DE68923286T2

DE68923286T2 - Impfstoffe und testsätze für haemophilus influenzae.

Info

Publication number: DE68923286T2
Application number: DE68923286T
Authority: DE
Inventors: Algis Anilionis; Robert Deich; Bruce Green; Robert Seid; Gary Zlotnick
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1988-09-01
Filing date: 1989-08-31
Publication date: 1996-03-07
Anticipated expiration: 2009-09-01
Also published as: DE68923286D1; EP0432220A4; AU3379693A; CA1340888C; JP3073212B2; EP0432220B1; AU651030B2; KR900701291A; WO1990002557A1; DK35891D0; DK35891A; DK174965B1; AU631378B2; KR0170752B1; EP0432220A1; JPH04502147A; ATE124420T1; KR0162488B1; AU4228889A

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen und verwandten Peptiden, abgeleitet von zwei Außenmembranproteinen von Haemophilus influenzae. Insbesondere betrifft die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen und verwandten Peptiden, umfassend Sequenzen von Außenmembranproteinen mit einem Molekulargewicht von etwa 16 000 Dalton, das heißt PBOMP-1 und PBOMP-2, von Typ b und nichttypisierbaren H. influenzae. Solche Proteine und Peptide werden als Immunogene in Impfstofformulierungen zur aktiven Immunisierung und zur Erzeugung von Antikörpern zur Verwendung bei der passiven Immunisierung und als Reagenzien in diagnostischen Assays verwendet.
Diese Proteine und Peptide können durch Reinigungsverfahren aus H. influenzae, die nachstehend beschrieben werden, erhalten werden oder unter Verwendung von entweder rekombinanter DNA oder chemisch synthetischen Methoden erzeugt werden. Zusätzlich betrifft die Erfindung neue DNA-Sequenzen und Vektoren, die zur spezifischen Expression von PBOMP-1 :-PBOMP-2- und PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsproteinen und verwandten Peptiden geeignet sind. Die Nucleotidsequenzen werden als Reagenzien in Nucleinsäure-Hybridisierungsassays verwendet.

2. Hintergrund der Erfindung

2.1. Rekombinante DNA-Technologie und Genexpression

Rekombinante DNA-Technologie bezieht die Insertion von spezifischen DNA-Sequenzen in ein DNA-Vehiculum (Vektor) unter Bildung eines rekombinanten DNA-Moleküls ein, das in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu replizieren. Im allgemeinen ist die inserierte DNA-Sequenz hinsichtlich des empfangenen DNA-Vehiculums fremd, das heißt die inserierte DNA- Sequenz und der DNA-Vektor sind von Organismen abgeleitet, die in der Natur keine genetische Information austauschen oder die inserierte DNA-Sequenz kann völlig oder teilweise synthetisch hergestellt sein.
Einige allgemeine Verfahren wurden entwickelt, die es ermöglichen, rekombinante DNA-Moleküle zu konstruieren. Beispielsweise beschreiben Cohen und Boyer in US-A-4 237 224 die Herstellung von solchen rekombinanten Plasmiden unter Verwendung der Aufspaltung mit Restriktionsenzymen und Verbindung mit DNA-Ligase durch bekannte Ligierungsverfahren. Diese rekombinanten Plasmide werden dann mit Hilfe von Transformation eingeführt und in unizellulären Kulturen, einschließlich procaryotischen Organismen und eucaryotischen Zellen, in Gewebskulturen gezüchtet. Aufgrund der allgemeinen Anwendbarkeit dieser darin beschriebenen Verfahren wird US-A-4 237 224 hinsichtlich seiner Offenbarung durch diesen Hinweis in die vorliegende Beschreibung aufgenommen.
Ein weiteres Verfahren zur Einführung rekombinanter DNA-Moleküle in unizelluläre Organismen wird von Collins und Hohn in US-A-4 304 863 beschrieben, das ebenfalls durch Hinweis aufgenommen wird. Dieses Verfahren nutzt ein Verpakkungs/Transduktionssystem mit Bakteriophagen-Vektoren (Cosmiden).
Rekombinante Gene können ebenfalls in Viren eingeführt werden, wie Pockenvirus. Rekombinante Viren werden durch Transfektion von Plasmiden in mit Viren infizierten Zellen erzeugt.
Ungeachtet des Verfahrens, das zur Konstruktion verwendet wird, muß das rekombinante DNA-Molekül mit der Wirtszelle kompatibel sein, das heißt in der Lage sein, autonom in der Wirtzelle zu replizieren oder stabil in eines der Wirtszellenchromosome integriert werden. Das rekombinante DNA-Molekül oder der Virus (beispielsweise eine Pockenvirusrekombinante) sollten auch eine Markerfunktion aufweisen, die die Selektion der gewünschten rekombinanten DNA-Moleküle oder des gewünschten rekombinanten DNA-Moleküls oder Viren oder Virus gestattet. Wenn außerdem alle der geeigneten Replikations-, Transkriptions- und Translationssignale richtig auf dem rekombinanten DNA-Molekül angeordnet sind, wird das Fremdgen in richtiger Weise in den transformierten Bakterienzellen exprimiert, wie im Fall mit bakteriellen Expressionsplasmiden oder in erlaubten Zellinien, infiziert mit einem rekombinanten Virus oder einem rekombinanten Plasmid, das einen eucaryotischen Replikationsstartpunkt trägt.
Verschiedene genetische Signale und Verarbeitungsereignisse steuern zahlreiche Stufen der Genexpression, beispielsweise DNA-Transkription und Boten-RNA (mRNA)-Translation. Transkription von DNA ist von der Anwesenheit eines Promotors abhängig, der eine DNA-Sequenz darstellt, die die Bindung von RNA-Polymerase steuert und dadurch die mRNA-Synthese fördert. Die DNA-Sequenzen von eucaryotischen Promotoren weichen von jenen procaryotischer Promotoren ab. Außerdem dürfen eucaryotische Promotoren und damit einhergehende genetische Signale nicht in einem procaryotischen System erkannt werden oder dürfen nicht in einem procaryotischen System wirken und zum anderen werden in eucaryotischen Zellen procaryotische Promotoren nicht erkannt und wirken nicht.
In ähnlicher Weise hängt die Translation von mRNA in Procaryonten von der Anwesenheit der richtigen procaryotischen Signale ab, die von jenen der Eucaryonten abweicht. Effiziente Translation von mRNA in Procaryonten erfordert eine ribosome Bindungsstelle, genannt die Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz auf der mRNA. Diese Sequenz ist eine kurze Nucleotidsequenz der mRNA, die vor dem Startcodon angeordnet ist, gewöhnlich AUG, das das aminoendständige Methionin des Proteins codiert. Die SD-Sequenzen sind zu dem 3'-Ende der 165 rRNA (ribosomalen RNA) komplementär und fördern wahrscheinlich die Bindung von mRNA an Ribosomen durch Duplexbildung mit der rRNA zur korrekten Positionierung des Ribosoms. Für einen Überblick über maximal gestaltete Genexpression, vergleiche Roberts und Lauer, 1979, Methods in Enzymology 68:473.
Viele andere Faktoren komplizieren die Expression von Fremdgenen in Procaryonten, auch nachdem geeignete Signale inseriert wurden und in geeigneter Weise positioniert wurden. Einer solcher Faktoren ist die Anwesenheit eines aktiven proteolytischen Systems in E. coli und anderen Bakterien. Dieses proteinabbauende System scheint abnorme oder Fremdproteine selektiv zu zerstören. Ein ungeheurer Nutzen würde daher durch die Bereitstellung einer Maßnahme zum Schutz von eucaryotischen Proteinen, exprimiert in Bakterien, gegen proteolytischen Abbau bereitgestellt werden. Eine Strategie ist die Konstruktion hybrider Gene, in denen die Fremdsequenz in Phase ligiert ist (das heißt, im korrekten Leseraster) in einem procaryotischen Gen. Expression dieses Hybridgens führt zu einem Fusionsproteinprodukt (ein Protein, das ein Hybrid von procaryotischen und Fremdaminosäuresequenzen ist).
Geeignete Expression eines klonierten Gens erfordert wirksame Transkription von DNA, Translation von mRNA und in einigen Fällen posttranslationale Modifizierung des Proteins. Expressionsvektoren wurden verwendet zur Expression von Genen in einem geeigneten Wirt und zur Erhöhung der Proteinerzeugung. Das klonierte Gen sollte in Nachbarschaft zu einem starken Promotor angeordnet werden, der steuerbar ist, so daß die Transkription zum erforderlichen Zeitpunkt in Gang gesetzt werden kann. Zellen können zu einer hohen Dichte gezüchtet werden und dann der Promotor zur Erhöhung einer Vielzahl von Transkripten induziert werden. Diese führen, sofern effizient translatiert, zu hohen Proteinausbeuten. Dies ist ein besonders wertvolles System, wenn das Fremdprotein für die Wirtszelle schädlich ist.

2.1.1 E. coli als Wirtssystem zur Expression

Die meisten Plasmidklonierungsvektoren, die üblicherweise in E. coli verwendet werden, sind Derivate von Co1E1- Typ-Replicons (für zusätzliche Information, siehe Oka et al., 1979, Mol. Gen. Genet. 172:151 bis 159). Die Co1E1-Plasmide werden in E. coli-Stämmen als monomere Moleküle mit einer Kopiezahl von etwa 15 bis 20 Kopien pro Chromosom stabil gehalten. Verschiedene Expressionsgrade von menschlichen und tierischen Proteinprodukten von Fremdgenen, inseriert in diese Plasmide, wurden erhalten. Sehr hohe Expressionsgrade sollten jedoch erhalten werden, damit das System zur Herstellung von Fremdproteinprodukten wirtschaftlich ausführbar wird.
Ein Weg, um große Mengen eines gegebenen Genprodukts zu erhalten, ist, ein Gen auf ein Plasmid zu klonieren, das eine sehr hohe Kopiezahl innerhalb der bakteriellen Zelle aufweist. Theoretisch sollten durch Erhöhung der Kopiezahlen eines bestimmten Gens die mRNA-Spiegel sich ebenfalls erhöhen, was zu einer erhöhten Produktion von rekombinantem Protein führen sollte.

2.1.2 Pockenvirus als Expressionsvektor

Der Pockenvirus kann als Klonierungs- und Expressionsvektor verwendet werden. Der Virus enthält ein lineares doppelsträngiges DNA-Genom und etwa 187 kB-Paare, die innerhalb des Zytoplasmas von infizierten Zellen replizieren. Diese Viren enthalten ein vollständiges transkriptionales Enzymsystem (einschließlich überkappenden, methylierenden und polyadenylierenden Enzymen) innerhalb des Viruskerns, die zur Virusinfektiosität erforderlich sind. Die transkriptionalen regulatorischen Sequenzen (Promotoren) vom Pockenvirus erlauben den Start der Transkription durch Pocken-RNA-Polymerase, jedoch nicht durch eucaryotische RNA-Polymerase.
Expression von Fremd-DNA in rekombinanten Viren erfordert die Fusion von Pockenpromotoren an Protein kodierende Sequenzen des Fremdgens. Plasmidvektoren, auch genannt Insertionsvektoren, wurden zur Insertion des chimären Gens in den Pockenvirus konstruiert. Eine Art des Insertionsvektors besteht aus: (1) einem Pockenviruspromotor, einschließlich der transkriptionalen Startstelle; (2) verschiedenen einmaligen Restriktionsendonucleasen-Klonierungsstellen stromabwärts von der transkriptionalen Startstelle zur Insertion von Fremd- DNA-Fragmenten; (3) nicht wesentliche Pockenvirus-DNA (wie das TK-Gen), die den Promotor flankiert und Klonierungsstellen, die die Insertion des chimären Gens in den homologen, nicht wesentlichen Bereich des Virusgenoms richten; und (4) einen bakteriellen Replikationsstartpunkt und antibiotische Resistenzmarker zur Replikation und Selektion in E. coli. Beispiele solcher Vektoren werden bei MacKett (1984, J. Virol. 49: 857 bis 864) beschrieben.
Rekombinante Viren werden durch Transfektion von rekombinanten bakteriellen Insertionsplasmiden, die das Fremdgen in mit Pockenvirus infizierten Zellen enthalten, erzeugt.
Homologe Rekombination findet innerhalb der infizierten Zellen statt und führt bei der Insertion des Fremdgens zu dem viralen Genom. Rekombinante Viren können unter Verwendung von immunologischen Techniken abgesucht und anschließend isoliert werden, wie DNA-Plaquehybridisierung oder genetische Selektion. Diese Pockenrekombinanten verbleiben bei ihren wesentlichen Funktionen und ihrer Infektiosität und können zur Unterbringung etwa 35 kB Fremd-DNA konstruiert werden.
Expression eines Fremdgens kann durch enzymatische oder immunologische Assays angezeigt werden [beispielsweise Immunopräzipitation, enzymgebundenes Immunsorbentassay (enzyme-linked immunosorbent assay) (ELISA), Radioimmunoassay oder Immunoblotting]. Zusätzlich werden natürlich vorkommende Meinbranglycoproteine, hergestellt durch rekombinante Pockenvirus infizierte Zellen, glycosyliert und können zu der Zelloberfläche transportiert werden. Hohe Expressionsgrade können durch Verwendung starker Promotoren oder durch Klonierung von Mehrfachkopien eines einzelnen Gens in geeigneten Vektoren und geeigneten Wirten erhalten werden.

2.1.3 Baculoviren als Expressionsvektor

Ein Baculovirus, wie Autographica californica Kernpolyhedrosisvirus (AcNPV), kann ebenfalls als Klonierungs- oder Expressionsvektor verwendet werden. Die infektiöse Form von AcNPV trifft man normalerweise in einer viralen Occlusion an. Diese Struktur ist größtenteils zusammengesetzt aus Polyhedrinpeptid, worin die Virusteilchen eingebettet sind. Polyhedringenexpression findet sehr spät im Infektionszyklus statt, nachdem reife Virusteilchen gebildet wurden. Polyhedringenexpression ist daher eine unabdingbare Funktion, das heißt, nicht occludierte Virusteilchen, hergestellt in Abwesenheit von Polyhedringenexpression, sind vollständig aktiv und in der Lage, Zellen in der Kultur zu infizieren. Gemäß der Europäischen Anmeldung Nr. 84 10 5841.5, Smith et al., wird ein rekomoinanter Baculovirus-Expressionsvektor durch Schneiden von Baculovirus-DNA unter Herstellung eines Fragments, das ein Polyhedringen oder einen Teil davon umfaßt Inserieren dieses Fragments in ein Klonierungsvehiculum und anschließend Inserieren des zu exprimierenden Gens derart, daß es unter Steuerung des Polyhedrin-Genpromotors kommt, hergestellt. Der in dieser Weise gebildete rekombinante Transfervektor wird mit Baculovirus-Helfer-DNA vermischt und zur Transfektion von Insektenzellen in der Kultur verwendet, unter Bewirkung von Rekombination und Einschluß des ausgewählten Gens am Polyhedringenort des Baculovirus-Genoms. Der erhaltene rekombinante Baculovirus wird zur Infektion anfälliger Insekten verwendet oder in Insektenzellen gezüchtet.

2.2 Haemophilus influenzae und Erkrankung

H. influenzae werden in zwei Gruppen eingeteilt. Jene Stämme, die eine bekannte Kapsel aufweisen, werden durch serologische Reaktion der Kapsel mit Referenzantisera typisiert. Es wurden Typen a - f identifiziert. Stämme, die nicht mit einem der Referenzantisera reagieren, sind nichttypisierbar.
H. influenzae Typ b (Hib) ist die häufigste Ursache neonataler Meningitis und anderer invasiver Infektionen in den Vereinigten Staaten (Fraser et al., 1974, Am. J. Epidemiol. 100:29-34). Das hauptsächliche Vorkommen von Kindheitsmeningitis findet man zwischen dem Lebensalter von 1 - 5 Jahren. 60 % der Meningitisfälle aufgrund Hib treten bei Kindern im Alter unter 2 Jahren auf (Fraser et al., siehe vorstehend).
Es ist nun allgemein anerkannt, daß nichttypisierbare H. influenzae ebenfalls Erkrankungen, einschließlich Pneumonie, Bakteriämie, Meningitis, Sepsis Post partum und akuter fieberhafter Tracheobronchitis bei Erwachsenen hervorrufen (Murphy et al., 1985, J. Infect. Diseases 152:1300-1307). Nichttypisierbare H. influenzae sind ein häufiger ätiologischer Erreger von Otitis media bei Kindern und Jugendlichen. Tatsächlich können etwa 20 - 40 % aller Fälle von Otitis media H. influenzae zugerechnet werden. Kindern können Mehrfachinfektionen desselben Organismus widerfahren, da die Infektion keine Langzeitimmunität überträgt. Derzeitig wird chronische oder wiederholte Otitis media durch Verabreichung von Antibiotika, notfalls erforderlich durch Drainage des Innenohrs, behandelt. H. influenzae-Stämme sind auch als eine primäre Ursache an Sinusitis beteiligt (Cherry J.D. und J.P. Dudley, 1981, in Textbook of Pediatric Infectious Diseases, Feigin und Cherry, Hrsg., Seite 103-105). Außerdem rufen nichttypisierbare H. influenzae neonatale Sepsis hervor.
Gegen das Kapselpolysaccharid von H. influenzae vom Typ b (Hib) erzeugtes Antiserum, nämlich Polyribosylribitolphosphat (PRP), wurde als bakterizid und schützend gegen Hib gefunden (Smith et al., 1973, Pediatrics 52:637-644; Anderson, et al., 1972, J. Clin. Inv. 51:31-88). Anti-PRP-Antikörper, sind jedoch gegen nichttypisierbare H. influenzae-Infektion unwirksam.

2.3 Impfstoffe gegen H. influenzae

Der ideale Kandidat für einen Haemophilus-Impfstoff würde drei Eigenschaften aufweisen: (a) er würde für Säuglinge von 2 bis 6 Monaten immunogen sein, (b) würde einen Antikörper hervorrufen, der gegen Infektionen, verursacht durch typisierbare und nichttypisierbare H. influenzae, schützen würde und (c) würde einen Antikörper gegen eine Determinante hervorrufen, die auf der Oberfläche aller Stämme von H. influenzae gefunden wird.
Die derzeitig verfügbaren Impfstoffe, die gegen Hib- Infektionen schützen, bestehen im wesentlichen aus PRP, dem Kapselpolysaccharid Typ b. Gereinigtes PRP-Polysaccharid ist immunogen bei Kindern mit einem Alter von mehr als 18 Monaten, ruft jedoch keine schützende Antikörperantwort bei jenen, die jünger als 18 Monate sind, hervor. Im allgemeinen wurde gezeigt, daß Polysaccharide bei Kindern mit einem Alter von weniger als 18 Monaten schwach immunogen sind.
Um dieses Problem anzugehen, begannen verschiedene Laboratorien Untersuchungen, bei denen PRP entweder chemisch an ein Proteinträgermolekül gekuppelt wird (Anderson et al., 1985, Ped. Res. 18:252A) oder mit Proteinmolekülen vermischt werden (Monji et al., 1986, Infect. Immun. 51:865 bis 871) und an Tiere oder Menschen verabreicht wird. Konjugation von PRP an Protein zeigt erwiesenermaßen eine anti-PRP-Antikörperantwort bei Säuglingen mit einem Alter von 6 Monaten, während ein Gemisch von PRP mit einigen Proteinen anti-PRP-Antikörper bei Jungtieren erzeugt hat (Monji et al., s.o.).
Obwohl das Konjugat und das Gemisch von Impfstofformulierungen eine Schwierigkeit von PRP-Impfstoffen anspricht, das heißt ihre Unfähigkeit, Säuglinge mit einem Alter von weniger als 18 Monaten zu schützen, heben sie nicht auf ein weiteres Hauptproblem des PRP-Impfstoffes ab. Anti-PRP-Antikörper sind gegen nichttypisierbare H. influenzae unwirksam, die per definitionem keine PRP-Kapsel aufweisen. Folglich besteht ein lang erkanntes Bedürfnis nach einem Impfstoff, der eine schützende Immunantwort bei Kindern von etwa 18 Monaten und jünger hervorrufen wird gegen sowohl typisierbare, einschließlich b und nichttypisierbare H. influenzae.
Die internationale Anmeldung WO-A-8804932, die sich mit Peptiden und Proteinen befaßt betrifft ein Außenmembranprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 16 000 Dalton von Haemophilus influenzae, genannt "Praxis Biologics Outer Membrane Protein-1" (PBOMP-1) und ein antigenisch verwandtes Außenmemoranprotein von Haemophilus influenzae mit einem Molekulargewicht von etwa 16 000 Dalton, genannt "Praxis Biologics Outer Membrane Protein-2" (PBOMP-2) sowie die molekular geklonten Gene oder Genfragmente, die diese Peptide oder Proteine codieren. Diese Druckschrift offenbart die Verwendung solcher Proteine bei Impfstoffen und Diagnoseassays für Haemophilus influenzae. Die Offenbarung dieser Druckschrift wird daher in vorliegende Anmeldung aufgenommen, da der in der vorliegenden Erfindung zitierte, zugrundeliegende Prozeß der gleiche ist wie der in diesem Dokument verwendete und die grundsätzlichen Proteine, von denen die vorliegende Erfindung abgeleitet wird, vollständig in diesem Dokument beschrieben werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Impfstofformulierung, die eine schützende Immunantwort gegen typisierbare H. influenzae, einschließlich Typ b und nichttypisierbare H. influenzae bei Kindern unter 6 Monaten sowie bei älteren Kindern und Erwachsenen hervorruft. Eine Ansatzmöglichkeit der vorliegenden Erfindung ist die Impfung mit einem Fusionsprotein oder Fragment davon, umfassend Sequenzen von zwei Außenmembranproteinen, die auf der Oberfläche von Haemophilus freiliegen. Der beste Kandidat ist ein Fusionsprotein, das Sequenzen von zwei Außenmembranproteinen von H. influenzae umfaßt, das heißt (PBOMP-2 und PBOMP-1). Außenmemoranproteine sind gewöhnlich an der Oberfläche exponierte Moleküle. Sie sind aus Protein zusammengesetzt das normalerweise bei Kindern immunogen ist, und es wurde von ihnen gezeigt, daß sie in der Lage sind, schützende Antikörper in anderen Bakteriensystemen hervorzurufen (Sugasawara et al., 1983, Infect. Immun. 42:980-985).
Außerdem wurde gezeigt, daß Hi- und Hib-Stämme ähnliche OMP-Profile aufweisen (Loeb und Smith, 1980, Infect. Immun. 30:709717). Antikörper zu OMP von Haemophilus könnten sowohl bakterizid als auch opsonisch sein, viel mehr als anti-PRP sich als bakterizid und opsonisch für Hib erwies (Anderson et al., 1972, J. Clin, Invest. 51:31-38, Cates et al., 1985, Infect. Immun. 48:183-189). Ein Außenmembranprotein hat den zusätzlichen Vorteil, daß es Hi und Hib gemeinsam ist und gegen beide Bakterienarten schützen könnte.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide und Proteine, verwandt zu einem PBOMP-1:PBOMP-2- oder PBOMP-2:PBOMP- 1-Fusionsprotein sowie molekular geklonte Gene oder deren Genfragmente, die diese Peptide oder Proteine codieren. In der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen, die beigefügt sind, ist PBOMP-1 vorgesehen, ein Außenmembranprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 16 000 Dalton von Haemonhilus influenzae zu bedecken, identifiziert durch die Anmelder und genannt "Praxis Biologics Outer Membrane Protein-1", während PBOMP-2 vorgesehen ist, ein verwandtes Außenmembranprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 16 000 Dalton von Haemophilus influenzae zu bedecken, ebenfalls identifiziert durch die Anmelder und genannt "Praxis Biologics Outer Membrane Protein-2". In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung umfassen chemisch synthetisierte Peptide einen antigenen Bereich oder antigene Bereiche von PBOMP-1 und PBOMP-2. Die Peptide werden an einen Proteinträger konjugiert zur Erzeugung eines immunogenen Peptidkonjugats. Die Peptide oder Proteine der vorliegenden Erfindung können als Immunogene in Impfstofformulierungen für H. influenzae oder als Reagenzien in diagnostischen Immunassays für H. influenzae verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum molekularen Klonieren von Genen oder Genfragmenten, die für Peptide, verwandt zu PBOMP-1:PBOMP-2- und PBOMP-2: PBOMP-1-Fusionsprotein codieren. Diese molekular geklonten Sequenzen können dann in einer weiteren Konstruktion von anderen Vektoren durch rekombinante DNA-Techniken, einschließlich Expressionsvektoren für die codierten Peptidprodukte, verwendet werden oder in diagnostischen Assays für H. influenzae auf der Grundlage von Nucleinsäurehybridisierung oder in einer Konstruktion einer Sequenz, die für PBOMP-1:PBOMP-2- oder PBOMP-2: PBOMP-1-Fusionsprotein codiert verwendet werden.
Die Peptide oder Proteine der vorliegenden Erfindung können aus H. influenzae gereinigt werden oder unter Verwendung von rekomoinanten DNA-Techniken in einem beliebigen Vektor-Wirts-System hergestellt werden oder durch chemische Verfahren synthetisiert werden. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung auch die Konstruktion neuer DNA-Sequenzen und Vektoren, einschließlich Plasmid-DNA und viraler DNA, wie menschliche Viren, tierische Viren, Insektenviren oder Bacteriophagen, die verwendet werden können, um Expression von PBOMP-1:PBOMP-2-verwandten Peptiden oder Proteinen zu steuern, wie PBOMP-1:PBOMP-2- oder PBOMP-2:PBOMP-1-verwandte Peptide oder Proteine in geeigneten Wirtszellen, aus denen die Peptide und Proteine gereinigt werden können. Chemische Verfahren zur Synthese von PBOMP-1- und PBOMP-2-verwandten Peptiden und Proteinen werden beschrieben.
PBOMP-1:PBOMP-2- und PBOMP-2:PBOMP-1-verwandte Peptide und Proteine können als Immunogene in Untereinheits- Impfstofformulierungen zur Verwendung gegen alle pathogenen H. influenzae verwendet werden, einschließlich sowohl Typ b als auch nichttypisierbare H. influenzae. PBOMP-1- und PBOMP- 2-verwandte Proteine oder Peptide können durch chemische Synthese, Reinigung aus H. influenzae oder Reinigung aus rekombinanten Expressionsvektorsystemen erhalten werden. PBOMP-1: PBOMP-2- und PBOMP-2:PBOMP-1-verwandte Proteine oder Peptide für Untereinheits-Impfstofformulierungen können durch Reinigung aus rekombinanten Expressionsvektorsystemen oder durch chemische Synthese erhalten werden. Alternativ dazu können rekombinante Viren, die PBOMP-1:PBOMP-2- oder PBOMP-2:PBOMP- 1-verwandte-Peptide oder Proteine selbst erzeugen oder Extrakte von Zellen, infiziert mit solchen rekombinanten Viren, als Immunogene in viralen Impfstofformulierungen verwendet werden. Da das PBOMP-1: PBOMP-2- oder PBOMP-2: PBOMP-1- Fusionsprotein als "fremd" in der Wirtszelle erkannt wird, wird eine humorale oder möglicherweise eine zellvermittelte Immunantwort induziert, die gegen PBOMP-1: PBOMP-2 oder PBOMP-2: PBOMP-1 gerichtet ist. In einer geeignet zubereiteten Impfstofformulierung sollte dies den Wirt gegen folgende H. influenzae-Infektionen schützen.
Die vorliegenden Untereinheits-Impfstofformulierungen sollten außerdem mit derzeit verfügbaren PRP-Impfstoffen kompatibel sein.
PBOMP-1:PBOMP-2- und PBOMP-2:PBOMP-1-verwandte Sequenzen der vorliegenden Erfindung können in humanmedizinischen Assays verwendet werden. Diese schließen die Verwendung von Peptiden und Proteinen der vorliegenden Erfindung als Reagenzien in Immunassays, wie ELISA-Tests und Radioimmunassays, ein, die als diagnostische Mittel zum Nachweis von H. influenzae-Infektion in Blutproben, Körperflüssigkeit, Gewebe, usw. geeignet sind. Die PBOMP-1:PBOMP-2- und PBOMP-2: PBOMP-1-codierenden Gensequenzen können in DNA-DNA- oder DNA- RNA-Hybridisierungsassays für ähnliche diagnostische Nachweise von H. influenzae verwendet werden. Zusätzlich liefern diese Reagenzien ein wertvolles Mittel bei der Aufklärung der Mechanismen der Pathogenese von H. influenzae.
Die vorliegende Erfindung ist außerdem auf anti- PBOMP-1: PBOMP-2- und/oder anti-PBOMP-2: PBOMP-1-monoklonale Antikörper gerichtet, die in passiven Immunisierungsabfolgen und in Diagnoseimmunassays verwendet werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können monoklonale Antikörper gegen PBOMP-1:PBOMP-2- und/oder PBOMP-2:PBOMP-1-verwandte Peptide erzeugt werden.

4. Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Die vorliegende Erfindung wird durch Hinweis auf die nachstehende genaue Beschreibung und Beispiele der speziellen Ausführungsformen sowie durch die beigefügten Zeichnungen besser verstanden.
Figur 1 zeigt eine Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid gelelektrophoretische Analyse (SDS-PAGE) von PBOMP-1. Proben und Gele wurden wie in Abschnitt 6.1 beschrieben hergestellt. Bahn 1 enthält etwa 5 ug PBOMP-1. Bahn 2 enthält vorgefärbte Standards niederen Molekulargewichts (MW): aus Ovalbumin, alpha-Chymotrypsinogen, beta-Lactoglobulin, Lysozym, Rindertrypsininhibitor und Insulin (A- und B-Ketten). Relative Molekulargewichte [in Kilodaltons (kD)] sind an der Seite dargestellt.
Figur 2 (A und B) zeigen die Reaktivität von Ganzzellenlysaten von E. coli und H. influenzae mit polyklonalen anti-PBOMP-1-Antikörpern und monoklonalen anti-PBOMP-1-Antikörpern (G1-1). In Figur 2A werden Lysate mit polyklonalen anti-PBOMP-1-Antikörpern umgesetzt. Die Bahnen sind wie nachstehend: (1) E. coli HB101; (2) E. coli JM83; (3) Molekulargewichtsstandards; (4) gereinigtes PBOMP-1, erhalten aus gezüchteten H. influenzae-Zellen. In Figur 2B wurden Lysate mit monoklonalen anti-PBOMP-1-Antikörpern umgesetzt. Die Bahnen sind wie in Figur 2A beschrieben.
Figur 3 gibt die Restriktionskarte von pGD103, einem Derivat von pLG339 (siehe Stoker et al., 1982, Gene 18:335- 41) wieder.
Figur 4 (A und B) gibt die Karten von pAA152 wieder, das ein 4,2 kB-Fragment von H. influenzae DNA, kloniert in pGD103, umfaßt. Ein Gen, das für PBOMP-1 codiert, wird auf einem 737 Bp BgIII-BamHI-Fragment lokalisiert. Figur 4A ist eine kreisförmige Restriktionskarte von pAA152. Figur 4B erläutert die Deletionsanalyse von inseriertem Fragment von pAA152. Die verbliebene H. influenzae-DNA in den Deletionsderivaten wird durch schwarze Linien ausgewiesen. PBOMP-Phenotyp wird rechts gekennzeichnet.
Figur 5 gibt die Reaktivität von Ganzzellenlysaten von E. coli JM83, enthaltend pAA152 mit individuellen monoklonalen Antikörpern wieder, die mit verschiedenen Epitopen von PBOMP-1 reagieren. Die Bahnen sind wie nachstehend: (A) monoklonaler Antikörper G1-1; (b) monoklonaler Antikörper G94-3; (C) monoklonaler Antikörper G18-3; (D) monoklonaler Antikörper 25-2 und (E) monoklonaler Antikörper G2-3.
Figur 6 gibt eine Autoradiographieanalyse von DS410- Minizellen, enthaltend rekombinante Plasmide pAA130 und pAA152 wieder. Molekulargewichtsstandards sind wie links an der Zeichnung ausgewiesen. Die Bahnen geben wieder: (A) DS410 (pAA130); (B) DS410 (pGD103) und (C) DS410 (pAA152). Der Ort von Kanamycinaminoglycosidase wird rechts von der Zeichnung gekennzeichnet.
Figur 7 (A und B) gibt Karten von pAA130 wieder, umfassend ein 5,7 kB-Fragment von H. influenzae DNA, kloniert in pGD103. Figur 7A gibt eine kreisförmige Restriktionskarte von pAA130 wieder. Figur 7B gibt eine Deletionsanalyse von H. influenzae inseriertem Fragment von pAA130 wieder. Durchgehende schwarze Linien weisen verbliebene H. influenzae-DNA in den Deletionsderivaten aus. PBOMP-Phänotyp wird rechts gekennzeichnet. Ein für PBOMP-2 codierendes Gen wird auf einem 781 Bp BstEII-XmnI-Fragment lokalisiert.
Figur 8 gibt die Reaktivität von Ganzzellenlysaten von E. coli JM83 und E. coli JM83, enthaltend pAA130 mit polyklonalem anti-PBOMP-1-Antiserum, wieder. Die Bahnen geben wieder: (A) JM83, enthaltend pAA130; (B) JM83, enthaltend pAA130; (C) JM83; (D) JM83; (E) Molekulargewichtsstandards, wie in Kilodalton an der rechten Seite der Figur ausgewiesen und (F) Hi S-2.
Figur 9 gibt die DNA-Sequenzierungsstrategie des 737 Bp-Insertfragments von pAA152 wieder, das den Ursprung, die Richtung und das Ausmaß der Sequenz, bestimmt von verschiedenen Klonen, zeigt. Der Pfeil im unteren Bereich zeigt die Anordnung des offenen Hauptleserasters (ORF).
Figur 10 gibt die Nucleotidsequenz von dem 737 Bp- Fragment wieder, das PBOMP-1-Gen enthält. Das vorausgesagte offene Leseraster (ORF) wird durch die unterstrichene Sequenz und die Richtung der Transkription durch den Pfeilkopf angezeigt.
Figur 11 gibt die gefolgerte Aminosäuresequenz von PBOMP-1 wieder. Die Nucleotidsequenz wird auf der oberen Linie ausgewiesen und die entsprechende Aminosäuresequenz darunter. Die innerhalb des Kastens eingeschlossene Aminosäure gibt die vorausgesagte N-terminale Aminosäure der reifen Form des Proteins wieder.
Figur 12 gibt die Ausrichtung der Teilaminosäuresequenz eines Peptids, abgeleitet von PBOMP-1 (unten) mit einem Teil der abgeleiteten Aminosäuresequenz des PBOMP-1-Gens (oben), wieder. Die innerhalb des Kastens eingeschlossenen Reste geben fehlende Übereinstimmung wieder.
Figur 13 gibt eine Sequenzierungsstrategie des 789 Bp BstEII-XmnI-Fragments von pAA130 wieder, das den Ursprung, die Ausrichtung und das Ausmaß der Sequenz, bestimmt für jeden Klon, zeigt. Der Pfeil im unteren Bereich weist den Ort des hauptsächlichen Leserasters (ORF) aus.
Figur 14 zeigt die Nucleotidsequenz des 789 Bp BstEII-XmnI-Fragments von pAA130, das das PBOMP-2-Gen enthält. Der vorbestimmte ORF wird durch die unterstrichene Sequenz dargestellt. Die Transkriptionsrichtung wird durch den Pfeilkopf dargestellt. Die zwei mit "N" bezeichneten Basen geben unbekannte Nucleotide wieder.
Figur 15 gibt die gefolgerte Aminosäuresequenz von PBOMP-2 wieder. Die Nucleotidsequenz wird oberhalb ausgewiesen und die entsprechende Aminosäuresequenz darunter. Der innerhalb des Kastens eingeschlossene Rest gibt die vorbestimmte N-terminale Aminosäure der reifen Proteinform wieder.
Figur 16 gibt ein Chromatogramm wieder, erhalten durch Gasflüssigchromatographie von Fettsäuren, von PBOMP-1. Nonadecansäure (C 19) war als innerer Standard einbezogen.
Figur 17 gibt autoradiographische SDS-PAGE-Analyse von E. coli JM83-Zellen, enthaltend rekombinante Plasmide pAA130 und pAA152 sowie als Kontrolle E. coli JM83-Zellen, enthaltend pGD103, wieder. Die Bahnen geben wieder: (1) pAA130; (2) pAA152 und (3) pGD103. Die Anordnung einer Bande von etwa 15 000 Dalton Molekulargewicht wird links auf der Zeichnung markiert.
Figur 18 (A und B) gibt Western-Blot-Gelanalyse von Ganzzellenlysaten von E. coli JM83, enthaltend pAA130 oder pAA152 in Gegenwart oder Abwesenheit von Globomycin, wieder. Molekulargewichtsstandards sind links von Figur 18 gekennzeichnet (A und B). Figur 18A gibt Lysate von Zellen wieder, enthaltend pAA152, die PBOMP-1-Gen enthalten. Die Bahnen geben wieder: (1) Globomycin liegt nicht vor und (2) Globomycin liegt vor.
Figur 18B gibt Lysate von Zellen wieder, enthaltend pAA130, das PBOMP-2-Gen enthält. Die Bahnen geben wieder: (1) Globomycin liegt nicht vor und (2) Globomycin liegt vor.
Figur 19 erläutert graphisch die Antikörperantwort, erhalten, wenn eine Impfstofformulierung, umfassend PBOMP-1 (5,2 ug), an Erwachsene verabreicht wurde.
Figur 20 gibt die Reaktivität von Ganzzellenlysaten von E. coli JM101 oder JM103 mit monoklonalen Antikörpern G- 204 wieder. Die Bahnen geben wieder: (A) JM103, enthaltend pPX166; (B) JM103, enthaltend pPX160; (C) JM101, enthaltend pUCIg; (D) Molekulargewichtsstandard, ausgewiesen in Kilodalton auf der linken Seite der Figur und (E) natives PBOMP-1 von H. influenzae.
Figur 21 ist die schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmiden, enthaltend die PBOMP-1-Protein codierende Sequenz ohne PBOMP-1-Signalsequenz. In Plasmid pPX167 wird das PBOMP-1-Gen ohne Signalsequenz stromabwärts des lac-Promoters inseriert. Plasmid pPX168 wurde durch Schneiden der PBOMP-1 codierenden Sequenz in pPX167 an der BamHI-Stelle in den Polylinker und Klonieren des erhaltenen Fragments in die BamHI-Stelle des Plasmids pINIII-ompA3 konstruiert. Plasmid pPX168 enthält eine chimäre Sequenz, die für reifes PBOMP-1, gebunden an den Aminoterminus der Signalsequenz von H. coli-omp A-Protein codiert.
Figur 22 gibt ein Chromatogramm wieder, erhalten unter Verwendung von Umkehrphasen-C-4-Hochleistungsflüssig- Chromatographie der überstehenden Fraktion des Zytoplasmaextrakts von E. coli-Stamm PR13, enthaltend Plasmid pPX167.
Figur 23A gibt die SDS-PAGE-Analyse von signalfreiem PBOMP-1, erhalten aus E. coii PR13 wieder, enthaltend PlasmidpPX167, gefärbt mit Coomassie-Farbstoff. Die Bahnen geben wieder: (1) zytoplasmatische Fraktion; (2) DEAE-Eluat und (3) Umkehrphaseneluat. Molekulargewichtsstandards wurden in der Bahn rechts von Bahn 1 laufen lassen und relative Molekulargewichte (in Kilodalton) sind an der linken Seite der Figur dargestellt. Figur 23B gibt die Reaktivität der Fraktionen mit anti-PBOMP-1 monoklonalen Antikörpern wieder. Die Bahnen sind wie in Figur 23A.
Figur 24 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmid pPX163, enthaltend die vollständig codierende Sequenz von PBOMP-2-Protein, inseriert stromabwärts des lac-Promotors.
Figur 25 gibt die SDS-PAGE-Analyse von Ganzzellenlysaten von E. coli JM103, enthaltend pPX163, gezüchtet in Anwesenheit oder Abwesenheit von IPTG, wieder. Die Bahnen geben wieder: (1) Molekulargewichtsstandards: Kilodalton; (2) Lysat von JM103, enthaltend ppX163, gezüchtet ohne IPTG und (3) wie in Bahn (2), gezüchtet in Gegenwart von IPTG (5 mMol) für 4 Stunden. Die Pfeile zeigen die Anordnung der drei PBOMP-2-reaktiven Banden, induziert durch IPTG.
Figur 26 ist die schematische Darstellung der Struktur von PBOMP-1, die die hydrophilen Bereiche des Proteins wiedergibt und Umkehrungen (reverse turns) in der Sekundärstruktur des Proteins zeigt. Ort und Größe von chemisch synthetisierten PBOMP-1-verwandten Peptiden innerhalb der PBOMP- 1-Sequenzen sind unten gezeigt.
Figur 27 gibt die Aminosäuresequenzen von 5 chemisch synthetisierten PBOMP-1-verwandten Peptiden wieder.
Figur 28 zeigt eine Karte von Epitopen auf dem PBOMP- 1-Protein, erkannt durch monoklonale Antikörper gegen PBOMP- 1.
Figur 29 gibt die Reaktivität von Ganzzellenlysaten von infizierten E. coli JM103-Zellen mit dem Kapselmangel H. influenzae-Stamm S2 (Bahn 4) wieder oder die klinisch nichttypisierbaren H. influenzae-Stämme: 0045E (Bahn 5), 1939 (Bahn 6), HST31 (Bahn 7) und Hib Eagan (Bahn 8) mit anti- PBOMP-2-monoklonalen Antikörpern, 61-1. Molekulargewichtsstandards (Kilodalton) sind in Bahn 2 dargestellt. Die Reaktivitäten von PBOMP-2 und PBOMP-1 mit anti-PBOMP-2 monoklonalen Antikörpern 61-1 sind in Bahnen 1 beziehungsweise 3 dargestellt.
Figur 30 ist die schematische Darstellung der Konstruktion eines Plasmids, enthaltend eine PBOMP-2: PBOMP-1-Fusionsprotein codierende Sequenz. Plasmid pPX183 wurde durch getrennten Aufschluß von Plasmiden, pPX163 und pPX167, mit Scai zur Vollständigkeit konstruiert. Der ppX163 ScaI-Aufschluß wurde außerdem mit HindIII unter Bereitstellung eines Teilaufschlusses behandelt und der pPX167 ScaI-Aufschluß wurde vollständig mit HindIII aufgeschlossen.
Das 2,7 kB ScaI-HindIII-Fragment von pPX163 und das 1,4 kB ScaI-HindIII-Fragment von pPX167 wurden isoliert und Gel-gereinigt. Die zwei ScaI- und HindIII-Fragmente wurden anschließend miteinander ligiert.
Figur 31 ist die schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmid pPX199, enthaltend eine PBOMP-2:PBOMP- 1-Fusionsprotein codierende Sequenz. Für Einzelheiten der Konstruktion siehe Text.
Figur 32 gibt eine SDS-PAGE-Analyse des Fett-acylierten PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsproteins, exprimiert durch E. coli-Zellen, enthaltend Plasmid pPX199, wieder. Etwa 5 ug des gereinigten Fusionsproteins wurden in einem 15 %-Gel (Bahn 2) analysiert. Vorgefärbte Standards niederen Molekulargewichts wurden zum Vergleich und zur Abschätzung des Molekulargewichts (Bahn 1) mitlaufen lassen.
Figur 33 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmid pPX512, enthaltend die PBOMP-2:PBOMP-1- Fusionsprotein codierende Sequenz ohne die PBOMP-2-Signalsequenz. In Plasmid pPX512 wird das PBOMP-2-Gen ohne die Signalsequenz stromabwärts des lac-Promotors inseriert. Plasmid pPX512 enthält eine chimäre Sequenz, die für reife PBOMP-2- Sequenz codiert, mit der Abweichung, daß das N-terminale Cystein durch Methionin ersetzt ist, gebunden an dem Carboxy-Terminus für die PBOMP-1-Sequenz. Für Einzelheiten der Konstruktion siehe Text.

5. Beschreibung der Erfindung im einzelnen

Die vorliegende Erfindung betrifft Fusionsproteine und -peptide, die Epitope von einem Außenmemöranprotein von H. influenzae mit einem Molekulargewicht von etwa 16 000 Dalton, das heißt, PBOMP-1 und ein verwandtes Außenmembranprotein von H. influenzae mit einem Molekulargewicht von etwa 16 000 Dalton, das heißt PBOMP-2, umfassen. Die Erfindung betrifft außerdem Fusionsproteine, umfassend Epitope anderer wichtiger Proteine von H. influenzae, einschließlich IgA-Protease, Fimörien und Außenmemöranproteine. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Proteine und Peptide, die zu Epitopen eines PBOMP-1:PBOMP-2- oder PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsproteins verwandt sind. Die scheinbaren Molekulargewichte, ermittelt unter Verwendung von SDS-PAGE, spiegeln die Gesamtmolekulargewichte der reifen Formen (das heißt proteolytisch verarbeiteten) wider, einschließlich posttranslationalen Modifizierungen (das heißt Fettacylierung, Acetylierung, usw.). Die Proteine und Peptide der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren oder durch chemische Synthese hergestellt werden. Außerdem können die Proteine und Peptide der Erfindung im wesentlichen rein aus Kulturen von H. influenzae unter Verwendung von neuen und verbesserten Verfahren zur Isolierung und Reinigung erhalten werden. Die PBOMP-1:PBOMP-2- und PBOMP-2:PBOMP-1-Proteine und Peptide, die Epitope von H. influenzae spezifizieren, können als Immunogene in verschiedenen Impfstofformulierungen zum Schutz gegen Infektion mit H. influenzae, einem ätiologische Erreger für bakterielle Meningitis, Otitis media, Epiglottitis, Pneumonie, usw., verwendet werden. Die Impfstofformulierungen sind wirksam sowohl gegen typisierbare H. influenzae- Stämme, einschließlich Typen a, b, c, d, e und f sowie nichttypisierbare H. influenzae-Stämme.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Nucleotidsequenz(en) der Gene, die für PBOMP-1:PBOMP-2- und PBOMP- 2:PBOMP-1-Proteine codieren sowie die Aminosäuresequenzen der PBOMP-1:PBOMP-2- und PBOMP-2:PBOMP-1-Proteine und Polypeptidfragmente davon.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden rekombinante DNA-Techniken zur Inserierung von Nucleotidsequenzen verwendet, die für PBOMP-1:PBOMP-2- und PBOMP-2:PBOMP-1-Epitope codieren in Expressionsvektoren, die die Expression dieser Sequenzen in geeigneten Wirtszellen steuern. Diese Expressionsvektor-Wirtszellensysteme können zur Herstellung von PBOMP-1:PBOMP-2 und PBOMP-2:PBOMP-1 und verwandten Proteinen und Peptiden verwendet werden. Die Genprodukte können aus Zellen in der Kultur gezüchtet werden und als Immunogene in Untereinheits-Impfstofformulierungen verwendet werden. Alternativ dazu kann die Aminosäuresequenz von PBOMP-1- und PBOMP-2-Proteinen und -Peptiden hergeleitet werden, entweder (1) aus im wesentlichen reinem PBOMP-1-Protein, isoliert aus H. influenzae, wie hier offenbart, oder (2) aus H. influenzae Nucleotidsequenzen, enthaltend die Rekombinanten, die immunogene PBOMP-1-, PBOMP-2-, PBOMP-1:PBOMP-2- oder PBOMP-2:PBOMP-1-verwandte Proteine und Peptide exprimieren. Diese Proteine und Peptide können dann chemisch synthetisiert werden und in synthetischen Untereinheits-Impfstofformulierungen verwendet werden.
Wenn der Expressionsvektor, der die PBOMP-1: PBOMP-2- oder PBOMP-2:PBOMP-1-Sequenz (en) exprimiert, ein rekombinanter Virus ist, kann der Virus selbst als Impfstoff verwendet werden. Infektiöse rekombinante Viren, die PBOMP-1: PBOMP-2- und/oder PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsproteine und -Peptide exprimieren und keine Krankheit im Wirt hervorrufen, können in Lebendvirus-Impfstofformulierungen unter Bereitstellung wesentlicher Immunität verwendet werden. Alternativ dazu können inaktivierte Virusimpfstoffe unter Verwendung von "abgetöteten" rekombinanten Viren verwendet werden, die PBOMP-1: PBOMP-2- und/oder PBOMP-2 : PBOMP-1-Proteine und -Peptide exprimieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem polyvalentes Antiserum und monoklonale Antikörper gegen PBOMP-1: PBOMP-2 und/oder PBOMP-2: PBOMP-1 sowie Verfahren zur Herstellung solchen Immunoglobulins für die passive Immunisierung und diagnostische Assays für H. influenzae. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung können monoklonale Antikörper gegen PBOMP-1:PBOMP-2- und/oder PBOMP-2: PBOMP-1- verwandte Peptide erzeugt werden.
Zum Zweck der Beschreibung kann das Verfahren der Erfindung in die nachfolgenden Stufen eingeteilt werden: (1) Isolation und Reinigung von PBOMP-1-Protein; (2) teilweise Aminosäuresequenzierung von PBOMP-1; (3) Erzeugung von PBOMP- 1- und/oder PBOMP-2-verwandten Peptiden, die einen immunogenen Bereich oder immunogene Bereiche von PBOMP-1 beziehungsweise PBOMP-2 umfassen; (4) Molekularklonieren von Genen oder Genfragmenten, die PBOMP-1 und PBOMP-2 und PBOMP-1: PBOMP-2- und/oder PBOMP-2: PBOMP-1-Fusionsproteine codieren, einschließlich Insertion von Genen oder Genfragmenten in Expressionsvektoren und Identifizierung und Reinigung der rekombinanten Genprodukte; (5) Nucleotidsequenzierung von Genen, die für PBOMP-1 und PBOMP-2 codieren und (6) Bestimmung der Immunopotenz von PBOMP-1-, PBOMP-2-, PBOMP-1: PBOMP-2- und/oder PBOMP-2:PBOMP-1-Proteinen und verwandten Produkten durch Herstellung von Antikörpern gegen gereinigte und rekombinante Protein- und Peptidprodukte. Das Verfahren umfaßt außerdem (7) Formulierung von Impfstoffen und (8) Diagnoseassays zur Ermittlung von PBOMP-1- und PBOMP-2-Genen oder Genprodukt (und folglich H. influenzae) in Proben von Körperflüssigkeiten.

5.1 Isolierung und Reinigung von PBOMP-1

In H. influenzae b Eagan und anderen Stämmen von H. influenzae ist das Außenmembranprotein PBOMP-1 mit dem Außenmembranwandkomplex verbunden. Ein erforderlicher Schritt bei der Reinigung von PBOMP-1 ist die Aufspaltung der Bindungen, die die äußeren Membranproteine in engem Zusammenhang mit der äußeren Membran und der Zellwand halten. Dies kann durch ein Verfahren bewirkt werden, das die nachstehenden zwei Schritte umfaßt: (1) Isolieren einer PBOMP-1-angereicherten, unlöslichen Zellwandfraktion von physikalisch aufgebrochenen Zellen von H. influenzae und dann (2) Solubilisieren von PBOMP-1 aus der Zellwandfraktion durch Erwärmen in Gegenwart eines Detergens, das geeignet ist zur Verabreichung an einen Menschen oder Aufschluß der Zellwandfraktion mit Lysozym, entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von Detergens.
Dieses Verfahren vermeidet die Verwendung von Denaturierungsmitteln und Reduktionsmitteln, wie Natriumdode-cylsulfat und 2-Mercaptoethanol (vergleiche Munson et al., 1984, Infect. Immun. 49:544-49), die wichtige Epitope zerstören könnten und die als Komponenten für Impfstofformulierungen zur Verabreichung an Menschen nicht geeignet sind.

5.1.1 Isolierung von PBOMP-1-angereichertem unlöslichem Zellwandmaterial aus H. influenzae

Eine gesamte Zellmembranfraktion kann durch Differentialsedimentation, gefolgt von Aufsprengen von H. influenzae- Zellen durch Verfahren erhalten werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt darauf: Beschallen, Vermahlen, Ausstoßen aus einer French-Press-ähnlichen Homogenisierungseinrichtung. Die Gesamtmembranfraktion kann außerdem in innere und äußere Membranen durch Dichtegradientensedimentation fraktioniert werden oder durch Differentialsolubilisierung der Innenmembran durch bestimmte Detergenzien, wie Triton X-100 oder N- Lauroylsarcosin, Natriumsalz (Sarcosyl). Außenmembranen werden vorzugsweise durch Differentialsolubilisierung der Innenmembranen in 1 % (Gewicht/Volumen) Sarcosyl in 10 mM HEPES- NaOH, ph 7,4 hergestellt. Eine Subfraktion, angereichert mit PBOMP-1, kann durch Differentialdetergensextraktion der anderen Außenmembran-Zellwandkomponenten hergestellt werden. Diese Anreicherung kann beispielsweise durch sequentielle Extraktion des äußeren Membran-Zellwandkomplexes (der nach Triton X-100 oder Sarcosyl-Extraktion, wie vorstehend beschrieben, verbleibt) mit 1 % Octylglucosid, Nonylglucosid, Zwittergent 3-14 oder Zwittergent 3-16 , gefolgt von Extraktion des unlöslichen Materials mit 1 % Sarcosyl und anschließend Zentrifugieren zur Isolation von PBOMP-1-angereichertem, isoliertem Material bewirkt werden.

5.1.2 Solubilisierung von PBOMP-1 aus dem PBOMP-1-angereichertem unlöslichem Zellwandmaterial

Solubilisierung von PBOMP-1 aus dem äußeren Membranzellwandkomplex kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden unter Verwendung einer der nachstehenden Möglichkeiten oder einer Kombination davon: (1) PBOMP-1 kann durch Extraktion der PBOMP-1-angereicherten Fraktion mit einem oder einer Kombination von verschiedenen Detergenzien, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Desoxycholat, Triton X-100 , Tween 80, CHAPS, CHAPSO, Dodecylmaltosid, Zwittergent 3-14 und Zwittergent 3-16 bei 55ºC bis 60ºC für 1 Stunde solubilisiert werden; (2) PBOMP-1 kann durch Aufbruch der Zellwand in der PBOMP-1-angereicherten Fraktion mit Lysozym, entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von Detergens solubilisiert werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Detergens ausgewählt aus Desoxycholat und Polyethoxylatsorbitanmonooleat (Tween 80).
Alternativ dazu kann PBOMP-1 durch Extraktion gesamter H. influenzae-Zellen, Außenmembranen oder Subfraktionen davon mit einem oder einer Kombination von Detergenzien, einschließlich, jedoch nicht darauf begrenzt: Triton X-100 , Sarcosyl, Octylglucosid, Nonylglucosid, Zwittergent 3-14 oder Zwittergent 3-16 isoliert werden. Die Extraktion sollte bei 55 bis 60ºC oder bei Raumtemperatur in einem geeigneten Puffersystem ausgeführt werden.
Nach Solubilisierung kann weitere Reinigung von PBOMP-1 durch bekannte Standardverfahren erreicht werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt darauf, Ionenaustausch, Molekularsieb, hydrophobe oder Umkehrphasenchromatographie, Affinitätschromatographie, Chromatofokussierung, isoelektrische Fokussierung und präparative Elektrophorese.

5.2 Charakterisierung von PBOMP-1 durch Aminosäureanalyse und Sequenzieren von PBOMP-Peptiden

Das aus H. influenzae erhaltene PBOMP-1 kann durch Aminosäureanalyse in Kombination mit Teilaminosäuresequenzierung von Peptidfragmenten charakterisiert werden. Um die Zerstörung und/oder Modifizierung von Aminosäuren in dem gereinigten Protein zu minimieren, ist es bevorzugt, PBOMP-1 in Methansulfonsäure, enthaltend Tryptamin zu hydrolysieren (Simpson et al., 1970, J. Biol. Chem. 251:1936-40). In einem experimentellen Beispiel wurden eine derartige Aminosäureanalyse mit Aminosäuresequenzierung von tryptischen Peptidfragmenten von PBOMP-1 zur Charakterisierung dieses hier beschriebenen, isolierten Peptids kombiniert (vergleiche Abschnitt 6.1.1.).
Schwierigkeiten traten auf während der anfänglichen Versuche, das PBOMP-1 durch Edman-Chemie zu sequenzieren, was vermuten läßt, daß der N-Terminus von dem Außenmemöranprotein von Haemophilus blockiert ist. Untersuchungen von Braun (1970, Eur. J. Biochem. 14:387-391) haben gezeigt, daß Fettsäuren an den N-terminalen Cysteinylrest des Braun'schen Lipoproteins von Escherichia coli gebunden sind. Ein Palmitylrest ist amidgebunden zu dem N-terminalen Cystein; zwei zusätzliche Fettsäuren sind ebenfalls zu demselben Cysteinylrest über eine Glycerylgruppe gebunden, die eine Thioetherbindung in dem E. coli-Braun-Lipoprotein bildet. (Id.) Folglich wurde das aus H. influenzae erhaltene PBOMP-1 weiter durch Fettsäureanalyse charakterisiert. Eine solche Untersuchung wies aus, daß die N-terminalen Reste des Außenmembranproteins und der Peptide der vorliegenden Erfindung kovalent gebundene Fettsäurereste aufweisen können. In einem Versuchsbeispiel zeigte eine solche Fettsäureanalyse die Anwesenheit von 3 Hauptfettsäuren, das heißt Laurinsäure, Palmitinsäure und ein Derivat von Palmitinsäure. Die acetylierten Proteine und Peptide der vorliegenden Erfindung mit einem kovalent gebundenen Fettsäurerest können teilweise für Impfstofformulierungen gegen H. influenzae Verwendung finden.

5.3. Erzeugung von PBOMP-1- und/oder PBOMP-2-verwandten Pertiden

PBOMP-1- und/oder PBOMP-2-verwandte Peptide, die einen antigenen oder immunogenen Bereich(e) von PBOMP-1 oder PBOMP-2 aufweisen, können durch proteolytische Spaltung des gesamten PBOMP-1- oder PBOMP-2-Proteins oder durch chemische Synthese von Peptidfragmenten erhalten werden. Beim letzteren Verfahren können Peptidfragmente chemisch synthetisiert werden, beispielsweise unter Verwendung eines automatischen Peptidsynthesizers.
PBOMP-1- oder PBOMP-2-verwandte Peptide, erzeugt entweder durch proteolytischen Aufschluß oder durch chemische Synthese, können durch übliche Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gereinigt werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt: Hochdruckflüssigchromatographie oder Säulenchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauscher, Molekularsieb, hydrophobe oder Umkehrphasensäulen, Affinitätssäulen oder Chromatofokussierung, isoelektrische Fokussierung oder präparative Gelelektrophorese.
Die Sequenz der proteolytischen Aufschlüsse von PBOMP-1 oder PBOMP-2 oder chemisch synthetisiertes PBOMP-1 oder PBOMP-2 werden durch bekannte Techniken ermittelt, die einschließen, jedoch nicht beschränkt darauf, einen automatischen Sequenator unter Verwendung des Edman-Abbauverfahrens oder das Verfahren der Aminosäureanalyse, das die Hydrolyse der Peptidbindungen einschließt (Simpson et al., 1976, J. Biol. Chem. 251:1936-1940).

5.4 Molekulares Klonen von Genen oder Genfragmenten, die PBOMP-1 und PBOMP-2 codieren

5.4.1 Isolierung von Genen, die für PBOMP-1 und verwandte PBOMP codieren

Ein OMP mit einem Molekulargewicht (NW) von 16 000 Dalton wurde ermittelt, sowohl durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), als auch Western- Blot-Analyse, in allen geprüften H. influenzae-Stämmen (derzeit einige 100). Daten monoklonaler Antikörper weisen aus, daß dieses Protein stark konserviert ist (Murphy et al., 1986, Infect. Immun. 54:774-49). Somit könnte ein H. influenzae-Stamm als Quelle für PBOMP-Gene dienen. Da viele H. influenzae-Stämme keine detektierbaren Plasmide oder induzierbare Prophagen enthalten, sind die PBOMP-Gene wahrscheinlich chromosomal. Folglich ist der erste Schritt bei der molekularen Klonierung von DNA-Sequenzen, die für PBOMP codieren, die Isolierung solcher Sequenzen aus H. influenzae chromosomaler DNA. Forthin wird DNA, die für H. influenzae-Gene codiert, als "Hi DNA" und DNA, die für PBOMP-Sequenzen codiert, als "PBOMP DNA" bezeichnet.
Um Hi DNA-Fragmente zu erzeugen, kann Hi DNA an speziellen Orten unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme geschnitten werden. Alternativ kann man geringe Konzentrationen von DNAase I zur Fragmentierung der DNA verwenden oder die DNA kann physikalisch gespalten werden, beispielsweise durch Beschallen. Die linearen DNA-Fragmente können dann gemäß der Größe getrennt werden durch übliche Verfahren, einschließlich, jedoch nicht begrenzt darauf: Agarose- und Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Säulenchromatographie (beispielsweise Molekularsieb oder Ionenaustauschchromatographie) oder Geschwindigkeitssedimentation in Saccharosegradienten.
Ein Restriktionsenzym oder eine Kombination von Restriktionsenzymen kann zur Erzeugung der Hi DNA-Fragment(e) die PBOMP-Sequenzen enthalten, verwendet werden, vorausgesetzt, das (die) Enzym(e) zerstört(en) nicht die Immunopotenz der PBOMP-Genprodukte. Die antigene Stelle eines Proteins kann beispielsweise aus etwa 7 bis etwa 14 Aminosäuren bestehen. Somit kann ein Protein der Größe der PBOMP-Peptide viele diskrete antigene Orte aufweisen und viele Teil-PBOMP-Polypeptid-Gensequenzen könnten daher für antigene Orte dienen. Folglich kann man viele Restriktionsenzym-Kombinationen verwenden zur Erzeugung von DNA-Fragmenten, die, wenn inseriert in einen geeigneten Vektor, in der Lage sind, die Herstellung von PBOMP-spezifischen Aminosäuresequenzen, umfassend verschiedene antigene Determinanten, zu spezifizieren.
Sind einmal die DNA-Fragmente erzeugt, kann die Identifizierung des spezifische DNA-Fragments, das das PBOMP-Gen enthält, auf zahlreichen Wegen bewirkt werden.
Die die PBOMP-Gene enthaltenden DNA-Sequenzen können durch Hybridisierung von Hi DNA-Fragmenten mit einer synthetischen Oligonucleotidsonde identifiziert werden. Redundante synthetische Oligonucleotidsonden werden auf der Basis der Aminosäuresequenz von Peptidfragmenten von PBOMP-Protein konstruiert. Beispielsweise können synthetische Oligonucleotidsonden auf der Grundlage der Aminosäuresequenz von im wesentlichen reinem PBOMP-1-Protein, isoliert aus H. influenzae, wie beschrieben in Abschnitt 5.1, hergestellt werden. Diese synthetischen Sonden können radiomarkiert werden mit ³²P-Adenosintriphosphat und zum Absuchen von Hi DNA-Banken für Klone, enthaltend PBOMP-spezifische Gensequenzen, verwendet werden (siehe Anderson et al., 1983, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80:6838-42).
Alternativ kann die PBOMP-Gen-DNA identifiziert und isoliert werden nach der Insertion in einen Klonierungsvektor in einem "Shotgun"-Verfahren ("Schrotschuß"-Verfahren). Eine Vielzahl von Vektor-Wirtssystemen ist auf dem Gebiet zur Verwendung bekannt. Vektorsysteme können entweder Plasmide oder modifizierte Viren sein. Geeignete Klonierungsvektoren schließen, sind jedoch nicht darauf beschränkt virale Vektoren, wie Lambda-Vektor-System-gt11, gt WES.tB, Charon 4 und Plasmid-Vektoren, wie pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKC101 und andere ähnliche Systeme, ein. Das Vektor-System muß mit der verwendeten Wirtszelle verträglich sein. Rekombinante Moleküle können in Zellen über Transformation, Transfektion oder Infektion eingeführt werden.
Wenn Hi DNA, die ein PBOMP-Gen oder Genfragment enthält, in einen Klonierungsvektor inseriert wird und zur Transformation geeigneter Wirtszellen verwendet wird, können viele Kopien des PBOMP-Gens oder Genfragments erzeugt werden. Dies kann durch Ligierung des Hi DNA-Fragments in einem Klonierungsvektor bewirkt werden, der komplementäre kohäsive Termini aufweist. Wenn jedoch die komplementären Restriktionsorte nicht vorliegen, können die Enden der DNA-Moleküle modifiziert werden. Solche Modifizierung schließt Herstellung von glatten Enden durch Aufschluß einsträngiger DNA-Termini oder durch Auffüllen einsträngiger DNA-Termini ein, so daß die Enden des glatten Endes ligiert werden können. Alternativ dazu kann eine beliebige gewünschte Stelle durch Ligieren von Nucleotidsequenzen (Linkern) an den DNA-Termini erzeugt werden. Diese ligierten Linker können spezielle, chemisch synthetisierte Oligonucleotide umfassen, die Restriktionsstellen-Erkennungssequenzen codieren. Beispielsweise wird gemäß dem DNA-Modifizierungsverfahren von Maniatis (siehe Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 107 bis 114) zerteilte DNA mit einer Restriktionsmethylase behandelt (beispielsweise M. EcoRI) und an synthetische DNA-Linker ligiert, die eine Restriktionsstelle für das Enzym codieren. Die DNA wird dann mit Restriktionsendonuclease behandelt zur Spaltung der terminalen Linker (jedoch nicht der modifizierten inneren Restriktionsstellen) und zu den-entsprechenden Vektorarmen ligiert. Bei einem alternativen Verfahren können der aufgespaltene Vektor und das PBOMP- DNA-Fragment durch homopolymere Schwanzbildung modifiziert werden.
Identifizieren eines geklonten PBOMP-Gens kann durch Herstellen einer chromosomalen Gen-Bank von Hi in einem Vektorsystem und Absuchen einzelner Klone für die Herstellung von PBOMP-1 oder PBOMP-1-verwandten Protein durch ein beliebiges der hier beschriebenen Verfahren, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt spezifische Reaktion mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern gegen PBOMP, bewirkt werden.

5.4.2 Insertion von PBOMP-Genen in Expressionsvektoren

Die Nucleotidsequenzen, die für PBOMP oder Teile davon codieren, werden in einen geeigneten Expressionsvektor, das heißt in einen Vektor, der die erforderlichen Elemente für Transkription und Translation der inserierten, proteincodierenden Sequenzen aufweist, inseriert. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden die Nucleotidsequenzen, die für sowohl PBOMP-1 als auch PBOMP-2 oder Teile davon codieren, in einen geeigneten Expressionsvektor, wie im vorhergehenden Satz beschrieben, inseriert. Eine Vielzahl von Wirts-Vektor-Systemen kann verwendet werden, um die proteincodierende(n) Sequenz(en) zu exprimieren. Hauptsächlich muß das Vektorsystem mit dem verwendeten Wirtssystem kompatibel sein. Wirts-Vektor-Systeme schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt die folgenden: Bakterien, transformiert mit Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA, Mikroorganismen, wie Hefe enthaltende Hefevektoren, Säugerzellsysteme, infiziert mit Virus (beispielsweise Pockenvirus, Adenovirus, usw.), Insektenzellsysteme, infiziert mit Virus(beispielsweise Baculovirus). Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren hinsichtlich ihrer Stärke und Spezifitäten. In Abhängigkeit davon, wenn ein Wirts-Vektor-System verwendet wird, kann eines einer Vielzahl geeigneter Transkriptions- und Translationselemente verwendet werden.
Um effiziente Expression des Gens zu erhalten (oder eines Teils des Gens), muß ein Promotor in dem Expressionsvektor vorliegen. RNA Polymerase bindet normalerweise an den Promotor und setzt die Transkription eines Gens oder einer Gruppe von verbundenen Genen und regulatorischen Elementen (genannt Operon) in Gang. Promotoren variieren hinsichtlich ihrer "Stärke", das heißt, hinsichtlich ihrer Befähigung, Transkription zu fördern. Für den Zweck der Expression eines klonierten Gens ist es erwünscht, starke Promotoren zu verwenden, um ein hohes Maß an Transkription und folglich Expression des Gens zu erhalten. In Abhängigkeit von dem Wirts- Zell-System, das verwendet wird, kann eine Vielzahl geeigneter Promotoren verwendet werden. Beispielsweise können, wenn in E. coli kloniert wird, dessen Bakteriophagen oder Plasmide, Promotoren, wie der lac Promotor, trp Promotor, recA Promotor, ribosomaler RNA-Promotor, die PR- und PL-Promotoren von Coliphagen Lambda und andere, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt lacUV5, ompF, bla, lpp und dergleichen, zur Richtung eines hohen Grades an Transkription von benachbarten DNA-Segmenten verwendet werden. Ein Hybrid trp- lacUV5-(tac)-Promotor oder andere E. coli-Promotoren, hergestellt durch rekombinante DNA- oder andere synthetische DNA- Techniken, können außerdem zur Bereitstellung von Transkription des inserierten Gens verwendet werden.
Bakterielle Wirtszellenstämme und Expressionsvektoren können ausgewählt werden, die die Wirkung des Promotors inhibieren, sofern nicht speziell induziert. Bei bestimmten Operonen ist die Zugabe von spezifischen Inducern zur effizienten Transkription der inserierten DNA erforderlich; beispielsweise wird lac-Operon durch die Zugabe von Lactose oder IPTG (Isopropylthio-beta-D-galactosid) induziert. Eine Vielzahl anderer Operone, wie trp, pro usw. werden unterschiedlich gesteuert. Das trp-Operon wird induziert, wenn Tryptophan in dem Züchtungsmedium abwesend ist und der PL-Promotor von Lambda kann induziert werden durch Erhöhung der Temperatur in Wirtszellen, die einen temperaturempfindlichen Lambda- Repressor enthalten, beispielsweise cI857. In dieser Weise können mehr als 95 % der Promotor spezifizierten Transkription in nichtinduzierte Zellen inhibiert werden. Die Expression des gentechnisch hergestellten PBOMP-Proteins oder -Peptids kann somit kontrolliert werden. Dies ist wichtig, wenn das Proteinprodukt des geklonten Gens letal ist oder schädlich für die Wirtszellen. In solchen Fällen können Transformanten unter Bedingungen gezüchtet werden, so daß der Promotor nicht induziert wird und wenn die Zellen eine geeignete Dichte in dem Züchtungsmedium erreichen, kann der Promotor zur Herstellung des Proteins induziert werden.
Ein solches Promotor/Operator-System ist das sogenannte "tac" oder trp-lac-Promotor/Operator-System (Russell und Bennett, 1982, Gene 20:231-243; DeBoer, European Patent Application, 67540, eingereicht am 18. Mai 1982). Dieser Hybridpromotor wird konstruiert durch Kombinieren des -35 Bp (-35 Bereich) des trp-Promotors und des -10 Bp (-10 Bereiches der Pribnow-Box) des lac-Promotors (die Sequenzen der DNA, die die RNA-Polymerase-Bindungsstellen sind). Zusätzlich zum Aufrechterhalten der starken Promotoreigenschaften des Tryptophan-Promotors wird tac auch durch den lac Repressor gesteuert.
Beim Klonieren in einer eucaryotischen Wirtszelle können Verstärkersequenzen (beispielsweise 72 Bp Tandemwiederholung von SV40 DNA oder die retroviralen langen terminalen Wiederholungen von LTR, usw.) inseriert werden, um den transkriptionalen Wirkungsgrad zu erhöhen. Verstärkersequenzen sind ein Satz von eucaryotischen DNA-Elementen, die den transkriptionalen Wirkungsgrad in einer relativ unabhängigen Weise von deren Position und Orientierung hinsichtlich des benachbarten Gens zu erhöhen scheinen. Im Gegensatz zu klassischen Promotorelementen (beispielsweise der Polymerase-Bindungsstelle und der Goldberg-Hogness "TATA"-Box), die unmittelbar 5' zu dem Gen angeordnet sein müssen, haben Verstärkersequenzen die bemerkenswerte Fähigkeit, stromaufwärts zu wirken, innerhalb oder stromabwärts von eucaryotischen Genen; die Position der Verstärkersequenz hinsichtlich des inserierten Gens ist daher weniger kritisch.
Spezielle Startsignale sind ebenfalls für eine wirksame Gentranskription und -translation in procaryotischen Zellen erforderlich. Diese Transkription- und Translation- Startsignale können in der "Stärke" variieren, wie gemessen durch die Menge von genspezifischer Boten-RNA beziehungsweise synthetisiertem Protein. Der DNA-Expressionsvektor, der einen Promotor enthält, kann ebenfalls eine beliebige Kombination verschiedener "starker" Transkription und/oder Translation- Startsignale enthalten. Beispielsweise erfordert wirksame Translation in E. coli eine Shine-Dalgarno-Sequenz (SD) von etwa 7 bis 9 Basen 5' zum Startcodon (ATG) unter Bereitstellung einer ribosomalen Bindungsstelle. Somit kann eine beliebige SD-ATG-Kombination, die von Wirtszellen-Ribosomen genutzt werden kann, angewendet werden. Solche Kombinationen schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt die SD- ATG-Kombination aus dem cro-Gen oder dem N-Gen vom Coliphagen Lambda oder von E. coli Tryptophan E, D, C, B oder A Genen. Außerdem kann eine beliebige SD-ATG-Kombination, hergestellt durch rekombinante DNA- oder andere Techniken, einschließlich Einbezug von synthetischen Nucleotiden, verwendet werden.
Ein beliebiges der vorstehend beschriebenen Verfahren für die Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor kann zur Ligierung eines Promotors und anderen Steuerungselementen in spezifischen Orten innerhalb des Vektors verwendet werden.
Folglich können genetische Sequenzen von H. influenzae, die jene Bereiche enthalten, die PBOMP-Proteine oder -Peptide codieren, in einen Expressionsvektor an einer speziellen Stelle in Bezug auf den Vektorpromotor und die Steuerelemente ligiert werden, so daß, wenn das rekombinante DNA-Molekül in eine Wirtszelle eingeführt wird, die fremde genetische Sequenz exprimiert (das heißt transkribiert oder translatiert) durch die Wirtszelle, werden kann. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung können Bereiche, die sowohl für PBOMP-1- als auch PBOMP-2-Proteine oder -Peptide codieren, in einen Expressiönsvektor ligiert werden. Der Bezug oder die Orientierung von PBOMP-Sequenzen zu dem Vektorpromotor und den Kontrollelementen wird bestimmen, ob die genetische Sequenz, die exprimiert wird, ein PBOMP-1: PBOMP-2- oder PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsprotein oder Peptidfragmente davon ist. Das rekombinante DNA-Molekül kann in geeignete Wirtszellen eingeführt werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, in Bakterien, Virus, Hefe, Säugerzellen oder dergleichen, durch Transformation, Transduktion oder Transfektion (in Abhängigkeit von dem Vektor/Wirtszellensystem). Transformanten werden auf der Grundlage der Expression eines oder mehrerer geeigneter Genmarker, die normalerweise in dem Vektor vorliegen, ausgewählt, wie Ampicillinresistenz oder Tetracyclinresistenz in pBR322 oder Thymidinkinaseaktivität in eucaryotischen Wirtssystemen. Expression solcher Markergene sollte ausweisen, daß das rekombinante DNA-Molekül intakt und zu replizieren ist. Expressionsvektoren können von Klonierungsvektoren abgeleitet werden, die gewöhnlich eine Markerfunktion enthalten. Solche Klonierungsvektoren können einschließen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, die Folgenden: SV40 und Adenovirus, Pockenvirusvektoren, Insektenviren, wie Baculoviren, Hefevektoren, Bakteriophagen-Vektoren, wie Lambda gt-WES-Lambda B, Charon 28, Charon 4A, Lambda gt-1-Lambda BC, Lambda gt-1-Lambda B, M13mp7, M13mp8, M13mp9 oder Plasmid DNA-Vektoren, wie pBR322, pAC105, pVA51, pACYC1I77, pKH47, pACYC184, pUB110, pMB9, pBR325, Col E1, pSC101, pBR313, pML21, RSF2124, pCR1, RP4, pBR328 und dergleichen.
Transfer- oder Arzneistoff-Resistenzfaktoren zwischen H. influenzae und E. coli über Konjugation (Stuy, 1979, J. Bact. 139:520-529) und Transformation (Mann, 1979, Plasmid 2:503-505) und Klonierung von Haemophilus chromosomalen Genen in E. coli (Mann et al., 1980, Gene 3:97-112) weisen aus, daß mindestens einige Gene in wirksamer Weise in beiden Organismen exprimiert werden können und daß die Grundmechanismen von transkriptionaler und translationaler Steuerung ähnlich sein können.
In der besonderen Ausführungsform der Beispiele der vorliegenden Erfindung wurde ein E. coli Plasmidsystem als Expressionsvektor ausgewählt. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung eines solchen E. coli Expressionsvektors eingeschränkt.
Gentechnische Verfahren könnten ebenfalls zur weiteren Charakterisierung und/oder Anpassung des geklonten Gens verwendet werden. Beispielsweise könnten ortsgerichtete Mutagenese oder das Gen, das für ein PBOMP-Protein codiert, verwendet werden zur Identifizierung von Bereichen des Proteins, die zur Erzeugung von schützenden Antikörperantworten verantwortlich sind. Sie könnten ebenfalls verwendet werden zur Modifizierung des Proteins in Bereichen außerhalb der schützenden Domänen, beispielsweise durch Erhöhung der Löslichkeit des Proteins für eine einfache Reinigung.

5.4.3 Identifizierung und Reinigung der exprimierten Genprodukte

Expressionsvektoren, die Fremdgeninserts enthalten, können durch 3 allgemeine Verfahren identifiziert werden: (1) DNA-DNA Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, die Sequenzen umfassen, welche homolog zu dem fremdinserierten Gen sind; (2) Anwesenheit oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen (beispielsweise Resistenz gegen Antibiotika, Transformationsphänotyp, Thymidinkinaseaktivität, usw.) und (3) Expression von inserierten Sequenzen auf der Grundlage von physikalischen, immunologischen oder funktionellen Eigenschaften des Genprodukts.
Ist einmal eine Rekombinante identifiziert, die ein PBOMP-Gen exprimiert, sollte das Genprodukt analysiert werden. Immunologische Analyse ist besonders wichtig, da das letztliche Ziel die Verwendung der Genprodukte oder rekombinanten Viren, die solche Produkte exprimieren, in Impfstofformulierungen und/oder als Antigene in Diagnoseimmunassays ist.
Eine Vielzahl von Antisera ist zur Analyse der Immunoreaktivität des Produkts verfügbar, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, polyvalente Antisera und monoklonale Antikörper, beschrieben in Abschnitt 6.2 s.u..
Die Identifizierung der Proteine und Peptide der Erfindung erfordert, daß das PBOMP verwandte Protein oder Peptid für eine Vielzahl von Antikörpern, gerichtet gegen PBOMP, immunoreaktiv ist oder gegen dessen Analoga und Derivate.
Das Protein oder Peptid sollte immunoreaktiv sein, ob es nun von der Expression einer vollständigen PBOMP-Gensequenz herrührt, eines Teils der Gensequenz oder von zwei oder mehreren Gensequenzen, die ligiert werden zur Steuerung der Produktion von Fusionsproteinen. Diese Reaktivität kann durch übliche immunologische Techniken gezeigt werden, wie Radioimmunopräzitation, Radioimmunkompetition, ELISA oder Immunoblots.
Ist einmal das H. influenzae PBOMP verwandte Protein identifiziert, kann es isoliert und durch übliche Verfahren gereinigt werden, einschließlich Chromatographie (beispielsweise Ionenaustausch-, Affinitäts- und Größenausschluß-Säulenchromatographie), Zentrifugieren, Differentiallöslichkeit oder andere übliche Verfahren zur Reinigung von Proteinen. Alternativ dazu, wenn einmal ein immunoreaktives H. influenzae PBOMP verwandtes Protein, das durch eine Rekombinante erzeugt wurde, identifiziert ist, kann die Aminosäuresequenz des immunoreaktiven Proteins aus der Nucleotidsequenz des chimären Gens, das die Rekombinante enthält, gefolgert werden. Im Ergebnis kann das Protein durch übliche chemische Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, synthetisiert werden, (beispielsweise vergleiche Hunkapiller et al., 1984, Nature 310: 105 bis 111).
In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, solche Peptide, ob durch rekombinante DNA-Techniken oder durch chemische Syntheseverfahren hergestellt, alle oder Teile der Aminosäuresequenzen, die im wesentlichen in Figur 11 und 15 dargestellt werden, einschließlich geänderter Sequenzen, in denen funktionell äquivalente Aminosäurereste für Reste substituiert werden innerhalb der Sequenz im Ergebnis einer stillen Änderung, ein. Beispielsweise können eine oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine weitere Aminosäure ähnlicher Polarität substituiert werden, die als funktionelles Äquivalent wirkt und zu einer stillen Änderung führt.
Austausche für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können ausgewählt werden von anderen Mitgliedern der Klasse, zu denen die Aminosäure gehört. Beispielsweise schließen die unpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Glycin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparagin und Glutaminsäure ein.

5.5 Nucleotid-Seguenzierung von PBOMP-Genen

Wenn einmal die Fragmente der DNA, die die PBOMP-Gene enthalten, identifiziert wurden, können die tatsächlichen Nucleotidsequenzen dieser Gene durch Sequenzanalyse der DNA bestimmt werden. Die sequentielle Ordnung dieser Basenpaare kann durch zwei Verfahren bestimmt werden, das Verfahren von Maxam und Gilbert (Maxam und Gilbert, 1980, Methods in Enzymology, 65:49) und das Didesoxy-Verfahren (Sanger et al., 1977, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 74:5463). Die tatsächlichen Start- und Stop-Signale der PBOMP-Gene können durch Analyse der Nucleotidsequenz für offene Leseraster ermittelt werden (Rosenberg et al., 1979, Ann. Rev. Genet. 13:319). Wenn eines oder mehrere offene Leseraster auf dem bestimmten DNA-Fragment gefunden wurden, könnte die Identität des tatsächlichen Gens durch Vergleich der vorbestimmten Aminosäuresequenz des Genprodukts zu der Aminosäuresequenz von PBOMP bestätigt werden. Die Anordnung des richtigen Leserasters kann auch unter Verwendung von Genfusionen bestimmt werden.

5.6 Bestimmung der Immunopotenz von PBOMP und PBOMP-verbundenen Peptiden

Erfahrungen mit Antikörpern zu dem Kapselpolysaccharid von Haemophilus influenzae Typ b, das heißt PRP, zeigen, daß das Vermögen der Antikörper, die Bakterien in in vitro- Assays abzutöten und gegen die Exposition mit Hib zu schützen, in Tiermodellsystemen mit der Fähigkeit eng verbunden ist, eine Schutzimmunantwort bei Säuglingen hervorzurufen.
Anti-PBOMP-Antikörper, hervorgerufen in Antwort auf PBOMP-Proteine und Peptide der Erfindung, die einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind, PBOMP-1:PBOMP-2- und PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsproteine, können unter Verwendung ähnlicher in vitro-Assaysysteme und Tiermodellsysteme zur Demonstration der Befähigung, sowohl Hi- als auch Hib-Zellen abzutöten und in menschlichen Modellsystemen vor der Exposition mit Hib zu schützen, geprüft werden. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können Antikörper in Antwort auf chemisch synthetisierte PBOMP-Peptide oder PBOMP-Peptide, erzeugt durch proteolytische Aufspaltung des PBOMP-Proteins, hervorgerufen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform würden solche PBOMP-Peptidfragmente an einen Proteinträger gekuppelt, beispielsweise Thyroglobulin, Rinderserumalbumin, Diphtheriatoxin oder enttoxifiziertes Toxin (Toxoid), Tetanustoxin oder -toxid, Pseudomonastoxin oder -toxoid, Staphylococcustoxin oder -toxoid, Pertussistoxin oder -toxoid, CRM&sub1;&sub9;&sub7;, usw., CRM&sub1;&sub9;&sub7; unterscheidet sich von nativem Diphtheriatoxin durch eine einzelne Aminosäure. CRM&sub1;&sub9;&sub7; und natives Diphtheriatoxin sind jedoch immunologisch nicht unterscheidbar. Für eine genaue Beschreibung von CRM&sub1;&sub9;&sub7;, siehe Patent- Nr. 4673574, herausgegeben am 16. Juni 1987, die hiermit durch Hinweis in die Beschreibung aufgenommen wird. Die Ergebnisse dieser Systeme sollten eine ähnliche Korrelation mit dem Potential von jenen der PBOMP zeigen, um eine Schutzimmunantwort hervorzurufen und um in zu einem Impfstoff für Säuglinge, Kinder und Erwachsene zu dienen.
Ein in vitro Komplement-vermitteltes bakterizides Assaysystem (Musher et al., 1983, Infect. Immun. 39:297-304; Anderson et al., 1972, J. Clin. Invest. 51:31-38), das bereits zum Messen bakterizider Aktivität von Antikörpern von PRP und Lipopolysaccharid (LPS) gegen H. influenzae verwendet wurde, könnte zur Bestimmung verwendet werden, ob oder nicht gegen ein bestimmtes PBOMP-Peptid oder Fragment davon gerichtete Antikörper, bakterizide Aktivität gegen H. influenzae Typ b und nichttypisierbare H. influenzae aufweist. Diese Assays können gegen eine relativ hohe Zahl von klinischen Isolaten beider Typen von Bakterien ausgeführt werden zur Bestimmung, ob ein breiter Bereich an Stämmen abgetötet wird. Vergleiche Abschnitte 7.1, 9.4 und 10.5 (s.u.) für illustrative Beispiele solcher in vitro bakteriziden Assays.
Weitere Daten über die Fähigkeit eines PBOMP oder eines Fragments davon, eine schützende Antikörperantwort hervorzurufen, können durch die Verwendung eines Jungratten-Meningitis-Modellsystems erzeugt werden (Smith et al., 1973, Infect. Immun. 8:278-290). Jungratten, exponiert vor dem 6. Lebenstag mit einer geeigneten Dosis H. influenzae Typ b, entwickeln Bakteriämie und tödliche Meningitis, ähnlich jenen bei Säuglingen. Wenn der Antikörper, der gegen einen Expositionsstamm wirksam ist, verwendet wird, um Jungratten vor der Exposition passiv zu immunisieren, werden sie vor Meningitis und dem Tod geschützt. Antikörper, gerichtet gegen derzeitigen Impfstoff gegen Haemophilus Typ b, PRP, sind im Jungratten-Modellsystem schützend. Passiver Schutz gegen Meningitis durch Haemophilus Typ b konnte durch Immunisierung von Jungratten mit polyklonalen anti-PBOMP-Kaninchen-Antikörper und anschließendem Exponieren der Ratten mit einer letalen Dosis H.influenzae Typ b gezeigt werden. Siehe Abschnitt 7.2 (s.u.) für ein erläuterndes Beispiel einer solchen in vivo schützenden Antikörperantwort, hervorgerufen durch die Proteine und Peptide der vorliegenden Erfindung.
Daten über die Fähigkeit des Antikörpers, für ein bestimmtes PBOMP gegen Hi zu schützen, könnten unter Verwendung des Chinchilla Otitis media-Tiermodellsystems erhalten werden. (Barenkamp et al., 1986, Infect. Immun. 52:572-78). In diesem Tiermodell werden Chinchillas durch Beimpfen des inneren Ohrkanals mit Hi exponiert. Eine Otitis media in ähnlicher Weise, wie sie bei Menschen gesehen wird, entwickelt sich. Chinchillas, die immunisiert wurden, entweder aktiv mit Hi OMP oder passiv mit Antikörpern, gerichtet gegen Hi OMP, werden gegen aurale Exposition mit Hi geschützt. (Barenkamp et al., s.o.). Dieses Tierrriodellsystem könnte verwendet werden zur Demonstration der Fähigkeit von Antikörpern für ein PBOMP gegen Hi zu schützen.
Es ist möglich, zu zeigen, daß anti-PBOMP-Antikörper zu einem zusätzlichen Schutz, zusammen mit anti-PRP-Antikörper durch Verwendung des Jungratten-Tiermodellsystems in der Lage sind. Anti-PBOMP-1-Antikörper, verdünnt zu einem Punkt, an dem sie nicht mehr in der Lage sind, Jungratten gegen Exposition mit Hib zu schützen, vermischt mit einer ähnlichen Verdünnung von anti-PRP-Antikörpern, können zusätzlichen Schutz zeigen und somit den Tod der Jungratten verhindern. Dieser additive Schutz könnte geeignet sein für eine potentielle Kombination von Impfstoffen, zusammengesetzt aus PRP oder einem Fragment oder Konjugat davon und dem PBOMP oder einem Fragment davon.

5.7 Formulierung eines Impfstoffs

Viele Verfahren werden verwendet zur Einführung der Impfstofformulierung, die nachstehend beschrieben werden in einen Menschen oder ein Tier. Diese schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane und intranasale Verabreichungswege.

5.7.1 Untereinheitsimpfstofformulierungen

Ein Zweck der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Proteinen oder Polypeptidfragmenten, verwandt zu Außenmembranproteinen von H. influenzae, PBOMP, einschließlich PBOMP-1:PBOMP-2- und PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsproteinen und verwandten Peptiden, die verwendet werden als Immunogene in einem Untereinheitsimpfstoff zum Schutz gegen Meningitis und anderen Erkrankungssymptomen von H. influenzae-Infektionen. Untereinheitsimpfstoffe umfassen einzig das relevante immunogene Material, das zur Immunisierung eines Wirts erforderlich ist. Impfstoffe, gentechnisch hergestellte Immunogene, chemisch synthetisierte Immunogene und/oder Immunogene, umfassend authentische im wesentlichen reine H. influenzae PBOMP, isoliert wie hier beschrieben, die in der Lage sind, eine Schutzimmunantwort hervorzurufen, sind besonders vorteilhaft, da keine Gefahr der Infektion des Empfängers besteht. Somit kann PBOMP-verwandtes Protein oder ein Fragment davon aus Rekombinanten gereinigt werden, die PBOMP-Epitope exprimieren. Solche Rekombinanten schließen beliebige der bereits beschriebenen bakteriellen Transformanten, Hefetransformanten oder gezüchteten Zellen, infiziert mit rekombinanten.Viren, die die PBOMP-Epitope exprimieren, ein (siehe Abschnitte 5.4 und 5.5, s.o.). Alternativ dazu kann PBOMP-verwandtes Protein oder Peptid chemisch synthetisiert werden. Zu diesem Zweck kann die Aminosäuresequenz eines solchen Proteins oder Peptids aus der Nucleotidsequenz des Gens gefolgert werden, das seine Expression (siehe Abschnitt 5.5, s.o.) spezifiziert. In einer weiteren alternativen Ausführungsform wird PBOMP-verwandtes Protein oder Peptid in wesentlich reiner Form aus Kulturen von H. influenzae (vergleiche beispielsweise Abschnitt 5.1., s.o.) isoliert.
Ob das Immunogen aus Rekombinanten gereinigt ist oder chemisch synthetisiert wird, das Endprodukt wird auf eine geeignete Konzentration eingestellt und mit einem geeigneten Impfstoffadjuvans formuliert. Geeignete Adjuvantien schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt: oberflächenaktive Stoffe, beispielsweise Hexadecylamin, Octadecylamin, Octadecylaminosäureester, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N'-N-bis(2-hydroxyethylpropandiamin), Methoxyhexadecylglycerin und Pluronicpolyole, Plyamine, beispielsweise Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Polyacrylsäure, Carbopol, Peptide, beispielsweise Muramyldipeptid, Dimethylglycin, Tuftsin, Ölemulsionen und Mineralgele, beispielsweise Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, usw.. Das Immunogen kann auch in Liposomen eingeschlossen sein oder konjugiert an Polysaccharide und/oder andere Polymere zur Verwendung in einer Impfstofformulierung.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das PBOMP-verwandte Protein oder Peptid ein Hapten, das heißt, ein Molekül, das antigen ist, indem es spezifisch oder selektiv mit verwandten Antikörpern reagiert, jedoch nicht immunogen ist, indem es keine Immunantwort hervorrufen kann. In solchen Fällen kann das Hapten kovalent an einen Träger oder an ein immunogenes Molekül gebunden werden, beispielsweise ein großes Protein, wie das Protein Serumalbumin, wird Immunogenizität zu dem gekuppelten Hapten übertragen. Der Hapten-Träger kann zur Verwendung in einem Untereinheitsimpfstoff formuliert werden.

5.7.2 Virale Impfstofformulierungen

Ein weiterer Zweck der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung entweder eines rekombinanten viralen Lebendimpfstoffs oder eines inaktivierten rekombinanten viralen Impfstoffs, der zum Schutz gegen Meningitis und anderen Erkrankungssymptomen von H. influenzae verwendet wird. Zu diesem Zweck werden rekombinante Viren hergestellt, die PBOMP- verwandte Epitope exprimieren (siehe Abschnitte 5.4. und 5.5., s. o.). Wenn der rekombinante Virus infektiös zu dem zu immunisierenden Wirt ist, jedoch keine Krankheit hervorruft, ist ein Lebendimpfstoff bevorzugt aufgrund der Vervielfältigung in dem Wirt, die zu einer verlängerten Stimulierung führt und somit eine wesentlich länger dauernde Immunität überträgt. Der infektiöse rekombinante Virus, wenn er in einen Wirt eingeführt wird, kann das PBOMP-verwandte Protein oder das Polypeptidfragment aus seinem chimären Gen exprimieren und dadurch eine Immunantwort gegen H. influenzae-Antigene hervorrufen. In Fällen, wenn eine solche Immunantwort gegen eine folgende H. influenzae-Infektion schützend ist, kann der rekombinante Lebendvirus selbst in einem vorbeugenden Impfstoff gegen H. influenzae-Infektion verwendet werden. Herstellung eines solchen rekombinanten Virus kann sowohl in vitro- (beispielsweise Gewebskulturzellen), als auch in vivo- Systeme (beispielsweise natürliches Wirtstier), einschließen. Beispielsweise können übliche Verfahren zur Herstellung und Formulierung von Blatternimpfstoff für die Formulierung von rekombinantem Virus-Lebendimpf stoff angepaßt werden, die ein zu PBOMP-verwandtes Protein oder Polypeptid exprimieren.
Multivalente Lebendvirus-Impfstoffe können aus einzelnen oder wenigen infektiösen rekombinanten Viren hergestellt werden, die Epitope von Organismen exprimieren, die Erkrankung zusätzlich zu den Epitopen von H. influenzae PBOMP hervorrufen. Beispielsweise kann ein Pockenvirus gentechnisch behandelt werden, so daß er codierende Sequenzen für andere Epitope zusätzlich zu jenen von H. influenzae PBOMP enthält. Ein solcher rekombinanter Virus selbst kann als immunogen in einem multivalenten Impfstoff verwendet werden. Alternativ dazu kann ein Gemisch von Pocken- oder anderen Viren, die jeweils ein unterschiedliches Gen exprimieren, das für verschiedene Epitope von PBOMP codiert und/oder andere Epitope von anderen krankheitshervorrufenden Organismen in einem multivalenten Impfstoff formuliert werden.
Ungeachtet der Tatsache, ob der rekombinante Virus für den Wirt, der immunisiert werden soll, infektiös ist oder nicht, kann eine inaktivierte Virusimpfstofformulierung hergestellt werden. Inaktivierte Impfstoffe sind "tot" in dem Sinne, daß ihr Infektionsvermögen gestört wurde, gewöhnlich durch chemische Behandlung (beispielsweise Formaldehyd). Idealerweise wird das Infektionsvermögen des Virus ohne Beeinflussung der Proteine zerstört, die die Immunogenizität des Virus tragen. Um inaktivierte Impfstoffe herzustellen, müssen große Mengen an rekombinantem Virus, der das PBOMP-verwandte Protein oder Polypeptid exprimiert, in einer Kultur gezüchtet werden zur Bereitstellung der erforderlichen Menge an relevanten Antigenen. Ein Gemisch von inaktivierten Viren, die verschiedene Epitope exprimieren, kann zur Formulierung der "multivalenten" Impfstoffe verwendet werden. In bestimmten Fällen können diese "multivalenten" inaktivierten Impfstoffe für Lebendimpfstofformulierungen bevorzugt sein aufgrund potentieller Schwierigkeiten mit gegenseitigen Störungen von Lebendviren, die gemeinsam verabreicht werden. In diesem Fall sollte der inaktivierte rekombinante Virus oder das Gemisch von Viren in einem geeigneten Adjuvans formuliert werden, um die immunologische Antwort auf die Antigene zu erhöhen. Geeignete Adjuvantien schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt: oberflächenaktive Stoffe, beispielsweise Hexadecylamin, Octadecylaminosäureester, Octadecylainin, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dicoctadecyl-N'- N-bis (2-hydroxyethylpropandiamin), Methoxyhexadecylglycerin und Pluronicpolyole, Plyamine, beispielsweise Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Polyacrylsäure, Carbopol, Peptide, beispielsweise Muramyldipeptid, Dimethylglycin, Tuftsin, Ölemulsionen und Mineralgele, beispielsweise Aluininiuinhydroxid, Aluminiumphosphat usw..

5.7.3 Passive Immunität und anti-idiotypische Antikörper

Anstelle der aktiven Immunisierung mit viralen oder Untereinheitsimpfstoffen ist es möglich, kurzzeitigen Schutz auf den Wirt durch Verabreichung eines vorgebildeten Antikörpers gegen ein Epitop von H. influenzae zu übertragen. Somit können die Impfstofformulierungen zur Herstellung von Antikörpern zur Verwendung in der passiven Immunotherapie verwendet werden. Humanimmunoglobulin ist bevorzugt in der Humanmedizin, da ein heterologes Immunoglobulin eine Immunantwort für seine fremdimmunogenen Komponenten auslösen kann. Eine solche passive Immunisierung könnte auf einer Behelfsbasis zum unmittelbaren Schutz von nichtimmunisierten Individuen, die speziellen Gefahren exponiert sind, verwendet werden, beispielsweise für Kleinkinder, die Kontakt mit bakteriellen Meningitis-Patienten ausgesetzt sind. Alternativ können diese Antikörper verwendet werden bei der Herstellung von antiidiotypischen Antikörpern, die wiederum als Antigen zur Stimulierung einer Immunantwort gegen H. influenzae PBOMP- Epitope verwendet werden können.

5.8 Diagnose-Assays

Ein weiterer Zweck der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Reagenzien zur Verwendung in Diagnose-Assays für den Nachweis von PBOMP-Antigenen (und folglich H. influenzae) in verschiedenen Körperflüssigkeiten von Individuen, die H. influenzae-Infektion unterliegen.

5.8.1 Immunoassays

In einer Variante dieser Ausführungsform können PBOMP-verwandte Proteine und Peptide der vorliegenden Erfindung als Antigene in Immunassays für den Nachweis von H. influenzae bei verschiedenen Patientengeweben und Körperflüssigkeiten verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt Blut, spinale Flüssigkeit, Sputum, usw..
Die erfindungsgemäßen Antigene können in beliebigen Immunassaysystemen verwendet werden, die auf dem Gebiet bekannt sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt darauf: Radioimmunassays, ELISA, "Sandwich"-Assay-Präzipitationsreaktionen, Geldiffusionspräzipitationsreaktionen, Immundiffusionsassays, Agglutinationsassays, Fluoreszenz-Immunassays, Protein-A-Immunassays und Immunelektrophoreseassays, um nur einige zu nennen.

5.8.2 Nucleinsäure-Hybridisierungsassay

In einer weiteren Art dieser Ausführungsform kann die neue Nucleotidsequenz der Gene, die für fusionsverwandtes Protein und verwandte Peptide der vorliegenden Erfindung codieren, als Sonden in Nucleinsäure-Hybridisierungsassays zum Nachweis von H. influenzae in verschiedenen Patienten-Körperflüssigkeiten verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt: Blut, spinale Flüssigkeit, Sputum, usw.
Die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen können in beliebigen Nucleinsäure-Hybridisierungsassay-Systemen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt: Southern-Blots (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:508); Northern-Blots (Thomas et al., 1980, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5201-05); Colony-Blots (Grunstein et al., 1975, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 72:3961-65), usw..
Die nachstehende Reihe von Beispielen werden zum Zweck der Erläuterung dargelegt, sind jedoch nicht vorgesehen, den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung einzuschränken.

6. Beispiele: Isolierung und Charakterisierung von natürlichen und rekombinanten DNA-abgeleiteten PBOMP

6.1 Isolierung, Reinigung und Analyse von PBOMP-1

In einer Reihe von Versuchen wurde PBOMP-1 im wesentlichen frei von anderen Zellwandkomponenten aus H. influenzae wie nachstehend erhalten:
H. influenzae Eagan wurde über Nacht gezüchtet auf entweder Hirn-Herz-Infusionsmedium, enthaltend 10 ug/ml Hämin und 1 ug/ml NAD (BHI-XV) oder mMIC (Modifizierung von Herriott et al., 1970, J. Bacteriol. 101: 513-16)-Medium. Nach Zentrifugieren bei 10 000 g für 15 min bei 4ºC wurde der Überstand in einen Rocal II Disinfektor gegeben. Das Zellpellet wurde gewogen und in 10 mM HEPES-NaOH (pH 7,4) suspendiert, 1 mM EDTA dazugegeben, mit einem Volumen an Puffer gleich etwa dem Fünffachen des Naßgewichts der Zellen. Die Zellsuspension wurde dann für 5 min in einem Eisbad in 100 ml aliquoten Mengen mit einem Branson Modell 350 Sonifier Cell Disruptor beschallt (Branson Sonic Power, Danbury, CT) bei 60 % Leistung der Impulseinstellung. Nach der Beschallung wurde die aufgebrochene Zellsuspension bei 10 000 g für 5 min bei 4ºC zentrifugiert, um nicht aufgebrochene Zellen zu entfernen. Die sedimentierten nicht aufgebrochenen Zellen wurden dann gewogen und wie vorher in einem Volumen von 10 mM HEPES- NaOH (ph 7,4), 1 mM EDTA, äquivalent dem etwa Fünffachen des Naßgewichtes der nicht aufgebrochenen Zellen erneut beschallt. Die Gesamtmembranfraktion wurde als ein Pellet erhalten, gefolgt von Zugabe von ausreichend NaCl unter Bereitstellung einer Endkonzentration von 0,5 M NaCl und Ultrazentrifugation des aufgebrochenen zellulären Materials bei 100 000 g für etwa 1 h.
Ein Außenmembran-Zellwandkomplex wurde dann durch Entfernen der Innenmembrankomponenten der gesamten Membranfraktion durch wiederholte Extraktion der gesamten Membranfraktion mit 1 % Sarcosyl erhalten, in 10 mM HEPES-NaOH, pH 7,4. Der die äußere Membran-Zellwandfraktion enthaltende unlösliche Rest wurde durch Zentrifugation bei 350 000 g für 30 min isoliert, in 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM EDTA suspendiert und über Nacht bei 4ºC gelagert.
Ein PBOMP-1-Zellwandkomplex wurde aus dem Rest der anderen Proteine in der Außenmembranfraktion durch aufeinanderfolgende Extraktion der Außenmembran-Zellwandfraktion mit Octylglucosid (zweimal) isoliert, gefolgt von Sarcosyl (zweimal). Beide Detergenzien wurden als 1 % (Gewicht/Volumen) in 50 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8,0, verwendet. Die Extraktionen wurden bei Raumtemperatur (20ºC) für 30 min jeweils ausgeführt. Das Gemisch wurde dann bei 100 000 g für 1 h zentrifugiert. Das unlösliche, sedimentierte Material, das nach der Extraktion mit Octylglucosid und Sarcosyl verblieb, ist ein PBOMP-1-Zellwandkomplex.
PBOMP-1 wurde durch 2 Verfahren solubilisiert: (1) Erwärmen auf 60ºC für 1 h in Gegenwart von einem oder verschiedenen Detergenzien oder (2) Aufbrechen der Zellwand durch Lysozyn-Aufschluß bei 37ºC für 1 h in Gegenwart oder Abwesenheit eines Detergens. Nach entweder (1) oder (2) wurde lösliches PBOMP-1 aus unlöslichem Material durch Zentrifugieren bei 100 000 g für 1 h bei 15ºC getrennt. In keinem Verfahren, (1) weder (2), wurde das einzelne Detergens kritisch für die Solubilisierung befunden. Alle Detergenzien, die bislang geprüft wurden (einschließlich: Desoxycholat, Triton X- 100 , Tween-80, CHAPS, CHAPSO, Dodecylmaltosid, Zwittergent 3-14 und Zwittergent 3-16 ) sind tatsächlich wirksam bei der wärmeabhängigen Solubilisierung sowie bei der Lysozym-induzierten Solubilisierung. Außerdem ist Octylglucosid sehr wirksam bei den Lysozym-induzierten Solubilisierungen und wurde routinemäßig bei 1 % (Gewicht/Volumen) Endkonzentration verwendet. Aus 40 g Naßgewichtszellen war es typischerweise möglich, etwa 8 mg PBOMP-1 zu gewinnen, im wesentlichen frei von anderen Zellwandkomponenten. Diese im wesentlichen reine PBOMP-1-Zubereitung wurde in einem SDS-PAGE-System zur Bestimmung des relativen Molekulargewichts der reduzierten denaturierten Form dieses Proteins analysiert und zur Bestimmung seiner Reinheit. (Figur 1)
Proben wurden zur Analyse durch SDS-PAGE durch deren Einstellung auf 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 25 mM Dithiothreitol und 2 % SDS mit 5 x konzentriertem Probepuffer, anschließend Erhitzen für 5 min bei 100ºC, hergestellt. Vor der Elektrophorese wurden alle Proben auf 6 % (Gewicht/Volumen) Saccharose und 0,001 % Bromphenolblau eingestellt. Die meisten Routineanalysen wurden unter Verwendung des Bio-Rad Mini Protean Gel Systems (Redmond, CA) ausgeführt. Die Gele waren 1,5 mm dick und die Trenngele enthielten 15 % Acrylamid mit einem Acrylamidanteil bis zu einem Verhältnis von 30:0,8, 0,375 M Tris-HCl (pH 8,8) und 0,1 % SDS. Das Sammelgel enthielt 4,8 % Acrylamid mit demselben Verhältnis an Acrylamid zu Bis, 125 mm Tris, HCl (pH 7,0) und 0,1 % SDS pro Gel. Nach der Elektrophorese wurden die Gele für mindestens 1 Stunde mit 0,125 % (Gewicht/Volumen) Goomassie blue in Ethanol:Essigsäure: Wasser (5:1:5) gefärbt und dann im selben Lösungsmittelsystem ohne den blauen Farbstoff entfärbt. Vorgefärbte Standards niederen Molekulargewichts schlossen die nachstehenden ein: Ovalbumin 43000; alpha-Ghymotrypsinogen 25700; Beta-Lactoglobulin 18400; Lysozym 14300; Rindertrypsininhibitor 6200; Insulin (A- und B-Ketten) 2300 und 3400 (BRL, Bethesda, MD) wurden verwendet, um die Bestimmung des relativen Molekulargewichts von PBOMP-1 zu unterstützen.
Weitere Reinigung von PBOMP-1 kann durch Standardverfahren erreicht werden, wie Ionenaustauschchromatographie, Molekularsieb, hydrophobe oder Umkehrphasenchromatographie, Ghromatofokussierung, Gelelektrophorese und dergleichen.

6.1.1 Charakterisierung von PBOMP-1 durch Aminosäurezusamnensetzung und Sequenz

Aminosäureanalyse wurde nach dem Verfahren von Simpson et al., (1976, J. Biol. Chem. 251:1936-1940) ausgeführt. Hydrolyse wurde ausgeführt durch Erwärmen von 0,5 bis 1 mg Protein in 0,1 ml 4 N Methansulfonsäure unter Vakuum in einem dickwandigen, verschlossenen Glasrohr bei 100ºC für 22 Stunden. Die Menge jeder Aminosäure wurde erhalten durch Vergleich der Flächen unter den verschiedenen Peaks mit den Flächen, die erhalten wurden unter Verwendung von bekannten Mengen von Standardaminosäuren. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 angeführt. Tabelle 1 Aminosäurezusammensetzung von PBOMP-1a Aminosäurerest Anzahl Asparaginsäure (Asp+Asn) Threonin Serin Glutaminsäure (Glu+Gln) Prolin Glycin Alanin Cystein Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Lysin Histidin Arginin Tryptophan a Das scheinbare Molekulargewicht von PBOMP-1 war 15057 Dalton. Die Gesamtzahl der Aminosäuren betrug 140.
Anfängliche Versuche beim Seguenzieren von PBOMP-1 unter Verwendung von Edman-Chemie ergaben keine zufriedenstellenden Ergebnisse aufgrund eines blockierten N-terminalen Restes. Um eine Teilaminosäuresequenz-Information zu erhalten, war es notwendig, das 16 000 Dalton Molekulargewicht PBOMP, mit proteolytischen Enzymen unter Bereitstellung von Peptidfragmenten, die zur Sequenzanalyse zugänglich sind, enzymatisch aufzuschließen.
Ein proteolytischer Aufschluß von dem 16 000 Dalton PBOMP-1, erhalten unter Verwendung von Trypsin bei 27ºC für 1 h, wurde durch Umkehrphasen-Hochruck-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) unter Verwendung einer C18-Säule getrennt. Ein großer, hydrophober Peptid-Peak (T9) wurde isoliert und anschließend auf einem Polybren-beschichteten Glasfaserpapier vor dem Start der Aminosäuresequenzierung immobilisiert.
Das T9-Peptid wurde durch Edman-Abbau (Edman et al., 1967, Eur. J. Biochem. 1:80-91) sequenziert. Jeder Zyklus des Sequenators, erzeugte eine Anilinothiazolinonphenylthiohydantoin-(PTH)-Aminosäure. Die Analyse wurde auf einer Umkehrphasen C18-HPLC-Patronen-Säule in einem flüssigchromatographischen System ausgeführt. Die PTH wurden bei Raumtemperatur mit einem Natriumacetat-Acetonitril-Gradienten eluiert und bei 270 nm mit einem UV-Detektor mit variabler Wellenlänge nachgewiesen.
Die Sequenzanalyse des T9-Peptids war wie nachstehend: Tyr-Asn-Thr-Val-Tyr-Phe-Gly-Phe-Asp-Lys-Tyr-Asp-Ile- Thr-Gly-Phe-Tyr-Val-Thr-Ile-Asp-Ala-Asp-Ala-Ala-Tyr-Leu-Asn- Ala-Thr-Pro-Ala-Ala.
Das T9-Peptid ist stark hydrophob und enthält 8 aromatische Aminosäuren (5 Tyr, 3 Phe) und 5 aliphatische Seitenkettenaminosäuren (1 Leu, 2 Val, 2 Ile). Der Tyrosingehalt dieses Peptids ist hoch, jedoch konsistent mit der Gesamtaminosäurezusammensetzung von PBOMP-1 (Tabelle 1). Zusätzlich ist PBOMP-1 unüblich darin, daß es 13 Tyrosinreste enthält, jedoch nicht Methionin oder Tryptophan.

6.1.2 Charakterisierung von PBOMP-1 durch Fettsäureanalyse

Wie in Abschnitt 6.1.1. ausgewiesen, führten anfängliche Versuche, PBOMP-1 durch Edman-Abbau zu sequenzieren, nicht zu zufriedenstellenden Ergebnissen aufgrund des blokkierten N-terminalen Restes. Fettsäureanalyse an gereinigtem H. influenzae PBOMP-1 wurde ausgeführt, um zu untersuchen, ob kovalent gebundene Fettsäureacylgruppen auf dem PBOMP-1-Peptid identifiziert werden könnten.
Vor der Fettsäureanalyse wurde PBOMP-1-Protein isoliert, wie vorstehend in Abschnitt 6.1 beschrieben, ausgiebig mit einem Gemisch von organischen Lösungsmitteln extrahiert, das heißt Chloroform:Methanol (2:1) und mit Desoxycholatdetergenz, um Reste von Verunreinigungen von endogenen Lipiden zu entfernen, Phospholipiden, usw.. Das freigelegte Protein wurde erhalten, entweder durch Acetonfällung oder durch ausgiebige Dialyse und durch Lyophilisieren getrocknet. Eine bekannte Menge an Nonadecansäure wurde als innerer Standard zu dem getrockneten, gereinigten PBOMP-1 (1 bis 3 mg) zugegeben und das Gemisch wurde mit 200 ul 4 N HCl bei 110ºC für 4 - Stunden unter Stickstoffatmosphäre hydrolysiert. Eine derartige Säurehydrolyse setzte Amid- oder Ester-gebundene Fettsäuren frei. Das Hydrolysat, mit Wasser auf 2 ml verdünnt, wurde dreimal mit gleichen Volumina Hexan extrahiert. Die kombinierten Hexanphasen wurden zweimal mit gleichen Volumina Salzlösung gewaschen und dann über Natriumsulfat getrocknet. Die Fettsäuren wurden in die entsprechenden Methylester mit Diazomethan (Schlenk, 1960, Anal. Chem. 32: 1412 bis 1414) umgewandelt, bevor sie in einen Gasflüssigchromatographen in ein Perkin Elmer Modell 8500 injiziert wurden. Trennung der Fettsäuremethylester wurde an einer SPB-1 Quarzkapillarsäule ausgeführt (Supelco Inc., Belefonte, PA). Erhaltene Peaks wurden durch Vergleich mit bekannten Standards identifiziert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 16 dargestellt.
Wie in Figur 16 ausgewiesen, sind 3 hauptsächliche Fettsäuren mit PBOMP-1 verbunden, das heißt Laurinsäure (C12), Palmitinsäure (C16) und ein Derivat von Palmitinsäure (C16'), für das eine definitive Identifizierung noch aussteht. C16' ist vielleicht eine verzweigtkettige Fettsäure mit 16 Kohlenstoffatomen.

6.2 Herstellung von anti-PBOMP-1- und anti-PBOMP-2-Antikörnern

6.2.1 Herstellung von polyklonalem anti-PBOMP-1- und anti- PBOMP-2-Antiserum

Im wesentlichen reines PBOMP-1 wurde als Immunogen zur Herstellung von anti-PBOMP-1-Antikörpern verwendet. Teilweise gereinigte, PBOMP-1 angereicherte Fraktionen, hergestellt wie in Abschnitt 6.1 beschrieben, wurden an 15 % SDS- PAGE-Gel bei 35 mA Konstantstrom und 10ºC Elektrophorese unterzogen. Die Proteinbanden wurden fixiert und gefärbt wie in Abschnitt 6.1.1 beschrieben. PBOMP-1-Banden wurden aus den Gelen herausgenommen und gegen Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) (20 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4) dialysiert bis zum Gleichgewicht. Die Acrylamid-Gelfragmente, die PBOMP- 1 enthielten, wurden durch Durchleiten durch eine Kanüle Kaliber 25 in PBS zerkleinert. Die Fragmente wurden intramuskulär in weiße Neuseeländer-Kaninchen an verschiedenen Stellen injiziert. Jedes Kaninchen erhielt eine Gesamtmenge von etwa PBOMP-1. Die Kaninchen wurden nach 2 Wochen und 3 Wochen nach der anfänglichen Immunisierung aufgefrischt. Den Tieren wurde eine Woche nach der letzten Immunisierung Blut entnommen und das Serum gesammelt. Die Tiere wurden mit 20 ug PBOMP-1 in Acrylamid zweimonatlich aufgefrischt, um hohe Titer an anti-PBOMP-1-Antikörper zu erhalten.
Alternativ wurde PBOMP-1 isoliert, wie vorstehend in Abschnitt 5.1 beschrieben, mit unvollständigem Freund'schem Adjuvans vermischt und emulgiert. Kaninchen wurden intramuskulär mit etwa 20 ug PBOMP-1 in Freund'schem Adjuvans geimpft. Die Tiere wurden 2 Wochen und 3 Wochen nach der anfänglichen Immunisierung aufgefrischt und 1 Woche nach der letzten Immunisierung wurde Blut entnommen.
Im wesentlichen reines PBOMP-2 wurde als Immunogen zur Herstellung von anti-PBOMP-2-Antikörpern verwendet. Teilweise gereinigte, mit PBOMP-2 angereicherte Fraktionen wurden hergestellt, wie beschrieben in Abschnitt 6.1 und wurden Elektrophorese an 15 % SDS-PAGE-Gel bei 35 mA Konstantstrom und 10ºC unterzogen. Die Proteinbanden wurden fixiert und gefärbt, wie in Abschnitt 6.1.1 beschrieben. PBOMP-2-Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und gegen Phosphat gepufferte Salzlösung PBS bis zum Gleichgewicht dialysiert. Die Acrylamid-Gelfragmente, die PBOMP-2 enthielten, wurden durch Leiten durch eine Kanüle Kaliber 25 in PBS zerkleinert. Die zerkleinerten PBOMP-2-Gelfragmente wurden mit vollständigem Freund'schem Adjuvans vermischt und emulgiert. Kaninchen wurden intramuskulär mit etwa 10 ug PBOMP-2 in Freund'schem Adjuvans geimpft. Die Kaninchen wurden mit 10 ug derselben Zubereitung in unvollständigem Freund'schem Adjuvans 4 Wochen nach der ersten Impfung aufgefrischt.

6.2.2 Herstellung von anti-PBOMP-1 und anti-PBOMP-2 monoklonalen Antikörnern

Hybridom-Zellinien, die Antikörper für PBOMP-1 oder PBOMP-2 ausschütten, wurden durch Fusion der Mausmyelom-Zellinie X63.Ag8.6543 mit Milzzellen, erhalten aus einer C57/B1- Maus, immunisiert gegen H. influenzae, wie nachstehend erhalten: Eine weibliche C57/B1-Maus wurde intraperitoneal viermal über einen Zeitraum von 2 Monaten mit 1 x 10&sup6; H. influenzae- Stamm S2-Zellen beimpft. 3 Monate später wurde die Maus mit im wesentlichen reinem PBOMP-1 oder PBOMP-2, isoliert aus einer SDS-PAGE-Bande, wie beschrieben in Abschnitt 6.2.1, immunisiert. Einen Monat später erhielt die Maus eine intravenöse Injektion von vollständigen Außenmembranen von S2. Die Zellfusion wurde am vierten Tag durch postintravenöse Injektion gemäß Standardverfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, ausgeführt (beispielsweise Gefter et al., 1977, Somat. Cell. Genet 3:231-36).
Überstände von Hybridom-Zellkulturen wurden durch Standard-ELISA unter Verwendung von H. influenzae-Außenmembranproteinen als Antigene abgesucht. Die Assays wurden auf Polystyrolplatten mit 96 Vertiefungen, beschichtet über Nacht bei 4ºC mit OMP, ausgeführt.
Die Platten wurden mit 40 mM Tris (pH 8,0) 150 mM NaCl, 5 % fettarmer Trockenmilch (BLOTTO) (siehe Abschnitt 6.4.4) blockiert und mit PBS/0,1 % Tween-20 gewaschen. Kulturüberstände, verdünnt 1:10 in PBS Tween-20, wurden zugegeben, für 60 min bei 25ºC inkubiert und wie vorstehend gewaschen. Gebundene Antikörper wurden mit alkalischen Phosphatase-Ziege F(ab')&sub2;-anti-Maus (IgG, IgM) und dem alkalischen Phosphatase-Substrat nachgewiesen. Positive Überstände wurden dann durch punktautoradiogaphische Analyse mit gereinigtem PBOMP-1, E. coli OMP und 52 Lipopolysaccharid (LPS) abgesucht. Gewünschte Hybridoma wurden durch begrenzte Verdünnung rekloniert (Mckearn, 1980, in Monoclonal Antibodies, Kennett, Mckearn und Bechtol, Herausgeber, Plenum Press, Seite 374) und durch Western-Blot mit Hib OMP abgesucht. Ausgewählte Hybridoma wurden in Balb/c-Mäuse zum Wachstum als Aszites durch Standardverfahren injiziert (Brodeur et al., 1984, J. Immunol. Meth. 71:265-72).
17 der durch Fusion von Mausmyelomzellen mit Milzzellen erzeugten Hybridoma aüs C7/B1-Mäusen, immunisiert mit PBOMP-2, wurden hinsichtlich ihrer Reaktivität zu PBOMP-2 unter Verwendung des Standard-ELISA-Assay abgesucht. Einer der Hybridoma, bezeichnet mit 61-1, wurde als spezifisch für PBOMP-2 befunden. Western-Blot-Verfahren, wie nachstehend beschrieben in Abschnitt 6.5.5 unter Verwendung von 61-1 als primärem Antikörper, zeigten, daß PBOMP-2 oder ein PBOMP-2- ähnliches Protein konserviert war und in den 3 klinisch nichttypisierbaren H. influenzae-Stämmen 0045E, 1939, und HST31 exprimiert wurde (siehe Figur 29).

6.3 Reaktivität von anti-PBOMP-1- und anti-PBOMP-2-Antikörfern mit E. coli

Western-Blot-Analyse der Reaktivität von anti-PBOMP- 1- und anti-PBOMP-2-Antiserum wurde wie in dem nachstehenden Abschnitt 6.4.4 beschrieben ausgeführt. 10 ul einer über Nacht in Probezubereitungspuffer, enthaltend 2-Mercaptoethanol, lysierten bakteriellen Kultur, wurden auf jede Bahn eines 15 % SDS-PAGE-Gels gegeben. Nach Elektrophorese und Übertragen auf Nitrocellulose wurden die Blots mit 1: 250-Verdünnungen von polyklonalen Kaninchen anti-PBOMP-1 sondiert. Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertem Ziegeanti-Kaninchen-IgG (Kirkegaard und Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) zeigte, daß die anti-PBOMP-1-Antisera das PBOMP-1 in Haemophilus und ein 18 000 Dalton-Protein in E. coli (Figur 2A) erkannten.
Um zu bestätigen, daß ein Epitop von PBOMP-1 mit einem Protein von E. coli mit 18 000 Dalton kreuzreagiert, wurden monoklonale Antikörper gegen PBOMP-1 hinsichtlich Reaktivität gegen E. coli-Proteine abgesucht. Obwohl die meisten der abgesuchten monoklonalen Antikörper mit E. coli nicht reagierten, reagierte eine Klasse von monoklonalen Antikörpern, ausgewiesen als monoklonale Antikörper G1-1, stark mit PBOMP-1 von Haemophilus und mit einem 18 000 Dalton-Protein in E. coli (Figur 2B). Dies weist aus, daß zumindest 1 Epitop, das auf PBOMP-1 vorliegt, mit einem Epitop eines E. coli-Proteins kreuzreagiert. Dies zeigt, daß ein Antiserum gegen H. influenzae PBOMP-1 auch gegen E. coli-Infektionen schützen kann. Der anti-PBÖMP-2-monoklonale Antikörper 61-1, wies nur eine schwache Kreuzreaktion mit einem Protein von etwa 15 000 Dalton von E. coli auf, zeigte jedoch keine nachweisbare Kreuzreaktivität mit PBOMP-1.

6.4 Allgemeine Verfahren, die zur Herstellung von rekombinanten Plasmiden verwendet wurden.

6.4.1 Bedingungen für Aufschlüsse mit Restriktionsenzym

Restriktionsendonucleasen wurden von BRL (Bethesda, MD), IBI (New Haven, CT), New England Biolabs (Beverly, MA) oder US Biochemical Corporation (Cleveland, OH) bezogen.
Restriktionsenzym-Aufschlüsse wurden durch Abgabe von DNA in einen geeigneten Restriktionspuffer ausgeführt, Zugabe von Restriktionsendonuclease und Inkubieren für einen geeigneten Zeitraum, um vollständigen Aufschluß zu gewährleisten. Eine Enzymeinheit wird als die Menge definiert, die erforderlich ist, um 1,0 ug DNA des Phagen-Lambda in 1 h in einem Gesamtreaktionsgemisch von 20 ul Volumen aufzuspalten. Mit den verschiedenen Enzymen verwendete Puffer sind nachstehend aufgeführt.
Salzarme Puffer, verwendet für ClaI-, HpaI-, HpaII- und KpnI-Aufschlüsse, bestanden aus: 10 mM Tris (pH 8,0), 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM Dithiothreitol (DTT).
Puffer mit mittlerem Salzgehalt, verwendet für AluI-, AvaI-, EcoRII-, EcoRV-, HaeII-, HaeIII-, HincIII-, HindIII-, PstI-, Sau3AI-, SphI-, SstI-, SstII-, TagI- und XhoI-Aufschlüsse, bestanden aus: 50 mM Tris (pH 8,0), 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 10 mM DTT.
Stark salzhaltige Puffer, verwendet für BamHI-, ECcoRI-, PvuI-, SalI- und XbaI-Aufschlüsse, bestanden aus 50 mM Tris (pH 8,0), 10 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl und 10 mM DTT.
Der für SmaI-Aufschlüsse verwendete Puffer, bestand aus: 10 mM Tris (pH 8,0), 20 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM DTT. Der für ScaI-Aufschlüsse verwendete Puffer, bestand aus: 100 mm NaCl: 10 mM Tris HCl (pH 7,4); 10 mM MgCl&sub2; und 1 mM DTT. Alle Restriktionsaufschlüsse wurden bei 37ºC ausgeführt mit der Abweichung von TagI, der bei 60ºC ausgeführt wurde.

6.4.2 Gelreinigüng von DNA-Fragmenten

Nach Aufschlüssen mit Restriktionsenzym wurden DNA- Fragmente von verschiedenen Größen abgetrennt und unter Verwendung von Gelelektrophorese in bei niedriger Temperatur schmelzender Agarose gereinigt (FMC LGT Agarose) unter Verwendung von 50 mM Tris-Acetat 1 mM EDTA-Puffer pH 7,8 bei 10 V/cm. Agarosekonzentrationen variierten von 0,8 % bis 1,5 % in Abhängigkeit von der Größe der Fragmente, die zu gewinnen waren. DNA-Banden wurden durch Ethidiumbromidfluoreszenz sichtbar gemacht und aus dem Gel ausgeschnitten. DNA wurde durch Schmelzen der Agarose bei 65ºC unter Zugabe von 4 Volumina 0,65 M NaCl, 10 M Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, um das Gemisch auf eine Endkonzentration von 0,5 M NaCl zu bringen, Aufgeben der DNA auf eine NACS-Säule (BRL, Bethesda, MD), die mit 0,5 mM NaCl, 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA (Beladungspuffer) ins Gleichgewicht gebracht wurde, Waschen der Säule mit 3 bis 5 Volumina Beladungspuffer und Eluieren mit 2 bis 3 Volumina 2 M NaCl, 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA gewonnen. Das DNA-Eluat wurde 1:1 mit bidestilliertem H&sub2;O verdünnt und mit 3 Volumina Ethanol gefällt. Das Pellet wurde mit 70 % Ethanol gewaschen, vakuumgetrocknet und in 10 mM Tris-HCl-Puffer resuspendiert, pH 7,5 enthaltend 1 mM EDTA (TE-Puffer).

6.4.3 DNA-Ligierung

Alle Ligierungen wurden unter Verwendung von T4 DNA- Ligase ausgeführt. T4 DNA-Ligase wurde von BRL (Bethesda, MD), United States Biochemicals (Cleveland, OH) oder Boehringer (Indianapolis, IN) bezogen. Eine Einheit (U) von T4 DNA Ligase wird als die Menge definiert, die erforderlich ist, um 50 % Ligierung von HindIII-Fragmenten von DNA des Bakteriophagen Lambda in 30 min bei 16ºC in 20 ul Volumen Ligase-Puffer bei einer 5'-DNA-Termini-Konzentration von 0,12 uM (300 ug/ml) zu erhalten. DNA-Ligierungen wurden in Ligase-Puffer ausgeführt, bestehend aus: 50 mM Tris (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, mM DTT, 1 mM Adenosintriphosphat). Normalerweise wurde eine DNA-Konzentration im Bereich von 20 bis 30 ug/ml und einem Mol-Verhältnis von Vektor zu Insert von 1:1 verwendet. T4 DNA-Ligase wurde in einem Verhältnis von 1 U zu 20 ul Reaktionsvolumen zugegeben. Inkubationen wurden für 18 bis 24 Stunden ausgeführt. Temperaturen wurden bei 15ºC für Ligierungen mit kohäsivem Ende ausgeführt und 22ºC für Ligierungen am glatten Ende. Wenn ausreichend Material verfügbar war, wurden die Ligierungen durch Analyse eines Teils des Reaktionsgemisches durch Agarose-Gelelektrophorese geprüft.

6.4.4 Protein-Immuno-Blot-Analyse (Western-Blot)

Proteine wurden auf Nitrocellulosebögen für Immuno- Blot-Analyse durch verschiedene Techniken in Abhängigkeit von der besonderen Anwendung fixiert. Phagenplaques wurden von Agarplatten durch vorsichtiges Anordnen einer sterilen 8,1 cm φ aufweisenden Nitrocellulose-Scheibe auf der Oberfläche einer Phagen-Titerplatte mit einem Durchnesser von 10 cm übertragen. Der Bogen wurde vollständig feucht werden lassen, die Orte durch Ausstanzen durch den Filter mit einer sterilen Nadel markiert und der Filter nach 2 min angehoben.
Kolonieblots wurden durch Übertragen von bakteriellen Kolonien auf einen Nitrocellulosebogen, Züchten der Kolonien durch Anordnen des Bogens (Kolonie zur Oberseite) auf Nähragar für 4 bis 6 Stunden und Chlordampf-Exposition des Bogens für 30 min zur Lyse der Kolonien ausgeführt. Proteingel-Übertragung wurde durch Anordnen eines SDS-PAGE-Gels, enthaltend ein Proteingemisch, das zu analysieren war, auf einen Nitrocellulosebogen und Anwenden von Horizontal-Elektrophorese in einem Hoeffer-Transphor-Gerät bei 0,5 A für 14 h in 25 mM Tris 0,38 M Glycin pH 8,8-Puffer ausgeführt.
Nach vollständigem Ablauf der Proteinübertragung wurden die Filter in 50 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 5 % fettarmer Trockenmilch (BLOTTO) bei 37ºC für 1 h in allen Fällen eingeweicht, mit der Abweichung von Kolonie-Blots. Wenn Kolonie-Blots ausgeführt wurden, wurden die Filter über Nacht bei 4ºC in BLOTTO eingeweicht, enthaltend 1 mg/ml Lysozym zum Aufschluß der Zelltrümmer. Filter wurden dann mit einer ersten Antikörpersonde bei einer geeigneten Verdünnung absorbiert (bestimmt durch Versuch und Irrtum) in BLOTTO für 3 h bei 37ºC, 3 x für 15 min mit BLOTTO gewaschen, mit Meerrettich-Peroxidase, konjugiert mit dem zweiten Antikörper, absorbiert (Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) bei einer Verdünnung von 1:500 in BLOTTO für 1 h bei 37ºC und mit BLOTTO 3 x für 15 min gewaschen. Die Filter wurden in 50 mM Tris (pH 7,0), 150 mM NaCl, 0,01 % Wasserstoffperoxid angeordnet und 0,06 % 4-Chlor-1-naphthol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in Methanol zugegeben. Wenn sich innerhalb von 20 min keine blaue Farbe entwickelte, wurde die beobachtete Reaktion als negativ angesehen. Die Reaktion wurde durch Übertragen der Filter in destilliertes Wasser und Trockenblotten gestoppt.

6.4.5 Genfusionen

Fusionen eines Gens oder Genfragments, das für ein PBOMP-Protein oder Peptid davon codiert, an ein weiteres Gen, wie ein Gen, das für alkalische Phosphatase codiert (Phoa) wurden, wie von Manoil und Beckwith beschrieben (1985, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:8129-8133), ausgeführt. Rekombinante Plasmide wurden in einen E. coli-Stamm, der eine Deletion des nativen Phoa-Gens enthält und ein Derivat von Transposon Tns (Tnphoa) trägt, das ein Gen für alkalische Phosphatase enthält, das keinen Promotor und keine Membrantransport-Signalsequenz aufweist, eingeführt, inseriert in die linke terminale Wiederholung von Tn5 auf ein F-Prime-Plasmid. Folglich erfordert die Herstellung von aktiven alkalischen Phosphataseenzym Transposition von TnPhoA, so daß das PhoA-Gen in dem Raster innerhalb eines aktiv transkribierenden Gens, enthaltend ein Membrantransport-Signalpeptid, fusioniert wird. Solche Transpositionen wurden durch Plattieren von Zellen in Gegenwart von 40 ug/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (XP, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) nachgewiesen. In Gegenwart dieses Farbstoffes erscheinen aktives alkalisches Phosphataseenzym erzeugende Kolonien intensiv blau in der Farbe, während Kolonien ohne aktive alkalische Phosphatase weiß erscheinen.

6.4.6 DNA-Filterhybridisierungs-Analyse (Southern-Blot)

DNA-Filterhybridisierungs-Analyse wurde gemäß Verfahren von Southern ausgeführt (1975, J. Mol. Biol. 98: 508) Durch Filterhybridisierung der zu analysierenden DNA wurde mit geeigneter(n) Restriktionsendonuclease(en) aufgeschlossen und durch Agarose-Gelelektrophorese in 0,8 % Agarose aufgetrennt (Seakem Portland, ME) unter Verwendung von 90 mM Tris- Borat, 8 mM EDTA-Puffer und 10 V/cm. Die DNA in dem Gel wurde durch Einweichen des Gels in 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH für 1 h denaturiert und durch Einweichen in 1,5 M NaCl/1,0 M Tris-HCl für 1 h neutralisiert. Denaturierte DNA wurde auf Nitrocellulose-Filterpapier durch Blotten übertragen. Nach der Übertragung der DNA wurden die Filter mit 6 x SSC gewaschen (hergestellt durch Verdünnung von 20 x SSC Stammlösung, enthaltend 175,5 g NaCl und 88,2 g Na-Citrat/l) gewaschen und luftgetrocknet. DNA-Fragmente wurden auf dem Filter durch Backen bei 80ºC für 2 h unter Vakuum fixiert.
DNA-Hybridisierungssonden wurden durch Nick-DNA-Neusynthese gemäß dem Verfahren von Rigby et al. hergestellt (1977, J. Mol. Biol., 113: 237-244). DNA für die Sonde (1 bis 2 ug) wurde in 100 ul Nick-Translations-Puffer gelöst (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgSO&sub4;, 10 mM DTT, 5 ug/ml Rinderserumalbumin und 20 ug jeweils dGTP, dCTP und dTTP). Zu diesem Reaktionsgemisch wurden 100 uCi alpha ³²P-dATP (Amersham, 2 bis 3000 Ci/mMol), 1,0 ng Desoxyribonuclease I (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 10 U E. coli DNA Polymerase I (Boehringer) zugegeben und das Gemisch wurde bei 15ºC für 45 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA auf 50 mM gestoppt und für 10 min auf 65ºC erhitzt, um die Enzyme zu desaktivieren. Die markierte DNA wurde durch Zugabe von 3 Volumina Ethanol gefällt und zu 50 pil 0,3 M Amnoniumacetat (NH&sub4;OAc) resuspendiert. Die Probe auf eine 1 ml Biogel P-50 Spin-Säule, mit 0,3 M NH&sub4;OAc ins Gleichgewicht gebracht, gegeben und durch Zentrifugieren bei 500 g für 5 min eluiert. Die Säule wurde mit 100 ul 0,3 M NH&sub4;OAc gewaschen und die Eluate vereinigt und mit 3 Volumina Ethanol gefällt. Das markierte DNA-Pellet wurde vakuumgetrocknet, in TE-Puffer resuspendiert, radioaktiver Einbau wurde mit einem Beckman (LS9000) Szintillationszähler durch Cherenkov-Streuung gemessen.
Zur Hybridisierung wurden Filter mit gebundenen DNA mit 6 x SSC befeuchtet und vorhybridisiert mit 6 x SSC/0,5 % SDS/5 x Denhardt's Lösung / 100 ug/ml tRNA bei 68ºC für 2 h zum Blockieren eines Überschusses an Bindungskapazität des Filters (1 x Denhardt's Lösung ist 0,02 % Ficoll, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon, 0,02 % Rinderserumalbumin in Wasser). Die Hybridisierungsreaktion wurde in dem gleichen Puffer ausgeführt, zu dem 0,01 M EDTA und 5 bis 10 Millionen CPM (Cherenkov) markierte Sonde zugegeben wurde. Diese Sondenlösung wurde auf 90ºC für 10 min vor dem Anwenden erwärmt, um die DNA-Stränge zu denaturieren, auf 68ºC gekühlt und mit dem Filter bei 68ºC für 18 bis 24 h inkubiert. Nach Hybridisierung wurden die Filter mit verschiedenen Sätzen von 0,1 x SSC/0,5 % SDS bei 68ºC gewaschen, um nicht spezifisch gebundene Sonden zu entfernen. Unter den verwendeten Bedingungen würde DNA-Homologie, die größer oder gleich als 90 % ist, positive Bindung der DNA-Sonde zeigen. Filter wurden luftgetrocknet und ein Kodak XAR-Film bei -70ºC unter Verwendung von Dupont CRONEX "Lightning Plus"-Verstärkerschirnen damit belichtet.

6.5 Klonierung der PBOMP-Gene von H. influenzae

Der Ursprung von H. influenzae chromosomaler DNA zum Klonieren der PBOMP-Gene war entweder H. influenzae KW2Ob (HIKW20B), ein Derivat des nicht eingekapselten Rd-Stammes von Hi, transformiert zu Typ b+ durch DNA von Stamm b-Eagan (Moxon et al., 1984, Clin. Invest. 73:298-306) oder H. influenzae 52, (Hi S2), eine spontane Kapsel-minus-Mutante von Hib Eagan.
Um eine Phagen-Lambda-Bank zu erzeugen, wurde chromosomale DNA aus Hi getrennt zu einer mittleren Länge von etwa 15 000 Basenpaaren (Bp), durch Behandlung mit T4 DNA Polynerase mit glatten Enden versehen, mit EcoRI DNA-Methylase modifiziert, an synthetische EcoRI-Linker ligiert und in dem rekombinanten Lambda-Phagen-Vektor Charon 4 kloniert.
Um eine Plasmid-Bank von chromosomaler DNA von Hi zu erzeugen, wurde S2 teilweise mit Sau3A geschnitten, die 3 bis 8 Kilobasen langen (kB) Restriktionsfragmente. Die so erzeugt wurden, wurden isoliert und in Plasmid-Vektor pGD103 an der BamHI-Restriktionsstelle ligiert. Dieses Plasmid ist ein Derivat von pLG339 (siehe Figur 3, vergleiche ebenfalls Stoker et al., 1982, Gene 18:335-41) und wird in 6 bis 8 Kopien/Zelle ausgeführt. Es enthält auch das lac Z-alpha-Peptid und den Polylinkerbereich aus Plasmid pUCB und daher, wenn transformiert in einem geeigneten E. coli-Stamm (wie JM83), erlaubt es die Selektion von rekombinanten Plasmiden durch Auslesen hinsichtlich Verlust an Lac+ Phänotyp. Wenn in der geeigneten Orientierung kloniert, ist es auch möglich, daß ein kloniertes Gen, das schlecht in E. coli exprimiert wird, unter die Steuerung eines starken, regulierten lac-Promotors kommen würde. E. coli-enthaltende rekombinante Plasmide wurden hinsichtlich der Herstellung von PBOMP unter Verwendung eines zu einem Pool zusammengegebenen Gemisches von monoklonalen Antikörpern oder polyklonalem anti-PBOMP-1-Antiserum abgesucht.

6.5.1 Konstruktion einer Hi Plasmid-Bank

Es ist möglich, daß PBOMP-1-Protein nicht exprimiert wird am oder inkompatibel ist mit dem Lambda-Phagen. Um dies zu prüfen, konstruierten wir eine chromosomale Plasmid-Bank von Hi S2. Klonieren von E. coli OMP-Genen an Plasmide mit hoher Kopiezahl erwies sich als zu toxisch (siehe Beispiel Beck et al., 1980, Nucleic Acid Res. 8:3011 bis 3024). Um dieses Problem zu vermeiden, verwendeten wir Plasmid pGD103, das eine geringe Kopiezahl liefert (siehe Figur 3).
Chromosomale DNA aus Hi S2 wurde teilweise mit Restriktionsendonuclease Sau3A (BRL, Bethesda, MD) aufgeschlossen. 500 ug DNA wurden in 5 ml Restriktionspuffer mit 50 Einheiten Sau3a für 1 h bei 37ºC aufgeschlossen. Fragmente wurden durch Geschwindigkeits-Sedimentation in einem Beckman SW28-Rotor auf 10 bis 40 % Saccharose-Gradienten, enthaltend 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 1 M NaCl bei 140 000 g für 24 h getrennt. 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt und als aliquote Mengen durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Fraktionen, die Restriktionsfragmente von 3 bis 8 kB in der Länge enthielten, wurden gesammelt und in TE-Puffer konzentriert. Plasmid pGD103 DNA wurde mit BamHi Endonuclease aufgeschlossen und mit alkalischer Kalbsphosphatase (Boehringer, Indianapolis, IN) behandelt (1 Einheit/ug DNA, 37ºC x 30 min in Restriktionspuffer). DNA wurde aus dem Reaktionsgemisch durch Phenolextraktion gereinigt und Ethanolfällung und in TE-Puffer resuspendiert. Da BamHi und Sau3A Restriktionsenzyme kohäsive Enden bilden, war keine weitere Behandlung von DNA vor der Ligierung erforderlich.
Etwa 25 ug jeweils von Sau3A aufgeschlossener Hi 52 DNA und von pGD103/BamHI/CAP aufgeschlossener DNA wurden in ml Ligierungspuffer, enthaltend 25 U T4-Ligase (Boehringer, Indianapolis, IN) aufgeschlossen und bei 15ºC für 18 h inkubiert. Eine aliquote 20 ul-Menge des Reaktionsgemisches wurde durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert, um die Ligierungsreaktion zu bestätigen (Ausgangsmaterial wurde in einer benachbarten Bahn laufen lassen). Das Ligierungsgemisch wurde dann in kompetente E. coli JM83 transformiert (siehe Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 250), inkubiert für 1 h in LB- Brühe bei 37ºC und auf LB-Agarplatten, enthaltend 50 ug/ml Kanamycinsulfat (Sigma Chemical Co., St. Louis, NO) und 40 ug/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid (X- gal, BRL Bethesda, MD) plattiert und 24 h bei 37ºC inkubiert. Etwa 50 % der kanamycinresistenten (kanR)-Kolonien, die sich entwickelten, waren weiß (Lac-), was eine Insertion von 52 DNA in die BamHI-Stelle in der lac-Region von pGD103 (Lac+ nicht Rekombinanten sind blau) auswies. 10 weiße Kolonien wurden willkürlich ausgewählt, verstärkt und enthielten Plasmide, die 4 bis 8 kB größer sind als pGD103 mit Insertionen an der Vektor BamHI-Stelle.
1525 weiße Kolonien wurden herausgenommen, einzeln verstärkt und gefroren gelagert bei -70ºC in LB-Brühe, enthaltend 18 % steriles Glycerin in Mikrotiterschalen mit 96 Vertiefungen.

6.5.2 Konstruktion einer Hib-Lambda-Genbank

Chromosomale DNA hohen Molekulargewichts von Hi KW2Ob wurden in TE-Puffer bei einer Konzentration von 20 ug/ml suspendiert und zu einer Länge von 15 000 Bp durch Leiten durch eine Kanüle Kaliber 25 gespalten. Überstehende Enden wurden durch Behandlung mit T4 DNA Polymerase in 50 mM Tris (pH 8,8), 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 10 mM DTT, 50 uM dATP, dCTP, dGTP und dTTP) bei 3700 für 20 min entfernt. DNA wurde dann mit EcoRI DNA mit Methylase (1 U/ug DNA) (BRL Bethesda, MD) in 100 mM Tris (pH 8,0), 10 mM EDTA, 0,1 mM S-Adenosylmethionin) für 3 h bei 37ºC modifiziert. Methylieren von DNA wurde durch Entfernen von 1 ug DNA aus der Reaktion, Vermischen mit 1 ug nichtmodifizierter Lambda-DNA und Aufschluß von 20 ul eines stark salzhaltigen Restriktionspuffers mit 5 Einheiten EcoRI für 1 h bei 37ºC verifiziert. Unter diesen Bedingungen wurde modifizierte Hi DNA nicht aufgeschlossen, während die zugegebene Lambda-DNA vollständig aufgeschlossen wurde.
20 ug modifizierte Hi DNA wurde zu 1 ug chemisch synthetisierten ECORI-Linkern (BRL Bethesda, MD) in einem 100 ul Reaktionsgemisch unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (5 U) ligiert. Nach 18 h wurde die Reaktion durch Erwärmen auf 60ºC für 20 min gestoppt, NaCl wurde zu einer Endkonzentration von 150 mm zugegeben und das Gemisch mit 10 U EcoRI für 6 h aufgeschlossen.
Modifizierte Hi DNA plus Linker wurde von aufgespaltenen und nichtligierten Linkern durch Agarose-Gelelektrophorese wie vorstehend beschrieben abgetrennt.
Präparierte Hi DNA wurde mit den linken und rechten EcoRI-Fragmenten von Lambda Charon 4 DNA bei einem 1:1:1 Mol- Verhältnis vermischt und mit T4 DNA-Polymerase für 18 h ligiert. Das ligierte DNA-Gemisch wurde in Lambda-Phagenteilchen unter Verwendung einer in vitro-Verpackungsreaktion verpackt. 5 ug ligierte DNA in 4 ul H&sub2;O wurden zu 7 ul 20 mM Tris (pH 8), 10 mM 2-Mercaptoethanol (2-ME), 3 mM MgCl&sub2;, 1 ul 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM Spermidin, 2 mM Putrescin, 10 mM MgCl&sub2;, 1,5 mM ATP, 5 mM 2ME und 5 ul beschallten Extrakt von E. coli 8H82690 (-1 imm 434, cIts, b2.red3, Eam 15, Sam7) Lysat zugegeben (Hohn et al., 1977, Proc. Nat'l Acad. Sci. 74:3259). Das Reaktionsgemisch wurde bei 22ºC für 1 h inkubiert und die verpackten Phagen wurden durch Zentrifugieren in 3 M bis 5 M CsCl [in 10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 0,02 % Gelatine (TMG-Puffer)] Stufengradienten für 250 000 g für 4 h in einem Beckman SW50.1-Rotor getrennt. Der so hergestellte Phage wurde titriert und erwies sich als Bank von 25 000 bis 30 000 erzeugten unabhängigen Klonen des Hi Genoms. Die Phagenbank wurde durch Plattierungsverstärkung unter Verwendung von E. coli KH802 als Phagenwirt unter Bereitstellung von 5 ml einer Phagensuspension, enthaltend 10&supmin;&sup9; plaquebildende Einheiten (PFU)/ml, verstärkt.

6.6 Isolierung von PBOMP-Genen

6.6.1 Isolierung eines PBOMP-Gens, das für ein Protein codiert, welches mit monoklonalen Antikörpern gegen PBOMP-1 reagiert.

Die Hi Plasmidbank wurde auf Nitrocellulosebögen auf LB-Kanamycin (50 ug/ml) Agar überführt, für 24 h bei 37ºC gezüchtet und durch Kolonie-Blot-Verfahren unter Verwendung eines Gemisches von 5 nichtkompetitiven monoklonalen Antikörpern zu PBOMP-1 als Sonde analysiert. Ein Klon, der mit der gemischten monoklonalen Probe reagierte, wurde isoliert und das Plasmid pAA152 genannt. Figur 4 zeigt eine Restriktionskarte von pAA152, die ein 4,2 kB Hi DNA Insert in Vektor pGD103 enthält. Western-Blot-Analyse bestätigte, daß Klon pAA152 ein 16 000 Dalton Protein exprimierte, das durch polyklonale anti-PBOMP-1 erkannt wurde und auch durch zusammengegebene monoklonale Antikörpersonden. Es erwies sich anschließend, daß Klon pAA152 ein Protein erzeugte, das von jedem einzelnen in dem anfänglichen Pool verwendeten monoklonalen Antikörper erkannt wurde (Figur 5).
Es wurde gefunden, daß das Sau3A-Insert in pAA152 die BamHI-Stelle im Polylinkerbereich an einem Ende des Inserts regenerierte. Deletionen von dieser BamHI-Stelle zu entweder der einmaligen Bg1II-Stelle oder der einmaligen XbaI-Stelle von Hi DNA führte zum Expressionsverlust von PBOMP, nachgewiesen auf Western-Blots. Deletionen der HincII-Stelle des Polylinkers zu entweder der XbaI- oder der Bg1II-Stelle der Hi Insert-DNA hielt PBOMP-Expression zurück (Figur 4). Aus diesen Ergebnissen schlußfolgern wir, daß das Gen, das für dieses PBOMP codiert, in dem Bg1II-BamHI 737 Basenpaarfragment innerhalb des Hi DNA Inserts von pAA152 liegt. Die Analyse von Minizellen (Achtman et al., 1979, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 76:4837-41), die die pAA152 tragen, wies aus, daß die klonierte Hi DNA für 2 Proteine von 16 000 beziehungsweise 40 000 Dalton Molekulargewicht codiert (Figur 6). Western-Blots von JM83 (pAA152) zeigen, daß zu einem Pool zusammengegebene monoklonale Antikörper gegen PBOMP-1 mit einem 16 000 Dalton Protein reagieren. Keine Kreuzreaktion ist ersichtlich innerhalb des Molekulargewichts im Bereich von 40 000 Dalton.

6.6.2 Isolierung eines PBOMP-Gens, das für ein Protein codiert, das mit polyklonalen PBOMP-1-Antisera reagiert.

Die verstärkte Phagenbank, hergestellt wie beschrieben in Abschnitt 6.5.1, wurde zu 1-2000 PFU, verdünnt in 1 ml TMG, und 50 ul E. coli KH802 (5 x 10&sup9; Zellen/ml) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei 37ºC für 20 min inkubiert und mit 3 ml Weichagar auf Agarplatten, enthaltend NZYCM-Medium, plattiert: 10 g NZ-Amin A, 5,0 g NaCl, 2,0 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 5 g Hefeextrakt, 1 g Casaminosäuren (pro 1). Platten wurden über Nacht inkubiert auf 4ºC für 30 bis 60 min abgekühlt und die Plaques wurden auf Nitrocellulose übertragen. Filter wurden mit polyklonalen anti-PBOMP-1 wie vorstehend beschrieben in Abschnitt 6.4.4 sondiert. Verschiedene positive Plaques wurden auf diese Weise nachgewiesen. Es wurden jedoch keine positiven Plaques nachgewiesen, wenn PBOMP-1 monoklonale Antikörper als Sonde verwendet wurden. Positive Plaques wurden von der Platte genommen und durch Züchten in E. coli KH802 verstärkt. Klone wurden durch SDS-PAGE-Gel/Western-Blot-Analyse des Phagenlysats bestätigt. Alle positiven Klone exprimierten ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 16 000 Dalton, das mit polyklonalem Antikörper zu PBOMP-1 reagierte. Dieses Protein war nicht in Kontroll-Lysaten von Charon 4-Phagen präsent. In ähnlichen Experimenten reagierten Lysate von den positiven Klonen mit monoklonalen Antikörpern für PBOMP-1 nicht.
Ein positiver Phage, bezeichnet Lambda 16-3, wurde zur weiteren Analyse ausgewählt. Dieses Phagenisolat wurde durch Züchten in E. coli KH802 in NZYCM-Brühe verstärkt, gewonnen durch Fällung mit 20 % Polyethylenglycol 6000 und in Cäsiumchlorid-Gleichgewichtsgradienten durch Banden markiert (4 M CsCl in TMG, Beckman SW50.1 Rotor, 300 000 g für 24 h). Phagen-DNA wurde durch Behandlung mit 0,1 % SDS und 20 ug/ml Proteinase K (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bei 55ºC für 1 h.isoliert, gefolgt von Extraktion mit Phenol- und Ethanolfällung.
Die Lambda 16-3 DNA wurde mit EcoRI aufgeschlossen und eine Teilkartierung des chromosomalen Hi Inserts erhalten. EcoRI-Fragmente des Inserts wurden isoliert und in Plasmidvektor pGD103 subkloniert. Klone, die die PBOMP-1 tragenden Fragmente exprimieren, die nicht mit 16 000 Dalton Protein kreuzreaktiv waren, wurden durch Western-Blot-Transferanalyse von Zell-Lysaten identifiziert. Einer von diesen wurde pAA130 genannt. Figur 7 gibt eine Restriktionskarte dieses Plasmids mit einem 5,7 kB-Fragment von Hi DNA, kloniert in pGD103-Plasmid, wieder.
Monoklonale Antikörper gegen PBOMP-1 reagierten nicht mit dem 16 000 Dalton Protein, exprimiert aus pAA130 (Daten nicht dargestellt). Das durch dieses rekombinante Plasmid exprimierte Protein wurde jedoch von polyklonalen anti-PBOMP-1- Antisera erkannt (siehe beispielsweise Figur 8).
Analyse von Minizellen (Achtman et al., s.o.), die pAA130 tragen, wiesen aus, daß die klonierte Hib DNA für Proteine mit scheinbaren Molekulargewichten von 16 000 und 17 000 Dalton codiert. Das markierte 16 000 Dalton-Protein wurde spezifisch durch polyklonale anti-PBOMP-1 immunopräzipitiert (Daten nicht dargestellt). Somit steuert Plasmid paaßo die Expression eines PBOMP mit einem Molekulargewicht von 16 000 Dalton.
Eine innere Deletion, erzeugt durch Herausnahme der DNA, inseriert zwischen der einmaligen PstI-Stelle und dem Insert und der einmaligen PstI-Stelle in dem Polylinker, beeinflußte die Expression des kreuzreagierenden Proteins nicht. Das XbaI-Fragment dieses Plasmids wurde durch ein ähnliches Verfahren deletiert und Expression des PBOMP-kreuzreagierenden Proteins wurde zürückgehalten (Figur 7). Ein zusätzliches Deletionsderivat dieses Plasmids wurde durch Religierung der zwei inneren Bg1II-Stellen erzeugt und dieses Derivat hielt ebenfalls Expression des PBOMP-kreuzreaktiven Proteins zurück.
Das 781 Basenpaar BstEII-XmnI-Fragment wurde durch Isolieren des Fragments aus niederschmelzendem Agarosegel, Auffüllen im BstEII-Ende mit Klenow-Fragment von DNA Polymerase I und Klonieren des Fragments in die HincII-Stelle von pGD103 kloniert. Western-Blot-Analyse unter Verwendung von polyklonalem anti-PBOMP-1 zeigte, daß dieses Plasmid die Expression des 16 000 Dalton PBOMP beibehielt. Wie bei pAA130 reagierte das aus diesem Plasmid erzeugte PBOMP nicht mit monoklonalem Antikörper zu PBOMP-1.
Als unabhängiges Verfahren zum Bestätigen des Ortes dieses PBOMP-Gens wurde das große EcoRI-PvuII-Fragment von pAA130 mit dem EcoRI-PvuII-Fragment von pLG339 ligiert unter Herstellung eines neuen Tetracyclin-resistenten Plasmids, das pAA136 bezeichnet wurde. Dieses Plasmid exprimierte das PBOMP, wie durch Western-Blot-Analyse bestätigt. Dieses Plasmid wurde transformiert in einen E. coli-Stamm mit Deletion des chromosomalen alkalischen Phosphatasegens (phoA) und dem transformierbaren Element TnPhoA. Drei unabhängige Transpositionen des Tnphoa-Elements in pAA136, die alkalische Phosphataseaktivität wiederherstellten, wurden isoliert. Die Stellen der TnPhoA-Insertionen in pAA136 wurden unter Verwendung der einmaligen DraI-Restriktionsstelle nahe dem linken terminalen Bereich von Tnphoa und den HindIII-, BstEII-, XmnI- und PstI- Stellen von pAA136 bestimmt. Es wurde ermittelt, daß alle 3 Insertionen in das BstEII-XmnI-Fragment von pAA136 fallen. Alle 3 TnPho-Insertionen waren in derselben Orientierung, was aussagt, daß Transkription des PBOMP-Gens von der BstEII- Stelle zur XmnI-Stelle in pAA136 gerichtet ist. Alle 3 Tn- PhoA-Transpositionen führten zu einem Verlust des 16 000 Proteins, wie mit polyklonalem anti-PBOMP-1-Antiserum durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Eine Fusion erzeugte eine neue Bande im Western-Blot bei 60 000 Dalton, was durch polyklonales anti-PBOMP-1-Antiserum ermittelt wurde. Diese Größe liegt innerhalb des vorbestimmten Bereiches von Fusionsproteinen, die durch Fusion von alkalischer Phosphatase (45 000 Dalton MW) an ein 16 000 Dalton MW-Protein erzeugt werden könnte. Wiederherstellung der PhoA-Aktivität in diesen Transpositionen bestätigt daß das PBOMP-Protein ein Peptidsignal für Membrantransport enthält und folglich ist es wahrscheinlich ein Membranprotein.
Die TnPho-Fusionen sind durch Subklonieren der Verbindung zwischen TnPhoA und den Hi-klonierten DNA-Sequenzen in M13 sequenziert. In allen Fällen wurden die PhoA codierenden Sequenzen in einem Raster mit dem vorbestimmten offenen Leseraster für das PBOMP-2-Gen von pAA130 bestimmt (siehe Abschnitt 6.7.2, s.u.)

6.7 Bestimmung der Nucleotidsequenz von PBOMP-Genen

6.7.1 Sequenzierungsstrategie für das PBOMP-Gen, exprimiert durch pAA152

Die Nucleotidsequenz des durch pAA152 exprimierten PBOMP-Gens wurde durch Didesoxynucleotid-Sequenzierung (Sanger et al., 1978, Proc. Nat'l Acad. Sci USA 74:5463-5467) des 737 Bp Bg1II-BamHI-Fragments von pAA152 nach Subklonierung in einsträngige Phagen der M13-Familie, das heißt, M13 mp18 und mp19, erhalten.
Der Ort und die Richtung der ermittelten Sequenzen aus den Subklonen sind in Figur 9 dargestellt. Die vollständige Nucleotidsequenz des BgII-BamHI-Fragments ist in Figur 10 dargestellt.
Das 737 Bg1II-BamHI-Fragment von pAA152 enthält ein einziges offenes Leseraster (ORF), das für ein Polypeptid mit 153 Aminosäuren codiert (Figur 11). Die Aminosäurezusammensetzung des aus der DNA-Sequenz bestimmten PBOMP-Gens paßt eng zur Aminosäurezusammensetzung des PBOMP-1-gereinigten Proteins (siehe Tabellen 1 und 2). Tabelle 2 Hergeleitete Aminosäurezusammensetzung von reifen PBOMP-1 und PBOMP-2 Aminosäurereste reifes PBOMP-1 von pAA152a reifes PBOMP-2 von pAA130b Asparaginsäure Asparagin Threonin Serin Glutaminsäure Glutamin Prolin Glycin Alanin Cystein Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Lysin Histidin Arginin Tryptophan a Das scheinbare Molekulargewicht von reifem PBOMP-1 betrug 14238 Da. Die Zahl der Aminosäurereste betrug 134. b Das scheinbare Molekulargewicht von reifem PBOMP-2 betrug 13461. Die Anzahl an Aminosäureresten betrug 136.
Zusätzlich hatte das PBOMP-1-Gen eine innere Peptidsequenz (AA 48-81), in der (30/33) Aminosäuren in maximaler Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz des inneren T9-Peptids von PBOMP-1 waren, unter der Berücksichtigung des Leu-68-Restes, der in der Sequenz des T9-Peptids nicht vorlag (Figur 12). Der aminoterminale Bereich von PBOMP-1 enthält auch eine Aminosäuresequenz, die Ähnlichkeit mit anderen Transportpeptidsequenzen zeigte (Watson, 1984, Nucleic Acids Res. 12:5145-5164). Aus diesen Daten und aus den Bindungsdaten der monoklonalen Antikörper schlußfolgern wir, daß dieses Gen das PBOMP-1-Protein codiert.

6.7.2 Sequenzierungsstrategie für das PBOMP-Gen von DAA130

Die Nucleotidsequenz des PBOMP-Gens von pAA130 wurde durch Didesoxynucleotid-Sequenzierung (Sanger et al., s.o.) des 789 Basenpaares BstEII-XmnI-Fragment von pAA130 nach Subklonieren in M13 mp18- und mp19-Phagen bestimmt. Diese rekombinanten Phagen wurden als M18001 und M19001 bezeichnet. Das universelle 17-Basen-Oligonucleotid-sequenzierende Primer (New England Biolabs) wurde zur Bestimmung der Sequenz von beiden Enden des BstEII-Xmni-Fragments verwendet (siehe Figur 13). Zwei zusätzliche Oligonucleotide wurden synthetisiert und als Primer für die Didesoxynucleotid-Sequenzierung verwendet (M18PR1, M19PR2). Alle weiteren Sequenzierungs-Primers wurden bei der Praxis Biologics, Rochester, N.Y., auf einem Applied Biosystems 380 B DNA-Synthesizer hergestellt. Die Primers wurden auf einer 1 uMol-Säule mit kontrolliert porösem Glas mit beta-Cyanoethylphosphat Schutzgruppenchemie hergestellt. Die Ausbeute an Oligonucleotid war ausreichend rein, um die Primers direkt von der Säule ohne weitere Reinigung zu verwenden. Die 2 synthetischen Oligonucleotid-Primers binden an Sequenzen mit etwa 200 Nucleotiden von jedem Ende des Fragments, wie in Figur 13 dargestellt. Die gesamte 789 Bp DNA-Sequenz des BstEII-XmnI-Fragments von pAA130 ist in Figur 14 dargestellt. Das in Figur 15 dargestellte ORF ist unterstrichen. Somit codiert ORF ein Polypeptid mit 154 Aminosäuren. Das aminoterminale 18-Restpeptid ähnelt einer Membran-Transportsignalsequenz, ermittelt für andere Proteine (Watson, 1984, so.). Außerdem demonstrierten Sequenzdaten aus den TnPhoA-Fusionen in pAA130, daß alle 3 Transpositionen innerhalb des Leserasters des 154 Aminosäurepolypeptids lagen.
Die Aminosäurezusammensetzung des vermutlichen reifen Genprodukts, wie es aus der DNA-Sequenz des ORF von pAA130 gefolgert wurde, weicht deutlich von jener ab, die durch Aminosäureanalyse von gereinigtem PBOMP-1 erhalten wird (Tabelle 1 und 2). Keine bedeutende Homologie wurde gefunden, wenn die Aminosäuresequenz des PBOMP-Gens von pAA130 mit jener des tryptischen Peptids T9 aus gereinigtem PBOMP-1-Protein verglichen wurde. Obwohl das durch dieses Gen codierte Produkt außerdem durch polyklonale anti-PBOMP-1-Antisera erkannt wurde, wird es nicht durch monoklonale Antikörper zu PBOMP-1 erkannt. Aus diesen Beobachtungen wird deutlich, daß das Hi Gen, exprimiert durch pAA130 nicht das Gen für PBOMP-1 ist. Somit wird das durch pAA130 codierte PBOMP-Gen PBOMP-2 genannt.

6.8. Charakterisierung von PBOMP, exprimiert durch rekombinante E. coli als Lipoproteine

Wie in Abschnitt 6.1.2. dargelegt, weist PBOMP-1, isoliert aus H. influenzae, kovalent gebundene Fettsäuren auf, einschließlich Laurinsäure, Palmitinsäure und ein Derivat von Palmitinsäure und kann folglich als bakterielles Lipoprotein klassifiziert werden. Die nachstehenden Versuche wurden ausgeführt, um zu untersuchen, ob PBOMP, exprimiert durch rekombinante E. coli, ebenfalls als Lipoproteine vorliegen. Zwei verschiedene in vivo-Verfahren wurden verwendet, um die Lipoproteinnatur der exprimierten PBOMP zu bestätigen.
In einer Versuchsreihe wurden Zellen, die PBOMP-exprimierte, rekombinante Plasmide enthielten, in Gegenwart von radioaktiv markierter Fettsäure gezüchtet. Unter solchen Bedingungen wird jegliches gebildetes Lipoprotein, das kovalent gebundene Fettsäure enthält, spezifisch radiomarkiert.
E. coli JM83-Zellen, mit entweder exprimierendem PBOMP-1 Plasmid pAA152 oder exprimierendem PBOMP-2 Plasmid pAA130 wurden für 2 h in M9-Minimalmedium, enthaltend 50 uCi/ml ¹&sup4;C-Palmitinsäure, gezüchtet. Ganzzellenlysate (Trichloressigsäure-Fällbares 10000 cpm/Bahn) wurden auf 15 % SDS-PAGE-Gelen bei 35 mA Konstantstrom elektrophoretischer Behandlung unterzogen. Die Gele wurden mit Natriumsalicylat (5 x Gelvolumen x 1 M Lösung für 20 min) imprägniert, getrocknet und bei -70ºC auf einem XAR-5-Film belichtet (Eastman Kodak Company, Rochester, N.Y.). Ganzzellenlysate von normalen E. coli JM83-Zellen, in ähnlicher Weise gezüchtet, wurden als Kontrollen laufen lassen. Die Ergebnisse sind in Figur 17 erläutert.
Wie in Figur 17 demonstriert, wurde ein radiomarkiertes Protein mit etwa 15 000 Dalton in Lysaten von E. coli beobachtet, die pAA152 und pAA130 enthielten, was nicht in Lysaten der Kontroll-E. coli-Zellen beobachtet wurde. Somit waren PBOMP-1 und PBOMP-2, exprimiert durch rekombinante E. coli, spezifisch radiomarkiert.
In weiteren Versuchsreihen wurden Zellen, die rekombinante PBOMP-exprimierende Plasmide enthielten, in Gegenwart von Globomycin gezüchtet, einem Antibiotikum, das dafür bestimmt ist, daß es die Verarbeitung aller bekannten bakterieilen Lipoproteine durch Inhibierung der Lipoprotein-Signalpeptidase blockiert (Inukai et al., 1978, J. Antibiotics (Tokyo) A:1203-1205).
E. coli JM83-Zellen, enthaltend entweder pAA152 oder pAA130, wurden in Gegenwart von 25 ug/ml Globomycin (erhalten von Dr. M. Inouye, Robert Woods Johnson Medical Dental School, Piscataway, N.J.) für 1 h gezüchtet. Ähnliche, mit Globomycin nicht behandelte Kulturen, dienten als Kontrolle. Ganzzellenlysate wurden auf 15 % SDS-PAGE-Gel elektrophoretischer Behandlung unterzogen, auf Nitrocellulose übertragen und mit polyklonalen anti-PBOMP-1-Antisera sondiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 18 dargestellt.
Wie in Figur 18 demonstriert, wurde in Lysaten von Globomycin-behandelten Zellen, die entweder PBOMP-1 oder PBOMP-2 exprimieren, eine etwa 16500 Dalton-Bande beobachtet, die in Lysaten der Kontrolle oder unbehandelten Zellen nicht nachgewiesen wurde.
Auf Grundlage der Ergebnisse, erhalten in beiden Serien der in vivo-Experimente, sind die PBOMP-1- und PBOMP-2- Proteine, exprimiert durch rekombinante E. coli, die PBOMP-1- Gene enthalten, Lipoproteine.

7. Wirkungsgrad der PBOMP-1 und PBOMP-2 Untereinheitsimpfstoffe

7.1 Bakterizide Aktivität von Antisera, induziert durch PBOMP-1 und PBOMP-2

Anti-PBOMP-1 polyklonale Kaninchen-Antisera, hergestellt wie beschrieben in Abschnitt 6.2., wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Hib und Hi abzutöten, in einem in vitro Komplement-vermittelten Bakterizid-Assay-System untersucht (siehe Musher et al., 1983, Infect. Immun. 39:297 bis 304; Anderson et al., 1972, J. Clin. Invest. 51:31 bis 38). Quellen.von Komplementen, die für das Assaysystem verwendet wurden, waren entweder präcolostrales Kalbsserum (PCCS) oder Kaninchen-Normalserum (NRS) die vorher mit einem nichttypisierbaren Hi-Stamm, S2, absorbiert wurden, um beliebige vorher vorliegende anti-Haemophilus-Antikörper zu entfernen. Das PCCS wurde unverdünnt verwendet und das NRS wurde bei einer Verdünnung von 1:4 für Hib verwendet und 1:8 für nichttypisierbare Hi. Alle Verdünnungen wurden unter Verwendung von Phosphat gepufferter Kochsalzlösung [20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), 0,15 M NaCl, enthaltend 0,15 mM MgCl&sub2; und 0,5 mM CaCl&sub2; (PCM)] zubereitet. Zu untersuchende Bakterienstämme wurden in BHI-XV gezüchtet, bis sie eine Konzentration von 1 x 10&sup9; Zellen/ml, gemessen durch optische Dichte bei 490 mm, erreichten. Bakterien wurden zu einer Endkonzentration von 1250 Zellen/20 ul in PCM verdünnt. 20 ul einer geeigneten Antikörperverdünnung in PCM wurden mit 20 ul einer Komplementquelle auf Eis in Vertiefungen einer 24-Vertiefungen-Mikrotiterplatte (Costar) vermischt. Die Mikrotiterplatte wurde vom Eis genommen und 20 ul der verdünnten Testbakterien wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Antikörperfreie Vertiefungen dienten als Negativkontrollen. Nach 30 min Inkubation bei 37ºC wurden 800 ul BHI-XV, enthaltend 0,75 % Agar bei 56ºC zu jeder Vertiefung gegeben und bei Raumtemperatur verfestigen lassen. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert und am darauffolgenden Tag gelesen.
Der BC-Titer des Antiserums wurde als reziproker Wert der höchsten Verdünnung, die in der Lage ist, 50 % der Testbakterien abzutöten, verglichen mit den Kontrollvertiefungen ohne Antikörper, ermittelt.
Das anti-PBOMP-1 wurde hinsichtlich bakterizider (BC)-Aktivität gegen verschiedene klinische und Labor-Hib- Isolate geprüft und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 BC-Aktivität von anti-PBOMP-1 Antisera gegen Labor- und klinische Stämme von Haemophilus influenzae Laborstämme abgetötete anti-PBOMP-1 H. influenzae Typ N.T. H. influenzae N.T. klinische Stämme Hib klinische Stämme geprüfte Stämme abgetötete Stämme a + mehr als 50 % der Testbakterien abgetötet. b +/- = etwa 50 % der Testbakterien überlebten.
Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, hatten anti-PBOMP-1- Antikörper BC-Aktivität gegen eine breite Vielzahl klinischer Isolate sowohl typisierbar (beispielsweise a, b, c), als auch nichttypisierbare H. influenzae-Stämme. 112 von 112 klinischen Hib-Isolaten wurden durch die anti-PBOMP-1-Antisera abgetötet. Diese Stämme wurden im Südwesten der USA, im Nordwesten der USA und im Westen von Kanada isoliert.
Um die Möglichkeit zu eliminieren, daß die Abtötung das Ergebnis von anti-LPS-Antikörpern war, wurde das BC-Assay mit 200 ng LPS von einem Hib-Stamm, verwendet zur Herstellung des Immunogens, in jeder Vertiefung ausgeführt. Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Bakterizide Aktivität von Antisera, absorbiert mit LPS Antiserum Testbakterien Titerb N.T. H. influenzae Hib Eagan a 0 oder 200 ng Hib Eagan LPS pro Vertiefung wurden verwendet. b exprimiert als reziproker Wert der höchsten Verdünnung von Antiseren, die 50 % der überlebenden Bakterien zeigen.
LPS senkt den Titer in dem anti-PRP um das Zweifache, den Titer des anti-PBOMP-1 gegen Hi um das Vierfache und den Titer von anti-PBOMP-1 gegen Hib überhaupt nicht. Obwohl LPS die BC-Aktivität von anti-PBOMP-1 reduzierte, eliminierte sie diese nicht. Einige der beobachteten Minderungen waren zweifelsohne das Ergebnis von antikomplementärer Aktivität des LPS, wie demonstriert durch die Reduktion des anti-PRP-BC-Titers.
Die wie in Abschnitt 6.2 beschrieben hergestellten anti-PBOMP-2-Antikörper wurden hinsichtlich bakterizider (BC) Aktivität gegen den Haemophilus influenzae 52-Stamm geprüft und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Sera wurden vor dem Beimpfen und 7 und 10 Tage nach der anfänglichen Immunisierung gesammelt. Wie nachstehend ausgewiesen, wurde die BC-Aktivität von anti-PBOMP-2-Antisera 7 Wochen nach der Inoculierung als signifikant erhöht beobachtet. Es wurde 10 Wochen nach der Impfung keine Steigerung beobachtet. Tabelle 5 BC-Aktivität von anti-PBOMP-2-Antisera gegen den S2-Stamm von Haemophilus influenzae Serum nach Woche bakterizider Titer Vielfaches der Erhöhung im Titer

7.2 Jungrattenschutz vor H. influenzae

Jungrattenschutzuntersuchungen wurden gemäß Smith et al. (1973, Infect. Immun. 8: 278-90) ausgeführt. Sprague-Dawley-Jungratten wurden passiv mit 0,1 ml variierenden Verdünnungen von Kaninchen-Antisera in PCM durch intraperitoneale Inoculierung am vierten Lebenstag immunisiert. 18 Stunden nach der Immunisierung wurden die Ratten intraperitoneal 10&sup4; bis 10&sup6; Hib-Zellen in 0,1 ml PCM exponiert. Überlebende der exponierten Ratten wiesen nach 72 Stunden nach der Infektion Schutz auf. Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6 Jungrattenschutz durch anti-PBOMP-1 Hib Expositions-Stamm Antiserum passiv übertragen Antiserum Verdünnung Expositionsdosis Überlebende/gesamt Eagan
Die Ergebnisse in Tabelle 6 weisen aus, daß Jungratten gegen die Infektion mit einer tödlichen Dosis von Hib durch passive übertragene anti-PBOMP-1-Antikörper geschützt sind. Die zusätzlichen klinischen Hib-Stamme, die als Infektionsstämme bei Jungratten Meningitis-Modell verwendet wurden, waren zur Demonstration des Schutzes des anti-PBOMP-1 gegen heterologe Hib klinische Isolate geschützt.
Zur Bestimmung, ob anti-PBOMP-1 die Schutzeffekte von anti-PRP blockiert oder additive Effekte aufweist, wurden Jungratten passiv mit anti-PRP und anti-PBOMP-1 verdünnt über die Endpunkte ihres Schutzes hinaus passiv immunisiert. Nach Exposition mit Hib waren die Antisera insgesamt in der Lage, bei höheren Verdünnungen zu schützen, als jene vorstehend (Tabelle 7). Diese Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 7, weisen aus, daß anti-PBOMP-1-Antikörper und anti-PRP-Antikörper einander nicht stören und in der Lage sind, additiven Schutz im Jungratten Meningitis-Modell zu ergeben. Tabelle 7 anti-PBOMP-1 + anti-PRP Jungtieruntersuchungen, Sera iniiziert. anti-PBOMP-1 (1:100)a anti-PRPb Überlebende/gesamt c a polyklonales Kaninchen-anti-PBOMP-1, verdünnt in PCM b polyklonales Kaninchen-anti-PRP:CRM&sub1;&sub9;&sub7;-Konjugat c Jung-Sprague-Dawley-Ratten, überlebend nach 72 h nach Exposition.

7.3 Immunogenizität von PBOMP-1 bei Erwachsenen

Sechs erwachsene Freiwillige erhielten 2 Impfungen mit Impfstofformulierungen, umfassend PBOMP-1, isoliert aus H. influenzae, wie in Abschnitt 6.1. beschrieben, (5,2 ug PBOMP-1 ohne Alum) in einmonatigen Intervallen, mit der Abweichung für einen Einzelnen, der nur eine einzige Impfung erhielt. Blutproben wurden unmittelbar vor der anfänglichen Inpfung genommen und anschließend in monatlichen Intervallen. Die spezifische Antikörperantwort der beinpften Erwachsenen wurde durch Messung des Antikörper-Titers von H. influenzae PBOMP (ELISA) gegen Diphtheriatoxoid (ELISA) (siehe Engvall et al., 1972, J. Immunol. 109:129 bis 135 für die allgemeine Beschreibung des ELISA) und zur Hib PRP-Polysaccharid (Farr- Typ RIA) (siehe Farr, 1958, J. Infect. Dis. 103:239 bis 262 für-die Beschreibung des Farr-Typs RIA) bewertet. Die erhaltenen Ergebnisse in dem PBOMP-1-ELISA sind in Figur 19 dargestellt.
Wie in Figur 19 demonstriert, zeigten 3 der 6 Individuen einen signifikanten Anstieg im Antikörper-Titer gegenüber PBOMP-1. Dieser Anstieg im Antikörper-Titer war stark spezifisch gegen PBOMP-1, angewendet als Immunogen, da keine signifikante Änderung in dem Titer des entweder Diphtheriatoxoid oder Hib PRP-spezifischen Antikörpers (Ergebnisse nicht dargestellt) beobachtet wurde.

7.4 Bakterizide Aktivität von Antisera, induziert durch signalfreie PBOMP-1

Ein rekombinantes signalfreies PBOMP-1 (hier als rPBOMP-1 bezeichnet), erhalten aus E. coli PR13-Zellen, enthaltend Plasmid pPX167, wie beschrieben nachstehend in Abschnitt 8.1, wurde als Immunogen zum Immunisieren von weißen Neuseeländer-Kaninchen verwendet. Das rPBOMP-1 wurde entweder in unvollständigem Freund'schem Adjuvans (IFA) emulgiert oder an Aluminiumhydroxid gebunden. rPBOMP-1 wurde an Alum durch Vermischen von rPBOMP-1 in einer Konzentration von 500 ug/ml in 0,85 % Salzlösung mit Alum in einer Konzentration von 500 ug/ml in einem 1:1-Verhältnis gebunden. Das Gemisch wurde bei 37ºC für 3 h geschüttelt und das Alum durch Zentrifugieren pelletiert. Überstand wurde durch BCA-Proteinassay untersucht (Pierce Chem. Co., Chicago, IL) hinsichtlich ungebundenen Proteins. Es wurde nichts festgestellt. Alum wurde resuspendiert in physiologischer Kochsalzlösung bei 500 ug/ml.
rPBOMP-1 wurde in IFA (Difco) in einem 1:1-Verhältnis emulgiert. Die Tiere wurden intramuskulär mit 50 ug jeder Zubereitung in 4-wöchigen Intervallen immunisiert. Den Tieren wurde nach Wochen 0, 6 und vor jeder Immunisierung Blut entnommen.
Die erhaltenen polyklonalen anti-rPBOMP-1-Kaninchen- Antisera, wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Hi in einem Komplement-vermittelten bakteriziden in vitro-Assaysystem abzutöten, wie vorstehend in Abschnitt 7.1 beschrieben, untersucht. Antisera wurden unmittelbar vor der ersten Immunisierung, Woche 0, 2 Wochen nach einer zweiten Immunisierung, Woche 6, geprüft. Die bakterizide (BC)-Aktivität der Antisera wurde mit jener der Antisera, hergestellt gegen PBOMP-1, isoliert aus H. influenzae (bezeichnet als "natives PBOMP-1") verglichen. Das Testbakterium war ein nichttypisierbarer H. influenzae-Stamm S-2. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8 BC-Aktivität von Antisera gegen rPBOMP-1a Antiserum gegen Antiserumb natives rPBOMP-1 (Alum) Woche Hyperimmunc a Testorganismus: nichttypisierbarer H. influenzae 52 b Für Einzelheiten hinsichtlich Immunisierungen, die angewendet wurden, zur Gewinnung der Antisera siehe Text c Hyperimmunes Antiserum wurde gegen Mehrfachdosierungen von nativem PBOMP-1 hergestellt.
Der BC-Titer von Antisera wurde als reziproker Wert der höchsten Verdünnung, die in der Lage ist, 50 % der Testbakterien, verglichen mit Kontrollvertiefungen ohne Antikörper, abzutöten, abgelesen.
Obwohl beide Kaninchen geringe Spiegel an BC-Aktivität vor der Immunisierung hatten, Titer von 1:5 und 1:10, hatte der BC-Titer, der bei Woche 6 erhaltenen Sera einen signifikanten Anstieg in der BC-Aktivität. Das mit rPBOMP-1 in IFA immunisierte Kaninchen hatte einen Titer von 1:160 und das mit rPBOMP-1 in Alum immunisierte Kaninchen hatte einen Titer von 1:80. Hyperimmunes Antiserum wurde erhalten, nachdem das Kaninchen Mehrfachdosierungen von nativem PBOMP-1 erhielt. Das hyperimmune Kaninchen-anti-PBOMP-1-Serum hatte einen Titer von 1:160. Diese Ergebnisse weisen klar aus, daß das rPBOMP-1 in der Lage ist, Antikörper hervorzurufen, der natives PBOMP-1 in Haemophilus erkennt und biologisch aktiv in dem bakteriziden Assaysystem ist.

8. Neue Plasmide für verstärkte Expression von PBOMP in E. coli

8.1 erhöhte Expression von PBOMP-1 in E. coli

Das PBOMP-1-Protein wird von dem 737 Bp BamHI-BgIII- Fragment von pAA152 exprimiert, wahrscheinlich unter der Steuerung seines nativen Promotors. Die Sequenz enthält eine gute Consensus-Ribosomenbindungsstelle und ein Startcodon des PBOMP-1-Gens. Während PBOMP-1, exprimiert in E. coli mit Plasmiden, die dieses Fragment enthalten, leicht durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen wurde, war die Menge an solchem erzeugten Protein weniger als 1 % des Zellproteins, das heißt weniger als die Menge von PBOMP-1, hergestellt in H. influenzae-Zellen, die das native Gen enthielten.
Als einen anfänglichen Versuch, höhere Mengen an PBOMP-1 in E. coli zu erzeugen, wurde das klonierte Gen unter die Kontrolle der Promotoren lac und Lambda PL, die bekanntlich hohe Proteinerzeugung ergeben, gesetzt. Promotoren wurden zu der BstNI-Stelle stromaufwärts des PBOMP-1-Startcodons (Figur 4A) gebunden. Spaltung an dieser Stelle entfernt den nativen PBOMP-1-Promotor, läßt jedoch die Ribosomenbindungsstelle intakt.
Diese Konstruktionen wurden wie nachstehend ausgeführt. Zunächst wurde das 739 Bp BamHI-BgIII-Fragment von pAA152, das das PBOMP-1-Gen trägt in die BamHI-Stelle des lac-Promotors von Plasmid pUC19 kloniert. Ein Klon, der das PBOMP-1-Gen in derselben Orientierung wie der lac-Promotor enthält, wurde pPX160 genannt. Expression von PBOMP-1 aus pPX160 in E. coli JM103 wurde vom nativen Promotor, nicht vom lac gesteuert; wahrscheinlich aufgrund eines Transkriptions- Terminationssignals in den 240 Bp zwischen der Bg1II-Stelle und dem Translationsstartcodon von PBOMP-1. Plasmid pPX160 wurde dann mit BstNI gespalten, das zwischen dem PBOMP-1- Startcodon und der Konsensus-Translationsstartstelle des Gens spaltet, jedoch die Ribosomenbindungsstelle, gebunden an den Codierungsbereich, beläßt. Die Enden wurden mit E. coli DNA Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt und das linearisierte Plasmid wurde mit BAMHI geschnitten. Das 577 Bp BstNI- Bg1II-Fragment, das das promotorlose PBOMP-1-Gen trägt, wurde zu pUCIg ligiert, gespalten mit HincII und BamHI. Das erhaltene Plasmid wurde pPX166 genannt und man fand durch Western- Blot, daß es PBOMP-1 unter der Steuerung des lac-Promotors in E. coli JM103 exprimiert.
Wenn PBOMP-1 aus lac oder PL-Promotoren in E. coli JM103 oder HB101-Stamm exprimiert wurde, wurden nur geringe Mengen an PBOMP-1 exprimiert. Western-Blot-Analyse von Lysaten dieser Zellen mit monoklonalen Antikörpern G-204, die an die aminoterminalen 20 Aminosäuren des reifen PBOMP-1 binden, zeigten die Anwesenheit von 4000 bis 5000 Dalton Peptid, erkannt durch diese monoklonalen Antikörper (Figur 20). In Zellen, die unter der Steuerung des induzierten PL-Promotors PBOMP-1 exprimieren, war die Bindungsaktivität von G-204 mehr als 90 % in diesem vermutlichen Abbauprodukt, was ausweist, daß PBOMP-1, in hohem Maße in E. coli exprimiert, instabil ist.
Plasmid pPX160 und pPX166 wurden in verschiedene E. coli-Stämme, die Mutationen enthalten, von denen berichtet wird, daß sie Proteine stabilisieren, transformiert. Diese schließen ATP-abhängige Protease (lon&supmin;)-Mutationen, Hitzeschockantwort (htp) und eine mRNA-stabilisierende Mutation (pnp) ein. Zusätzlich wurden die Plasmide, da Verarbeitung von PBOMP-1 als Lipoprotein dessen Stabilität erhöhen kann, in einen E. coli-Stamm ohne hauptsächliches natives E. coli- Lipoprotein, dem Mureinlipoprotein (lpp&supmin;) gegeben. In allen geprüften Stämmen war das durch monoklonalen Antikörper G-204 erkannte PBOMP-1-Abbauprodukt in etwa derselben Menge anwesend. Folglich scheint es, daß der Abbau von PBOMP-1 in E. coli auf eine etwas andere nicht identifizierte Aktivität zurückzuführen ist.
Als einen zweiten Ansatz wurde ein modifiziertes PBOMP-1-Gen durch Entfernen der nativen Signalsequenz des Gens hergestellt. Eine solche Konstruktion bietet zwei potentielle Vorteile gegenüber nativem PBOMP-1-Protein. Zunächst kann das signalfreie PBOMP-1 nicht zu der Membran transportiert werden und folglich sind Toxizitätseffekte aufgrund Überexpression von PBOMP-1 verringert. Zweitens, da es nicht mit-den extrem hydrophoben Lipidgruppen modifiziert ist, erfordert signalfreies PBOMP-1 nicht notwendigerweise die Verwendung von Detergenzien zur Isolierung oder Lagerung in Lösung.
Konstruktion einer signalfreien Form von PBOMP-1 ist in Figur 21 erläutert. Wie in Figur 21 gezeigt, wurde das PBOMP-1-Gen aus Plasmid pPX160 an Codon 19 mit AluI-Restriktionsendonuclease geschnitten. Das erhaltene Fragment wurde zu der SmaI-Restriktionsstelle innerhalb des pUC19 Polylinkerbereichs ligiert. Das erhaltene Gen exprinierte ein Hybridprotein, das die gesamte Aminosäuresequenz des nativen PBOMP-1 plus zusätzlichen 18 Aminosäuren von dem pUC19 Polylinkerbereich am Aminoterminus enthielt. Dieses Plasmid wurde pPX167 genannt.
Wie in Figur 21 gezeigt, wurde ein zweites rekombinantes Plasmid, das PBOMP-1 exprimiert, von Plasmid pPX167 durch Spalten einer BamHI-Stelle in dem Polylinker und Klonieren des Fragments in der BamHI-Stelle des Plasmids pINIII- ompA3 abgeleitet. Das erhaltene Plasmid pPX168 enthält ein Hybridgen, das natürliches PBOMP-1, gebunden an den Aminoterminus der Signalsequenz von E. coli OMP A Protein, codiert. Dieses Hybridprodukt wird durch die Membran über die OMP A Signalsequenz unter Erzeugung einer reifen PBOMP-1 freien Lipoprotein-Modifikation und mit 8 zusätzlichen Aminosäuren an dessen Aminoterminus verarbeitet.
Plasmide pPX167 und pPX168 wurden in E. coli JM103 transformiert und zur rekombinanten PBOMP-1-Synthese geprüft. Durch SDS-PAGE-Western-Blot-Analyse erwiesen sich beide Plasmide als Proteine codierend, die durch polyklonale und monoklonale anti-PBOMP-Antisera erkannt wurden. Das modifizierte PBOMP-1, synthetisiert aus pPX167, war mit Isopropylthio-beta-d-galactopyranosid (IPTG) induzierbar und war indem Zellcytoplasma angeordnet und war in Abwesenheit von Detergenzien löslich. Das modifizierte PBOMP-1 war nicht durch Coomassie-Färbung nachweisbar im gesamten Zell-Lysat von IPTG-induzierten Zellen und umfaßte weniger als 1 % des Gesamtzellproteins. Das aus pPX168 synthetisierte modifizierte PBOMP-1 war ebenfalls mit IPTG induzierbar (unter Steuerung des Hybrid lilac Promotors), wurde in das Medium ausgeschüttet und war ebenfalls in Abwesenheit von Detergenzien löslich. Wenn vollständig induziert, wurde dieses modifizierte PBOMP-1 in einer Menge von etwa 1 bis 2 mg Zellen erzeugt.
Plasmide pPX167 und pPX168 wurden ebenfalls in einer Vielzahl von E. coli-Stämmen für Expressionsgrade geprüft. Die geprüfte Kombination, die am erfolgreichsten war, war pPX167 chimäres Plasmid, transformiert in E. coli PR13, ein Stamm, der die mRNA-stabilisierende Mutation pnp enthielt. In diesem Stamm wird rekombinantes PBOMP-1 unter der Steuerung des lac Promotors bei etwa 2 bis 3 % des gesamten Zellproteins nach lac Induktion exprimiert. Dieses rekombinante PBOMP-1 wird als zytoplasmatisches Fusionsprotein, enthaltend etwa 17 Aminosäuren von dem lac alpha-Peptid und mehrere Klonierungssequenzen, fusioniert zu dem Aminosäureterminus des PBOMP-1-Gens, exprimiert.

8.1.1 Reinigung und Charakterisierung von signalfreiem PBOMP- 1

Die nachstehenden Versuche wurden zur Reinigung und Charakterisierung des signalfreiem PBOMP-1 ausgeführt (forthin als rPBOMP-1 bezeichnet).
Isolierung von zytoplasmatischem Extrakt. Zellen aus Kulturen über Nacht von E. coli PR13, enthaltend pPX167, gezüchtet in Luria-Brühe bei 37ºC, wurden bei 4ºC in einem GSA- Rotor bei 8000 U/min für 10 min pelletiert. Die Pellets wurden in 1/10 Volumina 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen und in 1/100 Volumen 10 mM Tris, pH 7,5, enthaltend 10 ug/ml DNase und 10 ug/ml RNase, resuspendiert. Die Zellen wurden entweder durch Beschallen mit 40 W für 10 min auf Eis oder durch dreifaches Durchleiten durch eine French-Preßzelle bei 20 000 psi aufgebrochen. Nicht aufgebröchene Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 10 000 U/min in einem SS-34-Rotor bei 4ºC für 10 min entfernt. Gesamtzellmembranen wurden durch Zentrifugieren bei 55 000 U/min in einem 60Ti-Rotor für 30 min bei 4ºC entfernt. Die Membranen wurden verworfen und der Überstand zurückbehalten.

DEAE-Fraktionierung von zytoplasmatischem Extrakt.

Der Überstand wurde über eine Ionenaustausch-DEAE-Biogel A (Biorad Laboratories, Richmond, CA)-Säule ins Gleichgewicht gebracht mit 10 mM Tris, pH 7,5, geleitet. Fast das gesamte Protein wurde auf der Säule unter diesen Umständen gebunden. Gebundenes rPBOMP-1 und andere Proteine wurden schrittweise mit 10 mM Tris, pH 7,5, enthaltend 80 mM NaCl, eluiert. Alle durch diesen Puffer eluierten Proteine wurden zusammengegeben und durch Fällung mit 60 % gesättigtem Ammoniumsulfat bei 4ºC konzentriert. Das Pellet wurde durch Zentrifugation gesammelt und in 10 mM Tris, pH 7,5, gefolgt von Dialyse gegen denselben Puffer, unter Entfernung von restlichem Ammoniumsulfat gelöst.

Umkehrphasenchromatographie von rPBOMP-1.

Der rPBOMP- 1 enthaltende Überstand wurde über eine 4,6 x 15 mm C-4-Umkehrphasen-HPLC-Säule nach Verdünnung in einem Puffer, enthaltend 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) in dH&sub2;O laufen lassen. Die Säule wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min unter Verwendung desselben Puffers betrieben. Das meiste des Proteins wurde unter diesen Umständen auf der Säule gebunden. Gebundenes rPBOMP-1 wurde als einzelner Peak durch einen 0 bis 95 % Acetonitrilgradienten in 0,1 % TFA innerhalb 20 min eluiert. Der große Peak, der rPBOMP-1 enthielt, (siehe Figur 22, Peak 1) wurde gesammelt und Fraktionen wurden gesammelt und durch Verdampfen des Lösungsmittels eingeengt. Getrocknetes rPBOMP-1 wurde in dH&sub2;O zurückgelöst.
SDS-PAGE wurde an dem zytoplasmatischen Extrakt, dem DEAE-Eluat und dem Umkehrphaseneluat, erhalten von E. coli PR13-Zellen, die Plasmid pPX167 enthielten, wie vorstehend beschrieben, ausgeführt. Nach Elektrophorese wurden die Gele mit Coomassie brilliant blue-Färbung für etwa 2 h eingefärbt. Western-Blot-Analyse unter Verwendung von monoklonalem Antikörper GD204 wurde ebenfalls ausgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 23 A und B erläutert.
Wie in Figur 23A gezeigt, ist rPBOMP-1 das Hauptpeptid, das in dem zytoplasmatischen Extrakt der Zellen von Plasmid pPX167 enthaltenden E. coli PR13 vorliegt, wenn es mit Coomassie-Farbstoff gefärbt wird (Figur 23A, Bahn 1). Wie durch Western-Blot-Reaktivität abgeschätzt sind mehr als 95 % von rPBOMP-1 in dem zytoplasmatischen Extrakt angeordnet. Da kein Detergens bei der Herstellung des zytoplasmatischen Extrakts verwendet wurde, weisen die Ergebnisse aus, daß das durch jene Zellen erhaltene rPBOMP-1 in 10 mN Tris-HCl, pH 7,5, ohne Detergens löslich ist. Dies stellt eine Abweichung zu dem von Hib-Zellen als Lipoprotein erhaltenen PBOMP-1 dar.
Vorläufige Versuche unter Verwendung des zytoplasmatischen Extrakts wiesen aus, daß rPBOMP-1, erhalten von E. coli PR13-Zellen, enthaltend pPX167 in wässerigen Lösungen als ein Komplex, entweder von sich selbst oder mit anderen zytoplasmatischen Proteinen vorliegen kann. Wenn Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung von Acrylamidagarosepolymeren oder Sephadexkügelchen unter Verwendung dieses rPBEMP-1 ausgeführt wurde, eluierte rPBOMP-1 bei einer scheinbaren Nolekularmasse von mehr als 100 000 Dalton (Daten nicht dargestellt). Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von DEAE-Biogel A (Biorad Laboratories, Richmond, CA) zeigte, daß rPBOMP-1 nicht als einzelner Peak bei einer besonderen Salzkonzentration eluierte. Das rPBOMP-1 eluierte über einem Bereich von NACI-Konzentrationen von etwa 20 mN bis 75 mN in 10 uM Tris, pH 7,5. Obwohl das eluierte rPBOMP-1 eines von vielen eluierten Proteinen in 80 uM NaCl-Waschlösung war, verblieb eine signifikante Anzahl an zytoplasmatischen Proteinen an der Säule bei Salzkonzentrationen von mehr als 80 mM gebunden. Somit wurde DEAE-Chromatographie wie vorstehend beschrieben verwendet als vorläufiger Schritt zur Entfernung einer bedeutenden Anzahl von kontaminierenden Proteinen von rPBOMP-1.
Wie in Figur 23A dargestellt, vermindert DEAE-Chromatographie größtenteils die Anzahl der Proteine, die in dem zytoplasmatischen Material gefunden wird (Figur 23A, Bahn 2) und ändert nicht die Reaktivität von rPBOMP-1 mit monoklonalem Antikörper (Figur 23B, Bahn 2).
Die Aminosäuresequenz von rPBOMP-1 weist aus, daß sie ein relativ hydrophobes Protein sein sollte. Obwohl es in dem zytoplasmatischen Extrakt ohne Detergenzien löslich war, wurde angenommen, daß das rPBOMP-1 hydrophober sein würde als die meisten der zytoplasmatischen Proteine. Das DEAE-Eluat, enthaltend rPBOMP-1, wurde somit an einer C-4 hydrophoben Wechselwirkungssäule wie vorstehend beschrieben chromatographiert und unter Verwendung eines Gradienten mit ansteigend Acetonitril eluiert. In diesem System sollten die hydrophoberen Proteine fester an die Säule gebunden werden und so bei höheren Erhöhung der Acetonitrilkonzentrationen eluiert werden. Es war denkbar, daß rPBOMP-1 fester binden würde als die meisten der kontaminierenden Proteine und weit nach ihnen eluieren würde. Wenn die rPBOMP-1 enthaltende Fraktion an einer C-4 Säule chromatographiert wurde, wurde PBOMP-1 als Hauptpeak von der Säule eluiert (Figur 21) und überraschenderweise wurde es zuerst bei der geringsten Konzentration von Acetonitril eluiert.
Wie in Figur 23A, Bahn 3 gezeigt war der rPBOMP-1- Peak rein, wie ermittelt durch Coomassie brilliant blue R-250-Färbung von 10 ug Protein nach SDS-PAGE. Der Peak zeigte 2 Banden, eine Haupt- und eine Nebenbande, nach Coomassie- Färbung, beide davon reagierten mit monoklonalem Antikörper zu PBOMP-1, der die aminoterminalen 20 Aminosäuren von PBOMP- 1 erkennt (Figur 23B, Bahn 3). Die Hauptbande, etwa 2000 kdalton kleiner als rPBOMP-1 in voller Größe, war ebenfalls im gesamten Zellextrakt von PR13 (pPX167) enthalten, was ausweist, daß das kleinere Protein nicht ein Nebenprodukt des Reinigungsverfahrens ist. Nach Konzentration durch Eindampfen des Lösungsmittels war das gereinigte rPBOMP-1 in wässerigen Lösungsmitteln ohne Detergenzien löslich.

Immunisierung von Kaninchen.

Kaninchen, weiße Neuseeländer, wurden mit rPBOMP-1, erhalten aus E. coli PR13-Zellen, enthaltend pPX167, entweder emulgiert in unvollständigem Freund'schem Adjuvans oder gebunden an Aluminiumhydroxid, immunisiert. rPBOMP-1 wurde an Alum durch Vermischen von rPBOMP-1 bei einer Konzentration von 500 ug/ml in 0,85 % Salzlösung mit Alum bei einer Konzentration von 500 ug/ml bei einem 1:1-Verhältnis gebunden. Das Gemisch wurde bei 37ºC für 3 h geschüttelt und das Alum durch Zentrifugieren pelletiert. Der Überstand wurde hinsichtlich ungebundenem Protein durch BCA-.Protein-Assay untersucht (Pierce Chem. Co., Chicago, IL). Nichts wurde nachgewiesen. Alum wurde in physiologischer Kochsalzlösung bei 500 ug/ml resuspendiert. rPBOMP-1 wurde in unvollständigem Adjuvans (Difco) in einem 1:1-Verhältnis emulgiert. Tiere wurden intramuskulär mit 50 ug jeder Zubereitung in 4-Wochen-Intervallen immunisiert. Den Tieren wurden bei den Wochen 0, 6 und vor jeder Immunisierung Blut entnommen. Diese Sera wurden hinsichtlich anti-PBOMP-1- und anti-rPBOMP-1-Antikörper unter Verwendung von ELISA und Western-Blot-Analyse untersucht.
Immunisierung mit dem rekombinanten PBOMP-1, rief Antikörpertiter gegen rekombinantes PBOMP-1 und PBOMP-1, erhalten von H. influenzae (bezeichnet als natives PBONP-1), wie durch ELISA-Assays bestimmt, hervor. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9 ELISA-Titer von Antisera gegen rPBOMP-1 ELISA-Titera gegen anti-rPBOMP-1 Antisera Adjuvans natives PBOMP- 1 Woche Alum a ELISA-Titer gibt den reziproken Wert der höchsten Verdünnung des Antiserums wieder, der das Doppelte des Hintergrundspiegels ergibt.
Wie in Tabelle 9 dargestellt, ruft Immunisieren von Tieren mit rPBOMP-1 entweder an Alum oder IFA deutliche Titer von Antikörper hervor, die mit sowohl rPBOMP-1 als auch nativern PBOMP-1 nach 6-wöchiger Postimmunisierung reaktiv sind.

8.2 erhöhte Expression von PBOMP-2 in E. coli

PBOMP-2 wird ebenfalls in geringen Graden (weniger als 1 % Zellprotein) von Plasmid pAA130 exprimiert. Expression von PBONP-2 ist scheinbar unter der Steuerung von dessen nativem Promotor.
Um die Ausbeute an PBOMP-2 zu verbessern, wurde das PBOMP-2-Gen in pAA130 an der einmaligen SspI-Restriktionsstelle 5 Basen 5' zu dem PBOMP-2-Startcodon geschnitten und an der 5mal-Stelle von pUC19 (Figur 24) ligiert. Die Ligierung führte zu einem hybridoffenen Leseraster (ORF), enthaltend das vollständige PBOMP-2 ORF (einschließlich der Signalsequenz) plus 18 Codone von pUC19 und 2 Codone aus der Genfusionsstelle. Das Proteinprodukt dieses Fusionsgens hatte ein vorbestimmtes Molekulargewicht von 17999 Dalton und wird unter Steuerung des lac Promotors exprimiert. Dieses Plasmid wird als pPX163 bezeichnet.
Wenn das Plasmid pPX163 in E. coli JM103 transformiert und mit IPTG induziert wurde, wurde ein Protein von 17500 Dalton scheinbaren Molekulargewichts exprimiert. Außerdem wurde ein Proteindoublet bei 15 000 Dalton Molekulargewicht beobachtet. Alle 3 Proteine wurden durch anti-PBOMP-1- Antisera auf Western-Blot (Figur 25) erkannt. Durch Coomassie blue-Färbung von SDS-PAGE, umfaßten die 3 Formen von rekombinanten PBOMP-2 etwa 15 % des gesamten Zellproteins nach lac-Induktion (Figur 25, Bahn 3). Die 3 Formen der aus pPx163 expriinierten rekombinanten PBOMP-2 wurden isoliert und die N- terminale Peptidanalyse ergab, daß:
1. Die Bande bei einem scheinbaren Molekulargewicht von 17 500 Dalton das vorbestimmte pUC19/PBOMP-2 Hybridprotein ist;
2. die obere 15 000 Dalton MW-Bande am ersten Methioninrest der PBOMP-2-Signalsequenz beginnt (das heißt das Startcodon des PBOMP-2 ORF) und wahrscheinlich zurückzuführen ist auf Reinitiierung der Translation an diesem Punkt und
3. die niedere Bande mit eineirt Molekulargewicht von 15 000 Dalton für die N-terminale Analyse blockiert ist und mit ¹&sup4;C-Palmitat markiert werden kann. Folglich besteht diese Bande aus mit Lipoprotein verarbeitetein PBOMP-2.

9. Kartierung von Epitop-Determinanten von PBOMP-1

9.1 Synthese und Spaltpeptide

Die meisten Antikörper erkennen antigene Determinanten auf Proteinen, die konformationsspezifisch sind, gebildet durch im Raum benachbarte Reste, jedoch nicht Reste, die in der primären Sequenz benachbart sind. Ein kleiner Teil von Antikörpern erkennt lineare Teile des Proteinmoleküls. Diese linearen oder kontinuierlichen Epitope bestehen gewöhnlich aus etwa 5 bis 10 Aminosäuren und heben sich von der Proteinoberfläche ab, die Ecken und Knicke auf dem Molekül und vermutlich Umkehrwindungen (reverse turns) und Schleifenstrukturen bildet. Für den meisten Teil sind kontinuierliche Epitope hydrophil und oberflächenzugänglich. Computeralgorithmen von Hopp und Wood (1981, Proc Natl. Acad. Sci. USA 78:3824-3828) und Chou und Fasman (1978, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276) wurden zur Identifizierung verschiedener hydrophiler Bereiche (ausgewiesen durch die kreuzweise schraffierten rechteckigen Kästen in Figur 26) von PBOMP-1 (Aminosäuresequenz ist in Figur 11 dargestellt), die Umkehrwindungen enthielten (ausgewiesen durch Vollpfeile in Figur 26), jeweils basierend auf einem Tetrapeptid (moving average), ermittelt. Diese Computerrecherche zeigte hydrophile Windungen, vorwiegend in der Nähe der amino- und carboxylterminalen Bereiche von PBOMP-1.
Fünf Peptide, P1 bis P5, entsprechend den 2 Endtermini, wurden zur chemischen Synthese ausgesucht. Peptid P1 entspricht den N-terminalen Resten 1 bis 20 des reifen Proteins (siehe Figur 26 und 27). Die verbliebenen 4 Peptide, P2 bis P5, sind ineinandergeschachtelte Serien von dem C-terminalen Ende von PBOMP-1, das längste davon ist P5, eine Sequenz mit 38 Aminosäuren, enthaltend Reste 97 bis 134 des reifen Proteins. Synthetische Peptide wurden durch Festphasenverfahren von Merrifield (1964, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 bis 2154) unter Verwendung symmetrischer Anhydrid-Kupplungschemie mit Abweichung der Aminosäuren Arginin, Asparagin und Glutamin ausgeführt, für die 1-Hydroxybenzotriazolester verwendet wurden. Die Synthese wurde mit einem Applied Biosystems (Modell 430A) automatischem Peptidsynthesizer ausgeführt. Jede Aminosäure wurde doppelt gekuppelt, was zu schrittweisen Ausbeuten von mehr als 99,5 %, wie durch den Ninhydrintest angezeigt, führte. Peptide wurden von dem Harz mit wasserfreier Flußsäure gespalten.
Proteolytische Fragmente von PBOMP-1 wurden durch Aufschluß mit zahlreichen Proteasen erhalten. EndoLys-C-Aufschluß führte zur Bildung eines großen 63 Aminosäurepeptids (Reste 1 bis 63) des reifen Proteins. Tyr 87-Glu 121 wurde erhalten von dem Aufschluß mit Staphylokokkus V8-Protease und Gly 18-Arg 85 wurde abgeleitet von einem endoArg-C-Auf schluß.
Sowohl chemisch synthetisierte Peptide, als auch proteolytische Fragmente wurden durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac C4-Säule unter Verwendung von Acetonitril/Wasser- Gradienten mit 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) analysiert. In allen Fällen überstieg die Reinheit der synthetischen Peptide 95 %, wie durch Aminosäuresequenzierung bestätigt.

9.2 Monoklonale Antikörper (Mabs)

Monoklonale Antikörper wurden erzeugt und gereinigt, wie in Abschnitt 6.2.2 beschrieben. Kurz gesagt: wurden Hybridom-Zellinien, die Antikörper gegen PBOMP-1 ausschütten, durch Fusion einer Mausmyelom-Zellinie, X63. Ag8,6543, mit Milzzellen, erhalten von einer C57/B1-Maus, immunisiert mit PBOMP-1, erhalten. Gewünschte Hybridoma wurden durch begrenzte Verdünnung rekloniert und hinsichtlich Reaktivität für PBOMP-1 durch Western-Blot abgesucht. Ausgewählte Hybridoma wurden in Balb/c-Mäuse zur Züchtung als Aszites injiziert.
Eine Gesamtzahl von 43 Hybridomklonen, die anti- PBOMP-1-Antikörper ausschütten, wurde aus den Fusionsexperimenten erhalten. Unter Verwendung von kompetitiver ELISA wurde demonstriert, daß ausgedehnte Kreuzkompetition unter den Mabs vorliegt, was ausweist, daß sie überlappende oder sehr nahe antigene Determinanten erkennen. Mabs wurden hinsichtlich ihrer Reaktivitätsprofile in 7 Gruppen kategorisiert. Repräsentative Mabs von diesen Gruppen wurden in weiteren Experimenten verwendet, zur Bestimmung und Definition geeigneter angrenzender Epitope für Impfstofforirtulierungen.

9.3 Epitopkartierung mit Mabs (monoklonalen Antikörpern)

9.3.1 Reaktivität von synthetischen Peptiden über direkte ELISA-Assays.

Ein direktes ELISA-Assay wurde verwendet zur Bestimmung der Bindung von monoklonalen Antikörpern für synthetische Peptide von PBOMP-1. Wie in Tabelle 10 ausgewiesen, reagierten nur 2 Mabs, G204-2 und G194-3, direkt mit dem P1-Peptid. Diese 2 Mabs erkennen scheinbar dieselben Epitope, da sie miteinander konkurrieren bei den kompetitiven Bindungsexperimenten (Daten nicht dargestellt). Die verbliebenen Mabs reagierten nicht mit einem der Peptide unter den zur Beschichtung der Mikrotiterplatten verwendeten Bedingungen. Tabelle 10 Punkt-Autoradiogramm-Bestimmung zur Ermittlung der Bindung von monoklonalen Antikörpern an synthetische Peptidsegmente von PBOMP-1 Peptid Monoklonale Antikörper der G-Reihe

9.3.2 Inhibitorwirkung von synthetischen Peptiden

Die relative Fähigkeit der synthetischen Peptide, die Bindung von verschiedenen Mäbs an PBOMP-1 zu inhibieren, die auf den Mikrotiterplatten beschichtet sind, sind in Tabelle 11 gezeigt. Alle diese monoklonalen Antikörper, die in dem kompetitiven ELISA verwendet werden (siehe Abschnitt 6.2.2 für eine genaue Beschreibung des Verfahrens) reagierten mit PBOMP-1. Peptid P1 war zu 100 % wirksam bei der Inhibierung der Bindung von Mabs G204-2 und G194-3 an natives PBOMP-1. Beide dieser Mabs reagierten auch direkt mit dem P1-Peptid (siehe vorstehend). Somit liegen die durch die Mabs G204-2 und G194-3 erkannten Epitop(e) innerhalb der ersten 20 Aminosäuren von PBOMP-1.
Die Bindung von Mabs G196-3, G212-6, G214-3 und G190- 8 zu PBOMP-1 wurde wirksam inhibiert (100 %) von allen C-Termini-Peptiden, P2-P5 (Tabelle 11). Diese 4 Mabs müssen ein Epitop(e), das innerhalb des P2-Peptids enthalten ist, eine Sequenz mit 15 Aminosäuren, die sich von Asp120 bis Tyr134 erstreckt, erkennen.
Beide Mabs G187-1 und G216-3 wurden stark inhibiert von der Bindung zu PBOMP-1, beschichtet auf einer Platte durch P4 und P5 Peptide (Tabelle 11). Andererseits waren sowohl P3 als auch P2 Peptide minimal wirksam bei der Inhibierung der Bindung von diesen 2 Mabs an PBOMP-1. Diese Inhibierungsdaten weisen aus, daß der 10 Aminosäurebereich (K-L- G-T-V-S-Y-G-E-E-K, Reste 103 bis 113 des reifen Proteins) ein Epitop enthält, das von Mabs G187-1 und G216-3 erkannt wird. Es ist möglich, daß dieser 10 Aminosäurebereich 2 Orte enthalten kann, da Mabs 216-3 und G187-1 von 2 nicht kreuzreagierenden Gruppen stammen. Tabelle 11 Konkurrenz zwischen PBOMP-1 und synthetischen Peptidsegmenten von PBOMP-1 für anti-PBOMP-1-monoklonale Antokörper im ELISA-Test Peptid % Inhibierung der bindung der monoklonalen Antikörper

9.3.3 Reaktivität von Mabs mit proteolytisch gespaltenen PBOMP-1-Fragmenten

PBOMP-1-Peptidfragmente, erzeugt durch proteolytische Spaltung, wurden hinsichtlich Reaktivität mit einer begrenzten Zahl von anti-PBOMP-1 Mabs durch direkte Punktautoradiographie- und Western-Blot-Immunoblot-Analyse geprüft. Ein großes 63 Aminosäurepeptid (Reste 1 bis 63 des reifen Proteins), erhalten von endolys-C-Aufschluß, reagierte mit Mab G204-2. Diese Beobachtung war nicht überraschend, da die N- terminale 20 Aminosäuresequenz innerhalb dieses Spaltpeptids enthalten ist. Ein Peptid, TyrB7 bis Glu121, erhalten von einem V8-Aufschluß, reagierte mit Mab G216-3. Dieser Mab erwies sich (siehe vorstehend) als eine Sequenz mit 10 Aminosäuren, die von diesem V8-Peptid umfaßt wird, die die Reste 103 bis 113 des reifen Proteins erkennt. Schließlich erwies sich Mab G219-3, der nicht an einen der synthetischen Peptide bindet, als reaktiv mit einem 68 Aminosäurepeptid, Gly18-Arg85, abgeleitet von einem endoarg-C-Aufschluß.
Zusammengefaßt zeigten diese Untersuchungen, die die Bindung von monoklonalen Antikörpern an synthetische Peptide und Peptide, erzeugt durch proteolytischen Aufschluß einbezogen, die Anwesenheit von kontinuierlichen antigenen Bereichen von PBOMP-1. Ein schematisches Diagrarnm, das die Kartierung von Epitopen, die durch Mabs erkannt werden, wiedergibt, ist in Figur 28 dargestellt. Zwei der vier Determinanten waren an den Kettenenden angeordnet, das heißt, die N-terminalen Reste 1 bis 20 und die C-terminalen 120 bis 134 des reifen Proteins. Der dritte antigene Bereich, erkannt durch Mab G216-3 und G187-1, wurde auf einer kleinen Aminosäuresequenz lokalisiert (10 Aminosäuren), die sich von Resten 103 bis 113 des reifen Proteins erstreckte. Schließlich wird ein größerer antigener Bereich, erkannt durch Mab G219-3, durch die Reste Gly18-Arg85 umspannt. Da das letztere Peptid ziemlich groß ist, könnte das Epitop leicht konformationsabhängig sein, da Versuche, es allmählich zu verkleinern, zum Verlust der Antigenizität führen.

9.4 Funktionelle Aktivität von Mabs

Die funktionelle Aktivität von Mabs wurde in einem bakteriziden Assay gegen H. influenzae-Stamm 52 geprüft. Das verwendete Komplement war präcolostrales Kalbsserum (PCCS), 2 x adsorbiert mit gewaschenen S2-Ganzzellen. Bakterien wurden über Nacht in Hirn-Herz-Infusions-Brühe (BHI), ergänzt mit Hämin bei 10 ug/ml und NAD bei 2 ug/ml (BHIXV) über Nacht gezüchtet und 1:15 in frischer Brühe verdünnt und bei 37ºC mit Belüftung inkubiert. Zellen wurden zu einer OD bei 490 nm von 0,9 (etwa 10 CFU/ml) gezüchtet. Die Bakterien wurden 40000-fach durch eine Verdünnungsreihe in steriler phosphatgepufferter Salzlösung, enthaltend 0,15 uM CaCl&sub2;, 0,5 uM MgCl&sub2; und enthaltend 0,5 % Rinderserumalbumin (PCMA) verdünnt. Die letztliche Verdünnung wurde in PCMA mit PCCS in einem Verhältnis von 4:1 ausgeführt.
Aszites-Flüssigkeit wurde in PCMA durch zunächst Verdünnen auf das Zehnfache in dem Puffer und anschließend Rückkonzentrieren zum ursprünglichen Volumen unter Verwendung einer Centricon Mikrokonzentrationseinheit mit einer 10000 cut- off-Membran gewaschen. Monoklonales Mausantiserum wurde mit gesättigtem Ammoniumsulfat bei 35 % Endkonzentration bei 4ºC über Nacht umgesetzt. Die Probe wurde für 10 min bei 4ºC in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in dem Zehnfachen des ursprünglichen Serumvolumens von PCMA resuspendiert. Die Probe wurde zum ursprünglichen Volumen unter Verwendung einer Centricon-Einheit mit einer 10000 cut-off-Membran wiederhergestellt. Die Probe wurde vier weitere Male zur Entfernung von Ammoniumsulfat gewaschen.
15 ul der Serumprobe wurden in die erste Vertiefung einer sterilen Mikrotiterplatte mit 96 U-förmigen Vertiefungen, gehalten aut Eis, gegeben. Zweifache serielle Verdünnungen unter Verwendung von PCMA wurden in den verbliebenen Vertiefungen ausgeführt. Die Platten wurden von dem Eis entfernt und 15 ul der Zell/Komplementsuspension wurden zu dem Serum in den Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden bei 37ºC für 45 min inkubiert. Eine 10 ul-Probe aus jeder Vertiefung wurde auf einer BHIXV-Platte verteilt und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Der bakterizide Titer wurde als Reziprokwert der höchsten Verdünnung aufgezeichnet, die in der Lage ist, die Zahl an CFU um 50 %, verglichen mit einer keine Antikörper enthaltenden Kontrollprobe, zu vermindern.
Die Ergebnisse dieser bakteriziden Assays sind in Tabelle 12 dargestellt. Von den 10 geprüften anti-PBOMP-Mabs waren G102-5, G56-5, G216-3 und G204-2 hinsichtlich bakterizider Aktivität positiv. Ein nicht verwandter viraler Mab zeigte keine Aktivität. Interessanterweise wurden zwei der vier definierten antigenen Determinanten von PBOMP-1, N-terminale Reste 1 bis 20 und 103 bis 113 des reifen Proteins, separat von 2 bakteriziden Mabs erkannt, nämlich G204-2 und G216-3. Die bakterizide Aktivität dieser 2 Mabs unterstützt die These, daß diese 2 Bereiche oberflächenexponiert auf dem Bakterium liegen. Überraschenderweise lassen vorläufige Inhibierungsdaten vermuten, daß Mab G204-2 eine stärkere Reaktivität zu dem synthetischen N-terminalen Peptid zeigt als zu dem nativen PBOMP-1. Dies ist im deutlichen Gegensatz zu der üblicherweise geringen antigenen Aktivität, die mit synthetischen Peptiden verbunden ist, wenn mit Antikörpern des gesamten Proteins gemessen wird. Augenscheinlich ahmte das freie N-terminale Peptid in Lösung die Struktur dieser Peptidsequenz in dem reifen PBOMP-1-Molekül nach und kann sterisch besser zugänglich für die Antikörperbindung sein. Zusätzlich zu Mabs G204-2 und G216-3 wurden zwei weitere Mabs, G102-5 und G56-5 als bakterizid für Haemophilus-Organismen gefunden. Da sie nicht mit synthetischen oder gespaltenen Peptiden reagieren, wurde angenommen, daß diese bakteriziden Mabs diskontinuierliche (oder konformationale) Epitope erkennen. Tabelle 12 Bakterizide Aktivität von anti-PBOMP-1 monoklonalen Antikörpern gegen nichttypisierbaren H. influenzae-Stamm S2a monoklonale Antikörper Gruppe Ergebnisse viral a Bedingungen, die für das bakterizide Assay verwendet wurden, sind im Text beschrieben. Von den 11 anti-PBOMP-1 monoklonalen Antikörpern waren 4 hinsichtlich bakterizides Assay gegen einen nichttypisierbaren Haemophilus S2-Stamm positiv. Ein nichtverwandter viraler monoklonaler Antikörper zeigte keine Aktivität.

10. Induktion eines biologisch funktionellen Antikörpers durch ein Koniugat eines svnthetischen N-terminalen Peptids von PBOMP-1

10.1 Chemische Charakterisierung von Peptid-Protein-Konjugaten

Das zur Synthese in dieser Untersuchung ausgewählte Peptid entsprach der N-terminalen 20 Aminosäuresequenz, Cys1 bis Tyr20 (P1) des reifen PBOMP-1 unter Verwendung der Verfahren, beschrieben in Abschnitt 9.1. Wie ebenfalls in Abschnitt 9.1 beschrieben, wurde das Peptid durch Umkehrphasen- HPLC gereinigt. Die letztliche Reinheit (95 %) der synthetischen Peptide wurde durch direkte Aminosäuresequenzierung mit einem Applied Biosystem Modell 477A Proteinsequenator bestätigt.
Konjugate wurden hergestellt unter Verwendung von MBS (3-Maleimidobenzoesäure-N-hydroxysuccinimidester, Pierce Chemical Co., Rockport, IL) als Vernetzungsmittel (Liu et al., 1979, Biochemistry 18:690 bis 697). Das Konjugationsverfahren schritt in allmählicher Folge fort. Erst wurden die epsilon- Aminogruppen von den Oberflächen-Lysinylresten von BSA (oder Thyroglobulin) mit einem Überschuß an MBS acyliert. Die Kupplungsreaktion wurde bei Raumtemperatur in phosphatgepufferter Salzlösung, ph 7,3, durch Vermischen des Proteinträgers mit MBS bei einem Mol-Verhältnis von 1:100 ausgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Sephadex-G-50 zur Entfernung überschüssigen MBS-Reagenzes entsalzen. Als Zweites wurde das Peptid P1, das die aminoterminalen Cysteinylreste trägt, mit Natriumborhydrid reduziert, um eine reaktive Sulfhydrylgruppe zu gewährleisten. Als Drittes wurde Konjugation durch Zugabe des reduzierten Peptids an eine Lösung, die BSA-MBS oder Thyroglobulin-MBS-Derivat enthielt und Ablaufenlassen der kovalenten Reaktion über Nacht erreicht. Dialyse wurde ausgeführt, um den Überschuß an nicht umgesetztem Peptid vor dem Gefriertrocknen zu entfernen. Kovalenz wurde durch eine Verschiebung im Molekulargewicht auf SDS-Gelen und durch Western-Blot-Analyse gezeigt. Die Verschiebung im Molekulargewicht entsprach 7 Molekülen Peptid pro BSA-Molekül und 25 Molekülen Peptid pro Thyroglobulinmolekül. Außerdem reagierten die Konjugatbanden mit sowohl anti-PBOMP-1 als auch anti-Peptid-Antisera auf einem Western-Blot.
Um Immunogenizität zu erhöhen, wurde das N-terminale Peptid mit Palmitylgruppen gemäß dem Verfahren von Hopp (1984, Mol. Immuno. 21: 13 bis 16) fettsäureacyliert. Das Peptid wurde im wesentlichen an den Aminoterminus mit Diglycinspacer, gefolgt von Lysylrest, verlängert. Sowohl die alpha- als auch epsilon-Aminogruppen von N-terminalem Lysin wurden mit Palmitinsäuren durch symmetrische Anhydridkupplungsverfahren acyliert. Die Vollständigkeit der Fettsäureacylierung wurde durch (1) einen negativen Ninhydrin-Test verifiziert, der vollständige Derivatisierung von Lysylaminogruppen anzeigt (2) Widerstandsfähigkeit des Peptids gegen Aminosäuresequenzierung aufgrund des blockierten N-Terminus und (3) längere HPLC-Elutionszeit unter Verwendung einer Umkehrphasensäule aufgrund der erhöhten Hydrophobizität.

10.2 Herstellung von polyklonalem anti-PBOMP-1 N-terminalem (N-1-20) Peptid-Antiserum

Swiss-Webster-Mäuse, die mindestens 6 Wochen alt waren, wurden von den Taconic Farms (Germantown, NY) erhalten. Gruppen von 5 Mäusen wurde vorher Blut entnommen und sie wurden intramuskulär mit 1 oder 10 ug eines (N-1-20) Trägerpeptidkonjugats mit oder ohne vollständiges Freund'sches Adjuvans (CFA) geimpft. Bei Woche 4 wurden die Tiere mit derselben Dosis Impfstoff, die für die Erstimpfung verwendet wurde, aufgefrischt. Mit CFA-erstbeimpfte Mäuse wurden mit Konjugat in nichtvollständigem Freund'schem Adjuvans (IFA) aufgefrischt. Den Mäusen wurden bei Wochen 4 und 6 Blut entnommen.
Kaninchen, erhalten von den Taconic Farms (Germantown, NY), wurden mit 10 ug Peptidkonjugat immunisiert und Blut nach demselben Impfplan, wie vorstehend beschrieben, entnommen.

10.3 Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen PBOMP-1 N-terminales (N-1-20)-Peptid

Hybridom-Zellinien, die Antikörper zu dem PBOMP-1 N- terirtinalen Peptidträgerkonjugat ausschütten, wurden durch Fusion der Mausmyelom-Zellinie, X63.Ag8.6543 mit Milzzellen, erhalten von einer C57/B1-Maus, immunisiert mit (N-1-20)-Trägerkonjugat wie in Abschnitt 6.2.2 beschrieben, erhalten. Gewünschte Hybridoma wurden durch begrenzende Verdünnung rekloniert (siehe Abschnitt 6.2.2 für eine genaue Beschreibung dieses Verfahrens) und hinsichtlich Reaktivität mit (N-1-20)- Trägerkonjugat durch Western-Blot ausgesucht. Ausgewählte Hybridoma wurden in Balb/c-Mäuse zur Züchtung als Aszites durch Standardverfahren injiziert (Brodeur et al., s.o.).

10.4 Immunogenizität von PBOMP-1 N-terminalem (N-1-20)-Peptidträger-Konjugat

Die Immunogenizität eines PBOMP-1 N-terminalen (N-1- 20) Peptidkonjugats wurde in einer Untersuchung geprüft. Mäuse und Kaninchen wurden subkutan mit 10 ug des (N-1-20) Peptidträgerkonjugats (oder PBOMP-1), emulgiert in CFA, immunisiert, gefolgt von einer 4 Wochen späteren Auffrischungsinjektion in IFA. Den Tieren wurde 14 Tage nach der letzten Injektion Blut entnommen.
Anti-(N-1-20) Peptidaktivität der Tierantisera wurde durch das ELISA-Verfahren, beschrieben in Abschnitt 6.2.2. s.o., bestimmt. Kurz gesagt, wurden Polystyrolplatten mit 96 Vertiefungen (NUNC Intermed, Thousand Oaks, CA) mit PBOMP-1 oder einem (N-1-20)-Peptid-Trägerkonjugat beschichtet, das heißt, (N-1-20)-Peptid-BSA in einer Konzentration von 1 ug/ml in PBS. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC in einer feuchten Kammer inkubiert. Vorimpfungsserum wurde immer als Negativ-Kontrolle verwendet und ein polyklonales anti-PBOMP- 1-Serum wurde als positive Kontrolle verwendet. Alkalische Phosphatase, gekuppelt an IgG anti-Maus-Antisera wurde als sekundärer Antikörper verwendet. Die Reaktion wurde mit p-Nitrophenylphosphat bei 1 mg/ml in Diethanolaminpuffer entwikkelt. Die optische Dichte (OD) bei 410 und 690 nm wurde unter Verwendung eines Bio-Tek 310 Autoreader abgelesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 angeführt. Tabelle 13 Antikörperantwort auf N-terminales Peptid, gemessen durch ELISA, Maus anti-(N-1-20)-Seraa Woche Kaninchen anti-(N-1-20)-Sera Maus anti-PBOMP-1-Seraa a Die Maus-Sera waren gesammelte Sera von 5 Tieren.
Die ELISA-Ergebnisse zeigten, daß (N-1-20)-Trägerkonjugat stark wirksam war bei der Maus und dem Kaninchen anti- Peptid-Antikörper mit einer Fähigkeit, das Peptid (gebunden an BSA-Träger) und natives PBOMP-1 (siehe Tabelle 13) zu erkennen. Mit (N-1-20)-Trägerkonjugat immunisierte Mäuse ergaben eine hohe anti-Peptid-Titerantwort von 1:1024000. Die Maus-anti-Peptid-Antikörper wurden in starker Weise von dem Stamm PBOMP-1 in dem ELISA bei 1:512000 erkannt. Diese anti- Peptid-Antikörper scheinen gegen N-terminales Peptid spezifisch zu sein, da nur vernachlässigbare Mengen dieser Antikörper mit BSA reagierten.
Der maximale Kaninchen anti-Peptid-Titer wurde mit Kaninchen Nr.2 bei 1:4096000 erhalten. Kaninchen Nr.1 hatte einen starken anti-Peptid-Titer von 1:256000. Beide Kaninchen anti-Peptid-Sera waren in der Lage, natives PBOMP zu erkennen, wie durch 32- und 512-fache Erhöhung der Titer, verglichen mit den Titern vor der Immunisierung von Kaninchen Nr.1 bzw. Kaninchen Nr.2 gezeigt. Interessanterweise wurden Antiprotein-Antikörper gegen PBOMP-1 entwickelt, die mit dem N- terminalen Peptid reagierten, bei einem ELISA-Titer von mehr als 1:256000, was vermuten läßt, daß das N-terminale Epitop immunodominant ist.
Die SDS/Western-Blot-Technik wurde ebenfalls verwendet zur Bewertung der Maus-Antipeptidsera, hervorgerufen von dem (N-1-20)-Trägerkonjugat. Der Antipeptid-Antikörper und die Maus-anti-PBOMP-1 polyklonalen Sera erwiesen sich als reaktiv mit beiden Konjugaten: Peptid-BSA und Peptid-Thyroglobulin und auch mit nativem PBOMP-1 auf Immunoblots. Die Western-Blot-Ergebnisse zeigten auch, daß wenig, falls überhaupt, Antikörper zu MBS-spacer erstellt wurden, da die Antipeptid-Sera nicht mit einem Kontrollkonjugat, bestehend aus "nonsense"-Peptid (von äquivalenter Größe) verbunden an BSA über den MBS-Spacer, reagierten.
Das freie Peptid (10 ug-Dosis) war nicht immunogen, auch wenn es mit FCA verabreicht wurde. Im Gegensatz zu anderen Ergebnissen (Hopp, 1984, Mol. Immuno. 21:13 bis 16) war das Palmityl-Peptidkonjugat auch nicht bei Mäusen immunogen. Um eine geeignete Antikörperantwort hervorzurufen, wurde das N-terminale Peptid an einen Proteinträger bzw. Thyroglobulin gekuppelt.

10.5 Funktionelles Assay: bakterizide Aktivität von anti-(N- 1-20) Peptid-Antikörper

Die bakterizide Aktivität (BC) von Maus-anti-(N-1-20) Peptid-Antisera gegen H. influenzae 52-Stamm wurde unter Verwendung von Verfahren, beschrieben in Abschnitt 9.4, s.o. gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 dargestellt. Tabelle 14 Bakterizide Aktivität von Antipeptid-Antikörper zu N-terminalem Peptid von PBOMP-1 BC Titer a Mäuse immunisiert mit Vorblut Woche freiem (N-1-20) Peptid Peptid-Trägerkonjugat nativem PBOMP-1 Kaninchen immunisiert mit Peptid-Trägerkonjugat Kaninchen a Bakterizide Aktivität wurde gegen einen nichttypisierbaren H. influenzae-Stamm 52 gemessen.
Die Maus-anti-(N-1-20)-Peptid-Konjugat-Antikörper waren in der Lage, 52-Organismen bei einer Verdünnung von 1/40 abzutöten, verglichen mit Maus-anti-PBOMP-1 polyklonalen Seren bei 1/80. Als Kontrollgruppe erhielten Mäuse, immunisiert mit freiem Peptid (unkonjugiert, verabreicht in CFA) keine wirksamen bakteriziden Antisera (Tabelle 14). Tatsächlich wurde keine signifikante (mehr als zweifache) Immunantwort auf das N-terminale (N-1-20) Peptid bei der Kontrollgruppe beobachtet.
Die bakterizide Aktivität der zwei einzelnen Kaninchen anti-(N-1-20) Peptid-Antisera ist ebenfalls in der Tabelle dargestellt. Obwohl die zwei Vorimmunizitäts-Sera bakterizide Aktivität besaßen, waren die Sera nach der Immunisierung wirksamer bei der Vermittlung von der Komplement-abhängigen Abtötung von H. influenzae. Kaninchen Nr.1 gab einen bakteriziden (BC) Titer von 1/2560 und zeigte einen achtfachen Anstieg gegenüber seinem Vorimmunitätsspiegel, während Kaninchen Nr.2 einen Titer von 1/1280, der das Vierfache wiedergibt, autwies. Wir erwarteten, daß Antisera von Kaninchen Nr.2, das den höheren anti-(N-1-20)-Titer aufwies, höhere BC- Aktivität aufwies, jedoch zeigte Kaninchen Nr.1 Antiserum eine bessere Abtötungswirkung.

11. Isolierung und Charakterisierung des von rekombinanter DNA abgeleiteten PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsproteins

11.1 Konstruktion von Plasmid pPX183 für die Expression von PBOMP-2:PBOMP-1 in E. coli

Die Konstruktion von Plasmid pPX183 für die Expression des PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsproteins unter der Steuerung des lac Promotors wird nachstehend beschrieben und in Figur 30 schematisch dargestellt.
DNA-Fragmente, einschließlich der PBOMP-1- und PBOMP- 2-Gene, wurden von Plasmiden pPX167 bzw. pPX163 abgeleitet. Die Isolierung jedes dieser Plasmide ist in den Abschnitten 8.1 und 8.2 s.o. beschrieben. Gereinigte DNA-Fragmente von Plasmiden pPX163 und pPX167 wurden separat mit Scal zur Vollständigkeit aufgeschlossen. Der pPX163-Aufschluß wurde zusätzlich mit HindIII zu einem Teilaufschluß behandelt. Ein erhaltenes Scal-HindIII-Fragment von 2,7 kB, einschließlich des Ursprungs der Replikation, des lac Promotors und des PBOMP-2-Gens wurde aus einem Agarosegel, wie beschrieben in Abschnitt 6.4.2., isoliert, s.o.. Ein 1,4 kB ScaI-HindIII- Fragment, einschließlich des PBOMP-1-Gens und Steuersequenzen wurde in ähnlicher Weise isoliert für einen vollständigen Scai-HindIII-Aufschluß von pPX167. Die 2 isolierten Scal-HindIII-Fragmente wurden dann zusammen unter Verwendung der in Abschnitt 6.4.3 beschriebenen Vertahren ligiert. Selektion von Ampicillin-resistenten Transformanten gewährleisten die Zurückbildung eines aktiven β-Lactamase-Gens (unterbrochen durch die ScaI-Stelle). Dieses Verfahren ergab ein 4,1 kB- Plasmid, das als pPX183 bezeichnet wurde. Dieses Plasmid codiert ein PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsprotein mit den 2 PBOMP-Genen, ligiert im Raster wie in Figur 30 gezeigt.

11.2 Expression des PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsproteins

Plasmid pPX183 wurde in E. coli JM103 transformiert und der erhaltene Stamm wurde hinsichtlich Erzeugung eines rekombinanten Fusionsproteins unter lac-Steuerung geprüft.
Coomassie Blue-gefärbte SDS-Polyacrylamid-Gele von Gesamtzellenextrakten von IPTG-induzierten JM103-Zellen, enthaltend Plasmid pPX183, zeigte ein neues Protein von etwa 30 000 Dalton Molekulargewicht, das 1-bis 2 % Gesamtzellprotein umfaßt. Western-Blot-Analyse zeigte, daß dieses rekombinante Fusionsprotein mit monoklonalen Antikörpern spezifisch für PBOMP-1 reagierte und auch mit jenen, die für PBOMP-2 spezifisch sind. Somit trägt das durch Plasmid pPX183 codierte Proteinprodukt Epitope sowohl von PBOMP-1 als auch PBOMP-2.

11.3 Konstruktion von Plasmid pPX199, das PBOMP-2: PBOMP-1-Fusionsprotein exprimiert.

Obwohl Plasmid pPX183 ein Hybrid PBOMP-1/PBOMP-2-Protein codiert, das heißt ein Fusionsprotein, enthält das durch dieses Plasmid exprimierte Protein zusätzliche Aminosäuren, die von dem pUC19-Vektor codiert wurden. Insbesondere enthält die Nucleotidsequenz von pPX183 18 zusätzliche Codone am 5'- Ende von pPX163 und 13 zusätzliche Codone an der Fusionsverbindung, d.h. 31 Codone, abgeleitet vom pUC19-Vektor. Ein neues Fusionsgen ohne das meiste dieser überschüssigen Information wird wie nachstehend konstruiert.
Zuerst wurde ein Derivat von pAA130, das PBOMP-2-Gen enthielt, mit SsPI, das 5 Nucleotide 5' zu dem Startcodon von PBOMP-2 schneidet, und dann mit HindIII, das das PBOMP-2-Gen am Codon 148 schneidet, das heißt 6 Codone von dem 3'-Ende des Gens, aufgeschlossen. Sequenzanalyse zeigte, daß dieses Fragment in Plasmid pUC8 ligiert und mit SmaI und HindIII aufgeschlossen werden könnte unter Erzeugung eines rekombinanten PBOMP-2-Gens, mit 7 Codonen fusioniert zu dem 5'- Ende des "nativen" Gens und 6 Aminosäuren, die am 3'-Ende fehlen. Ein Plasmid wurde in dieser Weise erzeugt und pPX195 genannt (siehe Figur 31).
Anschließend wurde Plasmid pPX167, enthaltend das PBOMP-1-Gen (siehe Abschnitt 8.1, s.o.) in folgender Weise modifiziert: die BamHI-Stelle an dem 3'-Ende des Gens wurde durch Teilaufschluß mit BamHI entfernt und durch Behandlung mit E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) religiert. Das erhaltene Plasmid, bezeichnet pX188, wurde durch Restriktionsanalyse verifiziert und durch Erzeugung von rPBOMP-1 (Figur 31) hergestellt. Das 5'-Ende des rPBOMP-1-Gens von pPX188 wurde durch Entfernen des HindIII-BAMHI-Fragments aus dem pUC19-Polylinkerbereich und Insertion eines synthetischen Oligonucleotids mit HindIII- und BamHI-klebrigen Enden und den 6 3'-Codonen von PBOMP-2, modifiziert. Diese Konstruktion wurde durch DNA-Sequenzanalyse verifiziert und Plasmid pPX198 genannt.
Plasmide pPX195 und pPX198 wurden mit HindIII und ScaI aufgeschlossen und die Fragmente, die PBOMP-2 und PBOMP- 1 trugen, wurden isoliert und miteinander ligiert. Das erhaltene Plasmid wurde pX199 (Figur 31) genannt. Plasmid pX199 exprimiert ein PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsgen mit 7 zusätzlichen Codonen (von pUC8) am 5'-Ende und 2 an der Fusionsverbindung. Das Fusionsprotein hatte ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 32 000 Dalton durch SDS-PAGE (siehe Figur 32) und wird auf Western-Blots durch polyklonale Antisera gegen PBOMP-1, PBOMP-2, PBOMP-2 Mab 61-1 (siehe Abschnitt 6.2.2) und einer Vielzahl von PBOMP-1 Mabs erkannt.

11.4 Expression von signalfreien PBOMP-2: PBOMP-1-Fusionsprotein

PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsprotein-Gen von pPX199 codiert das PBOMP-2-Signalpeptid und das erhaltene Fusionsprotein wird als Lipoprotein modifiziert und fest mit der Außenmembran von E. coli-Zellen, die es exprimieren, verbunden. Dieses Fusionsprotein ist schwierig von der Membran abzutrennen und in wässerigen Lösungsmitteln schlecht löslich. Die Konstruktion des Plasmids, das signalfrei PBOMP-2: PBOMP-1-Fusionsprotein exprimiert, ist in Figur 33 erläutert.
Zunächst wird eine signalfreie Form von PBOMP-2-Gen in folgender Weise konstruiert: Das 660 Bp EcoRI/SalI-Restriktionsfragment von Plasmid pPX163, das das PBOMP-2-Protein codiert, wurde isoliert und an der einzigen HphI-Stelle bei Nucleotid 91 des Gens geschnitten und das 545 Bp HphI/EcoRI-Fragment, das die carboxyterminalen 125 Aminosäuren von PBOMP-2 codiert, wurde isoliert.
Der nachstehende synthetische Oligonucleotid-Linker wurde dann konstruiert, um ein modifiziertes 5'-Ende des PBOMP-2-Gens wiederherzustellen:
Der Linker wurde derart ausgelegt, daß er ein modifiziertes PBOMP-2-Gen mit nachstehenden Merkmalen bedeutet:
(1) Abwesenheit von Sequenzen, die das Signalpeptid codieren,
(2) Wiederherstellung der vollständigen reifen PBOMP- 2-Sequenz, mit Ausnahme des N-terminalen Cysteinrestes (ersetzt durch Methionin)
(3) eine neue und einmalige NcoI-Restriktionsstelle beim Startcodon,
(4) eine Wobbelbasenänderung zur Erzeugung einer neuen und einmaligen EcoRV-Restriktionsstelle am Nucleotid 12 des Codierungsbereiches,
(5) eine neue Translationsstartstelle (SD Box) und
(6) ein Stopcodon, stromaufwärts im Raster (TAA) zur Verhinderung von lac-translationalem Durchlesen.
Der Linker wurde in einem 1:1:1 Mol-Verhältnis mit dem HphI/EcoRI-Fragment von pPX163 und pUC19 DNA gespalten mit xbai und EcoRI und ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in E. coli DHS lacIq transformiert und AmpR-Kolonien wurden hinsichtlich PBOMP-2-Produktion mit Mab 61-1 abgesucht. Verschiedene positive Kolonien wurden gefunden und die Konstruktion wurde durch Restriktion und DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Eines der Isolate wurde ppxsio genannt.
Plasmid pPX510 codiert ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 14 000 durch SDS-PAGE, das sowohl durch polyklonale anti-PBOMP-2-Sera als auch anti-PBOMP-2 Mab 61-1 erkannt wurde. Expression des signalfreien rekomoinanten PBOMP-2 war unter lac-Regelung und vollständig induzierte Zellen exprimierten die Konstruktion als etwa 5 % vom gesamten Zellprotein.
Ein signalfreies Fusionsgen wurde dann aus pPX510 und pPX198 in einer Weise analög zu der Konstruktion von pPX199 (siehe Abschnitt 11.3, s.o.) konstruiert. Kurz gesagt wurden die 2 Plasmide mit HindIII und ScaI aufgeschlossen und die PBOMP-1- und PBOMP-2-Fragmente wurden miteinander ligiert. Das erhaltene Plasmid wurde in E. coli DH 5α transformiert (BRL, Gaithersburg, MD) und wurde pPX512 genannt. Das signalfreie Fusionsprotein, exprimiert durch pPX512, hatte ein scheinbares Molekulargewicht von 30 000 Dalton durch SDS-PAGE und wurde durch polyklonale Antisera gegen sowohl PBOMP-1 als auch PBOMP-2 erkannt. Das Fusionsprotein wurde auch durch PBOMP-2 Mab 61-1 erkannt und alle PBOMP-1 monoklonalen Antikörper wurden durch Western-Blot-Analyse geprüft.

12. Wirkungsgrad von Fusionsproteinuntereinheitsimpfstoffen

12.1. Herstellung von anti-PBOMP-2:PBOMP-1-Antikörpern

Im wesentlichen reines PBOMP-2: PBOMP-1 wurde aus einem SDS-PAGE-Gel von Zellextrakten von E. coli JM103, enthaltend pPX183 (siehe Abschnitt 11.1, s.o.), isoliert. Die Position der Fusionsproteinbande auf dem präparativen SDS-PAGE- Gel wurde durch Coomassie Blue-Färbung von Streifen, geschnitten aus den Kanten des Gels, gefolgert. Scheiben, enthaltend das Fusionsprotein, wurden in Gel-Elutions-Puffer eingeweicht (0,2 M NaCl, 0,05 M Tris, pH 8,0, 0,1 % SDS und 0,1 uM EDTA) über Nacht bei Raumtemperatur durch leichtes Bewegen. Extrahiertes Protein wurde durch Lowry-Proteinbestimmung mit BSA als Standard abgeschätzt.
Zwei weibliche Kaninchen der Rasse Weiße Neuseeländer wurden in einer Untersuchung zur anfänglichen Immunogenizität verwendet. Vorblut (bei Woche 0) wurde vor der Beimpfung als Quelle für Vorimmunserum erhalten. 50 ug im wesentlichen reines PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsprotein (eingestellt auf ein Volumen von 100 ul) wurden mit dem gleichen Volumen von CFA vermischt und intramuskulär in die Kaninchen an mehreren Orten injiziert. Blutproben wurden 3 Wochen später entnommen und die Kaninchen wurden bei Woche 4 mit 50 ug Fusionsprotein, emulgiert in IFA, aufgefrischt. Blutproben wurden dann bei Woche 7 entnommen und für ELISA und bakterizide Assays zubereitet. Die Ergebnisse von ELISA und bakteriziden Aktivitäts- Assays sind in Tabelle 15 därgestellt. Tabelle 15 Antwort von polyklonalen Kaninchen anti-PBOMP-2: PBOMP-1-Antisera Anstieg im ELISA-Titer Kaninchen-Serum Blutentnahme Anstieg im BC-Titerb anti-PBOMPa siehe Text für Einzelheiten der Immunisierung. b Anstieg über einen Titer bei Woche 0 in BC gegen H. influenzae S2. d Blutentnahme nach einer Immunisierung. e Blutentnahme nach zwei Immunisierungen. wk = Woche
Immunisierung mit rekomoinantem Fusionsprotein PBOMP- 2: PBOMP-1 rief Antikörperantworten zu sowohl PBOMP-1 als auch PBOMP-2 hervor, wie in ELISA ermittelt und diese Antisera hatten bakterizide Aktivität gegen den nicht eingekapselten H. influenzae-Stamm S2 (Tabelle 15). Diese Ergebnisse zeigen, daß PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsprotein stark wirksam beim Hervorrufen einer Antikörperantwort gegen sowohl PBOMP-1 als auch PBOMP-2 ist und diese immunogene Antwort biologisch funktionell in einem bakteriziden Assay ist.
In einer weiteren Serie von Experimenten wurden erwachsene Chinchillas als Testsystem verwendet zur weiteren Demonstration der Immunogenizität und Wirksamkeit von PBOMP- 1:PBOMP-2-Fusionsprotein als Untereinheitsimpfstofformulierung. Die Chinchilla diente als Tiermodellsystem, da dieses Tier, wenn es mit H. influenzae infiziert wird, eine Otitis media entwickelt, die in ganz ähnlicher Weise beim Menschen beobachtet wird (siehe Barenkamp et al., 1986, Infect. Immun. 52:572-78).
Wie in Abschnitt 11. 3 ausgewiesen, ist das durch E. coli JN103, enthaltend pPX199 exprimierte PBOMP-2: PBOMP-1-Fusionsprotein, als ein Lipoprotein modifiziert und ist stark verbunden mit der Außenmembran von E. coli-Wirtszellen. Im wesentlichen reines PBOMP-2: PBOMP-1 wurde aus E. coli JM103, enthaltend pPX199, durch das nachstehende Verfahren, das verschiedene Detergensextraktion von Innen- und Außenwandproteinen von E. coli-Wirtszellen nach sich zog, isoliert. Kurz gesagt wurden die Innenmemoranproteine von E. coli unter Verwendung von 1 % Sarcosyl in 10 uM Tris-HCl pH 8, 5 uM EDTA unter Hinterlassen des unlöslichen Außenmemoran-Zellwandkomplexes extrahiert.
Eine Unterfraktion, angereichert mit PBOMP-2:PBOMP-1- Fusionsprotein, wurde durch Differentialdetergensextraktion von weiteren Außenmemoran-Zellwandkomponenten erhalten. Die Außenmembranproteine wurden von den Sarcosyl-unlöslichen Außenmembran-Zellwandkomponenten durch nacheinander folgende Extraktion mit 1 % Zwittergent 3-12 , 1 % Zwittergent 3-14 in 10 uM Tris-HCl, pH 8, 5 uM EDTA, 1 % Desoxycholat bei 60ºC, extrahiert. Das PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsprotein, angereichert mit unlöslichem Material, wurde durch nachstehende Zentrifugation erhalten. Das PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsprotein wurde durch Extraktion der PBOMP-2:PBOMP-1-angereicherten Fraktion mit 1 % Zwittergent 3-14, 50 uM Tris-HCl, 5 uM EDTA, ph 8,0, 6 M Harnstoff bei 80ºC für 45 min solubilisiert. Nach der Solubilisierung wurde Harnstoff aus dem extrahierten Fusionsprotein durch Dialyse gegen denselben Puffer ohne Harnstoff bei Raumtemperatur über Nacht entfernt.
Die scheinbare Reinheit des solubilisierten Fusionsproteins lag im Bereich von 75 bis 80 %. Etwa 25 mg Protein wurden aus etwa 10 bis 20 g Feuchtgewicht-Fusionsprotein solubilisiert. Das Hauptprotein wurde als intaktes Fusionsprotein identifiziert. Das hauptsächliche Protein niederen Molekulargewichts war auch von dem Fusionsprotein abgeleitet, da es den N-terminalen Bereich des PBOMP-1-Proteins, fusioniert an das PBOMP-2-Protein, enthielt, wie durch Epitopanalyse ermittelt. Das C-terminale 2/3 von PBOMP-1 lag in diesem Protein nicht mehr vor. Dies mag das Ergebnis von proteolytischem Abbau sein, möglicherweise während der Induktion oder aufgrund verfrühten Translationsabbruchs. Die Reinheit dieses Präparats ist in Figur 32 dargestellt.
Fünf ausgewachsene Chinchillas wurden in einem Tierexperiment verwendet. Vorblut (am Tag 0) wurde über Cardiopunktur vor der Beimpfung erhalten und wurde als Quelle für das Präimmunserum verwendet. 25 ug im wesentlichen reinen PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsproteins, erhalten aus E. coli-Zellen, enthaltend Plasmid pPX199, wie vorstehend beschrieben, absorbiert an Alum, wurde intramuskulär den Chinchillas injiziert. Blutproben wurden 30 Tage später entnommen und die Tiere wurden am 30. Tag mit 25 ug gereinigtem Fusionsprotein an Alum aufgefrischt. Blutproben wurden wiederum über Cardiopunktur am 60. Tag entnommen. Die Sera wurden für ELISA und bakterizide Assays zubereitet. ELISA wurde wie vorstehend beschrieben ausgeführt unter Verwendung entweder im wesentlichen reinen PBOMP-1 (anti-PBOMP-1) oder eine rekomoinante Form von PBOMP-2 (anti-PBOMP-2) als Antigen. Die bakterizide Aktivität der Serumproben wurde, wie vorstehend beschrieben in Abschnitt 7.1, unter Verwendung von H. influenzae P860295, einem klinischen nichttypisierbaren Stamm, erhalten von Dr. Charles Bluestone, Children's Hospital of Pittsburgh, PA, geprüft. Die Ergebnisse von ELISA und bakteriziden Aktivitäts- Assays sind in Tabelle 16 dargelegt. Tabelle 16 Antwort von Chinchilla- anti-PBOMP-2: anti-PBOMP- 1 Antiseraa ELISA-Titer Blutentnahme anti-PBOMP- c BC-Titer Vorblut Post a Für Einzelheiten der Immunisierung siehe Text. b Blutentnahmen wurden am Tag 0 (Vor), am Tag 30 (Post 1º) und am Tag 60 (Post 2º) entnommen. c Bakterizide Aktivität gegen H. influenzae P860295.
Immunisierung mit 25 ug des Fusionsproteins PBOMP-2: PBOMP-1 rief einen der höchsten Titer an BC-Aktivität, der je in unserem Labor gegen Außenmembran von Haemophilus beobachtet wurde, hervor. Zusammen mit dem hohen Maß an Aktivität, beobachtet im ELISA-Assay gegen sowohl PBOMP-1 als auch PBOMP-2, zeigen die Ergebnisse in Tabelle 16, daß PBOMP- 2:PBOMP-1-Fusionsprotein beim Hervorrufen einer Antikörperantwort gegen sowohl PBOMP-1 als auch PBOMP-2 bei Chinchillas überraschend stark wirksam ist. Diese Ergebnisse zeigen außerdem, daß das Fusionsprotein eine Immunantwort hervorruft, die biologisch aktiv ist in einem bakteriziden Assay gegen einen klinischen Stamm von H. influenzae.

12.2. PBOMP-2:PBOMP-1-Fusionsprotein in Kombination mit E- Protein-induzierten Anti-Haemophilus Antikörpern.

Das E-Protein ist ein weiteres Außenmembranprotein von H. influenzae mit einem Molekulargewicht von etwa 28 000 Dalton E-Protein existiert als Lipoprotein im Zusammenhang mit anderen Außenmembranproteinen von H. influenzae.
E Protein von H. influenzae wurde in im wesentlichen reiner Form, wie in der US-Patentanmeldung, Serien-Nr. 07/320971, eingereicht am 9. März 1989, erhalten. Kurz gesagt wurden Hüllen aus Hib Stamm Eagan-Zellen, gezüchtet entweder auf Hirn-Herz-Infusions-Medium, enthaltend 10 ug/ml Hämin und 1 ug/ml NAD (BHI/XV) oder mMIC (Modifikation von Herriott et al., 1970, J. Bacteriol., 101: 513-516 Medium) isoliert. Die Zellen wurden aus Flüssigkulturen durch Zentrifugation bei 10000 g, 4ºC für 10 min geerntet. Das Zellpellet wurde gewogen und in 10 uM HEPES-NaOH (pH 7,4), 1 uM EDTA, mit einem Volumen gleich dem Fünffachen des Naßgewichtes der Zellen, resuspendiert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Gaulin Homogenisators aufgebrochen. Die aufgebrochene Zellsuspension wurde bei 10000 g für 5 min bei 4ºC suspendiert, um ungebrochene Zellen und große Zelltrümmer zu entfernen. Die Überstandsfraktion wurde gewonnen und NaCl zu 0,5 M zugegeben. Zellmembranen wurden durch Zentrifugation bei 100000 x g für etwa 1 h bei 4ºC pelletiert.
Ein Außenmembran-Zellwandkomplex wurde durch Entfernen der Innenmembranen aus der Gesamtmembranfraktion durch wiederholte Extraktion der gesamten Membranfraktion mit 2 % Triton X-100 in 10 mM HEPES-NaOH, 1 mM MgCl&sub2;, pH 7,4, erhalten. Der unlösliche Rest, enthaltend den Außenmembran-Zellwandkomplex, wurde durch Zentrifugation bei 350000 g für 30 min bei 4ºC pelletiert. Dieser Komplex wurde dann in 50 mM Tris-HCl, 5 mM Na&sub2;EDTA, pH 8, resuspendiert und bei 4ºC gelagert.
Kontaminierende Proteine wurden aus H. influenzae- Zellhüllen durch Differentialdetergensextraktion wie nachstehend solubilisiert. Zellhüllen, hergestellt wie vorstehend beschrieben, wurden nacheinander zweimal mit 1 % Sarcosyl in 50 mM Tris-HCl, 5 mM Na&sub2;EDTA, pH 8, extrahiert. Diese Extraktion wurde 3 x wiederholt. Die solubilisierten Protein E-enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und durch eine DEAE- Säule, äquilibriert mit 50 mM Tris-HCl, 5 mM Na&sub2;EDTA, pH B, geleitet. Das E Protein wurde unter diesen Bedingungen nicht zurückgehalten, sondern die hauptsächlichen Proteinverunreinigungen wurden zurückgehalten. Die durchlaufenden Fraktionen, die E Protein enthielten, wurden dann über eine Hydroxylapatit-Säule geleitet, die mit 50 mM Tris-HCl, pH 8, äquilibriert wurde. Das Protein E wurde unter diesen Bedingungen zurückgehalten. Die Hydroxylapatit-Säule mit dem adsorbierten E Protein wurde dann mit einem Säulenvolumen von 50 mM Tris- HCl, ph 8, gewaschen. Das E-Protein wurde von dem Hydroxylapatit mit 1 % Zwittergent 3-14 in 0,3 M zweibasigem Phosphat, pH 8, eluiert. Fraktionen, enthaltend Protein E, wurden gesammelt, durch Diafiltration eingeengt und mit Ethanol gefällt. Das gefällte E-Protein wurde dann wiederum durch Differentialdetergensextraktion solubilisiert. Das Präzipitat wurde zunächst mit 1 % Octylglucosid extrahiert, in 50 mM Tris-HCl, pH 8 und das unlösliche E-Protein in dem Präzipitat zurückbehalten. Das Protein E wurde dann solubilisiert mit 1 % Zwittergent 3-14 in 50 mM Tris-HCl, 5 mM Na&sub2;EDTA, pH 8. E-Protein, hergestellt wie vorstehend beschrieben, ist im wesentlichen rein und im wesentlichen frei von Endotoxin.
25 ug des im wesentlichen reinen E-Proteins wurden mit 25 ug im wesentlichen reinen PBOMP-2: PBOMP-1-Fusionsprotein, erhalten wie in vorstehendem Abschnitt 12.1 beschrieben, vermischt, in 0,85 % Salzlösung verdünnt und mit Alum absorbiert.
Ausgewachsene Chinchillas wurden intramuskulär mit einer aliquoten Menge des Gemisches, enthaltend 25 ug PBOMP- 2:PBOMP-1-Fusionsprotein und 25 ug E-Protein, geimpft. Blutproben wurden am Tag 0 unmittelbar vor der ersten Immunisierung genommen, am Tag 30 vor der zweiten Immunisierung und am Tag 60. ELISA-Assays wurden wie vorstehend beschrieben ausgeführt, unter Verwendung von PBOMP-2: PBOMP-1 oder E-Protein als Antigen. Bakterizide Assays wurden wie vorstehend ausgeführt unter Verwendung von H. influenzae P860295 als Teststamm. Ergebnisse von ELISA und bakteriziden Assays sind in Tabelle 17 aufgelistet. Tabelle 17 Antwort von Chinchilla-anti-PBOMP-2:PBOMP-1-anti-E-Antiseraa ELISA-Titer Blutentnahme anti-PBOMPBC-Titerc Vor Post a Für Einzelheiten der Immunisierung siehe Text. b Vorblut wurde am Tag 0 (Vor), am Tag 30 (Post 10) und am Tag 60 (Post 20) entnommen. c Bakterizide Aktivität gegen H. influenzae P860295.
Ergebnisse der ELISA-Untersuchungen zeigen, daß die Antwort auf E Protein sehr stark war und Ausmaße erreichte, die vergleichbar waren zu jenen von PBOMP-2-Teilen des Fusionsproteins. Keine Blockierungseffekte wurden zwischen E-Protein und Fusionsprotein beobachtet. Die biologische Aktivität der Antisera wurde unter Verwendung des BC-Assays gemessen. 25 ug E riefen einen der höchsten BC-Titer, der in unserem Laboratorium je beobachtet wurde, mit Antikörper gegen OMP von Haemophilus hervor. Der BC-Titer war größer als jener von Chinchillas, die nur Fusionsprotein erhielten. Obwohl es nicht möglich ist, anzuführen, daß die BC-Aktivität der gemischten Impfstoff-Antisera einen synergistischen oder additiven Effekt aufwiesen, ist die Aktivität des Gemisches genauso wirksam oder besser als jene der Fusion allein. Diese Ergebnisse unterstreichen die Verwendung eines Gemisches von Fusionsprotein in Kombination mit gereinigtem E Protein als Impfstoff gegen Haemophilus.

13. Hinterlegung der Mikroorganismen

Die nachstehenden E. coli-Stämme, die die aufgeführten Plasmide tragen, wurden beim Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL, hinterlegt und ihnen wurden die nachstehenden Eingangs-Nummern zugeordnet: E. coli-Stamm Plasmid Eingangs-Nummer
Die ersten 6 E. coli-Stämme, die in der vorstehenden Tabelle angeführt sind, wurden beim NRRL eingereicht, um die vorangehende PCT-Anmeldung WO-88/04932, eingereicht im Namen des Anmelders der vorliegenden Erfindung, zu belegen.
Die vorliegende Erfindung ist in keiner Weise im Bereich durch die im Rahmen der vorliegenden Erfindung hinterlegten Mikroorganismen eingeschränkt da die hinterlegte Ausführungsform als einzelne Erläuterung eines Aspekts der Erfindung vorgesehen ist und viele Mikroorganismen, die funktionell äquivalent sind, innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung liegen. Tatsächlich können verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen, gezeigt und beschrieben, hierin vom Fachmann gemäß vorstehender Beschreibung und den beigefügten Figuren ersichtlich werden. Es ist vorgesehen, daß solche Modifizierungen in den Schutzbereich der beigefügten Ansprüche fallen.
Es ist auch selbstverständlich, daß alle Basenpaar- Größen, die für Nucleotide angegeben sind, angenähert sind und nur zum Zweck der Beschreibung verwendet werden. International Application No: PCT/ MICROORGANISMS Optional Sheet in connectionwith the microorganism referred to on page , line of the description A. IDENTIFICATION OF THE DEPOSIT Further deposits are identified on an additional sheet Name of depository Institution Agricultural Research Culture Collection Address of depository Institution (including postal code and country) 1815 North University Street Peoria, IL 61604 U.S.A. Date of deposit Accession Number B. ADDITIONAL INDICATIONS (leave blank if not applicable). This information is continued on a separate attached sheet C. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (If the indications are not for all designated states) D. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leave blank if not applicable) The indications listed below will be submitted to the International Bureau later (Specify the general nature of the Indications e.g. "Accession Number of Deposit") This sheet was received with the International application when filed (to be checked by the receiving Office) The date of receipt (from the applicant) by the International Bureau Authorised Officer Übersetzung relevanter Teile von Seite 116 Mikroorganismen Blatt im Zusammenhang mit den Mikroorganismen, angeführt auf S. 118, Zeilen 7 bis 34 der Beschreibung Identifizierung der Hinterlegung Weitere Hinterlegungen sind auf einem zusätzlichen Blatt angegeben...X Name der Hinterlegungsstelle Agricultural Research Culture Collection Adresse der Hinterlegungsstelle 1815 North University Street Peoria, IL 61604 USA Tag der Hinterlegung 17. Juni 1988 Eingangsnummer B-18377 Dieses Blatt wurde mit der Internationalen Anmeldung bei der Einreichung in Empfang genommen (geprüft durch den Eingangsbeamten) Unterschrift Bevollmächtigter Adresse der Hinterlegung: Agricultural Research 1815 North University Street Peoria, IL 61604 USA Hinterlegungstag Eingangsnummer Dezember August

Claims

1. Im wesentlichen reines antigenes Peptid oder Protein mit einem Epitop von Haemophilus influenzae, wobei das Peptid oder Protein ein Fusionsprotein PBOMP-1:PBOMP-2 mit einem Molekulargewicht von etwa 30 000 Dalton oder ein beliebiger antigener Teil davon, der einen Teil von sowohl PBOMP-1 als auch PBOMP-2 enthält, ist.

2. Peptid oder Protein nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, umfassend (a) die Aminosäuresequenz, wie sie im wesentlichen in Figur 11 von Aminosäurerest 20 bis 153 ausgewiesen ist oder einen beliebigen antigenen Teil davon und (b) die Aminosäuresequenz, wie sie im wesentlichen in Figur 15 von Aminosäurerest 19 bis 154 ausgewiesen ist oder einen beliebigen antigenen Teil davon.

3. Peptid oder Protein nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, umfassend (a) die Aminosäuresequenz, wie sie im wesentlichen in Figur 11 von Aminosäurerest 20 bis 39 ausgewiesen ist oder einen beliebigen antigenen Teil davon und (b) die Aminosäuresequenz, wie sie im wesentlichen in Figur 15 von Aminosäurerest 19 bis 154 ausgewiesen ist oder einen beliebigen antigenen Teil davon.

4. Im wesentlichen reines antigenes Peptid oder Protein mit einem Epitop von Haemophilus influenzae, wobei das Peptid oder Protein ein Fusionsprotein PBOMP-2:PBOMP-1 mit einem Molekulargewicht von etwa 30 000 Dalton oder ein antigener Teil davon, der einen Teil von sowohl PBOMP-2 als auch PBOMP-1 enthält, ist.

5. Peptid oder Protein nach Anspruch 4 mit einer Aminosäuresequenz, umfassend (a) die Aminosäuresequenz, wie sie im wesentlichen in Figur 15 von Aminosäurerest 20 bis 153 ausgewiesen ist oder einen beliebigen antigenen Teil davon und (b) die Aminosäuresequenz, wie sie im wesentlichen in Figur 11 von Aminosäurerest 19 bis 154 ausgewiesen ist oder einen beliebigen antigenen Teil davon.

6. Peptid oder Protein nach Anspruch 4 mit einer Aminosäuresequenz, umfassend (a) die Aminosäuresequenz, wie sie im wesentlichen in Figur 15 von Aminosäurerest 20 bis 39 ausgewiesen ist oder einen beliebigen antigenen Teil davon und (b) die Aminosäuresequenz, wie sie im wesentlichen in Figur 11 von Aminosäurerest 19 bis 154 ausgewiesen ist oder einen beliebigen antigenen Teil davon.

7. Peptid oder Protein nach Anspruch 1 mit einer oder mehreren antigenen Determinanten eines Außenmembranproteins von Haemophilus influenzae, erzeugt von einem Escherichia coli-Bakterium, hinterlegt beim NRRL und zugeordnet unter der Zugangs-Nr. B-18377 und Mutanten, Rekombinanten und gentechnisch erzeugten Derivaten davon.

8. Peptid oder Protein nach Anspruch 1 mit einer oder mehreren antigenen Determinanten eines Außenmembranproteins von Haemophilus influenzae, erzeugt von einem Escherichia coli-Bakterium, hinterlegt beim NRRL und zugeordnet unter der Zugangs-Nr. B-18530 und Mutanten, Rekombinanten und gentechnisch erzeugten Derivaten davon.

9. Peptid oder Protein nach Anspruch 1 mit einer oder mehreren antigenen Determinanten eines Außenmembranproteins von Haemophilus influenzae, erzeugt von einem Escherichia coli-Bakterium, hinterlegt beim NRRL und zugeordnet unter der Zugangs-Nr. B-18531 und Mutanten, Rekombinanten und gentechnisch erzeugten Derivaten davon.

10. Formulierung für einen Untereinheitsimpfstoff, wobei das Immunogen eine wirksame Menge eines Peptids oder Proteins nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9, vermischt mit einem pharmazeutischen Träger, umfaßt.

11. Rekombinanter Vektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die für eine antigene Determinante eines Fusionsproteins von Haemophilus influenzae codiert, mit (a) einer Aminosäuresequenz, wie im wesentlichen in Figur 11 ausgewiesen oder einem beliebigen Teil davon, umfassend mindestens 7 benachbarte Aminosäuren, wobei die Aminosäuresequenz eine oder mehrere antigene Determinanten eines PBOMP-1-Proteins von Haemophilus influenzae enthält und (b) einer Aminosäuresequenz, wie im wesentlichen in Figur 15 ausgewiesen oder einem beliebigen Teil davon, umfassend mindestens 7 benachbarte Aminosäuren, wobei die Aminosäuresequenz eine oder mehrere antigene Determinanten eines PBOMP-2-Proteins von Haemophilus influenzae enthält.

12. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 11, wobei der Vektor pPX183 oder ein mutantes, rekombinantes oder gentechnisch erzeugtes Derivat davon ist.

13. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 11, wobei der Vektor pPX199 oder ein mutantes, rekombinantes oder gentechnisch erzeugtes Derivat davon ist.

14. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 11, wobei der Vektor pPX512 oder ein mutantes, rekombinantes oder gentechnisch erzeugtes Derivat davon ist.

15. Bakterium, enthaltend den rekombinanten Vektor von Anspruch 11, umfassend ein Escherichia coli-Bakterium, hinterlegt beim NRRL und zugeordnet der Zugangs-Nr. B-18377 und Mutanten, Rekombinanten und gentechnisch erzeugte Derivate davon.

16. Bakterium, enthaltend den rekombinanten Vektor von Anspruch 11, umfassend ein Escherichia coli-Bakterium, hinterlegt beim NRRL und zugeordnet der Zugangs-Nr. B-18530 und Mutanten, Rekombinanten und gentechnisch erzeugte Derivate davon.

17. Bakterium, enthaltend den rekombinanten Vektor von Anspruch 11, umfassend ein Escherichia coli-Bakterium, hinterlegt beim NRRL und zugeordnet der Zugangs-Nr. B-18531 und Mutanten, Rekombinanten und gentechnisch erzeugte Derivate davon.

18. Verfahren zum Nachweis von Haemophilus influenzae in einer Gewebeprobe oder in Körperflüssigkeiten, umfassend: Verwendung des Peptids oder Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9 als Antigen in einem Assaysystem, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem enzymgebundenen Immunsorbentassay (enzyme-linked immunosorbent assay), einem Radioimmunassay, einem Geldiffusionsassay mit Präzipitinreaktion, einem Immundiffusionsassay, einem Agglutinationsassay, einem Fluoreszenzimmunassay, einem Protein-A-Immunassay, einem immunoelektrophoretischen Assay und Nachweis einer Reaktion mit dem Antigen, wobei eine Reaktion die Anwesenheit von Haemophilus influenzae in der Probe anzeigt.

19. Verfahren zum Nachweis von Haemophilus influenzae in einer Gewebeprobe oder in Körperflüssigkeiten, umfassend Verwendung einer Nucleotidsequenz von einem Gen, das für ein Peptid oder Protein codiert, das mit einem Fusionsprotein von Haemophilus influenzae verwandt ist, umfassend (a) eine Aminosäuresequenz, wie in Figur 11 ausgewiesen oder ein Fragment davon und (b) eine Aminosäuresequenz, wie in Figur 15 ausgewiesen oder ein Fragment davon, als Sonde in einem Nucleotidsäure-Hybridisierungsassay und Nachweis einer Reaktion mit der Sonde, wobei eine Reaktion die Anwesenheit von Haemophilus influenzae in der Probe anzeigt.