DE68916424T2

DE68916424T2 - Pasteurella-impfstoff.

Info

Publication number: DE68916424T2
Application number: DE68916424T
Authority: DE
Inventors: Svend Petersen; Foged Niels Taekker
Original assignee: STATENS VETERINAERE SERUMLABOR; Intervet International BV
Current assignee: STATENS VETERINAERE SERUMLABOR; Intervet International BV
Priority date: 1988-04-12
Filing date: 1989-04-11
Publication date: 1994-11-10
Anticipated expiration: 2009-04-12
Also published as: DK199588D0; US5369019A; EP0409895A1; AU3532089A; ATE107516T1; DE68916424D1; EP0409895B1; US6110470A; IE64033B1; WO1989009617A1; IE891151L

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Impfstoff zur Immunisierung von Tieren gegen durch ein osteolytisches Toxin bildende Mikroorganismen verursachte Krankheiten, eine ein Pasteurella multocida-Toxin codierende DNA-Seqiienz, die zur Herstellung des Toxins und als diagnostisches Mittel anwendbar ist, Verfahren zur Herstellung und Isolierung eines P. multocida-Toxins, Anwendung eines P. multocida-Toxins, einen gegen ein P. multocida-Toxin gerichteter monoklonaler Antikörper, ein den besagten monoklonalen Antikörper umfassendes diagnostisches Mittel und die Anwendung des besagten monoklonalen Antikörpers für verschiedene diagnostische und andere Zwecke.

TECHNISCHER HINTERGRUND

Atrophische Rhinitis ist eine Krankheit, die die Knochenstruktur der porcinen Schnauze profund angreift. Das ätiologische Agens, das zur Zeit als Ursache der wachstumsverhindernden progressiven atrophischen Rhinitis angesehen wird, sind toxigene (Toxin-bildende) Stämme von P. multocida, die sich in der Nasenhöhle von Schweinen ansiedeln [Pedersen und Barfod, 1981, (Ref. 1), Rutter und Rojas, 1982, (Ref. 2), Elling und Pedersen, 1985, (Ref.3), Pedersen et al., 1988 (Ref. 4)]. Es wurde gezeigt, dass die Nasenschleimhäute leichter durch P. multocida besiedelt werden, wenn die Resistenz niedriger ist, zum Beispiel wenn die Schweine gleichzeitig mit Bordetella bronchiseptica infiziert sind oder wenn die Nasenschleimhäute einem mildem chemischen Reizstoff ausgesetzt sind [cf. Pedersen und Elling, 1984, (Ref.5)].
Der pathologische Effekt einer P. multocida-Infektion kann einem Toxin zugeschrieben werden, das von diesem Bakterium erzeugt wird. Das Toxin, das ein scheinbares Molekulargewicht von 143 kD und ein tatsächliches Gewicht von 146,5 kD besitzt, induziert die Knochenresorption (Osteolyse) der Nasenmuscheln und anderer Knochenstrukturen in der Nasenhöhle durch die Stimulierung von Osteoclastenaktivität in den porcinen Nasenmuschelknochen und verursacht verminderte osteoblastische Knochenbildung.
Die Krankheit ist von grösster wirtschaftlicher Bedeutung für Schweinezüchter in der ganzen Welt, da, abgesehen von den pathologischen Effekten auf die nasalen (und gelegentlich fazialen) Knochen, wie oben bemerkt, eine verlangsamte Wachstumsrate der infizierten Schweine und daraus folgend höhere Produktionskosten verursacht werden. Es sind daher Versuche unternommen worden das Auftreten und die Bedeutung von P. multocida-Infektionen zu reduzieren, zum Beispiel durch die Herstellung von SPF (spezifisch pathogenfreie) Schweine durch Kaiserschnitt oder durch antibiotische Behandlung infizierter Tiere oder prophylaktische Impfung.
Bekannte Impfstoffe für die Immunisierung von Tieren, vor nehmlich von Schweinen, gegen Krankheiten, die der P. multocida-Infektion zugeschrieben werden, insbesondere atrophische Rhinitis, umfassen abgetötete P. multocida-Zellen, vorzugsweise kombiniert mit Bordetella bronchiseptica-Zellen (vergl. EP 85 469) und/oder einen (gewöhnlich durch Hitzebehandlung oder Zusatz von Formaldehyd) inaktivierten toxinhaltigen Extrakt des toxischen P. multocida. Impfstoffe der letztgenannten Art sind käuflich erhältlich sowohl von Northern Drugs & Chemicals Ltd., Kopenhagen, Dänemark, unter dem Handelsnamen Atrinord , als auch von Intervet International BV, Boxmeer, Holland unter dem Handelsnamen Nobi-vacART .
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung erwägen, dass ein, im Vergleich zu den bekannten Impfstoffpräparaten verbesserter immunogener Effekt erreicht werden könnte, indem ein gereinigtes und in geeigneter Weise modifiziertes Toxinpräparat zu Impfzwecken erhalten werden könnte, um entweder die herkömmlichen Impfstoffe zu ersetzen oder als ein Bestandteil davon.
Die Reinigung von P. multocida wurde früher bereits beschrieben. In Foged et al., 1987 (Ref.6) ist die Reinigung des Toxins durch Chromatographie und Gelelektrophorese offenbart. Das gereinigte Toxin wird allein zur Untersuchung seiner toxischen und pathologischen Wirkungen verwendet. Kamp et al., 1987 (Ref.7) offenbaren auch die Reinigung des P. multocida-Toxins zum Zweck klinischer Studien. Sie schlagen vor, dass das gereinigte Toxin als Antigen verwendet werden kann, um spezifische, für serologische Tests nützliche Antikörper herzustellen. Nakai et al., 1984 (Ref.8) offenbaren ein Verfahren zur Reinigung des P. multocida-Toxins durch Chromatographie und Polyacrylamidgelelektrophorese. Sie offenbaren weiterhin die Herstellung von polyklonalen, gegen das gereinigte Toxin gerichteten Antikörpern, die sie zur Analyse der Reinheit des gereinigten Toxins verwenden. Es wird vorgeschlagen, dass die Antikörper zur weiteren Untersuchung der Rolle des Toxins bei atrophischer Rhinitis verwendet werden können.
Keine dieser Publikationen schlägt die Verwendung des gereinigten Toxins als Komponente eines Impfstoffes zur Immunisierung von Tieren gegen Pasteurella-Infektionen vor, und es wird angenommen, dass es sich um ein neues Konzept handelt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung befasst sich mit einem ein pasteurella multocida-Toxin codierenden DNA-Fragment, das eine wie in Figur 10 (a) - (j) gezeigte Aminosäurensequenz umfasst, oder für eine immunogene Subsequenz oder ein Analog des besagten Toxins codiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Impfstoff zur Immunisierung eines Lebewesens, einschliesslich eines Menschen, gegen durch Mikroorganismen verursachte Krankheiten, die ein osteolytisches Toxin produzieren, wobei der Impfstoff eine immunogen wirksame Konzentration eines rekombinanten, immunogenen, entgifteten P. multocida-Toxins oder Toxinanalogs zusammen mit einem immunologisch annehmbaren Träger oder Vehikel umfasst, wobei das Toxin oder das Toxinanalog von dem obengenannten DNA-Fragment exprimiert wird.
Zur Herstellung der bekannten Impfstoffe wird ein toxischer Pasteurella-Stamm gezüchtet und das Toxin aus dem Kulturmedium oder aus einem Bakterienextrakt isoliert, gefolgt von einer Entgiftung, zum Beispiel durch Wärme- oder chemische Behandlung. Im Vergleich zu diesem Verfahren hat die Herstellung des Toxins oder des Toxinanalogs mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken eine Vielzahl von Vorteilen: es ist möglich, das Toxin oder das Toxinanalog herzustellen, indem ein nichtpathogener Organismus gezüchtet wird, das Toxin oder Toxinanalog kann in grösseren Mengen als von den Wildtyp-Stämmen von P. multocida hergestellt werden, zum Beispiel durch Verwendung eines starken Promotors um einen hohen Expressionsgrad des Toxingens zu induzieren oder durch Verwendung eines Vektors zum Klonieren des Toxingens, der eine hohe Kopienzahl hervorbringt, und es ist möglich das Toxin oder das Toxinanalog in einer entgifteten Form herzustellen, z.B. indem das für das Toxin codierende Gen einer Behandlung mit einem Mutagen ausgesetzt wird, oder durch Deletion eines Teils der für das Toxin oder Toxinanalog codierenden Nukleotidsequenz, Ersetzen eines oder mehrerer Nukleotide in der Sequenz, usw. Das rekombinante Toxin oder Toxinanalog kann in der im wesentlichen reinen Form in dem Impfstoff der Erfindung verwendet werden, kann aber auch als rohe oder teilweise gereinigte Präparation verwendet werden.
In dem vorliegenden Zusammenhang ist der Ausdruck "im wesentlichen rein" so zu verstehen, dass der Impfstoff im wesentlichen frei von anderen immunogenaktiven Komponenten ist, deren Gegenwart nachteilige Immunreaktionen in mit diesem Impfstoff immunisierten Tieren hervorrufen könnte und insbesondere, dass keine andere Komponente des das Toxin oder Toxinanalog produzierenden Mikroorganismus, wie zum Beispiel Zelltrümmer oder zelluläre Proteine ausser dem Toxin oder Toxinanalog selbst oder ein Protein oder Polypeptid mit dem das Toxin oder Toxinanalog fusioniert ist (siehe unten), in der Impfstoffpräparation vorhanden sind. Von einer hohen Reinheit des entgifteten Toxins oder des Toxinsanalogs wird angenommen, dass sie in einer hohen Antitoxinantwort nach Immunisierung mit dem Impfstoff der Erfindung resultiert und eine niedrigere Dosis des Toxins oder Toxinanalogs infolgedessen zu Zwecken der Immunisierung erforderlich sein kann, als diejenige, die bei rohen oder teilweise gereinigten Impfpräparaten angewendet wird. Ein im wesentlichen reines Toxin oder Toxinanalog hat den zusätzlichen Vorteil, dass seine genaue Konzentration in einer gegebenen Impfstoffpräparation bekannt ist, so dass eine exakte Dosis dem in Frage kommenden Tier verabreicht werden kann.
Der ein osteolytisches Toxin (d.h. ein Toxin, das direkt oder indirekt an der Knochenresorption beteiligt ist) erzeugende Mikroorganismus, gegen den der Impfstoff Immunität verleiht, ist vorzugsweise P. multocida. Andere Mikroorganismen, die osteolytische Wirkungen oder Regulierung spezifischer Marker des Knochenstoffwechsels gezeigt haben, sind z. B. Actinomyces viscocus und Bordetella pertussis [Trummel et al., 1979, (Ref. 9) und Price (Ref. 10)].
Aufgrund der toxischen Aktivität des P. multocida-Toxins ist es nicht möglich, das natürliche Toxin in einem Impfstoff der Erfindung zu verwenden. Es muss vielmehr in entgifteter Form vorhanden sein. Der Ausdruck "entgiftet" soll dahingehend verstanden werden, dass die toxische Aktitvität mindestens einer genügenden Anzahl, aber nicht notwendigerweise aller, der in der Impfstoffpräparation vorhandenen Toxinmoleküle entfernt wurde, so dass der Impfstoff, wenn dem zu immunisierenden Tier verabreicht, keine schädigenden toxischen Wirkungen in dem in Frage stehenden Tier verursacht, während immer noch eine zufriedenstellende Immunantwort hervorgerufen wird.
Die Entgiftung des P. multocida-Toxins oder Toxinanalogs kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Es ist so mit möglich, das Toxin oder Toxinanalog einer Wärmebehandlung zu unterziehen, wobei von dem Toxin bekannt ist, dass es hitzelabil ist und bei 70ºC inaktiviert (entgiftet) wird. Darüberhinaus kann das Toxin oder Toxinanalog einer Behandlung mit einer Chemikalie, wie zum Beispiel Formaldehyd, Glutaraldehyd oder ein geeignetes proteolytisches Enzym, z.B. Trypsin, unterzogen werden. Entgiftung kann auch durch Mutagenisierung des für das P. multocida-Toxin oder Toxinanalog codierenden Gens erreicht werden, zum Beispiel durch ultraviolette Bestrahlung, ionisierende Bestrahlung oder ein chemisches Mutagen wie zum Beispiel Mitomycin C, 5-Bromuracil, Methylmethansulfonat, Stickstoffsenf oder ein Nitrofuran. Darüberhinaus kann das Toxin durch Substitution, Deletion, Addition oder Insertion eines oder mehrerer Aminosäuren in das Toxin oder Toxinanalog oder durch Substitution, Deletion, Addition oder Insertion eines oder mehrerer Basenpaare in die für das Toxin oder Toxinanalog codierende Sequenz oder durch eine Kombination dieser Massnahmen, entgiftet werden.
Im Gegensatz zur Entgiftung durch Wärme- oder chemische Behandlung, hat das genetische Verfahren den offensichtlichen Vorteil in einer einheitlichen Population gleicher entgifteter Moleküle zu resultieren.
Es ist zu beachten, dass die Begriffe "Substitution, Deletion, Addition oder Insertion" unter Bezugnahme auf das Toxinprotein in seiner vollen Länge interpretiert werden sollten. "Substitution" bedeutet daher den Ersatz einer jeden einzelnen oder mehrerer Aminosäuren oder Nukleotide durch ein oder mehrere andere in der kompletten Aminosäuren- oder Nukleotidsequenz, "Addition" soll die Addition eines oder mehrerer Aminosäuren oder Nukleotide an jedem Ende der kompletten Aminosäure- oder Nukleotidsequenz bedeuten, "Insertion" soll die Einführung eines oder mehrerer Aminosäuren oder Nukleotide in der kompletten Aminosäuren- oder Nukleotidseqeunz bedeuten, und "Deletion" soll anzeigen, dass ein oder mehrere Aminosäuren oder Nukleotide von der kompletten Aminosäuren- oder Nukleotidsequenz deletiert wurden, entweder an einem der Enden oder an jeder geeigneten Stelle innerhalb der Sequenz. Es soll verstanden werden, dass die Entgiftung des Toxins oder Toxinanalogs auch durch eine Kombination zweier oder mehrerer dieser Verfahren erreicht werden kann.
Der Begriff "Toxinanalog" wird in dem vorliegenden Kontext verwendet, um ein Protein oder Polypeptid einer gleichen Aminosäurenzusammensetzung wie das P. multocida-Toxin anzuzeigen, wobei Variationen erlaubt sind, die keine ungünstige Wirkung auf die Immunogenität des Analogs besitzen.
Das analoge Polypeptid oder Protein kann von einem Mikroorganismus einer anderen Spezies als p. multocida abstammen oder kann teilweise oder vollständig synthetischen Ursprungs sein. Das analoge Polypeptid oder Protein kann auch eines sein, das mindestens ein mit anti-P. multocida-Antikörpern reagierendes Epitop umfasst, die in Proben von In dividuen mit atrophischer Rhinitis gefunden wurden, und/oder Antikörper induziert, die mit dem natürlichen P. multocida-Toxin reagieren. Der Begriff soll weiterhin jede immunogene Subsequenz, jedes funktionelle Aequivalent oder Derivat des Toxins bedeuten.
Der Begriff "immunogene Subsequenz" soll eine Sequenz des Toxins der vollen Länge bezeichnen, die von Anfang an als in einer, im Verhältnis zum Toxinprotein der vollen Länge gekürzten Form hergestellt wird, oder die im Anschluss an die Herstellung des Proteins der vollen Länge erzeugt wird, zum Beispiel durch proteolytische Spaltung desselben oder durch Expression einer Nukleotidsequenz, die kürzer als die volle, das P. multocida-Toxin codierende Nukleotidsequenz ist. Die minimale Subsequenz ist eine, die mindestens ein relevantes Epitop des Toxins umfasst, z.B. ein Epitop, das eine relevante Immunantwort in einem mit dem Impfstoff der Erfindung immunisierten Tier hervorruft.
Der Begriff "funktionelles Aequivalent" soll alle immunogen aktiven Substanzen einschliessen, welche die Fähigkeit aufweisen, eine Immunantwort in Tieren hervorzurufen, welchen der das Aequivalent enthaltende Impfstoff, verabreicht wurde, die derjenigen Immunantwort ähnlich ist, die durch das entgiftete P. multocida-Toxin hervorgerufen wird, sodass das Aequivalent in der Lage ist, Immunität gegen Krankheiten zu verleihen, die von das osteolytische Toxin produzierenden Mikroorganismen hervorgerufen werden. Das funktionelle Aequivalent kann von einem Mikroorganismus einer anderen Spezies als P. multocida abstammen oder kann teilweise oder ganz synthetischen Ursprungs sein. Es soll verstanden werden, dass die Aehnlichkeiten zwischen dem P. multocida-Toxin und dem funktionellen Aequivalent eher qualitativ als quantitativ sind, eher bezogen auf die Natur als auf die Stufe der Aktivität des funktionellen Aequivalents.
Der Begriff "Derivat" bedeutet eine Modifikation des Toxins, so wie sie durch Substitution, Insertion, Addition oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren oder Nukleotide oder durch Kombination dieser Massnahmen, wie oben beschrieben, oder durch Fusion mit einem anderen Polypeptid, erzeugt werden kann.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein DNA-Fragment, das eine für ein P. multocida-Toxin oder Toxinanalog codierende Nukleotidsequenz, wie oben beschrieben, umfasst. Das DNA-Fragment kann zum Beispiel in einem Verfahren zur Herstellung des Toxins oder Toxinanalogs durch rekombinante DNA-Techniken oder als diagnostisches Agens (d.h. als DNA-Sonde) verwendet werden.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment des besagten Antikörpers, der gegen ein, wie oben definiertes, P. multocida-Toxin oder Toxinanalog gerichtet ist oder mit diesem reagiert. Es ist zu beachten, dass der Antikörper mit beiden, dem toxischen und entgifteten Toxin reagieren kann und daher für verschiedene diagnostische, immunisierende und Isolationszwecke verwendet werden kann, wie weiter unten detaillierter beschrieben wird.

DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Das von P. multocida produzierte Toxin (im folgenden gelegentlich als PMT abgekürzt), von dem, wie oben bemerkt, allgemein angenommen wird, das verursachende Agens der porcinen atrophischen Rhinitis zu sein, wurde in der früheren Literatur verschiedentlich als "dermonekrotisches Toxin", "osteolytisches Toxin", "Nasenmuschelatrophietoxin" und "hitzelabiles Exotoxin" bezeichnet, aber es scheint, dass es das gleiche Toxin ist, da Aminosäurenzusammensetzung, isoelektrischer Punkt und biologische Aktivitäten der verschieden bezeichneten Toxine grundsätzliche Gemeinsamkeiten zeigen, obwohl geringe Unterschiede bei den Eigenschaften der von verschiedenen P. multocida-Stämmen isolierten Toxine zu existieren scheinen. Die geschätzte Aminosäurenzusammensetzung von PMT (wie von der DNA-Sequenz abgeleitet) ist wie folgt:
Ala wird 76 mal gefunden - 5,91%
Cys wird 8 mal gefunden - 0,62%
Asp wird 71 mal gefunden - 5,53%
Glu wird 100 mal gefunden - 7,78%
Phe wird 69 mal gefunden - 5,37%
Gly wird 71 mal gefunden - 5,53%
His wird 19 mal gefunden - 1,48%
Ile wird 92 mal gefunden - 7,16%
Lys wird 70 mal gefunden - 5,45%
Leu wird 127 mal gefunden - 9,88%
Met wird 36 mal gefunden - 2,80%
Asn wird 73 mal gefunden - 5,68%
Pro wird 62 mal gefunden - 4,82%
Gln wird 56 mal gefunden - 4,36%
Arg wird 58 mal gefunden - 4,51%
Ser wird 97 mal gefunden - 7,55%
Thr wird 66 mal gefunden - 5,14%
Val wird 63 mal gefunden - 4,90%
Trp wird 18 mal gefunden - 1,40%
Tyr wird 53 mal gefunden - 4,12%
Die Gesamtzahl der Aminosäurereste beträgt 1285, das Toxin der vollen Länge besitzt ein Molekulargewicht von 146,5 kD.
Das rekombinante, in dem Impfstoff der Erfindung verwendete Toxin oder Toxinanalog kann, genauer gesagt, von einer im wesentlichen in Figur 10 (a) - (j) dargestellten DNA-Sequenz oder einer Subsequenz davon codiert werden, die für eine immunogene Subsequenz des Toxins oder Toxinanalogs codiert.
Es ist zu beachten, dass die von der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäurensequenz ebenfalls in Figur 10 (a) - (j) über der DNA-Sequenz gezeigt ist. Ein geeignetes Analog kann eine DNA-Sequenz besitzen, die sich von der des natürlichen Toxins durch ein oder mehrere Basenpaare unterscheidet und die durch Substituieren eines oder mehrerer Nukleotide in der DNA-Sequenz des Toxins erhalten wurde, wobei entweder die gleiche Aminosäurensequenz entsteht, aber die Nukleotidsubstitutionen die Sequenz dem Codon-Gebrauch des Mikroorganismus, in den die Sequenz inseriert ist, angepasst ist, oder eine etwas verschiedene Aminosäurensequenz entsteht, die jedoch funktionell dem natürlichen Toxin entspricht.
Ausser dem wie oben beschriebenen Toxin oder Toxinanalog, kann der Impfstoff der Erfindung auch einen immunologisch annehmbaren Träger oder Vehikel umfassen. Dieses Vehikel kann jedes normalerweise zur Impfstoffherstellung benutztes Vehikel sein, z.B. ein Verdünnungsmittel wie eine isotone Kochsalzlösung, ein Suspensionsmittel, usw. Der Impfstoff kann durch Mischen einer immunogen wirksamen Konzentration des Toxins oder Toxinanalogs mit dem Vehikel in Mengen hergestellt werden, die in der gewünschten Konzentration des Toxins oder Toxinanalogs im Impfstoffpräparat resultieren. Obwohl die Konzentration des Toxins oder Toxinanalogs pro Dosiseinheit des Impfstoffes dem Alter der zu immunisierenden Tiere entsprechend (zum Beispiel ob Schweine oder Ferkel gegen P. multocida immunisiert werden sollen), der Art und Weise der Verabreichung und die Immunogenität des jeweiligen in dem Impfstoff vorhandenen Toxins variieren wird, wird als geeignete Konzentration des Toxins oder Toxinanalogs der Bereich von 0,1 - 500 ug pro Dosis des Impfstoffes angesehen.
Der Impfstoff kann weiterhin ein Adjuvans umfassen, um die Immunogenität des Impfstoffpräparats zu erhöhen. Das Adjuvans kann aus dem Freundschen vollständigen oder unvollständigen Adjuvans, Aluminiumhydroxid, Bordetella pertussis, einem Saponin, einem Muramyldipeptid, einem Iscom (immunstimulierender Komplex; siehe zum Beispiel EP 109 942) und einem Oel, wie einem pflanzlichen Oel, z.B. Erdnussöl, oder einem Mineralöl, z.B. Siliconöl, ausgewählt werden.
In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, das Toxin oder Toxinanalog an einen Träger zu kuppeln, insbesondere an einen makromolekularen Träger. Bei dem Träger handelt es sich gewöhnlich um ein Polymer, an den das Toxin über hydrophobe, nicht-kovalente Interaktion gebunden ist, wie ein Kunststoff, z.B. Polystyrol, oder ein Polymer, an das das Toxin kovalent gebunden ist, wie ein Polysaccharid oder ein Polypeptid, z.B. Kälberserumalbumin, Ovalbumin oder Hämocyanin der Napfschnecke. Der Träger sollte vorzugsweise nicht-toxisch und nicht-allergen sein. Das Toxin oder Toxinanalog kann an den makromolekularen Träger multivalent gekuppelt sein, da dies dem Impfstoffpräparat eine gesteigerte Immunogenität verleiht. Es wird ebenfalls in Erwägung gezogen, das Toxin oder Toxinanalog in multivalenter Form durch Polymerisieren des Toxins oder Toxinanalogs mit sich selbst darzustellen.
In einer speziellen Ausführung des Impfstoffes der vorliegenden Erfindung wird das wie oben definierte Toxin oder Toxinanalog mit einem anderen Polypeptid fusioniert. Techniken zur Herstellung fusionierter Polypeptide sind z.B. aus Casadaban und Cohen, 1983, (Ref. 11) bekannt. Als andere Möglichkeit kann die Fusion auch durch Fusionierung der das Toxin oder Toxinanalog codierenden Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz erfolgen, die für ein anderes Polypeptid codiert, so dass die fusionierte Nukleotidsequenz, wenn in einen geeigneten Vektor inseriert, nach Transformation des Vektors in einen geeigneten Mikroorganismus und Wachstum des Mikroorganismus unter für die Expression des fusionierten Sequenz vorteilhaften Bedingungen als ein Fusionspolypeptid exprimiert wird. Das Polypeptid, mit dem das Toxin fusioniert wird, kann zum Beispiel ein wie oben vorgeschlagenes Trägerpolypeptid, Lysozym oder ein anderes immunogenes Peptid wie ein Ty-Protein von Saccharomyces cerevisiae, Protein A aus Staphylococcus aureus, das Hepatitis B-Kernantigen, usw., sein.
Es wird ebenfalls in Erwägung gezogen, dass der Impfstoff die Form von Tabletten, Granula oder Kapseln zur oralen Verabreichung haben kann, da es Hinweise gibt, dass Immunogene durch die Darmwände aufgenommen werden können und B- Lymphocyten stimulieren, die dann zu lokalen epithelialen Regionen wandern, wo sie in Immunoglobulin ausscheidende Plasma-Zellen transformiert werden. Ein oraler Impfstoff sollte mit einem darmlöslichen Ueberzug versehen sein, um das Toxin oder Toxinanalog vor Substanzen, wie Pepsin, zu schützen, die im Magensaft vorkommen und die schädlich für das Toxin oder Toxinanalog sein könnten. Der darmlösliche Ueberzug kann aus Schellack, Celluloseacetatestern wie Celluloseacetatphthalat, Hydroxypropylmethylcelluloseestern wie Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, Polyvinylacetatestern wie Polyvinylacetatphthalat und Polymeren von Methacrylsäuren und (Meth)acrylsäureestern ausgewählt sein. Neuentwickelte Verfahren der Einkapselung, die auf Mikrokugeln mit einem Durchmesser von ungefähr 5-15 um basieren, sind von besonderem Interesse, da solche, eine immunogene Substanz enthaltende Partikel selektiv zu den Peyer'schen Plaques geliefert werden und dabei den Schleimhautoberflächen Immunität verleihen. Stimulierung der Immunantwort auf respiratorischen Schleimhautoberflächen kann auch durch intranasale Immunisierung erhalten werden. [Nestecky, 1987 (Ref. 12)].
Das DNA-Fragment der Erfindung, die Nukleotidsequenz enthaltend, die für das Toxin oder Toxinanalog codiert, kann von komplementärer cDNA abstammen, die durch Herstellen einer cDNA-Bank auf der Basis von mRNA aus einem toxinbildenden P. multocida-Stamm durch Standardmethoden erhalten wurde.
Als andere Möglichkeit und vorzugsweise kann die Nukleotidsequenz von einem P. inultocida-Genom durch die Suche nach einer genomischen Sequenz erhalten werden, die mit einer DNA-Sonde hybridisiert, die auf der Basis der vollständigen oder teilweisen Aminosäurensequenz des Toxins in Uebereinstimmung mit bekannten Verfahren hergestellt wurde oder durch Aufstellen einer Genbibliothek und Suche nach toxinerzeugenden Klonen mit der Hilfe von toxinspezifischen Antikörpern (für eine detailliertere Beschreibung dieses Verfahrens siehe Beispiel 4). Im Fall von PMT ist es nicht möglich, eine DNA-Sonde auf der Basis seiner N-terminalen Aminosäurensequenz herzustellen, da PMT am N-Terminus blokkiert ist und daher durch Verfahren zur Sequenzierung von Aminosäuren nicht abgebaut werden kann.
Eine anderes routinemässig angewendetes Suchverfahren, das sich als schwierig im Fall von PMT erwiesen hat, ist die Suche nach toxinerzeugenden Klonen mit Hilfe eines anti-PMT-Serums. Beim Anwenden eines Serums von einem wiederholt mit PMT immunisierten Hasen, fanden die Erfinder mit dem Kolonie-Blot-Verfahren, wie in Beispiel 5 beschrieben, in der Genbibliothek 5 E. coli-Klone. Weitere Untersuchungen der obengenannten 5 Klone zeigten jedoch, dass keiner von ihnen PMT erzeugte. Diese Ergebnisse zeigen die Bedeutung der Durchführung der Suche mit anti-PMT monoklonalen Antikörpern, we in Beispiel 5 beschrieben wird.
Die Nukleotidsequenz kann auch aus einem mit P. multocida infizierten Bakteriophagen erhalten werden, d.h. eine Nukleotidsequenz, die einem Bakterienstamm entstammen, der die Sequenz ursprünglich enthielt, wird auf einen anderen Stamm, der die Sequenz ursprünglich nicht enthielt, durch Bakteriophagentransfektion übertragen. In gleicher Weise kann die Nukleotidsequenz von einem Plasmid oder genetischen Element abgeleitet werden, die von einem Stamm zum anderen durch Konjugation, Transformation oder dergleichen übertragen wird.
Darüberhinaus kann die Nukleotidsequenz, die für das Toxin codiert, eine synthetische Sequenz sein, die gemäss Standardverfahren, z.B. wie in Matthes et al., 1984 (Ref. 13) beschrieben, hergestellt wurde. Schliesslich kann die Nukleotidsequenz aus einer gemischten genomischen und synthetischen oder gemischten cDNA und synthetischen Sequenz bestehen, die durch Ligation von DNA-Fragmenten genomischen, cDNA oder synthetischen Ursprungs (wie geeignet), gemäss bekannter Verfahren, hergestellt werden, wobei die DNA-Fragmente jeweils einen Teil der für das Toxin codierenden Nukleotidsequenz enthalten.
Gemäss der oben gegebenen Erklärung, kann das DNA-Fragment durch Substitution, Addition, Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Nukleotide in der Sequenz modifiziert worden sein, mit der Absicht eine Sequenz herzustellen, die, wenn exprimiert, in der Herstellung eines entgifteten Toxins oder Toxinanalogs resultiert.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein DNA- Fragment, das eine, wie im wesentlichen in Figur 10 (a) - (j) dargestellte, Nukleotidsequenz oder eine Modifikation davon, wie oben erwähnt, umfasst. Die für das vollständige Toxin codierende Sequenz beginnt bei Position 219 (oder 213) der in der Figur 10 (a) - (j) gezeigten Sequenz, während sich das Ende der Sequenz an Position 4073 befindet. Die in Figur 10 (a) - (j) dargestellte Sequenz wurde durch hinreichend bekannte Verfahren hergestellt, wie unten in Beispiel 7 beschrieben.
Das DNA-Fragment der Erfindung kann weiterhin eine für ein anderes Polypeptid codierende Nukleotidsequenz umfassen, die mit der das Toxin oder Toxinanalog codierenden Nukleotidsequenz fusioniert ist, in der Absicht, ein fusioniertes Polypeptid, wie oben beschrieben, herzustellen. Eine weitere Absicht der Herstellung eines fusionierten Polypeptids kann die Vereinfachung der Reinigung des Toxins sein. In diesem Fall kann die fusionierte Sequenz in einen geeigneten Vektor inseriert werden, der in einen geeigneten Wirtsmikroorganismus transformiert wird, der unter Bedingungen gezüchtet wird, die die Expression der fusionierten Sequenz gewährleisten, wonach das fusionierte Polypeptid aus der Kultur gewonnen wird, indem das fusionierte Polypeptid einer Affinitätschromatographie unterworfen wird, die einen Antikörper oder einen anderen mit dem zweiten Polypeptid reagierenden Liganden einbezieht. Nach der Reinigung kann das zweite Polypeptid entfernt werden, zum Beispiel durch geeignete proteolytische Spaltung gefolgt von der Trennung der beiden Polypeptide.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eien Expressionsvektor, der fähig ist sich in einem Wirtsmikroorganismus zu replizieren und der das oben beschriebene DNA-Fragment trägt. Der Vektor kann entweder zur autonomen Replikation fähig sein, wie im Falle eines Plasmids, oder er wird mit dem Wirtschromosom repliziert, wie im Falle eines Bakteriophagen. Spezifische Beispiele von Expressionsvektoren der Erfindung sind die unten in Beispiel 9 beschriebenen und in der beigefügten Figur 13 dargestellten Plasmide pSPE A-R.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf einen Mikroorganismus, der fähig ist, ein wie oben definiertes DNA-Fragment zu exprimieren und der einen, wie oben beschriebenen, Vektor trägt. Der Mikroorganismus ist vorzugsweise ein Bakterium, insbesondere ein gramnegatives Bakterium, wie E. coli.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen, entgifteten P.multocida-Toxins oder Toxinanalogs, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
a) Isolierung einer für das P. multocida-Toxin oder Toxinanalog codierenden Nukleotidsequenz,
b) Inserieren der besagten Sequenz, gegebenfalls in einer geeigneten modifizierten Form, die zu der Expression des entgifteten Toxins oder Toxinanalogs führt oder einer Subsequenz, die für eine immunogene Subsequenz des Toxins oder Toxinanalogs codiert, in einen Expressionsvektor,
c) Transformieren eines geeigneten Wirtsmikroorganismus mit dem in Schritt b) erzeugten Vektor,
d) Züchten des in Schritt c) erzeugten Mikrooorganismus unter zur Expression des Toxins oder Toxinanalogs geeigneten Bedingungen,
e) Ernten des Toxins oder Toxinanalogs aus der Kultur und
f) gegebenenfalls Unterwerfen des Toxins posttranslationaler Modifikationen zur Herstellung eines entgifteten Toxins oder Toxinanalogs.
In Schritt a) des Verfahrens kann die Nukleotidsequenz zum Beispiel durch Aufstellen einer P. multocida-Genbibliothek und Suche nach toxinpositiven Klonen gemäss bekannter Verfahren, wie oben angegeben und im Detail in Beispiel 4 weiter unten beschrieben, isoliert werden.
In Schritt b) des Verfahrens kann die gegebenenfalls ausgeführte Modifikation vor oder nach der Insertion in den Vektor durchgeführt werden. Die Modifikation kann eine Substitution, Addition, Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Nukleotide in der Sequenz oder eine Kombination davon, wie oben erklärt, umfassen.
Die Transformation in Schritt c) des Verfahrens kann mit Hilfe von Standardverfahren, wie in Maniatis et al. (Ref. 14) offenbart, durchgeführt werden.
Die Züchtung des Wirtsmikroorganismus in Schritt d) des Verfahrens kann in einem Kulturmedium, z.B. "Luria Broth"- Medium, durchgeführt werden, das normalerweise zu Fermentationszwecken verwendet wird und unter Bedingungen bezüglich pH, Temperatur, Belüftung, etc. dem in Frage kommenden Mikroorganismus angepasst wird, wie in Maniatis et al. (Ref 14) offenbart.
In Schritt e) des Verfahrens kann das Ernten des Toxins oder Toxinanalogs mit Hilfe bekannter Methoden, wie Präzipitation, Gelfiltration, Ionenaustausch oder HPLC-Umkehrphasenchromatographie oder Immunoaffinitätschromatographie, durchgeführt werden.
Falls die für das Toxin oder Toxinanalog codierende Nukleotidsequenz in Schritt b) des Verfahrens nicht modifiziert wurde, um in der Expression des entgifteten Toxins oder Toxinanalogs zu resultieren, sollte das Toxin oder Toxinanaolg einer posttranslationalen Modifikation in Schritt f) des Verfahrens unterworfen werden, zum Beispiel durch Wärmebehandlung, Behandlung mit einer Chemikalie wie Formaldehyd, Glutaraldehyd, oder einem geeigneten proteolytischen Enzym, z.B. Trypsin, oder durch Substitution, Addition, Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Aminosäuren im Toxin oder Toxinananlog.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur Immunisierung eines Lebewesens, einschliesslich eines Menschen, gegen durch ein osteolytisches Toxin erzeugende Mikroorganismen verursachte Krankheiten, wobei das Verfahren die Herstellng des Toxins oder Toxinanalogs durch rekombinante DNA-Techniken oder durch Peptidsynthese mit einem immunologisch annehmbaren Träger oder Vehikel, wie die oben aufgeführten, umfasst.
Ein weiterer interessanter Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen nicht-pathogenen Mikroorganismus, der eine für ein immunogenes entgiftetes P. multocida- Toxin oder Toxinanalog codierende inserierte Nukleotidsequenz trägt und fähig ist, diese zu exprimieren, zur Verwendung als Lebendvakzine zur Immunisierung eines Tieres gegen durch ein osteolytisches Toxin erzeugende Mikroorganismen verursachte Krankheiten. Die Anwendung einer Lebendvakzine kann vorteilhaft sein, da es einige Hinweise gibt, dass auf lebenden Organismen basierende Impfstoffe eine ausgezeichnete Immunogenität zeigen, die häufig zu einer lebenslangen Immunität gegen die in Frage kommende Krankheit führt. Lebendvakzine sind auch weniger teuer zu produzieren als solche, die auf einem gereinigten Protein basieren, da kein Reinigungsschritt erforderlich ist.
Um die Expression des Toxins oder Toxinanalogs in entgifteter Form zu gewährleisten, kann die für das Toxin oder Toxinanalog codierende Nukleotidsequenz in geeigneter Weise entweder vor oder nach der Einbringung in den Wirtsmikroorganismus durch Substitution, Addition, Insertion, oder Deletion eines oder mehrerer Nukleotide oder durch Kombination dieser Massnahmen, wie oben erklärt, modifiziert werden.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Lebendvakzine der Erfindung wird die das Toxin oder Toxinanalog codierende Nukleotidsequenz auf der äusseren Oberfläche der Wirtszelle exprimiert. Dies sorgt für eine vorteilhafte Präsentation des(r) Toxinepitops(e), das vom Immunabwehrmechanismus des Tieres, dem die Lebendvakzine verabreicht wurde, erkannt wird, und daher eine entsprechende Immunantwort auslöst. Eine Möglichkeit, die Expression des Toxins oder Toxinanalogs auf der Zelloberfläche auszulösen, besteht darin, die für das Toxin oder Toxinanalog codierende Nukleotidsequenz mit einer anderen, ein Oberflächenprotein oder eine Subsequenz davon (z.B. eine Signalsequenz) codierenden Nukleotidsequenz zu fusionieren, was dazu führt, dass das Toxin oder Toxinanalog auf der äusseren Oberfläche der Wirtszelle, gegebenenfalls als fusioniertes Polypeptid, exprimiert wird. Beispiele nützlicher Oberflächenproteine sind Adhäsine, fimbriale Proteine, z.B. das E. coli K88- oder Typ 1 fimbriale Protein oder das LamB-Protein von E. coli.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Anwendung eines rekombinanten, entgifteten P. multocida-Toxins oder Toxinanalogs zur Herstellung eines Impfstoffes zur Immunisierung eines Tieres, einschliesslich eines Menschen, gegen Krankheiten, die durch ein osteolytisches Toxin produzierende Mikroorganismen verursacht werden. Das zur Immunisierung verwendete Toxin oder Toxinanalog kann durch die in Figur 10 (a) - (j) gezeigte DNA-Sequenz oder eine Modifikation davon, wie oben erklärt, codiert sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenso auf ein Verfahren zur Immunisierung von Lebewesen, einschliesslich Menschen, gegen Krankheiten, die durch ein osteolytisches Toxin produzierende Mikroorganismen verursacht werden, wobei das Verfahren die Verabreichung einer immunogen wirksamen Konzentration eines rekombinanten, entgifteten P. multocida-Toxins oder Toxinanalogs, wie durch die in Figur 10 (a) -(j) dargestellte DNA-Sequenz oder eine Modifikation davon codiert, an ein Tier umfasst. Das Toxin oder Toxinanalog kann intravenös, intramuskulär, subcutan, intraperitoneal, oral oder intranasal verabreicht werden. Es wird in Betracht gezogen, dass eine geeignete Dosierung im Bereich von 0,1 - 500 ug sein wird, abhängig vom Alter und Zustand des in Frage kommenden Tieres, der Art und Weise der Verabreichung und der Immunogenität des Toxins oder Toxinanalogs.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung gegen ein P. multocida-Toxin gezüchtet, das von P. multocida ssp. multocida 45/78 erzeugt wird, welches bei der National Collection of Type Cultures (NCTC), Central Public Health Laboratory, London, England, mit der Zulassungsnummer NCTC 12178, öffentlich zugänglich ist.
In Verbindung mit der Forschung, die zu der vorliegenden Erfindung geführt hat, wurden mehrere verschiedene monoklonale Antikörper gegen das von diesem P. multocida-Stamm erzeugte Toxin hergestellt (siehe unten, Beispiel 1); repräsentative Beispiele dafür sind diejenigen, die von den Hybridoma-Zellen P3F37 und P3F51 erzeugt werden. Proben dieser Zellinien wurden gemäss den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren vom 3. Dezember 1987, in European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Center for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, England, mit den jeweiligen Zulassungsnummern ECACC 87120301 und ECACC 87120302, hinterlegt.
Der monoklonale Antikörper der Erfindung kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte umfasst:
a) Immunisieren eines geeigneten Tieres oder einer Tierzelle mit einem immunogenen P. multocida-Toxin oder -Toxinanalog, um Zellen zu erhalten, die einen Antikörper gegen das Toxin oder Toxinanalog erzeugen,
b) Fusionieren von Zellen, die den Antikörper erzeugen, mit Zellen einer geeigneten Myeloma-Zellinie und Selektionieren und Klonieren der daraus resultierenden Hybridoma-Zellen, die den besagten Antikörper erzeugen oder
c) Immortalisieren einer nichtfusionierten, den besagten Antikörper erzeugenden Zellinie, z.B. durch virale Transformation, gefolgt von
d) Züchten der Zellen von Schritt b) oder c) in einem geeigneten Medium, um besagten Antikörper zu erzeugen und Ernten des Antikörpers aus dem Wachstumsmedium.
Die anfängliche Immunisierung der Tiere im Schritt a) des Verfahrens erfordert eine Aenderung des herkömmlichen, von Köhler und Milstein in Nature 256, 1975, S. 495, beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, da PMT, wenn Mäusen in einer sublethalen Dosierung verabreicht, eine Atrtophie der Milz verursacht, die die Hybridoma-Technik ernstlich erschwert. Die Tiere müssen daher zuerst mit einer entgifteten Toxinpräparation immunisiert werden, da herausgefunden wurde, dass jede nachfolgende Wiederholungsimpfung mit natürlichem Toxin, das vor der Anwendung nicht engiftet werden muss, durchgeführt werden kann. Die Immunisierung kann andererseits gemäss herkömmlicher Verfahren durchgeführt werden, z.B. durch Verabreichung einer Lösung oder Suspension des (entgifteten) Toxins oder Toxinanalogs in einem geeigneten Lösungsmittel wie isotone Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung, die gegebenenfalls ein Adjuvans, wie oben beschrieben, enthält. Für solche Immunisierungzwecke geeignete Tiere sind zum Beispiel Mäuse, Hasen, Ziegen, Schafe, Meerschweinchen, usw. Das Ausbluten der Tiere und die Gewinnung der monoklonalen Antikörper kann gemäss herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden.
Die zur Fusion mit Myeloma-Zellen verwendeten Antikörper erzeugenden Zellen sind vorzugsweise Milz- oder Lymphzellen (z.B. Lymphoblasten, B-Lymphozyten, Plasma-Zellen oder verwandte, aus der Milz, den Lymphknoten oder funktionell verwandten Geweben stammende Zellen). Die Fusion der Antikörper erzeugenden Zellen und Myeloma-Zellen kann im wesentlichen, wie von Köhler und Milstein supra beschrieben, durchgeführt werden, dass heisst, vorzugsweise in Gegenwart eines Fusionspromotors, wie Polyethylenglykol. Ein Verhältnis von etwa 3 Antikörper erzeugenden Zellen pro Myeloma-Zelle wird bevorzugt. Die verwendete Nyeloma-Zellinie gehört vorzugsweise einer Art an, die in selektivem Medium nicht überleben und die Immunglobuline nicht allein erzeugen kann; eine Art von Zellinien, die häufig zur Zellfusion verwendet wird, ist eine solche, der das Enzym Hypoxanthin- Guanin-Phosphoribosyltransferase fehlt und die daher nicht in der Lage ist, in einem Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthaltenden Medium (HAT-Medium) zu wachsen.
Die Auswahl von Hybridoma-Zellen, die einen Antitoxin-Antikörper erzeugen, kann dann durch Züchten nichtfusionierter, Antikörper erzeugender Zellen durchgeführt werden, nichtfusionierte Myeloma-Zellen und vermutlich fusionierte Zellen in einem selektiven Medium (wie HAT), in dem die nichtfusionierten Myeloma-Zellen nicht wachsen können und schliesslich absterben. Die nichtfusionierten Antikörper erzeugenden Zellen können nur eine begrenzte Zeit überleben, nach der sie ebenfalls absterben. Auf der anderen Seite wachsen erfolgreich fusionierte Zellen weiter, da sie die permanenten Wachstumseigenschaften der elterlichen Myeloma-Zellen und die Fähigkeit in dem selektiven Medium zu überleben, von den Antikörper erzeugenden Zellen geerbt haben.
Als Alternative zur Hybridomaherstellung können unsterblich gemachte, nichtfusionierte Antikörper erzeugende Zellen entweder durch Transferieren der für die Erzeugung von Immunglobulin verantwortlichen Gene von einer Hybrydoma- zu einer anderen (lebensfähigeren) Zellinie oder durch virale Transformation wie in Klein et al. (Ref. 16) beschrieben, hergestellt werden.
Die daraus resultierenden Antikörper erzeugenden Zellen (ob Hybridoma- oder nichtfusionierte Zellen) können nach dem Klonieren, z.B. wie unten in Beispiel 1 beschrieben, in einem geeigneten Medium, wie RPMI 1640 in vitro gezüchtet werden. Dies resultiert in der Erzeugung von monklonalan Antikörpern sehr hoher Reinheit, da diese von den Zellen in den Kulturüberstand abgesondert werden. Die Antikörper können durch herkömmliche Verfahren wie Zentrifugation, Filtration, Chromatographie oder einer Kombination dieser Verfahren isoliert werden.
In einem alternativen Verfahren können die monoklonalen Antikörper auch in der Körperhöhle eines Tieres, wie einer Maus, erzeugt werden. In dieser Ausführungsform wird die Antikörper erzeugende Zelle in ein Tier, wie eine Maus, injiziert, in der Bildung eines Ascitestumors, der hohe Konzentrationen des Antikörpers in den Ascites des Tieres abgibt. Obwohl die Tiere auch normale Antikörper erzeugen, werden diese nur einen geringen Prozentsatz der monoklonalen Antikörper ausmachen, die von dem Ascites durch Standardreinigungsverfahren wie Zentrifugation, Filtration, Ausfällung, Chromatographie oder einer Kombination dieser Verfahren gereinigt werden können.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein diagnostisches Mittel, das einen wie oben definierten monoklonalen Antikörper umfasst.
Obwohl in einigen Fällen, zum Beispiel wenn das diagnostische Mittel in einem Agglutinationsassay verwendet wird, in welchem feste Partikel, an die der Antikörper gebunden ist, in Gegenwart eines P. multocida-Toxins in der dem Test unterzogenen Probe agglutinieren, ein Markieren des monoklonalen Antikörpers nicht notwendig ist, wird für die meisten Zwecke bevorzugt, einen Antikörper mit einer Markierung zur Verfügung zu stellen, um den gebundenen Antikörper nachzuweisen. In einem doppelten ("sandwich") Assay, kann mindestens einer der Antikörper mit einer Markierung ausgestattet sein. Substanzen, die in dem vorliegenden Kontext als Markierung verwendbar sind, können aus Enzymen, fluoreszierenden Substanzen, radioaktiven Isotopen und komplexbildenden Mitteln, wie Biotin, gewählt werden.
Beispiele von Enzymen, die als Markierungssubstanzen verwendet werden können, sind Peroxidasen, z.B. Meerettich- Peroxidase, oder Phospatasen, z.B. alkalische Phosphatasen. Als Enzyme sind sie nicht direkt nachweisbar, sie müssen mit einem Substrat kombiniert werden, um ein nachweisbares Reaktionsprodukt zu bilden, das zum Beispiel fluoreszierend oder gefärbt sein kann. Beispiele nützlicher Substrate sind H&sub2;O&sub2;/o-Phenylendiamin, H&sub2;O&sub2;/Azinodiethylbenzthiazolinsulphonsäure und p-Nitrophenylphosphat.
Beispiele für fluoreszierende, zur Markierung nützliche Substanzen sind H&sub2;O&sub2;/p-Hydroxyphenylessigsäure und Methylumbelliferylphosphat. Solche Substanzen können mit Hilfe eines Fluoreszensspektrophotometers auf an sich bekannte Weise nachgewiesen werden.
Beispiele radioaktiver Isotope, die als Markierungssubstanzen verwendbar sind, sind I-125, S-35 und P-32. Die von diesen Isotopen emittierte Radioaktivität kann in einem Gamma- oder Szintillationszähler auf an sich bekannte Weise gemessen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das diagnostische Mittel mindestens einen Antikörper, der kovalent oder nichtkovalent an einen festen Träger gebunden ist. Dieses kann in einem Doppelantikörperassay verwendet werden, in welchem Fall der Antikörper, der an den festen Träger gebunden ist, nicht markiert ist. Der feste Träger kann aus einem Polymer bestehen oder kann eine Matrix umfassen, auf der das Polymer aufgebracht ist. Der feste Träger kann aus einem Kunststoff, z.B. Latex, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Nylon, Polivinylidendifluorid, Cellulose, z.B. Nitrocellulose, und magnetischen Trägerpartikel (z.B. mit Polystyrol überzogene Eisenpartikel) gewählt werden.
Zur Verwendung in einem diagnostischen Assay kann der feste Träger jede zweckmässige Form haben. Es kann daher die Form einer Platte, z.B. einer dünnen Schicht oder, bevorzugt, einer Nikrotiterplatte, eines Streifens, Films, Papiers oder von festen Partikeln, wie Latexkugeln oder dergleichen, haben.
Eher als direkt an an einen festen Träger gebunden zu sein, kann der monoklonale Antikörpern an einen Liganden gebunden sein, der auf einem festen Träger immobilisiert ist. Beispiele von Liganden schliessen Protein A oder einen immunoglobulinspezifischen Antikörper ein.
Es ist zu beachten, dass alle Verfahren oder Anwendungen, die auf intakten monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern basieren, stattdessen durch Verwendung von Fragmenten des monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers, z.B. F(ab')&sub2; oder Fab-Fragmenten, durchgeführt werden könnten.
Zur Verwendung in einem Sandwich-Assay kann das diagnostische Mittel zusätzlich einen polyklonalen Antikörper umfassen. Dieser Antikörper kann markiert und/oder an einen festen Träger gebunden sein, wie oben beschrieben in Verbindung mit dem monoklonalen Antikörper.
Der monoklonale Antikörper der Erfindung kann in einem Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines P. multocida- Toxins oder Toxinanalogs in einer Probe angewendet werden, wobei das Verfahren ein Inkubieren der Probe mit einem monoklonalen Antikörper, wie oben beschrieben, und den Nachweis der Anwesenheit von gebundenem oder ungebundenem Toxin oder Toxinanalog, aus der besagten Inkubation resultierend, umfasst. Der Antikörper kann, wie oben beschrieben, mit einer Markierung ausgestattet sein und/oder kann an einen festen Träger, wie oben an Beispielen erläutert, gebunden sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Probe mit einem ersten monoklonalen Antikörper, der an einen festen Träger gebunden ist, und anschliessend mit einem zweiten monoklonalen oder polyklonalen, mit einer Markierung versehenen Antikörper inkubiert. Ein Beispiel für diese Ausführungsform ist der Sandwich-ELISA- (enzyme linked immunosorbent assay) Assay, der unten in Beipsiel 2 beschrieben ist.
In einer anderen Ausführungsform (einem sogenannten kompetitiven Bindungsassay) kann die Probe mit einem monoklonalen Antikörper, der an einen festen Träger gebunden ist, und gleichzeitig oder anschliessend mit einem markierten P. multocida-Toxin oder -Toxinanalog inkubiert werden, wobei letzteres um Bindungsstellen auf dem Antikörper mit jedem in der Probe vorhandenen Toxin oder Toxinanalog konkurriert.
Die dem vorliegenden Verfahren unterworfene Probe kann jede Probe sein, von der vermutet wird, dass sie ein P. multocida-Toxin oder -Toxinanalog enthält. Die Probe kann daher aus bakteriellen Suspensionen, bakteriellen Extrakten, Kulturüberständen, tierischen Körperflüssigkeiten (z.B. Serum, Kolostrum oder nasalem Schleim) und Zwischen- oder Endprodukten von Impfstoffen gewählt werden.
Ausser der diagnostischen Anwendung der monoklonalen Antikörper der Erfindung wird in Betracht gezogen, die bekannte Fähigkeit gewisser monoklonaner Antikörper, die Aktitivität biologisch aktiver Antigene zu hemmen oder zu blockieren, zu nutzen, durch Inkorporieren des monoklonalen Antikörpers in eine Zusammensetzung zur passiven Immunisierung eines Lebewesens einschliesslich eines Menschen, gegen Krankheiten, die durch ein osteolytisches Toxin erzeugende Mikroorganismen hervorgerufen werden, welche Zusammensetzung einen monoklonalen Antikörper, wie oben beschrieben, und einen geeigneten Träger oder ein geeignetes Vehikel umfasst. Die Zusammensetzung kann durch Vereinen einer wirksamen Menge des Antikörpers oder eines Fragmentes davon mit einem geeigneten Träger oder Vehikel hergestellt werden. Beispiele geeigneter Träger und Vehikel können solche, wie die oben in Verbindung mit dem Impfstoff diskutierten, sein. Die Zusammensetzung kann weiterhin eines der weiter oben genannten Adjuvantien umfassen.
Auf Experimenten mit Mäusen basierend (siehe Beispiel 11, unten), in denen monoklonale Antikörper passive Immunität gegen PMT induzierten, wird daran gedacht, einen PMT-spezifischen Antikörper zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung der atrophen Rhinitis in Schweinen anzuwenden. Er könnte intravenös, subcutan oder intramuskulär, wie auch oral in einer geeigneten geschützten Form oder über intranasale Aerosole verabreicht werden.
Eine weitere Anwendung des monoklonalen Antikörpers der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung eines P. multocida-Toxins oder -Toxinanalogs, wobei das Verfahren ein Adsorbieren eines, besagtes Toxin oder Toxinanalog enthaltenden, biologischen Materials an einen in einer Matrix immobilisierten monoklonalen Antikörper, wie oben beschrieben, Eluieren des besagten Toxins oder Toxinanalogs aus der Matrix und Gewinnen des Toxins oder Toxinanalogs aus dem Eluat umfasst.
Die Matrix kann sich aus jedem gewöhnlich für Affinitätschromatographiezwecke angewendetem Material wie Agarose, Dextran, kontrolliertes poröses Glas, DEAE-Cellulose, die gegebenenfalls durch CNBr, Divinylsulphon, etc. in an sich bekannten Verfahren aktiviert ist, zusammensetzen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein diagnostisches Mittel zum Nachweis von PMT-produzierenden Mikroorganismen, das eine markierte DNA-Sequenz umfasst, die homolog zu der für ein Pasteurella multocida-Toxin oder Toxinanalog kodierenden Sequenz ist. In diesem Zusammenhang soll die Bezeichnung "homolog zu" darauf hinweisen, dass die DNA-Sequenz mindestens eine Desoxyribonukleotideabfolge von mindestens 15 Basen mit 80% Homologie zu einem Teil der gezeigten Sequenz oder zu einem Teil der für ein Toxinanalog kodierenden Sequenz umfasst.
In einem, das diagnostische Agens anwendenden Verfahren, ist die Sonden-DNA markiert und die DNA wird denaturiert um die Stränge sowohl der Sonde als auch der Probe zu trennen; die DNAs werden gemischt und die Stränge werden sich selbst überlassen, um wieder die Doppelhelixstruktur zu bilden, aber im Falle von Homologie wird sich ein Teil der Sonden- DNA mit der Proben-DNA verbunden haben. Dies ist bekannt als Hydisierung und wird zum Beispiel von Southern, 1980 (Ref. 18) beschrieben. Die als Sonde verwendete DNA sollte eine einmalige Nukleotidsequenz von einer bestimmten Länge haben, um als diagnostisches Mittel ausreichend spezifisch zu sein. Die DNA-Sonde kann vorteilhafterweise mit einem radioaktiven Isotop, wie H-3, I-125, S-35 oder P-32, wie z.B. in Rigby et al., 1977 (Ref 19) beschrieben, einem komplexbildendes Mittel wie Biotin [Gebeyechu et al., 1987, (Ref. 20)] oder mit einem Dioxygenin-dUTP entsprechend dem vom Hersteller des Reagens, Boehringer, Mannheim, empfohlenen Verfahren, markiert sein.
In einer besonderen Ausführungsform des Erfindung wird der Nachweis der Anwesenheit von Pasteurella multocida produzierenden Mikroorganismen durch Verwendung von DNA-Sonden in der von Saiki et al., 1985, (Ref.21) beschriebenen Polymerasekettenreaktion durchgeführt. Die Polymerasekettenraktion (PCR) ist ein Verfahren, das zur Vermehrung von in einer Probe vorhandener DNA dient. Das Verfahren schliesst den Gebrauch von zwei Oligonukleotidprimern ein, die das zu vermehrende DNA-Segment flankieren. Die Oligonukleotidprimer können z.B. Regionen des Gens umfassen, das für das Pasteurella multocida-Toxin oder -Toxinanalog codiert und können daher verwendet werden, um das Gen oder Teile davon, die in der Probe vorhanden sind, zu vermehren. Die Oligonukleotidprimer hybridisieren mit entgegengesetzten Strängen der zu amplifizierenden DNA-Sequenz, und die Primer werden durch die Verwendung von DNA-Polymerase verlängert, z.B. dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I oder einer anderen nützlichen DNA-Polymerase wie der Taq-DNA-Polymerase, um eine DNA-Sequenz zu synthetisieren, die komplementär zur DNA-Sequenz ist, an welche die Primer gebunden sind. Im Anschluss an die Synthese dieser komplementären Sequenzen wird die synthetisierte DNA z.B. durch Erhitzen denaturiert, d.h. von ihren Elternsträngen gelöst, und die Elternstränge wie auch die neu synthetisierten DNA- Stränge werden einem weiteren PCR-Vermehrungszyklus unterworfen. Auf diese Weise ist es möglich, eine beträchtliche Vermehrung spezifischer DNA-Sequenzen, die in einer Probe vorhanden sind, zu erreichen. Durch die Anwendung des PCR- Vermehrungsverfahrens kann es möglich sein, ursprünglich sehr kleine und nicht-nachweisbare Mengen von in einer Probe vorhandenen DNA-Sequenzen zu vermehren und dann nachzuweisen.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Antikörpern in einer Probe gegen ein P. multocida-Toxin oder -Toxinanalog; das Verfahren umfasst Inkubieren der Probe mit einem P. multocida-Toxin oder -Toxinanalog und Nachweis des Vorhandenseins von gebundenem, aus der Inkubation resultierendem Antikörper.
Ein diagnostisches Mittel, das in diesem Verfahren verwendete Toxin oder Toxinanalog umfassend, kann andererseits jede der oben beschriebenen Eigenschaften diagnostischer Mittel haben, die den monoklonalen Antikörper umfassen und in ähnlichen Nachweisverfahren angewendet werden, obwohl diese eher gebundenen Antikörper als gebundenes Toxin als solches nachweisen werden. Das diagnostische Mittel kann zum Beispiel als Referenzstandard nützlich sein oder zum Nachweis von Antitoxin-Antikörpern in Körperflüssigkeiten, z.B. Serum, Kolostrum oder nasalem Schleim von Tieren, die dem Toxin oder Toxinanalog ausgesetzt waren.
Noch eine weitere Verwendung des P. multocida-Toxins oder -Toxinanalogs ist die Herstellung eines Toxinreferenzstandards, der als Standard zum Vergleich von qualitativen oder quantitativen analytischen Verfahren nützlich sein kann. In einem qualitativen Verfahren kann das in bekannter Konzentration vorhandene Standardtoxin mit einem monklonalen oder polyklonalen Antikörper, der gegen das Toxin oder Toxinanalog hergestellt wurde, reagieren, wobei eine positive Reaktion die Spezifität der Antikörper aufzeigt. In einem anderen Aspekt wird das Referenzstandardpräparat in einem quantitativen analytischen Verfahren angewendet, wobei verschiedene Konzentrationen des Präparats mit einem monoklonalen und polyklonalen Antikörper umgesetzt wird, um eine Kalibrierungskurve bereitzustellen, die es erlaubt, die genaue Konzentration des Toxins oder Toxinanalogs in einer Probe zu bestimmen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Die Erfindung wird weiterhin im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnungen offenbart, in welchen
Figur 1 ein Diagramm ist, das die Titration von PMT in einem quantitativen Sandwich-ELISA zeigt. Die in dem ELISA erhaltene Absorption bei 492 nm ist gegen die PMT-Konzentration aufgetragen. Die kleinste nachweisbare Konzentration von PMT ist ungefähr 1 ng/ml, was ungefähr 50 pg oder 0,35 fmol entspricht,
Figur 2 ein SDS-PAGE von Fraktionen der in Beispiel 3 beschriebenen Affinitätschromatographie zeigt. Bande A: der auf die Säule aufgetragene Kulturüberstand, Bande O: der Ausfluss aus der Säule, Bande E: das eluierte, gereinigte PMT und Bande M: Marken-Proteine zur Bestimmung des Molekulargewichts,
Figur 3 ist ein Western Blot, der die PMT-Erzeugung von 5 positiven rekombinanten E. coli-Klonen zeigt, die in dem Screening-Verfahren nachgewiesen wurden. Bande 1: SPE 301; Banden 2 und 3: SPE 308; Bande 4: SPE 315; Banden 5 und 6: SPE 312; Bande 7: SPE 311; Bande 8: gereinigtes PMT.
Figur 4 ist eine Restriktionsenzymschittstellenkarte des Plasmids pSPE 308 mit einer Länge von 21,5 kB (Kilobasenpaare). Der schraffierte Bereich markiert die P. multocida- DNA. Der schattierte Bereich markiert das pmt-Gen und der vertikal schraffierte Bereich markiert DNA des Plasmids pUN121.
Figur 5 ist eine Restriktionsenzymschnittstellenkarte des Plasmids pSPE 312 mit einer Länge von 13,8 kB. Der schraffierte Bereich markiert P. multocida-DNA, der schattierte Bereich markiert das pmt-Gen und der vertikal schraffierte Bereich DNA des Plasmids pUN121.
Fig. 6 ist eine Restriktionsenzymschnittstellenkarte des Plasmids, das durch enzymatische Spaltung des Plasmids pSPE 308 entstanden ist. Der schraffierte Bereich markiert P. multocida-DNA, der schattierte Bereich markiert das pmt-Gen und der vertikal schraffierte Bereich DNA des Plasmids pUN121.
Figur 7 ist eine Restriktionsenzymschnittstellenkarte des Plasmids, das durch enzymatische Spaltung des Plasmids pSPE 312 entstanden ist. Der schraffierte Bereich markiert P. multocida-DNA, der schattierte Bereich markiert das pmt-Gen und der vertikal schraffierte Bereich DNA des Plasmids pUN121.
Figur 8 ist ein Western Blot, der die PMT-Erzeugung durch Derivate der Plasmide pSPE 308 und pSPE312 zeigt. Bande 1: gereinigtes PMT; Bande 2: pSPE 350; Bande 3: pSPE 349; Bande 4: pSPE 341; Bande 5: pSPE 345; Bande 6: pSPE 312; Banden 7 und 8: gereinigtes PMT. Plasmid pSPE 349 ist identisch mit dem in Figur 7 gezeigten Plasmid pSPE 347.
Figur 9 ist eine Restriktionsenzymschnittstellenkarte des pmt-Gens. Die schattierten Bereiche bezeichnen das pmt-Gen, die vertikal schraffierten Bereiche bezeichnen einen möglichen Promotor und die schraffierten Bereiche bezeichnen einen möglichen Terminator.
Figur 10 (a) - (j) zeigt die DNA-Sequenz der pmt-Genregion und die davon abgeleitete Aminosäurensequenz. Die Aminosäuren werden durch den Einzelbuchstabencode, entsprechend dem konventionellen Gebrauch identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass die Aminosäurensequenz an Position 213 oder 219 beginnt.
Figur 11 ist eine Restriktionsenzymschnittstellenkarte des Plasmids pSPE 525 mit einer Länge von 7,7 kB. Der schraffierte Bereich markiert P. multocida-DNA, der schattierte Bereich markiert das pmt-Gen, der vertikal schraffierte Bereich markiert pUN121-DNA.
Figur 12 ist eine Restriktionsenzymschnittstellenkarte des Expressionsvektor pSPE 481 mit einer Länge von 8,25 kB. Die schraffierten (zur rechten Seite hin) Bereiche bezeichnen P. multocida DNA, die schattierten Bereiche bezeichnen das pmt-Gen, die schraffierten Bereiche (zur linken Seite hin) bezeichnen λPL DNA, die gekreuzt schraffierten Bereiche bezeichnen das amp-Gen und die vertikal schraffierten Bereiche markieren den Replikationsursprung (origin of replication).
Figur 13 ist eine Restriktionsenzymschnittstellenkarte der für das toxA codierenden Region. Die Ausdehnung der auf jedem der Derivatplasmide (pSPE A-R) vorhandenen codierenden Region wird durch Balken angezeigt (A-R). Schraffierte Balken: codierende Regionen im korrekten Leserahmen; offene Balken: codierende Regionen ausserhalb des Leserahmens des 5'-Teils der codierenden Region.
Figur 14 ist ein Western Blot, der die Erkennung durch ein Maus-anti-PMT-Antiserum von PMT-Derivaten zeigt, die von den Plasmiden pSPE A-L erzeugt wurden. Banden 7, 13, 14 und 15: verschiedene, das vollständige pmt-Gen enthaltende Stämme; Bande 1: Derivat A; Bande 2: Derivat I; Bande 3: Derivat B; Bande 4: Derivat J; Bande 5: Derivat L; Banden 6 und 9: Derivat E; Bande 8: Derivat C; Bande 10: Derivat G; Bande 11: Derivat H; Bande 12: Derivat D. Ungefähre Grössen (in Kilodalton) der vorherrschenden Derivate und Abbauprodukte sind angegeben.
Figur 15 ist ein Diagramm, das die Verteilung der relativen Adsorptionen (A/A&sub0;) in einem PMT-ELISA von Extrakten nichtcytopathischer (schraffierte Balken) und cytopathischer (schwarze Balken) Feldisolate von P. multocida, 1:1 i.n PBS- T-BSA verdünnt, zeigt.
Figur 16 ist ein Diagramm, das die mittlere ± SD der relativen Absorption (A/A&sub0;) der Verdünnungen von Extrakten cytopathischer (schwarze Quadrate) und nichtcytopathischer (offene Quadrate) Feldisolate von P. multocida zeigt.
Figur 17 ist ein Diagramm, das die Gegenwart von anti-PMT- Antikörpern in Serumproben von anti-PMT-Antikörper-negativen, infizierten und geimpften Schweinen zeigt, die durch einen kompetitiven ELISA nachgewiesen wurden. Das Diagramm zeigt die 50% Blockierungstiter bei einer Absorption von 492 nm. negativ infiziert geimpft.
Figur 18 zeigt die Koloniehybridisierung von P. multocida- Isolaten, wobei 17 toxinpositive und 18 toxinnegative, durch ELISA und EBL-Tests auf die Gegenwart des pmt-Gens getestete Stämme nachgewiesen wurden.
Figur 19 zeigt den Nachweis von Toxinaktivitäten in zellfreien, ultraschallbehandelten Lösungen rekombinanter E. coli-Klone. E. coli-Stamm MT102 mit PUN121 zeigte in einer 1/25-Verdünnung in PBS keine cytopathische Wirkung auf EBL- Zellen (a). Ultraschallbehandelte Lösungen von E. coli SPE312 (b) und toxische P. multocida (NCTC 12178) (c) 1/3125 verdünnt zeigten signifikante und Identische Effekte (80-fache Vergrösserung).
Figur 21 zeigt die das pmt-Gen-flankierende (schwarzer Bereich) P. multocida-DNA. Die Ausdehnung der Insertion der Plasmide pSPE308, pSPE312, pSPE344, pLOAO3 und pLOBO3 sind angezeigt. Die in der Sonde enthaltene DNA, die zum Hybridisieren verwendet wurde (schräg schraffierte Bereiche), und die Segmente, die die zwei homologen Sequenzen enthalten (vertikal schraffierte Bereiche), sind gezeigt.
Figur 2l zeigt einen Southern Blot von restriktionsenzymverdauter P. multocida-DNA. Sonde: 2,4 kB BgIII-EcoRI-Fragment von pLOBO3. Banden 10* - 14* sind eine Kurzzeitaussetzung der Banden 10 - 14.
Banden 1-4: Toxische P. multocida 45/78. Banden 5 - 9: Nichttoxische P. multocida MH81P8. Bande 10: pSPE308. Bande 11: pLOAO3. Bande 12: pLOAO2. Bande 13: pSPE312. Bande 14: pLOBO3.
Verwendete Restriktionsenzyme: HindIII: Banden 1, 5, 10, 11, 12 und 13.
EcoRI: Banden 2, 6 und 14.
BglII: Banden 3 und 7.
PvuII: Banden 4 und 8.
PstI: Bande 9.
Figur 22 zeigt einen Dot Blot von 24 verschiedenen P. multocida Bakteriophagen-Genomen. Sonde: pLOAO3. Die Sonde hybridisiert nicht mit B2 und C5. A7: pSPE308; B7: pSPE312, C/: pLOAO* und D7: pLOBO3 sind positive Kontrollen.

BEISPIEL 1

Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen ein P. multocida-Toxin

Immunisierung

P. multocida-Toxin (PMT) wurde, wie von Foged et al., (Ref. 6) beschrieben, gereinigt, d. h. durch 50% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Niederschlag eines zellfreien Extrakts des toxischen Typ D- Stammes von P. multocida ssp. multocida 45/78 (Ref. 3, 22), gefolgt von DEAE-Sephacel -Chromatographie und präparativer Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) auf an sich bekannte Weise.
Eine Suspension des wie oben beschriebenen und ungefähr 25 ug PMT enthaltenden (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Niederschlags wurde durch einstündige Inkubation mit 0,37% Formaldehyd bei 37ºC entgiftet. Weibliche BALB/c-Mäuse (8-12 Wochen alt) wurden subcutan an den Tagen 0 und 14 mit 300 ul einer 1:1-Lösung des unbearbeiteten Präparats des entgifteten P. multocida- Toxins und Freund'schem unvollständigem Adjuvans (Tag 0) oder PBS (Tag 14) immunisiert. An den Tagen 30 und 45 wurde 1 ug des natürlichen PMT in 200 ul PBS subcutan injiziert und am Tag 60 wurden die Mäuse intravenös mit 0,5 ug PMT in 100 ul PBS als Wiederholungsimpfung behandelt. Drei Tage nach der Wiederholungsimpfung wurden die Mäuse getötet und die Milz zur Fusion entnommen.

Herstellung der Hybridoma-Zellinien und monoklonaler Antikörper

Gemäss dem von Fazetas et al. (Ref. 23) und Gebeychu et al. (Ref. 20) beschriebenen Verfahren wurden die Milzzellen und P3-X63-Ag8.653-Myelomazellen mit Hilfe von 50% PEG 4000 GK (Merck) fusioniert und die resultierenden Hybridomazellen wurden selektiv in mit Hypoxanthin/Aminopterin/Thymin (HAT) ergänztem, 15% fetales Kälberserum (FCS) und 4% endothelialen Zellüberstand enthaltenden RPMI 1640-Medium gezüchtet (Costar, Niederlande).
Hybridoma-Zellinien wurden durch Analysieren ihrer jeweiligen monoklonalen Antikörper durch ELISA und Immunblotting ausgewählt.

ELISA zum Nachweis und zur Titrierung von monoklonalen Antikörpern

Mikrotiterplatten (Platte II mit 96-Vertiefungen, NUNC, Dänemark) wurden mit 50 ul/Vertiefung einer 0,75 ug/ml-Lösung gereinigtem PMT in PBS 16 Stunden bei 4ºC und 1 Stunde bei 20ºC überzogen. Die Vertiefungen wurden geleert und mit 200 ul PBS-T-BSA (PBS, 0,05% (V/V) Tween 20 und 1% Rinderserumalbumin enthaltend) 1 Stunde bei 20ºC blockiert und dann 3 mal mit PBS-T gewaschen. Fünfzig ul/Vertiefung des Hybridomakulturüberstandes wurde 1 Stunde bei 20ºC aufgetragen und die Platten wurden dann wie oben beschrieben gewaschen. Die anti-PMT-Antikörperaktivität wurde kolorimetrisch nach 1-stündiger Inkubation bei 20ºC mit 50 ul/Vertiefung eines mit Meerettich-Peroxidase konjugiertem Schaf-anti-Mausimmunoglobulin (Amersham International, U.K.) in einer 1:1,500 Verdünnung in PBS-T-BSA gemessen und (nach 3-maligem weiteren Waschen mit PBS-T, wie oben beschrieben) mit 50 ul einer o-Phenylendiamin(OPD)-H&sub2;O&sub2;-Substratlösung inkubiert. Die Reaktion wurde mit 150 ul 2 M H&sub2;SO&sub4; nach 5 Minuten gestoppt und die Absorption in einem Kontron SLT-210-Photometer (SLT-Labor-Instrumente, Zürich, Schweiz) bei 492 nm (Ref. 620 nm) gemessen.
Die mittlere Absorption der Sättigungsstufe der Titrationskurve P. multocida-Toxin (Asat) und die mittlere Konzentration des MAb, der in 50% der Asat (C50%) resultierte, wurde, wie oben beschrieben, durch ELISA bestimmt, ausser dass Serienverdünnungen des mit Protein-A gereinigten MAb in PBS-T-BSA verwendet wurden. Alle Ergebnisse basieren mindestens auf Doppelbestimmungen.

Immunoblotting

Um die Spezifität der monoklonalen Antikörper zu bestimmen, wurden die in dem unbearbeiteten zellfreien Extrakt aus P. multocida 45/78 enthaltenen Proteine vor der Uebertragung auf Nitrocellulosemembranen und immunologischem Nachweis durch SDS-PAGE getrennt. Polyacrylamidgele (Gesamt- Acrylamidgehalt: 10 %, relativer Gehalt an bis-Acrylamid: 3 %) und ein Elektrophorese-Puffer wurden gemäss Laemmli (Ref. 24) hergestellt. Die Elektrophorese wurde vertikal 16 Stunden bei 10ºC bei konstanter Spannung von 60 V oder 4 Stunden bei 250 Volt durchgeführt. Proteinbanden auf dem Gel wurden entweder durch Silberfärbung mit einer Nachweisgrenze von weniger als 1 ng Protein pro Bande (8) sichtbar gemacht oder auf eine Nitrocellulosemembran (0,45 um) unter Verwendung eines halbtrockenen Elektroblotters [Ancos, Olstykke, Dänemark (9)] transferiert. Das Protein auf der Nitrozellulosemembran wurde entweder durch ein kolloidales Gold-Silber-Vertärker-Färbeverfahren (Nachweisgrenze: ungefähr 0,5 ng Protein pro Bande) (Ref. 25) oder immunologisch durch ein zuvor von Bjerrum et al. beschriebenes Verfahren (Ref. 26) nachgewiesen. Eine positive Reaktion beim Immunoblotting wurde als + oder (+) bezeichnet, wenn eine starke oder (schwache) Färbung der PMT-Bande, jedoch kein anderes Protein, beobachtet wurde.
Färbung anderer Banden oder keine Reaktion wurde als - bezeichnet.
Das Molekulargewicht von PMT wurde durch einen Vergleich mit bekannten Markern geschätzt: Ovalbumin (43,0 kD, BSA (66,3 kD). Phosphorylase B (97,4 kD), β-Galactosidase (116,2 kD), RNA-Polymerase β (150,6 kD) und β' (155,2 kD) und Myosin (ungefähr 200 kD).

ELISA zur Bestimmung der Epitopspezifität

Die Schätzung von offensichtlicher Epitopspezifität der anti-PMT-MAbs wurde durch kompetitiven ELISA, ähnlich dem von Anderson et al. (Ref. 27) beschriebenen Verfahren, durchgeführt. Mikrotiterplatten wurden mit PMT überzogen und, wie oben beschrieben, blockiert. Fünfzig ul des kompetitiven MAb auf 10 ug/ml in PBS-T-BSA verdünnt, wurden zugegeben und 1 Stunde bei 20ºC inkubiert. Ohne die Vertiefungen auszusaugen, wurden 25 ul biotinylierter monoklonaler Antikörper zugegeben und 20 Minuten bei 20ºC inkubiert. Nach dem Waschen wurden 50 ul einer 1: 2'500-Verdünnung von mit Meerettich-Peroxidase konjugiertem Avidin (Kem-En-Tec, Dänemark) zugegeben und die Platten 45 Minuten bei 20ºC inkubiert. Das Substrat, die Reaktionszeit und Bestimmung der Absorption entsprachen der obengenannten Beschreibung.
Der biotinylierte MAb wurde als Arbeitsverdünnung, in ungefähr 75% der Absorption der Sättigungsstufe aus der Titrationskurve resultierend, verwendet. Diese Kurve wurde durch Verwendung eines Lösungsmittels anstelle des konkurrierenden MAb und Serienverdünnungen des biotinylierten MAbs aufgestellt. Das Ausmass der Blockierung durch einen konkurrierenden MAb wurde gemäss der Formel (1-A/A&sub0;) x 100 % berechnet, worin A der Durchschnitt der Absorption von drei Vertiefungen mit dem konkurrierenden MAb darstellt, und A&sub0; der Durchschnitt der Absorption von 8, das Lösungsmittel anstatt den konkurrierenden MAb enthaltenden Vertiefungen ist. Die Daten von 10 repräsentativen monoklonalen Antikörpern (MAb), alle zu der IgG&sub1;-Subklasse gehörend, aus 92 ELISA-positiven Ueberständen, sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt. TABELLE 1 Kennzeichnung von 10 representativen MAbs Hybridoma Gruppe Nr. Repräsentative MAb Asat Immunoblotten a) Asat ist die mittlere Absorption bei 492 nm bei der Sättigungsstufe in der ELISA-Titration. TABELLE 2 Ausmass des Blockierens durch 10 repräsentative MAb in dem kompetitiven ELISA Biotinylierter Nachweis-MAb (% Abnahme in A&sub0;a) Konkurrierende MAb (Hybridoma Gruppe Nr.) a) A&sub0; ist die mittlere Absorption der Verdünnungslösung anstelle des konkurrierenden MAb. b) Kein Blockieren (zwischen 12 % Anstieg und 9 % Abfall in A&sub0;). c) Die nahverwandten Hybridoma-Gruppen 6, 7 und 8 wurden durch einen zweiseitigen kompetitiven ELISA, der einen fangenden MAb verwendete (das Verfahren wird nicht beschrieben), voneinander unterschieden. Die Ergebnisse zeigten, dass Gruppe 6 mit Gruppe 3 und 4 verwandt ist, Gruppe 7 mit keiner anderen Gruppe und Gruppe 8 mit Gruppe 1.
Die ausgewählten Hybridomazellinien wurden dann bis zur Stabilität kloniert. Die resultierenden Klone wurden dann in "Zellfabriken" (Nunc, Dänemmark) bei 37ºC in mit 10% FCS ergänztem RPMI 1640-Medium gezüchtet und es wurden auch 5 x 10&sup6; Zellen/Maus in Balb/c-Mäuse Injiziert, was nach einer bestimmten Inkubationszeit zur Bildung eines Tumors im Peritoneum der Maus führt, welcher grosse Mengen von Antikörpern in den Ascites (ungefähr 5-10 ml, die 5-25 mg/ml enthalten) entlässt.
Die Hybridomazellkulturüberstände wurden auf eine Protein A-Agarosesäule (Kem-En-Tec, Dänemark) gegeben. Gebundene Antikörper wurden mit 0,05 M Essigsäure, pH 4 oder 0,03 M Zitronensäure, pH 3,0 eluiert und sofort mit einem geeigneten Puffer neutralisiert. Die gereinigten Antikörper wurden, wie von Guesdon et al., 1979 (Ref. 28) beschrieben, biotinyliert.
Zwei Hybridomazellinien, P3F37 und P3F51, die in Tabelle 1 als MAb erzeugend gezeigt werden, wurden am 3. Dezember 1987 in der European Collection of Cell Cultures, Center for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, U.K. mit den jeweiligen Ordnungssnummern ECACC 87120301 und ECACC 87120302 hinterlegt.

BEISPIEL 2

Quantifizierung des PMT

Quantifizierung des PMT wurde durch ein Sandwich-ELISA-Verfahren durchgeführt. Der Sandwich-ELISA wurde durch Ueberziehen einer jeden Vertiefung einer Mikrotiterplatte (Immunoplatte II mit 96 Vertiefungen, Nunc, Dänemark) mit 50 ul einer 2 ug/ml-Verdünnung des anti-PMT-MAb P3F51 (in Beispiel 1 hergestellt) in 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,6, 16 Stunden bei 4ºC und 1 Stunde bei 20ºC initiiert. Jede Vertiefung wurde 1 Stunde mit 200 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 0,05 % Tween 20 und 1 % Rinderserumalbumin (PBS-T-BSA) enthielt, inkubiert. Die Platten konnten mindestens 6 Monate aufbewahrt werden, indem 20 ul/Vertiefung PBS-Sorbit zugegeben wurde und die Vertiefungen mit Klebestreifen versiegelt wurden. Die Analyse wurde durch zwei PBS-T-Spülungen, gefolgt von einer Inkubation mit 50 ul/Vertiefung der Lösungen, von denen angenommen wurde, PMT zu erhalten, initiiert. Die Lösungen wurden entsprechend mit PBS-T-BSA verdünnt und 1 Stunde bei 20ºC inkubiert. Nach 3 PBS-T-Spülungen wurde jede Vertiefung mit 50 ul einer 0,5 ug/ml mit Biotin konjugiertem MAb, P3F37, 1 Stunde bei 20ºC inkubiert, gefolgt von drei weiteren Spülungen mit PBS-T und 45-minütiger Inkubation mit 50 ul/Vertiefung einer 1:2500-Verdünnung mit Meerettich-Peroxidase konjugiertem Avidin (Kem-En-Tec, Dänemark) bei 20ºC. Zuletzt wurden 50 ul/Vertiefung einer o-Phenylendiamin/H&sub2;O&sub2;- Lösung zugegeben. Die Reaktion wurde mit 2 M H&sub2;SO&sub4; nach 5 Minuten gestoppt und die Absorption in einem Kontron SLT- 210 Photometer (SLT, Labinstr., Zürich, Switzerland) bei 492 nm (Ref. 620 nm) gemessen.
Die Kalibrierung wurde mit einer PMT-Präparation, die durch Aminosäurenanalyse quantitativ bestimmt wurde (Ref. 6), durchgeführt und alle quantitativen Daten waren Mittelwerte von mindestens zwei Bestimmungen.
Unter Verwendung eines Sandwich-ELISA mit dem MAb P3F51 als fangendem Antikörper und biotinyliertem MAb P3F37 als nachweisendem Antikörper, war es möglich, weniger als 50 pg PMT in einer 50 ul Probe nachzuweisen. PMT in einer Konzentration von 1 ng/ml resultierte in einem A&sub4;&sub9;&sub2; von ungefähr 0,1, was mehr als der 8-fachen Hintergrundabsorption entspricht (siehe Fig.1).

BEISPIEL 3

Affinitätsreinigung von PMT

Ungefähr 100 mg des mit Protein-A-gereinigten MAb P3F51, das wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurde, wurde an 40 ml Divinylsulfon-Agarose (Mini-Leak, Kem-En-Tec, Dänemark), wie vom Hersteller beschrieben, gebunden und auf eine Säule (2,5 x 10 cm) geladen. Der durch die Züchtung des toxischen Typ D Stammes P. multocida 45/78 erhaltene Ueberstand wurde zentrifugiert (12'000 x g, 30 Minuten bei 4ºC), filtriert (Gelman, 0,45 um), mit 1/10 Volumen 1 M Tris-HCl, pH 7,7 gemischt, und NaCl wurde bis zu einer Konzentration von 0,5 M vor dem Auftragen auf die Affinitätssäule zugegeben. Wiederholte Spülungen vor der Elution der Säule wurden mit einem 0,1 M Tris-HCl-Puffer, der zunächst 1 % Triton X-100, dann 1,5 M NaCl und schliesslich 0,1 M NaCl enthielt, durchgeführt. Alle Spülpuffer enthielten 0,1% Natriumazid und hatten einen pH von 7,8. Das PMT wurde mit Glycin-HCl, pH 2,8, eluiert und sofort mit 1 M K&sub2;HPO&sub4;, pH 9,0, neutralisiert.
Das Vorhandensein von PMT in dem auf die Affinitätssäule aufgetragenen Kulturüberstand wurde durch die ungefähr 143 kD grosse Proteinbande, im SDS-PAGE (Fig. 2) zu sehen, nachgewiesen. Das Färbemuster der Proteine des durch die Säule gegebenen Materials (d.h. der Durchfluss) war identisch mit dem Muster, das vor dem Auftragen zu sehen war, mit Ausnahme der 143 kD-Bande, die auf der Säule zurückblieb. Folglich ist die ungefähr 143 kD grosse Proteinbande die einzig sichtbare Färbung, wenn die Proteinzusammensetzung des eluierten Materials mit SDA-PAGE sichtbar gemacht wird.
Ungefähr 2,67 mg von 3,41 mg des auf die Säule aufgetragenen PMT wurde in einem Endvolumen von 8 ml eluiert, was in einer 78 %igen Ausbeute durch Affinitätschromatographie resultiert (Tabelle 3). Nahezu die kompletten übrigen 22% des aufgetragenen PMT wurden in Fraktionen mit PMT-Konzentrationen unter 50 ug/ml eluiert.
Die spezifische Reinheit (ug PMT/mg Protein) war 284 mal höher in dem eluierten Material als in dem Kulturüberstand (Tabelle 3).
Die durchschnittliche minimale dermonekrotische Dosis des affinitätsgereinigten PMT in Meerschweinchen nach intradermaler Injektion und die durchschnittliche MCD von PMT für embryonische Rinderlungenzellen (EBL) in dem standardisierten EBL-Zelltest (Ref. 29) betrug jeweils ungefähr 35 ng und 30 pg. Die LD&sub5;&sub0; von PMT in BALB/c-Mäusen betrug 20 bis 40 ng (ungefähr 1,5 Pg/kg entsprechend) und in Wistar-Ratten ungefähr 100 ng (0,5 ug/kg entsprechend), intraperitoneal in einer einzigen Dosierung verabreicht. TABELLE 3 Reingung von PMT durch Affinitätschromatographie Vol. (ml) Protein (mg) Reinigungsfaktor Rückgew. von PMT, % Verwendeter Kulturüberstand von P.multocida 45/78 Durchfluss der Affinitätssäule Eluiertes Material a) N.B. nicht bestimmt b) Geschätzt aufgrund der Annahme der Reinheit des PMT in dem eluierten Material.

BEISPIEL 4

Herstellung einer P. multocida Genbibliothek in Escherichia coli

Donorstamm

P. multocida-Stamm 45/78. Der Stamm produziert ein dermonekrotisches Toxin, wie von Foged et al (Ref. 6) beschrieben.

Empfängerstamm

Escherichia coli K-12 Stamm MT102. Genotyp: thi, araD139, (araleu) 7697, lac X74, galU, rpsL, hsdR. Dieser Stamm wurde (von Mogens Trier Hansen, Novo Industri A/S, Dänemark) wie folgt konstruiert: Selektion auf Tetracyclinresistenz: Suche nach deo-Selektion auf deo+ Suche nach Tetracyclinsensibilität und r-P1-Umformung, Donor: Liste der Escherichia coli-Stämme (alle Stämme sind K12- Stämme) STAMM GENOTYP REFERENZ ODER QUELLE a) Casaban und Cohen, 1980, (Ref. 30). b) Von Bente Mygind, Laboratoriet for Biologisk Kemi B, Universtät Kopenhagen, Dänemark. c) Konstruiert von Mogens Trier Hansen, wie oben gezeigt. d) Wood, 1966 (Ref. 31).

Medien

P. multocida wurde in tryptischem Soja-Bouillon, von DIFCO erhältlich, gezüchtet. E. coli wurde in LB-Medium gezüchtet (Ref. 27).
Restriktionsenzyme und T4-Ligase wurden von New England Biolabs erhalten und wie vom Hersteller empfohlen angewendet.

DNA-Extraktion

Um chromosomale DNA von einen P. multocida-Stamm 45/78 zu isolieren, wurden Zellen einer stationären 250 ml- Übernachtkultur in 10 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mN EDTA resuspendiert und 20 Minuten mit 25 mg Lysozym bei 37ºC inkubiert. 2 ml einer 10% (G/V) SDS-Lösung wurden zu der Mischung gegeben, die gemischt und 10 Minuten auf Eis gestellt wurde. Zu der Lösung wurden dann 15 ml mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) gesättigtem Phenol gegeben, wonach die Lösung auf 65ºC erhitzt, vorsichtig gemischt und in Eis gekühlt wurde. Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 4000 x g wurde die wässrige Phase mit Äther extrahiert und mit Äthanol gefällt und das Pellet in 1 ml TE-Puffer resuspendiert. Die DNA wurde weiter durch Niederschlagen in einem CsCl-Dichtegradienten (Ref. 27) gereinigt. Nach der Reinigung wurde die DNA in 1 ml TE-Puffer resuspendiert.

Herstellung klonierbarer DNA-Fragmente

9 - 22 Kilobasenpaare (kb) grosse DNA-Fragmente mit 5' GATC-Überhängen wurden, wie folgt, hergestellt. Chromosomale DNA, wie oben beschrieben hergestellt, wurde teilweise durch Inkubation mit der Restriktionsendonuklease Sau3A verdaut. Bei bestimmten Intervallen nach dem Start der Restriktion, wurden Fraktionen des Inkubationsansatzes mit 1/20 Volumen 0,25 M EDTA gestoppt. Eine Probe von jeder Fraktion wurde in einem 1%-Agarosegel in TAE-Puffer, wie in Ref. 27 beschrieben, analysiert und eine Fraktion, die 4 - 22 kb-Fragmente enthielt, wurde identifiziert. Diese Fraktion wurde weiterhin in einem 8 ml Sacharose-Gradienten (40 -10%) durch Schichten der DNA auf den Gradienten vor der Ultrazentrifugation bei 41'000 UpM während 7,5 Stunden fraktioniert. 0,5 ml Subfraktionen wurden extrahiert, mit 1 Volumen TE-Puffer verdünnt, mit Äthanol gefällt und in TE- Puffer resuspendiert. Zwei dieser Fraktionen, jeweils 9 - 16 und 15 - 22 kb-Fragmente enthaltend, wurden für die folgenden Klonierungsschritte verwendet.

Klonierungsverfahren

9 - 16 kb und 15 - 22 kb DNA-Fragmente mit 5'GATC-Überhängen wurden mit BclI verdautem pUN121 (Ref. 27 und 19) mit Hilfe von T4-DNA-Ligase ligiert. Insertion der DNA in die einzige BclI-Stelle dieses Vektors führt zu Inaktivierung des cI-Gens, das den lambda cI-Repressor codiert, welcher im folgenden unfähig ist, die Transkription des Plasmid-codierten PL-Promotors in das Tetracyclinresistenzgen zu unterdrücken. Die resultierenden Plasmide wurden in kompetente E.coli MT 102-Zellen transformiert, wie in Ref. 27 beschrieben. Positive Selektion von Klonen mit plasmid-Insertionen wird durch Zugabe von Tetracyclin zu dem Medium (10 ug/ml) erreicht. Standardtransformationstechniken anwendend (Ref. 27), konnten 3332 Teracyclin-resistente rekombinante E. coli-Klone erhalten werden, 100% von diesen enthielten Insertionen und bildeten somit eine P. multcida- Stamm 45/78-Genbibliothek in E. coli. Kolonien der E. coli- Klone wurden auf 10 ug/ml Tetracyclin enthaltenden LB-Platten gezüchtet. Ein Teil einer jeden dieser Kolonien wurde bei -80ºC in einer 20%igen Glycerin-Lösung aufbewahrt.

BEISPIEL 5

Identifizierung von P. multocida-produzierenden E. coli- Klonen

Screening-Verfahren

Die Genbibliothek wurde durch Anwenden des Kolonie-Blotting-Verfahrens untersucht, um Kolonien auf Nitrocellulose zu übertragen (Ref. 14).
PMT-produzierende Klone wurden dann durch Inkubation der Nitrocellulosefilter wie folgt nachgewiesen: A) 15 Minuten in 50 mM Tris, pH 9,6, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween-20 (Waschpuffer) und 2 ul/ml DNaseI, B) 2 x 10 Minuten in Waschpuffer ohne DNaseI, C) 30 Minuten in Waschpuffer und 3% Gelatine und erhitzt, D) 2 x 10 Minuten in Waschpuffer mit 1% Tritin X-100, E) 60 Minuten in einer 10-fachen Verdünnung in Waschpuffer eines zuvor beschriebenen Hybridomaüberstands P3F51, F) 3 x 5 Minuten in Waschpuffer, G) 60 Minuten in Waschpuffer mit Meerettichperoxidase-gebundenen anti-Maus Ig- ganzen Antikörpern von Amersham (NA.931) 1:1000 verdünnt, H) 3 x 5 Minuten in Waschpuffer, I) 1 Minute in 10 mM NA&sub2;HPO&sub4;, 10 mM Zitronensäure, pH 5,0 (C/P-Puffer) und J) ungefähr 5 Minuten in einer Färbelösung bestehend aus 80 mM Dioctylnatriumsulfosuccinat (DONS), 24 mg 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin, 10 ml Äthanol, 30 ml C/P-Puffer und 20 ul H&sub2;O&sub2;, die unmittelbar vor Gebrauch gemischt wurde. Die Enzymreaktion wurde durch Inkubation in 100 mg DONS in 12,5 ml Äthanol und 37,5 ml H&sub2;O beendet.
Die folgenden Klone wurden mit Hilfe dieses Verfahrens als positiv identifiziert: SPE 301, 308, 311, 312 und 315.

Western Blot

Die in dem Screening-Verfahren erhaltenen positiven Klone wurden unter Anwendung der Western Blot-Technik weiter analysiert (Ref. 32).
Für das Western Blot-Verfahren wurde 1 ml einer Übernachtkultur pelletiert (5 Minuten bei 6000 x g) und in 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 3% SDS, 15% Glyzerin, 5% Mercaptoäthanol und Bromphenolblau, resuspendiert. Die Proben wurden 5 Minuten vor dem Aufladen auf ein Gel gekocht. Proteine wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (11) getrennt, wobei das Trenngel aus 7% (G/V) Acrylamid (Acrylamid-Bisacrylamid-Verhältnis von 40:1) in 0,4 M Tris, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,05% Glyzerin bestand.
Die nachfolgende Übertragung auf Nitrozellulosefilter wurde in einem halbtrockenen Elektroblotter, wie von Kyhse-Andersen (25) beschrieben, durchgeführt. Weitere Behandlung der Filter erfolgte, wie oben in dem Screening-Verfahren beschrieben.
Die Ergebnisse erscheinen in Figur 3, die ein Western Blot der 5 positiven Klone zeigt.
Von den transformierten Stämmen SPE 308 (Banden 2 und 3) und SPE 312 (Banden 5 und 6), jeweils die Plasmide pSPE 308 und pSPE 312 beherbergend, konnte gezeigt werden, dass sie PMT produzieren, während für SPE 302, SPE 315 und SPE 311 gezeigt werden konnte, dass dies nicht der Fall war. Gereinigtes PMT (Bande 8) wurde als Kontrolle verwendet. Das von SPE 308 und SPE 312 produzierte rekombinante Toxin zeigte die gleichen Eigenschaften bezüglich der Erkennung in dem, in Beispiel 1 beschriebenen, kompetitiven ELISA, wie das natürliche Protein; die Grösse und die toxische Aktivität in dem EBL-Test (ref. 29) waren unverändert.

BEISPIEL 6

Restriktionskartierung und Lokalisation des PMT-Gens

Die Plasmide pSPE 308 und pSPE 312 wurden bezüglich Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme (Restriktionsstellen) analysiert, wobei die Restriktionsstellen der meisten bekannten Enzyme mit einer Erkennungssequenz von 6 Basenpaaren (bp) getestet wurden. Die Ergebnisse sind in Figur 4 (pSPE 308) und Figur 5 (pSPE 312) dargestellt. Es erscheint aus den Abbildungen, dass die zwei Plasmide eine ungefähr 6 kb grosse Überlappung aufweisen (von Position 11'000 bis 17'000 in pSPE 308). Das pmt-Gen befindet sich daher innerhalb dieses Bereiches.
Bei der Konstruktion von Endpunktdeletionen in den überlappenden Bereichen in pSPE 308 und pSPE 312, wurde eine Anzahl von Plasmiden, die pSPE 308-Derivate pSPE 336, pSPE 341, pSPE 344 und pSPE 350 wie auch die pSPE 312-Derivate pSPE 338, pSPE 343, pSPE 345, pSPE 347/349 und pSPE 525 konstruiert. Die Ausmasse der resultierenden Plasmide sind in den Figuren 6 und 7 gezeigt.
Diese Plasmide wurden in den E.coli-Stamm MT 102 transformiert und auf die Produktion von PMT hin durch Western Blotting, wie oben beschrieben, analysiert.
In dem Western Blot wurde ein einzelnes Protein mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 125'000 Dalton gefunden. Dieser Blot ist in Figur 8 gezeigt. Das für dieses Protein codierende Plasmid pSPE 349 ist in einem Bereich rechts der EcoRI-Stelle bei Position 8200 in pSPE 312 deletiert (siehe Figur 5 und 7). Das Genprodukt des Plasmids pSPE 349 lokalisiert daher die Position und Orientierung des pmt-Gens (als schattierter Bereich in Figur 5 gezeigt). Die codierende Region beginnt ungefähr 3.3 kb stromaufwärts der EcoRI-Stelle bei Position 8'200 in pSPE 312, d.h. um die ClaI-Stelle bei Position 4900. Da die vollständige codierende Region auf etwa 3,9 kb geschätzt wird, endet das Strukturgen ungefähr bei Position 8'800 auf der in Figur 5 gezeigten Karte.

BEISPIEL 7

Sequenzierung des pmt-Gens

Die das pmt-Gen tragende, wie in Beispiel 4 lokalisierte Nukleotidsequenz wurde unter Anwendung des von Sanger et al., (Ref. 33) beschriebenen Verfahrens bestimmt. Die Sequenz von 4381 aufeinanderfolgender bp wurde bestimmt. Die DNA-Sequenz der Region ist in Figur 10 (a) - (j) gezeigt, in welcher die abgeleitete Aminosäurensequenz über der DNA- Sequenz, bei Position 219 - 221 beginnend, gezeigt ist. Das Methionin-Codon bei Position 219 - 221 ist das als Startcodon gegenüber dem Methionin der Position 213 - 218 bevorzugte Codon, aufgrund seines perfekten Abstandes zu der vermutlichen Ribosomenbindungsstelle bei Position 201 - 210. Der das pmt-Gen enthaltende Bereich wurde einen detaillierteren Restriktionskartierung durch eine Computersuche nach allen Restriktionsstellen für Restriktionsenzyme mit einer Erkennungsstelle von 6 bp unterzogen.
Die Ergebnisse, die einen hohen Grad an Uebereinstimmung mit der zuvor hergestellten Restriktionskarte zeigen, sind in Figur 9 dargestellt.

BEISPIEL 8

Expression des P. multocida-Toxins in E. coli

Die in verschiedenen rekombinanten E. coli-Klonen produzierte Menge an PMT wurde durch Schätzung des Einbaus von S-35-markiertem Methionin unter Anwendung des folgenden Verfahrens bestimmt. Zellen wurden in mit 0,2% Glukose, 1 ug/ml Thiamin und 50 ug/ml Leucin ergänztem AB-Minimalmedium (Ref. 21) bei 37ºC gezüchtet. Bei einer optischen Dichte (OD&sub4;&sub5;&sub0;) von 0,6 wurde 1 ul einer 1 mCi/ml S-35-Methioninlösung (von Amersham, SJ. 1015 erworben) zu einer 1 ml-Probe der Kultur bei 37ºC zugegeben. 3 Minuten später wurden 50 ul einer 10mg/ml unmarkiertes Methionin enthaltenden Lösung als Verfolgung zugegeben und nach weiteren 3 Minuten wurde die Probe auf Eis gestellt. Die Proben wurden pelletiert (5 Minuten bei 6'000 x g) und in Ladungspuffer (0,5 M Tris-HCl pH 6,8, 3% SDS, 15 % Glyzerin, 5 % Mercaptoäthanol, Bromphenolblau) resuspendiert. Anschliessend wurden die Proben im SDS-PAGE, wie in Beispiel 5 beschrieben, getrennt. Danach wurde das Gel getrocknet und über Nacht auf einem KODAK XAR-5-Röntgenfilm der Autoradiographie unterworfen. Relative Konzentration des PMT wurden durch Abtasten (scanning) des Röntgenfilms bestimmt unter Verwendung der β- und β'-Untereinheiten der E. coli RNA-Polymerase als Referenz.
Rekombinante, auf diese Weise getestete Klone waren MT102- Stämme, die die Plasmide pSPE 312 bzw. pSPE 525 (in Figur 11 gezeigt) und pSPE 481 (in Figur 12 gezeigt) beherbergten. Plasmid pSPE 481 besteht aus dem 7 kb grossen PstI- Fragment von pSPE 525, an ein 1,3 kb grosses PstI-Fragment des Plasmids pPL 195 ligiert, das einen Teil des Ampicillin-Resistenzgens und den lambda-PL-Promotor und eine Operatorregion enthält. pPL 195 wurde durch Insertion eines pUC8 EcoRI-HindIII-Polylinkers (Ref. 33) in einen EcoRI- und HindIII-verdauten PLc28-Vektor (Ref. 34) konstruiert. Das resultierende pSPE 481-Plasmid trägt den lambda-PL-Promotor, der in das pmt-Gen transkribiert. TABELLE 4 Geschätzte PMT-Konzentration in den rekombinanten E. coli- Klonen Moleküle/Zelle In obiger Berechnung verwendete Daten Methionin-Gehalt (%) Grösse (kD) Moleküle/Zelle (bei 2,5-3 Verdopplungen/Std.)
Darüberhinaus wurde der Gehalt von PMT in SPE 481, das folgende Verfahren anwendend, geschätzt. Eine 100 ml Kultur mit einer optischen Dichte (OD&sub4;&sub5;&sub0;) von 5 wurde pelletiert (5 Minuten bei 6000 x g) und in 10 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,0 resuspendiert, Der Überstand, der kein PMT enthielt, wurde verworfen und die geernteten Zellen durch Ultrabeschallung zerstört. PMT wurde dann weiter auf einer Anionen-Austausch-Säule, wie in Referenz 6 beschrieben gereinigt. Das gereinigte PMT wurde dann, wie in Beispiel 2 beschrieben, einem quantitativen ELISA unterworfen, wobei ein geschätzter Wert von 2-5 ug PMT/ml Kulturflüssigkeit erhalten wurde.
Der Escherichia coli K-12-Stamm MT102, das pSPE 481-Plasmid beherbergend, wurde am 21. März 1988, dem Budapester Vertrag entsprechend, in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der Stammbezeichnung Escherichia coli K-12 SPE 481 hinterlegt. Die Ordnungsnummer ist DSM 4488.

BEISPIEL 9

Herstellung und Charakterisierung von Toxinderivaten

Die folgenden Derivate toxincodierender Plasmide wurden zu dem Zweck konstruiert, verkürzte, d.h. entgiftete Toxine herzustellen, die potentiell nützlich für immunogene Zwecke sind. Die Konstrukte wurden auf der Basis der Restriktionskarten hergestellt, die in den Beispielen 6 und 7 offenbart werden. Die hypothetisch vom Toxin stammenden, von den Plasmiden pSPE A bis pSPE Q produzierten Proteine, die Proteine A bis Q, sind in Figur 13 dargestellt. Alle Derivate wurden optimal von den jeweiligen Plasmiden im Stamm SG 21059 exprimiert, der freundlicherweise von Susan Gottesmann zur Verfügung gestellt wurde. Der bekannte Genotyp dieses Stammes ist Δgal 1on146:: ΔTn10 Δ1ac.
1) pSPE A: Das Plasmid wurde durch Restriktion von pSPE 481 mit dem Restriktionsenzym StuI vor der Ligation konstruiert. Diese Deletion verursachte eine Veränderung des Leserahmens. Jedoch konnte, wie unten beschrieben, ein PMT- Derivat im Western Blot wie auch in dem EBL-Toxizitätstest nachgewiesen werden. Dies könnte auf in geringem Masse aufgetretene Verschiebung des Leserahmens während des Translationsvorganges zurückzuführen sein. Siehe Figur 13.
2) pSPE A: Das Plasmid wurde durch Restriktion von pSPE 481 mit dem Restriktionsenzym XbaI vor der Ligation konstruiert. Das Plasmid codiert für ein hypothetisches PMT-Derivat von ungefähr 108 kD, worin die Aminosäuren 169 bis 468 des PMT fehlen. Siehe Figur 13.
3) pSPE C: Das Plasmid wurde durch Restriktion von pSPE 481 mit dem Restriktionsenzym NdeI vor der Ligation konstruiert. Diese Deletion verursacht eine Änderung des Leserahmens. Jedoch konnte, wie unten beschrieben, ein PMT-Derivat in kleinen Konzentrationen nachgewiesen werden. Dies könnte auf eine irrtümliche Verschiebung des Leserahmens bei dem Translationsvorgang zurückzuführen sein. Siehe Figur 13.
4) pSPE D: Das Plasmid wurde durch Restriktion von pSPE 481 mit den Restriktionsenzymen NdeI und SnaBI und anschliessende Überführung der daraus resultierenden Enden in glatte Enden vor der Ligation konstruiert, wobei T4-Polymerase (von New England Biolabs erworben), wie vom Hersteller beschrieben, verwendet wurde. Diese Deletion verursachte eine Veränderung des Leserahmens. Jedoch konnte, wie unten beschrieben, ein PMT-Derivat in kleinen Konzentrationen nachgewiesen werden. Dies könnte auf eine irrtümliche Verschiebung des Leserahmens beim Translationsvorgang zurückzuführen sein. Siehe Figur 13.
5) pSPE E: Das Plasmid wurde durch Restriktion von pSPE 481 mit dem Restriktionsenzym HindIII vor der Ligation konstruiert. Das Plasmid codiert für ein hypothetisches PMT-Derivat von ungefähr 53 kD, da diese Deletion eine Veränderung des Leserahmens verursacht. Siehe Figur 13.
6) pSPE F: Das Plasmid wurde durch Restriktion von pSPE 312 mit dem Restriktionsenzym HindIII vor der Ligation konstruiert. Wie pSPE E codiert dieses Plasmid für ein hypothetisches PMT-Derivat von ungefähr 53 kD. Siehe Figur 13.
7) pSPE G: Das Plasmid wurde durch Restriktion von pSPE 481 mit den Restriktionsenzymen SnaBI und XhoI und durch anschliessende Überführung der resultierenden Enden in glatte Enden vor der Ligation, wie oben beschrieben, konstruiert. Das Plasmid codiert für ein hypothetisches PMT-Derivat von ungefähr 135 kD, worin die Aminosäuren 507 bis 568 des PMT fehlen. Siehe Figur 13.
8) pSPE H: Das Plasmid wurde durch Restriktion von pSPE 418 mit den Restriktionsenzymen SnaBI und SpeI und anschliessender Überführung der resultierenden Enden in glatte Enden, wie oben beschrieben, vor der Ligation konstruiert. Das Plasmid codiert für ein hypothetisches PMT-Derivat von ungefähr 88 kD, worin die Aminosäuren 569 bis 1058 von PMT fehlen. Siehe Figur 13.
9) pSPE I: Das Plasmid wurde durch Restriktion von pSPE 481 mit dem Restriktionsenzym NsiI vor der Ligation konstruiert. Das Plasmid codiert für ein hypothetisches PMT-Derivat von ungefähr 79 kD, worin die Aminosäuren 634 bis 1204 des PMT fehlen. Siehe Figur 13.
10) pSPE J: Das Plasmid wurde durch Restriktion von pSPE 312 mit dem Restriktionsenzym NsiI vor der Ligation konstruiert. Das Plasmid codiert für ein hypothetisches PMT- Derivat von ungefähr 70 kD. Siehe Figur 13.
11) pSPE K: Das Plasmid wurde durch Restriktion von pSPE 481 mit dem Restriktionsenzym SpeI und Überführung der resultierenden Enden in glatte Enden vor der Ligation, wie oben beschrieben, konstruiert. Das Plasmid codiert für ein hypothetisches PMT-Derivat von 117 kD. Siehe Figur 13.
12) pSPE L: Das plasmid wurde durch Restriktion von pSPE 312 mit dem Restriktionsenzym EcoRI vor der Ligation konstruiert. Das Plasmid codiert für ein hypothetisches PMT- Derivat von ungefähr 124 kD. Siehe Figur 13.
13) pSPE O: Das plasmid wurde durch teilweise Restriktion von nichtmethyliertem pSPE 481 mit dem Restrikionsenzym Bc1I vor der Ligation konstruiert. Das Plasmid codiert für ein hypothetisches PMT-Derivat von 133 kD, worin die Aminosäuren 30 bis 150 des PMT fehlen. Siehe Figur 13.
14) pSPE P. Das Plasmid wurde durch Restriktion von pSPE 481 mit dem Restriktionsenzym SpeI, anschliessender Behandlung mit der Exonuklease Bal31, Restriktion mit EcoRI und schliesslich Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, in Gegenwart aller vier Desoxyribonukleotide,vor der Ligation konstruiert. Das Plasmid codiert für ein hypothetisches PMT-Derivat von etwa 136 kD, worin die Aminosäuren 1043 bis 1130 des PMT fehlen. Siehe Figur 13.
15) pSPE Q. Das Plasmid wurde aus einem Derivat von pSPE 481, pSPE 680, konstruiert. pSPE 680 wurde durch Restriktion von pSPE 481 mit den Restriktionsenzymen BamHI und ClaI und Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I in Gegenwart aller vier Desoxynukleotide vor der Ligation konstruiert. Anschliessend wurde pSPEQ durch restriktion von pSPE 680 mit EcoRV vor der Ligation konstruiert. Das Plasmid codiert für ein hypothetisches PMT-Derivat von 127 kD, worin die Aminosäuren 175 bis 246 des PMT fehlen.
16) pSPE R: Das Plasmid wurde durch Restriktion von pSPE 481 mit den Restriktionsenzymen SpeI und EcoRI und Überführung der resultierenden Enden in glatte Enden vor der Ligation, wie oben beschrieben, konstruiert. Das resultierende Plasmid codiert für ein hypothetisches PMT-Derivat von etwa 117 kD. Siehe Figur 13.
Die Reaktionsfähigkeit ausgewählter Derivate mit einer Auswahl von anti-PMT-MAbs wurde durch Sandwich-ELISA, basierend auf dem Nachweis mit nicht-kompetitiven MAb-Kombinationspaaren, untersucht. Mit diesem Verfahren wurde ein Antigencode (Ag-Code), d.h. eine Bezeichnung, die den Epitopunterschied des Derivats verglichen mit PMT anzeigt, für jedes Derivat bestimmt.
Die minimale cytopathische Dosis (MCD) auf 120 ul 1,5 x 10&sup5; embryonaler Rinderlungenzellen wurde für einige affinitätsgereinigte PMT-Derivate bestimmt.
Die Ergebnisse der zwei Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 5): TABELLE 5 Derivat Ag-Code * nicht affinitätsgereinigt (ultraschallbehandelt) n.d.: nicht bestimmt
Der Antigencode "PMT" zeigt an, dass das Derivat im Sandwich-ELISA indifferent im Vergleich zu PMT reagiert, d.h. es können nicht alle, mit der MAb-Auswahl charakterisierten Epitope, die sich auf dem PMT befinden, auf dem Derivat nachgewiesen werden. Der Ag-Code, "PMT-x", worin x α, β oder γ ist, zeigt an, dass die MAb, die mit dem Epitop x auf PMT reagieren, nicht mit dem Derivat reagieren. Die Ergebnisse dieser Tests zeigen, dass Epitop α auf dem Derivat L fehlt, β auf O und P und γ auf B und C fehlen.
Die MCD von PMT ist annähernd 0.01-0,03 ng und es ist daher offensichtlich, dass die obengenannten Derivate L und O praktisch nicht cxytopathisch im Vergleich zu PMT sind, wobei P einen geringen Rest cytopathischer Aktivität zeigt.
Ein Western Blot, ein Maus-anti-PMT-Antiserum verwendend, wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, wurde durchgeführt und ein vollständiger Meerettich-Peroxidase-anti- Maus-Ig-Antikörper (von Amersham geliefert) wurde als zweiter Antikörper verwendet. Von Stämmen, die die Plasmide pSPE A, B, C, D, E, G, H, I und L beherbergen, konnte gezeigt werden, dass sie mit dem anti-PMT-Antiserum reagieren (siehe Figur 14).

An Mäusen durchgeführte Versuche zur Untersuchung der immunogenen Wirkung auf das O-Derivat

Zweck:

Um den immunogenen Effekt von PMT nach der Deletion im N- terminalen Ende (O-Derivat) zu untersuchen.

Verfahren:

Für die Versuche wurden BALB/c-Mäuse verwendet. Sexuell ausgereifte weibliche Mäuse wurden subcutan 2 mal in 14tägigen Intervallen mit 0,3 ml O-Derivat (2,5 - 5 ul/ml) in 20%igem Alhydrogel (vergleiche Beispiel 12) in PBS + 0,01% Null-Maus-Serum immunisiert.
Gleichzeitig mit der 1. Impfung wurden die Mäuse gepaart. Die zweite Impfung fand ungefähr eine Woche vor der zu erwartenden Geburt statt.
1) Ungefähr 10 Tage alt, wurden die Mäusebabies in zwei Gruppen aufgeteilt. Der Hälfte von ihnen wurde PMT intranasal getropft (insgesamt 60 ng PMT), der anderen Hälfte wurde PMT in verschiedenen Konzentrationen intraperitoneal (i.p.) injiziert. Die Anzahl der toten Tiere wurde registriert.
2) Allen erwachsenen weiblichen Mäusen wurde nach dem Töten der überlebenden Mäusebabies Blut entnommen. Die Blutproben wurden durch ELISA, wie in Beispiel 13 beschrieben, auf die Gegenwart von Antikörpern gegen PMT analysiert. Sofort nach der Blutprobenentnahme wurde den Mäusen i.p. verschiedene Konzentrationen an PMT injiziert. Die Anzahl toter Tiere wurde notiert. Schematischer Versuchsplan Versuchswoche Nr. weibliche BALB/c-Mäuse wurden gepaart und anschliessend mit dem O-Derivat immunisiert weibliche Mäuse wurden ein zweites Mal mit dem O-Derivat immunisiert weibliche Mäuse gebaren 121 Mäusebabies die Mäusebabies wurden in die Gruppe I (61), die intranasal mit PMT behandelt wurde, und Gruppe II (61), die i.p. mit PMT behandelt wurde, eingeteilt überlebende Mäusebabies wurden getötet weibliche BALB/c-Mäuse wurden ausgeblutet weibliche BALB/c-Mäuse wurden i.p. mit PMT injiziert die Anzahl der überlebenden weiblichen BALB/c-Mäuse wurde festgehalten und die Tiere getötet Versuch beendet.
Die Ergebnisse sind in Tabellen 6 und 7 gezeigt.
LD&sub7;&sub5; in ungeschützen Mäusebabies betrug 20 ng PMT i.p. injiziert.
LD&sub5;&sub0; in ungeschützten erwachsenen Mäusen betrug 70 ng PMT i.p. injiziert.

Schlussfolgerung:

Es kann geschlossen werden, dass Mäuse, die von Müttern abstammen, die mit der beschriebenen Dosis des O-Derivat-Impfstoffes geimpft wurden, i.p. PMT-Injektionen von mindestens 25 x LD&sub5;&sub0; überleben können. Der Schutz wird über Antikörper, die über das Kolostrum von der Mutter auf die Nachkommen übertragen werden, erreicht.
Darüberhinaus kann geschlossen werden, dass mit dem O-Derivat geimpfte Tiere Antikörper gegen PMT entwickeln, selbst wenn einige Unterschiede gesehen werden. Die Mäuse können i.p. PMT-Injektionen von mindestens 50 x LD&sub5;&sub0; überleben.
Mäuse, die mit dem O-Derivat geimpft wurden, können daher einen beträchtlichen Schutz gegen PMT auf ihre Nachkommen via Kolostrum übertragen. Die Mäuse entwickeln selbst Antikörper gegen PMT und sind sogar gegen hohe PMT-Konzentrationen geschützt. TABELLE 6 SCHEMA DER IMPFVERSUCHE AN MÄUSEN (ERWACHSEN) MIT DEM O-FRAGMENT Menge an PMT (Immunitätstest) Versuch x, (s) (ln, Titer) KONZ. (Impfstoff) * Anzahl der toten Mäuse / Anzahl der i.p. injizierten Mäuse TABELLE 7 SCHEMA DER VERSUCHE MIT DEM O-FRAGMENT BEI DEN MÄUSE-NACHKOMMEN Menge an PMT (Immunitätstest) Versuch * Anzahl der toten Mäuse / Anzahl der i.p. injizierten Mäuse

BEISPIEL 10

Unterscheidung von PMT&spplus;- und PMT&supmin;-Stämmen durch PMT-ELISA

615 Feldisolate und 7 Referenzstämme von P. multocida wurden untersucht. Die Feldisolate wurden von nasalen Abstrichen (603 Isolate) und Lungen (12 Isolate) von Schweinen aus 156 dänischen Herden erhalten und wurden aufgrund folgender Kriterien identifiziert: Säure aus Glukose, Saccharose, Mannit, Sorbit und nicht aus Maltose, Arabinose, Dulcit und Inosit produziert; und Produktion von Indol, Ornithindecarboxylase, Katalase, Oxidase und nicht von Urease.
Extrakte für Toxinanalysen wurden durch Ernten von Blutagarübernachtkulturen (9 cm-Petrischalen, 37ºC) mit Hilfe eines Spatels in 2 ml sterilem Wasser hergestellt. Die Suspenionen wurden bei 37ºC ungefähr 18 Stunden lang extrahiert. Ein Teil des Extrakts wurde sofort durch PMT- ELISA, wie in Beispiel 2 beschrieben, untersucht. Alle Absorptionen (A) wurden als Prozentzahl der von einer positiven Kontrolle erhaltenen Absorption (A&sub0;) ausgedrückt. Diese Kontrolle war eine 1:1-Verdünnung eines Extrakts, der für jeden Test frisch von dem toxischen Typ D Referenzstamm P. multocida ssp. multocida 45/78 angesetzt wurde.
Ein anderer Teil wurde zentrifugiert (30 Minuten bei 1500 x g), der Überstand steril filtriert und anschliessend im EBL-Test, wie zuvor in Referenzen 22 und 29 beschrieben, untersucht.
Die 615 Feldisolate wurden mit Hilfe des EBL-Tests als toxisch (250) oder nicht-toxisch (365) charakterisiert und gehörten dem kapsulären Typ A (119 toxische und 92 nichttoxische Isolate) oder D (131 toxische und 273 nicht-toxische Isolate) an.
Für die 615 Feldisolate und die 7 Referenzstämme wurde eine vollständige Übereinstimmung zwischen dem EBL-Test und dem PMT-ELISA (Tabelle 8) erhalten. TABELLE 8 EBL-Zelltest a) PMT-ELISA b) Feldisolate von P. multocida ssp multocida Stamm vom Typ (CCUG 17977) P. multocida ssp. septica Stamm vom Typ (NCTC 10204) P. multocida ssp. gallicida Stamm vom Typ (NCTC 10322) P. multocida ssp. multocida, Typ A Referenzstamm (ATCC 12945) P. multocida ssp. multocida, Typ A Referenzstamm (NCTC 12177) P. multocida ssp. multocida, Typ A Referenzstamm (ATCC 7707) P. multocida ssp. multocida, Typ D Referenzstamm (NCTC 12178) P. multocida ssp. multocida, Typ D
a) Alle EBL-positiven (+) bakteriellen Extrakte zeigten EBL-Titer von über 10³ (im Mittel 10&sup4;, Bereich 10³-10&sup6;) im EBL-Zelltest, EBL-negative (-) Extrakte waren nicht cytopathisch.
b) Alle 1:1 verdünnten ELISA-positiven (+) bakteriellen Extrakte zeigten relative Absorptionen über 39% (Mittel ± SD: 94% I 13%) in dem PMT-ELISA, wohingegen alle ELISA-negativen (-) Extrakte relative Absorptionen unter 9% (2,1% ± 1,9%) zeigten.
Die cytopathischen und nichtcytopathischen Extrakte der 615 Feldisolate wurden durch den PMT-ELISA in zwei klar zu unterscheidende Gruppen getrennt (Figur 15). Da der Mittelwert ± SD der Absorption, der von den 1:1-verdünnten Extrakten der 250 toxischen Isolate erhalten wurde, 1,72 ± 0,46 betrug, waren visuelle anstatt der photometrischen Messungen der ELISA-Ergebnisse für die Unterscheidung von P. multocida-Extrakten zufriedenstellend. Der mittlere ± SD der PMT-Konzentration in den Extrakten der toxischen Isolate von P. Multocida wurde auf 2,8 ± 1,9 ul/ml geschätzt, und da die Nachweisgrenze des PMT-ELISA bei ungefähr 50 pg (1 ng/ml) PMT liegt (vergleiche Beispiel 2), können Verdünnungen der Extrakte (Figur 16) und Extrakte mit niedrigen PMT-Konzentration entsprechend mit dem PMT-ELISA getestet werden. Der Hauptvorteil des PMT-ELISA im Vergleich zu vorhandenen Tests ist die Unabhängigkeit von Zellkulturen oder Einrichtungen für Labortiere, der Fähigkeit eines einzelnen Laboranten mehrere hundert Proben pro Tag zu bearbeiten und der Möglichkeit innerhalb von 4 Stunden quantitative, objektive Ergebnisse von bakteriellen Extrakten zu erhalten.

BEISPIEL 11

Neutralisation von PMT mit monoklonalen Antikörpern

Proben (30 ul) von PMT, entweder in PBS oder PMT in einem rohen, zellfreien Extrakt von P. multocida 45/78 (Referenz 6), die PMT in Mengen bis zu 12 ng und 1 ug gereinigten MAb (P3F51) enthielten, wurden 15 Minuten bei 20ºC vor der Zugabe zu embryonalen Rinderlungenzellen (EBL) (120 ul, 1,5 x 10&sup5; Zellen/ml) wie für den ursprünglichen EBL-Test (Referenz 29) beschrieben, inkubiert. Die minimale cytopathische Dosis (MCD) von PMT wurde ohne die Anwesenheit von MAb in der Probe bestimmt. Der Neutralisationstiter wurde als Zahl der minimalen Dosis angegeben, die mit 1 ug MAb neutralisiert werden konnte.
Die Ergbnisse sind unten in Tabelle 9 dargestellt. TABELLE 9 Hybridomagruppe Nr. Repräsentative MAb Neutralisation im EBL-Zelltest (x MCD)a a) Neutralisation der cytopathischen Wirkung auf PMT wurde als Zahl der minimalen cytopathischen Dosis (MCD), die von 1 ug des MAb neutralisiert wird, bestimmt. Die MCD von PMT ist ungefähr 30 pg.
Wie in Tabelle 9 gezeigt, resultierte die Zugabe von 1 Pg MAb zu PMT 15 Minuten vor der Zugabe zu den EBL-Zellen in einem 30- bis 400-fachen Anstieg der MCD bei 9 der 10 repräsentativen MAb, wobei MAb P3F37 eine sehr niedrige Neutralisationswirkung auf PMT hat. Die Neutralisation des cytopathischen Effekts auf PMT wurde auch erreicht, wenn ein roher, zellfreier Extrakt von P. multocida 45/78 anstatt reinem PMT verwendet wurde.
Proben (200 ul), die PMT in unterschiedlichen Konzentrationen bis zu 2,56 ug und gereinigten MAb zwischen 0,15 ug und 15 ug enthielten, wurden 15 Minuten bei 20ºC inkubiert und intraperitoneal (i.p.) in weibliche BALB/c-Mäuse (6 Wochen alt, 15 bis 30 g) injiziert. Mäuse, die innerhalb einer Woche von dem Zeitpunkt der PMT-Injektion starben, wurden registriert und die lethale Dosis an PMT und der neutralisierende Effekt des MAb wurden bestimmt. Wenn 1,5 ug oder 15 ug P3F51 zugegeben wurden, erhöhte sich die lethale Dosis PMT jeweils um das 4- bzw. 34-fache, während 0,15 ug des MAb keine neutralisierende Wirkung zeigte.
Um die in vivo Neutralisationsfähigkeit der anti-PMT monoklonalen Antikörper zu untersuchen, wurden 200 ul einer Lösung, die 15 ug gereinigten monoklonalen Antikörper (PF3F51) enthielt, in weibliche BALB/c-Mäuse (6 Wochen alt, 15-20g) 2 Wochen vor der i.p. Verabreichung von 200 ul einer Lösung, die PMT in verschiedenen Konzentrationen bis 2,56 ug entweder in reiner Form oder als rohen Zellextrakt von P. multocida 45/78 (Referenz 6) enthielt, injiziert (i.p.). Die neutralisierende Wirkung wurde, wie oben beschrieben, geschätzt.
Die lethale PMT-Dosis stieg ungefähr um das 32-fache an, wenn die Mäuse passiv mit 15 ug P3F51 2 Tage vor dem Immunitätstest mit PMT oder einem rohen Zellextrakt von P. multocida 45/78 immunisiert wurden.

BEISPIEL 12

Impfung mit gereinigtem PMT oder Derivat O

15 mg von, wie in Beispiel 3 beschieben gereinigtem PMT in 45 ml PBS wurden gegen 0,35% Formaldehyd in PBS, pH 7,3- 7,9, 36 Stunden bei 4ºC dialysiert, wonach 1 g/l Lysin-HCl zu der Dialyseflüssigkeit gegeben und nach 18 Stunden die Dialyse mit wiederholtem Wechseln des PBS fortgesetzt wurde. Das so hergestellte entgiftete PMT wurde auf fehlende (oder ausreichend reduzierte) toxische Aktivität sowohl in dem Mauslethalitätstest und dem oben beschriebenen cytopathischen Test in EBL-Zellen, als auch in einem dermonekrotischen Test bei Meerschweinchen, wie von Foged et al. (1) beschrieben, analysiert.
10 mg eines biologisch inaktiven (entgifteten) PMT in 40 ml PBS wurde dann an 10 ml Aluminiumhydroxidgel, das von Superfos, Dänemark, unter dem Handelsnamen Alhydrogel erhältlich ist, wie vom Hersteller empfohlen, gekuppelt und in 20% Aluminiumhydroxid in PBS bis zu einer Endkonzentration von ungefähr 5 ug/ml oder 125 ug/ml an entgiftetem PMT verdünnt.
Trächtige Schweine wurden subcutan 4 - 6 Wochen und 2 - 3 Wochen vor dem Ferkeln mit einer Dosis von 3 ml der oben hergestellten entgifteten PMT-Impfstoffzusammensetzung immunisiert. Nach dem Werfen wurden die Ferkel intranasal mit Bordetella bronchiseptica und P. multocida, wie in Referenz 1 beschrieben, inokuliert, und die Schutzwirkung wurde in den Schweinen durch Messen der täglichen Gewichtszunahme vor dem Schlachten der Schweine (bei ungefähr 90 Kg Lebendgewicht) bestimmt und die osteopathologischen Zustände der Schweineschnauze beim Schlachten bestimmt. Schweine von immunisierten Muttertieren wurdem mit Schweinen von nicht-immunisierten Muttertieren verglichen, und die schützende Wirkung der Immnunisierung ist in Tabelle 10 gezeigt. TABELLE 10 Anzahl der Tiere (Nachkommen) Mittlere tägliche Gewichtszunahme n. d. Entwöhnung Anzahl d.Tiere mit ernster Nasenhöhlenatrophie (%) Schweine von nichtimmunisierten Mutterschweinen Schweine von immunisierten Mutterschweinen
In einer noch laufenden Studie wurden Mutterschweine mit einer 50 ug/Dosis affinitätsgereinigem Derivat-O von ultraschallbehandelten Proben eines pSPE O enthaltenden E. coli- Klons, wie in Beispiel 9 beschrieben, immunisiert. Es wurden keine Modifikationen, ausser der Kupplung von O an Alhydrogel, durchgeführt. Vorläufige Ergebnisse der Impfstudie zeigen, dass:
a) die Serum- und Kolostrumtiter gegen natives PMT in den Mutterschweinen, die mit dem Derivat O und formaldehydbehandeltem PMT geimpft wurden, ähnlich sind,
b) die spezifischen Antikörper in beiden Impfgruppen gleichermassen gut durch das Kolostrum auf die Ferkel übertragen werden,
c) die klinischen Symptome der atrophen Rhinitis gleichermassen gut in den Nachkommen der Mutterschweine, die mit O (O-Ferkel) und mit formaldehydbehandelten PMT (P-Ferkel) geimpft wurden, verhindert werden und dass diese Vorbeugung nahe an 100% zu sein scheint, wenn sie mit Ferkeln, die von ungeimpften Mutterschweinen geboren wurden (Kontrollferkel), verglichen werden,
d) das toxische P. multocida, das zur experimentellen Infektion verwendet wird, in signifikant höheren Mengen aus Kontrollferkeln als aus 5 Wochen alten O- oder P-Ferkeln rückisoliert werden kann.

BEISPIEL 13

Nachweis von anti-PMT-Antikörpern

Durch ein im wesentlichen wie in Beispiel 2 beschriebenes Verfahren, jedoch durch Inkubieren des überziehenden monoklonalen Antikörpers mit einem vorgemischten Ansatz aus Serum und einer konstanten Menge PMT, ist es möglich, anti- PMT-Antikörper im Serum zum Beispiel von mit P. multocida infizierten Schweinen oder mit dem Impfstoff dieser Erfindung geimpften Tieren nachzuweisen. Die Mischung, die für konzentrierte oder verdünnte Serumproben hergestellt wurde, wurde vor der 15minütigen Inkubation in den Mikrotiterplatten 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Anwesenheit von anti-PMT-Antikörpern in der Serumprobe wurde durch eine Abnahme der Absorption, im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben, nachgewiessen (im Abschnitt mit dem Titel "ELISA zur Bestimmung der Epitopspezifität"). Die Ergebnisse sind in Figur 17 dargestellt, die die 50%igen Blokkierungstiter des Serums eines für anti-PMT-Antikörper ne gativen Schweins (< 2), eines mit einem toxinproduzierenden P. multocida-Stamm infizierten Schweins (ungefähr 14) und einem mit dem in Beispiel 12 beschriebenen Impfstoff geimpften Mutterschwein (ungefähr 250), zeigt.

BEISPIEL 14

Nachweis von PMT durch Kolonie-Blots und Immunoblotting

Das Vorhandensein von PMT in Proben kann durch ein Kolonie- Blot-Verfahren (Referenz 14), wie in Beispiel 5 beschrieben (der Abschnitt mit dem Titel "Screening-Verfahren"), nachgewiesen werden.
In ähnlicher Weise kann das Vorhandensein von PMT in den Proben durch elektrophoretische Trennung der Proteine durch SDS-PAGE (wie in Beispiel 1 beschrieben) und elektrophoretische Übertragung auf eine Nitrocellulosemembran nachgewiesen werden, auf der PMT, falls vorhanden, durch in Beispiel 1 beschriebenes Immunoblotting (in dem Abschnitt mit dem Titel "Immunoblotting") sichtbar gemacht wird. Die elektrophoretische Position der gefärbten Proteinbande gibt auch die offensichtlichen Molekulargewichte des PMT (ungefähr 143 kD) wieder.

BEISPIEL 15

Genetische Unterscheidung zwischen PMT&spplus;- und PMT&supmin;-Isolaten von P. multocida, durch Koloniehybridisierung nachgewiesen

P. multocida-Isolate (17 toxinpositive und 18 toxinnegative, wie oben beschrieben durch ELISA und EBL-Tests bestimmt) wurden auf Agarplatten aus Tryptischem Sojabouillon (von DIFCO erhältlich) ausplattiert. Nach der Inkubation über Nacht bei 37ºC wurde ein Replika auf einem Nitrocellulosemembranfilter (Schleicher und Schüll BA 85) hergestellt. Dieses Replika wurde (mit der Oberfläche nach oben) auf 4 aufeinander folgende Whatman 3MM-Filter gelegt, die jeweils in 10% SDS, Denaturierungspuffer (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl), Neutralisationspuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 8,0, 1,5 M NaCl) und 2 x SSPE (360 mM NaCl, 20 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 2 mM EDTA, pH 7,4) getränkt waren. Die Inkubation wurde 5 Minuten auf jedem Filter bei Raumtemperatur durchgeführt. Anschliessend wurden die Nitrocellulosefilter getrocknet und die DNA auf dem Filter durch 2stündiges Backen bei 80ºC fixiert. Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden in 6 x SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), 0,5 % SDS und 5 x Denhardt'sche Lösung 2 Stunden beziehungsweise über Nacht bei 65ºC inkubiert. Die Sonde war ein radioaktiv markiertes XbaI-Fragment von Position 1623 bis 4376 der in Figur 10 (a) - (j) gezeigten Sequenz, die durch Nick-Translationsverfahren (Referenz 22) hergestellt wurde. Nach der Hybridisierung wurden die Filter bei 25ºC in 2 x SSC, 2 x 15 Minuten in 0,5% SDS und 2 x 1 Stunde bei 65ºC in 0,2 x SSC und 0,5% SDS gewaschen und über Nacht autoradiographiert.
Die Ergebnisse sind in Figur 18 dargestellt, die zeigt, dass Kolonien in Position 5, 6, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 17, 19, 22, 34, 36, 37, 39, 45, und 50 PMT&spplus; und Kolonien in den Positionen 7, 23, 24, 26, 28, 30, 32, 42, 44, 47, 48, 53, 56, 58, 63, 66, 73 und 75 PMT&supmin; waren. Diese Ergebnisse stimmen mit den ELISA und EBL-Bestimmungen überein. Somit verdanken die nichttoxischen Stämme ihren Mangel an Toxinproduktion dem Fehlen des pmt-Gens, das für PMT codiert.

BEISPIEL 16

Reinigung von rPMT und Vergleich von rPMT mit PMT

In dem Toxinreinigungsverfahren wurden Zellen, die aus einer stationären 1 l Über-Nacht-Kultur von SPE312 geerntet wurden, in 10 ml H&sub2;O resuspendiert und mehrmals 0,5 Minuten bei 0ºC, ein Branson Ultraschallgerät 250 (Branson, Conn., U.S.A.) verwendend, mit Ultraschalll behandelt. Die ultraschallbehandelte Lösung wurde vor dem Auftragen auf eine Affinitätssäule, die durch Immobilisieren des anti-PMT MAb P3F51, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt wurde, auf 50 ml in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,8 , 0,5 M NaCl, verdünnt. Nach wiederholtem Waschen der Affinitätssäule, wurde rPMT mit 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,8, wie zuvor für die Reinigung von PMT aus Extrakten des toxischen P. multocida beschrieben, eluiert. Alle Fraktionen wurden sofort mit 1 M K&sub2;HPO&sub4; neutralisiert.
Eine verdünnte, bakterielle, mit Ultraschall behandelte Lösung von SPE312, ungefähr 82 ug rPMT enthaltend, durch quantitativen ELISA, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt, wurde auf eine 1 ml-Affinitätssäule gegeben, an die ungefähr 5 mg des anti-PMT-MAb P3F51 gebunden waren. In dem Eluat konnte kein rPMT nachgewiesen werden. Bei der Eluierung wurden ungefähr 75 ug rPMT in den beiden Hauptfraktionen von jeweils 1,4 ml erhalten. Dies entspricht einer Rückgewinnung von 91% des eingesetzten rPMT.

PMT-Assays

Quantifizierung von rPMT wurde, wie für PMT (Beispiel 2) beschrieben, durchgeführt, den Fänger anti-PMT MAb P3F51 und den biotinylierten Detektor MAb P3F51 unter Verwendung von PMT-ELISA, einem Sandwich-ELISA, der auf der gleichen, wie unten beschriebenen Technik zur Untersuchung der Epitope auf rPMT und PMT, beruht. Die Quantifizierung durch den PMT-ELISA wurde mit Ergebnissen verglichen, die in einem modifizierten Coomassie-Brilliantblau-Farbbindungsmikroassay, zuvor zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen und Farbbindungsfähigkeit von PMT im Vergleich mit Rinderserumalbumin (BSA) angewendet, erhalten wurden.
Vergleich der Epitope auf rPMT und PMT wurde mit Hilfe von Sandwich-ELISAs, die auf 10 anti-PMT MAb (Beispiel 1) basieren, die aus Hybridoma-Überständen auf Protein A-Agarosesäulen gereinigt wurden, durchgeführt. Von diesen MAb konnte gezeigt werden, dass sie mit verschiedenen PMT- Epitopen reagieren. Die Sandwich-ELISA wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt. Doppelbestimmungen wurden mit beiden Antigenen in allen 100 Kombinationen der 10 fangenden MAb und dem gleichen biotinylierten Detektor-MAb durchgeführt. Kombinierte MAb-Paare, die in Absorptionen unter 0,3 resultierten, wurden als kompetitiv betrachtet. Für die nicht-kompetitiven Kombinationspaare wurden die Ergebnisse als Mittelwert der Doppelbestimmung der Absorption, die für rPMT erhalten wurde, relativ zu dem Mittelwert der Absorption für PMT, beschrieben.
Die dermonekrotischen und lethalen Effekte von rPMT und PMT wurden jeweils durch intradermale Injektion in Meerschweinchen oder intraperitoneale Injektion in BALB/c-Mäuse von 200 ul von Verdünnungen der zuvor ELISA-quantifizierten Proben bestimmt. Proben, die in dermalen Läsionen von 10 mm und mehr 48 Stunden nach der intradermalen Injektion resultierten, wurden als dermonekrotisch bewertet und Proben, die nach weniger als 5 Tagen nach der intraperitonealen Injektion im Tod resultierten, wurden als lethal bewertet. Alle Ergebnisse basierten mindestens auf Doppelbestimmungen.
Affinitätsgereinigte rPMT und PMT zeigten sehr ähnliche Reaktionsmuster in dem strukturellen ELISA-Test, der auf 100 Kombinationspaaren 10 verschiedener anti-PMT-MAbs und 100 ng/ml affinitätsgereinigtem Antigen basiert. Bei PMT zeigten 25 Paare einen Absorptionswert von (A492) unter 0,3, was als Hinweis auf Kompetitionseignung angesehen wurde. Die gleichen 25 Paare zeigten kompetitive Reaktionen, wenn es sich bei dem Antigen um 100 ng/ml rPMT handelt. Die verbleibenden 75 nicht kompetitiven Paare resultierten in A492 über 0,3, sowohl wenn PMT als auch wenn rPMT verwendet wurden. Der Gesamtmittelwert ± SD für die 75 berechneten Werte relativer Absorption von rPMT verglichen mit PMT, betrug 112% ± 8%. Nur geringe Unterschiede von dem Gesamtmittelwert wurden für die Mittelwerte der 10 fangenden MAb und der 10 biotinylierten Detektor-MAb beobachtet.
PMT und rPMT reagierten sehr ähnlich, wenn sie auf cytopathologische Wirkung auf EBL-Zellen, auf dermonekrotische Aktivität in Meerschweinchen und auf Lethalität in Mäusen getestet wurden, und ihre Fähigkeit Coomassie-Brilliantblau zu binden war gleich und ungefähr 2,5mal schwächer als die Farbbindungsaktivität von BSA (Tabelle 11). TABELLE 11 Cytopathische, dermonekrotische, lethale und farbbindenede Wirkung von PMT und rPMT Probe minimale cytopath. Dosis (pg) minimale dermonekr. Dosis (ng) minimale lethale Dosis (ng) Farbindung (%) a a Die Konzentration von BSA im Verhältnis zur Konzentration der Probe, die in gleicher Farbbildung in dem Coomassie Brilliantblau-Farbbindungsmikroassay resultiert.

BEISPIEL 17

Untersuchung von ultraschallbehandelten E. coli- und P. multocida-Lösungen auf cytopathische Aktivität

Ultraschallbehandelte Lösungen von E. coli SPE312 und P. multocida 45/78, wie in Beispiel 16 beschrieben hergestellt, wurden auf ihre cytopathische Wirkung in dem embryonischen Rinderlungen(EBL)zelltest (Referenz 29) getestet. Eine Reihe 5-facher Verdünnungen wurde von jeder ultraschallbehandelten Lösung hergestellt und 30 ul von jeder Probe wurde zu 1,8 x 10&sup4; EBL-Zellen in 120 ul Kulturmedium gegeben und die Mischung 3 Tage bei 37ºC vor der Fixierung und Färbung inkubiert. Proben, die in Monoschichten von EBL-Zellen resultierten, die morphologisch von den epithelähnlichen quirlförmigen Mustern der Negativkontrollkultur unterscheidbar waren, wurden als cytopathisch bewertet. Die cytopathische Wirkung der affinitätsgereinigten rPMT und PMT in dem EBL-Zelltest wurden in gleicher Weise bestimmt. Die minimale cytopathische Dosis (MCD) der Proben wurde als minimale Konzentration von rPMT und PMT berechnet, bestimmt durch den quantitativen PMT-ELISA, die eine cytopathische Wirkung verursachten.
Neutralisierung der cytopathischen Wirkung von ultraschallbehandelten E. coli SPE313-Lösungen durch anti-PMT-MAb wurde mit der Neutralisierung mit reinem PMT verglichen: Proben (30 ul), die ungefähr 1 ug MAb und unterschiedliche Konzentrationen ultraschallbehandelter Lösung oder PMT enthielten, wurden 15 Minuten bei 20ºC vor der Zugabe zu EBL-Zellen inkubiert. Die Ergebnisse wurden als die Zahl der MCDs, die von jedem MAb isoliert werden, und als Verhältnis zwischen der Zahl neutralisierender MCDs der ultraschallbehandelten Lösung und reinem PMT für jeden MAb angegeben.
Von ultraschallbehandelten Lösungen aus SPE308 und SPE312 konnte gezeigt werden, dass sie morphologische Veränderungen in embryonalen Rinderlungen(EBL)zellen verursachten, identisch mit denen, die durch die toxischen Stämme von P. multocida (Figur 19 (Daten von SPE308 sind nicht gezeigt)) verursacht wurden. Wie für reines PMT beobachtet, konnte die cytopathische Wirkung der ultraschallbehandelten Lösung aus E. coli SPE312 durch Inkubation mit anti-PMT-MAb neutralisiert werden. Zwischen der 5- und 125-fachen MCD der ultraschallbehandelten Lösung konnte durch verschiedene anti-PMT-MAb neutralisiert werden, wohingegen zwischen der 3- und 125-fachen MCD der reinen PMT neutralisiert wurde. Der Gesamtmittelwert ± SD der 10 berechneten Werte der relativen Zahl neutralisierender MCDs von ultraschallbehandelten E. coli SPE312-Lösungen verglichen mit PMT, betrug 95% ± 32%. Ein mit PMT in keiner Beziehung stehender MAb, der als Kontrolle verwendet wurde, neutralisierte die Wirkung der beiden cytopathischen Präparationen nicht.

BEISPIEL 18

Analyse der Beschaffenheit der das pmt-Gen flankierenden DNA

In einem Versuch, die Beschaffenheit der das pmt-Gen von P. multocida 45/78 flankierenden DNA zu untersuchen, wurde Chromosomenabschreitung (chromosome walking), wie in Referenz 37 beschrieben, durchgeführt. Durch Anwendung des Koloniehybridisierungsverfahrens wurden Plasmide, die P. multocida-DNA tragen, wie in Beispiel 4 beschrieben, aus der P. multocida-Genbibliothek isoliert.

Sonden

Das Plasmid pLOLO3 wurde durch Subklonierung eines 0,8 kB AccI-HindIII-DNA-Fragments von pSPE 344 (Figur 20) in den Vektor pGEM-blue (Promega, Wi, U.S.A.) konstruiert. Das Plasmid pLORO2 wurde in gleicher Weise durch Subklonierung des 2,4 kB EcoRI-BglII-Fragments von pSPE312 (Figur 20) in den Vektor pGEM-blue konstruiert. Der E. coli K12 Stamm DH5alpha (BRL, Md, U.S.A.) wurde als Wirtsstamm für pLOLO3 und pLORO2 verwendet. pLOLO3 und pLORO2 wurden in ihrer linearisierten Form zur Herstellung von RNA-Sonden der P. multocida-DNA, die in diesen Plasmiden vorhanden war, verwendet. Die RNA-Sonden wurden radioaktiv markiert, indem das Riboprobe System II-Verfahren (Promega, Wi, U.S.A.) angewendet wurde, und für die Koloniehybridisierung und für Southern Blots, wie unten beschrieben, verwendet.

Koloniehybridisierung

Die P. multocida-Genbibliothek wurde in geeigneter Verdünnung auf verschiedenen LB-Schalen, die 10 ug/ml Tetracyclin enthielten, ausplattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Replikas der Platten wurden auf Nitrocellulosemembranen hergstellt, und die Zellen wurden lysiert und die DNA auf den Filtern fixiert, wie in Beispiel 15 beschrieben.
Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden bei 65ºC in 50% Formamid, 6 x SSC (0,15 NaCl, 0,015 M Trinatriumcitrat, pH 7,0), 0,1 % SDS, 5 x Denhardt'sche Lösung und 200 ug/ml denaturiertem Lachssperma jeweils mindestens 2 Stunden bzw. über Nacht inkubiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter zweimal bei Raumtemperatur in 1 x SSC, 0,1% SDS und zweimal bei 65ºC in 0,1 x SSC, 0,1% SDS gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Filter über Nacht autoradiographiert.
Dieses Verfahren resultierte in der Isolierung einer Anzahl von Klonen, die P. multocida-DNA tragen, die die Insertionen von pSPE308 oder pSPE312 flankieren. Diese Klone wurden weiterhin durch Anwendung der Southern Blot-Technik analysiert. Die Southern Blots zeigten, dass die folgenden Plasmide von der RNA-Sonde, die von pLOLO3 codiert wurde, erkannt wurden: pLOAO1, pLOAO2 und pLOAO3. In ähnlicher Weise wurden die Plasmide pLOBO1, pLOBO2 und pLOBO3 von der RNA- Sonde erkannt, die von pLORO2 codiert wurde.
pLOAO3 (ungefähr 14,2 kB) und pLOBO3 (ungefähr 12,7 kB) hatten die grössten Insertionen. Ihre Restriktionskarten und eine Southern Blot Analyse zeigen, dass pLOAO3 und pSPE308 überlappende DNA von ungefähr 4,0 kB enthalten und dass pLOBO3 und pSPE 312 überlappende DNA von ungefähr 1,7 kB, wie in Figur 20 dargestellt, besitzen.
Ein Southern Blot wurde durchgeführt, DNA von dem toxischen P. multocida 45/78 und dem nicht-toxischen P. multocida MH81P8-Stamm, Typ D (Referenz 36) verwendend, die wie in Beispiel 4 beschrieben, extrahiert wurde [ein KI-Gradient (0,875 g/ml) wurde anstatt eines CsCl&sub2;-Gradienten verwendet], und mit den, wie in Figur 21 dargestellten Restriktionsenzymen verdauten Plasmiden pLOAO3, pLOAO2, pSPE308, pSPE312 und pLOBO3. Als Sonde diente das durch Nicktranslation (Rigby et al., 1977 (Referenz 19)) radioaktiv markierte 2,4 kB BglII-EcoRI-Fragment von pLOBO3. Die Ergebnisse zeigen, dass:
1) die Sonde eine DNA-Sequenz auf jedem der Plasmide pLOAO3 und pLOBO3 erkennt. Es gibt daher eine homologe Sequenz auf jeder Seite des pmt-Gens. Der Abstand zwischen diesen homologen Sequenzen beträgt ungefähr 25 kB,
2) die Sonde verschiedene Fragmente chromosomaler DNA auf beiden P. multocida-Stämmen erkennt, die in diesem Southern Blot verwendet wurden.
Die obengenannten Ergebnisse könnten darauf hinweisen, dass die DNA, die das pmt-Gen flankiert, und daher das pmt-Gen selbst, ursprünglich in einem Bakteriophagen, einem Transposon, einem Plasmid oder einem anderen genetischen Element, das in das bakterielle Chromosom integriert ist, vorgekommen ist.

Dot Blot

DNA von 24 aus P. multocida-Stämmen isolierten Bakteriophagen, von denen gezeigt werden konnte, dass sie sich in ihrem lytischen Verhalten gegenüber einer Reihe von P. multocida-Stämmen unterscheiden, wurden durch Dot Blotting an einen Nylonfilter gebunden. Das Plasmid pLOAO3 wurde durch Nicktranslation radioaktiv markiert und als Sonde gegen den Filter verwendet. Hybridisierungs- und Waschbedingungen waren wie oben beschriebenen. Die Ergebnisse sind in Figur 22 dargestellt. Die Sonde hybridisiert mit 22 von 24 Bakteriophagen und, wie erwartet, mit den vier positiven Kontrollen. Bei der Verwendung von pSPE308 und pLOBO3 als Sonden, wurden gleiche Ergebnisse erhalten. pSPE312 ergab nur eine geringe Hybridisierung mit einigen der Bakteriophagengenome. Das 4,5 kB pmt-Gen, das ClaI-PvuII-Fragment von pSPE 312 (Figur 5) enthaltend, zeigte keinerlei Homologie mit keinem der Bakteriophagengenome (Autoradiographien sind nicht gezeigt).
Die Ergebnisse zeigen, dass es Sequenzen gibt, die homolog zur P. multocida-Bakteriophagen-DNA auf beiden Seiten des pmt-Gens sind. Dies untermauert weiterhin die Ansicht, dass sich das pmt-Gen in einem Prophagen befindet.

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Claims

1. Ein DNA-Fragment, das für ein Pasteurella multocida-Toxin codiert, eine Aminosäurensequenz, wie in Figur 10(a) - (j) dargestellt, umfassend, oder das für eine immunogene Subsequenz oder ein Analog des Toxins codiert.

2. Ein DNA-Fragment gemäss Anspruch 1, worin die Nukleotidsequenz von einem Pasteurella multocida-Genom stammt.

3. Ein DNA-Fragment gemäss Anspruch 1, worin die Nukleotidsequenz von einem für Pasteurella multocida infektiösen Bakteriophagen oder von einem Plasmid stammt.

4. Ein DNA-Fragment gemäss Anspruch 1, worin die Nukleotidsequenz aus einer synthetischen Sequenz besteht,

5. Ein DNA-Fragment gemäss Anspruch 1, worin die Nukleotidsequenz aus einer gemischten genomischen und synthetischen Sequenz besteht.

6. Ein DNA-Fragment gemäss Anspruch 1, dessen Sequenz durch Substitution, Addition, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden modifiziert wurde.

7. Ein DNA-Fragment gemäss Anspruch 6, das eine DNA-Subsequenz der Region ist, die für das Pasteurella multocida-Toxin codiert, wobei besagte codierende Region eine Deletion aufweist in der Sequenz , die ein Fragment umspannt, das aus der Gruppe

a, 2331 Nukleotide langen StuI-Restriktionsenzymfragment,

b. 900 Nukleotide langen XbaI-Restriktionsenzymfragment,

c. 395 Nukleotide langen NdeI-Restriktionsenzymfragment,

d. 803 Nukleotide langen NdeI/SnaBI-Restriktionsenzymfragment,

e. 1502 Nukleotide langen HindIII-Restriktionsenzymfragment,

f. 2397 Nukleotide langen HindIII/Stopcodonfragment,

g. 186 Nukleotide langen XhoI/SnaBI-Restriktionsenzymfragment,

h. 1470 Nukleotide langen SnaBI/SpeI-Restriktionsenzymfragment,

i. 1710 Nukleotide langen NsiI-Restriktionsenzymfragment,

j. 1952 Nukleotide langen NsiI/Stopcodonfragment,

k. 682 Nukleotide langen SpeI/Stopcodonfragment,

l. 466 Nukleotide langen EcoRI/Stopcodonfragment,

o. 363 Nukleotide langen BclI-Restriktionsenzymfragment,

p. 900 Nukleotide langen XbaI-Restriktionsenzymfragment,

q. 216 Nukleotide langen EcoRV-Restriktionsenzymfragment und

r. 218 Nukleotide langen Spei/EcoRI-Restriktionsenzymfragment,

ausgewählt ist.

8. Ein DNA-Fragment gemäss einem der Ansprüche 1, 6 oder 7, das weiterhin eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein anderes Polypeptid codiert, das mit der das Toxin oder das Toxinanalog codierenden Nukeotidsequenz fusioniert ist.

9. Ein Expressionsvektor, der sich in einem Wirtsmikroorganismus replizieren kann und in den ein DNA-Fragment gemäss einem der Ansprüche 1 - 8 inseriert ist.

10. Ein Expressionsvektor gemäss Anspruch 9, in welchem das inserierte DNA-Fragment das DNA-Fragment gemäss Anspruch 7 ist.

11. Ein Mikroorganismus, der ein DNA-Fragment gemäss einem der Ansprüche 1 - 8 exprimieren kann und der einen Vektor gemäss Anspruch 9 oder 10 enthält.

12. Ein Mikroorganismus gemass Anspruch 11, der ein Bakterium ist.

13. Ein Mikroorganismus gemäß Anspruch 12, welcher ein gramnegatives Bakterium, insbesondere E. coli, ist.

14. Ein Verfahren zur Herstellung eines Pasteurella multocida Toxine oder einer immunogenen Subsequenz oder eines Analoga davon, umfassend

Züchten eines einen Expressionsvektor gemäss Anspruch 9 oder 10 enthaltenden Mikroorganismus unter zur Expression des Toxins oder der immunogenen Subsequenz oder des Analogs geeigneten Bedingungen,

Ernten des Toxins oder der Toxinsubsequenz oder des Analogs aus der Kultur und

gegebenenfalls Unterwerfen des Toxins einer posttranslationalen Modifikation, um das entgiftete Toxin oder Toxinanalog herzustellen.

15. Ein Verfahren gemäss Anspruch 14, die anfänglichen Schritte

a) des Isolierens eines DNA-Fragments umfassend, das eine wie in Figur 10 (a)-(j) gezeigte Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Toxin oder eine Subsequenz oder ein Analog davon codiert, welches für die immunogene Toxinsubsequenz oder das Analog Codiert,

b) des Inserierens des DNA-Fragments umfassend, gegebenenfalls in geeigneter modifizierter Form, in einen Expressionsvektor, in der Expression des entgifteten Toxins oder Toxinanalogs oder einer Subsequenz oder eines Analogs davon, die für eine inmunogene Subsequenz des Toxins oder des Toxinanalogs codieren, resultierend,

c) des Transformierens eines geeigneten Wirtsmikroorganismus mit dem in Schritt b) hergestellten Vektor umfassend,

16. Ein Verfahren gemäss Anspruch 14 oder 15, worin die Sequenz, die für das Toxin oder Toxinanalog codiert, durch Substitution, Addition, Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Nukleotide der Sequenz modifiziert wird.

17. Ein Vefahren gemäss Anspruch 14 oder 15, worin die gegebenentails durchgeführten posttranslationalen Modifikationen durch thermale Benandlung, Behandlung mit einer Chemikalie und Substitution, Addition, insertion oder Deletion eines oder mehrerer Aminosäuren des Toxins oder Toxinanalogs durchgeführt werden.

18. Ein Verfähren gemäss Anspruch 17, worin die Chemikalie aus Formaldehyd, Glutaraldehyd und einem geeigneten proteolytischen Enzym ausgewählt wird.

19. Ein Verfahren gemäss Anspruch 14, worin der Expressionsvektor gemäss Anspruch 10 angewendet wird.

20. Ein Verfahren gemäss Anspruch 14, worin in den Expressionsvektor ein DNA-Fragment inseriert ist, das die Pasteurella multocida-Toxin codierende Region umfasst, die eine Deletion in der Sequenz des 186 Nukleotide langen Xho/SnaBI-Restriktionsenzymfragments besitzt.

21. Ein Verfahren gemäss Anspruch 14, worin ein DNA-Fragment in den Expressionsvektor inseriert ist, das die Pasteurella multocida-Toxin codierende Region umfasst, die eine Deletion in der Sequenz des 466 Nukleotide langen EcoRI/Stopcodonfragments besitzt.

22. Ein Verfahren gemäss Anspruch 14, worin ein DNA-Fragment in den Expressionsvektör inseriert ist, das die Pasteurella multocida-Toxin codierende Region umfasst, die eine Deletion in der Sequenz des 363 Nukleotide langen BclI-Restriktionsenzymfragments besitzt.

23. Ein Verfahren gemäss Anspruch 14, worin ein DNA-Fragment in den Expressionsvektor inseriert ist, das die Pasteurella multocida-Toxin cödierende Region umfasst, die eine Deletion in der Sequenz dem 216 Nukleotide langen EcoRV-Restriktionsenzymfragments besitzt.

24. Ein apathogener Mikroorganismus, in den ein DNA-Fragment gemäss Anspruch 1 inseriert ist und der in der Lage ist, dieses DNA-Insert zu exprimieren, welches für ein Immunogenes entgiftetes Pasteurella multocida-Toxin oder ein Toxinanalog codiert, zur Verwendung als Lebendvakzine zur Immunisation von Tieren gegen Krankheiten, die von Mikroorganismem verursacht werden, die ein osteolytisches Toxin bilden.

25. Ein Mikroorganismus gemäss Anspruch 24, worin die für das Toxin oder das Toxinanalog codierende Nukleotidsequenz durch Substitution, Addition, Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Nukleotide in der Sequenz modifiziert ist.

26. Ein Mikroorganismus gemäss Anspruch 24, worin die für das Toxin oder das Toxinanalog codierende Nukleotidsequenz auf der äusseren Oberfläche der Wirtszelle exprimiert ist.

27. Ein Mikroorganismus gemäss Anspruch 26, worin die für das Toxin oder das Toxianalog codierende Nukleotidsequenz mit einer anderen ein Oberflächenprotein oder eine Subsequenz davon codierenden Nukleotidsequenz fusioniert ist, welche das Toxin oder das Toxinanalog auf der äusseren Oberfläche der Wirtszelle, gegebenenfalls als Fusionsprotein, zur Expression bringt.

28. Ein Mikroorganismus gemäss Anspruch 27, worin das Oberflächenprotein aus den fimbrialen Proteinen oder Adhäsinen oder des LamB-Proteins von E. coli ausgewählt wird.

29. Ein diagnostisches Mittel zum Nachweis von Pasteurella multocida-Toxin produzierenden Mikroorganismen oder Bakteriophagen, die ein pmt-Gen enthalten, das ein gemäss Anspruch 1 definiertes DNA-Fragment umfasst, an welches eine markierende Substanz gebunden ist.

30. Ein diagnostisches Mittel gemäss Anspruch 29, worin die Markierung aus radioaktiven Isotopen, Enzymen und komplexbildenden Mitteln, z. B. Biotin, ausgewählt ist.

31. Ein Verfahren rum Nachweis des Vorhandenseins eines Pasteurella multocida-Toxin produzierenden Mikroorganismus in einer Probe, worin dar Verfahren ein Vermehren einer für ein Pasteurella multocida-Toxin oder Toxinanalog codierende DNA-Sequenz in besagtem Mikroorganismus durch Polymerasekettenreaktion (PCR) gefolgt von dem ein DNA-Fragment gemäss Anspruch 1 anwendenden Nachweis umfasst, wobei Oligonukleotidsequenzen verwendet werden, die in Wesentlichen zumindest zu einem Teil des in den Ansprüchen 1-8 definierten DNA-Fragments komplementär sind.

32. Ein Verfahren gemäss Anspruch 31, worin das zum Nachweis verwendete DNA-Fragment eine Markierung besitzt.

33. Ein Verfahren gemäss Anspruch 32, worin die Markierung aus radioaktiven Istopen, Enzymen und komplexbildenden Mitteln, wie z. B. Biotin, ausgewählt werden.

34. Ein Impfstoff, der ein Derivat eines Pasteurella multocida-Toxins enthält, das von dem Derivat ausgewählt ist, das von jedem der auf dem DNA-Fragment gemäss Anspruch 7 vorhandenen codierenden Sequenzen codiert werden kann.

35. Ein Imfstoff gemäss Anspruch 34, worin das Toxinderivat ein Derivat von etwa 135 kD ist, das von einem Plasmid, ein gemäss Anspruch 20 definiertes DNA-Fragment umfassend, codiert werden kann.

36. Ein Imfstoff gemäss Anspruch 34, worin das Toxinderivat ein Derivat von etwa 124 kD ist, das von einem Plasmid, ein gemäss Anspruch 21 definiertes DNA-Fragment umfassend, codiert werden kann.

37. Ein Imfstoff gemäss Anspruch 34, worin das Toxinderivat ein Derivat von etwa 133 kD Ist, das von einem Plasmid, ein gemäss Anspruch 22 definiertes DNA-Fragment umfassend, codiert werden kann.

38. Ein Imfstoff gemäss Anspruch 34, worin das Toxinderivat ein Derivat von etwa 127 kD ist, das von einem Plasmid, ein gemäss Anspruch 23 definiertes DNA-Fragment umfassend, codiert werden kann.

39. Ein Impfstoff gemäss einem der Ansprüche 34 - 38, worin das Derivat mit einem anderen Polypeptid fusioniert ist

40. Ein Impfstoff gemäss Anspruch 39, worin das Polypeptid, mit dem das Derivat fusioniert ist, aus Rinderserumalbumin, Ovalbumin, dem Hämocyanin der Schlüssellochschnecke und Lysozym ausgewählt ist.