DE3751727T2

DE3751727T2 - Polypeptide zur verwendung bei der diagnose von mycoplasmainfektionen bei schweinen, sowie rekombinant-dns-verfahren zur herstellung derselben

Info

Publication number: DE3751727T2
Application number: DE3751727T
Authority: DE
Inventors: Jerry Kuner
Original assignee: Amgen Boulder Inc
Current assignee: Amgen Boulder Inc
Priority date: 1986-07-25
Filing date: 1987-07-22
Publication date: 1996-07-25
Anticipated expiration: 2007-07-23
Also published as: EP0315637A4; HU208550B; DK160888A; IL83324A0; AU7784687A; DE3751727D1; HUT52819A; AU622855B2; WO1988000977A1; EP0315637A1; JPH01503753A; EP0315637B1; DK160888D0; IL83324A; ATE135048T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Klasse von Polypeptiden, die in diagnostischen Assays zum Bestimmen der Anwesenheit von Antikörpern gegen Mycoplasmaorganismen in Säugern, insbesondere in Ferkeln oder Schweinen, nützlich sind. Die Erfindung betrifft auch rekombinanate DNA-Verfahren zum Herstellen dieser Polypeptide und rekombinante Phagenclone, enthaltend DNA- Seqeuenzen, die zur Verwendung in den rekombinanten Verfahren geeiqnet sind.
Enzootische Pneumonie von Schweinen, auch als Viruspneumonie, infektiöse Pneumonie, anteriore Lappenpneumonie, enzootische Viruspneumonie und mycoplasmale Pneumonie des Schweins bekannt, verursacht selten den Tod, aber führt oft zu schwerer Morbidität und verringerter Leistungsfähigkeit hinsichtlich der Gewichtszunahme von Schweinen. Ursprünglich wurde angenommen, daß sie von einem Virus verursacht wird, 1965 wurde ermittelt, daß das auslösende Agens Mycoplasma hyopneumoniae, auch als Mycoplasma suipneumoniae bekannt war.
Diese Krankheit wird von Schwein zu Schwein übertragen über die nasalen Passagen bei in Luft enthaltenen Organismen, die von infizierten Schweinen ausgestoßen werden. Die Mycoplasmen etablieren sich selbst tief in dem apicalen und Herzlappen der Lungen, wo sie sichtbare, pflaumenfarbige oder graue Läsionen hervorrufen und Schwierigkeiten beim Atmen und verringerte Gewichtszunahme verursachen. Die primäre Infektion durch M. hyopneumoniae kann von einer sekundären Infektion durch andere Mycoplasmaarten (M. hyorhinus und M. floculare) wie auch von bakteriellen Pathogenen (Pasteurella- und Bordetellaarten) gefolgt werden.
Die Mycoplasmen sind prokaryotische Zellen, die kleiner und einfacher in der Struktur sind als Bakterien, aber komplexer als Viren. Im Gegensatz zu Viren sind sie in der Lage, freilebend vorzukommen, obwohl sie oft mit eukaryotischen Zellen assoziiert sind. Sie sind von einer Zellmembran, aber nicht von einer Zellwand umgeben. Sie besitzen ein extrem kleines Genom, ungefähr 750000 Basenpaare in Länge.
Während die Krankheit oft nicht fatal ist, verursacht sie ein verlangsamtes Wachstum und verlangsamte Gewichtszunahme in den betroffenen Tieren zu einem Zeitpunkt, wenn die Tiere für die Vermarktung gefüttert werden. Somit sind Tiere, die durch den Organismus infiziert worden sind, beim Schlachten weniger wert als nicht-infizierte Gegenstücke.
Wegen der ernsthaften ökonomischen Konsequenzen von Schweinepneumonie, ist nach diagnostischen Testverfahren gesucht worden, die die Anwesenheit einer Infektion, verursacht durch Mycoplasma hyopneumoniae, in Schwein, anzeigen.
EP-A-0196215 beschreibt Oberflächen-Antigene von Mycoplasma hyopneumoniae. Antiseren weisen in Western Blots von Gesamtzellproteinen von M. hyopneumoniae mehrere Proteine mit Molekulargewichten von 90000, 68000, 50000, 30000 bzw. 26000 nach. Die vorliegenden Erfinder haben eine Klasse von Polypeptiden gefunden, die nützlich sind bei der Diagnose von dieser und bestimmten anderen Mycoplasma-infektionen. Diese Polypeptide zeigen, wenn sie in diagnostischen in vitro Assays verwendet werden, die Anwesenheit von Antikörpern gegen bestimmte Mycoplasma-Organismen in infizierten Ferkel- und Schweineseren an.
Um die Verwendung dieser Polypeptide zu erleichtern, betrifft die vorliegende Erfindung auch rekombinante DNA-Verfahren zum Herstellen der Polypeptide. Diese rekombinanten DNA-Verfahren verwenden DNA-Sequenzen, die in verschiedenen rekombinanten Phagendonen enthalten sind, die hierin beschrieben werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Polypeptide bereitzustellen, die in der Diagnose von bestimmten Mycoplasmainfektionen, insbesondere von Mycoplasma hyopneumoniae-Infektionen, im Schwein nützlich sind. Es ist auch eine Aufgabe der vorligenden Erfindung, rekombinante DNA-Verfahren zum Herstellen dieser Polypeptide zu identifizieren.
Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden teilweise in der Beschreibung, die folgt, ausgeführt, oder sie können anhand der Ausübung der vorliegenden Erfindung erlernt werden. Die Aufgaben und Vorteile können realisiert und erzielt werden anhand der Mittel und Kombinationen, die insbesondere in den beigefügten Ansprüchen ausgeführt sind.
Zur Lösung der Aufgaben und in Übereinstimmung mit den Zwecken der vorliegenden Erfindung werden Proteine A, C, D und E, wie in Anspruch 1 angegeben, offenbart. Die DNA, die Teilen dieser Proteine entspricht, ist in verschiedenen Lambda-Phagen enthalten, die ebenfalls hierin identifiziert und in den Ansprüchen 2 bis 5 spezifiziert werden.
Weiterhin wird ein rekombinantes DNA-Verfahren zur Herstellung der Polypeptide, wie in Anspruch 1 spezifiziert, offenbart.
Diese Proteine können einen immundiagnostischen Komplex erzeugen, wenn sie Seren aus Schweinen ausgesetzt werden, die mit Mycoplasma hyopneumoniae und bestimmten anderen Mycoplasmaorganismen infiziert sind. Dieses Verfahren umfaßt:
(a) Herstellen einer DNA-Sequenz, die einen Wirtsmikroorganismus veranlassen kann, das Protein herzustellen;
(b) Clonieren der DNA-Sequenz in einen Vektor, der in einen Wirtsmikroorganismus übertragen und darin repliziert werden kann, wobei der Vektor Kontrollelemente für die DNA-Sequenz enthält;
(c) Übertragen des Vektors, enthaltend die DNA-Sequenz und die Kontrolleelemente, in einen Wirtsmikroorganismus, der das antigene Protein exprimieren kann;
(d) Kultivieren des Mikroorganismus unter Bedingungen, die geeignet sind zur Amplifikation des Vektors und zur Expression des Proteins; und
(e) in beliebiger Reihenfolge:
i) Ernten des Proteins; und
ii) Veranlassen des Proteins, eine Struktur anzunehmen, wodurch es antigene Eigenschaften erhält, die analog sind zu den Eigenschaften, die Mycoplasma-Organismen aufweisen.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Jetzt wird ausführlich Bezug genommen auf die gegenwärtig bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen, die zusammen mit den Zeichnungen und den folgenden Beispielen dazu dienen, die Prinzipien der vorliegenden Erfindung zu erläutern.
Wie oben ausgeführt, betrifft die vorliegende Erfindung eine Klasse von Polypeptiden, die nützlich sind, u.a. zur in vitro- Diagnose von Mycoplasma-infektionen in Schwein. Diese im wesentlichen gereinigten Proteine sind analog zu verschiedenen Mycoplasma hyopneumoniae-Proteinen, von denen angenommen wird, daß sie eine Immunantwort induzieren können, wenn sie in Schweinegewebe vorliegen. Da eine Immunantwort in infizierten Schweinen gegen analoge Antigene hervorgerufen worden ist, enthalten die Seren solcher infizierten Schweine Antikörper, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Polypeptide erkennen. Somit können die augenblicklichen Polypeptide, entweder in Kombination oder einzeln, als der aktive Bestandteil in einem diagnostischen in vitro Assay dienen, um die Anwesenheit von Antikörpern in Schweineseren zu bestimmen, die gegen verschiedene Mycoplasma-Arten gerichtet sind.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff "anajog", wenn in Verbindung mit einem Protein, Antigen oder Polypeptid verwendet, ein Polypeptid bedeuten, das Antikörper nachweisen kann, die in Antwort auf eine Infektion mit natürlichen Mycoplasma-Proteinen im Schwein hervorgerufen wurden. Ein Polypeptid, das analoge antigene Eigenschaften besitzt, wird somit gewisse Homologie zu dem nativen Mycoplasma-Protein aufweisen. Es ist anzumerken, daß "analoge" Polypeptide, so wie der Begriff hierin verwendet wird, eine Immunantwort hervorrufen können die stärker ist, gleich ist oder schwächer ist, als die Antwort, die durch natürliche Mycoplasma-Proteine hervorgerufen wird.
Die folgenden Oberflächenproteine sind von den vorliegenden Erfindern als brauchbar in solchen in vitro-Diagnostika aufgefunden wurden. Diese umfassen: Protein A, ein 105 kD-Protein von M. hyopneumoniae; Protein C, ein 85 kD-Protein von M. hyopneumoniae; Protein D, ein 70 kD-Protein von M. hyopneumoniae; Protein E, ein 43 kD-Protein von M. hyopneumoniae. Es ist anzumerken, daß die mit den hierin offenbarten Proteinen assoziierten Molekulargewichte nicht als absolute Werte zu interpretieren sind, und sie wurden durch SDS-PAGE bestimmt. Es wird angenommen, daß jedes der Proteine A bis E ein Protein darstellt, das auf der Oberfläche des Mycoplasma-Organismus vorkommt. Wenn intakte Mycoplasmazellen leicht mit einer Protease (Trypsin) behandelt werden, besitzt jedes dieser Proteine Sensititvität gegenüber dem Abbau durch die Protease, wobei dies ihre Lage auf der Zelloberfläche anzeigt.
Weiterhin wird angenommen, daß jedes dieser Proteine einen oder mehrere spezifische Anteile enthält, der als antigene Determinante dienen kann, die an mindestens einen Antikörper binden kann, der in Seren von mit Mycoplasma infiziertem Schwein vorliegt. Diese spezifischen antigenen Anteile könnten, entweder alleine oder in verschiedenen Kombinationen deshalb als die Basis für einen diagnostischen in vitro-Assay dienen.
DNA-Sequenzen, die Teile dieser Proteine codieren, sind in den hierin identifizierten Lamda gt11-Clonen enthalten. Die DNA- Sequenzen, die für die vollständigen Proteine codieren, sind in der gleichen gt11-Bank enthalten, aus der die obigen Clone stammten, und es werden unten Verfahren beschrieben, die die Identifizierung und Isolierung solcher done erlauben.
Ein Teil des Gens, das das Polypeptid A (105 kD) codiert, ist in dem Lamda gt11-Clon R60b enthalten, der ein Insert von Mycoplasma-DNA von 1,5 Kilobasen enthält. Dieses Fragment kann unter Verwendung der Restriktionsendonukleasen KpnI und SacI herausgeschnitten werden, die in den flankierenden Vektorsequenzen, aber nicht innerhalb des Inserts spalten. Das entsprechende Expressionsplasmid R60b-a ist konstruiert worden durch Insertion des KpnI/SacI-Insertionsfragments des Lambda gt11-Clons in den Plasmidvektor pSEV6.
Ein Teil des Gens, das das Polypeptid C (85 kD) codiert, ist in dem Lambda gt11-Clon R69 enthalten, der ein Insert von Mycoplasma-DNA von 0,5 Kilobasen enthält. Dieses Fragment kann unter Verwendung der Restriktionsendonukleasen KpnI und SacI herausgespalten werden, die in den flankierenden Vektorsequenzen, aber nicht innerhalb des Inserts spalten. Das entsprechende Expressionsplasmid R69b ist konstruiert worden durch Insertion des KpnI/SacI-Insertionsfragments des Lambda gt11- Clons in den Plasmidvektor pSEV6.
Ein Teil des Gens, das das Polypeptid D (70 kD) codiert, ist in dem Lambda gt11-Clon 86-4 enthalten, der ein Insert von Mycoplasma-DNA von 3,2 Kilobasen enthält. Dieses Fragment kann herausgespalten werden unter Verwendung der Restriktionsendonukleasen KpnI und SauI, die in den flankierenden Vektorsequenzen, aber nicht innerhalb der Inserts spalten. Das entsprechende Expressionsplasmid 86-4C ist konstruiert worden durch Insertion des KpnI/SauI-Insertionsfragments des Lambda gt11- Clons in den Plasmidvektor pSEV6.
Ein Teil des Gens, das das Polypeptid E (43 kD) codiert, ist in dem Lambda gt11-Clon P1 enthalten, der ein Insert von Mycoplasma-DNA von 0,5 Kilobasen enthält. Dieses Fragment kann herausgespalten werden unter Verwendung der Restriktionsendonukleasen KpnI und SacI, die in den flankierenden Vektorsequenzen, aber nicht innerhalb des Inserts spalten. Das entsprechende Expressionsplasmid P1C ist konstruiert worden durch Insertion des KpnI/SacI-Insertionsfragments des Lambda gt11- Clons in den Plasmidvektor pSEV6.
Verschiedene Verfahren können verwendet werden zum Exprimieren der DNA, die die Proteine oder die vorgeschlagenen antigenen Determinanten codiert. Insbesondere kommt in Betracht, die DNA, die in den gt11-Phagenclonen enthalten ist, in Säugersystemen zu exprimieren.
Bei einer alternativen bevorzugten Ausführungsform wird in Betracht gezogen, die DNA von Interesse aus der DNA, die in dem gt11-Phagenclon enthalten ist, herauszuspalten, und in einer geeigneten Form in ein mikrobielles Expressionssystem einzuführen. Bei dieser Ausführungsform werden die antigenen Polypeptide hergestellt nach einem Verfahren, umfassend:
(a) Herstellen einer DNA-Sequenz, die einen Wirtsmikroorganismus veranlassen kann, ein Polypeptid herzustellen, das antigene Eigenschaften besitzt, die analog sind zu solchen, die ein Polypeptid besitzt, das von einem Mycoplasma-Organismus hergestellt wird;
(b) Clonieren der DNA-Sequenz in einen Vektor, der in einen Wirtsmikroorganismus übertragen und darin repliziert werden kann, wobei ein solcher Vektor Kontrollelemente für die DNA-Sequenz enthält;
(c) Übertragen des Vektors, enthaltend die DNA-Sequenz und Kontrollelemente, in einen Wirtsmikroorganismus, der die antigenen Polypeptide exprimieren kann;
(d) Kultivieren des Wirtsmikroorganismus unter Bedingungen, die geeignet sind zur Amplifikation des Vektors und zur Expression des Polypeptids; und
(e) in beliebiger Reihenfolge:
i) Ernten des Polypeptids; und
ii) Veranlassen des Polypeptids, eine Struktur anzunehmen, wodurch es antigene Eigenschaften erhält, die analog sind zu den Eigenschaften, die Polypeptide besitzen, die von Mycoplasma-Organismen erzeugt werden.
Da M. hyopneumoniae ein Prokaryont ist, kann genomische DNA direkt verwendet werden, ohne Bedenken hinsichtlich von Introns haben zu müssen. Jedoch ist von mindestens einer Mycoplasma-Art gezeigt worden, daß sie das normale Stopcodon UGA als ein Tryptophancodon bei der Proteinsynthese verwendet. Falls dies auch für M. hyopneumoniae gilt, würde die Expression in anderen Systemen (z.B. E. coli) in vorzeitigem Abbruch während der Proteinsynthese enden, wenn dieses Codon als ein Stopcodon gelesen wird. ob dies für die Proteine von Interesse der Fall ist, kann ermittelt werden durch Kultivieren des Expressionsvektors in geeigneten tRNA-Suppressorstämmen. Falls ein vorzeitiger Abbruch auftritt, ist es auch möglich, das Problem zu korrigieren durch DNA-Sequenzierung des Bereichs, enthaltend das UGA-Codon, und Substituieren durch das geeignete Codon durch zielgerichtete Mutagenese. Diese Verfahren können vom Fachmann leicht ausgeführt werden.
Die gemäß dem obigen Verfahren hergestellte DNA wird in einen Expressionsvektor eingefügt, der geeignet ist zur Verwendung in dem beabsichtigten Expressionssystem. Erfindungsgemäße Ausführungsformen können auch andere bekannte oder gegenwärtig unbekannte Vektoren verwenden, die eine oder mehrere der DNA- Sequenzen enthalten, die die hierin beschriebenen antigenen Polypeptide codieren. Insbesondere ist bevorzugt, daß diese Vektoren einige oder sämtliche der folgenden Eigenschaften aufweisen:
(1) sie besitzen eine minimale Anzahl an Wirtsmikroorganismus- Sequenzen;
(2) sie sind in dem gewünschten Wirt stabil;
(3) sie können in einer hohen Anzahl von Kopien in dem gewünschten Wirt vorliegen;
(4) sie besitzen einen regulierbaren Promotor;
(5) sie besitzen mindestens eine DNA-Sequenz, die einen selektierbaren Stoffwechselweg codiert, die auf einem Teil des Plasmids vorliegt, der getrennt ist von der DNA, in die die DNA-Sequenzen eingeführt werden, die für das antigene Polypeptid codieren; und
(6) sie sind in den Vektor integriert.
Die folgende, nicht abschließende Liste an Clonierungsvektoren führt Vektoren an, die leicht verändert werden können, um die obigen Kriterien zu erfüllen, und sie sind deshalb zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Solche Änderungen können vom Fachmann leicht durchgeführt werden im Licht der verfügbaren Literatur und der hierin gegebenen Lehren. Tabelle I Wirte Vektoren Bemerkungen E. coli BACILLUS B. subtilis B. amyloliquefaciens B. stearothermophilus PSEUDOMONAS P. aeruginosa P. putida CLOSTRIDIUM C. perfringens SACCHAROMYCES S. cerevisiae Zahlreiche selektierbare Replikons sind charakterisiert worden. Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. Genetics and Biotechnology of Bacilli, Ganesan und Hoch, Herausgeber, 1984, Academic Press. Einige Vektoren, brauchbar in einem breiten Wirtsbereich von gramnegativen Bakterien, umfassend Xanthomonas und Agrobacterium. Shuttle-Plasmide für E. coli und C. perfringens Konstruktion Ref. Squires, C. et al., (1984), Journal Bacteriol. 159 465-471. Botstein und Davis in Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern, Jones und Broach, Herausgeber, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory.
Selbstverständlich können jetzt weitere Clonierungsvektoren existieren oder entwickelt werden, die die oben angegebenen Eigenschaften aufweisen und deshalb zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Diese Vektoren werden auch vom Umfang der offenbarten Reihen an Clonierungsvektoren umfaßt, in die die DNA-Sequenzen, die die antigenen Polypeptide codieren, eingeführt werden können, zusammen mit jedem beliebigen notwendigen Kontrollelement, und wobei der geänderte Vektor dann vom Umfang der vorliegenden Erfindung mit erfaßt wird und in dem unten ausführlicher beschriebenen rekombinanten DNA-Verfahren verwendet werden kann.
Diese "Kontrollelemente", wie hierin diskutiert, umfassen in nicht-beschränkender Weise mindestens einen Promotor, mindestens eine Ribosomenbindungssequenz und mindestens einen Transkriptionsterminator. Vorzugsweise umfassen diese "Kontrollelemente" auch mindestens einen Operator, mindestens eine Leadersequenz für Proteine, die aus dem intrazellulären Raum heraustransportiert werden sollen, mindestens einen Regulator und eine beliebige andere DNA-Sequenz, die notwendig oder bevorzugt ist, für die geeignete Transkription und anschließende Translation der Vektor-DNA.
Zusätzlich zu der obigen Liste ist ein E. coli-Vektorsystem bei einer Ausführungsform als ein Clonierungsvektor bevorzugt. Weiterhin sind mehrere Vektorplasmide, die in einem breiten Bereich gramnegativer Bakterien autonom replizieren, bevorzugt zur Verwendung als Clonierungsvehikel in Wirten der Gattung Pseudomonas. Diese sind beschrieben von Tait, R.C., Close, T.J., Lundquist, R.C., Hagiya, M., Rodriguez, R.L. und Kado, C.I in Biotechnology, Mai 1983, Seiten 269-275; Panopoulos, N.J. in Genetic Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publishers, New York, New York, Seiten 163-185 (1981); und Sakaguchi, K. in Current Topic in Microbiology and Immunology 96: 31-45, (1982), wobei jede dieser Literaturstellen durch Bezugnahme hierin eingeführt wird.
Eine besonders bevorzugte Konstruktion verwendet das Plasmid RSF1010 und Derivate davon, wie beschrieben von Bagdasarian, M., Bagdasarian, M.M., Coleman, S. und Timmis, K.N. in Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, Timmis, K.N. und Puhler, A., Herausgeber, Elsevier, North Holland Biomedical Press (1979), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Die Vorteile von RSF1010 sind, das es ein relativ kleines, in einer hohen Kopienzahl vorkommendes Plasmid ist, das leicht in E. coli- und Pseudomonas-Arten transformiert und darin stabil aufrechterhalten werden kann. In diesem System ist es bevorzugt, das Tac-Expressionssystem zu verwenden, wie beschrieben für Escherichia, da der E. coli-trp-Promotor leicht von der Pseudomonas-RNA-Polymerase erkannt werden kann, wie ausgeführt von Sakaguchi, K. in Current Topics in Microbiology and Immunology 96: 31-45 (1982) und Gray, G.L., McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Seeburg, P.H. und Heyneker, H.L. in Bioltechnology, Februar 1984, Seiten 161-165, die beide hierin durch Bezugnahme eingeführt werden. Die Transkriptionsaktivität kann weiterhin maximiert werden durch den erforderlichen Austausch des Promotors mit beispielsweise einem E. coli- oder P. aeruginosa-trp-Promotor.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird P. aeruginosa mit Vektoren transformiert, die die Synthese der antigenen Polypeptide entweder als intrazelluläres Produkt oder als ein an Leadersequenzen gekoppeltes Produkt steuern, die sein Prozessieren und den Transport aus der Zelle beeinflussen wird. Bei dieser Ausführungsform werden diese Leadersequnzen vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Beta-Lactamase, OmpA- Protein und der von Carboxypeptidase G2 von Pseudomonas. Die Translation kann mit der Translationsinitiation für jedes der E. coli-Proteine wie auch den Initiationsstellen für ein beliebiges der stark exprimierten Proteine des Wirts gekoppelt sein, um die intrazelluläre Expression der antigenen Polypeptide zu verursachen.
In den Fällen, wo Restriktions-Minus-Stämme einer Pseudomonas- Wirtsart nicht verfügbar sind, ist die Transformationseffizienz mit den Plasmidkonstrukten, die von E. coli isoliert wurden, schlecht. Deshalb ist die Passage des Pseudomonas-Clonierungsvektors durch einen r- m+-Stamm einer anderen Art vor der Transformation des gewünschten Wirts wünschenswert, wie ausgeführt in Bagdasarian, M., et al., Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, Seiten 411-422, Timmis und Puhler, Herausgeber, Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird.
Weiterhin umfaßt ein bevorzugtes Expressionssystem in Wirten der Gattung Bacillus die Verwendung des Plasmids pUB110 als das Clonierungsvehikel. Wie in anderen Wirtsvektorsystemen ist es in Bacillus möglich, die erfindungsgemäßen antigenen Polypeptide entweder als intrazelluläres oder als sezerniertes Protein zu exprimieren. Die vorliegenden Ausführungsformen umfassen beide Systeme. Shuttle-Vektoren, die sowohl in Bacillus wie auch E. coli replizieren, sind verfügbar zum Konstruieren und zum Testen von verschiedenen Genen, wie beschrieben von Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, S. und Shivakumar, A.G. in Genetic Engineering, Band 2, Setlow und Hollander, Herausgeber, Plenum Press, New York, New York, Seiten 115-131, (1980), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Für die Expression und Sekretion der antigenen Polypeptide von B. subtilis wird die Signalsequenz von Alpha-Amylase vorzugsweise mit der codierenden Region für das antigene Polypeptid gekoppelt. Zur Synthese von intrazellulären Polypeptiden wird die übertragbare DNA-Sequenz translational gekoppelt mit der Ribosomen-Bindungsstelle der Alpha-Amylase-Leadersequenz.
Die Transkription eines jeden dieser Konstrukte wird vorzugsweise durch den Alpha-Amylasepromotor oder ein Derivat davon gesteuert. Dieses Derivat enthält die RNA-Polymeraseerkennungssequenz des nativen Alpha-Amylasepromotors, aber enthält auch die lac-Operatorregion. Ähnliche Hybridpromotoren, konstruiert von dem Penicillinasegenpromotor und dem lac-Operator, arbeiten nachweislich in Bacilluswirten auf eine regulierbare Weise, wie ausgeführt von Yansura, D.G. und Henner in Genetic and Biotechnology of Bacilli, Ganesan, A.T. und Hoch, J.A., Herausgeber, Academic Press, Seiten 249-263, (1984), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Das lacI-Gen von lacIq würde auch umfaßt sein zur Beeinflussung der Regulation.
Eine bevorzugte Konstruktion für die Expression in Clostridium befindet sich in Plasmid pJU12, beschrieben von Squires, C.H. et al. in J. Bacteriol. 159: 465-471, das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird, das in C. perfringens gemäß dem Verfahren von Heefner, D.L. et al., wie beschrieben in J. Bacteriol. 159: 460-464 (1984), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird, transformiert wird. Die Transkription wird durch den Promotor des Tetracyclinresistenzgens gesteuert. Die Translation ist mit den Shine-Dalgarno-Sequenzen dieses gleichen tetr-Gens auf eine strikt analoge Weise gekoppelt, wie in den oben ausgeführten Verfahren für Vektoren, die zur Verwendung in anderen Wirten geeignet sind.
Die Aufrechterhaltung von fremder DNA, die in Hefe eingeführt wurde, kann auf mehreren Wegen erzielt werden. Siehe z.B. Botstein, D., und Davis, R.W., in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathern, Jones und Broach, Herausgeber, Seiten 607-636 (1982), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Ein bevorzugtes Expressionssystem zur Verwendung in Wirtsorganismen der Gattung Saccharomyces trägt das Gen für das antigene Polypeptid auf dem 2-Micron-Plasmid. Die Vorteile des 2-Micron-Rings umfassen eine relativ hohe Anzahl von Kopien und Stabilität, wenn er in cir&sup0;- Stämme eingeführt wird. Diese Vektoren enthalten vorzugsweise den Replikationsursprung und mindestens einen antibiotischen Resistenzmarker von pBR322, um die Replikation und Selektion in E. coli zu ermöglichen. Weiterhin enthält das Plasmid vorzugsweise 2-Micron-Sequenzen und das LEU2-Hefegen, um den gleichen Zwecken in LEU2-Mutanten der Hefe zu dienen.
Der regulierbare Promotor des Hefegens GAL1 wird vorzugsweise so angepaßt sein, daß er die Transkription des Gens für das antigene Polypeptid steuert. Die Translation der DNA-Sequenz in Hefe wird mit der Leadersequenz gekoppelt sein, die die Sekretion des Hefe-Alpha-Faktors steuert. Dies führt zur Bildung eines Fusionsproteins, das in Hefe prozessiert werden kann, und führt zur Sekretion des gewünschten antigenen Polypeptids. Alternativ wird ein antigenes Methionyl-Polypeptid translatiert für den Einschluß innerhalb der Zelle.
Wie sich aus der Untersuchung der einzelnen Clonierungsvektoren und Systeme, die in Tabelle I und der Beschreibung enthalten sind, ergibt, können verschiedene Kontrollelemente in jedem der erfindungsgemäßen bevorzugten Vektoren vorhanden sein. Weiterhin kommt es in Betracht, jedes beliebige, weitere Kontrollelement, das erforderlich sein kann, diesen Vektoren anzufügen, unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren, insbesondere im Licht der hierin gegebenen Lehren.
In der Praxis ist es möglich, jeden dieser Vektoren auf eine Weise herzustellen, die es erlaubt, sie leicht zu isolieren, zusammenzubauen und auszutauschen. Dies erleichtert den Zusammenbau von mehreren funktionellen Genen aus Kombinationen dieser Elemente und der codierenden Region für das antigene Polypeptid. Weiterhin sind viele dieser Elemente in mehr als einem der Wirte anwendbar.
Mindestens ein Replikationsursprung, der von dem in Betracht gezogenen Wirtsorganismus erkannt wird, zusammen mit mindestens einem selektierbaren Marker und mindestens einer Promotorsequenz, die die Transkription der DNA starten kann, die das antigene Polypeptid codiert, werden als in diesen Vektoren enthaltend angesehen. Weiterhin kommt es in Betracht, daß die Vektoren bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen DNA-Sequenzen enthalten, die als Regulatoren ("Operatoren") dienen können, sowie weitere DNA-Sequenzen, die für die Regulatorproteine codieren können. Bei bevorzugten Vektoren dieser Reihe enthalten die Vektoren zusätzlich Ribosomenbindungsstellen, Transkriptionsterminatoren und Leadersequenzen.
Diese Regulatoren dienen bei einer Ausführungsform dem Verhindern der Expression der DNA-Sequenz, die das antigene Polypeptid codiert, in der Anwesenheit von bestimmten Umweltbedingungen, und in der Anwesenheit von anderen Umweltbedingungen erlauben sie die Transkription und anschließende Expression des durch die DNA-Sequenz codierten Proteins. Insbesondere ist es bevorzugt, daß regulatorische Segmente in den Vektor derart eingefügt werden, daß die Expression der DNA-Sequenz in der Abwesenheit von beispielsweise Isopropylthio-beta-d-galactosid nicht erfolgt. In dieser Situation können die transformierten Mikroorganismen, die die DNA von Interesse enthalten, bis zu einer gewünschten Dichte vor der Initiation der Expression des antigenen Polypeptids kultiviert werden. Bei dieser Ausführungsform wird die Expression des gewünschten antigenen Polypeptids induziert durch das Zusetzen einer Substanz zu der mikrobiellen Umgebung, die die Expression der DNA-Sequenz veranlassen kann, nachdem die gewünschte Dichte erzielt worden ist.
Weitere Kontrollelemente umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Ribosomenbindungsstellen und andere DNA-Sequenzen, die notwendig sind für die mikrobielle Expression von Fremdproteinen. Die Kontrollelemente, wie hierin diskutiert, können routinemäßig vom Fachmann im Lichte der vorherigen Literatur und der hierin enthaltenen Lehren ausgewählt werden. Allgemeine Beispiele für diese Kontrollelemente sind ausgeführt in B. Lewin, Genes, Wiley & Sons, New York (1983), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Verschiedene Beispiele für geeignete Kontrollelemente können in den oben diskutierten Vektoren aufgefunden werden, und können anhand der Durchsicht der Publikationen ermittelt werden, die die grundlegenden Eigenschaften der zuvor erwähnten Vektoren diskutieren.
Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist eine weitere DNA-Sequenz unmittelbar vor der DNA-Sequenz lokalisiert, die das antigene Polypeptid codiert. Die weitere DNA-Sequenz kann als ein Translationskuppler fungieren, d.h. sie ist eine DNA- sequenz, die eine RNA codiert, die dazu dient, die Ribosomen in unmittelbarer Nachbarschaft zu der Ribosomenbindungsstelle der RNA für das anitgene Polypeptid zu positionieren, an die es sich anschließt.
Durch Synthese und/oder Isolierung aller erforderlichen und gewünschten Komponententeile der oben diskutierten Clonierungsvektoren werden die Vektoren anhand von Verfahren, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, zusammengesetzt. Das Zusammensetzen solcher Vektoren liegt innerhalb der Fähigkeiten und Aufgaben des Fachmanns und ist somit möglich, ohne unzumutbares Experimentieren. Zum Beispiel sind ähnliche DNA-Sequenzen in geeigneten Clonierungsvektoren ligiert worden, wie ausgeführt in Schonert et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81: 5403-5407 (1984), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird.
Bei der Konstruktion der erfindungsgemäßen Cloierungsvektoren ist zusätzlich anzumerken, daß mehrere Kopien der DNA-Sequenz, die für das antigene Polypeptid codiert, und ihre anhängenden Kontrollelemente in jeden Vektor eingefügt werden können. Bei einer solchen Ausführungsform erzeugt der Wirtsorganismus eine größere Menge des gewünschten antigenen Polypeptids pro Vektor. Die Anzahl multipler Kopien der DNA-Sequenz, die in den Vektor eingefügt werden kann, wird nur durch die Fähigkeit des erhaltenen Vektors, aufgrund seiner Größe, in einen geeigneten Wirtsmikroorganismus übertragen und darin repliziert und transkribiert zu werden, begrenzt.
Weiterhin ist es bevorzugt, daß der Clonierungsvektor einen selektierbaren Marker enthält, wie einen Wirkstoffresistenzmarker oder anderen Marker, der die Expression eines selektierbaren Stoffwechselwegs durch den Wirtsmikroorganismus hervorruft. Eine solche Wirkstoffresistenz oder ein anderer selektierbarer Marker soll teilweise die Selektion von Transformanden ermöglichen. Weiterhin kann die Anwesenheit eines solchen selektierbaren Markers in dem Clonierungsvektor von Nutzen sein zum Abhalten von kontaminierenden Mikroorganismen von der Vermehrung in dem Kulturmedium. Bei dieser Ausführungsform wird eine reine Kultur des transformierten Wirtsorganismus erhalten durch Kultivieren des Mikroorganismus unter Bedingungen, die den induzierten Phänotyp für das Überleben verlangen.
Es wird angemerkt, daß es bei einer bevorzugten Ausführungsform auch wünschenswert ist, das 3'-Ende der codierenden Region zu rekonstruieren, um den Zusammenbau mit 3'-nicht-translatierten Sequenzen zu ermöglichen. Umfaßt von diesen nicht-translatierten Sequenzen sind solche, die die mRNA stabilisieren oder ihre Transkription erhöhen und solche, die ein starkes Transkriptionsterminationssignal bereitstellen, die den Vektor stabilisieren können, wie sie identifiziert wurden von Gentz, R., Langner, A., Chang, A.C.Y., Chohen, S.H. und Bujard, H., in Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 118: 4936-4940 (1981), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird.
Der so erhaltene Vektor wird dann in den geeigneten Wirtsmikroorganismus übertragen. Es wird angenommen, daß ein beliebiger Mikroorganismus, der die Fähigkeit hat, exogene DNA aufzunehmen und diese Gene und die angefügten Kontrolleelemente zu exprimieren, ausgewählt werden kann. Es ist bevorzugt, daß der Wirtsmikroorganismus ein anaerober, fakultativ anaerober oder aerober ist. Spezielle Wirte, die vorzugsweise in diesem Verfahren eingesetzt werden, umfassen Hefen und Bakterien.
Spezielle Hefen umfassen solche der Gattung Saccharomyces und insbesondere Saccharomyces cerevisiae.
Spezielle Bakterien umfassen solche der Gattung Bacillus und Escherichia und Pseudomonas. Verschiedene andere bevorzugte Wirte sind in Tabelle 1, siehe oben, ausgeführt. In einer anderen alternativen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird Bacillus subtilis, Escherichia coli oder Pseudomonas aeruginosa als der Wirtsmikroorganismus ausgewählt.
Nachdem ein Wirtsmikroorganismus ausgewählt worden ist, wird der Vektor in den Wirtsmikroorganismus übertragen mit Hilfe von Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind. Beispiele für solche Verfahren können gefunden werden in Advanced Bacterial Genetics von R.W. Davis et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1980), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Es ist bei einer Ausführungsform bevorzugt, daß die Transformation bei einer niedrigen Temperatur erfolgt, da die Temperaturregulation als ein Mittel angesehen wird zum Regulieren der Genexpression, indem Kontrollelemente, wie oben ausgeführt, verwendet werden. Bei einer weiteren Ausführungsform, falls osmolare Regulatoren in den Vektor eingefügt worden sind, kann die Regulation der Salzkonzentrationen während der Transformation erforderlich werden, um die geeignete Kontrolle der synthetischen Gene sicherzustellen.
Wenn es in Betracht kommt, daß die rekombinanten antigenen Polypeptide letztendlich in Hefe exprimiert werden, ist es bevorzugt, daß der Clonierungsvektor zunächst in Escherichia coli übertragen wird, wo dem Vektor zu replizieren erlaubt wird, und aus dem der Vektor nach der Amplifikation erhalten und gereinigt wird. Der Vektor wird dann in die Hefe für die endgültige Expression des antigenen Polypeptids übertragen.
Die Wirtsmikroorganismen werden unter Bedingungen kultiviert, die für die Expression der antigenen Polypeptide geeignet sind. Diese Bedingungen sind üblicherweise spezifisch für den Wirtsorganismus und können vom Fachmann leicht ermittelt werden im Lichte der veröffentlichten Literatur betreffend die Kultivierungsbedingungen für solche Organismen, z.B. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland, das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird.
Sämtliche Bedingungen, die erforderlich sind für die Regulation der Expression der DNA-Sequenz, abhngig von den Kontrollelementen, die in den Vektor eingefügt sind oder dort vorliegen, liegen bei den Transformations- und Kultivierungsphasen vor. Bei einer Ausführungsform werden die Zellen bis zu einer hohen Dichte in der Anwesenheit von geeigneten regulatorischen Bedingungen kultiviert, die die Expression der DNA-Sequenz, die das antigene Polypeptid codiert, hemmen. Wenn die optimale Zelldichte erreicht wird, werden die Umgebungsbedingungen zu solchen geändert, die zur Expression der DNA-Sequenz geeignet sind. Es kommt somit in Betracht, daß die Erzeugung des antigenen Polypeptids in einer Zeitspanne erfolgt anschließend an das Wachstum der Wirtszellen bis zur nahezu optimalen Dichte, und daß das erhaltene antigene Polypeptid zu einem Zeitpunkt geerntet wird, nachdem die regulatorischen Bedingungen, die erforderlich sind für die Expression, induziert wurden.
Die hierin in Betracht gezogenen Transkriptionsterminatoren dienen zum Stabilisieren des Vektors. Insbesondere kommen solche Sequenzen, wie beschrieben von Gentz et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4936-4940 (1981), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird, für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht.
Selbstverständlich ist die Anwendung der erfindungsgemäßen Lehren auf ein spezielles Problem oder eine spezielle Umgebung innerhalb des fachmännischen Könnens im Lichte der hierin gegebenen Lehren. Beispiele für die erfindungsgemäßen Produkte und repräsentative Verfahren für deren Isolierung und Herstellung werden in den folgenden Beispielen gegeben. Es ist anzumerken, daß sämtliche Literaturstellen, die zur weiteren Erläuterung dieser Beispiele verwendet werden, hierin durch Bezugnahme eingeführt sind.

Beispiele

Die hierin zitierten Literaturstellen werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeführt.

I. Konstruktion der Lambda gt11-Expressionsbank

A. Konstruktion der genomischen DNA-Expressionsbank von M. hyopneumoniae

Die Überlegung bei der Konstruktion einer genomischen Expressionsbank war, einen repräsentativen Clon für jedes antigenisch aktive Protein zu erhalten, das von M. hyopneumoniae exprimiert werden könnte. Da prokaryotische DNA keine Introns enthält, war es erforderlich, eine cDNA-Bank zu konstruieren, um dieses zu erreichen. Wegen der geringen Genomgröße ist eine relativ kleine Anzahl an Clonen erforderlich, um das M. hyopneumoniae- Genom adäquat zu repräsentieren. Unter Verwendung der Abschätzung der Genomgröße von M. hyopneumoniae wurde berechnet, daß für eine 99 %ige Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer jeden 100 bp-Region in beiden Orientierungen und in sämtlichen drei Leserastern 1,4 x 10&sup5; einzelne Rekombinanten erforderlich waren.
In Lambda gt11 werden clonierte DNA-Fragmente, die für Peptide codieren, als Fusionsproteine exprimiert, wenn sie in der einzigen EcoRI-Stelle nahe dem Carboxyterminus des Beta-Galactosidasegens in den Phagen eingefügt werden. Die Insertion von Fremd-DNA in das Beta-Galactosidasegen inaktiviert das Gen und erlaubt somit die Identifizierung von rekombinanten Phagen auf Indikatorplatten.
Die genomische Expressionsbank von M. hyopneumoniae wurde in vier Folgeschritten erhalten. Erstens, genomische DNA wurde von M. hyopneumoniae-Zellen erhalten. Zweitens, zufällige Fragmente wurden durch Beschallung erzeugt, die überstehenden Enden wurden glatt gemacht unter Verwendung von Polymerase des Phagen T4, interner EcoRI-Methylase, EcoRI-Linker wurden den Enden angefügt und überschüssige Linker wurden abgespalten. Drittens, die hergestellten Fragmente wurden in die Lambda gt11-Vektor- DNA (bezogen von Vector Cloning Systems, San Diego, CA) ligiert und in vitro verpackt. Schließlich wurden die in vitro verpackten rekombinanten Phagen amplifiziert.

1. Präparation von genomischer DNA von Mycoplasma hyopneumoniae-Zellen

Ungefähr 10¹¹ gefrorene M. hyopneumoniae-Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in ein Polypropylengefäß überführt. Das Volumen der Zellen betrug 0,8 ml. Diesem wurde 1 ml einer Proteinase K- Lösung zugefügt: 0,075 M Tris pH 8; 0,17 M EDTA pH 8; 0,15 % Triton X 100; und 400 µg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indiananapolis, Indiana). Die Zellen wurden mit der Proteinase K-Lösung bei 65ºC für 30 Minuten inkubiert. 2,0 ml Phenol wurden der Mischung zugesetzt, und das Gefäß wurde bei 4ºC für 20 Minuten leicht geschüttelt. Die Probe wurde dann in einem Beckman JA20-Rotor bei 5000 Upm für 5 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die wäßrige Phase wurde mit einer Plastikpipette mit einer großen Bohrung entfernt. Die wäßrige Phase wurde mit 2 ml einer 24:1-Mischung von Chloroform und Isoamylalkohol extrahiert unter Schütteln für 20 Minuten bei 4ºC, Stehenlassen des Gefäßes für 5 Minuten zum Trennen der Phasen und dann Entfernen der wäßrigen Phase mit einer Plastikpipette mit großer Bohrung.
Die wäßrige Phase wurde dann erneut mit Phenol extrahiert gefolgt von Chloroform und Isoamylalkohol, wie im obigen Absatz beschrieben. Die extrahierte wäßrige Phase wurde auf 0,3 M Natriumacetat eingestellt durch Zusetzen von 1/10 des Volumens einer 3,0 M Natriumacetatstocklösung. Die DNA wurde von dieser Lösung präzipitiert durch den Zusatz von 2,5 Volumen kaltem Ethanol. Leichtes Mischen mit dem Ethanol ergab eine große viskose Masse an Nukleinsäure, die aus der Lösung "herausgewickelt" wurde mit Hilfe eines kleinen Glasstabs. Dieses Material wurde dann zweimal mit 70 % Ethanol abgespült und an der Luft trocknengelassen. Die trockenen Nukleinsäuren wurden in 0,5 ml TE-Puffer resuspendiert durch Schütteln der Lösung für 16 Stunden bei 4ºC.
Um jegliche kontaminierende RNA aus der M. hyopneumoniae-DNA- Präparation zu entfernen, wurden die Nukleinsäuren mit RNaseA behandelt. 5/10 Milliliter der Sporozoitennukleinsäurepräparation wurden mit 2,5 µg/ml RNaseA (Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) bei 65ºC für 30 Minuten behandelt. Die wäßrige Phase wurde auf 3,2 M Ammoniumacetat eingestellt durch Zusetzen von 0,75 Volumen einer 7,5 M Stocklösung. Die DNA wurde aus dieser Lösung präzipitiert durch den Zusatz von 0,54 Volumen Isopropanol. Das Einmischen des Isopropanols ergab ein großes viskoses Pellet, das aus der Lösung herausgewickelt wurde und zweimal mit 80 % Ethanol abgespült wurde. Nach dem Trocknen an Luft wurde die DNA in 0,2 ml TE-Puffer resuspendiert.
Die Integrität der M. hyopneumoniae-DNA wurde durch Elektrophorese über ein Agarosegel und anschließendes Färben des Gels mit Ethidiumbromid analysiert. Diese Ergebnisse zeigten, daß die DNA ein hohes Molekulargewicht besaß und relativ frei von RNA war. Die Konzentration der DNA wurde durch die optische Adsorption bei 260 nm ermittelt. Diese spezielle Präparation ergab 90 µg gereinigte DNA.

2. Präparation von beschallten, genomischen DNA-Fragmenten von M. hyopneumoniae

Um ein gegebenes Fragment des M. hyopneumoniae-Genoms zu erhalten, das in dem geeigneten Leseraster für die Transkription und Translation des nativen Polypeptids ausgerichtet war, wurde entschieden, zufällige Fragmente durch Beschallen zu erzeugen, so daß sämtliche mögliche Raster repräsentiert sein würden.
M. hyopneumoniae-DNA wurde mit einer kleinen spitzen Sonde eines Branson Sonifier-Zellaufbrechers 200, eingestellt auf die niedrigste Energieeinstellung, beschallt. 80 µg DNA in einem 200 µl Gesamtvolumen wurden mit drei Stößen von jeweils 3 Sekunden beschallt. Dies erzeugte Fragmente, die in dem Bereich von 0,3 bis 23 Kb Größe lagen, wobei der größte Anteil in dem Bereich von 1,3 bis 4,4 Kb lag.
Die durch die Beschallung erzeugten, überhängenden Enden wurden in glatte Enden überführt unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs; Beverly, Mass.). Die Reaktion wurde ausgeführt in 33 mM Tris Acetat pH 7,8; 66 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin, 0,5 mM Dithiothreitol und 0,1 mM eines jeden Desoxynukleotidtriphosphats dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Für 65 µg beschallter DNA wurden 20 Einheiten T4-Polymerase für 1 Stunde bei 37ºC umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Erwärmen der Probe für 10 Minuten auf 68ºC abgestoppt. Überschüssige Salze wurden entfernt durch Überleiten der Reaktionsmischung über eine Biogel P30-Säule (Bio Rad), die in TE äquilibriert war.
Um jedes genomische DNA-Fragment von M. hyopneumoniae, das interne EcoRI-Stellen enthalten könnte, zu schützen, war es erforderlich, die DNA zu modifizieren. EcoRI-Methylase (New England Biolabs) wurde mit der fragmentierten M. hyopneumoniae- DNA in der Anwesenheit von 5-Adenosylmethionin umgesetzt unter Bedingungen, wie sie vom Hersteller empfohlen werden. Die Methylase wurde durch Phenolextraktion der Reaktionsmischung inaktiviert und restliches Phenol wurde durch Etherextraktionen entfernt. Der Mix wurde dann auf 0,3 M mit Natriumacetat eingestellt und 2,5 Volumen Ethanol wurden zugesetzt. Nach 30 Minuten bei -70ºC wurde die präzipitierte DNA durch Zentrifugation pelletiert. Diese DNA wurde in TE-Puffer resuspendiert.
Kurze Oligonukleotid-EcoRI-Linker (New England Biolabs) wurden an die Fragmente mit den glatten Enden in einer Ligierungsreaktion, die aus 66 mM Tris pH 7,6, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol, 10 mM, ATP bestand, angefügt, wobei der Linker bei 5 bis 10 µM vorlag. T4-DNA-Ligase (P.L. Biochemicals) wurde zugesetzt, und die Reaktion wurde bei 14ºC für 16 Stunden fortgesetzt. Die Ligierungsreaktion wurde durch Erwärmen der Mischung auf 70ºC für 10 Minuten abgestoppt.
Dann wurde Natriumchlorid auf 0,1 M zugesetzt, überschüssiges EcoRI wurde zugesetzt, und die Reaktion wurde bei 37ºC für mehrere Stunden inkubiert. Das EcoRI wurde zugesetzt, und die Reaktion wurde bei 37ºC für mehrere Stunden inkubiert. Das EcoRI wurde durch Erwärmen auf 70ºC für 10 Minuten inaktiviert.

3. Ligierung von Fragmenten an Lambda gt11 und in vitro- Verpackung der rekombinanten DNA

Phosphatase-behandelte und EcoRI-gespaltene Lambda gt11-DNA wurde mit den hergestellten Fragmenten von M. hyopneumoniae-DNA gemischt. Diese DNAs wurden mit T4-DNA-Ligase (P.L. Biochemicals) über Nacht bei 14ºC ligiert. Ein kleines Aliquot dieser Ligierungsreaktionsmischung wurde durch Gelelektrophorese analysiert, um die Ligierungsreaktion zu untersuchen. Die Mischung wurde auf 70ºC für 5 Minuten erwärmt, und dann mit in vitro-Verpackungsextrakten von Lambda (Vector Cloning Systems, San Diego, CA) gemischt. Die Verpackungsreaktion erfolgte für 60 Minuten bei Raumtemperatur, und dann wurde ein Tropfen Chloroform zugesetzt, um bakterielles Wachstum zu verhindern. Die Titration dieser Mischung ergab eine Bank mit einer Komplexität von 1,5 x 10&sup5; Rekombinanten.

4. Amplifikation der M. hyopneumoniae-Expressionsbank

Verpackte Phagen wurden mit Lambdaöl verdünnt und an E. coli- Stämme Y1088 adsorbiert, wie von Young, R., und Davis, R., in Science, 222: 778-782 (1983) beschrieben. Die Amplifikation der Bank auf diesem Stamm stellt sicher, daß das Beta-Galactosidasegen nicht exprimiert wird; deshalb wird kein Phage, der codierende Sequenzen enthält, die für die E. coli-Wirtszelle schädlich sein könnten, exprimiert und nicht aus der Bank verloren. Die Amplifikation der Bank ergab einen Stock, der 6 x 10&sup5; Phagen pro ml enthielt.
Die Entfernung von überschüssigen Linkem und die Größenfraktionierung der DNA-Fragmente erfolgte durch Dichtezentrifugation in einem 10 %- bis 40 %-Sucrosegradienten in 1 M NaCl, 20 mM Tris pH 8, 5 mM EDTA. Die DNA wurde auf den Gradienten aufgetragen und in einem Beckman SW41-Rotor bei 26000 Upm für 24 Stunden bei 15ºC zentrifugiert.
Die Fraktionen wurden in 0,3 ml Aliquots gesammelt. Diese wurden durch wäßrige Gelelektrophorese und Anfärben durch Ethidiumbromid untersucht, um die Größe der verschmierten Fragmente in jeder Fraktion mit Molekulargewichtsmarkern zu vergleichen. Fraktionen, die angereichert waren mit Fragmenten in dem Bereich von 1 bis 6 Kb wurden vereinigt, dann dialysiert und konzentriert unter Verwendung eines Centricon 30 (Amicon) Apparates.

II. Allgemeine Verfahren

A. Antikörper-Screening der Lambda gt11:M. hyopneumoniae- Expressionsbank

Die Lambda gt11:M. hyopneumoniae-Expressionsbank wurde in einer Dichte von 5000 bis 20000 Phagen pro 150 mm-Platte unter Verwendung von E. coli Y1090 als Wirt ausplattiert, wie beschrieben von Young und Davis in Science 222: 778-782 (1983). Die Platten wurden bei 37ºC oder 42ºC für 4 Stunden inkubiert, dann mit einem Nitrozellulosefilter (BA-85, Schleicher und Schuell) überlagert, der in 10 mM IPTG eingetaucht und an Luft getrocknet worden war. Nach dem Inkubieren über Nacht bei 37ºC wurden die Filter batchweise gewaschen für dreimal 10 Minuten in TBS (10 mM Tris HCl pH 8,0, 150 mM NaCl). Unspezifische Proteinbindungsstellen auf den Filtern wurden blockiert durch Inkubieren der Filter für 60 Minuten in TBS + 2 % Rinderserumalbumin (Fraktion V, Miles Laboratories, Elkhart, IN). Die Filter wurden dann einzeln oder in Paaren für 2 Stunden mit 10 bis 20 ml primärem Antikörper (z.B. Schweinimmunserum, hyperimmunem Antimycoplasma-Kaninchenserum, monoclonalem Antimycoplasma-Maus-Antikörpern) inkubiert, die typischerweise 1:200 (1:500 bei den monoclonalen) mit TBS, dem 2 % Rinderserumalbumin (BSA) zugesetzt worden war, verdünnt werden. Die Filter wurden 3 x 10 Minuten mit TBS, enthaltend 0,1 % NP-40 (Sigma) gewaschen, dann einzeln oder in Paaren für 60 Minuten mit 10 bis 20 ml Lösung eines zweiten Antikörpers (z.B. Peroxidase- konjugiertes Ziege-Antikaninchen-IgG, Cappel Laboratories) inkubiert, der 1:500 in TBS + 2 % Rinderserumalbumin verdünnt war. Die Filter wurden batchweise 3 x 10 Minuten in TBS gewaschen und in einer Lösung, enthaltend 200 ml TBS, 2,5 ml Wasserstoffperoxid und 40 ml einer 3 mg/ml-Lösung an 4-Chlor-1- naphthol in Methanol, angefärbt. Das Anfärben wurde abgestoppt durch Entfernen der Filter aus dem Wasser. Positiv angefärbte Plaques wurden mehreren Runden eines erneuten Screenings mit Antikörper, wie oben beschrieben, bis zur Reinheit unterzogen.

B. Elution von Antikörpern, die an auf Nitrozellulosemembranen immobilisierte Proteine gebunden sind

Wenn Proteine auf Nitrozellulosemembranen immobilisiert werden, wie bei Western Blot-Transfers von Proteinen, die auf Polyacrylamidgelen aufgetrennt worden waren, oder Replikas von Phagenplaques, die von Agarplatten abgenommen wurden, ist es möglich, Antikörper zu binden, die spezifisch die immobilisierten Proteine erkennen. Antikörper, die nicht spezifisch an die immobilisierten Proteine binden, verbleiben in Lösung und können leicht abgewaschen werden, wobei sie nur die spezifisch gebundenen zurücklassen.
Die gebundenen Antikörper können eluiert werden durch Abspülen der Filter mit einem Puffer mit niedrigem pH (5 mM Glycin pH 2,3, 0,5 M NaCl, 0,5 % Tween 20, 0,01 % BSA), der den Antikörper-Antigenkomplex dissoziiert. Wenn die eluierten Antikörper sofort neutralisiert werden, d.h. Verwenden von 50 mM Tris HCl in der Endkonzentration, behalten sie die volle Aktivität bei und können für eine Vielzahl von analytischen Zwecken verwendet werden.

1. Bestimmen von Mycoplasmen-Protein, das dem Insertclon entspricht

Antikörper, die von Plaquereplikas eines gereinigten rekombinanten Clons eluiert worden waren, wurden verwendet, um zu bestimmen, welches Mycoplasma-protein diesem Clon entsprach. Durch Eluieren der an Plaquereplikas dieser rekombinanten Clone gebundenen Antikörper und Verwenden dieser Antikörper zum Untersuchen von Western Blots der Mycoplasmaproteine war es möglich, zu bestimmen, welches Protein durch den rekombinanten Clon codiert wird.
5000 bis 10000 Plaques eines einzelnen, gereinigten, rekombinanten Clons wurden auf eine 100 mm-Platte ausplattiert, und ein Plaqueabzug wurde hergestellt. Die abgezogenen Filter wurden 3 x 10 Minuten in TBS gewaschen und unspezifische Proteinbindung wurde blockiert durch Inkubation in TBS + 10 % BSA für 1 Stunde. Die Filter wurden 3 x 10 Minuten in TBS gewaschen. Ein 5 mm breiter Streifen wurde von dem Zentrum der Filterscheibe abgeschnitten. Polyclonales Antimycoplasma-Serum wurde an den Streifen gebunden, gewaschen und durch Western Blot-Elutionen eluiert. Die eluierten Antikörper wurden dann verwendet zum Untersuchen eines Western Blots von Mycoplasmaproteinen.

III. Plasmidvektoren für die Expression von Fusionsproteinen

Eine Anzahl von antigenisch reaktiven rekombinanten Phagendonen von M. hyopneumoniae wurden in der Expressionsbank identifiziert. Da die Lambda gt11 Lysogene nur eine beschränkte Menge an Fusionsprotein zu erzeugen schienen, konstruierten wir einen Plasmidexpressionsvektor, der die Fusionsproteine in Milligrammengen erzeugen würde.

A. pSEV4

Plasmid pLG2 wurde von Dr. L. Guarente (MIT) (Guarente, L., in Cell, 20: 543-553 (1980)) erhalten. Dieser Vektor ist ein pBR322-Derivat, der, wie Lambda gt11, einen lac-Operator und Promotorsequenzen zusätzlich zu einem Wildtyp-Beta-Galactosidasegen, das eine einzige EcoRI-Stelle nahe dem 3'-Ende des Gens besitzt, enthält. Weiterhin enthält pLG2 das lac- Repressorgen. Das Übertragen von M. hyopneumoniae-DNA-Inserts von Lambda gt11 in die EcoRI-Stelle dieses Vektors ergibt ein identisches Fusionsprotein zu dem, das anfänglich in dem Phagen identifiziert worden war.
Plasmid pLG2 wurde modifiziert, um eine zusätzliche EcoRI- Stelle vor seiner Verwendung zur Expression zu entfernen. Plasmid pLG2 wurde partiell mit EcoRI-Restriktionsendonuklease gespalten, um das Plasmid zu linearisieren. Die Plasmid-DNA wurde dann auf einem präparativen Agarosegel dargestellt, und die Bande, die der linearen Größe entsprach, wurde aus dem Gel eluiert. Die eluierte DNA wurde präzipitiert durch Einstellen der Lösung auf 0,3 M mit Nateriumacetat und Zusetzen von 2,5 Volumen Ethanol. Die DNA wurde durch Zentrifugation pelletiert, und das Pellet wurde in TE-Puffer resuspendiert. Das Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I wurde mit der DNA in der Anwesenheit von dATP und dTTP gemischt, um die EcoRI- cohaesiven Enden aufzufüllen. Nach der Inaktivierung durch Wärme bei 70ºC für 10 Minuten wurde T4-DNA-Ligase (P.L. Biochemicals) zugesetzt, und die Mischung wurde bei 4ºC für 16 Stunden inkubiert. Die ligierte DNA wurde dann zum Transformieren von E. coli AMA1004 verwendet. Casadaban, M., et al., in Methods in Enzymology 100: 293 (1983).
Die Transformanden wurden auf Ampicillinplatten in der Anwesenheit eines farberzeugenden Substrats für Beta-Galactosidase- Aktivität (X-GAL) selektiert. Es wurde nach Transformanden mit Beta-Galctosidase-Aktivität hin abgesucht durch Spalten der DNA mit EcoRI. Ein Plasmid, pSEV4, das nur eine einzige EcoRI- Stelle nahe dem Aminoterminus des Beta-Galctosidasegens besaß, wurde unter den Transformanden identifiziert und charaktisiert.
Plasmid pSEV4 besitzt eine einzige EcoRI-Stelle nahe dem Aminoterminus des Beta-Galactosidasegens. Plasmid pSEV4 enthält den Wildtyp lac-Operator, Promotor und Repressor zusätzlich zu dem Beta-Galactosidasegen. Durch Induktion mit IPTG für 60 Minuten wurde die Beta-Galactosidase-Aktivität um das 300-fache gesteigert. Nicht-induzierte Zellen, enthaltend pSEV4, erzeugten ungefähr 1000 Einheiten/mg an gesamtem, zellulären Protein, während IPTG-induzierte Zellen ungefähr 300000 Einheiten/mg des gesamten Zellproteins ergaben. Die Proteingelanalyse von induzierten und nicht-induzierten Zellen zeigte auch die Überproduktion von Beta-Galactosidase durch induzierte Zellen. Dieses neue Plasmid, pSEV4, ist verwendet worden zum Exprimieren einer Anzahl von M. hyopneumoniae-Antigenen als Fusionsproteine.

B. pSEV6

Ein Nachfolger von pSEV4 wurde konstruiert, um das polarisierte "Kassetten"-Subclonieren von DNA-Inserts aus Lambda gt11 direkt in einen Plasmidexpressionsvektor zu ermöglichen. Da EcoRI- Inserts in beliebiger Orientierung in pSEV4 subcloniert werden konnten, wurde jeder pSEV4-Subclon auf seine antigene Reaktion untersucht. Das polarisierte Subclonieren unter Verwendung von pSEV6 erübrigt den Bedarf an dieser zusätzlichen Analyse.
Extensives Kartieren von pSEV4 lokalisierte fünf Restriktionsendonukleasestellen in dem lac-Operon 5' zu der einzigen EcoRI-Stelle des Beta-Galactosidasegens. Drei dieser Stellen sind einmalig, und zwei wurden einmalig gemacht durch die Deletion von überflüssiger DNA zwischen dem lacI-Gen und dem von pBR322 stammenden ampr-Gen. Nur eine brauchbare Restriktionsstelle wurde 3' von der EcoRI-Stelle gefunden, die NcoI-Stelle, deshalb wurden zusätzliche Restriktionsenzymstellen in diese Region eingeführt unter Verwendung eines chemisch synthetisierten Polylinkers.
Die Konstruktion von pSEV6 wurde in zwei Schritten durchgeführt. Erstens, pSEV4 wurde um ungefähr 5700 Basenpaare verkürzt, um überschüssige DNA zu entfernen. Plasmid pSEV4 wurde mit SphI-Restriktionsendonuklease gespalten, und das Enzym wurde durch Erwärmen auf 70ºC für 10 Minuten inaktiviert. Die DNA wurde dann partiell mit AatII gespalten, und die erhaltene Spaltung wurde durch Elektrophorese auf einem präparativen Agarosegel dargestellt. Das 7620 bp-Fragment wurde aus dem Gel herausgeschnitten und elektroeluiert.
Die elektroeluierte DNA wurde aus einer 0,3 M Natriumacetatlösung präzipitiert durch Zusatz von 2,5 Volumen Ethanol und Inkubieren bei -70ºC für 30 Minuten. Die DNA wurde durch Pelletieren in einer Brinkman-Mikrozentrifuge für 15 Minuten konzentriert, und das Pellet wurde in TE-Puffer resuspendiert. T4- DNA-Polymerase (New England Biolabs) wurde zugesetzt, um die cohaesiven Enden, die durch die AatII-Spaltung erzeugt worden waren, in glatte Enden zu überführen. Nach der Wärmeinaktivierung der T4-DNA-Polymerase wurde T4-DNA-Ligase (P.L. Biochemicals) zugesetzt, um die glatten Enden der DNA-Fragmente zu ligieren. Die ligierte DNA wurde zum Transformieren von kompetenten AMA1004 E. coli-Zellen verwendet. Lac&spplus;-Transformanden wurden auf das 7620 bp-Plasmid hin abgesucht. Ein Plasmid, pSEV5, wurde identifiziert und als dasjenige charakterisiert, das die geeignete Struktur besitzt.
DNA von pSEV5 wurde nach Standardverfahren gereinigt und anschließend mit der Restriktionsendonuklease NcoI gespalten, die eine einzige Stelle 3' von dem Beta-Galctosidasegen spaltete. Ein Oligonukleotid-Adaptermolekül, das die NcoI- Stelle regenerieren und das auch BglII- und KpnI-Stellen enthalten würde, wurde chemisch synthetisiert. Die Sequenz dieses Adapter-Moleküls ist wie folgt:
5'-GTAAGGAGGAATAACATATGGAATTCGAG-3'
3 -ACGTCATTCCTCCTTATTGTATACCTTAAGCTCCTAG -5'
Dieses Oligonukleotid wurde mit dem NcoI-gespaltenen pSEV5 mit T4-DNA-Ligase (P.L. Biochemicals) ligiert. Die ligierte DNA wurde zum Transformieren von kompetenten E. coli AMA1004-Zellen verwendet. DNA aus den erhaltenen lac&spplus;-Transformanden wurde auf die Anwesenheit der einmaligen KpnI- und NcoI-Stellen hin abgesucht. Ein Plasmid wurde bei diesem Absuchen identifiziert, das sämtliche der entworfenen Sequenzen enthielt. Dieses Plasmid, pSEV6, ist verwendet worden zur Expression von verschiedenen der antigenisch reaktiven Fusionsproteine.

IV. Reinigung der clonierten Antigene für Tierversuche

Die Beta-Galactosidase: :M. hyopneumoniae-Antigen-Fusionsproteine sind gereinigt worden entweder unter Verwendung einer Affinitätssäule mit einem Substratanalog für Beta-Galactosidase oder durch klassische Verfahren der Proteinreinigung.

A. Herstellen von Extrakten

2 l Luriamedium, pH 7,5, enthaltend 50 µg/ml Ampicillin, wurde mit 10 bis 20 ml einer über-Nacht-Kultur von E. coli AMA1004, enthaltend eines der rekombinanten Plasmide, inokuliert. Die Zellen wurden bei 37ºC bis zur mid-log-Phase (A&sub6;&sub0;&sub0; = 0,2) kultiviert. Isopropylthiogalactosid (IPTG) wurde auf eine Endkonzentration von 1 mM zugesetzt, um die Bildung des Fusionsproteins zu induzieren. Die Zellen wurden für 2 Stunden wachsengelassen und dann durch Zentrifugation bei 5000 x G für 15 Minuten bei 4ºC geerntet. Sämtliche anschließenden Operationen wurden bei 4ºC durchgeführt.
Die Zellen wurden in 20 ml Aufbrechpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 5 % Glycerin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) bei 4ºC resuspendiert und wieder bei 5000 x G für 15 Minuten zentrifugiert. Die Zellen wurden wieder in 20 bis 40 ml Aufbrechpuffer suspendiert. Die Zellen konnten zu diesem Zeitpunkt eingefroren und bei -20ºC gelagert werden, falls gewünscht.
Die ungefrorenen oder aufgetauten Zellen wurden aufgebrochen durch zweimaliges Durchleiten durch eine French-Preßzelle (Aminco) bei 20000 psi. Zelitrümmer wurden durch Zentrifugation bei 30000 x G für 30 Minuten entfernt. Die weitere Klärung des Extrakts konnte an diesem Punkt durch Ultrazentrifugation bei 100000 x G für 30 Minuten erreicht werden. Das Protein wurde dann präzipitiert durch den Zusatz von Ammoniumsulfat auf eine Endkonzentration von 20 bis 40 % Sättigung. Die optimale Konzentration von Ammoniumsulfat, die für die Präzipitation des Fusionsproteins erforderlich ist, variiert mit den einzelnen Proteinen und muß experimentell bestimmt werden unter Verwendung von beispielsweise den Verfahren, wie ausgeführt in Heppel, L., in Methods in Enzymology, 1: 570-576 (1955).
Die Präzipitatlösung wurde für 1 Stunde gerührt und das Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 30000 x G für 15 Minuten entfernt. Das Pellet wurde erneut in 10 bis 15 ml Ausgangspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,1 % Trition X 100) aufgelöst und dann über Nacht gegen 500 ml des Ausgangspuffers dialysiert.

1. Affinitätsreinigungsverfahren

Die Verwendung einer Beta-Galactosidaseaffinitätssäule basiert auf dem Verfahren, wie beschrieben von Steers und Cuatrecasas in Methods in Enzymology, 34: 350-358 (1974). Affinitätsharz (p-Aminophenyl-beta-D-thiogalactopyranosid-Agarose, erhalten von Sigma) wurde in eine 15 cm-Säule mit 1,5 cm Durchmesser gepackt. Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumina an Ausgangspuffer mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2; und 1,0 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,1 Triton X 100 vor der Verwendung gewaschen. Die Säule kann nach der Verwendung regeneriert werden durch extensives Waschen mit Elutionspuffer 0,1 Natriumborat, pH 10,0, 250 mM NaCl, 1 mM DTT oder durch Waschen mit 6 M Guanidinhydrochlorid in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Nach dem Waschen wird die Säule erneut äquilibriert mit 10 Säulenvolumen an Ausgangspuffer.
Für die Affinitätschromatographie wurde dialysiertes Material auf die vor-äquilibrierte Affinitätssäule mit einer Fließrate von ungefähr 0,2 ml/Minute gegeben. Nachdem die Probe auf die Säule aufgetragen worden war, wurde die Säule mit 15 ml Ausgangspuffer bei der gleichen Flußrate gewaschen, dann mit 30 ml Ausgangspuffer bei ungefähr 0,5 ml/minute, gefolgt von 180 ml Ausgangspuffer bei ungefähr 1 ml/minute. Schließlich wurde die Säule mit 120 ml Ausgangspuffer ohne Triton bei der gleichen Flußrate gewaschen.
Das absorbierte Protein wurde mit 0,1 Natriumborat, pH 10,0, 250 mM NaCl, 1 mM DTT unter Verwendung von 120 ml bei einer Flußrate von ungefähr 1 ml/Minute eluiert. Die Fraktionen, die das Peak-Protein enthalten, wurden vereinigt, und konnten, falls gewünscht, konzentriert werden auf ungefähr 10 ml unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationseinheit (Modell 8050), enthaltend eine YM-30-Membran.

2. Ultrazentrifugationsreinigung

Eine alternative Reinigung, die für einige der Fusionsproteine (z.B. pSEV4::CH2-13) verwendet werden konnte, erfolgt durch das Herstellen von dialysiertem Protein, wie oben ausgeführt. Das dialysierte Material wird einer Ultrazentrifugation bei 100000 x G für 30 Minuten unterzogen. Das Pellet, das den Großteil des Fusionsproteins enthält, wurde in einem kleinen Volumen an Dialysepuffer 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2; und 1,0 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,1 M Triton X 100, aufgelöst. Dieses Verfahren ergibt Material, das nicht so rein ist wie das, das durch die Affinitätssäule erhalten wurde, wenn es durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese untersucht wird.

3. Analyse

Die gemäß diesen Verfahren erhaltenen, gereinigten Materialien wurden auf Protein hin untersucht mit der Bio-Rad (Richmond, CA) Proteinmethode, wie vom Hersteller empfohlen. Es wurde auch einer Analyse durch SDS-Polyacrylamidelektrophorese unterzogen. Diese Gele werden sichtbar gemacht entweder durch Proteinanfärbung oder durch Western Blot Analyse. Die Proteinfärbung wurde typischerweise durchgeführt mit entweder der Silberfärbemethode, wie beschrieben von Wray, W.P., et al., in Anal. Blockem. 118: 197-203 (1981) oder der Bio-Rad Proteinfärbung. Die Western Blot Analyse wird durchgeführt wird beschrieben von Remart, J., et al., in PNAS (USA) 76: 3116 (1979).
Die Western Blot Analyse umfaßt den elektrophoretischen Transfer der aufgetrennten Proteinbanden auf Nitrozellulose, Blockieren des Nitrozellulosepapiers mit BSA, Behandeln mit einem spezifischen Antikörper (entweder Anti-Beta-Galactosidase oder Anti-Mycoplasma-Serum). Nach dem Waschen werden die Blots mit dem geeigneten, Peroxidase-konjugierten zweiten Antikörper behandelt, gefolgt von der Farbentwicklung unter Verwendung der Peroxidase-katalysierten Reaktion.

V. Verfahren zum Herstellen des vollständigen M. hyopneumoniae- Gens, das von einem Clon für ein Fusionsprotein codiert wird

Die rekombinanten M. hyopneumoniae-Clone, die abgenommen wurden, weil sie reaktiv waren mit verschiedenen Antimycoplasma-seren, enthalten nur einen Teil der vollständig codierenden Region für das spezielle Polypeptid wegen des Erfordernisses, daß die Insert-Sequenz im Raster liegt mit dem Beta- Galactosidasegen von Lambda gt11 und der beschränkten Anzahl an abgesuchten Clonen. In einigen Fällen kann es wichtig sein, die vollständig codierende Sequenz eines gegebenen antigenen M. hyopneumoniae-Polypeptids cloniert zu haben, um die Immunantwort zu maximieren oder die Antwort zu modulieren. Unten wird ein Verfahren angegeben, das die Isolierung von Clonen erlaubt, die solche Fragmente der vollen Länge enthalten.
Die oben beschriebene Lambda gt11-Expressionsbank kann auch als eine einfache genomische Bank angesehen werden, falls man nicht verlangt, daß die eingefügten Segmente von M. hyopneumoniae als Fusionsproteine exprimiert werden. Einige dieser Clone sollten die vollständige codierende Region für ein spezielles Protein enthalten, selbst wenn sie nicht im Raster ist mit dem Beta- Galactosidaseexpressionssystem.
Diese Clone können nachgewiesen werden unter Verwendung von DNA-Hybridisierungsproben, die von Clonen stammen, die bereits anhand von Antikörperverfahren abgenommen wurden, und von denen bekannt ist, daß sie bestimmten Mycoplasma-proteinen entsprechen. Die Insertfragmente von diesen Clonen werden "Nicktranslatiert" unter Verwendung von E. coli-DNA-Polymerase, um 32-P-markierte Desoxynukleotide in die DNA einzubauen. Diese markierte DNA wird dann als eine radioaktive Probe verwendet, um homologe M. hyopneumoniae-Sequenzen aus der rekombinanten Lambda gt11-Bank zu selektieren. Aus der rekombinanten Bank durch dieses Verfahren selektierte Phagen werden dann Plaquegereinigt, DNA wird hergestellt, und das spezifische M. hyopneumoniae-Insert wird mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen kartiert. Die erhaltene Karte wird mit einer ähnlichen Karte verglichen, die von dem anfänglichen Clon erhalten wurde, um die Identität des neuen genomischen Phagen zu bestätigen.
Da es in den prokaryontischen Genen keine Introns gibt, kann man aus der Größe des codierten Proteins bestimmen, wieviel DNA auf jeder Seite der markierten DNA umfaßt sein muß, um sicher zu sein, daß das vollständige Gen enthalten ist. Das vollständige Gen muß nicht in einem einzigen Clon enthalten sein; jedoch ist es für den Fachmann möglich, das vollständige Gen zu erhalten. Dies erfolgt durch "Wandern" entlang des M. hyopneumoniae-Genoms durch Isolieren von Phagen, die flankierende genomische DNA von M. hyopneumoniae enthalten, unter Verwendung des Verfahrens von Bender, E., et al., in J. Mol. Biol. 168: 17-33 (1983).

VI. Verfahren zur Identifizierung von Clonen, die Oberflächenproteinen entsprechen

Von Proteinen, die auf der Oberfläche einer Mycoplasma-zelle exponiert vorliegen, ist gezeigt worden, daß sie gegenüber dem Abbau durch eine Protease, wie Trypsin, empfänglich sind, wenn gesamte, intakte Zellen mit dem Enzym leicht behandelt werden (Klinkert, M.,Herrmann, R., und Schaller, H., (1985) Infection and Immunity 49, 329-335), das hierin durch Bezugnahme eingeführt wird. Diese Technik, in Kombination mit der Elution von Antikörpern von Clonen, erlaubt die rasche Bestimmung, ob ein spezieller Clon einem Trypsin-sensitiven Oberflächenprotein entspricht. Gesamtproteine von trypsinisierten und nicht-trypsinisierten Mycoplasma-zellen werden in benachbarte Spuren eingebracht und durch SDS-Polyacrylamid-slab-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die dargestellten Proteine werden dann per Elektroblot auf Nitrozellulosemembran anhand des Western Blot- Verfahrens übertragen. Dieser Blot wird dann unter Verwendung von Antikörpern von einem polyclonalen Serum behandelt, die affinitätsgereinigt worden waren mit einem spezifischen Clon unter Verwendung der oben beschriebenen Antikörperelutionstechnik.
Das spezifische Mycoplasma-protein auf dem Western Blot, das dem Clon entspricht, wird dargestellt durch Anfärben des gebundenen Antikörpers in der Spur mit Proteinen aus nicht-trypsinisierten Zellen, wobei eine spezifisch angefärbte Bande auftritt. Falls das Protein Trypsin-sensitiv ist, wird die entsprechende Position in der Spur mit Proteinen von trypsinisierten Zellen blank sein, während eine nicht-trypsinsensitve Bande wie in den unbehandelten Zellen angefärbt sein wird.

Claims

1. Oberflächenprotein von Mycoplasma hyopneumoniae, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein A, Protein C, Protein D und Protein E,

worin diese Proteine durch mindestens eine der folgenden Quellen an Antikörper erkannt werden: Schweineimmunserum, Anti- Mycoplasma-Hyperimmunserum des Kaninchens und monoklonale Anti- Mycoplasma-Antikörper der Maus, und worin

das Protein A ein Molekulargewicht von 105 kD besitzt, das Protein C ein Molekulargewicht von 85 kD besitzt, das Protein D ein Molekulargewicht von 70 kD besitzt, unter der Bedingung, daß das Protein p 68 gemäß EP-A-0196215 ausgenommen ist, und das Protein E ein Molekulargewicht von 43 kD besitzt, wobei die Molekulargewichte der Proteine durch SDS-PAGE bestimmt werden.

2. Ein Phagenklon λgt11, enthaltend ein 1,5 kb-Insert in der EcoRI-Stelle des λgt11, wobei das Insert für einen Teil des Proteins A nach Anspruch 1 kodiert.

3. Ein Phagenklon λgt11, enthaltend ein 0,5 kb-Insert in der EcoRI-Stelle des λgt11, wobei das Insert für einen Teil des Proteins C nach Anspruch 1 kodiert.

4. Ein Phagenklon λgt11, enthaltend ein 3,2 kb-Insert in der EcoRI-Stelle des λgt11, wobei das Insert für einen Teil des Proteins D nach Anspruch 1 kodiert.

5. Ein Phagenklon λgt11, enthaltend ein 0,5 kb-Insert in der EcoRI-Stelle des λgt11, wobei das Insert für einen Teil des Proteins E nach Anspruch 1 kodiert.

6. Ein rekombinantes DNA-Verfahren zum Herstellen der Proteine nach Anspruch 1, die eine Antigenantwort induzieren können, umfassend:

(a) Herstellen einer DNA-Sequenz, die einen Wirtsmikroorganismus veranlassen kann, das Protein herzustellen;

(b) Klonieren der DNA-Sequenz in einen Vektor, der in einen Wirtsmikroorganismus übertragen und darin repliziert werden kann, wobei der Vektor Kontrollelemente für die DNA-Sequenz enthält;

(c) übertragen des Vektors, enthaltend die DNA-Sequenz und die Kontrollelemente, in einen Wirtsmikroorganismus, der das antigene Protein exprimieren kann;

(d) Kultivieren des Wirtsmikroorganismus unter Bedingungen, die geeignet sind zur Amplifikation des Vektors und zur Expression des Proteins; und

(e) in beliebiger Reihenfolge:

i) Ernten des Proteins; und

ii) das Protein veranlassen, eine Struktur anzunehmen, wodurch es antigene Eigenschaften gewinnt, die analog sind zu den Eigenschaften, die Mycoplasma-Organismen aufweisen.