JPH01503753A

JPH01503753A - 豚のマイコプラズマ感染診断に有用なポリペプチド及びそれを製造するための組換えｄｎａ法

Info

Publication number: JPH01503753A
Application number: JP62504592A
Authority: JP
Inventors: クンナー，ジェリイ，エム
Original assignee: サイナーゲン，インコーポレーテッド
Priority date: 1986-07-25
Filing date: 1987-07-22
Publication date: 1989-12-21
Also published as: DE3751727T2; HU208550B; ATE135048T1; AU7784687A; EP0315637B1; EP0315637A1; DK160888D0; WO1988000977A1; IL83324A0; AU622855B2; EP0315637A4; HUT52819A; DK160888A; DE3751727D1; IL83324A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】豚のマイコプラズマ感染診断に有用なポリペプチド及びそれを製造するための組換えＤＮＡ＠発明の背景本発明は、動物、特に豚でのマイコプラズマに対する抗体の存在を測定する診断に有用なポリペプチドに関する。また本発明は、このポリペプチドを製造するための組換えＤＮＡ法及び該組換え法に有用なりＮＡ配列を含む組換えファージクローンに関する。

豚のウィルス性肝炎、感染性肝炎、前葉肝炎、風土病ウィルス肝炎、マイコプラズマ肝炎などとして知られている風土性の豚肝炎によって死に到ることはまれであるが、しかしながらこれらの疾患はしばしば重篤な症状となり、それによって体重の減少が起る。

元来、これらの疾患はウィルスによって引き起こされると考えられてはいたが、１９６５年にこれらの病原体はＨｙｃｏｐｌａｓｍａ　５ｕｉＤｎｅｕｌＯｎｉａｅとしても知られているＨｙＣＯｐｌａＳ＋ａａ　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅであることが明らかにされた。

これらの疾患は、感染した豚から排出される浮遊微生物が他の豚の轡へ浸入して豚から豚へと伝染するものである。マイコプラズマは肺くの先端及び６葉に生息し、紫色または灰色の組ｔＩｉｉ変を生ぜ、しめ、・呼吸１困灘及び体重減少を引き起こす。Ｈ，ｈｙｏｐｒｅｕｌｏｎｉａｅによる一次感染に続いて、バクテリア病原体（Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌ　ｌａ及びＢｏｒｄａｔｅｌｌａ種）並びに他のマイコプラズマ種（Ｈ，ｈｙｏｒｈｉｎｕｓ及びＭ、　ｆｌｏｃｕｌａｒｅ）による第二次感染が起こる。

マイコプラズマは、バクテリアよりもそのｓｉは簡単で少さいがウィルスよりは１Ｍ９＠な原核１１１ｗ１の１つである。

ウィルスとは違って、マイコプラズマはしばしば真核細胞と一緒に見出されるがそれ自身独自に存在することができる。マイコプラズマは、細胞壁ではなく細胞膜と結合する。マイコプラズマはその長さが約７５０．０００塩基対の非常に小さなゲノムを有している。

マイコプラズマによって引き起こされる疾患は致命的となることはあまりないが、それによって、家畜として市場へ供給される動物の成長が抑制され体重減少が引き起こされる。従って、マイコプラズマに感染した動物は、感染していない動物に比べて、市場に供給される際には経済的価値が低下したものとなる。

このように豚肝炎によって経済的に重要な結果が生じるため、豚でのＨｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の存在を診断するテスト法がめられていた。

本発明者は、Ｈｙｃｏｐ＋ａｓｍａ　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びある種の他のマイクプラズマの感染の診断に有用なポリペプチドを見出した。このポリペプチドをｉｎ　ＶｉｔｒＯ診断に用いることによって、感染した豚の血清におけるある種のマイコプラズマに対する・抗舊の存在を測定することができる。

また本発明は、これらのポリペブチ１ドの利用を促進するための、該ポリペプチドの製造用の組換えＤＮＡ法に関する。この組換えＤＮＡ法は、本明細書において記載される各種の組換えファージクローン中に含有されるＤＮＡ配列を利用するものである。

発明の要旨本発明の目的は、豚のマイコプラズマ感染、特にＨｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の診断に有用なポリペプチドを提供することにある。

本発明の他の目的は、これらポリペプチドの製造のための組換えＤＮＡ法を提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は以下の記載によって明らかにされており、また本発明の実例からも明らかとなるであろう。これらの利点及び目的は、請求の範囲において指摘されている手段及び組合わせによって實現され達成される。

本発明の目的を達成するため、そしてまた本発明の目的により、プロティンＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥが記載されいる。これらの蛋白質の一部分に対応するＤＮＡが、本発明において同定される各種のラムダファージ中に含まれている。

更には、マイコプラズマ表面蛋白と類似したポリペプチドを製造するための組換えＤＮＡ法についても記載される。この蛋白質は、ＨｙＣＯｐｌａＳＩｌａ　ｈｙｏｐｎｅｕｉｏｎ；ａｅ及び他のある種のマイコプラズマに感染した豚の血清にさらした時に、診断用免疫複合体を創製する能力を有している。

本発明の組換えＤＮＡ法は、（２）マイコプラズマによって産生されるポリペプチドが有する抗原特性と類似した抗原特性を有するポリペプチドを宿主微生物に産生させることの出来るＤＮＡ配列を？Ａ製し：０該ＤＮＡ配列のためのオペレーションエレメントを含有するベクターであって、宿主１甥に導入されそこで複製することの出来るベクターに、該ＤＮＡ配列をクローニングし：（へ）かくして得られる該ＤＮＡ配列及びオペレーションエレメントを含むベクターを、抗原性ポリペプチドを発現することの出来る宿主微生物中に導入し：ゆ該ベクターの増幅及びポリペプチドの発現に適当な条件下で該宿主微生物を培養し：（ｅ）次いで、（１）ポリペプチドを回収する、及び！ｉｉｌポリペプチドの構造を推定して、マイコプラズマによって産生されるポリペプチドが有する抗原特性と類似した抗原特性を有するポリペプチドを同定する、ことをいずれかの順序で行なう：ことからなる。

上記した一般的記述及び以下に述べる詳細な記載は例示にすぎず、クレームされた本発明を限定するものではない。

好ましい態様の詳細な配ト以下に本発明の好ましい態様について詳細に記述する。

これらの記載並びに図面及び実例によって本発明の詳細な説明される。

上記したように、本発明は、特に、豚のマイコプラズマ感染のｉｎ　ＶｉｔｒＯ診断に有用なポリペプチドに関する。

実質的に精製されたこれらの蛋白は、肝組織中に存在した時には免疫応答を誘導することが出来ると考えられる各種のＨｙｃｏｐｌａｓｓａ　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ蛋白と類似した蛋白である。類似抗原に対しても感染した豚では免疫応答が誘導されることから、感染した豚の血清中には、本発明のポリペプチドの１つもしくはそれ以上を認識する抗体が含まれているものと考えられる。しかして、本発明のそれぞれのポリペプチドあるいはその組合わせが、豚の血清中での各種のマイコプラズマ種に対する抗体の存在を測定するｉｎ　ＶｉｔｒＯ診断法に用いる要素となり得る。

本明細書において蛋白、抗原又はポリペプチドに関連して用いる“類似”と言う用品は、天然のマイコプラズマ蛋白の感染に応答して産生される抗体を検出する能力を有するポリペプチドを意味する。類似の抗原特性を有するポリペプチドは、天然のマイコプラズマ蛋白に対しである程度の相同性を有していると考えられる。本明細書において用いる“類似”ポリペプチドとは、天然のマイコプラズマ蛋白によって誘導される免疫応答よりも強いあるいはそれと同じあるいは弱い免疫応答を誘導することの出来るポリペプチドを意味する。

以下に示す実質的に純粋な形態の蛋白がｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断に有用であることが本発明者によって見出された。かかる蛋白としては、Ｈ，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１０５ｋｄ蛋白であるプロティンＡ、　Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの９０　ｋｄｌ白であるプロティンＢ　、　Ｈ，ｈｙｏｐｎｅｕｉｏｎｉａｅの８５ｋｄ蛋白であるプロティンＣ，Ｈ，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの７０ｋｄ蛋白であるプロティンＤ１及びＨ，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの４３ｋｄ蛋白であるプロティンＥがある。これらの蛋白の分子量は絶対的な値ではない。

プロティンＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥのそれぞれは、マイコプラズマの表面上に存在する蛋白の１つである。インタクトのマイコプラズマ細胞をプロテアーゼくトリプシン）でわずかに処理した場合には、これらの蛋白のそれぞれがプロテアーゼ消化に対して感受性を示し、従ってこれらの蛋白は細胞表面上に存在していることが示唆される。

更には、これらの蛋白のそれぞれが、マイコプラズマで感染した豚の血清中に存在する抗体の少なくとも１つに結合することの出来る抗原デターミナントとして１つもしくはそれ以上の特異的部分を有している。これらの抗原性を有する特異的部分が、それぞれ単独であるいは他との組合せで、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断法に用いる要素となることが出来る。

これらの蛋白部分をコードするＤＮＡ配列は、本発明によって同定されたラムダ０ｔ１１クローン上に含まれている。全蛋白をコードするＤＮＡ配列は、このクローンが得られた同じｇｔ１１ライブラリー中に含まれており、そのようなりＮＡ配列を含むクローンの同定及び単離法は以下に記述する。

ポリペプチドＡ（１０５ｋｄ）をコードする遺伝子部分は、１．５キロベースのマイコプラズマＤＮＡの挿入配列を含むラムダＱｔ１１クローンＲ６０ｂ上に含まれている。この断片は、践挿入配列ではなくフランキングベクター配列を切断する制限酵素Ｋｐｎ１及び５ａｃ１を用いて切り出すことが出来る。ラムダＱｔ１１クローンのＫＤｎｌ／５ａｃ１挿入断片をプラスミドベクターＤＳＥＶ６に挿入することによって、対応する発現プラスミドＲ６０ｂ−ａを構築することが出来る。

ポリペプチドＢ（９０ｋｄ）をコードする遺伝子部分は、０．４５キロベースのマイコプラズマＤＮＡの挿入配列を含むラムダＱｔｌ　１クローンしＭＭＣＩ− ９上に含まれている。この断片は、該挿入配列ではなくフランキン１を用いて切り出すことが出来る。

ポリペプチドＣ（８５ｋｄ）をコードする遺伝子部分は、０．５キロベースのマイコプラズマＤＮＡの挿入配列を含むラムダｏｔｌ　１クローンＲ６９上に含まれている。

この断片は、該挿入配列ではなくフランキングベクター配列を切断する制限酵素ＫＤｎ１及び３ａｃ１を用いて切り出すことが出来る。ラムダＱｔ１１クローンのＫＤｎ１／５ａｃ１挿入断片をプラスミドベクター１）ＳＥＶ６に挿入することにより、対応する発現プラスミドＲ６９ｂを構築することができる。

ポリペプチドＤ（７０ｋｄ）をコードする遺伝子部分は、３．２キロベースのマイコプラズマＤＮＡの挿入配列を含むラムダＱｔ１１クローン８６−４上に含まれている。

この断片は、該挿入配列ではなくフランキングベクター配列を切断する制限酵素ＫＤｎ１及び５ａｕＩを用いて切り出すことが出来る。ラムダ０ｔ１１クローンのＫＤｎ１／５ａｕ１挿入断片をプラスミドベクターＤＳＥＶ６に挿入することによって、対応する発現プラスミド８６−４Ｇが構築される。

ポリペプチドＥ（４３ｋｄ）をコードする遺伝子部分は、０．５キロベースのマイコプラズマＤＮＡの挿入配列を含むラムダｏｔ１１クローンＰ１上に含有されている。

この断片は、該挿入配列ではなくフランキングベクター配列を切断する制限酵素ＫＤｎ１及び５ａＣ１を用いて切り出すことが出来る。ラムダＱｔ１１クローンのＫｐｎ１／５ａｃ１挿入断片をプラスミドベクターｐｓＥＶ６に挿入することにより、対応する発現プラスミドＰ１Ｇを構築することが出来る。

各種の方法を用いて、蛋白あるいは抗原デターミナントをコードするＤＮＡを発現することが出来る。特に、に）ｔｌ　１クローンに含まれているＤＮＡＬｔ＠乳動物系で発現できると考えられる。

他の好ましい態様においては、目的とするＤＮＡをＱｔ１１ファージクローン上に含まれているＤＮＡから切り出し、適当な形態で微生物系に挿入することも妃えられる。この態様では、抗原性ポリペプチドは以下の工程からなる方法によって調製することができる。

即ち、（２）マイコプラズマによって産生きれるポリペプチドが有する抗原特性と類似した抗原特性を有するポリペプチドを宿主微生物に産生させることの出来るＤＮＡ配列を調製し；０該ＤＮＡ配列のためのオペレーションエレメントを含有するベクターであって、宿主微生物中に導入されそこで複製することの出来るベクターに、該ＤＮＡ配列をエレメントを含むベクターを、抗原性ポリペプチドを発現することの出来る宿主微生物中に導入し：ゆ該ベクターの増幅及びポリペプチドの発現に適当な条件下で該宿主微生物を培養し；（ｅ）次いで、１ｉ）ポリペプチドを回収する、及び１ｉｉ１ポリペプチドの構造を推定して、マイコプラズマによって産生されるポリペプチドが有する抗原特性と類似した抗原特性を有するポリペプチドを同定する、ことをいずれかの順序で行なう：ことからなる方法によって調製することが出来る。

Ｈ，ｈνｏｐｎｅｕｓ＋ｏｎｉａｅは原核生物であるため、イントロンについて考慮することなくゲノムＤＮＡを用いることが出来る。しかしながら、少なくとも１つのマイコプラズマ種は、通常のストップコドンＬＪＧＡを、蛋白合成でのトリプトファンコドンとして利用していることが見出されている。Ｈ，ｈｙｏｐｎｅｕｓ＋ｏｎｉａｅの場合にもこの事実があてはまるとすれば、他の系（例えばＥ、　ｃｏｌｉ　）で発現させてこのコドンがストップコドンとして読まれる場合には、蛋白合成が未成熟の段階で終止するものと思われる。目的とする蛋白を合成する際にこのようなことが起こるか否かは、適当なｔＲＮＡサプレッサー株中で発現ベクターを生育せしめることによって決定することが出来る。

未成熟の段階で蛋白合成が終止する場合には、ＵＧＡコドンを含む領域についてＤＮＡ配列決定し、部位特異的突然変異により適当なコドンと置換することによって、この問題を解決することが可能である。この手法は、当業者にとっては容易に達成できるものと思われる。

上記の方法によって調製されたＤＮＡは、意図する発現系に用いるのに適当な発現ベクター中に挿入される。

本発明の態様においては、本明細書で記載される抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を１つもしくはそれ以上含むベクターであれば、他の公知のあるいは現在は未だ見出されていないベクターのいずれも用いることが出来る。特に、このようなベクターは、以下に示す特性の全部またはいくつかを有していることが好ましい。

即ち、（１）宿主生物の配列を最低限の数で含有している：１２１意図する宿主生物中にて安定である；（３）意図する宿主生物中に高コピー数で存在することが出来る：（４１ｍ１節可能なプロモーターを有している；（５）抗原性ポリペプチドが挿入される部分から離れた装置に、選択マーカーをコードするＤＮＡ配列の少なくとも１つを有している；（６）ベクターに組込まれる。

以下に挙げるクローニングベクターが全てではないが、これらのクローニングベクターは上２した特性を有するように容易に修正することが出来、従って本発明において好ましく使用される。そのような修正については、文献及び本明ｉ占の記載から実業もは容易に実施できるものと思われる。

表　■ Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｐＵｃ８　多くの選択レブリコーンについてｐＵｃ９　特徴付けがされている。Ｈａｎｉａｔｉｓ。

ｐＢＲ３２２Ｔ、ｅｔ　ａｔ、（１９８２）　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＤＧＷ７　ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａ１ｘ＋ｒａｔｏｒｙ　１％ｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄｐ　Ｉ　ａ　ｃ　ＩＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

ＢＲ３２５ＢＡＣＬＬＬｌｊＳ　ＤＵＢ　１１０　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ｐｓＡＯ５０１［Ｊｃｉｌｌｉ、　ＧａｎｅｓａｎとＨｏｃｈ、　ｅｄｓ、。

Ｂ、ａＩＩｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　ｐｓＡ２１００　１９８４．＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｂ、　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ　ｐ３［）６１）ＢＤ８Ｔ１２７ＰＳＥＵＤＯ）［１ＮＡＳ　ＲＳ　Ｆ　１０１０　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、　ＡｇｒｏｈａｃｔｅｒｉｕｍなどのＰ、　ａｅｎＪ（ｌｉｒｉＯ３ａ　Ｒｍｓ　１４９　グラムネガティブバクテリアの広範Ｐ、　ｐｕｔｉｄａ　ｐＫＴ２０９　囲宿主に有用ないくつがのベクター。

Ｋ２５ａ７２７ＣＬＯＳＴＲＩＤＩＵＨｐＪＩＪ　１２　Ｅ、　ｃｏｌｉ及びＣ，圓ｒｆｒｉｎｇｅｎｓ用シャＣ，ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ　ｐＪｔＪ７　トルベクタープラスミドベクターのＤＪＵＩＯ構築、５ｑｕｉｒｅｓ、　ｃ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）ＤＪＬＪＩ　６　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１５９　：　４６５−ｐＪＵ１３　４７１゜５ＡＣＣＨＡＲＯＨＹＣＥＳ　ＹＥｐ２４　ＢｏｔＳｔｅｉｎとＤａｖｉｓ、　Ｈｏ１ｅｃｕｌａｒＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｙ　Ｉ　Ｄ　５　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　５ａｃｃｈａｒｏ−ＹＲｐｌ　７　ｍｙｃｅｓ、５ｔｒａｔｈｅｒｎ、　Ｊｏｎｅｓ、及びＢｒｏａｃｈ、ｅｄｓ、、１９８２．　Ｃｏｔ（ＩＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

以上のクローニングベクターに加えて、上記した特性を有するクローニングベクターは他にもあり、また今後見出されるものもある。それらのベクターも本発明において用いることが出来る。これらのベクターも本発明で用いる一連のクローニングベクターの範囲内のものである。これらのベクター中には、必要なオペレーションエレメントとともに抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が挿入され、これらの修正されたベクターは本発明の範囲内のものであり、以下により詳細に記載する組換えＤＮＡ法に用いることが出来る。

本明細書で用いる“オペレーションエレメント”とは、それらに限定されるものではないが、少なくとも１つのブロモ−ター、少なくとも１つのリポソーム結合配列及び少なくとも１つの転写ターミネータ−を含むことを意味する。好ましくはこの“オペレーションエレメント”は、更に、少なくとも１つのオペレーター、蛋白を細胞外へ分泌するための少なくとも１つのリーダー配列、少なくとも１つのレギュラー配列、及びベクターＤＮＡの転写並びにそれに続く翻訳に必要なあるいは好適な他のＤＮＡ配列を含むことを意味する。

上記に挙げたクローニングベクターに加えて、Ｅ、　ｃｏｌｉベクター系も１つの好ましいクローニングベクターである。更には、広馳囲のグラム陰性菌において自己複製するいくつかのプラスミドベクターも、Ｐｓｅｕｄｏ■ｏｎａｓ　ＫＭ主のクローニングベクターとして好ましいものである。これらについては、Ｔａ１ｔ、　Ｒ，Ｃ，。

Ｃ１ｏｓｅ、　Ｔ、　Ｊ、、　Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ、　Ｒ，Ｃ，、Ｈａｇｉｙａ、　Ｈ，。

Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、　Ｒ，Ｌ、、及びにａｄｏ、　Ｃ，１，、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

ＨａＶ、１９８３．　ｐＤ、　２６９−２７５　：Ｐａｎｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｎ。

Ｊ、、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅｓ。

Ｐｒａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、１６３ −１８５　。

＜１９８１）：及びＳａｋａｇｕｃｈｉ、　Ｋ、、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃ　１ｎＨｉｃｒｏｂｉｏｌｏｏｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｏｙ９６　：　３１−４５．　（１９８２）に記載されており、これらのそれぞれを本明細書に引用する。

プラスミドＲ８ＦＩＯＩＯ及びその誘導体を用いるのが１つの特に好ましい構築例であり、これらは、Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ、　Ｈ，、Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ、　Ｈ，Ｈ，、Ｃｏ１ｅｉａｎ、　Ｓ、、及びＴｉｍｍ１ｓ、に、Ｎ、、　Ｐｌａｓｌｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｒｖｅｎｔａｌａｎｄ　Ｃｏ！１ｌｅｒｃｉａｌ　Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ、　Ｔｉ１ｌｌｉＳ、に、Ｎ、及びＰｕｈｌｅｒ、　Ａ、、　ｅｄｓ、、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ｎｏｒｔｈ　ＨｏｌｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｏ　、　（１９７９）に記載されており、本明細書に引用する。Ｒ８Ｆ１０１０の利点としては、比較的小さくかつ高コピー数のプラスミドであって、Ｅ、　ｃｏｌｉ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の両者に導入されて安定に維持されるという利点が挙げられる。この系では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａについて記載したようにＴａｃ発現系を用いるのが好ましい。何故なら、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ、　Ｋ、、　ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉ＋ｕｎｕｎｏｌｏｏｙ　９６　：　３１−４５　（１９８２）：及びＧｒａｙ、　Ｇ、Ｌ、、　ＨｃＫｅｏｗｎ、に、Ａ、。

Ｊｏｎｅｓ、Ａ、Ｊ、Ｓ、、　Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、Ｈ，、とＨｅｙｎｅｋｅｒ、　Ｈ，Ｌ、。

Ｂｉｏ　／Ｔｅｃｈｎｏｉｏａｙ、Ｆｅｂ、　１９８４．　ｐｐ、１６１−１６５に記載されているように、Ｐｓｅｕｄｏｗ＋ｏｎａｓ　ＲＮＡポリメラーゼはＥ、　ｃｏｌｉ　ｔｒｐプロモーターをよく認識することが出来ると考えられるためである。これら２つの文献の記載は本川ｌＢ書に引用する。また、ブロモ− ターを例えばＥ、　ｃｏｌｉもしくはｐ、　ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ　ｔｒｐプロモーターに変換することによって転写活性を更に高めることも出来る。

好ましい態様においては、抗原性ポリペプチドの合成を誘導するベクターでｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを形質転換する。

抗原性ポリペプチドは、細胞内生成物として得られる。

あるいはリーダー配列と結合した生成物として得られ、その後ブＯセツシングを受けて細胞外へ分泌される。この態様においては、リーダー配列は、好ましくは、べ−ターラクタマーゼ、０＋ａｐＡプロテイン及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのカルボキシペプチダーゼＧ２のリーダー配列からなる群より選ばれる。ｖＡ訳は、宿主の８発現蛋白のいずれの開始部位とも密接に関連しており、それと同様にＥ、　ｃｏｌｉ蛋白のいずれのａ訳開始とも密接に関連しており、それによって抗原性ポリペプチドの細胞内発現が誘導される。

宿主Ｐｓｅｕｄｏ■ｏｎａｓ種のレストリクジョンマイナス株が利用出来ない場合には、Ｅ、　ｃｏｌｉから単離されたプラスミド構築体で形質転換してもその効率は低い。従って、宿主を形質転換する前に、Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ、　Ｈ，、ｅｔ　ａｔ、。

Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　ＣｏｍｍｅｒｃｉａｌＩｍｐｏｒｔａｎｃｅ、ＤＤ、４１１−４２２　、Ｔｉｍｍ１ｓとＰｕｈｌｅｒｅｄｓ　、、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　／Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｒｅｓｓ（１９７９）に記載されているように、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓクローニングベクターを他の種のγ−ｍ＋株に通すのが望ましい。この文献の記載を本明細書に引用する。

更に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主の好ましい発現系は、クローニングベクターとしてプラスミドｐＬＪＢ１１０を用いる系である。他の宿主ベクター系では、Ｂａｃｉｌｌｕｓにて本発明の抗原性ポリペプチドを細胞内蛋白あるいは分泌蛋白として発現することが出来る。本発明の態様においてはこれら両者の系を用いることが出来る。Ｄｕｂｎａｕ。

Ｄ、、　Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、、　Ｃｏｎｔｅｎｔｅ、　Ｓ、、及び５ｈｉｖａｋｕｖａｒ、　Ａ。

Ｇ、、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ、２　、ＳｅｔｌｏｗとＨｏ１ｌａｒ＋＋ｊｅｒ　ｅｄｓ、、Ｐｌｅｎｕｓ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

ｐｏ、１１５−１３１．（１９８０）に記載されているように、ＢａｃｉｌｌｕｓとＥ、ｃｏｌｉの両者においてＩＩＩＩｊすることの出来るシャトルベクターを、各種の遺伝子を横築しテストするのに利用することが出来る。これら文献の記載を本川ＩＢｌに引用する。抗原性ポリペプチドを８．５ｕｂｔｉｌｉｓにて発現せしめて分泌させるために、抗原性ポリペプチドをコードする領域にアルファアミラーゼのシグナル配列を連結するのが望ましい。ｌ１ｌｌ胞内のポリペプチドを合成するためには、アルファアミラーゼのリーダー配列のリポソーム結合部位にポータプルＤＮＡ配列を連結することが考えられる。

これらの構築体の転写は、好ましくは、アルファアミラーゼプロモーター又はそのｙｋ誘導体よって誘導される。

この誘導体は、天然アルファアミラーゼプロモーターのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含み、更に１８Ｃオペレーターも含むものである。ベニシリナーゼ遺伝子ブＯモーター及びｉａＣオペレーターから構築される同様のハイブリッドプロモーターが、Ｙａｎｓｕｒａ、　Ｄ、Ｇ、及びＨｅｎｎｅｒ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｉ。

Ｇａｎｅｓａｎ、Ａ、Ｔ、及びＨｏｃｈ、　Ｊ、Ａ、、　ｅｄｓ、、　Ａｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ　、　ＤＤ、２４９−２６３．（１９８４）に記載されているような調節された形態で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主中にて機能することが示されている。この文献の記載を本朝ｍ書に引用する。オａｃＩＱの１８Ｃ工遺伝子も調節を行なうために使うことが出来る。

Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕ−にて発現せしめるための１つの好ましい構築体は、５ｑｕｉｒｅｓ、　Ｃ，Ｈ，ｅｔ　ａｔ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５９　：４６５−４７１　（１９８４）に記載されているプラスミドｐＪＵ１２を用いて得られる構築体であり、これは、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５９　：　４６０−４６４　（１９８４）に記載されたＨｅｅｆｎｅｒ、　Ｄ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、の方法によってＣ，ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに導入することが出来る。これらの文献のｋｌを本明細書に引用すゐ。テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーターによって転写がｙｈ導される。他の宿主に用いる上記したベクターの場合と同様に、ｔｅｒｔ　遺伝子のシャインダルガノ配列と翻訳とが密接に関連している。

酵母に導入された外来ＤＮＡは、各種の方法により、例えばＢｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ、、及びＤａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、、　ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、５ｔｒａｔｈｅｒ、ｎ、Ｊ’ｏｎｅｓ及びＢｒｏａｃｈ、　ｅｄｓ、、　ＤＤ、　６０７− ６３６　（１９８２）に記載された方法で維持することが出来る。この文献の記載は本川ａｌｌに引用する。５ａｃｃｈａｒｏｉｙｃｅｓ属の宿主生物に用いる１つの好ましい発現系は、２ミクロンプラスミド中に抗原性ポリペプチド遺伝子を保持する発現系である。

２ミクロン環状プラスミドの利点は、比較的菖い］ピー数を有しており、またｃａｒ　株に導入した時に安定であるという点である。これらのベクターは、複製オリジンと少なくとも１つのｐＢＲ３２２の抗生物質耐性マーカーを有しているのが好ましく、それによって、［。

ｃｏｌｉ中にて複製し選択することが可能となる。更に、これらのプラスミドは、２ミクロン配列と酵母ＬＥＵ２遺伝子を有しているのが望ましく、それによってＬＥＵ２変異株にて複製し選択することが出来る。

酵母ＧＡＬ１遺伝子の調節可能なプロモーターを、抗原性ポリペプチドの転写を誘導するために用いるのが好ましい。酵母でのＤＮＡ配列の翻訳は、酵母アルファファクターの分泌を誘導するリーダー配列と密接に関連している。酵母にて融合蛋白が合成されて、プロセッシングを受けて、目的とする抗原性ポリペプチドが分泌される。あるいはまた、メチオニル抗原性ポリペプチドが翻訳されて細胞内に産生される。

表１及び水明ｍ書に記載した個々のクローニングベクター及び系から明らかなように、本発明の好ましいベクター中には各種のオペレーションエレメントが存在することができる。必要とされるオペレーションエレメントはいずれであっても、当業者に公知の方法、特に本明細書に記載した方法を用いてベクターに加えることができる。

実際には、これらのベクターは、容易に単能し組立てそして交換することの出来るように構築することが可能である。上記したエレメントと抗原性ポリペプチドコード領域とを組合わせて、多くの機能的遺伝子を一緒にして組立てることが出来る。更には、多くのエレメントは一種以上の宿主に通用することが出来る。

ベクターには、少なくとも１つの選択マーカー及び抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を開始させることの出来る少なくとも１つのプロモーターとともに、宿主微生物によって認識される少なくとも１つの複製オリジンを導入することが出来る。更には、ベクターには、レギュレーター（“オペレーター”）として機能するＤＮＡ配列及びレギュレーター蛋白をコードするＤＮＡ配列を含有させることも出来る。好ましい態様においては、ベクターには、更に、リポソーム結合部位、転写ターミネータ−及びリーダー配列を含有させることが出来る。

レギュレーターは、ある環境条件下では抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現を抑刊し、他のある環境条件下では抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の転写を行なわせ次いでその発現を行なわせることが出来る。特に、例えばイソプロピルチオベーターｄ−ガラクトシドの非存在下ではＤＮＡ配列の発現が起こらないように、レギュレーターセグメントをベクター中に導入するのが望ましい。この場合には、目的とするＤＮＡ配列を保持する形質転換微生物が所望の濃度に到達するまで生育し、その後に抗原性ポリペプチドの発現が開始される。この態様においては、所望の濃度に達した後に、ＤＮＡ配列の発現を誘導する物質を加えることによって、抗原性ポリペプチドの発現が誘導される。

更に他のオペレーションエレメントとしては、これらに限定されるものではないが、リポソーム結合部位及び異種蛋白の発現に必要な他のＤＮＡ配列がある。これらのオペレーションエレメントは、先行文献及び本川ｍｌの記載を参照して当業者ならば容易に選択出来るものと思われる。オペレーションエレメントの一般的な例については、Ｂ、　Ｌｅｗｉｎ、　Ｇｅｎｅｓ、　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８３）に記載されており、この文献の記載を本川ｓ！１ｇに引用する。適当なオペレーションエレメントの例が、この文献に記載されているベクターに用いられており、それらベクターの基本的な特徴についての説明からオペレーションエレメントがよく理解されるものと思われる。

本発明の１つの好ましい態様においては、抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の直前に更に他のＤＮＡ配列を置くことが出来る。かかるＤＮＡ配列としては、トランスレーショナル力ツブラーがあり、このＤＮＡ配列は、抗原性ポリペプチドＲＮＡのリポソーム結合部位に隣接した所にリポソームが位置するようにするＲＮＡをコードするＤＮＡ配列である。

クローニングベクターに必要な全ての成分を合成し及び／又は単ｍｌするに際しては、当業者に一般的に公知の方法によってベクターを組立てることが出来る。

ベクターの構築は当業者が実施することの出来るものであって、過度の実験を必要としないで実現可能なものである。例えば、５ｃｈｏｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８１　：　５４０３−５４０７　（１９８４）に記載されているようにして、ＤＮＡ配列を適当なりローニングベクターに連結することが出来る。この文献の記載を本明細書に引用する。

本発明のクローニングベクターを構築するに際しては、抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列及びそれに付随したオペレーションエレメントを高コピー数で各ベクターに挿入することに注意すべきである。このような場合には、宿主生物によって、ベクター当りより多くの量の抗原性ポリペプチドが産生きれる。ベクター中に挿入されるＤＮＡ配列のコピー数は、得られるベクターが宿主微生物中に導入されてそこで複製し転写されることが出来るような大きさであれば何んら制限を受けない。

クローニングベクターは、薬剤耐性マーカーあるいは宿主微生物によって選択特性の発現を引き起こす他のマーカーなど選枦マーカーを含んでいるのが好ましい。薬剤耐性マーカーあるいは他のマーカーは、形質転換体の選択を促進するために用いられる。クローニングベクター中の選択マーカーを利用して、培養培地中の混入微生物が増殖するのを抑制することが出来る。表現型が生存するのに必要な条件下で培養することによって、形質転換微生物を純粋培養することが出来る。

好ましい態様においては、コード領域の３′末端を再構築して３′非翻訳配列を組立てるのが望ましい。３′非翻訳配列には、ｍＲＮＡを安定化させるあるいはその転写を促進する配列、及びベクターを安定化させる強力な転写終止シグナルを提供する配列などがある。シグナルは、Ｇｅｎｔｚ、　Ｒ，、Ｌａｎｇｎｅｒ、　Ａ、、　Ｃｈａｎｇ　、　Ａ、Ｃ，Ｙ、。

Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｈ，、及びＢｕｊａｒｄ、　Ｈ，、ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

υ５Ａ７８：４９３６−４９４０（１９８１）に記載されているようにして同定することができ、この文献の記載を本明細書に引用する。

かくして得られるベクターを適当な宿主微生物中に導入する。外来ＤＮＡを取り込みそれらの遺伝子及びそれに付随したオペレーションエレメントを発現する能力があればいずれの微生物であっても宿主微生物として用いることが出来る。宿主微生物は、嫌気生物、通性嫌気生物あるいは好気生物が好ましい。本発明に用いるのに特に好ましい宿主生物は酵母とバクテリアである。酵出としては、例えば５ａｃｃｈａｒｏｓｙｃｅｓ属の酵母、特にＳａｃｃｈａｒｏｗ＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉｕｅが挙げられる。

バクテリアとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ及びＰｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ属が挙げられる。他の好ましい宿主生物は、前記した表１に記載されている。本発明の他の好ましい態様においては、宿主微生物として、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、　ＰＳｅｕｄＯＩＯｎａＳａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどが用いられる。

宿主生物を選Ｒ後に、当業者に公知の一般的方法を用いて該宿主生物中にベクターを導入する。かかる方法の例は、Ｒ，Ｉｌ、　Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８０）に記載されており、この文献の記載を本用ｍ書に引用する。１つの態様に６０では、温度を調節して、上記したオペレーションエレメントを用いた遺伝子の発現を調節することが出来るため、形質転換を低温で行なうのが好ましい。他の態様にお（Ｘでは、モル浸透圧レギュレーターをベクターに挿入した場合には、形質転換時の塩Ｓ度を調節して、合成遺伝子のコントロールを確実に行なうことが必要である。

組換え抗原性ポリペプチドを酵母にて発現する場合には、最初にクローニングベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ中に導入して、そこでベクターを複製させて増幅した後に、ベクターを単離して精製し、次いで該ベクターをＷｇ母に導入して、そこで最終的に抗原性ポリペプチドを発現するのが好ましい。

抗原性ポリペプチドの発現に適当な条件下で宿主微生物を培養する。培養条件は、一般的に、用いる宿主生物に特異的であり、そのような条件は、宿主生物の生育条件に関する文献を参照して容易に決定することができる。

文献としては、例えばＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　８ｔｈ、　Ｅｄ、、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄがあり、この文献の記載を本用ｍ書に引用する。

ＤＮＡ配列の発現を調節するのに必要な条件は、ベクター中に存在するあるいはベクター中に挿入されたオペレーションエレメントに依存しており、このような条件はいずれも形質転換及び培養期間中に実施されるものである。

１つの態様においては、抗原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現を抑える条件下で、高深度になるまでｉｌｌ胞を生育せしめる。、最適細胞濃度に到達した時に、培養条件を、ＤＮＡ配列の発現に好適な条件に変更する。

宿主細胞が生育して最過渡度に近づいた後にある一定期間接、抗原性ポリペプチドの産生が起こり、発現に必要な条件となった後ある期間経過後に、得られる抗原性ポリペプチドを回収する。

転写ターミネータ−を用いることによってベクターが安定化される。特に、Ｇｅｎｔｚｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７８：４９３６−４９４０＜１９８１）に２載された配列を本発明に用いることが出来る。この文献の記載を本明細書に引用する。

本発明の教示を他の特定の問題に適用するのは、木用ｍｙ、の記載を参照すれば当業者は容易に行なうことが出来るものと考えられる。以下の実施例において、本発明で得られる生成物の例、及びそれを製造し単離する代表的工程が記載されている。これらの実施例をより良く理解するために用いた参考文献の記載を本明細書に引用する。

例ここに引用した文献は、その全てを本明細書に引用する。

Ｈ，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって発現される抗原活性を有する蛋白用のクローンを得るために必要な原理に基づいて、ゲノム発現ライブリーを構築した。原核生物ＤＮＡはイントロンを含んでいないので、ｃＤＮＡライブラリーを構築する必要がない。ゲノムサイズが小さいため、Ｈ０ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムを得るには比較的少数のクローンしか必要としない。Ｈ，ｈｙｏｐｎｅｕ■ｏｎｉａｅのゲノムサイズから、両方の方向性を有しかつ三つの全リーディングフレーム中の全ての１ｏｏｂｐ領域を９９％の可能性で含むには、個々の組換え体を１．４Ｘ１０”個必要であると計算した。

ラムダｇｔ１１では、ペプチドをコードするりＯ−ン化ＤＮＡ断片は、それをファージのベーターガラクトシダーゼ遺伝子のカルボキシ末端の近くのユニークＥＣ０ＲＩ部位に挿入した場合には、融合蛋白として発現される。ベーターガラクトシダーゼ遺伝子に外来ＤＮＡを挿入することによって、遺伝子が不活性化され、そのためインディケータ−プレート上で組換えファージを同定することが出来る。

Ｈ，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノム発環ライブラリーは４つの工程によって得ることが出来る。最初にＨ，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎ；ａｅ３胞からゲノムＤＮＡを得る。第２に、超音波処理してランダム断片を作成し、次いでファージＴ４ポリメラーゼである内部ＥＣ０ＲＩメチラーゼで平滑末端とし、次いで末端にＥＣ０ＲＩリンカ−を連結して、過剰のリンカ−を切り出す。第３に、得られる断片をラムダＧｌｔ１１ベクターＤ　Ｎ　Ａ　（Ｖｅｃｔｏｒ　ＣｌｏｎｉｎａＳｙｓｔｅｍｓ　、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　、ＣＡから購入）ニ連結し、１ｎＶｉｔｒＯパツケージングを行なう。最後に、ｉｎ　ＶｉｔｒＯパッケージ組換えファージを増幅する。

１　、　ＨｖＣＯｐｌａｆｉｌ　ｈｙｏｐｎｅｕｌＯｎｉａｅ　ｍ胞からゲノムＤＮＡの５ｌｉＪ製約１０１１個の凍結したＨ、　ｈｙ０ｐｎｅＬＩｌｏｎｉａｅ！＄１胞を溶解して、ポリエチレンチューブに移した。細胞容Ｓは０．８ｄであった。これにプロテインナーゼに溶液［０，０７５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＤＨ８Ｓｏ、　１７Ｍ　ＥＤＴＡ　ＤＨ８；０．１５％　ＴｒｉｔｏｎＸ　１００　：及び４００１１９／ｄブＯテインナーゼＫ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｈａｎｎｈｅｉｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ。

Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎｄｉａｎａ　）　］の１１１１を加えた。細胞をプロテインナーゼＫｌ液とともに６５℃で３０分間インキュベートした。フェノール２．０ｄを混合物に加え、４℃で２００分間っくりと振とうした。次いで、サンプルを４℃で、５００　ｒｐ−で、５分間Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ　Ａ　２００−ターで遠心した。水層を大きな突のあいたプラスチックピペットで除いた。水層にクロロホルムとイソアミルアルコールの２４：１載合物２ｄを加えて、４℃で２０分掻上うし、次いでチューブを５分間静置して層を分離させ、大きな突のあいたプラスチックピペットで水層を取って抽出した。

次いで水層を、フェノール次いで上記したクロロホルムとイソアミルアルコールの混合で再抽出した。得られる水層に３，０Ｍ酢酸ナトリウムストック溶液の水層１／１０容量を加えて０．３Ｍ酢酸ナトリウムとなるように調整した。２．５倍容量の冷却したエタノールを加えて、ＤＮＡを沈殿させた。エタノールをゆっくりと混合して、大量の粘稠な核酸を得、それを小さなガラス棒を用いて巻取った。次いでこの物質を７０％エタノールで２回リンスして、風乾した。乾燥した核酸をＴＥバッファー０．５ｄに加えて４℃で１６時間振とうして再懸濁した。

Ｈ，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＤＮＡＩｔｌ物から混入ＲＮＡを除去するために、核酸をＲＮａｓｅ　Ａで処理した。スボＯゾイト核１１［Ｊ物の５７１０ミリリツトルを、６５℃で３０分間２．５ｕ９／ｌｄ　ＲＮａｓｅＡ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｅｌｋｈａｒｔ、１ｎｄｉａｎａ　）で処理した。水層に７．５Ｍストック溶液の０．７５倍容量を加えて３．２Ｍ酢酸アンモニウムに調整した。０．５４倍容量のイソプロパツールを加えて、ＤＮＡを沈殿させた。イソプロパツールを混合して粘稠な大量のペレットを得、それを巻取って８０％エタノールで２回リンスした。風乾後、ＤＮＡをＴＥバッファー０．２ＩＩｌｌに再懸濁した。

得られたＨ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ［）　Ｎ　Ａを７ガロースゲルを用いた電気泳動に付し、次いでエチジウムブロマイドでゲルを発色せしめて分析した。この結果から、得られたＤＮＡは高分子量であってＲＮＡをほとんど含まないことが明らかとなった。ＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍでの吸光度に基いて測定した。精製ＤＮＡ９０μ９が得られた。

２、超音波処理したＨ、　ｈｙｏｐｎｅｕｓｏｎｉａｅゲノム断片の調製Ｈ，ｈｙｏｐｎｅｕｌＯｎｉａｅのゲノムから得た断片を、ポリペプチドの転写翻訳が行なわれるリーディングフレーム上に並べるために、超音波処理によって可能なすべてのフレームに対応するランダム断片を作成することを決めだ。

低パワーにセットしたＤｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｆｉｅｒｌｌ胞粉砕器２００（７）先端に付いたブローブチＨ，ｈｙｏｐｎｅｕｓｏｎｉａｅＤ　Ｎ　Ａを超音波処理した。全量２００μｌのＤＮＡ８０μ９を３回の３秒バーストで超音波処理した。これによって、０．３−２３ｋｂの大きさの断片を得た。１．３−４．４ｋｂの大きさの断片が最も多く含まれていた。

超音波処理によって得られる断片の末端を、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ；　Ｂｅｖｅｒｌｙ。

ＨａＳＳ）を用いて平滑末端とした。反応は３３１Ｈ１−リスアセテートρ８７．８［６６ｍＭ酢酸カリウム、１ＱｔＨ酢酸マグネシウム、０．１η／Ｉｄウシ血清アルブミン、０．５■Ｈジチオスレイトール及びｄＡＴＰＳｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのデオキシヌクレオチドトリホスフェートのそれぞれを０．１■ Ｈ］中で実流した。超音波処理ＤＮＡ６５μ９とＴ４ポリメラーゼ２０ユニットを３７℃で１時間反応させた。サンプルを１０分間６８℃に加熱して反応を止めた。ＴＥで平衡化したＢｉｏｇｅｌ　Ｐ　３０　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　）カラムに反応混合物を通して、過剰の塩を除いた。

内部ＥＣ０ＲＩ部位を有するＨ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムＤＮＡ断片を保護するために、このＤＮＡを修正することが必要であった。断片化したＨ、　ｈｙｏｐｎｅｕｓｏｎｉａｅＤ　Ｎ　ＡをＳ−アデノシルメチオニンの存在下で、その供給者の勧める条件下で、ＥＣ０ＲＩメチラーゼ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｔａｎｄＢｉｏｌａｂｓ　）と反応させた。反応混合物をフェノールで抽出することによって、上記メチラーゼを不活性化し、残渣フェノールをエーテル抽出によって除去した。次いで、混合物を酢酸ナトリウムで０．３Ｍに調整し、２．５倍容量のエタノールを加えた。−７０℃で３０分間放置後、沈殿したＤＮＡを遠心してベレット化した。このＤＮＡをＴＥバッファーに再懸濁した。

短かいオリゴヌクレオチドＥｃｏＲＩリンカ−（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂ１１ａｂｓ）を、平滑末端を有する断片に連結させた。連結反応は、６６１８　Ｔｒｉｓ　ＥＩＨ７，６，５ｉＮＭｇＣ１２，５ｍＨジチオスレイトール、１０１ＨＡＴＰからなる反応液中で５−１０μＭリンカーと反応させて実施した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐ、　Ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅａｉｃａｌｓ）を加えて、１４℃で１６時間反応させた。

反応混合物を７０℃で１０分間加熱して連結反応を停止させた。

次いで塩化ナトリウムを加えて０．１Ｍとし、過剰のＥＣ０ＲＩを加えて、反応混合物を３７℃で数時間インキュベートした。７０℃で１ｏ分間加熱してＥＣ０ＲＩを不活性化した。

３、ラムダＱｔ１１への断片の結合及び組換えＤＮＡのインビトロパッケージングホスファターゼ処理しＥＣ０ＲＩで開裂したラムダ０ｔ１１ＤＮＡを、Ｈ，ｈｙｏｐｎｅｕｏ＋ｏｎｉａｅ［）　Ｎ　ＡのＩ製断片と混合した。これらのＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐ。

Ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて１４℃で１晩で連結させた。

連結反応混合物の少量のアリコートを採取して、ゲル電気泳動で分析して、連結反応をモニターした。混合物を７０℃で５分間加熱して、次いでラムダｉｎ　ＶｉｔｒＯパッケージング用抽出物（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　５ａｎＤｉｅΩｏ、ＣＡ）と混合した。室温で６０分間パッケージング反応を行ない、次いでクロロホルムを滴下してバクテリアの生育を抑えた。この混合物を分析した所、１．５×１０５個の組換え体からなるライブラリーが得られた。

４　、　Ｈ，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ発現ライブラリーの増幅パッケージしたファージをラムダオイルで希釈して、Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，とＤａｖｉｓ、　Ｒ，、５ｃｉｅｎｃｅ２２２　：　７７８−７８２　（１９８３）に記載された方法に従って、Ｅ、　ｃｏｌｉ株Ｙ１０８８に吸着させた。この株でライブラリーの増幅を行なうことによって、ベーターガラクトシダーゼ遺伝子は発現されず、従って、宿主Ｅ、　ｃｏｌｉ　＠胞に有害なコード配列を含むファージはいずれも発現されず、またライブラリーから失なわれることもない。ライブラリーを増幅することによって、１ＪＩＩｅ当り６Ｘ１０”個のファージを有するストックが得られた。

１Ｍ　ＮａＣｊ　（２０１１４Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，５ｍＭＥＤＴＡ）の１０−４０％シュクロースグラジェントを用いた密度勾配遠心法により、過剰のリンカ− を除いてＤＮＡ断片のサイズ分画を行なった。最高温度のグラジェントにＤＮＡを付して、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＳＷ４１　ローター中で２６、ＯＯＯｒｐｍで１５ ℃で２４時−間回転させた。

０．３ｄ！のフラクションを集めた。これらを水性ゲル電気泳動に付してエチジウムブーロマイドで発色させて、それぞれのフラクション中の断片の標本の大きさを分子量マーカーと比較した。１−６ｋｂの範囲の断片を多く含むフラクションを集めて、透析し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０（Ａｉｉｃｏｎ）で澹縮した。

■、一般的方法Ａ、ラムダ（ｌｌ］ｔ１１の抗体スクリーニングＨ，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ発現ライブラリーＹｏｕｎｇとうａｖｉｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ２２２　：　７７８−７８２　（１９８３）に記載された方法に従って、宿主生物として［。

ｃｏｌｉＹ１０９０を用いて、１５０ｊｌＩ１１プレート当り５゜０００−２０．０００フアージの濃度で、ラムダＱ　ｔ　１１　：　Ｈ，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ発現ライブラリーをプレートした。得られるプレートを３７℃又は４２ ℃で４時間インキュベートし、次いで、１０１１８　１ＰＴＧに浸して風乾したニトロセルロースフィルター（ＢＡ−８５，５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｖｅｌｌ）でカバーした。３７℃で１晩インキユベーシヨン後、ＴＢＳ　（１０１８Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｐＨ８，０，１５０ｍＨＮａＣｊ）ｒバッチ洗浄（３ ×１０分間）した。ＴＢＳ及び２％ウシ血清アルブミン（）ラクションＶ、　Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｅｌｋｈａｒｔ、ＩＮ）中で６０分間フィルターをインキュベートすることによって、フィルター上の非特異的蛋白結合部位をブロックした。

次いで、フィルターのそれぞれをあるいはベアーで、−次抗体（例えば免疫豚血清、高免疫うビット抗マイコプラズマ血清、マウスモノクローナル抗マイコプラズマ抗体）の１０−２０ｍと２時間インキュベートした。この−次抗体は、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えたＴＢＳで１：２００（モノクローナルの場合にに５００）に希釈して用いた。０．１％ＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ　）を含むＴＢＳでフィルターを洗浄した（３Ｘ１０分間）。

次いで、それぞれのフィルターを単独であるいはベアーで、ＴＢＳ及び２％ウシ血清アルブミンで１：５００に希釈した二次抗体（例えばパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ラビットＩ　Ｑ　Ｇ　、　Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）の溶液１Ｏ−２０ｄと６０分間インキュベートした。ＴＢＳでバッチ洗浄しく３Ｘ１０分間）　、２００ｄＴＢＳ、２．５ａｅ過酸化水素及び４−クロロ−１− ナフトールの３６１Ｆ／ｄメタノール溶液からなる混合溶液中で発色せしめた。

フィルターを水に移して発色を停止させた。ポジティブ発色プラークを上記したようにして抗体で数回再スクリーニングして純粋なプラークを得た。

Ｂ、蛋白に結合した抗体の溶出ニトロセルロース膜への固定化ポリアクリルアミドゲル上に、あるいは寒天プレート特表千１−５０３７５３　（１Ｑ）から得たファージプラークのレプリカ上に分離された蛋白のウェスタンプロットトランスファーのように、蛋白をニトロセルロース膜に固定化する時に、固定化される蛋白を特異的に認識する抗体を結合させることが可能である。固定化される蛋白と特異的に結合しない抗体は溶液中に残りまた容易に洗い流すことが出来る。従って特異的に結合する抗体のみを残すことが出来る。

結合した抗体は、抗体抗原複合体を解離することの出来る低ｐＨバッファー（５ｍＭグリシン、ｐＨ２，３，０，５８ＮａＣ１，０，５％Ｔｗｅｅｎ　２０．０．０１％ＢＳＡ）でフィルターをリンスすることによって溶出することが出来る。溶出した抗体を、例えば、終濃度５０ｍＨＴｒｉｓＨＣｊで直ぐに中和すれば、その活性をほぼ完全に保持出来、従って各種の分析に用いることが出来る。

１、マイコプラズマ蛋白の決定挿入クローンの対応材は精製した組換えクローンのプラークレプリカから溶出された抗体を用いて、どのマイコプラズマ蛋白がクローンに対応しているかを決定することが出来る。組換えクローンのプラークレプリカに結合した抗体を溶出し、この抗体を用いてマイコプラズマ蛋白のウェスタンプロットをプローブすることによって、組換えクローン中でコードされている蛋白を決定することが出来る。

１つの＃ｆｉ製組換えクローンから得た５、０００−１０゜０００個のプラークを１００＃ｌｌ＋プレート上にプレートし、プラークリフトを行なった。リフトフィルターをＴＢＳで洗浄しく３Ｘ１０分１ｆｆｉ）　、ＴＢＳ及び１０％ＢＳＡで１時間インキュベーションして非特異的蛋白結合部位をブロックした。フィルターをＴＢＳで洗浄した（３×１０分間）。フィルターディスの中央から５Ｍ４のストリップを切り取った。ポリクローナル抗マイコプラズマ血清をこのストリップに結合させ、洗浄して、ウェスタンプロット溶出液により溶出させた。次いで溶出した抗体を用いて、マイコプラズマ蛋白のウェスタンプロットをプ抗原反応性を有する多数のＨ，ｈｙｏｐｎｅｕｓｏｎｉａｅ組換えファージクローンを、発現ライブリー中で同定した。ラムダＣ１ｔ１１溶原菌は限られた量の融合蛋白した産生じないと考えられたので、ミリグラムのオーダーで融合蛋白を産生ずるプラスミド発現ベクターをｌａ築した。

Ａ、ＤＳＥＶ４Ｄｒ、　Ｌ、　Ｇｕａｒｅｎｔｅ　（Ｍ　Ｉ　Ｔ　）からプラスミドｐＬＧ２を得た（Ｇｕａｒｅｎｔｅ、　Ｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　２０　：　５４３−５５３（１９８０））。このベクターはｐＢＲ３２２誘尋体であって、３′末端近くに唯一のＥｃｏＲＩ部位を有する野生型ベーターガラクトシダーゼ遺伝子に加えて、ラムダｃ＋ｔｉ　ｉと同様に、１ａｃオペレーターとプロモーター配列を有している。更にプラスミドｐＬＧ２は１８Ｃレプレツサー遺伝子を持っている。ラムダｏｔｌｌから得たＨ、　ｈｙｏｐｎｅｕｓ＋ｏｎｉａｅ［）　Ｎ　Ａ挿入配列をこのベクターのＥＣｏＲＩ部位に移して、ファージ中で最初に同定されたものと同一の融合蛋白を得た。

発現用に用いる前に、プラスミド−ｐＬＧ２を修正して余分なＥｃｏＲＩ部位を除いた。ＥＣ０ＲＩ制限酵素でプラスミドＥ）ＬＧ２を部分消化してこのプラスミドを線状化した。このプラスミドＤＮＡを分離用アガロースゲルに付して、線状ＤＮＡバンドをゲルから溶出させた。

溶出したＤＮＡを、酢酸ナトリウムを加えてその溶液を０．３Ｍとし２．５倍容吊のエタノールを加えて沈殿させた。遠心してＤＮＡをベレット化し、ＴＥバッファーに再懸濁させた。ｄＡＴＰとｄＴＴＰの存在下でＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片とＤＮＡとを混合して、ＥＣ０ＲＩ粘看末端を充填した。７０℃で１０分間加熱して不活性化させた後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐ、Ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）を加えて、４℃で１６時間インキュベートした。次いで、連結したＤＮＡを用いてＥ、　ｃｏｌｉ　ＡＭＡＩ　００４を形質転換した（　Ｃａ５ａｄａｂａｎ。

Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、　ＨｅｔｈＯｄＳ　ｉｎ　ｒｎｚｙｗ＋ｏ＋ｏｏｙ１００　：　２９３（１９８３））。

ベーターガラクトシダーゼ活性（Ｘ−ＧＡＬ）用の発色性基質の存在下で、アンピシリンプレート上で形質転換体を選択した。ベーターガラクトシダーゼ活性を有する形質転換体を、ＥＣ０ＲＩでそのＤＮＡを開裂することによってスクリーニングした。ベーターガラクトシダ−ゼ遺伝子のアミン末端近くに唯一のＥＣｏＲＩ部位を有するプラスミドｐＳＥＶ４を、形質転換体から同定しその特徴付けを行なった。

プラスミドＤＳＥＶ４は、ベーターガラクトシダーゼ遺伝子のアミノ末端近くにユニークＥＣ０ＲＩ部位を有している。プラスミド１）ＳＥＶ４は、ベーターガラクトシダーゼ遺伝子に加えて、野生型の１ａｃオペレーター、プロモーター及びリプレッサーを有している。Ｉ　ＰＴＧで６０分ａ：１Ｒｓｔ、た所、ベーターガラクトシダーゼ活性が３００倍に上昇した。プラスミドｐＳＥＶ４を含む誘導しない細胞は、全細胞蛋白当り約１０００ユニツトを産生し、他方、Ｉ　ＰＴＧで誘導した細胞は、全細胞蛋白当り約３００．０００ユニツトを産生じた。誘導ＩＢ胞及び非誘導Ｉ胞の蛋白をゲル分析した所、ｙｋ導細胞によってベーターガラクトシダーゼが過剰に産生されることが示された。このｒｎ浜なプラスミドＤＳＥＶ４を用いて、融合蛋白として多数のＨ，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原を発現せしめた。

Ｂ、ｐＳＥＶ６ラムダＱｔ１１から得たＤＮＡ挿入配列を直接プラスミド発現ベクターに分極化カセットサブクローニングを行なうことが可能となるように、ＤＳＥＶ４を用いてベクターを構築した。、ＥｃｏＲＩ挿入配列はＤＳＥＶＡ中にいずれの方向でもサブクローニングすることが出来るので、それぞれのｐｓＥＶ４を抗原反応のためにサブクローニング出来る。Ｉ）ＳＥＶ６を用いて分極サブクローニングを行なうことにより、余分な分析をする必要がなくなる。

ＤＳＥＶ４をマツビツングした所、ベーターガラクトシダーゼ遺伝子のユニークＥｃｏＲＩ部位の５′側の１ａＣオペロン中に５つ“の制限酵素部位を有していた。

これらの部位のうち３つの部位はユニーク部位であり、他の２つの部位は、！ａＣＩ遺伝子とｐＢＲ３２２由来ａｍｐ’遺伝子との間の余分なりＮＡを除去することによってユニーク部位とした。ＥｃｏＲＩとＮＣｏＩ部位の３′側に唯一の有用な制限酵素部位が見出されたので、化学合成ポリリンカーを用いてこの領域に更に制限酵素部位を挿入した。

ｏｓＥＶ６を２工程で構築した。最初に、余分なりＮＡをｌ去り、ｒｐｓＥＶ４を約５．７００ｂＤＥか＜Ｌ。

た。Ｓ　ｐ　ｈ　Ｉ　ＩＪ限酢素でプラスミドＤＳＥＶ４を開裂し、この酵素を７０℃で１０分間加熱して不活性化した。次いで得られるＤＮＡをＡａｔＩ［で部分消化し、得られる消化物を分離用アガロースゲルを用いた電気泳動に付した。ゲルから７．６２０ｂｐの断片を切り出し電気溶出させた。

溶出したＤＮＡに２．５倍容量のエタノールを加えて一７０℃で３０分間インキュベートして、０．３Ｍ酢酸ナトリウム溶液からＤＮＡを沈殿させた。Ｂｒ１ｎｌｖａｎマイクロ遠心機で１５分間ベレット化することによりＤＮＡを濃縮し、ペレットをＴＥバッファー中に再懸濁した。

ＡａｔＩ［消化によって生じる粘着末端を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）を加えて平滑末端とした。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを加熱して不活性化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ｐ、　Ｌ、　Ｂｉｏｃｈｍｉｃａｌｓ　）を加えて、ＤＮＡＩＩｊ片の平滑末端を連結させた。連結したＤＮＡを用いてコンピテントＡＭＡ１００４　Ｅ、　ｃｏｌｉを形質転換したｅｌ−ａｃ　形質転換体を用いて７．６２０ｂｐプラスミドの存在をスクリーニングした。過当な構造を有するプラスミドとして、プラスミドＤＳＥＶ５を同定しその特徴付けを行なった。

Ｗ卑怯によりｐｓＥＶ５からＤＮＡを精製し、次いで制限酵素ＮＣ０Ｉで開裂した。これにより、ベーターガラクトシダーゼ遺伝子の３′側のユニーク部位が開裂される。オリゴヌクレオチドアダプター分子によりＮＣｏＩ部位が作成され、またＢＱｊＩ［とＫｐｎＩ部位を有するオリゴヌクレオチドアダプター分子を化学的に合成した。このアダプター分子の配列は以下の通りである。

５’−ＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡ＾ＴＡＡＣＡＴＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧ−３’３ ’−ＡＣＧＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＡＴＡＣＣＴＴＡＡＧＣＴＣＣＴＡＧ−５゜Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐ、Ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）を用いて、このオリゴヌクレオチドを、ＮｃｏＩで開裂した。５ＥＶ５に連結した。得られるＤＮＡを用いてコンピテントＥ、　ｃｏｌｉ　ＡＭＡ　１００４を形質転換した。得られる１ａＣ＋形質転換体のＤＮＡについて、ユニークＫＣ）ｎＩ及びＮｃｏ　Ｉ部位の存在をスクリーニングした。

このスクリーニングにより、意図する配列を全て含むプラスミドが同定された。

このプラスミドｐＳＥＶ６を、各種の抗原反応性融合蛋白の発現用に用いた。

■、動物テスト用のクローン化抗原の精製ベーターガラクトシダーゼ用の基質アナログを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、あるいは古典的な蛋白ｍ製法により、ベーターガラクトシダーゼ：Ｈ，ｈｙＯｐｎｅＬＩＩＩＯｎｉａｅ抗原融合蛋白を精製した。

Ａ、抽出物の精製５０μｇ／ｍｅアンピシリンを含むｔｕｒｉａブロース（ｐＨ７，５＞２１に、組換えプラスミドの１つを保持するＥ、　ｃｏｌｉ　ＡＭＡ　１００４を１晩培養したちの１０−２０〆を接種した。ＩＢ胞を３７℃で、対数増殖期の中期＜Ａ６ｏｏ＝０．２＞まで生育させた。インプロピルチオガラクトシド（ｌ　ＰＴＧ）を終瀧度１＋ａＨで加えて、融合蛋白の形成を誘導した。細胞を２時間生育せしめ、次いで４℃で１５分閤５０００ＸＧで遠心してｎＩ胞を採取した。これに続く全ての操作は４℃で実施した。

ａ胞をブレーキングバッファー（５０＊ＨＴｒｉｓ　−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，２５０＋ＨＮａＣ１，１０ｍＭＶＩＱＣＩ　、５％グリセロール、１１１Ｈフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ））２０−に４℃で再懸濁せしめ、５０°００×Ｇで１５分間再び遠心した。細胞をブレーキングバッファー２Ｏ− ４０ｄに再懸濁した。

この時点で細胞を凍結し、必要に応じて一２０℃で保存した。

不凍結の細胞又は溶解した細胞を、２０．０００ｐｓｉでＦｒｅｎｃｈプレッシャーセル（Ａｇｍｉ、ｃｏ）に２回通して破壊した。３０．０ＯＯＸＧで３０分間遠心して細胞破片を除いた。１ｏｏ、０ＯＯｘＧで３０分間超遠心して抽出物を更に分画した。終濃度２０−４０％飽和濃度で硫酸アンモニウムを加えて融合蛋白を沈殿させた。融合蛋白を沈殿させるのに必要な最適濃度は個々の蛋白によって変動するので、例えば、ＨｅＤＤｅｌ、　Ｌ、、　ＨｅｔｈＯｄＳ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１　：　５７０−５７６　（１９５５）に記載された方法を用いて実験的に決定しなければならない。

沈殿溶液を１Ｒｆｌｌｌ攪拌し、３０．０ＯＯＸＧで１５分間遠心して沈殿を採取した。ペレットをスターティングバッファー（５０ｓＨＴｒｉｓ−ＨＣｊ、ＥＩＨ７，５，２５０１１ＨＮａＣｊ、１０ｓＨＭｇＣｊ　、１ｅＨジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び０．１％■「目ｏｎＸ−１００＞１Ｏ−１５ｄに溶解し、５００＋ｄのスターティングバッファーに対して透析した。

１．アフィニティーｔａｉｔＪ法５ｔｅｅｒＳとＣｕａｔｒｅｃａＳａＳ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎハｌｌ０ＩＯＱＶ、３４　：３５０−３５８　（１９７４）に記載された方法に基づいて、ベーターガラクトシダーゼアフィニティーカラムを用いた。アフィニティー樹脂（ｐ−アミノフェニル−ベーター−Ｄ−チオガラクトピラノ　シドーアガ０− ス、Ｓｉｇｍａ社から入手）を、直径１．５１Ｊのカラムに１５ｃの長さで詰めた。使用前に、スターティングバッファー（５０１８Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ、ＣＨ７，５，２５０１１１４ＮａＣｊ、１０ｓＨＭＧＣｊ　、１．０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ＞及び０．１Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ　１００）のカラム１０倍容量で洗浄した。使用後に、溶出バッファー（０，１ナトリウムボレート、ｐＨ１０，０，２５０ｓＨＮａＣ１，１ｍＨＤ　Ｔ　Ｔ　）で十分に洗浄することにより、あるいは６Ｍグアニジン塩酸塩の５０ｍＨＴｒｉｓ　−ＨＣ１（ｐＨ７，５）溶液で洗浄することによってカラムを再生することが出来る。洗浄後に、スターティングバッファーのカラム１０倍容量で再び平衡化する。

アフィニティークロマトグラフィーを行なうために、透析した材料を流速的０．２ＩＪ！／ｍｉｎであらかじめ平衡化したアフィニティーカラムに付した。サンプルをカラムに付した後、同じ流速でスターティングバッファー１５ｄ、次いで約０．５ｍ／１ｎの流速でスターティングバッファー３０ａｅ更に約１ｄ／ｗｉｎの流速でスターティングバッファー１８０Ｉｉを用いてカラムを洗浄した。最後に、同じ流速でＴｒｉｔＯｎを除いたスターティングバッファー１２０ｄでカラムを洗浄した。流速的１ｍ／ｗｉｎで溶出液（０，１＋）−ＩＪ’７ムボＬ／ −）−１ｌｌＨ１０，Ｏ１２５ＯｍＨＮａＣｊ！１１ｍＨＤＴＴ）１２０ｍを用いて、吸着した蛋白を溶出させた。フラクションを含むピーク蛋白を集めて、必要に応じて、ＹＭ−３０Ｉｌを有するＡ１１ＣＯｎ限界ｉｉｉ過１　（Ｍｏｄｅｌ　８０５０）　ヲ用いて濃縮することも出来る。

２、超遠心による精製いくつかの融合蛋白（例えばＥ）ＳＥＶ４　：　：　ＣＨ２−１３）に使用できる他の精製法は、上記した透析蛋白を用いることによって遺戒できる。透析した材料を１００゜０００ＸＧで３０分間超遠心する。′＃１１合蛋白を含むペレットを少量の透析用バッファー（５０ｓＨＴｒｉｓ−ＨＣｊ、ｔｌＨ７，５，２５０ｓＨＮａＣ１，１０１８ＭＧＣｊ２及び１．０Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び０．１ＭＴｒｉｔｏｎ　−Ｘ　１００　）　ニ’ｌｉ解シタ。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた所、この方法によって得られる物質は、アフィニティーカラムによって得られるものほど純度は高くはなかった。

３、九逝これらの方法によって得られる精製した物質について、Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）蛋白法を用イＴ　ｇ追考の指針に従って蛋白の分析を実施した。またＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析も行なった。

蛋白を発色させることにより、あるいはウェスタンプロット分析によってゲルを視覚化させた。簀ｒａｇ、　Ｗ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、。

＾ｎａ１．　Ｂｌｏｃｋｅｍ、　１１８：１９７−２０３　（１９Ｂ１）に記載された銀染色により、あるいはＢｉｏ−Ｒａｄ蛋白染色によって、蛋白を発色させることが出来る。Ｒｅ１ａｒｔ。

Ｊ、　ｅｔ　ａｔ、、　ＰＮＡＳ（ＬＩＳＡ）７６　：　３１１６　（１９７９）に記載された方法に従ってウェスタンプロット分析を実施することが出来る。

ウェスタンプロット分析では、溶解した蛋白バンドをニトロセルロースに移し、ニトロセルロースペーパーをＢＳＡでブロックし、次いで特異的抗体（抗ベーターガラクトシダーゼ又は抗マイコプラズマ血清）でプローブする。洗浄後、適当なパーオキシダーゼを結合した２次抗体でプロットをプローブし、次いでパーオキシダーゼ触媒反応によって発色させる。

各種の抗マイコプラズマ血清と反応性を有するものとしてピックアップされた組換えＨ，ｈｙ０ｐｎｅｔｌｌｌｏｎｉａｅクローンは、特定のポリペプチドをコードする全領域の１部しか含んでいない。何故なら、挿入配列はラムダＱｔ１１のベーターガラクトシダーゼ遺伝子とともにフレーム中に存在している必要がありまたスクリーニングしたクローンの数が限られていたためである。ある場合には、免疫応答を最大にするためにあるいは調節するために、Ｈ，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原性ポリペプチドの全コード領域をクローン化することが重要である。全長断片を含むり〇−ンの１１１１を行なう方法のアウトラインを以下に示す。

Ｈ，ｈｙｏｐｎｅｕｗｏれｉａｅの挿入セグメントを融合蛋白として発現する必要がない場合には、上記したラムダｇｔｉ　１発現ライブラリーはシンプルゲノムライブラリーと見ることが出来る。

特定の蛋白をコードする領域がベーターガラクトシダーゼ発現系とともにフレーム中にあったとしても、このようなりローンのいくつかはこの特定の蛋白をコードする全領域を含んでいることがある。

このようなり０−ンは、抗体法によって既にピックアップされたクローンから得たものであって特定のマイコプラズマ蛋白に対応することが既知のＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを用いることによって検出できる。

このようなりローンから得られる挿入断片を、Ｅ　ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼを用いてニックトランスレーションに付して、３２Ｐ−ラベル化デオキシヌクレオチドを該ＤＮＡ中に導入する。このラベル化ＤＮＡを放射活性プローブとして用い、組換えラムダｇｔ１１ライブラリーからＨ，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ相同性配列を選択する。この方法によって組換えライブラリーから選択されたファージが１ｉ製プラークであり、ＤＮＡを調製し、そしてＨ，ｈｙｏｐｎｅｕｌｏｎｉａｅ特巽的挿入配列を各種のｉｉ＋１限酵素を用いてマツピングする。得られるマツプを、最初のクローンから得た同様のマツプと比較して、新しいゲノムファージであることを確認する。

原核生物遺伝子にはイントロンが存在しないため、コードされる蛋白のサイズから、全遺伝子が含まれているためにはラベル化ＤＮＡのいずれかの側にどの程度の大ビさのＤＮＡがなければならないかを決定することが出来るゎ全遺伝子は１つのクローン中に含まれていないこともあるが、しかしながら当業者ならば全遺伝子を得ることは可能である。Ｂｅｎｄｅｒ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｈｏｔ、　Ｂｉｏｌ。

１６８　：　１７−３３　（１９８３）に記載された方法を用いて、１４．　ｈｙｏｐｎｅｕｌＯｎｉａｅフランキングゲノムＤＮＡを含むファージを単離してｓ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムにそって調べることによって全遺伝子を得ることができる。この文献の記載を本明細書に引用する。

■０表面蛋白に対応するクローンの同　法マイコプラズマ細胞の表面上にさらされている蛋白は、そのインタクト全細胞をトリプシンなどのプロテアーゼでわずかに処理した時に、該酵素による消化に敏感であることが示されている（Ｋｌｉｎｋｅｒｔ、　Ｈ，、Ｈｅｒｒｉａｎｎ、　Ｒ，。

と５ｃｈａｌｌｅｒ、　Ｈ，、（１９８５）　、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ　４９　、３２９−３３５　）　、クローンからの抗体の溶出とこの技術を用いることによって、トリプシン感受性表面蛋白に特定のクローンが対応しているか否かを迅速に決定することが出来る。トリプシン処理したマイコプラズマ細胞から得た全蛋白及びトリプシン処理をしないマイコプラズマ細胞から得た全蛋白を、となり合わせたレーンに置いて、ＳＤＳポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動で分離スる。次いで、ウェスタンプロット法によって、蛋白をニトロセルロース股に移す。上記した抗体溶出法により特異的りＯ−ンからアフィニティーｙｉｔｊしたポリクローナル血清から得られる抗体を用いて、このプロットをプローブする。

トリプシン処理をしない＠臣から得た蛋白のレーン中の結合抗体を染色することによって、クローンに対応するウェスタンプロット上の特異的マイコプラズマ蛋白が現われ、特異的発色ハントとして示される。この蛋白がトリプシン感受性であれば、トリプシン処理した１［１１１から得た蛋白のレーン中の対応する位置がブランクとなり、他方、トリプシン非感受性バンドは、未処理細胞中で発色される。

本発明の方法においては、各種の修正及び変更が当業者にとっては明らかであろう。そのような修正及び変更が木用Ｉｌｌの請求の範囲及びその均等物の範囲内のものであれば、いずれもそれらは本発明によってカバーされるものである。

゛　国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．プロテインＡ、プロテインＢ、プロテインＣ、プロテインＤ及びプロテインＥからなる群より選はれる本質的に純粋なＭｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ蛋白。
２．フアージラムダ９ｔ１１クローンＲ６０ｂ。
３．フアージラムダ９ｔ１１クローンＬＭＨＣｌ−９。
４．フアージラムダ９ｔ１１クローンＲ６９。
５．フアージラムダｇｔ１１クローン８６−４。
６．フアージラムダｇｔ１１クローンＰ１。
７．抗原性応答を誘導することの出来るマイコプラスマポリペプチドと類似のポリペプチドを製造するための組換えＤＮＡ法であつて、（ａ）マイコプラズマによつて産生されるポリペプチドが有する抗原特性と類似した抗原特性を有するポリペプチドを宿主微生物に産生させることの出来るＤＮＡ配列を調製し；（ｂ）該ＤＮＡ配列のためのオペレーションエレメントを含有するベクターであつて、宿主微生物中に導入されそこで複製することの出来るベクターに、該ＤＮＡ配列をクローニングし：（ｃ）かくして得られる該ＤＮＡ配列及びオペレーションエレメントを含むベクターを、抗原性ポリペプチドを発現することの出来る宿主微生物中に導入し：（ｄ）該ベクターの増幅及びポリペプチドの発現に選当な条件下で該宿主微生物を培養し；（ｅ）次いで、（ｉ）ポリペプチドを回収する、及び（ｉｉ）ポリペプチドの構造を推定して、マイコプラズマによつて産生されるポリペプチドが有する抗原特性と類似した抗原特性を有するポリペプチドを同定する、ことをいずれかの順序で行なう：ことからなる上記方法。