３の教示に従って所望の組み立てを行なう。ま
ず生き残ったコロニーを選択して所望の表現型（Ａｍｐ
Ｒ１ＣｍＲ％Ｔｅ ｔ ” ）にライて試験し、次いで
構成プラスミドの制限酵素分析およびアガロースゲル電
気泳動分析によって所望のＥ、ｃｏｌｉＫ１２ ＨＢＩ
ＯＩ／ＰＦＪ１４１およびＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｈ
ＢＩＯＩ／ＰＦＪ１４２形質転換体であることを同定し
た。
実施例１５ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ ／ｐＦＪ１４１およびＳ、ａｍｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ／ｐＦＪ１４２ の組み立て プラスミドＰＦＪ１２７およびｐＦＪ２７７の代わりに
プラスミドｐＦＪ１４１およびｐＦＪ１４２を形質転換
に用いる以外は実質的に実施例９の教示に従って所望の
組み立てを行なう。得られた形質転換体を前の実施例９
で述べた方法により、チオストレプトン耐性に関して選
択する。この様にして組み立てられたチオストレプトン
耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ−ｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅ
ｎｓ／ｐＦＪ１４１およびＳ、ａｍｂｏｆａ−ｃｉｅｎ
ｓ／ｐＦＪ１４２コロニーを周知の方法で単離し、次い
で常法通り、構成プラスミドの制限酵素分析および電気
泳動分析によって同定した。
ｃｉｅｎｓ ／ｐＦＪ１４１およびＳ、ａｍｂｏｆａｃ
ｉｅｎｓ／ｐＦＪ１４２ の組み立て プラスミドＰＦＪ１２７およびｐＦＪ２７７の代わりに
プラスミドｐＦＪ１４１およびｐＦＪ１４２を形質転換
に用いる以外は実質的に実施例９の教示に従って所望の
組み立てを行なう。得られた形質転換体を前の実施例９
で述べた方法により、チオストレプトン耐性に関して選
択する。この様にして組み立てられたチオストレプトン
耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ−ｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅ
ｎｓ／ｐＦＪ１４１およびＳ、ａｍｂｏｆａ−ｃｉｅｎ
ｓ／ｐＦＪ１４２コロニーを周知の方法で単離し、次い
で常法通り、構成プラスミドの制限酵素分析および電気
泳動分析によって同定した。
実施例１６ プラスミドＰＦＪ２９１およびｐＦＪ２９
２の組み立て 大多数のＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２株は自身のＤＮＡ中の
ある残基をメチル化（Ｍｅｔｈｙｌａｔｅ ）する。例
えば、ｄａｍ遺伝子により指定されるメチラーゼは、Ｄ
ＮＡ配列：５ＧＡｍｅＴＣ３中の、指示したアデニンの
６位のアミン基をメチル化する。このメチル化により、
認識される配列中にこのメチル化された配列が含まれて
いるような、ある種のエンドヌクレア−ゼ（全てではな
い）によるＤＮＡの開裂が妨げられることがわかった。
２の組み立て 大多数のＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２株は自身のＤＮＡ中の
ある残基をメチル化（Ｍｅｔｈｙｌａｔｅ ）する。例
えば、ｄａｍ遺伝子により指定されるメチラーゼは、Ｄ
ＮＡ配列：５ＧＡｍｅＴＣ３中の、指示したアデニンの
６位のアミン基をメチル化する。このメチル化により、
認識される配列中にこのメチル化された配列が含まれて
いるような、ある種のエンドヌクレア−ゼ（全てではな
い）によるＤＮＡの開裂が妨げられることがわかった。
本発明に一般的に用いられる制限酵素であるＢｃｌ Ｉ
は、Ｂｃｌ Ｉ認識配列５’ＴＧＡＴＣＡ３’がメチル
化されている場合、これを開裂しない。この様な問題を
避けるために、プラスミドｐＦＪ２５８は、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ ｄａｍ−菌株（例えばＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉ
ｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。
は、Ｂｃｌ Ｉ認識配列５’ＴＧＡＴＣＡ３’がメチル
化されている場合、これを開裂しない。この様な問題を
避けるために、プラスミドｐＦＪ２５８は、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ ｄａｍ−菌株（例えばＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉ
ｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。
−Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉｓ ニ寄託され、ソ
ノ永久ストックカルチャー・コレクションの一部となっ
ているＧＭ４８株）に導入されねばならない。この菌株
は寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５７２５の下、誰でも入手
できる。
ノ永久ストックカルチャー・コレクションの一部となっ
ているＧＭ４８株）に導入されねばならない。この菌株
は寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５７２５の下、誰でも入手
できる。
プラスミドｐＦＪ２５８のＤＮＡ約５μノを、それぞれ
、実施例２Ａおよび１３Ａと実質的に同様にしてＢａｍ
Ｈ■およびＢｃｌ ■制限酵素′で処理する。
、実施例２Ａおよび１３Ａと実質的に同様にしてＢａｍ
Ｈ■およびＢｃｌ ■制限酵素′で処理する。
プラスミドＰＦＪ２５８の複製起源含有〜２．８５ｋｂ
フラグメントは常法に従って回収し得る。
フラグメントは常法に従って回収し得る。
次に、単離した〜２．８５ｋｂフラグメント約５μ２を
、実施例１２Ａと同様にしてｘｂａ １制限酵素′で処
理する。このＸｂａＩ消化フラグメントは、常法に従っ
て回収することができる。
、実施例１２Ａと同様にしてｘｂａ １制限酵素′で処
理する。このＸｂａＩ消化フラグメントは、常法に従っ
て回収することができる。
×制限酵素類は実施例２で述べた供給源から容易に入手
することができる。
することができる。
プラスミドｐＬＲ１またはｐＬＲ４（実施例１０Ａて単
離）の〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨＩ消化ネオマイシン耐
性付与フラグメントを、上で単離したＸｂａ ■消化フ
ラグメントに、Ｔ４ＤＮＡ＋Ｊガーゼを用いて付加する
ことにより、所望の組み立てを行なう。ライゲーション
は実質的に実施例８Ｃの方法に従って行なう。
離）の〜３．４ ｋｂ ＢａｍＨＩ消化ネオマイシン耐
性付与フラグメントを、上で単離したＸｂａ ■消化フ
ラグメントに、Ｔ４ＤＮＡ＋Ｊガーゼを用いて付加する
ことにより、所望の組み立てを行なう。ライゲーション
は実質的に実施例８Ｃの方法に従って行なう。
実施例８および１０で説明した様に、挿入された耐性付
与フラグメントの方向性により、２つの方向性のプラス
ミドが得られる。プラスミドｐＦＪ２９１およびｐＦＪ
２９２は、プラスミドｐＦＪ２５８の複製起源含有フラ
グメントを含んでいるが、プラスミド中に唯１個のＸｂ
ａＪ制限サイトを含有するように修飾される。プラスミ
ドｐＦＪ２９１およびＰＦＪ２９２の制限サイト地図を
添付の第７図に示す。
与フラグメントの方向性により、２つの方向性のプラス
ミドが得られる。プラスミドｐＦＪ２９１およびｐＦＪ
２９２は、プラスミドｐＦＪ２５８の複製起源含有フラ
グメントを含んでいるが、プラスミド中に唯１個のＸｂ
ａＪ制限サイトを含有するように修飾される。プラスミ
ドｐＦＪ２９１およびＰＦＪ２９２の制限サイト地図を
添付の第７図に示す。
実施例１７ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａ
ｃｉｅｎｓ ／ｐＦＪ２９１およびＳ 、 ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｃｅ ／ ｐ Ｆ Ｊ ２ ｇ ２ （ｙ）
組み立て プラスミドＰＦＪ１２７およびｐＦＪ２７７の代りにプ
ラスミドｐＦＪ２９１およびｐＦＪ２９２を形質転換に
用いる以外は実質的に実施例９と同様にして所望の組み
立てを行なう。
ｃｉｅｎｓ ／ｐＦＪ２９１およびＳ 、 ａｍｂｏｆ
ａｃｉｅｎｃｅ ／ ｐ Ｆ Ｊ ２ ｇ ２ （ｙ）
組み立て プラスミドＰＦＪ１２７およびｐＦＪ２７７の代りにプ
ラスミドｐＦＪ２９１およびｐＦＪ２９２を形質転換に
用いる以外は実質的に実施例９と同様にして所望の組み
立てを行なう。
実施例１８ プラスミドｐＦＪ２９５およびｐＦＪ２９
６、および形質転換体Ｓ、 ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ ｐＦＪ２９５およびＳ、 ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ｐ Ｆ Ｊ ２９６の組み立て 実施例１６の前文で述べた理由に基つき、プラスミドＰ
ＦＪ２５８ ＤＮＡは、制限酵素で処理する前に、Ｅ、
ｃｏｌｉ ｄａｍ菌株、例えばＥ、 ｃｏｌｉ ＧＭ４
８、ＮＲＲＬ Ｂ−１５７２５に導入しなければならな
い。
６、および形質転換体Ｓ、 ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ ｐＦＪ２９５およびＳ、 ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
／ｐ Ｆ Ｊ ２９６の組み立て 実施例１６の前文で述べた理由に基つき、プラスミドＰ
ＦＪ２５８ ＤＮＡは、制限酵素で処理する前に、Ｅ、
ｃｏｌｉ ｄａｍ菌株、例えばＥ、 ｃｏｌｉ ＧＭ４
８、ＮＲＲＬ Ｂ−１５７２５に導入しなければならな
い。
この導入の後、プラスミドＰＦＪ２５８ ＤＮＡ約５μ
２を、それぞれ実施例１２Ａおよび１３Ａの方法に従っ
てＸｂａｌおよびＢｃｌ Ｉ制限酵素で処理する。
２を、それぞれ実施例１２Ａおよび１３Ａの方法に従っ
てＸｂａｌおよびＢｃｌ Ｉ制限酵素で処理する。
プラスミドｐＦＪ２ｓ８に由来する〜２．２３ｋｂ複製
起源含有フラグメントは常法により回収することができ
る。′ ×制限酵素類は実施例２で述べた供給源から容易に得る
ことができる。
起源含有フラグメントは常法により回収することができ
る。′ ×制限酵素類は実施例２で述べた供給源から容易に得る
ことができる。
所望ノ組み立テハ、合成ＸｂａＩ−ＢｃｌＩ ＤＮＡリ
ンカ−を〜２．２３ｋｂ Ｘｂａ Ｉ −Ｂｃｌ Ｉ
７ ラフｌ ｙトに付加し、次いて、この様にして修飾
されたフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼを用いて
、Ｂｃｌ■処理してプラスミドＰＦＪ１２７ （Ｂａｍ
Ｈ：［制限酵素の代りにＢｃｌ ■制限酵素を用いる以
外は実質的に実施例１０Ｂと同様にして調製される）に
ライゲートすることにより行なう。ＸｂａｌおよびＢｃ
ｌ■各制限酵素並ひにＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ酵素は実施
例２で述べた供給源から入手することができる。
ンカ−を〜２．２３ｋｂ Ｘｂａ Ｉ −Ｂｃｌ Ｉ
７ ラフｌ ｙトに付加し、次いて、この様にして修飾
されたフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼを用いて
、Ｂｃｌ■処理してプラスミドＰＦＪ１２７ （Ｂａｍ
Ｈ：［制限酵素の代りにＢｃｌ ■制限酵素を用いる以
外は実質的に実施例１０Ｂと同様にして調製される）に
ライゲートすることにより行なう。ＸｂａｌおよびＢｃ
ｌ■各制限酵素並ひにＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ酵素は実施
例２で述べた供給源から入手することができる。
〜２．２３ ｋｂ Ｘｂａ）−Ｂｃｌ Ｉフラグメント
にＸｂａ エ−ＢＣＩＩＩＪンカーを付加した後、実質
的に実施例８Ｃと同様にして、ｐＦＪ１２７のＢｃｌ
Ｉ処理フラグメントにライゲートシ、プラスミドＰＦＪ
２９５およびｐＦＪ２９６を形成させ、次いで、実質的
に実施例９と同様にしテＳ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
に導入し、Ｓ。
にＸｂａ エ−ＢＣＩＩＩＪンカーを付加した後、実質
的に実施例８Ｃと同様にして、ｐＦＪ１２７のＢｃｌ
Ｉ処理フラグメントにライゲートシ、プラスミドＰＦＪ
２９５およびｐＦＪ２９６を形成させ、次いで、実質的
に実施例９と同様にしテＳ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
に導入し、Ｓ。
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ｐＦＪ ２９５およびＳ、
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ＰＦＪ２９６を得る。実施例
８および１０で説明し−た様に、挿入されたチオストレ
プトン耐性付与フラグメントの方向性により、２つの方
向性のプラスミドが得られる。
ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ／ＰＦＪ２９６を得る。実施例
８および１０で説明し−た様に、挿入されたチオストレ
プトン耐性付与フラグメントの方向性により、２つの方
向性のプラスミドが得られる。
※Ｘｂａ ■−Ｂｃｌ Ｉおよび他のリンカ−類は、Ｎ
ｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓｌｌｎｃ、（３
２Ｔｏｚｅｒ Ｒｏａｄ。
ｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓｌｌｎｃ、（３
２Ｔｏｚｅｒ Ｒｏａｄ。
Ｂｅｖｅｒｌｙ、 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｅｓ ０
１９１５）から入手でき、これらはＣｒｅａら（１９７
８，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ 、Ａｃａｄ。
１９１５）から入手でき、これらはＣｒｅａら（１９７
８，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ 、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ、、 ７５ ： ５７６５ ）およ
びＩ ｔａｋｕｒａら（。
びＩ ｔａｋｕｒａら（。
１９７７ 、５ｃｉｅｎｃｅ １９８ ：１０５６ ）
によって議論されている。
によって議論されている。
以上述べた方法に従って組み立てた代表的なプラスミド
および形質転換体を以下の表１および２に示す。
および形質転換体を以下の表１および２に示す。
表２ 代表的な形質転換体
１． Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｒ／Ｒ’ （ただし
、ｋはａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、 ａｕｒｅｏｆａｃｉ
ｅｎｓ、ｇｒｉ ５ｅｏｆｕｓｃｕｓ 。
、ｋはａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、 ａｕｒｅｏｆａｃｉ
ｅｎｓ、ｇｒｉ ５ｅｏｆｕｓｃｕｓ 。
ｆｒａｄｉａｅ×、１ｉｖｉｄａｎｓ 、ｇｒａｎｕｌ
ｏｒｕｂｅｒ 、 ｔｅｎｅ−ｂｒａｒｉｕｓ、 ｃｉ
ｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓまたはｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ
であり、ｋｌはそれぞれ独立して表１に示したｐＦＪプ
ラスミドである。
ｏｒｕｂｅｒ 、 ｔｅｎｅ−ｂｒａｒｉｕｓ、 ｃｉ
ｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓまたはｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ
であり、ｋｌはそれぞれ独立して表１に示したｐＦＪプ
ラスミドである。
−２，Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｒ”／Ｒ３（ただし、Ｒ２はに
１２、Ｋ１２ＨＢＩＯＩまたはＧＭ４８であり、Ｋ３は
それぞれ独立してプラスミドｐＦＪ２８５、ｐＦＪ２８
６、ＰＦＪ２８７、ｐＦＪ２８８、ＰＦＪ２８９または
ｐＦＪ２９０である）。
１２、Ｋ１２ＨＢＩＯＩまたはＧＭ４８であり、Ｋ３は
それぞれ独立してプラスミドｐＦＪ２８５、ｐＦＪ２８
６、ＰＦＪ２８７、ｐＦＪ２８８、ＰＦＪ２８９または
ｐＦＪ２９０である）。
χＳ、 ｆｒａｄｉａｅ の形質転換には以下の方法を
用いたニ ゲリシン０．４％の存在下、２９℃においてＴＢＳ培地
中で増殖させた低光学濃度（ＯＤ）の細胞（４０、Ｄ、
単位以下）を用いる。氷上、Ｐ培地中でリゾチームｌ＋
ｌｖ／＋＋＋ｔ’の存在下にプロトプラストを形成させ
、次いでＰ培地で２回洗浄する。１〜３時間冷やした後
、周囲温度に加温する。
用いたニ ゲリシン０．４％の存在下、２９℃においてＴＢＳ培地
中で増殖させた低光学濃度（ＯＤ）の細胞（４０、Ｄ、
単位以下）を用いる。氷上、Ｐ培地中でリゾチームｌ＋
ｌｖ／＋＋＋ｔ’の存在下にプロトプラストを形成させ
、次いでＰ培地で２回洗浄する。１〜３時間冷やした後
、周囲温度に加温する。
ウシ胸腺ＤＮＡ０．８μ２とプロタミン硫酸塩１．５μ
ノを１分間混合した後、Ｐ培地１０μｌ中に懸濁した純
化プラスミドＤＮＡ（１００μ２以下）、希釈したプロ
トプラスト（１／３Ｘ）２００μｌ、および０．９ｍｅ
の５５％ＰＥＧ１００Ｏを加えて１分間混合する。軟寒
天積層を使用し、プロトプラストを平板上に置いて２９
℃で１６〜２４時間インキュベートした後、適当な抗生
物質を積層する。
ノを１分間混合した後、Ｐ培地１０μｌ中に懸濁した純
化プラスミドＤＮＡ（１００μ２以下）、希釈したプロ
トプラスト（１／３Ｘ）２００μｌ、および０．９ｍｅ
の５５％ＰＥＧ１００Ｏを加えて１分間混合する。軟寒
天積層を使用し、プロトプラストを平板上に置いて２９
℃で１６〜２４時間インキュベートした後、適当な抗生
物質を積層する。
２９°Ｃて再度インキュベートし、この平板を７〜１０
日間で評価する。
日間で評価する。
第１図はプラスミドｐＦＪ２５８の制限地図、第２図は
プラスミドｐＬＲ１、ＰＬＲ２およびｐＬＲ４の制限サ
イト地図、第３図はプラスミドＰＦＪ１２７およびｐＦ
Ｊ ２７７の制限サイトおよび機能地図、第４図はプラ
スミドｐＦＪ２７８およびｐＦＪ２７９の制限サイトお
よび機能地図、第５図はプラスミドｐＦＪ２８２の制限
サイトおよび機能地図、第６図はプラスミドＰＦＪ１４
１およびｐＦＪ１４２の制限サイトおよび機能地図、第
７図はプラスミドｐＦＪ２９１およびｐＦＪ２９２の制
限サイトおよび機能地図である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンノでニー 代 理 人 弁理士 青白 葆（ほか１名）ＦＩＧ、Ｉ ＩａＩ ａｌ Ｉ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ｐＦＪ１！７ ｂａ Ｉ ＦＪ２７７ ＦＩＧ、４ ｐＦＪ１！７８ ｐＦＪ２７１ｉ１ ＦＩＧ、５ ｄＩ ｐＦＪ２１１！ ＦＩＧ、６ ｐＦＪ１４２ ＦＩＧ、７ ｐＦＪ２・１ ｐＦＪ２９ｆｆｉ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’ 識別記号庁 （０１２Ｎ １／２０ Ｃ１２Ｒ１：０７） 内整理番号 手続補正書（，５−Ａ） １．事件の表示 、昭和６０年特許願第 ３２０ 万 ２、発明の名称 、 ストレプトマイセス、大腸菌、および関連微生物用
クローニングベクター ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 アメリカ合衆国インディアナ州インディアナポリ
ス市、イースト・マツカーティ・ストリート３０７番６
、補正の対象：明細書の「特許請求の範囲」の欄および
「発明の詳細な説明」の欄 ７、補正の内容 （１）特許請求の範囲の欄を別紙の通り補正します。 （２）発明の詳細な説明の欄を下記の通り補正します。 １〕明細書第５頁第１．７〜８．１０．１６および１８
行、第８頁第６行、第１８頁第５．１１および１５行、
第１９頁第１．５．７，１０，１２および１９行、第２
０頁第８行、第２９頁第８行、第３１頁第６行および下
第３行、第３２頁第６行および下第３行、第３４頁第７
行、第１１頁第２行並ひに第６８頁第２行記載のｒ ５
ｔｒｅｐｔｏｉｎｙｃｅｓ Ｊを「ストレプトマイセス
」と補正する。 ２）第８頁第５行記載の「Ｅ、 ｃｏｌｉ」を「大腸菌
（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｊと補正する。 ３）第９頁第９〜ｌＯ行、第４８買上第５〜下第４行記
載の「Ｎｏｒｔｈｅｒｎ−Ｉｌｌｉｎｏｉｓ 在」を［
ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリイ（Ｎ
ｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ）（ペオリア、イリノイｘ （
Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉｓ ）ｇＪと補正する
。 ４）第９頁第１２〜１３行および第３４頁第１０行記載
のｒＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊを「大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ） Ｊと補正す
る。 ５）第１Ｏ頁第１３および下第２行、第３７頁第１２行
並びに第４２頁第４行記載の「ＴｈｏｍｐｓｏｎＪを「
トンプソン（Ｔｏｍｐｓｏｎ） Ｊと補正する。 ６）第１０頁第１４行、第３７頁第１３行および第４２
頁第４行記載の「Ｎａｔｕｒｅ Ｊを「ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ） Ｊ と補正する。 ７）第１１頁第２行、第１８頁第９．１１．１６および
１７行、第１９頁第１および３行、第５８頁第１４およ
び１４行、第３５頁第４、下第４および下第２行、第１
０頁第１４および１４行、第４１頁第７行、第４４頁第
５行、第５７頁第５゜６．１４および１５行、第５８頁
第１４行、第５９−６０頁第６行、第６２頁下男２行お
よび第６８頁第８行記載のｌ Ｅ、 ｃｏｌｉＪを「大
腸菌」と補正する。 ８）第１１頁第２行記載（７） 「Ｌｏｍｏｕｓｋｙａ
」を「ロモフスカヤ（Ｌｏｍｏｕｓｋａｙａ） Ｊ
、同頁上第３行〜下第２行記載の「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａＪ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｊ を「マイクロバイ
オロジカル・レビュース（Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ） Ｊと補正する。 ９）第２０頁第１１行〜第２８頁第２行記載の［Ｓ 、
Ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ −関連菌株。」 を次文
の通り補正する。 ｒＳ、カナマイセチカス（Ｓ、Ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃ
ｕｓ ） （カナマイシン類）、Ｓ、クレストマイセチ
カス（Ｓ。 ｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅｃｉｃｕｓ ） （アミノシジ
ン）、Ｓ、グリセオフラバｘ （Ｓ、ｇｒｉｓｃｏｆＪ
ａｖｕｓ） （抗生物１１ＭＡ１２６７）、Ｓ、ミクロ
スポレウ７． （Ｓ、ｍ１ｃｒｏｓ−ｐｏｒｅｕｓ ）
（抗生物質５Ｆ−７６７）、Ｓ、リボシジフイカス（Ｓ
、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ ） （抗生物質Ｓ Ｆ
７３３）、５．７ラボペルシカス（Ｓ、ｆＪａｖｏｐ
ｅｒｓｉｃｕｓ ） （７゜ペクチノマイシン）、Ｓ、
スペクタビリス〔Ｓ。 ５ｐｅｃｘａｂｊＪｉｓ ） （７クチノスペクタシン
〕、Ｓ。 リモサス・ホルマ・パロモマイシナス（Ｓ、ｒｉｍｏｓ
ｕｓｆｏｒｍａ ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎｕｓ ）パロ
モマイシン類、カテヌリン）、Ｓ、フラディエ・バー・
イタリカス（Ｓ。 ｆｒａｄｉａｅ ｖａｒ、１ｔａｌｉｃｕｓ ） （７
ミ７ シジン）％Ｓ、プルエンシスロバー９プルエンシ
ス（Ｓ、ｂｌｕｅｎｓｉｓｖａｒ、ｂｌｕｅｎｓｉｓ
）（プルエンソマイシン〕、Ｓ、カテニューレ（Ｓ ｃ
ａｃｅｎｕｌａｅ ） （カナメリン）、Ｓ。 オリボレティキュリ・バー・セルロフィラス（Ｓ。 ｏｌｉｖｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ｖａｒ ｃｅｌｌｕｌｏ
ｐｈｉｌｕｓ ） （デストマイ’、ｔ：ｉＡ）、Ｓ、
７−ネブラリウス（Ｓ、ｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ）（ト
フラマイシン、アブラマイシン天ｓ、ラベンデューレ（
Ｓ、Ｉａｖｅｎｄｕｌａｅ ） （ネオーマイ’／ ｙ
） 、ｓ、ｙタマインン）、Ｓ、バイグロスコピカス
・バーーサガミエンシス（Ｓ 、 ｈｙｇｒｏｓｒｏｐ
ｉｃｕｓ ■、ｓａｇａｍｉｅｎｓｉす（スペクチノマ
イシン）、Ｓ、ビキニエンシス（Ｓ。 ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ ） （ストレプトマイシン）
、Ｓ、グリセウス（Ｓ ｇｒｉｓｅｕｓ ） （ストレ
プトマイシンへＳ、エリスロクロモゲネス・バー・ナル
トエンシフ、 （Ｓ、ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅ
ｎｅｓ ｖａｒ、 ｎａｒｕｔｏｅｎｓｉｓ）（ストレ
プトマイシン）、Ｓ、プールエンシス（ｓ。 ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ ） （ストレプトマイシン）、Ｓ
、ガルバス（Ｓ、 ｇａｌｂｕｓ） （ス）レフトマイ
シン）％ｓ、ラメウＸ （Ｓ、 ｒａｍｅｕｓ ）（ス
トレプトマイシン）、Ｓ、オリバセウス（Ｓ、０１ｉｖ
ａｃｅｕｓ）（ストレフトマイシン〕、Ｓ＋７ シュ、
＝ｃ ンシｘ （Ｓ、ｍａｓｈｕｅｎｓｉｓ） （スト
レプトマイシン）、Ｓ、バイグロスコピカス・バー・リ
モネウス（Ｓ、 ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ
、Ｉｉｍｏｎｅｕｓ ） （バリダマイシン類）、Ｓ、
リモファシエンス（Ｓ。 ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）（デストマイシン）、、Ｓ、
ハイグａスコピカス・ホルマ・グレボサス（Ｓ 、 ｈ
ｙｇｒｏｓｃｏｐｉ −ｃｕｓ ｆｏｒｍａ ’ｇｌｅ
ｂｏｓｕｓ ）（グレボマイシン〕、Ｓ。 フラデイエ（Ｓ、 ｆｒａｄｉａｅ ）（ハイブリマイ
シン類。 、ネオマイシン類〕、５ 、 ｘ −ロ：／シカ、ｚ
（Ｓ、 ｅｕｒｏ−ｃｉｄｉｃｕｓ ） （抗生物質Ａ
１６３１６−Ｃ）、Ｓ。 アクアカナス（Ｓ 、 ａｑｕａｃａｎｕｓ ） （Ｎ
−メチルハイグロマイシンＢ）、Ｓ、クリスタリナス（
Ｓ、ｃｒｙｓ−ｔａＪＪｉｒｔｕｓ ） （ハイグ０フ
ィシ：ｙＡ）、Ｓ、／ポリトエンシス（Ｓ 、 ｎｏｂ
ｏｒｉ ｔｏｅｎｓｊｓ ）（ハイグロマイシン）、Ｓ
、バイグロスコピカス（Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕ
す（ハイグロマイシンｉ）、Ｓ、アトロファシエレｘ
（Ｓ、 ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ）（ハイグロマイシン
）、Ｓ、カスガスビナ７、 （Ｓ、ｋａｓｕｇａｓｐｉ
ｎｕｓ ） （カナマイシン〕、Ｓ、カスガエンシス（
Ｓ、ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ ）（カナマイシン類）、
Ｓ、ネトロブシス（５，ｎｅｔｒｏ−ｐｓｉｓ ）（抗
生物質ＬＬ−ＡＭ３１）、 Ｓ−リビダス（Ｓ、ｌ１ｖ
ｉｃｆｕｓ ）（リビドマイシン類）、Ｓ、、ｔ７エン
シス（Ｓ、ｈｏｆｕｅｎｓｉｓ）（ナルトマイシン複合
体〕、およびＳ、カナメ（Ｓ、ｃａｎｕｓ）（リボシル
パロマミン）。 マクロライド抗生物質を産生し、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には１例えば以下
のようす轍生物の非制限細胞が含まれる；Ｓ、ケレステ
イス（Ｓ、ｃａｅｌｅｓｔｉｓ）（抗生物ｆｆＭ１８８
）、Ｓ、プラテンシス（Ｓ、ｐｌａ−ｔｅｎｓｉｓ）（
プラテンマイシン）、Ｓ、ロツチェイ・バー幸ホルビリ
ス（Ｓ、 ｒｏｃｈｅｉ ｖａｒ、ｖｏｌｕｂｉｌｉｓ
）（抗生物質Ｔ２６３６）、Ｓ、ベネズエレ、（Ｓ、ｖ
ｅｎｅ−ｚｕｅｌａｅ ）（メチマイシンｉ）、Ｓ、グ
リセオフラバス（Ｓ 、 ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ
）（プントリン〕、Ｓ、ナルボネンシス（Ｓ、 ｎａｒ
ｂｏｎｅｎｓｉｓ ） （ジョサマイシン、ナルボネン
シス）、Ｓ、フンジシジカス（Ｓ、ｆｕｎｇｉ−ｃｉｄ
ｉｃｕｓ）（抗生物質ＮＡ−１８１）、Ｓ、グリセオフ
ァシエンス（Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆａｃｉｅｎｓ）（抗生
物質ＰＡ１３３Ａ、Ｂ）、Ｓ、ｏゼオシトレウス（Ｓ、
ｒｏｓｅｏ−ｃｉｔｒｅｕｓ）（・アイボサイタリン）
、Ｓ、プルネオグリセウス（Ｓ、ｂｒｕｎｅｏｇｒｉｓ
ｃ、！１１ｓ ）（７／ｌｚボサイクリン）、Ｓ、ｏゼ
オクロモゲネｘ （Ｓ、ｒｏｓｅｏｅｈｒｏｍｏｇｅｎ
ｅｓ）（フルボサイクリン）、Ｓ、シネロクロモゲネス
（Ｓ。 ｃ ｉｎｅ ｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅ ｓ ） （シ
ラマイシンＢ）、Ｓ、アルプス（Ｓ、ａｌｂｕｓ）（ア
ルボマイセチｙ）、Ｓ、７ルウス（Ｓ、ｆｅｌｌｅｕｓ
）（アルボマイシン、ピクロマイシン〕、Ｓ、ｏツチェ
イ（Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ）（ランカシジン、ボレリジン〕
、Ｓ、ビオラセオニゲル（Ｓ、ｖｉｏｌａ−ｃｅｏｎｉ
ｇｅｒ ）（７ンカシジン）、Ｓ、グリセウス（Ｓ。 ｇｒｉｓｅｕｓ）（ボレリジン）、Ｓ、メゼウス（Ｓ８
ｍａｉｚｅｕｓ）（インゲラマイシン）、Ｓ、アルプス
・バー・コイルマイセチカｘ （Ｓ、ａｌｂｕｓ ｖａ
ｒ、 ｃｏｉｌｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ）（コレイマイシ
ン）、Ｓ、ミカロファシエンス（Ｓ。 ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ ） （アセチルａイコマ
イシン、ニスピノマイシン）、Ｓ、バイグロスコピカス
（Ｓ。 １；１ｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ）Ｃツリマイシン、
レロマイシン、−マリドマイシン、タイロシン、カルボ
マイシン〕。 Ｓ、グリセオスビラリス（Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｓｐｉ）ａ
ｌｉｓ） （し０フイシン）％Ｓ、ラベンジュＬ／ （
Ｓ、Ｉａｖｅｎｄｕｌａｅ）（アルドガマイシ：／）％
Ｓ、リモリス（Ｓ、ｒｉｍａｓｕｓ）（＝ニー）ラマイ
シン）、Ｓ、デルタｘ （Ｓ、ｄｅｌｃａｅ）（デルタ
マイシン類）、Ｓ、ファンジシジカス・バー春エスピノ
マイセチカス（Ｓ、ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ
。 ｅｓｐｉｎｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ）（ｘ スピノマイ
シン類）％ｓ、フルジシジカｘ （Ｓ、ｆｕｒｄｉｃｉ
ｄｉｃｕｓ）（ミデカマイシン）、Ｓ、７ンボ７７ シ
ーｒ−：／ ス（Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ） （７
オロマシジンＤ）、Ｓ、エンロシデイカス（Ｓ、ｅｎｒ
ｏ−ｃｉｄｉｃｕｓ ） （メチマイシン）、Ｓ、グリ
セオラス（ｓ。 ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）（グリセオフラプス）、Ｓ、フラ
ボクロモゲネス（Ｓ ｆｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅ
ｓ ） （ア？＋１ｆｆ フィシン、シリコマイシン類
）、Ｓ、フイムブリアタス（Ｓ、ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ
） （ア７０ フィシン）、Ｓ、ファシキュ７ ス（
Ｓ、ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ）（デフ０フイシン）、Ｓ。 エリスレウス（Ｓ、ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ ） （エリス
ＣＩ７ イレン類）、Ｓ、７ ：／チビオチカス（５，
ａｎｔｉｂｉｏｃｉｃｕｓ ）（オレアンドマイシン）
、Ｓ、オリボクロモケネス（Ｓ、ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｅｓ ） （オレアンドマイシン）、Ｓ、スピ
ニクロモケネス・バー・スラガオエンシス（Ｓ、ｓｐｉ
ｎｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａｒ、ｓｕｒａｇａｏ
ｅｎｓｉｓ ） （クジマイシン類）、Ｓ、キタサトエ
ンシス（Ｓ。 ｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓ ） （ｏイコマイシン）
、Ｓ、ナルボネンシス・バー・ジョサマイセチカス（Ｓ
、ｎａｒｂｏ−ｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｊｏｓａｍｙ
ｃｅｔｉｃｕｓ ） （ｏインマイシンＡ３．ジョサマ
イシン）、Ｓ、アルボグリセオラス（Ｓ、ａｌｂｏｇｒ
ｉｓｅｏｊｕｓ ）（ミコノマイシ：／）、Ｓ、ビキニ
エンシｘ （Ｓ、 ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ ）（ｆ−
Ｖルコ−ｖイ、シ：／）、Ｓ、サーラタス（Ｓ 、 ｃ
ｉｒｒａｔｕｓ ）（シラマイシン）、Ｓ、ジャ力／ｌ
／ ｉ−？’シフ、 （Ｓ、ｄｊａｋａｒｃｅｎｓｉｓ
）にダマイシン）、５．ｔ−リ”ｔ −７７，（Ｓ、ｅ
ｕｒｙ−ｔｈｅｒｍｕｓ ） （アンゴラマイシン）、
Ｓ、フラディエ（Ｓ、ｆｒａｄｉａｅ ） （タイ”
シンｓ ７クテ／シ：／、マクロシン）、Ｓ、ゴシキエ
ンシス（Ｓ 、 ｇｏｓｈｊｋｉｅｎｓｉｓ）（パンダ
マイシン）、Ｓ、グリセオフラプス（Ｓ。 ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ ） （アキュマイシン〕、
Ｓ、ハルス゛テジイ（Ｓ、ｈａｌｓｔｅｄｉす（カルボ
マイシン〕、Ｓ、テンダニ（Ｓ、ｔｅｎｄａｅ ）（カ
ルボマイシン）、５．７クロスポレウス＋（Ｓ、ｍａｃ
ｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）（カルボマイシン〕、Ｓ、サーモ
トレランス（Ｓ、ｔｈｅｒｍｏｃｏｌｅｒａｎｓ ）（
カルボマイシン）、およびＳ、アルビレチキュリ（Ｓ。 ａｌｂｉｒｅ【１Ｃｕ１１）（カルボマイシン）。 β−ラクタム抗生物質を産生じ、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には１例えば以下
のような微生物の非制限細胞が含まれる：Ｓ、リップ？
、＝ （Ｓ 、Ｉ ｉｐｍａｎｉす（Ａ１６８８４、
ＭＭ４５５０．ＭＭ１３９０２）、Ｓ、タラブリゲラｘ
（Ｓ 、 ｃｌａｖｕｌ ｉｇｅｒｕｓ ）（Ａ １
５８８６ Ｂ、クラプラン酸）、Ｓ、ラクタムデユラン
ス（Ｓ 、 Ｉａｃｃａｍｄｕｒａｎｓ ） （セフ７
フイシンＣ）％Ｓ、グリセウス（Ｓ ６ｇｒｉｓｅｕｓ
） （セファマイシンＡ１Ｂ）、Ｓ 、バイグロスコ
ピカス（Ｓ 、 ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）（デア
セトキシセファロスポリンＣ）、Ｓ、ワダヤマｘ ンシ
ス（Ｓ、ｗａｄａｙａｍｅｎｓｉｓ ） （ＷＳ −３
４４２−Ｄ）、Ｓ、チャートレウシス（Ｓ 、 ｃｈａ
ｒｔｒｅｕｓｉｓ ） 。 （ＳＦ１６２３）、Ｓ、ヘテロモルフ７ ス（Ｓ 、
ｈｅｔｅｒｏ−ｍｏｒｐｈｕｓ ）およびＳ、パナｘ
ンシ７． （Ｓ 、 ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ）（Ｃ２０
８１Ｘ ） ｉ ”−シナモネ：／ シス； （Ｓ 、
ｃｉｎｎａ−ｍｏｎｅｎｓｉｓ ）、Ｓ、フィシン゛す
７／７ ス（Ｓ 、 ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ入Ｓ 、
ハ／ｌ／ステジ（Ｓ、ｈａｌｓｔｅｄｉｉ）％Ｓ、ａ７
チェイ（Ｓ 、ｒｏｃｈｅｉ）およびＳ、ビリドクａモ
ゲネス（Ｓ。 ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）（セファマイシ
ンＡ、Ｂ）Ｓ、カトレヤ； （Ｓ、ｃａｔｔｌｅｙａ
）（チ、ｘ−ｊ−マイシン）；およびＳ、オリバセウス
（Ｓ 、 ｏｌ １ｖａｃｅｕｓ） ％Ｓ、フラボビレ
ンス（Ｓ 、 ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎｓ ） 、Ｓ 、
７ラハ７、 （Ｓ 、 ｆＪａｖｕｓ）、Ｓ、フルボビ
リシス（Ｓ。 ｆｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉｓ ） 、Ｓ 、７ ／Ｌ／ゲ
、／７オラス（Ｓ 、ａｒｇｅｎ−ｔｅｏｌｕｓ ）お
よびＳ、シオヤエンシス（Ｓ 、 ５ｉｏｙａ−ｅｎｓ
ｉｓ ） （ＭＭ４５５０およびＭＭ１３９０２）。 ポリエーテル抗生物質を産生じ、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には１例えば以下
のような微生物の非制限細胞が含まれる：Ｓ、アルプス
（Ｓ 、 ａｌｂｕｓ）（Ａ２０４、Ａ２８６９５Ａお
よびＢ、サリノマイシン）、Ｓ、バイグロスコピカス（
Ｓ 、ｈｙｇｒｏｓｅｏｐｉｃｕｓ） （Ａ ２１８ｓ
エメリシト、ＤＥ３９３６、Ａ１２０Ａ、Ａ２８６９５
ＡおよびＢ、エテロマイシン、ジアネマイシン）、Ｓ、
グリセウス（Ｓ 、 ｇｒｉｓｅｕｓ）（クリツリキシ
ン）、Ｓ、：＋ングロハタｘ （Ｓ 、 ｃｏｎｇｌｏ
ｂａｔｕｓ ） （イオノマイシン）、 Ｓ、ユーロシ
ジカス・バー ・アステロシジカｘ （Ｓ 、 ｅｕｒ
ｏｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ、ａｓｔｅｒｏｃｉｄｉｃｕ
ｓ）（ライドロマイシン）、Ｓ、ラサリエンシス（Ｓ。 Ｉａｓａｌｉｅｎｓｉｓ （ラサロシド）、Ｓ、リボシ
ジフイカＸ （Ｓ 、 ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ
）（ｏ ／ フィシン）、Ｓ、カカオ俸ペー・アソエン
シス（Ｓ、ｃａｃａｏｉ ｖａｒ、ａｓｏ−ｅｎｓｉｓ
） （ライソセリン〕、Ｓ、シナモネンシス（（Ｓ
、ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ ） （モネンシン）、
Ｓ、オーレオファシェンス（Ｓ 、 ａｕｒｅｏｆａｃ
ｉｅｎｓ ）（ナラジン〕、Ｓ＃ガリナリウｘ （Ｓ
、 ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｓ ） （ＲＰ ３０５０４
）、Ｓ、ロングウツデンシス（Ｓ 、 Ｉｏｎｇｗｏｏ
ｄｅｎｓｉｓ）（ライソセリン）、Ｓ＋フラベオラス（
Ｓ、ｆｌａｖｅｏ−Ｉｕｓ ）（ＣＰ３８９３６）、Ｓ
、ムタビリス（５０ｍｕｔａ−ｂｉｌｌｉｓ ）（Ｓ−
１１７４３１）、およびＳ、ビオラセオニゲル（Ｓ、ｖ
ｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ）（＝ゲリシン）。 グリコペプチド抗生物質を産生じ１本発明に係るベクタ
ーを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいスト
レプトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には１例えば以
下のような微生物の非制限細胞が含まれる：Ｓ、オリエ
ンタリス（Ｓ 、 ｏｒｉｅｎｃａ −１ｉｓ）および
Ｓ、ハラツマジエンシス（Ｓ、ｈａｒａｎＯｍａ−ｃｈ
ｉｅｎｓｉｓ ） （バンコマイシン）％Ｓ、カンジダ
ス（Ｓ、ｃａｎｄｉｄｕｓ ） （Ａ −３５５１２、
ア ボッくルーシン〕、およびＳ、ｘブロスポレウｙ、
（Ｓ 、ｅｂｕｒｏ−ｓｐｏｒｅｕｓ ） （Ｌ Ｌ
−ＡＭ３７４ ）およびＳ、）Ｅカエンシス（Ｓ、ｔ
ｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ）（Ａ４７９３１１ ）。 本発明に係るベクターを特に有用に使用でき。 −形質転換できる、その他の好ましいストレプトマイセ
スの非制限菌株宿主細胞には、例えば以下のような微生
物の非制限細胞が含まれる：Ｓ、フエ１ノカラー（Ｓ
、ｃｏｅｌ １ｃｏｌｏｒ） 、Ｓ 、グラニｌ 口）
レ−）＜−（Ｓ １ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｃｒ ） 、
Ｓ 、ロゼオスポーラス（Ｓ、ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ
） 、Ｓ 、リビダンス（５，１ｉｖｉｄａｎｓ）＋
Ｓ、テネブラリウ７． （Ｓ 、 ｔｅｎｅｂｒａｒｉ
ｕｓ ）、Ｓ、アクリマイシンス（Ｓ 、 ａｃｒｉｍ
ｙｃｉｎｓ ）、Ｓ、グラウセ゛ンセ：ｙ ス（Ｓ、
ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ ） 、 Ｓ 、パルビリン（
−５゜ｐａｒｖｉｌｉｎ） 、Ｓ 、ブリスチネスピラ
リ７． （Ｓ 、 ｐｒｉｓｔｉ −ｎａｅｓｐｉｒａ
ｌｉｓ ） 、 Ｓ 、ビオラセオル−バー （Ｓ 、
ｖｉｏｌａ−ｃｅｏｒｕｂｅｒ ）、Ｓ、ビナセウス（
５、ｖｉｎａｃｅｕｓ） 。 Ｓ、バーギ＝ ｘ （Ｓ 、 ｖｉｒｇｉｎｉａｅ ）
、 Ｓ 、ニスピノサス（ｓ 、ｅｓｐｉｎｏｓｕｓ
）およびＳ、アズレウス（５，ａｚｕ−ｒｅｕｓ ）
。 上記の代表的なストレプトマイセス宿主細胞に加えて、
本発明に係るベクターは、例えば以下のようなその簡の
種類の非制限菌株に有用に使用でき、かつ細胞中に形質
転換できる：バチルス（Ｂａｃｉ−１１ｕｓ ）、スタ
フイロコツカ７． （５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）
、およびストレプトスポランギウム（Ｓｔｒｅｐｔｏ−
ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ）、アクチノプラネス（Ａｃｔ
ｉｎｏｐｌａｏｅｓ）％ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ
）およびミクロモノスポーラ（Ｍｉｃｒｏｒｎｏｎｏｓ
ｐｏｒａ ）を含むアクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｃｅｓ ）関連菌株。」１０〕第２８頁第１１行
、第４８頁第１２および第１５〜１６行、第６２頁第４
行、第５１頁下第２行、第５２頁第１０行および上第３
行、第５４頁＄６〜７行、第６２頁第４行、第５８頁第
７〜８行並びに第６２頁第４行記載のｒ Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ Ｊを「ストレプ
トマイセス・アンボッアシｘ シス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ） Ｊと補正する
。 １１）第２８頁第１２．１３．１５％１６．１６〜１７
および１７行、第２８頁末行〜第２９頁第１行、第２９
頁第１．２〜３．４および５行、第４８頁第１３行、第
４５頁第７行、第５１頁末行。 第５２頁第１１行、第４５頁第７行、第５７頁下第２行
、第５８頁第８〜９行、第６２頁第１２および１３行並
びに第６４頁第５．５〜６および６行記載の［Ｓ、ａｍ
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ Ｊ並びに第６２頁第５行記載の「
Ｓ 、 ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｃｅ ｆ；−［ストレプ
トマイセス拳アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ）」と補正する。 １２）第３８頁第５〜第１１行記載の「Ｎｅｗ・・・在
）。」を１次文の通り補正する。 「ニューイングランド・バイオ・ラボス（ＮｅｗＥｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｄｓ、）、 Ｉｎｃ、 （３２
）ザー、ｏ−ド、ヘハリー、マサチューセツ７ （Ｔｏ
ｚｅｒ Ｒｏａｄ 。 Ｂｅｖａｒｌｙ％Ｍａｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ）０１９
１５在）、ベーリンガーーマンハイム・バイオケミカル
ス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ） （７９４１キヤツスルウエイ
・ドライブ（Ｃａｓ、ｔｌｅｗａｙ Ｄｒｉｖｅ ）
Ｐ、０．Ｂｏｘ５０８１６、インディアナポリス、イン
ディアナ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ％Ｉｎｄｉａｎ
ａ） ４５２５ Ｑ在）、およびベセスダ・リサーチ・
ラボラトリイズ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ） Ｉ ｎｃ 、 （８７１
７グローブモント・＋Ｉ−−クル（Ｇｒｏｖｅｍｏｎｃ
Ｃ１ｒｃｌｅ ） 、Ｐ、Ｏ。 Ｂｏｘ５７７、ガイザーバーグ、メリーランド（Ｇａｉ
ｔｈｅｒｂｕｒｇ 、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ） ２０７
６０在）。」１３）第４０頁第２〜５行記載の「Ｎｅｗ
・・・在）」を［ニューイングランド・バイオ・ラボス
（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ、）、Ｉｎ
ｃ、（３２１−ザー・ロード、ヘハリー、マサチュー
セフ ７ （Ｔｏｚｅｒ Ｒｄ、、Ｂｅｖｅｒｌｙ。 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ）Ｑ ｌ ９ ｌ ５在
）、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイズ（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ Ｒｅ５ｅｒｅｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）
（Ｐ ＯＢｏｘ ５７７ 、ガイザースバーグ、メリ
ー７ ン）−（Ｇａｉｃｈｅｒｓｂｕｒｇ 、 Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ）２０７６０在）」と補正する。 １４）第４０頁第１５行記載の［ＢｏＪｉｖａｒ Ｊを
「ボリμ（Ｂｏｌｉｖａｒ） Ｊ、「Ｇｅｎｅ」を「ジ
ーン、 （Ｇｅｎｅ） Ｊとそれぞれ補正する。 １ １５）第４１頁第１１行記載の「Ｂｅｒｔａｎｉ」を「
ハータニイ（Ｂｅｒｔａｎｉ） Ｊ、 「Ｊ 、 Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙＪを「ジャーナル・オブ・バタテ
リオロジイ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ −〇１０ｇγ）」と
それぞれ補正する。 １６）第４０頁第２〜下第４行記載の「Ｍｉｌｌｅｒ・
・Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｊを「ミラー、１９７２．エクス
ペリメンツΦイン・モレキュラー・ジエネテイツクス、
コールド・スプリング・ハーバ−、ラボラトリイ、ス、
コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（Ｍｉ
ｌｌｅｒ 、１９７２、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ
Ｍｏｌｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｂｏｒＬａｂｓ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ％Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） Ｊと補正
する。 １７）第４５頁第７行記載の「Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉ。 Ｌａｂ」ヲ「ニュー自イングランド会バイオ・ラボ（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂ ） Ｊト補正
する。 １８）第４５頁第１３行〜１５行記載の「Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、−Ｙｏｒｋ ） Ｊを「マニアテイス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ ）ら（１９８２モレキユラー・クローニン
グ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイズ
、コールド−スフリングｅハーバ−、ニューヨーク（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ 、 Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ ） ） Ｊと補正する。 １９）第４５頁第７行、第４５頁第７行および第５０頁
第１２行記載の「Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｊを［マニアテイ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ） Ｊと補正する。 ２０）第４７頁第１１〜１３行記載の「Ｈｏｐｗｏｏｄ
・・・Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｊを「ホップウッド（Ｈｏｐ
ｗｏｏｄ ）およびライト（Ｗｒ ｉ ｇｈす、１９７
８、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・ジェネ
ラル・ジエネテイツクス（１，Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａ
ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」と補正す
る。 ２１）第５８頁第８〜下第５行記載の「ＳｉｇＩＴｌａ
・・・在）Ｊをｒシグマ（Ｓｉｇｍａ）（セント・ルイ
ス、ミズリイ（Ｓｔ、 Ｌｏｕｉｓ・、Ｍｉｓｓｏｕｒ
ｉ ）在）」と補正する。 ２２）第５９〜第６０頁第７〜８行記載の「Ｎｏｒｔｈ
ｅｒｎ・・・ｌ１ｌｉｎｏｉｓ 」を「ノーザン・リー
ジョナル・り今一チ・ラボラトリイ、ペオリア、イリノ
イス（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅ
ａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 、 Ｐｅｏ−ｒｉａ
、 ｌＮ１ｎｏｉｓ） Ｊと補正する。 ２３）第６４頁第１１〜１３行記載の［Ｎｅｗ −＝
０１９１５）Ｊをｒニューイングランド・バイオ・ラボ
ス・インコーホレイテッド（３２トザー・ロード、ベバ
リイ、マサチューセッツ０１９１５）Ｊと補正する。 ２４）第６４頁第１４行〜第１６行記載の［Ｃｒｅａ・
１０５６）Ｊを［Ｃｒｅａ（フレア〕ら（１９７８、
プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
イー オブ・サイｘ ７ ス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｃｌ、Ａ
ｃａｄ。 Ｓｃｉ、）、ＵＳＡ、、７５：５７６５）およびイタク
ラ（Ｉｔａｋｕｒａ ）ら（１９７７、サイ−Ｔ−ｙ
ス（Ｓｅｉｅｎｃｅ）１９８ ：１０５６）Ｊ と補正
する。 ２５）第６８頁第３〜５行記載の［ａｍｂｏｆａｃｉｅ
ｎｓ −・−ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ Ｊを「アンボフ
ァシエンス（ａｍｂｏ−ｆａｃｉｅｎｓ）、オーレオ７
７ シ：ｒ−ン７． （ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎ’す、
グリセオフスカス（ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ） 、フ
ラデイエ（ｆｒａｄｉａｅ ）＊、リビダ：／ ｘ （
Ｉｉｖｉｄａｎｓ） 、グラエユ。 ／ｌ／−バー （ｇｒａｎｕｌ’ｏｒｕｂｅｒ ） 、
テネブラリウス（ｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ ）、シナモ
ネンシス（ｃｉｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）またはトヨ力エ
ンシス（【０γｏｃａｅｎｓｉｓ ） Ｊと補正する。 ２６〕第６８頁第１３行記載の「Ｓ 、 ｆｒａｄｉａ
ｅ Ｊを「Ｓ、フラデイｘ （Ｓ、 ｆｒａｄｉａｅ
） Ｊと補正する。 以上 （８リ ４Ｃ（） ２、特許請求の範囲 １、ａ〕プラスミドＰＪＦ２５８の機能的複製起源含有
制限フラグメント、および ｂ〕形質転換、細胞分裂および培養可能な感受性かつ非
制限的大腸菌またはストレプトマイセス宿主細胞中に導
入した時、少なくとも１つの抗生物質に対する耐性を付
与するｌまたはそれ以上のＤ Ｎ Ａセグメント。 を含有する組換えＤＮＡクローニングベクター。 ２、ＰＦＪ２５８の制限フラグメントが〜３．５４ｋｂ
ＳａＪＩ−Ｂｃｌ （制限フラグメントである第１項に
記載のベクター。 ３、ｐＦＪ２５８の制限フラグメントが〜２．８５ｋｂ
ＢａｍＨＩ−Ｂｃｌ制限フラグメントである第１項に記
載のベクター。 ４、ＰＦＪ２５８ の制限フラグメントが〜２．２３ｋ
ｂＫｂａＩ−Ｂｃｌ■制限フラグメントである第１項に
記載のベクター。 ５、プラスミドＰＦＪ １２７．ｐＦＪ２７７、ｐＦＪ
２７８゜ＰＦＪ２７９．ＰＦＪ２８０．ＰＦＪ２８１．
ＰＦＪ２８２、ＰＦＪ２８３．ＰＦＪ２８４、ＰＦＪ２
９１．ＰＦＪ２９２、ｐＦＪ２９３．ｐＦＪ２９４、ｐ
ＦＪ２９５、ｐＦＪ２９６゜ＰＦＪ２９７％ＰＦＪ２９
８．ＰＦＪ２９９％ｐＦＪ３００゜ｐＦＪ３０３、また
はｐＦＪ３０４ である第１項に記載のベクター。 ６、第１項に記載のベクターであって、更にり大腸菌プ
ラスミドの機能的なレプリコン含有フラグメント、 を含有する組換えＤＮＡクローニングベクター。 ７、大腸・菌プラスミドの機能的なレプリコン含有フラ
グメントかプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５また
はＰＢＲ３２８のフラグメントである第６項にｔ己載の
ベクター。 ８、プラスミドｐＦＪ１４１．ｐＦＪ１４２、ｐＦＪ２
８５゜ＰＦＪ２８６．ＰＦＪ２８７．ｐＦＪ２８８、Ｐ
ＦＪ２８９ また 。 はＰＦＪ２９０ である第７項に記載のベクター。 ９、第１項〜第８項のいずれかに記載の組換えＤＭＡク
ローニングベクターを含んでいる形質転換された非制限
的宿主細胞。 ＰＦＪ１２７ である第１０項に記載の形質転換された
宿主細胞。 １２、ノカルジアである第９項に記載の宿主細胞。 １３、バチルスである第９項に記載の宿主細胞。 １４、 第６項〜第８項のいずれかに記載のベクターを
含有する、形質転換された非制限的大腸菌宿主細胞、好
ましくはに１２株の宿主細胞。 １５、大腸菌に１２／ｐＦＪ１４１ である第１４項に
記載の形質転換された宿主細胞。 １６、大腸菌に１２／ｐＦＪ１４２である第１４項に記
載の形質転換された宿主細胞。 １７、プ５ｙ、 ミ）−ｐＦＪ２５８の〜３．６４ｋｂ
５ａｌＩ−Ｂｃｌ ｉ制限フラグメント。 詔、プラスミドｐＦＪ２５８の〜２．Ｂ ５ ｋ ｂ
Ｂａｍ−１１−Ｂｃｌ（制限フラグメント。 １９、プラスミ）−ｐＦＪ２５８ の〜２．２３ｋｂ
Ｘｂａ■−Ｂｃｌ■制限フラグメント。
プラスミドｐＬＲ１、ＰＬＲ２およびｐＬＲ４の制限サ
イト地図、第３図はプラスミドＰＦＪ１２７およびｐＦ
Ｊ ２７７の制限サイトおよび機能地図、第４図はプラ
スミドｐＦＪ２７８およびｐＦＪ２７９の制限サイトお
よび機能地図、第５図はプラスミドｐＦＪ２８２の制限
サイトおよび機能地図、第６図はプラスミドＰＦＪ１４
１およびｐＦＪ１４２の制限サイトおよび機能地図、第
７図はプラスミドｐＦＪ２９１およびｐＦＪ２９２の制
限サイトおよび機能地図である。 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンノでニー 代 理 人 弁理士 青白 葆（ほか１名）ＦＩＧ、Ｉ ＩａＩ ａｌ Ｉ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ｐＦＪ１！７ ｂａ Ｉ ＦＪ２７７ ＦＩＧ、４ ｐＦＪ１！７８ ｐＦＪ２７１ｉ１ ＦＩＧ、５ ｄＩ ｐＦＪ２１１！ ＦＩＧ、６ ｐＦＪ１４２ ＦＩＧ、７ ｐＦＪ２・１ ｐＦＪ２９ｆｆｉ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’ 識別記号庁 （０１２Ｎ １／２０ Ｃ１２Ｒ１：０７） 内整理番号 手続補正書（，５−Ａ） １．事件の表示 、昭和６０年特許願第 ３２０ 万 ２、発明の名称 、 ストレプトマイセス、大腸菌、および関連微生物用
クローニングベクター ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 アメリカ合衆国インディアナ州インディアナポリ
ス市、イースト・マツカーティ・ストリート３０７番６
、補正の対象：明細書の「特許請求の範囲」の欄および
「発明の詳細な説明」の欄 ７、補正の内容 （１）特許請求の範囲の欄を別紙の通り補正します。 （２）発明の詳細な説明の欄を下記の通り補正します。 １〕明細書第５頁第１．７〜８．１０．１６および１８
行、第８頁第６行、第１８頁第５．１１および１５行、
第１９頁第１．５．７，１０，１２および１９行、第２
０頁第８行、第２９頁第８行、第３１頁第６行および下
第３行、第３２頁第６行および下第３行、第３４頁第７
行、第１１頁第２行並ひに第６８頁第２行記載のｒ ５
ｔｒｅｐｔｏｉｎｙｃｅｓ Ｊを「ストレプトマイセス
」と補正する。 ２）第８頁第５行記載の「Ｅ、 ｃｏｌｉ」を「大腸菌
（Ｅ、ｃｏｌｉ） Ｊと補正する。 ３）第９頁第９〜ｌＯ行、第４８買上第５〜下第４行記
載の「Ｎｏｒｔｈｅｒｎ−Ｉｌｌｉｎｏｉｓ 在」を［
ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリイ（Ｎ
ｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ）（ペオリア、イリノイｘ （
Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌｉｎｏｉｓ ）ｇＪと補正する
。 ４）第９頁第１２〜１３行および第３４頁第１０行記載
のｒＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊを「大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ） Ｊと補正す
る。 ５）第１Ｏ頁第１３および下第２行、第３７頁第１２行
並びに第４２頁第４行記載の「ＴｈｏｍｐｓｏｎＪを「
トンプソン（Ｔｏｍｐｓｏｎ） Ｊと補正する。 ６）第１０頁第１４行、第３７頁第１３行および第４２
頁第４行記載の「Ｎａｔｕｒｅ Ｊを「ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ） Ｊ と補正する。 ７）第１１頁第２行、第１８頁第９．１１．１６および
１７行、第１９頁第１および３行、第５８頁第１４およ
び１４行、第３５頁第４、下第４および下第２行、第１
０頁第１４および１４行、第４１頁第７行、第４４頁第
５行、第５７頁第５゜６．１４および１５行、第５８頁
第１４行、第５９−６０頁第６行、第６２頁下男２行お
よび第６８頁第８行記載のｌ Ｅ、 ｃｏｌｉＪを「大
腸菌」と補正する。 ８）第１１頁第２行記載（７） 「Ｌｏｍｏｕｓｋｙａ
」を「ロモフスカヤ（Ｌｏｍｏｕｓｋａｙａ） Ｊ
、同頁上第３行〜下第２行記載の「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａＪ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｊ を「マイクロバイ
オロジカル・レビュース（Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ） Ｊと補正する。 ９）第２０頁第１１行〜第２８頁第２行記載の［Ｓ 、
Ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ −関連菌株。」 を次文
の通り補正する。 ｒＳ、カナマイセチカス（Ｓ、Ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃ
ｕｓ ） （カナマイシン類）、Ｓ、クレストマイセチ
カス（Ｓ。 ｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅｃｉｃｕｓ ） （アミノシジ
ン）、Ｓ、グリセオフラバｘ （Ｓ、ｇｒｉｓｃｏｆＪ
ａｖｕｓ） （抗生物１１ＭＡ１２６７）、Ｓ、ミクロ
スポレウ７． （Ｓ、ｍ１ｃｒｏｓ−ｐｏｒｅｕｓ ）
（抗生物質５Ｆ−７６７）、Ｓ、リボシジフイカス（Ｓ
、ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ ） （抗生物質Ｓ Ｆ
７３３）、５．７ラボペルシカス（Ｓ、ｆＪａｖｏｐ
ｅｒｓｉｃｕｓ ） （７゜ペクチノマイシン）、Ｓ、
スペクタビリス〔Ｓ。 ５ｐｅｃｘａｂｊＪｉｓ ） （７クチノスペクタシン
〕、Ｓ。 リモサス・ホルマ・パロモマイシナス（Ｓ、ｒｉｍｏｓ
ｕｓｆｏｒｍａ ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎｕｓ ）パロ
モマイシン類、カテヌリン）、Ｓ、フラディエ・バー・
イタリカス（Ｓ。 ｆｒａｄｉａｅ ｖａｒ、１ｔａｌｉｃｕｓ ） （７
ミ７ シジン）％Ｓ、プルエンシスロバー９プルエンシ
ス（Ｓ、ｂｌｕｅｎｓｉｓｖａｒ、ｂｌｕｅｎｓｉｓ
）（プルエンソマイシン〕、Ｓ、カテニューレ（Ｓ ｃ
ａｃｅｎｕｌａｅ ） （カナメリン）、Ｓ。 オリボレティキュリ・バー・セルロフィラス（Ｓ。 ｏｌｉｖｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ｖａｒ ｃｅｌｌｕｌｏ
ｐｈｉｌｕｓ ） （デストマイ’、ｔ：ｉＡ）、Ｓ、
７−ネブラリウス（Ｓ、ｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ）（ト
フラマイシン、アブラマイシン天ｓ、ラベンデューレ（
Ｓ、Ｉａｖｅｎｄｕｌａｅ ） （ネオーマイ’／ ｙ
） 、ｓ、ｙタマインン）、Ｓ、バイグロスコピカス
・バーーサガミエンシス（Ｓ 、 ｈｙｇｒｏｓｒｏｐ
ｉｃｕｓ ■、ｓａｇａｍｉｅｎｓｉす（スペクチノマ
イシン）、Ｓ、ビキニエンシス（Ｓ。 ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ ） （ストレプトマイシン）
、Ｓ、グリセウス（Ｓ ｇｒｉｓｅｕｓ ） （ストレ
プトマイシンへＳ、エリスロクロモゲネス・バー・ナル
トエンシフ、 （Ｓ、ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅ
ｎｅｓ ｖａｒ、 ｎａｒｕｔｏｅｎｓｉｓ）（ストレ
プトマイシン）、Ｓ、プールエンシス（ｓ。 ｐｏｏｌｅｎｓｉｓ ） （ストレプトマイシン）、Ｓ
、ガルバス（Ｓ、 ｇａｌｂｕｓ） （ス）レフトマイ
シン）％ｓ、ラメウＸ （Ｓ、 ｒａｍｅｕｓ ）（ス
トレプトマイシン）、Ｓ、オリバセウス（Ｓ、０１ｉｖ
ａｃｅｕｓ）（ストレフトマイシン〕、Ｓ＋７ シュ、
＝ｃ ンシｘ （Ｓ、ｍａｓｈｕｅｎｓｉｓ） （スト
レプトマイシン）、Ｓ、バイグロスコピカス・バー・リ
モネウス（Ｓ、 ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ
、Ｉｉｍｏｎｅｕｓ ） （バリダマイシン類）、Ｓ、
リモファシエンス（Ｓ。 ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）（デストマイシン）、、Ｓ、
ハイグａスコピカス・ホルマ・グレボサス（Ｓ 、 ｈ
ｙｇｒｏｓｃｏｐｉ −ｃｕｓ ｆｏｒｍａ ’ｇｌｅ
ｂｏｓｕｓ ）（グレボマイシン〕、Ｓ。 フラデイエ（Ｓ、 ｆｒａｄｉａｅ ）（ハイブリマイ
シン類。 、ネオマイシン類〕、５ 、 ｘ −ロ：／シカ、ｚ
（Ｓ、 ｅｕｒｏ−ｃｉｄｉｃｕｓ ） （抗生物質Ａ
１６３１６−Ｃ）、Ｓ。 アクアカナス（Ｓ 、 ａｑｕａｃａｎｕｓ ） （Ｎ
−メチルハイグロマイシンＢ）、Ｓ、クリスタリナス（
Ｓ、ｃｒｙｓ−ｔａＪＪｉｒｔｕｓ ） （ハイグ０フ
ィシ：ｙＡ）、Ｓ、／ポリトエンシス（Ｓ 、 ｎｏｂ
ｏｒｉ ｔｏｅｎｓｊｓ ）（ハイグロマイシン）、Ｓ
、バイグロスコピカス（Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕ
す（ハイグロマイシンｉ）、Ｓ、アトロファシエレｘ
（Ｓ、 ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ）（ハイグロマイシン
）、Ｓ、カスガスビナ７、 （Ｓ、ｋａｓｕｇａｓｐｉ
ｎｕｓ ） （カナマイシン〕、Ｓ、カスガエンシス（
Ｓ、ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ ）（カナマイシン類）、
Ｓ、ネトロブシス（５，ｎｅｔｒｏ−ｐｓｉｓ ）（抗
生物質ＬＬ−ＡＭ３１）、 Ｓ−リビダス（Ｓ、ｌ１ｖ
ｉｃｆｕｓ ）（リビドマイシン類）、Ｓ、、ｔ７エン
シス（Ｓ、ｈｏｆｕｅｎｓｉｓ）（ナルトマイシン複合
体〕、およびＳ、カナメ（Ｓ、ｃａｎｕｓ）（リボシル
パロマミン）。 マクロライド抗生物質を産生し、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には１例えば以下
のようす轍生物の非制限細胞が含まれる；Ｓ、ケレステ
イス（Ｓ、ｃａｅｌｅｓｔｉｓ）（抗生物ｆｆＭ１８８
）、Ｓ、プラテンシス（Ｓ、ｐｌａ−ｔｅｎｓｉｓ）（
プラテンマイシン）、Ｓ、ロツチェイ・バー幸ホルビリ
ス（Ｓ、 ｒｏｃｈｅｉ ｖａｒ、ｖｏｌｕｂｉｌｉｓ
）（抗生物質Ｔ２６３６）、Ｓ、ベネズエレ、（Ｓ、ｖ
ｅｎｅ−ｚｕｅｌａｅ ）（メチマイシンｉ）、Ｓ、グ
リセオフラバス（Ｓ 、 ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ
）（プントリン〕、Ｓ、ナルボネンシス（Ｓ、 ｎａｒ
ｂｏｎｅｎｓｉｓ ） （ジョサマイシン、ナルボネン
シス）、Ｓ、フンジシジカス（Ｓ、ｆｕｎｇｉ−ｃｉｄ
ｉｃｕｓ）（抗生物質ＮＡ−１８１）、Ｓ、グリセオフ
ァシエンス（Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｆａｃｉｅｎｓ）（抗生
物質ＰＡ１３３Ａ、Ｂ）、Ｓ、ｏゼオシトレウス（Ｓ、
ｒｏｓｅｏ−ｃｉｔｒｅｕｓ）（・アイボサイタリン）
、Ｓ、プルネオグリセウス（Ｓ、ｂｒｕｎｅｏｇｒｉｓ
ｃ、！１１ｓ ）（７／ｌｚボサイクリン）、Ｓ、ｏゼ
オクロモゲネｘ （Ｓ、ｒｏｓｅｏｅｈｒｏｍｏｇｅｎ
ｅｓ）（フルボサイクリン）、Ｓ、シネロクロモゲネス
（Ｓ。 ｃ ｉｎｅ ｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅ ｓ ） （シ
ラマイシンＢ）、Ｓ、アルプス（Ｓ、ａｌｂｕｓ）（ア
ルボマイセチｙ）、Ｓ、７ルウス（Ｓ、ｆｅｌｌｅｕｓ
）（アルボマイシン、ピクロマイシン〕、Ｓ、ｏツチェ
イ（Ｓ、ｒｏｃｈｅｉ）（ランカシジン、ボレリジン〕
、Ｓ、ビオラセオニゲル（Ｓ、ｖｉｏｌａ−ｃｅｏｎｉ
ｇｅｒ ）（７ンカシジン）、Ｓ、グリセウス（Ｓ。 ｇｒｉｓｅｕｓ）（ボレリジン）、Ｓ、メゼウス（Ｓ８
ｍａｉｚｅｕｓ）（インゲラマイシン）、Ｓ、アルプス
・バー・コイルマイセチカｘ （Ｓ、ａｌｂｕｓ ｖａ
ｒ、 ｃｏｉｌｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ）（コレイマイシ
ン）、Ｓ、ミカロファシエンス（Ｓ。 ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ ） （アセチルａイコマ
イシン、ニスピノマイシン）、Ｓ、バイグロスコピカス
（Ｓ。 １；１ｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ）Ｃツリマイシン、
レロマイシン、−マリドマイシン、タイロシン、カルボ
マイシン〕。 Ｓ、グリセオスビラリス（Ｓ、ｇｒｉｓｅｏｓｐｉ）ａ
ｌｉｓ） （し０フイシン）％Ｓ、ラベンジュＬ／ （
Ｓ、Ｉａｖｅｎｄｕｌａｅ）（アルドガマイシ：／）％
Ｓ、リモリス（Ｓ、ｒｉｍａｓｕｓ）（＝ニー）ラマイ
シン）、Ｓ、デルタｘ （Ｓ、ｄｅｌｃａｅ）（デルタ
マイシン類）、Ｓ、ファンジシジカス・バー春エスピノ
マイセチカス（Ｓ、ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ
。 ｅｓｐｉｎｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ）（ｘ スピノマイ
シン類）％ｓ、フルジシジカｘ （Ｓ、ｆｕｒｄｉｃｉ
ｄｉｃｕｓ）（ミデカマイシン）、Ｓ、７ンボ７７ シ
ーｒ−：／ ス（Ｓ、ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ） （７
オロマシジンＤ）、Ｓ、エンロシデイカス（Ｓ、ｅｎｒ
ｏ−ｃｉｄｉｃｕｓ ） （メチマイシン）、Ｓ、グリ
セオラス（ｓ。 ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）（グリセオフラプス）、Ｓ、フラ
ボクロモゲネス（Ｓ ｆｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅ
ｓ ） （ア？＋１ｆｆ フィシン、シリコマイシン類
）、Ｓ、フイムブリアタス（Ｓ、ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ
） （ア７０ フィシン）、Ｓ、ファシキュ７ ス（
Ｓ、ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ）（デフ０フイシン）、Ｓ。 エリスレウス（Ｓ、ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ ） （エリス
ＣＩ７ イレン類）、Ｓ、７ ：／チビオチカス（５，
ａｎｔｉｂｉｏｃｉｃｕｓ ）（オレアンドマイシン）
、Ｓ、オリボクロモケネス（Ｓ、ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｅｓ ） （オレアンドマイシン）、Ｓ、スピ
ニクロモケネス・バー・スラガオエンシス（Ｓ、ｓｐｉ
ｎｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｖａｒ、ｓｕｒａｇａｏ
ｅｎｓｉｓ ） （クジマイシン類）、Ｓ、キタサトエ
ンシス（Ｓ。 ｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓ ） （ｏイコマイシン）
、Ｓ、ナルボネンシス・バー・ジョサマイセチカス（Ｓ
、ｎａｒｂｏ−ｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｊｏｓａｍｙ
ｃｅｔｉｃｕｓ ） （ｏインマイシンＡ３．ジョサマ
イシン）、Ｓ、アルボグリセオラス（Ｓ、ａｌｂｏｇｒ
ｉｓｅｏｊｕｓ ）（ミコノマイシ：／）、Ｓ、ビキニ
エンシｘ （Ｓ、 ｂｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ ）（ｆ−
Ｖルコ−ｖイ、シ：／）、Ｓ、サーラタス（Ｓ 、 ｃ
ｉｒｒａｔｕｓ ）（シラマイシン）、Ｓ、ジャ力／ｌ
／ ｉ−？’シフ、 （Ｓ、ｄｊａｋａｒｃｅｎｓｉｓ
）にダマイシン）、５．ｔ−リ”ｔ −７７，（Ｓ、ｅ
ｕｒｙ−ｔｈｅｒｍｕｓ ） （アンゴラマイシン）、
Ｓ、フラディエ（Ｓ、ｆｒａｄｉａｅ ） （タイ”
シンｓ ７クテ／シ：／、マクロシン）、Ｓ、ゴシキエ
ンシス（Ｓ 、 ｇｏｓｈｊｋｉｅｎｓｉｓ）（パンダ
マイシン）、Ｓ、グリセオフラプス（Ｓ。 ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ ） （アキュマイシン〕、
Ｓ、ハルス゛テジイ（Ｓ、ｈａｌｓｔｅｄｉす（カルボ
マイシン〕、Ｓ、テンダニ（Ｓ、ｔｅｎｄａｅ ）（カ
ルボマイシン）、５．７クロスポレウス＋（Ｓ、ｍａｃ
ｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）（カルボマイシン〕、Ｓ、サーモ
トレランス（Ｓ、ｔｈｅｒｍｏｃｏｌｅｒａｎｓ ）（
カルボマイシン）、およびＳ、アルビレチキュリ（Ｓ。 ａｌｂｉｒｅ【１Ｃｕ１１）（カルボマイシン）。 β−ラクタム抗生物質を産生じ、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には１例えば以下
のような微生物の非制限細胞が含まれる：Ｓ、リップ？
、＝ （Ｓ 、Ｉ ｉｐｍａｎｉす（Ａ１６８８４、
ＭＭ４５５０．ＭＭ１３９０２）、Ｓ、タラブリゲラｘ
（Ｓ 、 ｃｌａｖｕｌ ｉｇｅｒｕｓ ）（Ａ １
５８８６ Ｂ、クラプラン酸）、Ｓ、ラクタムデユラン
ス（Ｓ 、 Ｉａｃｃａｍｄｕｒａｎｓ ） （セフ７
フイシンＣ）％Ｓ、グリセウス（Ｓ ６ｇｒｉｓｅｕｓ
） （セファマイシンＡ１Ｂ）、Ｓ 、バイグロスコ
ピカス（Ｓ 、 ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）（デア
セトキシセファロスポリンＣ）、Ｓ、ワダヤマｘ ンシ
ス（Ｓ、ｗａｄａｙａｍｅｎｓｉｓ ） （ＷＳ −３
４４２−Ｄ）、Ｓ、チャートレウシス（Ｓ 、 ｃｈａ
ｒｔｒｅｕｓｉｓ ） 。 （ＳＦ１６２３）、Ｓ、ヘテロモルフ７ ス（Ｓ 、
ｈｅｔｅｒｏ−ｍｏｒｐｈｕｓ ）およびＳ、パナｘ
ンシ７． （Ｓ 、 ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ）（Ｃ２０
８１Ｘ ） ｉ ”−シナモネ：／ シス； （Ｓ 、
ｃｉｎｎａ−ｍｏｎｅｎｓｉｓ ）、Ｓ、フィシン゛す
７／７ ス（Ｓ 、 ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ入Ｓ 、
ハ／ｌ／ステジ（Ｓ、ｈａｌｓｔｅｄｉｉ）％Ｓ、ａ７
チェイ（Ｓ 、ｒｏｃｈｅｉ）およびＳ、ビリドクａモ
ゲネス（Ｓ。 ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）（セファマイシ
ンＡ、Ｂ）Ｓ、カトレヤ； （Ｓ、ｃａｔｔｌｅｙａ
）（チ、ｘ−ｊ−マイシン）；およびＳ、オリバセウス
（Ｓ 、 ｏｌ １ｖａｃｅｕｓ） ％Ｓ、フラボビレ
ンス（Ｓ 、 ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎｓ ） 、Ｓ 、
７ラハ７、 （Ｓ 、 ｆＪａｖｕｓ）、Ｓ、フルボビ
リシス（Ｓ。 ｆｕｌｖｏｖｉｒｉｄｉｓ ） 、Ｓ 、７ ／Ｌ／ゲ
、／７オラス（Ｓ 、ａｒｇｅｎ−ｔｅｏｌｕｓ ）お
よびＳ、シオヤエンシス（Ｓ 、 ５ｉｏｙａ−ｅｎｓ
ｉｓ ） （ＭＭ４５５０およびＭＭ１３９０２）。 ポリエーテル抗生物質を産生じ、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には１例えば以下
のような微生物の非制限細胞が含まれる：Ｓ、アルプス
（Ｓ 、 ａｌｂｕｓ）（Ａ２０４、Ａ２８６９５Ａお
よびＢ、サリノマイシン）、Ｓ、バイグロスコピカス（
Ｓ 、ｈｙｇｒｏｓｅｏｐｉｃｕｓ） （Ａ ２１８ｓ
エメリシト、ＤＥ３９３６、Ａ１２０Ａ、Ａ２８６９５
ＡおよびＢ、エテロマイシン、ジアネマイシン）、Ｓ、
グリセウス（Ｓ 、 ｇｒｉｓｅｕｓ）（クリツリキシ
ン）、Ｓ、：＋ングロハタｘ （Ｓ 、 ｃｏｎｇｌｏ
ｂａｔｕｓ ） （イオノマイシン）、 Ｓ、ユーロシ
ジカス・バー ・アステロシジカｘ （Ｓ 、 ｅｕｒ
ｏｃｉｄｉｃｕｓ ｖａｒ、ａｓｔｅｒｏｃｉｄｉｃｕ
ｓ）（ライドロマイシン）、Ｓ、ラサリエンシス（Ｓ。 Ｉａｓａｌｉｅｎｓｉｓ （ラサロシド）、Ｓ、リボシ
ジフイカＸ （Ｓ 、 ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ
）（ｏ ／ フィシン）、Ｓ、カカオ俸ペー・アソエン
シス（Ｓ、ｃａｃａｏｉ ｖａｒ、ａｓｏ−ｅｎｓｉｓ
） （ライソセリン〕、Ｓ、シナモネンシス（（Ｓ
、ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ ） （モネンシン）、
Ｓ、オーレオファシェンス（Ｓ 、 ａｕｒｅｏｆａｃ
ｉｅｎｓ ）（ナラジン〕、Ｓ＃ガリナリウｘ （Ｓ
、 ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｓ ） （ＲＰ ３０５０４
）、Ｓ、ロングウツデンシス（Ｓ 、 Ｉｏｎｇｗｏｏ
ｄｅｎｓｉｓ）（ライソセリン）、Ｓ＋フラベオラス（
Ｓ、ｆｌａｖｅｏ−Ｉｕｓ ）（ＣＰ３８９３６）、Ｓ
、ムタビリス（５０ｍｕｔａ−ｂｉｌｌｉｓ ）（Ｓ−
１１７４３１）、およびＳ、ビオラセオニゲル（Ｓ、ｖ
ｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ）（＝ゲリシン）。 グリコペプチド抗生物質を産生じ１本発明に係るベクタ
ーを特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいスト
レプトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には１例えば以
下のような微生物の非制限細胞が含まれる：Ｓ、オリエ
ンタリス（Ｓ 、 ｏｒｉｅｎｃａ −１ｉｓ）および
Ｓ、ハラツマジエンシス（Ｓ、ｈａｒａｎＯｍａ−ｃｈ
ｉｅｎｓｉｓ ） （バンコマイシン）％Ｓ、カンジダ
ス（Ｓ、ｃａｎｄｉｄｕｓ ） （Ａ −３５５１２、
ア ボッくルーシン〕、およびＳ、ｘブロスポレウｙ、
（Ｓ 、ｅｂｕｒｏ−ｓｐｏｒｅｕｓ ） （Ｌ Ｌ
−ＡＭ３７４ ）およびＳ、）Ｅカエンシス（Ｓ、ｔ
ｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ）（Ａ４７９３１１ ）。 本発明に係るベクターを特に有用に使用でき。 −形質転換できる、その他の好ましいストレプトマイセ
スの非制限菌株宿主細胞には、例えば以下のような微生
物の非制限細胞が含まれる：Ｓ、フエ１ノカラー（Ｓ
、ｃｏｅｌ １ｃｏｌｏｒ） 、Ｓ 、グラニｌ 口）
レ−）＜−（Ｓ １ｇｒａｎｕｌｏｒｕｂｃｒ ） 、
Ｓ 、ロゼオスポーラス（Ｓ、ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ
） 、Ｓ 、リビダンス（５，１ｉｖｉｄａｎｓ）＋
Ｓ、テネブラリウ７． （Ｓ 、 ｔｅｎｅｂｒａｒｉ
ｕｓ ）、Ｓ、アクリマイシンス（Ｓ 、 ａｃｒｉｍ
ｙｃｉｎｓ ）、Ｓ、グラウセ゛ンセ：ｙ ス（Ｓ、
ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ ） 、 Ｓ 、パルビリン（
−５゜ｐａｒｖｉｌｉｎ） 、Ｓ 、ブリスチネスピラ
リ７． （Ｓ 、 ｐｒｉｓｔｉ −ｎａｅｓｐｉｒａ
ｌｉｓ ） 、 Ｓ 、ビオラセオル−バー （Ｓ 、
ｖｉｏｌａ−ｃｅｏｒｕｂｅｒ ）、Ｓ、ビナセウス（
５、ｖｉｎａｃｅｕｓ） 。 Ｓ、バーギ＝ ｘ （Ｓ 、 ｖｉｒｇｉｎｉａｅ ）
、 Ｓ 、ニスピノサス（ｓ 、ｅｓｐｉｎｏｓｕｓ
）およびＳ、アズレウス（５，ａｚｕ−ｒｅｕｓ ）
。 上記の代表的なストレプトマイセス宿主細胞に加えて、
本発明に係るベクターは、例えば以下のようなその簡の
種類の非制限菌株に有用に使用でき、かつ細胞中に形質
転換できる：バチルス（Ｂａｃｉ−１１ｕｓ ）、スタ
フイロコツカ７． （５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）
、およびストレプトスポランギウム（Ｓｔｒｅｐｔｏ−
ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ）、アクチノプラネス（Ａｃｔ
ｉｎｏｐｌａｏｅｓ）％ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ
）およびミクロモノスポーラ（Ｍｉｃｒｏｒｎｏｎｏｓ
ｐｏｒａ ）を含むアクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｃｅｓ ）関連菌株。」１０〕第２８頁第１１行
、第４８頁第１２および第１５〜１６行、第６２頁第４
行、第５１頁下第２行、第５２頁第１０行および上第３
行、第５４頁＄６〜７行、第６２頁第４行、第５８頁第
７〜８行並びに第６２頁第４行記載のｒ Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ Ｊを「ストレプ
トマイセス・アンボッアシｘ シス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ） Ｊと補正する
。 １１）第２８頁第１２．１３．１５％１６．１６〜１７
および１７行、第２８頁末行〜第２９頁第１行、第２９
頁第１．２〜３．４および５行、第４８頁第１３行、第
４５頁第７行、第５１頁末行。 第５２頁第１１行、第４５頁第７行、第５７頁下第２行
、第５８頁第８〜９行、第６２頁第１２および１３行並
びに第６４頁第５．５〜６および６行記載の［Ｓ、ａｍ
ｂｏｆａｃｉｅｎｓ Ｊ並びに第６２頁第５行記載の「
Ｓ 、 ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｃｅ ｆ；−［ストレプ
トマイセス拳アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ ）」と補正する。 １２）第３８頁第５〜第１１行記載の「Ｎｅｗ・・・在
）。」を１次文の通り補正する。 「ニューイングランド・バイオ・ラボス（ＮｅｗＥｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｄｓ、）、 Ｉｎｃ、 （３２
）ザー、ｏ−ド、ヘハリー、マサチューセツ７ （Ｔｏ
ｚｅｒ Ｒｏａｄ 。 Ｂｅｖａｒｌｙ％Ｍａｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ）０１９
１５在）、ベーリンガーーマンハイム・バイオケミカル
ス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ） （７９４１キヤツスルウエイ
・ドライブ（Ｃａｓ、ｔｌｅｗａｙ Ｄｒｉｖｅ ）
Ｐ、０．Ｂｏｘ５０８１６、インディアナポリス、イン
ディアナ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ％Ｉｎｄｉａｎ
ａ） ４５２５ Ｑ在）、およびベセスダ・リサーチ・
ラボラトリイズ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ） Ｉ ｎｃ 、 （８７１
７グローブモント・＋Ｉ−−クル（Ｇｒｏｖｅｍｏｎｃ
Ｃ１ｒｃｌｅ ） 、Ｐ、Ｏ。 Ｂｏｘ５７７、ガイザーバーグ、メリーランド（Ｇａｉ
ｔｈｅｒｂｕｒｇ 、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ） ２０７
６０在）。」１３）第４０頁第２〜５行記載の「Ｎｅｗ
・・・在）」を［ニューイングランド・バイオ・ラボス
（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ、）、Ｉｎ
ｃ、（３２１−ザー・ロード、ヘハリー、マサチュー
セフ ７ （Ｔｏｚｅｒ Ｒｄ、、Ｂｅｖｅｒｌｙ。 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ）Ｑ ｌ ９ ｌ ５在
）、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイズ（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ Ｒｅ５ｅｒｅｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）
（Ｐ ＯＢｏｘ ５７７ 、ガイザースバーグ、メリ
ー７ ン）−（Ｇａｉｃｈｅｒｓｂｕｒｇ 、 Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ）２０７６０在）」と補正する。 １４）第４０頁第１５行記載の［ＢｏＪｉｖａｒ Ｊを
「ボリμ（Ｂｏｌｉｖａｒ） Ｊ、「Ｇｅｎｅ」を「ジ
ーン、 （Ｇｅｎｅ） Ｊとそれぞれ補正する。 １ １５）第４１頁第１１行記載の「Ｂｅｒｔａｎｉ」を「
ハータニイ（Ｂｅｒｔａｎｉ） Ｊ、 「Ｊ 、 Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙＪを「ジャーナル・オブ・バタテ
リオロジイ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ −〇１０ｇγ）」と
それぞれ補正する。 １６）第４０頁第２〜下第４行記載の「Ｍｉｌｌｅｒ・
・Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｊを「ミラー、１９７２．エクス
ペリメンツΦイン・モレキュラー・ジエネテイツクス、
コールド・スプリング・ハーバ−、ラボラトリイ、ス、
コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（Ｍｉ
ｌｌｅｒ 、１９７２、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ
Ｍｏｌｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｂｏｒＬａｂｓ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ％Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） Ｊと補正
する。 １７）第４５頁第７行記載の「Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉ。 Ｌａｂ」ヲ「ニュー自イングランド会バイオ・ラボ（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂ ） Ｊト補正
する。 １８）第４５頁第１３行〜１５行記載の「Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、−Ｙｏｒｋ ） Ｊを「マニアテイス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ ）ら（１９８２モレキユラー・クローニン
グ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイズ
、コールド−スフリングｅハーバ−、ニューヨーク（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ 、 Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ ） ） Ｊと補正する。 １９）第４５頁第７行、第４５頁第７行および第５０頁
第１２行記載の「Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｊを［マニアテイ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ） Ｊと補正する。 ２０）第４７頁第１１〜１３行記載の「Ｈｏｐｗｏｏｄ
・・・Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｊを「ホップウッド（Ｈｏｐ
ｗｏｏｄ ）およびライト（Ｗｒ ｉ ｇｈす、１９７
８、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・ジェネ
ラル・ジエネテイツクス（１，Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａ
ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」と補正す
る。 ２１）第５８頁第８〜下第５行記載の「ＳｉｇＩＴｌａ
・・・在）Ｊをｒシグマ（Ｓｉｇｍａ）（セント・ルイ
ス、ミズリイ（Ｓｔ、 Ｌｏｕｉｓ・、Ｍｉｓｓｏｕｒ
ｉ ）在）」と補正する。 ２２）第５９〜第６０頁第７〜８行記載の「Ｎｏｒｔｈ
ｅｒｎ・・・ｌ１ｌｉｎｏｉｓ 」を「ノーザン・リー
ジョナル・り今一チ・ラボラトリイ、ペオリア、イリノ
イス（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅ
ａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 、 Ｐｅｏ−ｒｉａ
、 ｌＮ１ｎｏｉｓ） Ｊと補正する。 ２３）第６４頁第１１〜１３行記載の［Ｎｅｗ −＝
０１９１５）Ｊをｒニューイングランド・バイオ・ラボ
ス・インコーホレイテッド（３２トザー・ロード、ベバ
リイ、マサチューセッツ０１９１５）Ｊと補正する。 ２４）第６４頁第１４行〜第１６行記載の［Ｃｒｅａ・
１０５６）Ｊを［Ｃｒｅａ（フレア〕ら（１９７８、
プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
イー オブ・サイｘ ７ ス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｃｌ、Ａ
ｃａｄ。 Ｓｃｉ、）、ＵＳＡ、、７５：５７６５）およびイタク
ラ（Ｉｔａｋｕｒａ ）ら（１９７７、サイ−Ｔ−ｙ
ス（Ｓｅｉｅｎｃｅ）１９８ ：１０５６）Ｊ と補正
する。 ２５）第６８頁第３〜５行記載の［ａｍｂｏｆａｃｉｅ
ｎｓ −・−ｔｏｙｏｃａｅｎｓｉｓ Ｊを「アンボフ
ァシエンス（ａｍｂｏ−ｆａｃｉｅｎｓ）、オーレオ７
７ シ：ｒ−ン７． （ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎ’す、
グリセオフスカス（ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ） 、フ
ラデイエ（ｆｒａｄｉａｅ ）＊、リビダ：／ ｘ （
Ｉｉｖｉｄａｎｓ） 、グラエユ。 ／ｌ／−バー （ｇｒａｎｕｌ’ｏｒｕｂｅｒ ） 、
テネブラリウス（ｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ ）、シナモ
ネンシス（ｃｉｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）またはトヨ力エ
ンシス（【０γｏｃａｅｎｓｉｓ ） Ｊと補正する。 ２６〕第６８頁第１３行記載の「Ｓ 、 ｆｒａｄｉａ
ｅ Ｊを「Ｓ、フラデイｘ （Ｓ、 ｆｒａｄｉａｅ
） Ｊと補正する。 以上 （８リ ４Ｃ（） ２、特許請求の範囲 １、ａ〕プラスミドＰＪＦ２５８の機能的複製起源含有
制限フラグメント、および ｂ〕形質転換、細胞分裂および培養可能な感受性かつ非
制限的大腸菌またはストレプトマイセス宿主細胞中に導
入した時、少なくとも１つの抗生物質に対する耐性を付
与するｌまたはそれ以上のＤ Ｎ Ａセグメント。 を含有する組換えＤＮＡクローニングベクター。 ２、ＰＦＪ２５８の制限フラグメントが〜３．５４ｋｂ
ＳａＪＩ−Ｂｃｌ （制限フラグメントである第１項に
記載のベクター。 ３、ｐＦＪ２５８の制限フラグメントが〜２．８５ｋｂ
ＢａｍＨＩ−Ｂｃｌ制限フラグメントである第１項に記
載のベクター。 ４、ＰＦＪ２５８ の制限フラグメントが〜２．２３ｋ
ｂＫｂａＩ−Ｂｃｌ■制限フラグメントである第１項に
記載のベクター。 ５、プラスミドＰＦＪ １２７．ｐＦＪ２７７、ｐＦＪ
２７８゜ＰＦＪ２７９．ＰＦＪ２８０．ＰＦＪ２８１．
ＰＦＪ２８２、ＰＦＪ２８３．ＰＦＪ２８４、ＰＦＪ２
９１．ＰＦＪ２９２、ｐＦＪ２９３．ｐＦＪ２９４、ｐ
ＦＪ２９５、ｐＦＪ２９６゜ＰＦＪ２９７％ＰＦＪ２９
８．ＰＦＪ２９９％ｐＦＪ３００゜ｐＦＪ３０３、また
はｐＦＪ３０４ である第１項に記載のベクター。 ６、第１項に記載のベクターであって、更にり大腸菌プ
ラスミドの機能的なレプリコン含有フラグメント、 を含有する組換えＤＮＡクローニングベクター。 ７、大腸・菌プラスミドの機能的なレプリコン含有フラ
グメントかプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５また
はＰＢＲ３２８のフラグメントである第６項にｔ己載の
ベクター。 ８、プラスミドｐＦＪ１４１．ｐＦＪ１４２、ｐＦＪ２
８５゜ＰＦＪ２８６．ＰＦＪ２８７．ｐＦＪ２８８、Ｐ
ＦＪ２８９ また 。 はＰＦＪ２９０ である第７項に記載のベクター。 ９、第１項〜第８項のいずれかに記載の組換えＤＭＡク
ローニングベクターを含んでいる形質転換された非制限
的宿主細胞。 ＰＦＪ１２７ である第１０項に記載の形質転換された
宿主細胞。 １２、ノカルジアである第９項に記載の宿主細胞。 １３、バチルスである第９項に記載の宿主細胞。 １４、 第６項〜第８項のいずれかに記載のベクターを
含有する、形質転換された非制限的大腸菌宿主細胞、好
ましくはに１２株の宿主細胞。 １５、大腸菌に１２／ｐＦＪ１４１ である第１４項に
記載の形質転換された宿主細胞。 １６、大腸菌に１２／ｐＦＪ１４２である第１４項に記
載の形質転換された宿主細胞。 １７、プ５ｙ、 ミ）−ｐＦＪ２５８の〜３．６４ｋｂ
５ａｌＩ−Ｂｃｌ ｉ制限フラグメント。 詔、プラスミドｐＦＪ２５８の〜２．Ｂ ５ ｋ ｂ
Ｂａｍ−１１−Ｂｃｌ（制限フラグメント。 １９、プラスミ）−ｐＦＪ２５８ の〜２．２３ｋｂ
Ｘｂａ■−Ｂｃｌ■制限フラグメント。
Claims (1)
- １．３）プラスミドＰＪＦ２５８の機能的複製起源含有
制限フラグメント、および ｂ）形質転換、細胞分裂および培養可能な感受性かつ非
制限的Ｅ、ｃｏｌｉまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿
主細胞中に導入した時、少な胸中も１つの抗生物質に対
する耐性を付与する１またはそれ以上のＤＮＡセグメン
ト、 を含有する組換えＤＮＡクローニングベクターっ２、ｐ
ＦＪ２５８の制限フラグメントが〜３．６４ｋｂＳａｌ
Ｉ−Ｂｃｌ ■制限フラグメントである第１項に記載
のベクター。 ３、 ｐ 、Ｆ Ｊ ２５ｇの制限フラグメントが〜２
．８５ｋｂＢａｍＨｉ −Ｂｃｌ 工制限フラグメント
である第１項に記載のベクター。 ４、ＰＦＪ２５８の制限フラグメントが〜２．２３ ｋ
ｂＸｂａ Ｉ−Ｂｃｌ 工制限フラグメントである第１
項に記載のベクター。 ５、プラスミドｐＦＪ１２７、ＰＦＪ２７７、ｐＦＪ２
７８、ＰＦＪ２７９、ｐＦＪ２８０、ｐＦＪ２８１、ｐ
ＦＪ２８２、ＰＦＪ２８３、ｐＦＪ２８４、ｐＦＪ２９
１、ＰＦＪ２９２、Ｐ）’Ｊ２９３、ｐＦＪ２９４、ｐ
ＦＪ２９ｓ、ＰＦＪ２９６、ｐＦＪ２９７、ｐＦＪ２９
８、ｐＦＪ２９９、ｐＦＪ３００、ＰＦＪ３０３、また
はｐＦＪ３０４である第１項に記載のベクター。 ６第１項に記載のベクターであって、更にｃ） Ｅ、ｃ
ｏｌｉプラスミドの機能的なレプリコン含有フラグメン
ト、 を含有する組換えＤＮＡクローニングベクター。 ７、 Ｅ、 ｃｏｌ ｉプラスミドの機能的なレプリコ
ン含有フラグメントかプラスミドＰＢＲ３２２、ｐＢＲ
３２５またはＰＢＲ３２８のフラグメントである第６項
に記載のベクター。 ８、プラスミドｐＦＪ１４１、ＰＦＪ１４２、ｐＦＪ２
８５、ＰＦＪ２８６、ｐＦＪ２８７、ｐＦＪ２８Ｂ、ｐ
ＦＪ２８９ またはｐＦＪ ２９０である第７項に記載
のベクター。 ９、第１項〜第８項のいずれかに記載の組換えＤＮＡク
ローニングベクターを含んでいる形質転換された非制限
的宿主細胞。 １０、５ｔｒｅ、、ｐｔｏｍｙｃｅｓ 、好ましくはそ
の種かｆｒａｄｉａｅ、 ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、
ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、 ａｍｂｏｆａ−ｃｉｅｎｓ
、 １ｉｖｉｄａｎｓ１ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、
ｃｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ。 ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ 、またはｔｏｙｏｃａｅ
ｎｓｉｓである第９− 項に記載の宿主細胞。 １１、 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉ
ｅｎｓ／ｐＦＪ１２７である第１０項に記載の形質転換
された宿主細胞。 １２、Ｎｏｃａｒｄｉａ である第９項に記載の宿主細
胞。 １３、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ である第９項に記載の宿主
細胞。 １４、第６項〜第８項のいずれかに記載のベクターを含
有する、形質転換された非制限的Ｅ、ｃｏｌｉ宿主細胞
、好ましくはに１２株の宿主細胞。 １５、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２／ＰＦＪ１４１ である第
１４項に記載の形質転換された宿主細胞。 １６、Ｅ、ｃｏＨＫ１２／ＰＦＪ１４２である第１４項
に記載の形質転換された宿主細胞。 １７、プラスミドＰＦＪ２５８ （７）〜３．６４ｋｂ
Ｓａｌ ニーＢｃｌ Ｉ制限フラグメント。 １８、プラスミドＰＦＪ２５８の〜２．８５ ｋｂ Ｂ
ａｍＨＩ−Ｂｃｌｉ制限フラグメント。 １９ プラスミドＰＦＪ２５８（Ｄ 〜２．２３ｋｂＸ
ｂａ■−Ｂｃｌ ■制限フラグメント。
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