JP3073212B2 - ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のためのワクチンおよび診断アッセイ - Google Patents

ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のためのワクチンおよび診断アッセイ

Info

Publication number
JP3073212B2
JP3073212B2 JP01510093A JP51009389A JP3073212B2 JP 3073212 B2 JP3073212 B2 JP 3073212B2 JP 01510093 A JP01510093 A JP 01510093A JP 51009389 A JP51009389 A JP 51009389A JP 3073212 B2 JP3073212 B2 JP 3073212B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
pbomp
protein
dna
gene
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP01510093A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH04502147A (ja
Inventor
アニリオニス，アルジス
セイド，ロバート，シー，ジュニア．
デイチ，ロバート，エー．
ズロトニック，ゲーリー，ダヴリュー．
グリーン，ブルース，エー
Original Assignee
アメリカン サイアナミド カンパニー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/239,572 external-priority patent/US5098997A/en
Application filed by アメリカン サイアナミド カンパニー filed Critical アメリカン サイアナミド カンパニー
Publication of JPH04502147A publication Critical patent/JPH04502147A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3073212B2 publication Critical patent/JP3073212B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1242—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 1.発明の分野 本発明はヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophi
lus influenzae）の外層膜に関連するタンパク質および
ペプチドを調製するための組成物および方法に関する。
より詳細には、本発明は、PBOM−１およびPBOMP−２を
包含する、ｂ型および非類型性H.インフルエンザエの分
子量約16000ダルトン外層膜タンパク質の一クラスに関
係するタンパク質およびペプチド調製のための組成物お
よび方法に関する。これらタンパク質およびペプチドは
能動免疫化のためのワクチン製剤における免疫原とし
て、また受動免疫化に使用する抗体を生成させるための
免疫原として、および診断アッセイに於ける試薬として
使用される。
上記タンパク質およびペプチドをH.インフルエンザエ
からの新規改良精製法によって得ることができ、あるい
は組換えDNA法または化学合成法のいずれかを用いてこ
れらを生産することができる。さらに、本発明はPBOMP
−１およびPBMOP−２関連タンパク質およびペプチドの
発現を指示するのに有用な新規DNA配列およびベクター
に関する。このヌクレオチド配列は核酸ハイブリダイゼ
ーションアッセイに於ける試薬として用いられる。
2.発明の背景 2.1 組換えDNA技法および遺伝子発現 組換えDNA技法は特定のDNA配列をDNA運搬媒体（ベク
ター）内に挿入して、宿主細胞内で複製しうる組換えDN
A分子を形成させることを包含する。一般に、挿入され
たDNA配列は受容体であるDNA運搬媒体にとって外来のも
のである、すなわち挿入DNA配列およびDNAベクターは自
然の状態では遺伝情報を交換しない生物に由来するか、
または挿入DNA配列は完全にまたは部分的に合成によっ
て作成できる。組換えDNA分子の機構を可能にするつい
くつかの一般的な方法が開発されている。たとえば、Co
henおよびBoyerの米国特許第4,237,224号は制限酵素で
の切断、および既知連結方法によるDNAリガーゼを用い
る結合法を用いたかかる組換えプラスミドの作製を記載
している。これら組換えプラスミドを次に原核生物およ
び組織培養で増殖させた真核細胞を包含する単細胞性培
養物に形質転換によって導入しそして精製させる。米国
特許第4,237,224号に記載された技法は一般的に適用可
能であるので、同特許はここに参考文献として本明細書
にとり込まれる。
単細胞生物に組換えDNA分子を導入するためのもう一
つの方法がCollinsおよびHohnによって米国特許第4,30
4,863号に記載されており、これも参考文献としてここ
にとり込まれる。この方法はバクテリオファージ（コス
ミド）を用いるパッケージング／形質導入系を利用す
る。
また組換え遺伝子をワクシニアウイルスのようなウイ
ルスに導入することもできる。ウイルスに感染した細胞
にプラスミドをトランスフェクションすることによって
組換えウイルスを生成させることができる。
構築に用いた方法にかかわらず、組換えDNA分子は宿
主細胞に適合しなければならない、すなわち、宿主細胞
内で自律的に複製できるかまたは宿主細胞の一染色体に
安定に組み込まなければならない。また、組換えDNA分
子またはウイルス（例えば、ワクシニアウイルス組換え
体）は所望の組換えDNA分子またはウイルスの選択を可
能にするマーカー機能をも有するべきである。さらに、
もし適当な複製、複写、および翻訳シグナルのすべてが
組換えDNA分子上に正しく配置されているならば、細菌
発現プラスミドを用いた場合にそうであるように形質転
換された細菌細胞において、または真核生物の複製起点
を担持する組換えウイルスまたは組換えプラスミドに感
染した許容細胞系において、外来遺伝子は正しく発現さ
れよう。
種々の遺伝的シグナルおよびプロセシング事象によ
り、多くの遺伝子発現レベルが制御される；例えば、DN
Aの転写およびメッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳。DNA
の転写はプロモーター、すなわちRNAポリメラーゼの結
合を指示しそれによってmRNA合成を促進するDNA配列、
の存在に依存する。真核生物プロモーターのDNA配列は
原核生物プロモーターのものとは異なる。その上、真核
生物プロモーターとそれに付随する遺伝的シグナルは、
原核生物系では認識されないかもしれないしまたは機能
できないかも知れない。そしてさらに原核生物プロモー
ターは真核細胞内で認識されず、また機能しない。
同様に、原核生物に於けるmRNAの翻訳は真核生物のシ
グナルとは異なる適正な原核生物シグナルの存在に依存
する。原核生物に於てmRNAが効率よく翻訳されるために
は、mRNA上にシャイン−ダルガルノ（SD）配列と呼ばれ
るリボソーム結合部位を必要とする。この配列は、タン
パク質のアミノ末端メチオニンをコードする開始コド
ン、通常はAUG、の前に位置するmRNAの短いヌクレオチ
ド配列である。このSD配列は16S rRNA（リボソームRN
A）の３′末端に相補的であり、そしておそらくはrRNA
と対合して二本鎖を形成してリボソームを適正な場所に
配置することを可能にすることによって、mRNAのリボソ
ームへの結合を促進する。遺伝子発現を最大にすること
に関する総説としては、Roberts and Lauer,1979,Metho
ds in enzymology 68:473を参照されたい。
適正なシグナルが挿入されそして適切に配置された後
も、外来遺伝子の原核生物内での発現は多くの他のファ
クターによって複雑に影響される。かかるファクターの
一つは、E.コリ（E.coli）および他の細菌における活性
なタンパク分解系である。このタンパク質−分解系は、
「異常な」または外来タンパク質を選択的に破壊すると
思われる。したがって、細菌内に発現された真核生物タ
ンパク質をタンパク分解的崩壊から保護するための方法
の開発により多大な用途がもたらされよう。一つの戦略
としては、外来配列を原核生物遺伝子に同調して（すな
わち正しい読み枠で）連結したハイブリッド遺伝子の構
築がある。このハイブリッド遺伝子の発現により融合タ
ンパク質産物が生じる（このタンパク質は原核性および
外来アミノ酸配列のハイブリッドである）。
クローニングされた遺伝子の発現を成功させるために
は、効率よいDNAの転写、mRNAの翻訳および場合によっ
てはタンパク質の翻訳後修飾が必要である。適当な宿主
中で遺伝子を発現させそしてタンパク質生産を増加させ
るために発現ベクターが用いられている。必要な場合に
転写を開始できるように、制御可能な強力なプロモータ
ーの次にクローン化された遺伝子を置くべきである。細
胞を高密度となるまで増殖させることができ、次にプロ
モーターを誘導して転写物の数を増加させることができ
る。これらは、もし効率的に翻訳されれば高収率でタン
パク質を生じるであろう。これは、もし外来タンパク質
が宿主細胞に対して有害な場合には特に価値ある系であ
る。
2.1.1 発現用宿主系としてのE.コリ E.コリで普通に用いられるプラスミドクローニングベ
クターのほとんどは、ColEl−型レプリコンの誘導体で
ある（これ以上の情報については、Okaら、1979,Mol.Ge
n.Genet.172:151−159参照）。ColElプラスミドは染色
体当り約15−20コピーのコピー数を有する単量体分子と
してE.コリ株中に安定保持される。これらのプラスミド
に挿入された外来遺伝子のヒトおよび動物タンパク質産
物について種々のレベルの発現が得られている。しかし
ながら、その系が外来タンパク質産物を生産するために
経済的に実行可能となるためには、非常に高い発現レベ
ルが得られなければならない。
ある特定の遺伝子産物を大量に得るための一方法は、
細菌細胞内で非常に大きなコピー数を有するプラスミド
上に遺伝子をクローン化することである。理論上は特定
の遺伝子のコピー数を増加させることにより、mRNAレベ
ルも増加しこのことが組換えタンパク質の生産増加をも
たらす筈である。
2.1.2. 発現ベクターとしてのワクシニアウイルス クローニングおよび発現ベクターとしてワクシニアウ
イルスを使用することができる。このウイルスは感染し
た細胞の細胞質内で複製する約187kb対の線状二本鎖DNA
ゲノムを含有する。これらウイルスは（キャップ形成、
メチル化およびポリアデニル化酵素を包含する）完全な
転写酵素系をウイルス感染力に必要なウイルスコア内に
含有する。ワクシニアウイルス転写調節配列（プロモー
ター）により真核生物RNAポリメラーゼによるのではな
くワクシニアRNAポリメラーゼによる転写開始が可能と
なる。
外来遺伝子が組換えウイルスで発現されるには、ワク
シニアプロモーターをその外来遺伝子のタンパク質コー
ド配列に融合させる必要がある。挿入ベクターとも称さ
れるプラスミドベクターを作製してキメラ遺伝子をワク
シニアウイルスに挿入した。ある種の挿入ベクターは以
下から構成される：すなわち（１）転写開始部位を包含
するワクシニアウイルスプロモーター；（２）転写開始
部位の下流にある、外来DNAフラグメント挿入のための
数個のそれぞれ一つずつの制限エンドヌクレアーゼクロ
ーニング部位；（３）ウイルスゲノムの相同非必須領域
へのキメラ遺伝子の挿入を指示するクローニング部位と
プロモーターとをはさむ非必須ワクシニアウイルスDNA
（例えばTK遺伝子）；および（４）E.コリでの複製およ
び選択のための、細菌の複製起点および抗生物質耐性マ
ーカー。かかるベクターの例はMackettにより記述され
ている（1984,J.Virol.49:857−864）。
組換えウイルスは外来遺伝子を含有する組換え細菌挿
入プラスミドをワクシニアウイルス感染を受けた細胞に
トランスフェクションさせることによって生成される。
感染細胞内で相同的組換えが起こり、その結果外来遺伝
子がウイルスゲノムに挿入される。免疫学的技法、DNA
プラークハイブリダイゼーション、または遺伝的選択に
よって組換えウイルスをスクリーニングしそして次に単
離することができる。これらワクシニア組換え体はその
必須機能および感染力を保持しておりそして約35kbの外
来DNAを中に取り込んで構築することができる。
酵素的または免疫学的アッセイによって外来遺伝子の
発現を検出することができる［例えば、免疫沈降法、エ
ンザイム−リンクトイムソルベントアッセイ（ELIS
A）、ラジオイムノアッセイ、またはイムノブロッティ
ング］。さらに、組換えワクシニア感染細胞から生産さ
れる、天然に存在する膜糖タンパク質をグリコシル化し
そして細胞表面に輸送することができる。強力なプロモ
ーターを使用することによるか、または適当なベクター
および適当な宿主において多コピーの単一遺伝子をクロ
ーニングすることによって高レベルの発現を達成でき
る。
2.1.3. 発現ベクターとしてのバキュロウイルス 例えばオートグラフィカ・カリフォルニカ（Autograp
hica californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）のよ
うなバキュロウイルスもクローニングまたは発現ベクタ
ーとして使用できる。感染性形態のAcNPVは通常ウイル
ス封入体中に見いだされる。この構造はその中にウイル
ス粒子を包埋したポリヘドリンペプチドから主としてな
っている。ポリヘドリン遺伝子の発現は成熟ウイルス粒
子が形成された後、感染サイクルの終わり近くに起こ
る。したがって、ポリヘドリン遺伝子発現は必ずしも必
須の機能ではなく、すなわち、ポリヘドリン遺伝子発現
のない状態で生産された封入されないウイルス粒子は完
全に活性であり、培養細胞に感染する能力を有する。Sm
ithらによる欧州特許出願第84105841.5号によると、組
換えバキュロウイルス発現ベクターは、バキュロウイル
スDNAを切断してポリヘドリン遺伝子またはその一部を
包含するフラグメントを生成させ、このフラグメントを
クローニングベクターに挿入し、その後発現されるべき
遺伝子をポリヘドリン遺伝子プロモーターの制御下とな
る様式で挿入することによって調製される。こうして作
製された組換えトランスファーベクターをバキュロウイ
ルスヘルパーDNAと混合し、これを用いて培養昆虫細胞
をトランスフェクションしてバキュロウイルスゲノムの
ポリヘドリン遺伝子座で、選ばれた遺伝子の組換えおよ
び組み込みをおこさせる。その結果得られた組換えバキ
ュロウイルスを用いて感受性の昆虫または培養昆虫細胞
を感染させる。
2.2. ヘモフィルス・インフルエンザエおよび疾病 H.インフルエンザエは二群に分けられる。既知の莢膜
を有する株は、その莢膜と基準抗血清との血清学的反応
によって分類される。ａ−ｆ型が同定されている。いか
なる基準抗血清とも反応しない株は非類型性として知ら
れる。
ｂ型H.インフルエンザエ（Hib）は、米国で、新生児
髄膜炎およびその他の侵入感染の最も高頻度な原因であ
る（Fraserら、1974,Am.J.Epidemiol.100:29−34）。小
児髄膜炎の主な発生は１才から５才の間にみられる。こ
れらHibによる髄膜炎症例の60パーセントが２才以下の
小児に発生する（Fraserら、上記）。
非類型性H.インフルエンザエ（Hi）も、成人に肺炎、
菌血症、髄膜炎、産褥敗血症、および急性熱性気管・気
管支炎を含めた疾病を引き起こすことが現在十分に立証
されている（Murphyら、1985,J.Infect.Diseases 152:1
300−1307）。非類型性Hiは、しばしば小児および青年
の中耳炎の原因であり、全中耳炎症例の約20から40％を
引き起こす。感染はあまり長く持続する免疫を付与しな
いので、小児は同じ生物による感染を繰り返し経験する
可能性がある。慢性の、または繰り返し起こる中耳炎の
現在一般に行われている治療法には抗生物質の投与およ
び内耳から肺膿するためのチューブの挿入が含まれる。
また、Hi株は副鼻腔炎の第一原因としても関与している
（Cherry,J.D.およびJ.P.Dudley,1981,Textbook of Ped
iatric Infectious Diseases,FeiginおよびCherry編、p
p103−105）。さらに、非類型性Hiは新生児敗血症を惹
起する。
ｂ型H.インフルエンザエ（Hib）のポリリボシルリビ
トールリン酸（PRP）を含んでなる莢膜多糖に対して生
成された抗血清は、Hibに対して殺菌性でかつ防御性で
あることが明らかにされている（Smithら、1973,Pediat
rics 52:637−644;Andersonら、1972,J.Clin.Inv.51:31
−38）。抗−PRP抗体は非類型性H.インフルエンザエの
感染に対しては効果がない。
2.3. H.インフルエンザエに対するワクチン ヘモフィルスに対するワクチンとして理想的な候補は
次の三つの性質を有しよう、すなわち（ａ）そのワクチ
ン候補は２−６カ月の乳児に於て免疫原性であろう、
（ｂ）類型性および非類型性H.インフルエンザエによっ
て引き起こされた感染に対してこれを防御する抗体を惹
起しよう、そして（ｃ）H.インフルエンザエのすべての
菌株の表面にみられる決定基に対する抗体を惹起しよ
う。
現在一般に利用されているHib感染防御ワクチンは基
本的にはPRP、ｂ型莢膜多糖からなる。精製PRP多糖は18
カ月をこえる小児では免疫原性であるが、18カ月以下で
は防御抗体応答を引き出さない。一般に、多糖は約18カ
月以下の小児では弱い免疫原であることが示されてい
る。
この問題を処理するために、PRPをタンパク質キャリ
アー分子に化学的に結合させるか（Andersonら、1985,P
ed.Res.18:252A）またはタンパク質分子と混合し（Monj
iら、1986,Infect.Immun.51:865−871）、そして動物ま
たはヒトに投与するという研究が、様々な研究室で始め
られている。PRPのタンパク質への接合によって６カ月
程度のヒト乳児で抗−PRP抗体応答が引き出されること
が示されている。一方、PRPとある種のタンパク質との
混合物は幼獣において抗−PRP抗体を生成させている（M
onjiら、上記）。
接合および混合ワクチン製剤はPRPワクチンの問題点
の一つ、すなわち18カ月以下の乳幼児を防御することが
できない点を解決するが、PRPワクチンのもう一つの主
要な問題を解決することができない。抗−PRP抗体は非
類型的H.インフルエンザエには無効であり、このH.イン
フルエンザエは定義によれば、PRP莢膜を有しない。し
たがって、ｂ型を含めた類型的および非類型的H.インフ
ルエンザエの両方に対する防御免疫応答を約18カ月およ
びそれ以下の乳幼児に惹起しようワクチンの必要性が長
い間認識されてきた。
本発明の目的の一つは、６カ月以下の乳児のみならず
それより大きい幼児および成人に於いてもｂ型を含む類
型的H.インフルエンザエおよび非類型的H.インフルエン
ザエに対する防御免疫応答を引き出すワクチン製剤を提
供することである。本発明の方法はヘモフィルス表面に
露出しているタンパク質またはそのフラグメントを用い
て予防接種することである。その最適な候補はH.インフ
ルエンザエの外層膜タンパク質（OMP）である。外層膜
タンパク質は通常表面に露出した分子である。これらは
乳幼児に於いては通常免疫原性であるタンパク質から構
成され、そして他の細菌系で防御抗体を惹起させる能力
を有することが示されている（Sugasawaraら、1983,Inf
ect.Immun.42:980−985）。
さらに、HiおよびHib株が類似したOMPプロフィールを
有することが示されている（LoebおよびSmith,1980,Inf
ect.Immun.30:709−717）。ヘモフィルスのあるOMPに対
する抗体は抗−PRPがHibにとって殺菌性かつオプソニン
作用性であることが示されたのと同程度に殺菌性であり
かつオプソニン作用を有していた（Andersonら、1972,
J.Clin.Invest.51:31−38;Catesら、1985,Infect.Immu
n.48:183−189）。外層膜タンパク質はHiおよびHibに共
通であるという付加的な利点を有しており、そして両タ
イプの細菌に対して防御できる。
3.発明の要約 本発明は、出願人によって同定され、「プラクシスバ
イオロジクス 外層膜タンパク質−１」（PBOMP−１）
と命名されたヘモフィルス・インフルエンザエの分子量
約16000ダルトンの外層膜タンパク質、およびやはり出
願人によって同定され、「プラクシス バイオロジクス
外層膜タンパク質−２」（PBOMP−２）と命名され
た、ヘモフィルス・インフルエンザエの分子量約16000
ダルトンの抗原性の関係のある外層膜タンパク質に関連
したペプチドおよびタンパク質に関し、ならびにまたこ
れらのペプチドまたはタンパク質をコードする分子クロ
ーニングされた遺伝子または遺伝子フラグメントにも関
する。本発明はまたPBOMP−1:PBOMP−２またはPBOMP−
2:PBOMP−１融合タンパク質に関連したペプチドおよび
タンパク質、ならびにこれらペプチドまたはタンパク質
をコードする分子クローニングされた遺伝子または遺伝
子フラグメントに関する。本発明の詳細な態様に於いて
は、化学合成されたPBOMP−１またはPBOMP−２関連ペプ
チドはそれぞれPBOMP−１またはPBOMP−２の抗原性領域
を包含する。このペプチドをタンパク質キャリアーに結
合させると免疫原性ペプチド接合体が生成される。本発
明はまた、新規方法および改良性を用いてH.インフルエ
ンザエから得られた実質的に純粋なPBOMP−１に関す
る。本発明のペプチドまたはタンパク質は、H.インフル
エンザエに対するワクチン製剤における免疫原として、
またはH.インフルエンザエに関する診断イムノアッセイ
に於ける試薬として用いることができる。
本発明はまた、PBOMP−１およびPBOMP−２関連ペプチ
ドをコードする遺伝子または遺伝子フラグメントの分子
クローニングのための方法にも関する。これら分子クロ
ーニングされた配列をさらに、組換えDNA技法によっ
て、コードされたペプチド産物のための発現ベクターを
含む他のベクターの構築に使用できるしまたは核酸ハイ
ブリダイゼーションに基づくH.インフルエンザエに関す
る診断アッセイに使用でき、あるいはPBOMP−1:PBOMP−
２またはPBOMP−2:PBOMP−１融合タンパク質をコードす
る配列の作製に用いることができる。
本発明のペプチドまたはタンパク質はH.インフルエン
ザエから精製できるしまたは任意のベクター−宿主系に
於いて組換えDNA技法を用いて生産でき、または化学的
方法により合成することができる。したがって、本発明
はまた、新規DNA配列およびベクターの構築にも関す
る。ここでこのベクターにはプラスミドDNAおよびウイ
ルスDNA例えば、ヒトウイルス、動物ウイルス、昆虫ウ
イルス、またはバクテリオファージこれらは適当な宿主
細胞中でPBOMP−１およびPBOMP−２関連ペプチドまたは
タンパク質ならびにPBOMP−1:PBOMP−２またはPBOMP−
2:PBOMP−１関連ペプチドまたはタンパク質の発現を指
示するのに使用できるが包含され、、その宿主細胞から
ペプチドおよびタンパク質を精製することができる。PB
OMP−１およびPBOMP−２関連ペプチドおよびタンパク質
の化学合成法を述べる。
PBOMP−１、PBOMP−２、PBOMP−1:PBOMP−２、および
PBOMP−2:PBOMP−１関連ペプチドおよびタンパク質は、
ｂ型および非類型的H.インフルエンザエの両者を含むす
べての病原性H.インフルエンザエに対して使用するため
のサブユニットワクチン製剤における免疫原として使用
できる。サブユニットワクチン調製のためのPBOMP−１
およびPBOMP−２関連タンパク質またはペプチドは化学
合成、H.インフルエンザエからの精製または組換え発現
ベクター系からの精製によって取得できる。サブユニッ
トワクチン調製のためのPBOMP−1:PBOMP−２、およびPB
OMP2:PBOMP−１関連タンパク質またはペプチドは組換え
発現ベクター系からの精製または化学合成によって取得
できる。あるいはまた、PBOMP−１、PBOMP−２、PBOMP
−1:PBOMP−２、またはPBOMP−2:PBOMP−１関連ぺプチ
ドまたはタンパク質を生産する組換えウイルス自体を、
またはかかる組換えウリウスに感染した細胞の抽出物
を、ウイルスワクチン製剤における免疫原として使用で
きる。PBOMP−１またはPBOMP−２タンパク質、またはPB
OMP−1:PBOMP−２またはPBOMP−2:PBOMP−１融合タンパ
ク質は宿主動物で「異物」として認識されようから、そ
れぞれPBOMP−１、PBOMP−２、PBOMP−1:PBOMP−２、ま
たはPBOMP−2:PBOMP−１に対する体液性免疫、そしてお
そらく細胞性免疫応答が誘導されよう。適正に調製され
たワクチン製剤においては、このことがその後のH.イン
フルエンザエ感染に対して宿主に防御するはずである。
さらに、本発明のサブユニットワクチン製剤は現在一般
に入手しうるPRPワクチンと適合しよう。
本発明のPBOMP−１関連および／またはPBOMP−２関連
配列はヒト医療用アッセイに使用できる。これらには、
本発明のペプチドおよびタンパク質のイムノアッセイに
於ける試薬として使用が包含される。このイムノアッセ
イの例としてはELISAテストおよびラジオイノムアッセ
イがあり、これらは血液試料、体液、組織などに於ける
H.インフルエンザエ感染を検出するための診断手段とし
て有用である。PBOMP−１をコードするかおよび／また
はPBOMP−２をコードする遺伝子配列はH.インフルエン
ザエを同様に診断検出するためのDNA−DNAまたはDNA−R
NAハイブリダイゼーションアッセイに使用できる。さら
に、これらの試薬はH.インフルエンザエの疾病発生のメ
カニズムを解明するための価値ある手段を提供しよう。
本発明はさらに、抗−PBOMP−１、抗−PBOMP−２、抗
−PBOMP−1:PBOMP−２、および／または抗−PBOMP−2:P
BOMP−１モノクローナル抗体にも関し、これらのモノク
ローナル抗体は受動免疫化療法および診断用イムノアッ
セイに使用できる。本発明の一実施態様に於いては、PB
OMP−１、PBOMP−２、PBOMP−1:PBOMP−２、および／ま
たはPBOMP−2:PBOMP−１関連ペプチドに対してモノクロ
ーナル抗体を生成させることができる。
4.図面の簡単な説明 以下の詳細な説明および特定の態様の実施例、ならび
に添付の図面を参照することによって、本発明をより完
全に理解することができよう。これらの図面に於いて： 図１は、PBOMP−１のドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）分析を表す。
試料およびゲルは6.1節記載のようにして調製した。レ
ーンＡは約５μｇのPBOMP−１を含有する。レーンＢは
染色済み低分子量（MW）標準物すなわちオバルブミン、
アルファーキモトリプシノーゲン、ベータ−ラクトグロ
ブリン、リゾチーム、ウシトリプシンインヒビターおよ
びインスリン（ＡおよびＢ鎖）を含有する。相対分子量
［キロダロトン（kb）］を横にする。
図２（ＡおよびＢ）はE.コリおよびH.インフルエンザ
エの全細胞溶解物とポリクローナル抗−PBOMP−１抗体
およびモノクローナル抗−PBOMP−１抗体（Gl−１）と
の反応性を示す。図2Aに於ては、溶解物をポリクローナ
ル抗−PBOMP−１抗体と反応させた。レーンは以下の通
りである：すなわち（１）E.コリHP101;（２）E.コリJM
83;（３）分子量標準物；（４）H.インフルエンザエ培
養細胞から得られた精製PBOMP−１。図2Bに於ては溶解
物をモノクローナル抗−PBOMP−１抗体と反応させた。
レーンは図2Aに記載の通りである。
図３はpLG339の誘導体であるpGD103の制限地図を表す
（Stokerら、1982,Gene 18:335−41参照）。
図４（ＡおよびＢ）はpGD103にクローン化されたH.イ
ンフルエンザエDNAの4.2Kbフラグメントを含有するpAA1
52の地図を示す。PBOMP−１をコードする遺伝子は、737
bpのBgl II−BamH Iフラグメントに局在する。図4AはpA
A152の環状制限地図である。図4BはpAA152の挿入フラグ
メントの欠失分析を示す。欠失誘導体中に残存するH.イ
ンフルエンザエDNAを黒線で示す。PBOMP表現型を右側に
示す。
図５はpAA152を含有するE.コリJM83の全細胞溶解物
と、PBOMP−１の異なる種々のエピトープと反応する個
々のモノクローナル抗体との反応性を示す。レーンは以
下の通りである：すなわち（Ａ）モノクローナル抗体Gl
−1:（Ｂ）モノクローナル抗体G94−3;（Ｃ）モノクロ
ーナル抗体G18−3;（Ｄ）モノクローナル抗体25−2;お
よび（Ｅ）モノクローナル抗体G2−３。
図６は組換えプラスミドpAA130およびpAA152を含有す
るDS410ミニ細胞のオートラジオグラフィー分析を表
す。分子量標準を図の左側に示す。レーンは（Ａ）DS41
0（pAA130）；（Ｂ）DS410（pGD103）；および（Ｃ）DS
410（pAA152）を表す。カナマイシンアミノグリコシタ
ーゼの位置を図の右側に示す。
図７（ＡおよびＢ）はpGD103にクローン化されたH.イ
ンフルエンザエDNAの5.7Kbフラグメントを含有するpAA1
30の地図を表す。図7Aは、pAA130の環状制限地図を表
す。図7BはpAA130のH.インフルエンザエ挿入フラグメン
トの欠失分析を示す。黒実践は欠失誘導体に於ける残存
H.インフルエンザエDNAを示す。PBOMP表現型を右側に示
す。PBOMP−２をコードする遺伝子は、781bp BstE II−
Xmn Iフラグメントに局在する。
図８はE.コリJM83、およびpAA130含有E.コリJM83の全
細胞溶解物とポリクローナル抗−PBOMP−１抗血清との
反応性を表す。レーンは（Ａ）pAA130含有JM83;（Ｂ）p
AA130含有JM83;（Ｃ）JM83;（Ｄ）JM83;（Ｅ）図の右側
にキロダルトンで表示した分子量標準物；および（Ｆ）
Hi S−２を表す。
図９は種々のクローンから決定された配列の起点、方
向および範囲を示すpAA152の737bp挿入フラグメントのD
NA配列決定方法を示す。いちばん下の矢印は主要な読み
とり枠（ORF）の位置を示す。
図10はPBOMP−１遺伝子を含有する737bpフラグメント
のヌクレオチド配列を表す。予測される読みとり枠（OR
F）を下線を付した配列によって示しそして転写方向を
矢印の向きで示す。
図11はPBOMP−１の推定アミノ酸配列を表す。ヌクレ
オチド配列を上の例に示し、対応するアミノ酸配列を下
に示す。四角で囲んだアミノ酸は当該タンパク質の成熟
型の予想されるＮ−末端アミノ酸を表す。
図12はPBOMP−１由来ペプチドの部分アミノ酸配列
（下）とPBOMP−１遺伝子から引き出されたアミノ酸配
列の一部（上）とを平行に並べたものである。四角で囲
んだ残基はミスマッチを表す。
図13は、pAA130の789bp BstE II−Xmn Iフラグメント
の配列決定方法を表し、各々のクローンから決定された
配列の起点、方向および範囲を示す。いちばん下の矢印
は主要な読みとり枠（ORP）の位置を示す。
図14はPBOMP−２遺伝子を含有するpAA130の789bpBstE
II−Xmn Iフラグメントのヌクレオチド配列を表す。予
測されるORFを下線を付した配列によって示す。転写方
向の矢印の向きで示す。“N"で示される二つの塩基は未
知ヌクレオチドを表す。
図15はPBOMP−２の推定アミノ酸配列を表す。ヌクレ
オチド配列を上の列に示し、対応するアミノ酸配列を下
に示す。四角で囲んだ残基は、当該タンパク質の成熟型
の予想されるＮ−末端アミノ酸を示す。
図16はガス液体クロマトグラフィーを用いて得られ
た、PBOMP−１の脂肪酸のクロマトグラムを表す。内部
標準としてノナデカン酸（C19）が含まれる。
図17は組換えプラスミドpAA130およびpAA152を含有す
るE.コリJM83細胞、ならびにpGD103を含有する対照E.コ
リJM83細胞のオートラジオグラフィーによるSDS−PAGE
分析を表す。レーンは（１）pAA130;（２）pAA152およ
び（３）pGD103を表す。約15,000ダルトンの分子量のバ
ンドの位置を図の左側に示す。
図18（ＡおよびＢ）はグロボマイシン存在下または非
存在下におけるpAA130またはpAA152を含有するE.コリJM
83の全細胞溶解物のウエスタンブロットゲル分析を表
す。分子量標準を図18（ＡおよびＢ）の左側に示す。図
18AはPBOMP−１遺伝子を含有するpAA152含有細胞の溶解
物を表す。レーンは（１）はグロボマイシンなし；およ
び（２）グロボマイシンあり、を表す。
図18BはPBOMP−２遺伝子を含有するpAA130含有細胞の
溶解物を表す。レーンは（１）はグロボマイシンなし；
および（２）グロボマイシンあり、を表す。
図19はPBOMP−１（5.2μｇ）を含有するワクチン製剤
をヒト成人に投与した場合に得られる抗体応答をグラフ
に示したものである。
図20はE.コリJM101またはJM103の全細胞溶解物とモノ
クローナル抗体Ｇ−204との反応性を表す。レーンは
（Ａ）pPX166を含有するJM103;（Ｂ）pPX160を含有する
JM103;（Ｃ）pUC19を含有するJM101;（Ｄ）図の左側に
キロダルトンで表示された分子量標準物；および（Ｅ）
H.インフルエンザエ由来の天然型PBOMP−１、を表す。
図21はPBOMP−１シグナル配列を有しないPBOMP−１タ
ンパク質コード配列を含有するプラスミドの作製を模式
的に示す。プラスミドpPX167にシグナル配列を欠失した
PBOMP−１遺伝子をlacプロモーターの下流に挿入する。
pPX167内のPBOMP−１コード配列をポリリンカー内のBam
H I部位で切断し、生成するフラグメントをプラスミドp
IN III−ompA3のBamH I部位にクローニングすることに
よってプラスミドpPX168を構築した。プラスミドpPX168
はE.コリompAタンパク質のシグナル配列にアミノ末端で
結合した成熟PBOMP−１をコードするキメラ配列を含有
する。
図22はプラスミドpPX167を含有するE.コリ株PR13の細
胞質抽出物の上清フラクションの逆相Ｃ−４高性能液体
クロマトグラフィーを用いて得られたクロマトグラムを
表す。
図23AはプラスミドpPX167を含有するE.コリPR13から
得られたシグナルレスPBOMP−１のSDS−PAGE分析をクー
マシー染色して示したものである。レーンは（１）細質
胞フラクション；（２）DEAE溶出液；および（３）逆相
溶出液を表す。分子量標準物をレーン１の左側のレーン
に流し、相対分子量（キロダルトン）を図の左側に示
す。図23Bは抗−PBOMP−１モノクローナル抗体とこれら
フラクションとの反応性を表す。レーンは図23Aにおけ
ると同じである。
図24はlacプロモーターの下流に挿入されたPBOMP−２
タンパク質の全コード配列を含有するプラスミドpPX163
の作製を模式的に示す。
図25はIPTGの存在下または非存在下で増殖させたpPX1
63含有E.コリJM103の全細胞溶解物のSDS−PAGE分析を表
す。レーンは以下を表わす、すなわち（１）分子量標準
物：キロダルトン；（２）IPTG無しで増殖させたpPX163
含有JM103の溶解物；および（３）レーン２と同様だ
が、IPTG（5mM）の存在下で４時間増殖させた。矢印はI
PTGによって誘導された三つのPBOMP−２反応性バンドの
位置を示す。
図26はPBOMP−１構造の模式図であり、このタンパク
質の親水性領域を表し、さらにこのタンパク質の二次構
造に存在するリバース ターンを表す。PBOMP−１配列
内の、化学合成したPBOMP−１関連ペプチドの位置およ
び大きさを下に示す。
図27は５種類の化学合成PBOMP−１関連ペプチドのア
ミノ酸配列を表す。
図28はPBOMP−１に対するモノクローナル抗体によっ
て認識されるPBOMP−１タンパク質上のエピトープの地
図を示す。
図29は感染E.コリJM103細胞の全細胞溶解物と莢膜の
ないH.インフルエンザエ株S2との反応性（レーン４）；
または非類型性臨床H.インフルエンザエ株;0045E（レー
ン５）、1939（レーン６）、HST31（レーン７）、およ
びHib Eagan（レーン８）と抗−PBOMP−２モノクローナ
ル抗体、61−１との反応性を表す。分子量標準物（キロ
ダルトン）をレーン２に示す。PBOMP−２およびPBOMP−
１の抗−PBOMP−２モノクローナル抗体61−１との反応
性をそれぞれレーン１および３に示す。
図30はPBOMP−2:PBOMP−１融合タンパク質コード配列
を含有するプラスミド構築の模式図である。プラスミド
pPX163およびpPX167を別々にSca Iで完全に消化するこ
とによって、プラスミドpPX183が構築された。pPX163 S
ca I消化物をさらにHind IIIで処理して部分消化物を生
成させ、一方、pPX167 Sca I消化物をHind IIIで完全に
消化した。pPX163由来の2.7kb Sca I−Hind IIIフラグ
メントおよびpPX167由来の1.4kb Sca I−Hind IIIフラ
グメントを単離しそしてゲル精製した。続いて、この二
つのSca I−Hind IIIフラグメントを連結した。
図31はPBOMP−2:PBOMP−１融合タンパク質コード配列
を含有するプラスミドpPX199構築の図解である。構築の
詳細については本文を参照されたい。
図32はプラスミドpPX199含有E.コリ細胞によって発現
された、脂肪酸でアシル化されたPBOMP−2:PBOMP−１融
合タンパク質のSDS−PAGE分析を表す。約５μｇの精製
融合タンパク質を15％ゲルで分析した（レーン２）。染
色済み低分子量標準物を分子量の比較概算用に操作した
（レーン１）。
図33はPBOMP−２シグナル配列を欠失したPBOMP−2:PB
OMP−１融合タンパク質コード配列を含有するプラスミ
ドpPX512の構築を示す模式図である。プラスミドpPX512
においては、シグナル配列を欠失したPBOMP−２遺伝子
がlacプロモーターの下流に挿入される。プラスミドpPX
512は成熟PBOMP−２配列をコードするキメラ配列を含有
するがただし、Ｎ−末端システインがメチオニンにより
置換され、カルボキシ末端ではPBOMP−１配列に結合し
ている。構築の詳細は本文参照。
5.発明の詳細な説明 本発明は分子量約16000ダルトンを有するH.インフル
エンザエの外層膜タンパク質、すなわちPBOMP−１、お
よび関連の分子量約16000ダルトンのH.インフルエンザ
エ外層膜タンパク質、すなわちPBOMP−２、のエピトー
プに関連するタンパク質およびペプチドに関する。本発
明はさらにIgAプロテアーゼ、フィンブリ（fimbri）、
および外層膜タンパク質を包含するH.インフルエンザエ
の他の重要なタンパク質のエピトープを含有する融合タ
ンパク質にも関する。本発明はまたPBOMP−1:PBOMP−２
またはPBOMP−2:PBOMP−１融合タンパク質のエピトープ
に関連するタンパク質およびペプチドにも関する。SDS
−PAGEを用いて決定された見かけの分子量は成熟（すな
わち、タンパク分解によるプロセシングを受けた）形態
の全分子量を反映するものであり、あらゆる翻訳後修飾
（例えば脂肪酸によるアシル化、アセチル化、など）を
包含する。本発明のタンパク質およびペプチドは組換え
DNA法を用いて、または化学合成によって生産できる。
さらに、本発明のPBOMP−１および／またはPBOMP−２タ
ンパク質およびペプチドは単離精製のための新規および
改良された方法を用いてH.インフルエンザエ培養物から
実質的に純粋な形態で得ることができる。H.インフルエ
ンザエのエピトープを特定するPBOMP−１、PBOMP−２、
PBOMP−1:PBOMP−２、およびPBOM−2:PBOMP−１タンパ
ク質およびペプチドは種々なワクチン製剤に於ける免疫
原として用いて、細菌性髄膜炎、中耳炎、喉頭蓋炎、肺
炎などの原因であるH.インフルエンザエ感染に対して防
御することができる。このワクチン製剤はa,b,c,d,eお
よびｆ型を包含するH.インフルエンザエ類型的菌株、な
らびに非類型的H.インフルエンザエ株のいずれに対して
も有効である。
本発明はさらにPBOMP−１、PBOMP−２、PBOMP−1:PBO
MP−２、およびPBOMP−2:PBOMP−１タンパク質をコード
する遺伝子のヌクレオチド配列、ならびにPBOMP−１、P
BOMP−２、PBOMP−1:PBOMP−２、およびPBOMP−2:PBOMP
−１タンパク質およびそのポリペプチドフラグメントの
アミノ酸配列にも関する。
本発明のある態様によれば、組換えDNA技法を用いてP
BOMP−１、PBOMP−２、PBOMP−1:PBOMP−２、およびPBO
MP−2:PBOMP−１エピトープをコードするヌクレオチド
配列を、適当な宿主細胞内でこれら配列の発現を指示す
る発現ベクターに挿入する。これらを発現ベクター宿主
細胞系を用いてPBOMP−１、PBOMP−２、PBOMP−1:PBOMP
−２、およびPBOMP−2:PBOMP−１、および関連タンパク
質およびペプチドを生産できる。この遺伝子産物は培養
細胞から精製でき、そしてサブユニットワクチン製剤に
於ける免疫原として使用できる。あるいはまた、PBOMP
−１およびPBOMP−２タンパク質およびペプチドのアミ
ノ酸配列は（１）本文に示すH.インフルエンザエから単
離された実質的に純粋なPBOMP−１タンパク質から、ま
たは（２）免疫原性PBOMP−１、PBOMP−２、PBOMP−1:P
BOMP−２またはPBOMP−2:PBOMP−１関連タンパク質およ
びぺプチドを発現する組換え体に含有されるH.インフル
エンザエヌクレオチド配列から推定できる。次に、これ
らのタンパク質およびペプチドを化学合成して合成サブ
ユニットワクチン製剤に使用することができる。
PBOMP−１、PBOMP−２、PBOMP−1:PBOMP−２またはPB
OMP−2:PBOMP−１配列を発現する発現ベクターが組換え
ウイルスである場合には、そのウイルス自体をワクチン
として使用できる。PBOMP−１および／またはPBOMP−２
タンパク質およびペプチド、およびPBOMP−1:PBOMP−２
および／またはPBOMP−2:PBOMP−１融合タンパク質およ
びペプチドを発現しかつ宿主に疾患を引き起こさない感
染性組換えウイルスを生ウイルスワクチン製剤に使用し
て、実質的な免疫を与えることができる。あるいはま
た、不活化ウイルスワクチンはPBOMP−１、PBOMP−２、
PBOMP−1:PBOMP−２および／またはPBOMP−2:PBOMP−１
タンパク質およびペプチドを発現する「死滅」組換えウ
イルスを用いて調製することもできる。
本発明はさらに、PBOMP−１、PBOMP−２、PBOMP−1:P
BOMP−２および／またはPBOMP−2:PBOMP−１に対する多
価抗血清およびモノクローナル抗体、ならびに受動免疫
化のためにこのようなイムノグロブリンの使用法、およ
びH.インフルエンザエに関する診断アッセイにも関す
る。本発明の特定の態様に於いては、PBOMP−１、PBOMP
−２、PBOMP−1:PBOMP−２および／またはPBOMP−2:PBO
MP−１関連ペプチドに対するモノクローナル抗体を生成
させることができる。
説明の目的で、本発明の方法を以下の段階に分けるこ
とができる：すなわち（１）PBOMP−１タンパク質の単
離および精製；（２）PBOMP−１の部分的なアミノ酸配
列決定；（３）それぞれPBOMP−１またはPBOMP−２の単
一または複数の免疫原性領域を包含するPBOMP−１およ
び／またはPBOMP−２関連ペプチドの生成；（４）PBOMP
−１およびPBOMP−２、およびPBOMP−1:PBOMP−２およ
び／またはPBOMP−2:PBOMP−１融合タンパク質をコード
する遺伝子または遺伝子フラグメントの発現ベクターへ
の挿入を包含する、上記遺伝子または遺伝子フラグメン
トの分子クローニング、およびその組換え遺伝子産物の
同定および精製；（５）PBOMP−１およびPBOMP−２をコ
ードする遺伝子のヌクレオチド配列決定；および（６）
PBOMP−１、PBOMP−２、PBOMP−1:PBOMP−２および／ま
たはPBOMP−2:PBOMP−１タンパク質および関連産物の免
疫力を精製組換えタンパク質およびペプチド産物に対す
る抗体生産によって測定すること。上記方法はさらに、
（７）ワクチンの製剤化、および（８）体液検体中にお
けるPBOMP−１およびPBOMP−２遺伝子または遺伝子産物
（そしてそれゆえH.インフルエンザエ）を検出するため
の診断アッセイ、をも包含する。
5.1. PBOMP−１の単離および精製 H.インフルエンザエb EaganおよびH.インフルエンザ
エの他の菌株に於いて、多層膜タンパク質PBOMP−１
は、外層膜−細胞壁複合体と結合している。PBOMP−１
精製に必要なステップは、外層膜タンパク質を外層膜お
よび細胞壁と強固な結合状態に保っているその結合を破
壊することである。以下の二段階を含んでなる本発明の
新規改良法によってこれを達成できる：すなわち（１）
H.インフルエンザエの物理的破壊細胞からPBOMP−１が
富化された不溶性細胞壁フラクションを単離し、次に
（２）ヒトへの投与に達する界面活性剤存在下で加熱す
ることによって細胞壁フラクションからPBOMP−１を可
溶化するかまたは界面活性剤の存在下または非存在下の
いずれかの条件下リゾチームを用いて細胞壁フラクショ
ンを消化する。
本発明の新規改良法は、重要なエピトープを破壊する
可能性がありヒトに投与するワクチンに適しない成分で
ある、ドデシル硫酸ナトリウムおよび２−メルカプトエ
タノール（Munsonら、1984,Infect.Immun.49:544−49参
照）のような変性剤および還元剤の使用を回避するもの
である。
5.1.1. H.インフルエンザエからのPBOMP−１富化不溶
性細胞壁物質の単離 音波処理フレンチプレス他ホモジナイズ装置からの排
出による粉砕を包含するがそれらに限定されない方法に
よるH.インフルエンザエ細胞の破砕後、分画沈降法によ
って全細胞膜フラクションを得ることができる。この全
膜フラクションは密度勾配沈降法によるかまたはTriton
X−100（商標）またはＮ−ラウロイルサルコシン、ナ
トリウム塩（サルコシル）のようなある種の界面活性剤
による内層膜の分画可溶化によってさらに内層膜および
外層膜に分別できる。外層膜は10mM HEPES−NaOH,pH7,4
中の１％（w/v）サルコシル中で内層膜を分画可溶化す
ることによって調製することが好ましい。PBOMP−１富
化サブフラクションは他の外層膜−細胞壁成分の分画界
面活性剤抽出によって生成させることができる。この富
化は例えば１％オクチルグルコシド、ノニルグルコシ
ド、Zwittergent 3−14（商標）、またはZwittergent 3
−16（商標）を用いて外層膜−細胞壁複合体（このもの
は前記のようにトリトンＸ−100TMまたはサルコシル抽
出後に残留する）を連続抽出し続いて１％サルコシルを
用いて不溶性物質を抽出しそして次に遠心してPBOMP−
１富化不溶性物質を単離することにより達成できる。
5.1.2. PBOMP−１富化不溶性細胞壁物質からのPBOMP−
１の可溶化 外層膜−細胞壁複合体からのPBOMP−１の可溶化は以
下の方法の一つまたはそれらの組合せを用いていくつか
の異なる方法で達成できる：（１）デオキシコレート、
Triton X−100（商標）、Tween 80,CHAPS,CHAPSO,ドデ
シルマルトシド,zwittergent 3−14（商標）およびzwit
tergent 3−16（商標）を包含するがそれらに限定され
ないいくつかの界面活性剤のうちの一つまたは任意の組
合せを用い55℃−60℃で１時間、PBOMP−１富化フラク
ションを抽出することによりPBOMP−１を可溶化でき
る；（２）界面活性剤の存在下または非存在下のいずれ
かの条件下、PBOMP−１富化フラクション中の細胞壁を
リゾチームで破壊することによりPBOMP−１を可溶化で
きる。好ましい態様によれば界面活性剤はデオキシコレ
ートおよびポリエトキシレートソルビタンモノオレエー
ト（Tween−80）から選択される。
あるいはまた、Triton X−100（商標）、サルコシ
ル、オクチルグルコシド、ノニルグルコシド、zwitterg
ent 3−14（商標）、またはzwittergent 3−16（商標）
を包含するがそれらに限定されない界面活性剤のうちの
一つまたは組合せを用いて全H.インフルエンザエ細胞、
外層膜またはそのサブフラクションを抽出することによ
りPBOMP−１を単離できる。この抽出は適当な緩衝剤系
に於いては55−60℃または室温で行うことができよう。
可溶化後、イオン交換、分子ふるい、疎水性または逆
相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、クロマトフォーカシング、等電点電気泳動、およ
び調製用電気泳動を包含するがそれらに限定されない既
知の標準的方法によってPBOMP−１をさらに精製するこ
とができる。
5.2. PBOMPペプチドのアミノ酸分析および配列決定に
よるPBOMP−１の特性決定 ペプチドフラグメントの部分的アミノ酸配列決定と組
み合わせたアミノ酸分析によって、H.インフルエンザエ
から得られたPBOMP−１を特性決定できる。精製タンパ
ク質に於けるアミノ酸の破壊および／または修飾を最小
限に抑えるために、トリプタミン含有メタンスルホン酸
中でPBOMP−１を加水分解するのが好ましい（Simpson
ら、1970,J.Biol.Chem.251:1936−40）。本発明の一実
施例に於てはかかるアミノ酸分析をPBOMP−１のトリプ
シンペプチドフラグメントのアミノ酸配列決定と組み合
わせて、記載のようにして単離された新規ペプチドの特
性決定を行った（6.1.1節参照）。
最初にエドマン法によってPBOMP−１を配列決定する
試みにおいて経験した困難によって、ヘモフィルス外層
膜タンパク質のＮ−末端がブロックされていることが示
唆された。Braun（1970,Eur.J.Biochem.14:387−391）
の研究により、エシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）のブラウン（Braun's）リポタンパク質のＮ−末端シ
ステイン残基には脂肪酸が結合されていることが明らか
になっている。パルミチル部分がＮ−末端システインに
アミド結合している；また、さらに二つの脂肪酸が同じ
システイン残基にグリセリル基を介して結合し、E.コリ
ブラウンリポタンパク質中でチオエーテル結合を形成し
ている。（同上）したがって、H.インフルエンザエから
得られたPBOMP−１をさらに脂肪酸分析によって特性決
定した。かかる分析によって、本発明の外層膜タンパク
質およびぺプチドのＮ−末端残基は共有結合した脂肪酸
残基を有する可能性があることが示された。本発明の一
実施例に於ては、かかる脂肪酸分析により三つの主要な
脂肪酸、すなわちラウリン酸、パルミチン酸およびパル
ミチン酸誘導体の存在が明らかに示された。共有結合し
た脂肪酸部分を有する本発明のアセチル化タンパク質お
よびペプチドはH.インフルエンザエに対するワクチン製
剤にとって特に有用でありうる。
5.3. PBOMP−１および／またはPBOMP−２関連ペプチド
の生成 それぞれPBOMP−１またはPBOMP−２の抗原性または免
疫原性領域を含有するPBOMP−１および／またはPBOMP−
２関連ぺプチドは、全PBOMP−１またはPBOMP−２タンパ
ク質のタンパク分解的切断によるかまたはペプチドフラ
グメントの化学合成によって生成させることができる。
後者法に於ては、例えば自動化ぺプチド合成装置を用い
てぺプチドフラグメントを化学的に合成できる。
タンパク分解的消化または化学合成のいずれかによっ
て生成された本発明のPBOMP−１またはPBOMP−２関連ぺ
プチドは当業者に知られた標準的方法によって精製でき
る。このような方法には、高圧液体クロマトグラフィー
またはイオン交換、分子サイズ、疎水性または逆相カラ
ム、アフィニティーカラムを用いるカラムクロマトグラ
フィー、あるいはクロマトフォーカシング、等電点電気
泳動または調製用ゲル電気泳動が包含されるがそれらに
限定されない。
PBOMP−１またはPBOMP−２のタンパク分解消化物また
は化学合成されたPBOMP−１またはPBOMP−２の配列は、
ペプチド結合の加水分解を伴うエドマン分解法またはア
ミノ酸分析法を利用した自動化シークエネーターを包含
するが、それらに限定されない当業者に知られた方法に
より決定される（Simponら、1976,J.Biol.Chem.251:193
6−1940）。
5.4. PBOMP−１およびPBOMP−２をコードする遺伝子ま
たは遺伝子フラグメントの分子クローニング 5.4.1. PBOMP−１および関連PBOMPをコードする遺伝子
の単離 ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS−PAGE）およびウェスタンブロット分析のい
ずれによっても、テストしたすべてのH.インフルエンザ
エ株（現在数百）で、分子量（MW）16000ダルトンのOMP
が検出されている。モノクローナル抗体のデータによっ
て、このタンパク質が高度に保存されていることが示さ
れる（Murphyら、1986,Infect.Immun.54:774−49）。し
たがって、任意のH.インフルエンザエ株がPBOMP遺伝子
の供給源として利用できよう。多くのH.インフルエンザ
エ株は検出可能なプラスミドまたは誘導可能なプロファ
ージを何ら含有しないため、PBOMP遺伝子はおそらく染
色体にある。したがって、PBOMPをコードするDNA配列の
分子クローニングの第一段階は、H.インフルエンザエ染
色体DNAからかかる配列を単離することである。H.イン
フルエンザエ遺伝子をコードするDNAは以下「Hi DNA」
と称し、PBOMP配列をコードするDNAを「PBOMP DNA」と
称する。
Hi DNAフラグメントを生成させるために、種々の制限
酵素を用いHi DNAを特異的部位で切断することができ
る。あるいはまた、DNAをフラグメント化するために低
濃度のDNAアーゼＩを使用してもよく、または例えば音
波処理によって物理的にDNAを剪断することもできる。
次に、線状DNAフラグメントをアガロースおよびポリア
クリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー
（例えば、分子ふるいまたはイオン交換クロマトグラフ
ィー）またはスクロース密度勾配に於ける速度沈降法を
包含するがそれらに限定されない標準的技法により、サ
イズにしたがって分離することができる。
もし、その酵素が、PBOMP遺伝子産物の免疫力を破壊
しないならば、任意の制限酵素または制限酵素組合せを
用いて、PBOMP配列を含有するHi DNAフラグメントを生
成させることができる。たとえば、タンパク質の抗原性
部位は、約７から約14までのアミノ酸からなることがで
きる。したがって、PBOMPペプチド程度の大きさを有す
るタンパク質は多くの分離した抗原性部位を有する可能
性があり、それゆえ多数の部分的なPBOMPポリペプチド
遺伝子配列が抗原性部位をコードできよう。従って多く
の制限酵素を組み合わせて用いてDNAフラグメントを生
成させることができ、このフラグメントは、適当なベク
ターに挿入されると、異なる抗原決定基を含有するPBOM
P特異的アミノ酸配列の生産を指示できる。
ひとたびDNAフラグメントが生成されると、PBOMP遺伝
子を含有する特定のDNAフラグメントの同定は多くの方
法で行うことができる。
Hi DNAフラグメントを合成オリゴヌクレオチドプロー
ブとハイブリダイゼーショさせることによりPBOMP遺伝
子を含有するDNA配列を同定できる。PBOMPタンパク質の
ペプチドフラグメントのアミノ酸配列に基づいて、重複
する合成オリゴヌクレオチドプローブが構築される。例
えば、5.1節記載のH.インフルエンザエから単離された
実質的な純粋なPBOMP−１タンパク質のアミノ酸配列に
基づいて合成オリゴヌクレオチドプローブを調製でき
る。これらの合成プローブは、32P−アデノシン三リン
酸で放射性標識してこれを用いて、PBOMP−特異的遺伝
子配列を含有するクローンについて、Hi DNAライブラリ
ーをスクリーニングすることができる（Andersonら、19
83,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:6838−42）。
あるいはまた、「ショットガン」法でクローニングベ
クター中に挿入後、PBOMP遺伝子DNAを同定し単離するこ
とができる。当業上知られた多数のベクター宿主系を用
いることができる。ベクター系はプラスミドであって
も、修飾ウイルスであってもよい。適当なクローニング
ベクターには、ラムダベクター系gt 11,gt WES.tB、シ
ャロン（Charon）４のようなウイルスベクター、および
pBR322,pBR325,pACYC177,pACYC184,pUC8,pUC9,pUC18,pU
C19,pLG339,pR290,pKC37,pKC101およびその他の同様の
系のようなプラスミドベクターが包含されるがそれらに
限定されない。ベクター系は使用する宿主細胞に適合し
なけらばならない。形質転換、トランスフェクションま
たは感染によって組換え分子を細胞内に導入することが
できる。
PBOMP遺伝子または遺伝子フラグメントを含有するHi
DNAをクローニングベクターに挿入し、それを用いて適
当な宿主細胞を形質転換するならば、PBOMP遺伝子また
は遺伝子フラグメントの多数のコピーを生成させること
ができる。これは相補的な付着端を有するクローニング
ベクターにHi DNAフラグメントを連結することによって
達成できる。しかしながら、もし相補的制限部位が存在
しない場合は、DNA分子の末端を修飾することができ
る。かかる修飾は一本鎖DNA末端を切り戻すことによる
かまたは一本鎖末端を充填することによる平滑末端の生
成を包含し、それによって得られた末端を平滑末端連結
することができる。あるいはまた、任意の所望の部位
を、DNA末端にヌクレオチド配列（リンカー）を連結す
ることによって作成することもできる。これら連結され
たリンカーは制限部位認識配列をコードする特定の化学
合成オリゴヌクレオチドを有することができる。たとえ
ば、ManiatisのDNA修飾法（Maniatisら、1982,Molecula
r Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,pp.107−11
4参照）にしたがって、剪断されたDNAを制限メチラーゼ
（例えばM.EcoR I）で処理しそしてその酵素の制限部位
をコードする合成DNAリンカーに連結する。次に、このD
NAを制限エンドヌクレアーゼで処理して末端リンカーを
切断し（修飾された内部制限部位は切断されない）適当
なベクターのアームに連結する。別法では、切断された
ベクターおよびPBOMP DNAフラグメントをホモポリマー
テイリングによって修飾することができる。
クローン化されたPBOMP遺伝子は、Hiの染色体遺伝子
バンクをベクター系に確立し、本文に記載された任意の
方法によって個々のクローンをPBOMP−１またはPBOMP−
１関連タンパク質の生産に関してスクリーニングするこ
とによって同定できる。かかるスクリーニング法には、
PBOMPに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗
体との特異的反応が包含されるがそれらに限定されな
い。
5.4.2. PBOMP遺伝子の発現ベクターへの挿入 PBOMPまたはその一部をコードするヌクレオチド配列
を適当な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質
コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベ
クターに挿入する。本発明の特定の態様に於いてはPBOM
P−１およびPBOMP−２の両者、またはその一部をコード
するヌクレオチド配列を、前記の文章に記載のような適
当な発現ベクターに挿入する。様々な宿主−ベクター系
をタンパク質コード配列の発現に利用できる。基本的に
はベクター系は、用いる宿主細胞に適合しなければなら
ない。宿主−ベクター系には以下が包含されるが、それ
に限定されない：すなわちバクテリオファージDNA、プ
ラスミドDNAまたはコスミドDNAで形質転換された細菌；
酵母ベクターを含有する酵母のような微生物；ウイルス
（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に
よる感染を受けた哺乳動物細胞系；ウイルス（例えばバ
キュロウイルス）による感染を受けた昆虫細胞系。これ
らのベクターの発現要素はその強さおよび特異性がまち
まちである。利用する宿主−ベクター系に応じて、多数
の適当な転写および翻訳要素の任意のひとつを使用でき
る。
遺伝子（または遺伝子の一部）の効率的な発現を得る
ためには発現ベクター中にプロモーターが存在しなけれ
ばならない。RNAポリメラーゼは通常プロモーターに結
合しそして遺伝子または一群の連結された遺伝子群およ
び調節要素（オペロンと称される）の転写を開始する。
プロモーターの「強さ」、すなわち転写を促進する能力
は様々である。クローン化された遺伝子を発現させるに
は、高レベルの転写、そしてそれゆえ遺伝子発現、を得
るためには強力なプロモーターを用いることが望まし
い。利用する宿主細胞系に応じて、多数の適当なプロモ
ーターのうちの任意の一つを用いることができる。例え
ば、E.コリ、そのバクテリオファージまたはプラスミド
でクローニングする場合には、例えば、lacプロモータ
ー、trpプロモーター、recAプロモーター、リボソームR
NAプロモーター、コリファージラムダのPRおよびPLプロ
モーターのようなプロモーター、およびその他のlacUV
5、ompF、bla、lppなどを包含するがそれらに限定され
ないプロモーターを用いて隣接DNAセグメントの高レベ
ルの転写を指示することができる。さらに、組換えDNA
または他の合成的DNA技法によって作成されたハイブリ
ッドtrp−lacUV5（tac）プロモーターまたはその他のE.
コリプロモーターを用いて挿入遺伝子の転写を行うこと
ができる。
特異的誘導が行われない場合にはプロモーターの作用
が抑制されるような細菌性宿主細胞系統および発現ベク
ターを選択することができる。ある種のオペロンでは、
特定のインデューサーを添加することが挿入DNAの効率
よい転写に必要である：すなわち例えばlacオペロンは
ラクトースまたはIPTG（イソプロピルチオ−ベータ−Ｄ
−ガラクトシド）の添加によって誘導される。trp,pro
などの様々なその他のオペロンは、異なった制御のもと
にある。trpオペロンは、増殖培地中にトリプトファン
が存在しない場合に誘導される；また、cI857のような
温度感受性ラムダリプレッサーを含有する宿主細胞に於
いては、温度を上昇させることによってラムダのPLプロ
モーターを誘導することができる。このようにして、プ
ロモーターにより指示される転写の95％以上を非誘導細
胞で抑制することができる。したがって、遺伝子工学に
よって作成されたPBOMPタンパク質またはそのペプチド
の発現を制御できる。このことはクローニングされた遺
伝子のタンパク質産物が宿主細胞に対して致死的または
有害である場合に重要である。かかる場合、形質転換体
をプロモーターが誘導されない条件下で培養し、そして
細胞が増殖培地中で適当な密度に達したところで当該タ
ンパク質生産のためにプロモーターを誘導することがで
きる。
かかるプロモーター／オペレーター系の一つがいわゆ
る「tac」またはtrp−lacプロモーター／オペレーター
系である（RussellおよびBennett,1982,Gene 20:231−2
43;DeBoer,European Patent Application,67,540 1982
年５月18日出願）。このハイブリッドプロモーターは、
trpプロモーターの−35b.p.（−35領域）とlacプロモー
ターの−10b.p.（−10領域またはプリブナウボックス）
（RNAポリメラーゼ結合部位であるDNAの配列）を結合す
ることによって構築される。トリプトファンプロモータ
ーの強力なプロモーター特性の維持に加えて、tacはlac
リプレッサーによる制御も受ける。
真核生物宿主細胞でクローニングする場合には、エン
ハンサー配列（例えば、SV40 DNAの72bpタンデム反復配
列またはレトロウイルスの長い末端反復すなわちLTRな
ど）を挿入して転写効率を高めることができる。エンハ
ンサー配列は、その近傍遺伝子と関連した位置および方
向とは比較的無関係な様式で転写効率を高めると考えら
れる一組の真核生物DNA要素である。遺伝子のすぐ５′
側に存在しなければならない古典的なプロモーター要素
（例えば、ポリメラーゼ結合部位およびGoldberg−Hogn
ess「TATA」ボックス）とは異なり、エンハンサー配列
は真核生物遺伝子の上流、内部、または下流で機能する
注目すべき能力を有する；したがって、挿入遺伝子に対
するエンハンサー配列の位置は重要ではない。
原核細胞に於ける効率よく遺伝子の転写および翻訳の
ためには、特異的な開始シグナルも必要である。これら
転写および翻訳開始シグナルは、それぞれ遺伝子特異的
メッセンジャーRNA量および合成されたタンパク質量に
よって測定されるように、その「強さ」が変動しうる。
DNA発現ベクターはプロモーターを含有するが、様々な
「強さ」の転写および／または翻訳開始シグナルを任意
に組み合わせて含有することもできる。例えば、E.コリ
に於ける効率よい翻訳のためには、開始コドン（ATG）
の約７−９塩基５′側のシャイン−ダルガルノ（SD）配
列が必要であり、これはリボソーム結合部位を付与す
る。したがって、宿主細胞リボソームが利用可能な任意
のSD−ATGの組合せを用いることができる。かかる組合
せにはコリファージラムダのcro遺伝子またはＮ遺伝子
由来のSD−ATG組み合せ、またはE.コリトリプトファン
遺伝子E,D,C,B,またはＡ由来のSD−ATGの組合せが包含
されるがそれらに限定されない。さらに、合成ヌクレオ
チドの組み込みを含む組換えDNAまたはその他の技法に
よって作成された任意のSD−ATGの組合せを使用でき
る。
DNAフラグメントのベクターへの挿入に関してこれま
でに記載された任意の方法を用いてプロモーターおよび
その他の制御要素をベクター内の特定の部位に連結する
ことができる。
したがって、PBOMPタンパク質またはペプチドをコー
ドする領域を含有するH.インフルエンザエ遺伝子配列
を、発現ベクター内に、ベクタープロモーターおよび制
御要素に関して特定の部位に連結でき、従って得られた
組換えDNA分子を宿主細胞内に導入した場合に外来遺伝
子配列が宿主細胞によって発現（すなわち転写および翻
訳）できる。本発明の詳細な態様に於いては、PBOMP−
１およびPBOMP−２タンパク質またはペプチドをコード
する領域を発現ベクターに連結できる。ベクタープロモ
ーターおよび制御要素に対するPBOMP配列の関係または
方向が、発現された遺伝子配列がPBOMP−1:PBOMP−２融
合タンパク質またはそのペプチドフラグメントである
か、またはPBOMP−2:PBOMP−１であるかを決定するであ
ろう。形質転換、形質導入またはトランスフェクション
によって（これはベクター／宿主細胞系の如何による）
組換えDNA分子を適当な宿主細胞（細菌、ウイルス、酵
母、哺乳動物細胞などを包含するがそれらに限定されな
い）に導入できる。形質転換体は例えばpBR322に於ける
アンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性、または
真核宿主系に於けるチミジンキナーゼ活性のようなベク
ター中に通常存在する一またはそれ以上の適当な遺伝子
マーカーの発現に基づき選択される。かかるマーカー遺
伝子の発現は、その組換えDNA分子が無傷であって複製
していることを示すはずである。発現ベクターはクロー
ニングベクターに由来することができ、これは通常マー
カー機能を含有する。かかるクローニングベクターには
以下が包含されるがそれらに限定されない：すなわちSV
40およびアデノウイルス；ワクシニアウイルスベクタ
ー；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス；酵母ベク
ター；ラムダgt−WES−ラムダＢ、シャロン28、シャロ
ン4A、ラムダgt−１−ラムダBC、ラムダgt−１−ラムダ
Ｂ、M13mp7、M13mp8、M13mp9のようなバクテリオファー
ジベクター；またはpBR322,pAC105,pVA51,pACYC177,pKH
47,pACYC184,pUB110,pMB9,pBR325,Col E1,pSC101,pBR31
3,pMR313,pML21,RSF2124,pCR1,RP4,pBR328などのような
プラスミドDNAベクター。
H.インフルエンザエとE.コリの間の接合を介した薬剤
耐性因子の転移（Stuy,1979,J.Bact,139:520−529）；
およびE.コリ中へのヘモフイルス染色体遺伝子の形質転
換（Mann,1979,Plasmid 2:503−505）およびクローニン
グ（Mannら、1980,Gene 3:97−112）によれば、少なく
ともいくつかの遺伝子が両方の生物に於いて効率よく発
現できること、および転写および翻訳制御の基本的メカ
ニズムが同様であろうことが示される。
本発明の実施例に於ける特定の実施態様に於いては発
現ベクターとしてE.コリプラスミド系を選択した。しか
しながら、本発明はかかるE.コリ発現ベクターの使用に
限定されない。
遺伝子工学的技法を用いて、クローニングされた遺伝
子を更に特性決定および／または適合させることもでき
よう。例えば、PBOMPタンパク質をコードする遺伝子の
特定部位の突然変異誘発を用いて、防御抗体応答を引き
起こす原因となるタンパク質の領域を同定することがで
きよう。また、上記タンパク質を防御ドメイン外の領域
で修飾し、例えば精製が容易になるようにタンパク質の
溶解性を増加させることもできよう。
5.4.3 発現された遺伝子産物の同定および精製 外来遺伝子挿入物を含有する発現ベクターは３種の一
般的方法、即ち：（１）外来挿入遺伝子と相同である配
列からなるプローブを用いたDNA−DNAハイブリダイゼー
ション；（２）「マーカー」遺伝子機能の有無（例えば
抗生物質耐性、形質転換表現型、チミジンキナーゼ活性
等）；および（３）遺伝子産物の物理的、免疫学的また
は機能的な特性に基づく挿入配列の発現、により同定で
きる。
ひとたびPBOMP遺伝子を発現する組換え体が同定され
ると、遺伝子産物を分析しなければならない。究極の目
的は遺伝子産物またはかかる産物を発現する組換えウイ
ルスをワクチン製剤中および／または診断イムノアッセ
イにおける抗原として使用することであるから、免疫学
的分析が特に重要である。
6.2節で後述する多価抗血清およびモノクローナル抗
体を包含するがそれらに限定されない種々の抗血清を産
物の免疫反応性の分析に利用できる。
本発明のタンパク質およびペプチドの同定には、PBOM
P関連タンパク質またはペプチドがPBOMPまたはその類似
体および誘導体に対する種々の抗体に対して免疫反応性
を有することを必要とする。
タンパク質またはペプチドは、それが全PBOMP遺伝子
配列の発現で得られたものであっても、遺伝子配列の一
部の発現で得られたものであっても、あるいは融合タン
パク質の生産を指示するために連結された２つまたはそ
れ以上の遺伝子配列の発現で得られたものであっても、
免疫反応性でなければならない。この反応性は、放射線
免疫沈降、放射線免疫拮抗、ELISAまたはイムノブロッ
トのような標準的な免疫学的方法により示されうる。
ひとたび、H.インフルエンザエPOBMP関連タンパク質
が同定されると、これを、クロマトグラフィー（例えば
イオン交換、アフィニティーおよびサイジングカラムク
ロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差を含む標準的
方法によるかまたはタンパク質糖製のための任意の他の
標準的技法により単離および精製できる。
あるいは、組換え体により生産された免疫反応性H.イ
ンフルエンザエPBOMP関連タンパク質がひとたび同定さ
れると、免疫反応性タンパク質のアミノ酸配列を組換え
体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列から推定
できる。その結果、タンパク質を当該分野で知られてい
る標準的な化学的方法により合成できる（例えばHunkap
iller等、1984,Nature 310:105−111参照）。
本発明の詳細な態様においてはかかるペプチドには、
組換えDNA技法により生産されたものであっても化学合
成法で得られたものであっても、実質的に図11および／
または図15に示されるアミノ酸配列の全てまたは一部が
包含され、これには、機能的に均等なアミノ酸残基が配
列内の残基にとってかわってサイレント変化が生じてい
る変化した配列も包含されるがそれらに限定されるわけ
ではない。例えば、配列内の１つまたはそれ以上のアミ
ノ酸残基を機能的に均等な作用をする同様の極性の別の
アミノ酸で置換することによりサイレント変化を生じさ
せることができる。配列内でのアミノ酸の代替物はその
アミノ酸が属するクラスの他の構成要因から選択しう
る。例えば非極性（疎水性）アミノ酸にはグリシン、ア
ラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、
フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが
包含される。極性中性アミノ酸には、セリン、トレオニ
ン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグル
タミンが包含される。正電荷（塩基性）アミノ酸にはア
ルギニン、リジンおよびヒスチジンが包含される。負電
荷（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミ
ン酸が包含される。
5.5 PBOMP遺伝子のヌクレオチド配列 PBOMP遺伝子を含有するDNAフラグメントがひとたび同
定されると、これら遺伝子の実際のヌクレオチド配列が
DNA配列分析により確認できる。塩基対の配列順序はマ
キサム・ギルバート法（MaxamおよびGilbert,1980,Meth
ods in Enzymolgy,65:49）またはジデオキシ法（Sanger
等.,1977,Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 74:5463）の２つ
の方法の何れかにより決定できる。PBOMP遺伝子の実際
の開始および終始シグナルは読みとり枠のヌクレオチド
配列の分析により確認できる（Rosenberg等.,1979,Ann.
Rev.Genet.13:319）。特定のDNAフラグメント上に１つ
以上の読みとり枠が見出された場合は、実際の遺伝子の
同一性は、遺伝子産物の予想アミノ酸配列とPBOMPのア
ミノ酸配列を比較することにより確認できよう。適正な
読み枠の位置も遺伝子融合を用いて測定できよう。
5.6 PBOMPおよびPBOMP関連ペプチドの免疫能力の測定 ｂ型ヘモフィルス・インフルエンザエの莢膜多糖、即
ちPRPに対する抗体を用いた経験では、インビトロアッ
セイにおいて殺菌を殺し、そして動物モデル系において
Hibを用いる挑戦から防御する抗体の能力は、ヒト幼児
に防御免疫応答を惹起する能力と密接に関連しているこ
とが示される。
PBOMP−１および／またはPBOMP−２タンパク質および
／またはPBOMP−1:PBOMP−２およびPBOMP−2:PBOMP−１
融合タンパク質を包含するがそれらに限定されない本発
明のPBOMPタンパク質およびペプチドに応答して惹起さ
れた抗PBOMP抗体を、同様のインビトロアッセイ系およ
び動物モデル系を用いて検査して、HiおよびHib細胞を
殺す能力および動物モデル系でHibを用いた挑戦から保
護する能力を証明することができる。本発明の詳細な態
様においては、抗体は化学合成されたPBOMPペプチドま
たはPBOMPタンパク質のタンパク質分解的切断により生
成されたPBOMPペプチドに応答して惹起される。好まし
い態様においては、かかるPBOMPペプチドフラグメント
はタンパク質キャリアー例えばチログロブリン、ウシ血
清アルブミン、ジフテリアトキシンまたは無毒化トキシ
ン（トキソイド）、破傷風トキシンまたはトキソイド、
シュードモナストキシンまたはトキソイド、スタフィロ
コッカストキシンまたはトキソイド、百日咳トキシンま
たはトキソイド、CRM197等に結合されよう。CRM197は単
一のアミノ酸により天然のジフテリアトキシンと区別さ
れる。しかしながら、CRM197と天然のジフテリアトキシ
ンは免疫学的には区別不可能である。CRM197に関する詳
細は、1987年６月16日分布の特許4,673,574号に記載さ
れており、その内容は参考文献として本明細書に組み込
まれる。これらの系から得られた結果によれば、防御免
疫応答を惹起する各PBOMPの能力とヒトの幼児、小児お
よび成人用のワクチンとして用いることできる各PBOMP
の能力における同様の相関が示されるはずである。
H.インフルエンザエに対するPRPおよびリポ多糖（LP
S）の抗体の殺菌活性を測定するために以前使用された
インビトロ補体媒介殺菌アッセイ系（Musher等,1983,1n
fect.Immun.39:297−304;Anderson等,1972,J.Clin.Inve
st.51:31−38）を用いて特定のPBOMPペプチドまたはそ
のフラグメントに対する抗体がｂ型H.インフルエンザエ
および非類型的H.インフルエンザエに対する殺菌活性を
有するかどうか判定できよう。これらのアッセイは、２
種類の細菌の比較的大量の臨床単離株に対して実施して
広範囲の株が殺傷されるかどうかを判定できる。かかる
インビトロ殺菌アッセイの例示については7.1,9.4およ
び10.5（後述）節を参照されたい。
PBOMPまたはそのフラグメントが防御抗体応答を惹起
する能力に関する情報は、幼若ラット髄膜炎モデル系を
用いることにより更に得られる（Smith等,1973,Infect.
Immun.8:278−290）。第６日目以前に適当な用量のH.イ
ンフルエンザエｂ型で挑戦された幼若ラットは菌血症を
発症しヒト幼児で見られると同様の致命的髄膜炎を起こ
す。挑戦株に対して殺菌活性を有する抗体を用いて幼若
ラットを受動免疫化した後に挑戦を行なえば、髄膜炎お
よび死亡を防ぐことができる。ｂ型ヘモフィルス、PR
P、に対する現在のワクチンに対する抗体は幼若ラット
モデル系において防御作用を示す。ｂ型ヘモフィルス髄
膜炎に対する受動防御は、幼若ラットをウサギポリクロ
ーナル抗PBOMP抗体で免疫化し、次いで、致死量のｂ型
H.インフルエンザエでラットを攻撃することにより示さ
れよう。本発明のタンパク質およびペプチドにより惹起
されるかかるインビボ防御抗体応答の例示については7.
2節（後述）を参照されたい。
特定のPBOMPに対する抗体のHiに対する防御能力に関
するデータは、チンチラ中耳炎動物モデル系を用いて得
ることができた（Barenkamp等,1986,Infect.Immun.52:5
72−78）。この動物モデルにおいては、Hiを内耳管に接
種することによりチンチラを攻撃する。ヒトで見られる
ものとかなり似ている中耳炎が発生する。Hi OMPによる
能動免疫化またはHi OMPに対する抗体による受動免疫化
の何れかを施されたチンチラでは、Hiによる耳攻撃に対
し保護される。（Barenkamp等，前述）この動物モデル
系を用いてPBOMPに対する抗体のHiに対する防御能力を
示すことができた。
幼若ラット動物モデルを用いることにより抗PBOMP抗
体が抗PRP抗体と相加的保護を行ないうることを示すこ
とが可能である。Hibでの攻撃から幼若ラットをもはや
保護できないような濃度まで希釈した抗PBOMP−１抗体
を同様な希釈度の抗−PRP抗体と混合したものは相加的
保護を示し、それによって幼若ラットの死亡が阻止され
る。この相加的保護は、PRPまたはそのフラグメントま
たは接合体と、PBOMPまたはそのフラグメントとからな
る有効な複合ワクチンとして有用であろう。
5.7 ワクチン製剤 多くの方法を用いてヒトまたは動物に後述するワクチ
ン製剤を導入できる。これらには、限定するものではな
いが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下および鼻内
の投与経路が包含される。
5.7.1 サブユニットワクチン製剤 本発明の１つの目的は、H.インフルエンザエ感染の髄
膜炎およびその他の症状に対して防御するためのサブユ
ニットワクチンにおける免疫原として使用されるPBOMP
−１、PBOMP−２および関連タンパク質およびペプチ
ド、並びにPBOMP−1:PBOMP−２およびPBOMP−2:PBOMP−
１融合タンパク質および関連ペプチドを包含するH.イン
フルエンザエの外層膜タンパク質PBOMPに関連するタン
パク質またはポリペプチドフラグメントに提供すること
である。サブユニットワクチンは宿主を免疫化するのに
必要な関連免疫原物質のみを含有する。防御免疫応答を
惹起しうる、遺伝子工学により得られた免疫原、化学合
成された免疫原および／または本発明書に記載するよう
にして単離された真正の実質的に純粋なH.インフルエン
ザエPBOMPからなる免疫原から調製したワクチンは、そ
れらが受容者に感染する危険が無いことから特に好都合
である。即ち、PBOMP関連タンパク質またはそのフラグ
メントは、PBOMPエピトープを発現する組換え体から精
製できる。かかる組換え体には、前述した殺菌性形質転
換体、酵母形質転換体、またはPBOMPエピトープを発現
する組換えウイルスに感染した培養細胞の何れも包含さ
れる（前述の5.4および5.5節参照）。あるいは、PBOMP
関連タンパク質またはペプチドを化学的に合成してもよ
い。この目的のためには、かかるタンパク質またはペプ
チドのアミノ酸配列をその発現を指示する遺伝子のヌク
レオチド配列から推定できる（前述の5.5節参照）。更
に別の態様においては、PBOMP関連タンパク質またはペ
プチドがH.インフルエンザエの培養物から実質的に純粋
な形態で単離される（例えば前述の5.1節参照）。
免疫原も組換え体から精製する場合も化学合成する場
合も、最終産物を適切な濃度に調整しそして任意の適当
なワクチンアジュバントとともに製剤化する。適当なア
ジュバントには、それらに限定されないが、界面活性物
質例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オ
クタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジメチル
−ジオクタデシルアンモニウムブロマイド、N,N−ジコ
クタデシル−N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロ
パンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、
およびプルロニックポリオール；ポリアミン、例えばプ
ラン、硫酸デキストラン、ポリIC、ポリアクリル酸、カ
ルボポル；ペプチド、例えばムラミルジペプチド、ジメ
チルグリシン、タフトシン；油乳濁液；およびミネラル
ゲル、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム
等が包含される。免疫原はまた、リポソームにとり込ん
だり、または糖類および／またはその他の重合体に結合
させてワクチン製剤中に使用することもできる。
本発明のこの様式の更に別の態様においては、PBOMP
関連タンパク質またはペプチドはハプテン、即ち、それ
が同族の抗体と特異的または選択的に反応するという点
で抗原性を有するが、免疫応答を惹起できないという点
で免疫原性を有しない分子である。このような場合、ハ
プテンはキャリアーまたは免疫原性分子に共有結合させ
ることができる。例えば、タンパク質血清アルブミンの
ような大型のタンパク質がそれに結合したハプテンに免
疫原性を付与しよう。ハプテン−担体は、サブユニット
ワクチンとして使用するために製剤化できる。
5.7.2 ウイルスワクチン製剤 本発明の別の目的は、H.インフルエンザエの髄膜炎お
よびその他の疾患症状に対して防御するために使用され
る生組換えウイルスワクチンまたは不活性化組換えウイ
ルスワクチンのいずれかを提供することである。この目
的のためには、PBOMP関連エプトープを発現する組換え
ウイルスを調製する（前述の5.4および5.5節参照）。組
換えウイルスが免疫化されるべき宿主に対して感染性を
有するが、疾患を生じさせない場合は、宿主内での増殖
により長期化した刺激をもたらし、それにより、実質的
に長期間持続する免疫が付与されるという理由で生ワク
チンが好ましい。感染性組換えウイルスは宿主に導入さ
れると、そのキメラ遺伝子からPBOMP関連タンパク質ま
たはポリペプチドフラグメントを発現でき、それにより
H.インフルエンザエ抗原に対する免疫応答が惹起され
る。このような免疫応答によりその後のH.インフルエン
ザエ感染を防御できる場合は、生組換えウイルスそのも
のを、H.インフルエンザエ感染に対する予防ワクチンと
して使用できる。このような組換えウイルスの生産には
インビトロ（例えば組織培養細胞）およびインビボ（例
えば天然宿主動物）系が包含される。例えば、天然痘ワ
クチンの調製および製剤化のための従来の方法を、PBOM
P関連タンパク質またはポリプチドを発現する生組換え
ウイルスワクチンの製剤化に適合させることができる。
多価生ウイルスワクチンは、H.インフルエンザエPBOM
Pエピトープに加え、疾患をもたらす生物のエピトープ
を発現する単一または２、３の感染性組換えウイルスか
ら調製できる。例えば、H.インフルエンザエPBOMPのエ
ピトープに加えて他のエピトープのコード配列を含有す
るようにワクシニアウイルスを作成できる。かかる組換
えウイルスそのものを多価ワクチンにおける免疫原とし
て使用できる。あるいは、PBOMPの種々の異なるエピト
ープおよび／または他の疾患惹起生物の他のエピトープ
をコードする異る遺伝子をそれぞれ発現するワクシニア
または他のウイルスの混合物を多価ワクチン中に配合で
きる。
組換えウイルスが免疫化されるべき宿主に感染性であ
ろうとなかろうと、不活化ウイルスワクチン製剤を調製
できる。不活化ワクチンはそれらの感染力が通常は化学
処理（例えばホルムアルデヒド処理）により破壊されて
いるという意味において「死んだ」ものである。理想的
には、ウイルスの感染力をウイルスの免疫原性を担持す
るタンパク質を損なうことなく破壊する。不活化ワクチ
ンを調製するには、PBOMP関連タンパク質またはポリペ
プチドを発現する組換えウイルスを大量に培養増殖させ
て必要量の関連抗原を得なければならない。種々のエピ
トープを発現する不活化ウイルス混合物を用いて「多
価」ワクチンを製剤することもできる。ある場合におい
ては、一緒に投与される生ウイルスの相互干渉による難
点の可能性ゆえに、これらの「多価」不活化ワクチンの
方が生ワクチン製剤よりも好ましいであろう。何れの場
合においても、不活化組換えウイルスまたはウイルス混
合物は適当なアジュバント中に製剤化して抗原に対する
免疫学的応答を増強しなければならない。適当なアジュ
バントには、それらに限定しないが、界面活性物質、例
えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステ
ル、オクタデシルアミン、リゾレチシン、ジメチル−ジ
オクタデシルアンモニウムブロマイド、N.N−ジコクタ
デシル−Ｎ′,N−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパ
ンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、お
よびプルロニックポリオール；ポリアミン、例えばピラ
ン、硫酸デキストラン、ポリIC、ポリアクリル酸、カル
ボポル；ペプチド、例えば、ムラミルジペプチド、ジメ
チルグリシン、タフトシン；油乳濁液；およびミネラル
ゲル、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム
等が包含される。
5.7.3 受動免疫および抗イディオタイプ抗体 ウイルスまたはサブユニットワクチンで能動免疫する
代わりに、H.インフルエンザエのエピトープに対し予め
形成された抗体を投与することにより宿主に短期防御を
付与することが可能である。即ち、ワクチン製剤を用い
て受動免疫療法に用いる抗体を生産できる。異種イムノ
グロブリンは外来性免疫原成分に対する免疫応答を誘発
しうるため、ヒト用の医薬においてはヒトイムノグロブ
リンが好ましい。かかる受動免疫化は、特定の危険に曝
された未免疫化個体、例えば細菌性髄膜炎患者と接触し
た小児を直ちに防御するための緊急措置として使用でき
よう。あるいは、これらの抗体を用いて抗イディオタイ
プ抗体を生産でき、次にこれを抗原として用いてH.イン
フルエンザエPBOMPエピトープに対する免疫応答を促進
することができる。
5.8 診断アッセイ 本発明の更に別の目的は、H.インフルエンザエ感染が
疑われる個体の種々の体液中におけるPBOMP抗原（従っ
てH.インフルエンザエ）を検出するための診断アッセイ
用試薬を提供することである。
5.8.1 イムノアッセイ この態様の１つの様式においては、本発明のPBOMP関
連タンパク質およびペプチドを血液、脊髄液、痰等を包
含するがそれらに限定されない種々の患者の組織および
体液中のH.インフルエンザエの検出のためのイムノアッ
セイにおける抗原として使用できる。
本発明の抗原は少数例をあげればラジオイムノアッセ
イ、ELISAアッセイ、「サンドイッチ」アッセイ、沈降
反応、ゲル拡散沈降反応、免疫核酸アッセイ、凝集アッ
セイ、蛍光イムノアッセイ、タンパク質Ａイムノアッセ
イおよび免疫電気泳動アッセイを包含するがそれらに限
定されない当業上知られた任意のイムノアッセイ系に使
用できる。
5.8.2 核酸ハイブリダイゼーションアッセイ 本実施態様の別の様式においては、本発明のPBOMP関
連タンパク質およびペプチドをコードする遺伝子の新規
ヌクレオチド配列を核酸ハイブリダイゼーションアッセ
イにおけるプローブとして用いて、血液、脊髄液、痰等
を包含するがそれらに限定されない種々の患者体液中の
H.インフルエンザエの検出を行なうことができる。
本発明のヌクレオチド配列は、サザンブロット（Sout
hern,1975,J.Mol.Biol.98:508）；ノーザンブロット（T
homas等,1980,Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 72:5201−0
5）；コロニーブロット（Grunstein等,1975,Proc.Nat′
l.Acad.Sci.USA 72:3961−65）等を包含するがそれらに
限定されない知られた任意の核酸ハイブリダイゼーショ
ンアッセイ系において使用できる。
以下の連続する実施例は説明を目的として提示したの
であり、本発明の範囲を制限するためのものではない。
６ 実施例：天然および組換えDNA由来PBOMPの単離およ
び特性決定 6.1 PBOMP−１の単離、精製および分析 一連の実験において、他の細胞壁成分を実質的に含ま
ないPBOMP−１を以下のようにしてH.インフルエンザエ
から得た。
H.インフルエンザエEaganを10μg/mlヘミンおよび１
μg/ml NADを含有する脳心臓進出培地（BHI−XV）また
はmMIC（Heriott等の変法,1970,J.Bacteriol.101:513−
16）培地上で一夜増殖させた。４℃で15分間10,000×ｇ
で遠心分離した後、上清をRocal IITM殺菌剤中に捨て
た。細胞ペレットを秤量し、10mM HEPES−NaOH（pH7.
4）,1mM EDTA中に懸濁させ、その際の緩衝液の容量は細
胞湿潤重量の約５倍とした。次に細胞懸濁液をパルス設
定60％パワーでBranson 350型音波細胞破砕機（Branson
Sonic Power,Danbury,CT）を用いて100mlずつ氷浴内で
５分間音波処理した。音波処理後、破砕された細胞懸濁
液を４℃で５分間10,000×ｇで遠心分離し、未破壊細胞
を除去した。次に沈降した未破壊細胞を秤量し、前回の
ように、未破壊細胞の湿潤重量の約５倍に等しい容量の
10mM HEPES−NaOH pH7.4,1mM EDTA中で再度音波処理し
た。充分な量のNaClを添加して最終濃度0.5M NaClと
し、破砕細胞物質を約１時間100,000×ｇで超遠心後に
総膜フラクションがペレットとして得られた。
次に、10mM HEPES−NaOH,pH7.4中１％サルコシルを用
いて総膜フラクションを反復抽出することにより総膜フ
ラクションから内層膜成分を除去することにより、外層
膜−細胞壁複合体を得た。外層膜細胞壁フラクションを
含有する不溶性残留物を30分間350,000×ｇで遠心分離
して単離言し、50mMトリスpH8.0,5mM EDTA中に懸濁し、
そして４℃で一夜保存した。
PBOMP−１細胞壁複合体はオクチルグルコシド（２
回）次いでサルコシル（２回）を用いて外層膜−細胞壁
フラクションを続けて抽出することにより外層膜フラク
ション中の他のタンパク質の残りから単離した。両界面
活性剤は50mMトリス,5mM EDTA,pH8.0中１％（w/v）で用
いた。抽出は室温（20℃）でそれぞれ30分間行なった。
次に混合物を１時間100,000×ｇで遠心分離した。オク
チルグルコシドおよびサルコシルで抽出した後に残留す
る不溶性沈降物質がPBOMP−！細胞壁複合体である。
PBOMP−１の次の２つの方法、即ち（１）数種類の界
面活性剤のうちの１つの存在下で１時間60℃に加熱する
か、または（２）界面活性剤の存在下または非存在下、
１時間37℃のリゾチーム消化による細胞壁破壊により可
溶化した。（１）または（２）の何れかの後、15℃で１
時間100,000×ｇで遠心分離することにより不溶性物質
から可溶性PBOMP−１を分離した。（１）および（２）
の何れにおいても選択された特性の界面活性剤が可溶化
にとって決定的に重要である。事実、今日まで試験した
全界面活性剤（デオキシコレート、トリトンＸ−100TM,
ツイーン80,CHAPS,CHAPSO,ドデシルマルトシド、zwitte
rgent 3−14TM,zwittergent 3−16TMが包含される）が
熱依存性可溶化のみならずリゾチーム誘導可溶化におい
て有効である。更に、オクチルグリコシドはリゾチーム
誘導体可溶化に非常に効果的であり、通常最終濃度１％
（w/v）で用いられた、湿潤重量40gの細胞から、典型的
には、他の細胞壁成分を実質的に含まないPBOMP−１が
約8mg単離できた。この実質的に純粋なPBOMP−１調製物
を、SDS−PAGE系で分析してこのタンパク質の還元変性
型の相対分子量を測定し、その純度を評価した（図
１）。
試料は、５×濃縮試料緩衝液を用い0.1Mトリス塩酸,p
H7.0,15mMジチオトレイトール、および２％SDSとなるよ
うに調整したのち、100℃で５分間加熱することによ
り、SDS−PAGE用に調製した。電気泳動に先立ち全試料
を６％（w/v）スクロールおよび0.001％ブロモフェノー
ルブルーとなるように調整した。最もルーチンな分析は
Bio−Rad Mini Protean Gel System（Redmond,CA）を用
いて行なった。ゲル厚みは1.5mmであり、そして分離用
ゲルはアクリルアミドとbisの比が30:0.8で15％アクリ
ルアミド、0.375Mトリス塩酸（pH8.8）および0.1％SDS
を含有した。試料添加用ゲルはアクリルアミドとbisの
比が同様の4.8％アクリルアミド,125mMトリス−HCl（pH
7.0）および0.1％SDSをゲル当り含有した。電気泳動の
後、ゲルをエタノール：酢酸：水（5:1:5）中0.125％
（w/v）クーマシーブルーで少なくとも１時間染色し、
ブルー染料を含有しない同じ溶媒系で汚れを落とした。
予め染色した低分子量標準物質：オバルブミン,43,000;
アルファキモトリプシノーゲン,25,700;ベータ−ラクト
グロブリン,18,400;リゾチーム,14,300;ウシトリプシン
インヒビター,6,200;インスリン（ＡおよびＢ鎖）,2,30
0および3,400（BRL,Bethesda,MD）を用いてPBOMP−１の
相対分子量測定の助けとした。
PBOMP−１のこれ以上の精製は、イオン交換クロマト
グラフィー、分子ふるい法、疎水制または逆相クロマト
グラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動等
のような標準的な方法で行なうことができる。
6.1.1 アミノ酸組成および配列によるPBOMP−１の特性
決定 Simpson等の方法（1976,J.Biol.Chem.251:1936−194
0）に従ってアミノ酸分析を行なった。0.5〜1mgのタン
パク質を厚壁密封ガラス管中、真空下、4Nメタンスルホ
ン酸0.1ml中100℃で22時間加熱することにより加熱分解
を行なった。各アミノ酸の量は、標準アミノ酸の既知量
を用いて得られた面積と種々のピークの下部面積を比較
することにより得られた。得られた結果を表１に示す。
表 １ PBOMP−1aのアミノ酸組成 アミノ酸残基 数 アスパラギン酸（Asp＋Asn） 15 トレオニン 6 セリン 7 グルタミン酸（Glu＋Gln） 12 プロリン 3 グリシン 18 アラニン 19 システイン 1 バリン 10 メチオニン 0 イソロイシン 4 ロイシン 11 チロシン 13 フェニルアラニン 4 リジン 8 ヒスチジン 2 アルギニン 7 トリプトファン 0 ａ PBOMP−１の見かけの分子量は15,057ダルトンであ
った。アミノ酸残基の総数は140であった。
最初にエドマン法を用いてPBOMP−１の配列決定を行
なったが、ブロックされたＮ末端が原因で満足できる結
果が得られなかった。部分的なアミノ酸配列の情報を得
るために、タンパク質分解酵素を用いて分子量16,000ダ
ルトンのPBOMPを酵素的に消化して配列分析を行い易い
ペプチドフラグメントを得る必要があった。
27℃で１時間トリプシンを用いて得られた、16,000ダ
ルトンPBOMP−１のタンパク質分解的消化物をC18カラム
を用いた逆相高圧液体クロマトグラフィー（RP−HPLC）
により分離した。大きな疎水性ペプチドピーク（T9）を
単離し、次にポリブレンコーティングガラス繊維紙上に
固定化した後にアミノ酸配列決定を開始した。
T9ペプチドはエドマン分解（Edman等,1967,Eur.J.Bio
chem.1:80−91）により配列決定した。シークエネータ
ーの各サイクルからアニリノチアゾリノンフェニルチオ
ヒダントイン（PHT）−アミノ酸が生成した。分析は液
体クロマトグラフィー系を用いて逆相C18 HPLCカートリ
ッジカラム上で行なった。PTHは酢酸ナトリウム−アセ
トニトリル濃度勾配を用いて室温で溶離し、そして可変
式UV波長検出器を用いて270nmで検出した。
T9ペプチドの配列分析を以下に示す。
T9ペプチドは芳香族アミノ酸８個（5 tyr,3 Phe）お
よび脂肪族側鎖アミノ酸５個（1 Leu,2 Val,2 Ile）を
含有し非常に疎水性が高い。このペプチドのチロシン含
有量は高いが、PBOMP−１の総アミノ酸組成と合致する
（表１）。更に、PBOMP−１はチロシン13個を含有する
メチオニンもトリプトファンも含有しない点において特
殊である。
6.1.2 脂肪酸分析によるPBOMP−１の特性決定 6.1.1節に示したとおり、エドマン分解による最初のP
BOMP−１配列決定では、ブロックされたＮ末端残基が原
因で満足できる結果が得られなかった。精製H.インフル
エンザエPBOMP−１の脂肪酸分析を行なって、共有結合
した脂肪酸アシル基がPBOMP−１プチド上で同定できる
かどうかを調べた。
脂肪酸分析に先立ち、上記6.1節に記載したようにし
て単離したPBOMP−１タンパク質を有機溶媒混合物即ち
クロロホルム：メタノール（2:1）、およびデオキシコ
レート界面活性剤で充分に抽出しつくし、内因性脂質、
リン脂質等の痕跡量の混入物すべてを除去した。アセト
ン沈降によるか、または充分透析後に凍結乾燥すること
により裸のペプチドが得られた。既知量のノナデカン酸
を内部標準物質として乾燥精製PBOMP−１（１−3mg）に
添加し、そしてこの混合物を窒素雰囲気下で4N塩酸200
μｌを用いて110℃で４時間加水分解した。かかる酸化
水分解によりアミド−またはエステル−結合脂肪酸が放
出された。加水分解物を水で2mlに希釈し、これを等容
量のヘキサンで３回抽出した。ヘキサン層を合わせ、等
容量の食塩水で２回洗浄し、そして次に硫酸ナトリウム
で乾燥した。この脂肪酸をジアゾメタンを用いて相当す
るメチルエステルに変換（Schlenk,1960,Anal.Chem.31:
1412−1414）した後に、Perkin Elmer 8500型ガス−液
体クロマトグラフィー装置に注入した。脂肪酸メチルエ
ステルの分離はSPB−１融合シリカキャピラリーカラム
（Supelco,Inc.,Belefonte,PA）上で行なった。生成す
るピークを既知標準物質と比較することにより同定し
た。得られた結果を図16に示す。
図16に示すとおり、３種類の主要脂肪酸、即ちラウリ
ル酸（C12）、パルミチン酸（C16）およびまだ明確に同
定されていないパルミチン酸誘導体（C16′）がPBOMP−
１に結合している。C16′は恐らくは炭素原子16個を有
する分岐鎖脂肪酸であろう。
6.2 抗PBOMP−１および抗PBOMP−２抗体の調製 6.2.1・ポリクローナル抗体PBOMP−１および抗PBOMP−
２抗血清の調製 実質的に純粋なPBOMP−１を免疫原として用いて抗PBO
MP−１抗体を調製した。6.1節に記載したようにして調
製した部分調製PBOMP−１富化フラクションを10℃、35m
A定電流で15％SDS−PAGEゲル上で電気泳動した。タンパ
ク質バンドを固定しそして6.1.1節に記載のようにして
染色した。PBOMP−１バンドをゲルから切り取り、リン
酸塩緩衝食塩水（PBS）（20mMリン酸ナトリウム、150mM
NaCl,pH7.4）で平衡となるまで透析した。PBOMP−１を
含有するアクリルアミドゲルフラグメントをPBS中25ゲ
ージ針に通すことにより細断した。フラグメントをニュ
ージーランド白ウサギに多重部位で筋肉内注射した。各
ウサギには総量で約20μｇのPBOMP−１を投与した。最
初の免疫化の２週間後および３週間後に再度免疫化し
た。最終免疫化の１週間後に供試動物から採血し、血清
を回収した。供試動物には２か月に１度、ブースターと
してアクリルアミド中のPBOMP−1 20μｇを与えて高力
価の抗PBOMP−１抗体を維持した。
別法として、5.1筋に記載したようにして単離したPBO
MP−１をフロインド不完全アジュバントと混合し、乳化
した。フロインドアジュバント中のPBOMP−１約20μｇ
をウサギに筋肉内注射した。最初の免疫化の２週間後お
よび３週間後に供給動物を再度免疫化し、最終免疫化の
１週間後に採血した。
実質的に純粋なPBOMP−２を免疫原として用いて抗PBO
MP−２抗体を調製した。6.1節に記載したようにして調
製した部分精製PBOMP−２富化フラクションを10℃、35m
A定電流で、15％SDS−PAGEゲル上で電気泳動した。タン
パク質バンドを固定し、6.1.1節に記載のようにして染
色した。PBOMP−２バンドをゲルから切り取り、リン酸
塩緩衝食塩水（PBS）で平衡となるまで透析した。PBOMP
−２を含有するアクリルアミドゲルフラグメントをPBS
中25ゲージ針を通過させることにより細断した。この細
断したPBOMP−２ゲルフラグメントをフロインド完全ア
ジュバントと混合し、乳化した。フロインドアジュバン
ト中のPBOMP−２約10μｇをウサギ筋肉内注射した。供
試動物には、最初の接種の４週間後に、フロインド不完
全アジュバント中の同じ調製物10μｇをブースターとし
て与えた。
6.2.2 抗PBOMP−１および抗PBOMP−２モノクローナル
抗体の生産 PBOMP−１またはPBOMP−２に対する抗体を分泌するハ
イブリドーマ細胞系は以下に記述するようにしてマウス
ミエローマ細胞系X63.Ag8.6543とH.インフルエンザエで
免疫化したC57/B1マウスから得られた脾細胞との細胞融
合により得られた。即ち、雌C57/B1マウスにH.インフル
エンザエS2株細胞１×106個を２か月にわたり４回腹腔
内注射した。３か月後、6.2.1節に記載のSDS−PAGEバン
ドから単離された実質的に純粋なPBOMP−１またはPBOMP
−２でマウスを免疫化した。１か月後、S2からの全外層
膜をマウスに静脈注射した。細胞融合は、当業者に知ら
れている標準的な方法により静脈内注射後第４日目に行
なった（例えばGefter等,1977,Somat.Cell.Genet 3:231
−36参照）。
ハイブリドーマ細胞培養液上清は、H.インフルエンザ
エ外層タンパク質を抗原として用い標準ELISAによりス
クリーニングした。アッセイは４℃で一夜OMPコーディ
ングした96ウェルポリスチレンプレートを用いて行なっ
た。
プレートを、40mMトリス（pH8.0）,150mM NaCl,5％脱
脂ドライミルク（BLOTTO）でブロックし（6.4.4筋参
照）、PBS/0.1％ツイーン20で洗浄した。PBS/ツイーン2
0で1:10に希釈した培養上清を添加し、25℃で60分間イ
ンキュベートしそして前記と同様に洗浄した。結合され
た抗体はアルカリホスファターゼ−ヤギＦ（ab′）２抗
マウス（IgG,IgM）およびアルカリホスファターゼ基質
を用いて検出した。次に陽性の上清を、精製PBOMP−
１、E.コリOMPおよびS2リポ多糖（LPS）を用いるドット
ブロット分析によりスクリーニングした。所望のハイブ
リドーマを限界希釈法（McKearn,1980,「Monoclonal An
tibodies」,Kennett,McKearnおよびBechtol編、Plenum
Press,p.374）により再クローニングしそしてHib OMPを
用いるウエスタンブロットによりスクリーニングした。
選択されたハイブリドーマを標準的な方法により腹水と
して増殖させるためにBalb/cマウスに注射した（Brodeu
r等,1984,J.Immunol.Meth.71:265−72）。
マウスエミローマ細胞をPBOMP−２で免疫化したC7/B1
マウスの脾細胞と融合させることにより生成した17のハ
イブリドーマを、標準ELISAアッセイを用いてPBOMP−２
に対する反応性に関してスクリーニングした。61−１で
表示される１ハイブリドーマはPBOMP−２に特異的であ
ることが解った。一次抗体として61−１を用いる後記6.
5.5節のウエスタンブロット法では、PBOMP−２またはPB
OMP−２様タンパク質は３種類の臨床的な非類型的H.イ
ンフルエンザエ株,0045E,1939およびHST31において保存
され発現されることが示された（図29参照）。
6.3 抗PBOMP−１およびPBOMP−２抗体のE.コリとの反
応性 抗PBOMP−１およびPBOMP−２抗血清の反応性のウエス
タンブロット分析は後述する6.4.4節に記載されるよう
にして実施された。２−メルカプトエタノールを含有す
る試料調製緩衝液中で溶解した一夜細菌培養物10μｌを
15％SDS−PAGEゲルの各レーンに適用した。電気泳動、
およびニトロセルロースに移行させた後、ブロットをウ
サギポリクローナル抗PBOMP−１の1:250希釈物で探索し
た。セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ
IgG（Kirkegaaed ＆ Perry Laboratories,Gaithersbur
g,MD）とインキュベートしたところ、抗PBOMP−１抗血
清はヘモフィルス中のPBOMP−１およびE.コリ中の18000
ダルトンタンパク質を認識することが示された（図2
A）。
PBOMP−１のエピトープがE.コリの18000ダルトンタン
パク質と交差反応することを認識するために、PBOMP−
１に対して調製されたモノクローナル抗体をE.コリタン
パク質に対する反応性に関しスクリーニングした。スク
リーニングされた殆どのモノクローナル抗体はE.コリと
反応できなかったが、モノクローナルGl−ｌで示される
１つのクラスのモノクローナル抗体はヘモフィルスのPB
OMP−１およびE.コリ中の18000ダルトンタンパク質と強
力に反応した（図2B）。このことは、PBOMP−１上に存
在する少なくとも１つのエピトープがE.コリタンパク質
上のエピトープと交差反応することを示している。これ
は、H.インフルエンザエPBOMP−１に対する対血清もま
た、いくつかのE.コリ感染から防御しうることを示して
いる。抗PBOMP−２モノクローナル抗体61−１は、E.コ
リからの約15000ダルトンのタンパク質と弱く交差反応
することは示されたが、PBOMP−１とは何ら検出可能な
交差反応性を示さなかった。
6.4 組換えプラスミド調製に用いられる一般的操作 6.4.1 制限酵素消化の条件 制限エンドヌクレアーゼはBRL（Bethesda,MD）,IBI
（New Haven,CT）、New England Biolabs（Beverly,M
A）またはUS HBiochemical Corporation（Cleveland,O
H）から購入した。
制限酵素消化は、適切な制限緩衝液中にDNAを懸濁
し、制限エンドヌクレアーゼを添加しそして完全な消化
を確保するに適切な時間インキュベートすることにより
行なった。酵素１単位は、全反応混合物20μｌ容量中で
１時間ファージラムダDNA1.0μｇを完全に消化するのに
必要な量として定義される。種々の酵素と一緒に使用し
た緩衝液を以下に列挙する。
Cla I,Hpa I,Hpa IIおよびKpn I消化に用いられた低
塩緩衝液は、10mMトリス（pH8.0）,10mM MgCl2および10
mMジチオトレイトール（DTT）を含有した。
Alu I,Ava I,EcoR II,EcoR V,Hae II,Hae III,Hinc I
II,Hind III,Pst I,Sau3A I,Sph I,Sst I,Sst II,Taq I
およびXho I消化に用いられた中塩緩衝液は、50mMトリ
ス（pH8.0）,10mM MgCl2,50mM NaClおよび10mM DTTを含
有した。
BamH I,EcoR I,Pvu I,Sal IおよびXba I消化に用いら
れた高塩緩衝液は、50mMトリス（pH8.0）,10mM MgCl2,1
50mM NaClおよび10mM DTTを含有した。
Sma I消化に用いられた緩衝液は、10mMトリス（pH8.
0）,20mM KCl,10mM MgCl2,および10mM DTTを含有した。
Sca I消化に用いられた緩衝液は100mM NaCl,10mM トリ
ス−HCl（pH7.4）;10mM MgCl2および1mM DTTを含有し
た。制限消化は、60℃で行なったTaq Iを除いて、全て
の酵素が37℃で行われた。
6.4.2 DNAフラグメントのゲル精製 制限酵素消化後、種々の大きさのDNAフラグメント
を、10ボルト/cmで、50mMトリス酢酸塩1mM EDTA緩衝液p
H7.8を用いた低融点アガロース（FMC LGTアガロース）
中のゲル電気泳動を用いて分離精製した。アガロース濃
度は回収するべきフラグメントの大きさに応じて0.8％
〜1.5％まで変化させた。DNAバンドをエチジウムブロマ
イド蛍光により可視化し、ゲルから切り出した。65℃で
アガロースゲルを融解させ、４容の0.65M NaCl,10mMト
リス（pH8.0）,1mM EDTAを添加して混合物の最終濃度を
0.5M NaClとし、0.5M NaCl,10mMトリスpH8.0,1mM EDTA
（負荷解消液）で平衡としたNACSカラム（BRL,Bethesd
a,MD）にDNAを負荷し、カラムを３〜５容の負荷緩衝液
で洗浄しそして２〜３容の2M NaCl,10mMトリス8.0,1mM
EDTAで溶離することによりDNAを回収した。DNA溶出液を
二回蒸留水で1:1に希釈しそして３容のエタノールで沈
殿させた。ペレットを70％エタノールで洗浄し、真空乾
燥しそして1mM EDTAを含有するpH7.5の10mMトリスHCl緩
衝液（TE緩衝液）中に再懸濁した。
6.4.3 DNA連結 全ての連結はT4 DNAリガーゼを用いて行なわれた。T4
DNAリガーゼはBRL（Bethesda,MD）,United States Bio
chemicals（Cleveland,OH）またはBoehringer（Indiana
polis,IN）から購入した。T4 DNAリガーゼの１単位
（Ｕ）は、５′−DNA末端濃度0.12μＭ（300μg/ml）で
リガーゼ緩衝液20μｌ中、16℃で30分間にバクテリオフ
ァージラムダDNAのHind IIIフラグメントの50％連結を
生ずるに要する量として定義される。DNA連結は、50mM
トリス（pH7.5）,10mM MgCl2,10mM DTT,1mMアデノシン
トリホスフェートよりなるリガーゼ緩衝液中で行なわれ
た。通常は、20〜30μg/mlの範囲のDNA濃度およびベク
ター対挿入物モル比1:1が用いられた。T4 DNAリガーゼ
は20μｌ反応容量に対し1Uの割合で添加した。インキュ
ベーションは18〜24時間行なった。粘性末端連結は15
℃、ブラント末端連結は22℃で行なった。充分な物質量
が入手しうる場合は、アガロースゲル電気泳動により反
応混合物の一部を分析することにより連結を検査した。
6.4.4 タンパク質イムノブッロト分析（ウエスタンブ
ロット） タンパク質をニトロセルロースシートに固定し、個々
の用途に応じて種々の方法によりイムノブロット分析を
行なった。直径8.1cmの滅菌ニトロセルロースディスク
を直径10cmのファージタイタープレート上に穏やかに重
ねあわせることによりファージプラークを寒天プレート
に移した。シートを充分湿潤させ、滅菌針でフィルター
を穿刺することにより位置をマークしそして２分後にフ
ィルターを持ちあげた。
細菌コロニーをニトロセルロースシートに移し、シー
トを栄養寒天上に（コロニー側を上にして）４〜６時間
重ねることによりコロニーを成長させそしてシートをク
ロロホルム蒸気に30分間曝露してコロニーを溶解させる
ことによりコロニーブロットを行なった。分析すべきタ
ンパク質混合物を分有するSDS−PAGEをニトロセルロー
スシート上に重ね、25bmMトリス0.38MグリシンpH8.8緩
衝液中0.5Aで14時間Hoeffer Transphor装置中で水平電
気泳動を行うことにより、タンパク質ゲルを移行させ
た。
ひとたびタンパク質の移行が完了すると、コロニーブ
ロットを除く全ての場合において、50mMトリス（pH8.
0）,150mM NaCl,5％脱脂ドライミルク（BLOTTO）中にフ
ィルターを37℃で１時間浸漬した。コロニーブロットの
場合は、1mg/mlリゾチームを含有するBLOTTO中に４℃で
一夜フィルターを浸漬して細胞屑を消化した。次にフィ
ルターにBLOTTO中の適切な希釈度（試行錯誤で決定）の
第１の抗体プローブを37℃で３時間吸着させ、BLOTTOで
15分間３回洗浄し、BLOTTO中1:500の希釈度のセイヨウ
ワサビペルオキシダーゼ接合第２抗体（Kirkegaard and
Perry,Gaithersburg,MD）を37℃で１時間吸着させ、そ
してBLOTTOで３回15分間ずつ洗った。フィルターを50mM
トリス（pH7.0）,150mM NaCl,0.01％過酸化水素中に入
れ、メタノール中の0.06％４−クロロ−１−ナフトール
（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）を添加した。20分
内に青色が発色しない場合は、反応は陰性とみなされ
た。フィルターを蒸留水中に入れ、吸水乾燥することに
より反応を停止させた。
6.4.5 遺伝子融合 PBOMPタンパク質またはそのプチドをコードする遺伝
子または遺伝子フラグメントの他の遺伝子、例えばアル
カリホスファターゼ（PhoA）をコードする遺伝子との融
合は、ManoilとBeckwith（1985,Proc.Nat′l.Acad.Sci.
USA.82:8129−8133）記載のようにして行なった。天然P
hoA遺伝子欠失があり、Ｆプライムプラスミド上のTn5の
左側末端反復配列に挿入されたプロモーターおよび膜輸
送シグナル配列の両方を欠いたアルカリホスファターゼ
遺伝子を含有するトランスポゾンTn5の誘導体（TnPho
A）を担持するE.コリ株に組換えプラスミドを導入し
た。それゆえ、活性アルカリホスファターゼ酵素の生産
には、PhoA遺伝子が膜輸送シグナルペプチドが含有する
活性に転写された遺伝子内に枠内融合される様式でのTn
PhoAのトランスポジョションが必要である。かかるトラ
ンスポジションは、40μg/ml 5−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルホスフェート（XP,Sigma Chemical Co.,
St.Louis,MO）の存在下で細胞を培養することにより検
出した。この染料の存在下では、活性アルカリホスファ
ターゼ酵素を生産するコロニーは、強い青色を呈するの
に対し、活性アルカリホスファターゼ欠損コロニーは白
色を呈する。
6.4.6 DNAフィルターハイブリダイゼーション分析（サ
ザンブロット） DNAフィルターハイブリダイゼーション分析はSouther
nの方法（1975,J.Mol.Biol.98:508）に従って実施し
た。フィルターハイブリダイゼーションで分析すべきDN
Aを適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして90m
Mトリス−ホウ酸塩,8mM EDTA緩衝液および10ボルト/cm
を用いて0.8％アガロース（SeaKem Portland,ME）中で
のアガロースゲル電気泳動により分離した。ゲルを1.5M
NaCl/0.5M NaOH中に１時間浸漬することによりゲル中
のDNAを変性させ、そして1.5M NaCl/1.0Mトリス−HClに
１時間浸漬させることにより中和した。変性DNAをブロ
ッティングによりニトロセルロース濾紙に移行させた。
DNA移行の後、フィルターを6X SSC（１当りNaCl 175.
5gおよびクエン酸ナトリウム88.2gを含有する20X SSC貯
蔵液を希釈した調製）を洗浄し、風乾した。真空下に80
℃で２時間ベークすることによりDNAフラグメントをフ
ィルターに固定した。
DNAハイブリダイゼーションプローブは、Rigby等の方
法（1977,J.Mol.Biol.,113:237−244）に従ってニック
トランスレーションにより調製した。プローブ用DNA
（１−２μｇ）をニックトランスレーション緩衝液（50
mMトリス−HCl,pH7.4,10mM MgSO4,10mM DTT,5μg/mlウ
シ血清アルブミン、および各々20μｍのdGTP,dCTPおよ
びdTTP）100μ中に溶解した。この反応混合物に100μ
Ciのアルファ32P−dATP（Amersham,2−3000 Ci/ミリモ
ル）、1.0ngのデオキシリボヌクレアーゼＩ（Sigma Chm
ical Co.,St.Louis,MO）および10UのE.コリDNAポリメラ
ーゼＩ（Boehringer）を添加しそしてこの混合物を45分
間15℃でインキュベートした。50mMになるまでEDTAを添
加し、60℃で10分間加熱して酵素を不活化することによ
り反応を停止させた。３容のエタノールを添加すること
により標識DNAを沈殿させ、0.3M酢酸アンモニウム（NH4
OAc）50μｌ中に再懸濁した。0.3M NH4OAcで平衡とした
1ml Biogel P−50スピンカラムに試料を負荷しそして50
0×ｇで５分間遠心分離することにより溶離させた。カ
ラムを0.3M NH4OAc 100μｌで洗浄し、溶出液を合わせ
て３容エタノールを用いて沈澱させた。標識DNAペレッ
トを真空乾燥し、TE緩衝液に再懸濁しそして放射能の取
り込みをCherenkov散乱によりBeckman（LS9000）シンチ
レーションカウンターで計数した。
ハイブリダイゼーションには、DNAが結合されたフィ
ルターを6X SSCで湿潤させ、6X SSC/0.5％SDS/5X Denha
rdt溶液/100μg/ml tRNAと２時間68℃で予備ハイブリダ
イズさせてフィルター上の余分な結合容量をブロックし
た（1X Denhardt溶液は水中の0.02％Ficoll,0.02％ポリ
ビニルピロリドン,0.02％ウシ血清アルブミンであ
る）。ハイブリダイゼーション反応は0.01M EDTAおよび
５−10,000,000CPM（Cherenkov）標識プローブが添加さ
れた同じ緩衝液中で行なった。プローブ溶液を負荷に先
立ち10分間90℃に加熱してDNA鎖を変性させ、68℃に冷
却しそして18〜24時間68℃でフィルターとインキュベー
トした。ハイブリダイゼーション後、0.1×SSC/0.5％SD
Sを数回交換しながら68℃でフィルターを洗浄すること
により非特異的に結合したプローブを除去した。用いら
れた条件下では、90％またはそれ以上のDNA相同物がDNA
プローブの陽性結合を示した。フィルターを風乾し、Du
pout CRONEX Lightning Plus′増感スクリーンを用いて
−70℃でKodak XARフィルムに露出させた。
6.5 H.インフルエンザエPBOMP遺伝子のクローニング PBOMP遺伝子をクローニングするためのH.インフルエ
ンザエ染色体DNA源はH.インフルエンザエKW20b（HiKW20
b）、即ち菌株がｂ−Eagan由来のDNAによりｂ＋型に形
質転換されたHi非莢膜Rd株の誘導株（Moxon等,1984,Cli
n.Invest.73:298−306）またはH.インフルエンザエS2
（HiS2）、即ちHib Eaganの自然発生莢膜マイナス突然
変異体の何れかであった。
ファージラムダライブラリーを形成させるには、Hi由
来染色体DNAを剪断して平均の長さを約15000塩基対（b
p）とし、T4 DNAポリメラーゼでブラント末端となし、E
coR I DNAメチラーゼを用いて修飾し、合成EcoR Iリン
カーに連結しそして組換えラムダファージベクターChar
on4中にクローン化した。
プラスミドライブラリーを形成するためにはHi S2の
染色体DNAを、Sau3Aで部分的に切断し、このようにして
生成した３〜８キロベース（kb）の長さの制限フラグメ
ントを単離し、BamH I制限部位でプラスミドベクターpG
D103に連結した。このプラスミドはpLG339の誘導体であ
り（図３参照；また、Stoker等,1982,Gene 18:335−41
も参照）、６〜８コピー／細胞で担持される。これはま
たlacZ−アルファペプチドおよびプラスミドpUC8由来の
ポリリンカー領域を有しているため、適切なE.コリ株
（例えばJM83）に形質転換された場合は、Lac＋表現型
の欠損をスクリーニングすることにより組換えプラスミ
ドを選択できる。適切な方向でクローン化された場合
は、E.コリ中での発現の小さいクローン化遺伝子が強力
な調節されたLacプロモーターの制御下となる。モノク
ローナル抗体またはポリクローナル抗PROMP−１抗血清
のプールされた混合物を用いて組換えプラスミドを含有
するE.コリを、PBOMP生産に関してスクリーニングし
た。
6.5.1 Hiプラスミドライブラリーの作製 PBOMP−１タンパク質が発現されないかまたはラムダ
ファージと適合性を有しない可能性がある。これを調べ
るために、Hi S2のプラスミド染色体ライブラリーを作
製した。E.コリOMP遺伝子の高コピー数プラスミド上で
のクローニングは有毒であることが示されている（例え
ばBeck等,1980,Nucleic Acid Res.8:3011−3024）。こ
の問題を避けるために、低コピー数プラスミドpGD 103
を使用した（図３参照）。
Hi S2由来染色体DNAを制限エンドヌクレアーゼSau3A
（BRL,Bethesda,MD）で部分的に消化した。DNA 500μｇ
をSau3A 50単位を用い制限緩衝液5ml中で37℃で１時間
消化した。10mMトリス（pH8.0）,1mM EDTA,1M NaClを含
有する10〜40％スクロースの濃度勾配を用いBeckman SW
28ローター中24時間140,000×ｇで速度沈降によりフラ
グメントを分離した。2mlずつフラクションを採取し、
一部をアガロースゲル電気泳動で分析した。長さ３〜8K
bの制限フラグメントを含有するフラクションをプール
してTE緩衝液中で濃縮した。プラスミドpGD103 DNAをBa
mH Iエンドヌクレアーゼで消化し、仔ウシアルカリホス
ファターゼ（Boehringer,Indianapolis,IN）（１単位／
μg DNA,37℃×30分、制限緩衝液中）で処理した。フェ
ノール抽出およびエタノール沈殿により反応混合物から
DNAを精製し、TE緩衝液に再懸濁した。BamH IおよびSau
3A制限酵素は粘性末端を形成するため、連結前にこれ以
上DNAを処理する必要はなかった。
Hi S2−Sau3A消化DNAおよびpGD103/BamH I/CAP消化DN
Aのそれぞれ25μｇを25U T4リガーゼ（Boehringer,Indi
anapolis,IN）を含有する連結緩衝液500ml中で混合し15
℃で18時間インキュベートした。反応混合物のうち20μ
をアガロースゲル電気泳動で分析し、連結反応を検査
した（出発物質を隣のレーンで泳動させた）。次に連結
混合物をコンピテントE.コリJM83（Maniatis等,1982,Mo
lecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,p.25
0）に形質転換し、LB−ブロス中37℃で１時間インキュ
ベートしそして50μg/mlの硫酸カナマイシン（Sigma Ch
emical Co.,St.Louis,MO）および40μg/mlの５ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド（Ｘ−gal,BRL Bethesda,MD）を含有するLB−寒天
プレートに塗布し37℃で２時間インキュベートした。発
生したカナマイシン耐性（kanR）コロニーの約50％が白
色（Lac−）を呈し、このことはpGD103のlac領域のBamH
I部位にS2 DNAが挿入されたことを示している（Lac＋
非組換え体は青色）。白色コロニー10個を無作為に選択
し、増幅させたところ、ベクターBamH I部位での挿入を
有する、pGD103よりも４〜8Kb大きいプラスミドが含有
されていることが解った。
1525個の白色コロニーを採り、個々に増幅させ、そし
て96ウェルマイクロタイターデイッシュ中、18％滅菌グ
リセロールを含有するLBブロス中、−70℃で凍結保存し
た。
6.5.2 Hibラムダ遺伝子バンクの作製 Hi KW20b由来高分子量染色体DNAを200μg/mlの濃度で
TE緩衝液中で懸濁させ、25ゲージ針を通過させることに
より平均の長さ15000bpに剪断した。50mMトリス（pH8.
8）,10mM MgCl2,20mM（NH4）2SO4,10mM DTT,50μM dAT
P,dCTP,dGTPおよびdTTP中、T4 DNAポリメラーゼで37℃2
0分処理することにより突出末端を除去した。次に、100
mMトリス（pH8.0）,10mM EDTA,0.1mM S−アデノシルメ
チオニン中のEcoR I DNAメチラーゼ（1U/μg DNA）（BR
L Bethesda,MD）を用い37℃で３時間DNAを修飾した。DN
Aのメチル化は反応混合物から１μｇのDNAを取り出し、
未修飾のラムダDNA1μｇと混合しそしてEcoR I 5単位を
用いて高塩制限緩衝液20μｌ中37℃で１時間消化するこ
とにより検べた。これらの条件下では、修飾されたHi D
NAは消化されないが、添加したラムダDNAは完全に消化
される。
修飾Hi DNA 20μｇを、T4 DNAをリガーゼ（5U）を用
いて反応混合物100μｌ中で化学的に合成したEcoR Iリ
ンカー（BRL BEthesda,MD）１μｇに連結した。18時間
後、20分間60℃に加熱することにより反応を停止させ、
塩化ナトリウムを最終濃度150mMとなるまで添加し、そ
してこの混合物を10UのEcoR Iで６時間分解した。修飾H
i DNA＋リンカーを、上記したようなアガロースゲル電
気泳動により切断および未連結のリンカーから分離し
た。
調製したHi DNAを1:1:1のモル比で、ラムダCharonの
左右EcoR Iフラグメントと混合し、T4 DNAポリメラーゼ
を用い18時間連結した。連結したDNA混合物をインビト
ロパッケージング反応を用いてラムダファージ粒子内に
パッケージングした。水４μｌ中の連結DNA5μｇを７μ
ｌの20mMトリス（pH8）,10mM2−メルカプトエタノール
（２−ME）,3mM MgCl2,1μｌの10mMトリス,pH7.5,1mMス
ペルミジン、2mMプトレッシン、10mM MgCl2,1.5mM ATP,
5mM 2MEおよび５μｌのE.コリBHBS2690（−1 imm 434,c
Its,b2.red3,Eam 15,Sam7）分解物の超音波抽出物（Hoh
n等,1977,Proc.Nat′l.Acad.Sci.74:3259）に添加し
た。反応混合物を１時間22℃でインキュベートし、Beck
man SW 50.1ローター中3M〜5MのCsCl（10mMトリス（pH
7.5）,10mM MgCl2,0.02％ゼラチン（TMG緩衝液））段階
的濃度勾配で250,000×ｇで４時間遠心分離することに
よりパッケージングされたファージを分離した。ファー
ジを界面から取出してTMGで透析した。このようにして
調製したファージの力価判定したところ、Hiゲノムの独
立クローン25−30,000のライブラリーが生成したことが
解った。このファージライブラリーを、ファージ宿主と
してE.コリKH802を用いてプレート増幅させることによ
り増幅させて10-9プラーク形成単位（PFU）/mlのファー
ジ懸濁得5mlを得た。
6.6 PBOMP遺伝子の単離 6.6.1 PBOMP−１に対するモノクローナル抗体と反応す
るタンパク質をコードするPBOMP遺伝子の単離 HiプラスミドライブラリーをLB−カナマイシン（50μ
g/ml）寒天上のニトロセルロースシートに移し、37℃で
24時間成長させ、プローブとしてPBOMP−１に対する５
種類の非競合モノクローナル抗体の混合物を使用するフ
ロニーブロット法で分析した。混合モノクローナル抗体
プローブに反応したクローンを単離してプラスミドをpA
A152と命名した。図４はベクターpGD103の4.2Kb Hi DNA
挿入物を含有するpAA152の制限地図である。ウエスタン
ブロット分析によればクローンpAA152がポリクローナル
抗PBOMP−１によっておよびプールしたモノクローナル
抗体プローブによっても認識される16000ダルトンのタ
ンパク質を発現することが示された。その後クローンpA
A152は、最初のプールで用いた個々のモノクローナル抗
体のそれぞれにより認識されるタンパク質を生産するこ
とが示された（図５）。
pAA152のSau3A挿入物は、挿入物の一端でポリリンカ
ー領域のBamH I部位を生成したことがわかった。このBa
mH I部位からHi DNAの非反復Bgl II部位または非反復Xb
a I部位までの欠失により、ウエスタンブロットで検出
されるPBOMPの発現が消失した。ポリリンカーのHinc II
部位からHi挿入物DNAのXba IまたはBal II部位の何れか
までの欠失ではPBOMP発現は温存された（図４）。これ
らの結果から、このPBMPをコードする遺伝子は、pAA152
のHi DNA挿入物内のBal II−BamH I 737塩基対フラグメ
ント内に存在すると結論される。pAA152を担持するミニ
細胞（Achtman等,1979,Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA.76:4
837−41）の分析によれば、クローン化Hi DNAはそれぞ
れ16000および40000ダルトンの分子量を有する２つのタ
ンパク質をコードすることが示された（図６）。JM83
（pAA152）のウエスタンブロットでは、PBOMPに対して
調製されたモノクローナル抗体をプールしたものは1600
0ダルトンタンパク質と反応することが示される。40,00
0ダルトン分子量の領域内では何ら交差反応はみとめら
れない。
6.6.2 ポリクローナル抗体PBOMP−１抗血清と反応する
タンパク質をコードするPBOMP遺伝子の単離 上記6.5.1節記載のようにして作製した増幅ファージ
ライブラリーをTMG 1ml中１〜2000PFUとなるまで希釈し
そしてE.コリKH802（５×109細胞/ml）50μｌを添加し
た。この混合物を20分間37℃でインキュベートし、NZYC
M培地:10g NZ Amine A,5.0g NaCl,2.0g MgSO4・7H2O,5g
酵母エキス,1gガサミノ酸（１当り）を含有する寒天
プレート上、軟質寒天3mlとともに塗布した。プレート
を一夜インキュベートし、30〜60分間４℃に冷却しそし
てプラークをニトロセルロースに移した。上記6.4.4節
に記載のようにしてポリクローナル抗PBOMP−１を用い
てフィルターを探索した。この方法によりいくつかの陽
性プラークが検出された。しかしながら、プローブとし
てPBOMP−１モノクローナル抗体を用いた場合は何ら陽
性プラークは検出されなかった。プレートから陽性プラ
ークを取出してE.コリKH802内で成長させることにより
増幅させた。ファージ溶解物をSDS−PAGEゲル／ウエス
タンブロット分析によりクローンを分析した。全ての陽
性クローンがPBOMP−１に対するポリクローナル抗体と
反応する見かけの分子量16000ダルトンのタンパク質を
発現した。このタンパク質はCharon 4ファージの対照溶
解物中には存在しなかった。同様の実験において、陽性
クローンからの溶解物はPBOMP−１に対するモノクロー
ナル抗体と反応できなかった。
ラムダ16−３と呼ばれる１つの陽性ファージを選択し
て更に分析を行なった。このファージ単離株をNZYCMブ
ロス中E.コリKH802内で成長させることにより増幅さ
せ、20％ポリエチレングリコール6000で沈澱させて回収
し、塩化セシウム平衡濃度勾配でバンドを形成させた
（TMG中4M CsCl,Beckman SW 50.1ローター,300,000×g,
24時間）。0.1％SDSおよび20μg/mlプロティナーゼＫ
（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）で55℃１時間処理
し次いでフェノール抽出およびエタノール沈殿を行うこ
とによりファージDNAを単離した。
ラムダ16−3DNAをEcoR I消化しそしてHi染色体挿入物
の部分的物理的地図を得た。挿入物のEcoR Iフラグメン
トを単離してプラスミドベクターpGD103にサブクローン
化した。PBOMP−１交差反応性16000ダルトンタンパク質
を発現するフラグメントを担持するクローンを、細胞溶
解物のウエスタンブロット移行分析により同定した。こ
れらの１つをPAA130と呼んだ。図７は、pGD103プラスミ
ド中にクローン化されたHi DNA由来の5.7Kbフラグメン
トを有するこのプラスミドの制限地図である。
PBOMP−１に対するモノクローナル抗体はpAA130から
発現された16000ダルトンタンパク質と反応しなかった
（データは示さず。）しかしながら、この組換えプラス
ミドにより発現されたタンパク質はポリクローナル抗体
PBOMP−１抗血清により認識された（例えば図８参
照）。
pAA130を担持するミニ細胞の分析（Achtman等、前
述）によれば、クロー化されたHib DNAは見かけの分子
量16000および17000ダルトンを有するタンパク質をコー
ドする。標識された16000ダルトンタンパク質は、ポリ
クローナル抗PBOMP−１により特異的に免疫沈降された
（データは示さず）。従って、プラスミドpAA130は、16
000ダルトン分子量PBOMPの発現を指示する。
挿入物の固有のPst I部位とポリリンカー中の単一Pst
I間に挿入されたDNAを切り出すことにより生成する内
部欠失は、交差反応性タンパク質の発現に影響しなかっ
た。このプラスミドのXba Iフラグメントを同様の方法
で欠失させたところ、PBOMP交差反応性タンパク質の発
現は温存された（図７）。このプラスミドのさらに欠失
を有する誘導体は、２つの内部Bgl II部位の再連結によ
り生成され、この誘導体もまた、PBOMP交差反応性タン
パク質の発現を温存していた。
低融点アガロースゲルからフラグメントを単離し、Bs
tE II末端をDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント
で充填しそしてこのフラグメントをpGD103のHinc II部
位にクローニングすることにより、781塩基対BstE II−
Xmn Iフラグメントをクローン化した。ポリクローナル
抗PBOMP−１を用いるウエスタンブロット分析では、こ
のプラスミドは16000ダルトンPBOMPの発現を温存してい
ることが示されていた。pAA130と同様、このプラスミド
から生産されたPBOMPは、PBOMP−１に対するモノクロー
ナル抗体と反応できなかった。
このPBOMP遺伝子の位置を調べる独立した方法とし
て、pAA130の大きなECOR I−Pvu IIフラグメントをpLG3
39のEcoR I−Pvu IIフラグメントと連結して、新しいテ
トラサイクリン耐性プラスミドpAA136を得た。このプラ
スミドはウエスタンブロットで調べるとPBOMPを発現し
た。このプラスミドを、染色体アルカリホスファターゼ
遺伝子（phoA）を欠失し、転移因子TnPhoAを担持するE.
コリ株に形質転換した。アルカリホスファターゼ活性を
復旧させるものであるpAA136へのTnPhoAエレメントの独
立した３つのトランスポジション物が単離された。pAA1
36中へのTnPhoA挿入部位は、TnPhoAの左末端領域に近い
固有のDra I制限部位、およびpAA136のHind III,BstE I
I,Xmn IおよびPst I部位を用いて決定された。３つの挿
入全てがpAA136のBstE II−Xmn Iフラグメント内にある
と判定された。３つのTnPho挿入は全て同一方向であ
り、このことはPBOMP遺伝子の転写がpAA136内で、EstE
II部位からXmn I部位の方向に向かって指示されること
を示しいる。３つのTnPhoAトランスポジション物全てが
ウエスタンブロットにより検出されるとおり、ポリクロ
ーナル抗PBOMP−１抗血清により検出される16000ダルト
ンタンパク質を失っていた。１つは融合株はウエスタン
ブロットで新しいバンドを形成し、これは60000ダルト
ンの位置にあり、ポリクローナル抗PBOMP−１抗血清に
より検出された。この大きさは、分子量16000ダルトン
タンパク質へのアルカリポスファターゼ（45000ダルト
ン）の融合により生成しうる融合タンパク質の予想範囲
内である。これらのトランスポジション物におけるPhoA
活性の復旧は、PBOMPタンパク質が膜輸送のためのペプ
チドシグナルを含有しており、それゆえ恐らく膜タンパ
ク質であることを証明している。
TnPhoAおよびHiクローン化DNA配列の間の接合部M13に
サブクローンすることによりTnPho融合体を配列決定し
た。全ての場合において、PhoAコード配列は、pAA130の
PBOMP−２遺伝子の予測された読みとり枠の枠内にある
ことが解った（後述6.7.2節参照）。
6.7 PBOMP遺伝子のヌクレオチド配列の決定 6.7.1 pAA152により発現されたPBOMP遺伝子に関する配
列決定法 pAA152により発現されたPBOMP遺伝子のヌクレオチド
配列は、pAA152の737bp Bgl II−BamH Iフラグメントを
M13群、即ちM13mp18およびmp19の一本鎖ファージ中にサ
ブクローン化後のジデオキシヌクレオチド配列決定（Sa
ngerら、1978,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA.74:5463−546
7）により得た。
これらのサブクローンから決定された配列の位置およ
び方向を図９に示す。Bgl II−BamH Iフラグメントの完
全なヌクレオチド配列を図10に示す。
pAA152の737bp Bgl II−BamH Iフラグメントは、153
アミノ酸のポリペプチド（図11）をコードする単一の読
み取り枠（ORF）を含有する。DNA配列から決定されたPB
OMP遺伝子のアミノ酸組成はPBOMP−１精製タンパク質の
アミノ酸組成に近接一致する（表１および表２参照）。
加えて、PBOMP−１遺伝子はT9ペプチドの配列（図1
2）に存在しないLeu−68残基が許容される場合には、
（30/33）アミノ酸がPBOMP−１のT9内部のペプチドのア
ミノ酸配列と一致した並びに有する内部ペプチド配列
（AA48−81）を有する。また、PBOMP−１のアミノ末端
領域は、他の膜輸送ペプチド配列との類似性を示すアミ
ノ酸配列をも含有する（Watson,1984,Nucleic Acids Re
s.12:5145−5164参照）。これらのデータおよびモノク
ローナル抗体結合データから、本発明者らはこの遺伝子
がPBOMP−１タンパク質をコードすると結論する。
6.7.2 pAA130のPBOMP遺伝子に関する配列決定法 pAA130のPBOMP遺伝子のヌクレオチド配列は、pAA130
の789塩基対SstE II−Xmn IフラグメントをM13mp18およ
びmp19ファージ中にサブクローン化後のジデオキシヌク
レオチド配列決定（Sangerら、上記）により決定した。
これらの組換えファージを夫々M18001およびM19001と称
する。普遍的な17塩基オリゴヌクレオチド配列決定プラ
イマー（New England Biolabs）を使用してSstE II−Xm
n Iフラグメントの両末端からその配列を決定した（図1
3参照）。更に二つのオリゴヌクレオチドを合成し、ジ
デオキシヌクレオチド配列決定用のプライマー（M18PR
I、M19PR2）として用いた。全ての他の配列決定プライ
マーはPraxis Biologics,Rochester,N.Y.でApplied Bio
systems 380B DNA合成装置上で作製した。これらプライ
マーはβ−シアノエチルホスフェート保護基化学により
１μモルの制御された細孔ガラスカラム上で作製され
た。オリゴヌクレオチドの収率はプライマーをそれ以上
精製することなくカラムから直接使用するに充分に純粋
であった。二つの合成オリゴヌクレオチドプライマー
は、図13に示されるようにフラグメントの各末端から約
200ヌクレオチド内側の配列に結合する。pAA130のBstE
II−Xmn Iフラグメントの合計789pb DNA配列を図14に示
す。ORFは図15に示されるように下線が引いてある。こ
のようにORFは154アミノ酸のポリペプチドをコードす
る。アミノ末端の18残基ペプチドは、他のタンパク質に
関して決定された膜輸送シグナル配列に似ている（Wats
on,1984,上記）。加えて、pAA130に於けるTnphoA融合か
らの配列データでは、三つのトランスポジション全てが
154アミノ酸ポリプチドの読み取り枠中に入ることが示
された。
pAA130のORFのDNA配列から推定されるような提案され
た成熟遺伝子産物のアミノ酸組成は、精製PBOMP−１の
アミノ酸分析により決定されたそれとかなり異なる（表
１および表２）。pAA130のPBOMP遺伝子のアミノ酸配列
を精製PBOMP−１タンパク質からのトリプシンペプチドT
9のそれと比較した場合、何ら有意な相同性が見られな
かった。加えて、この遺伝子によりコードされる産物は
ポリクローナル抗PBOMP−１抗血清により認識される
が、PBOMP−１のモノクローナル抗体により認識されな
い。これらの観察から、pAA130により発現されたHi遺伝
子はPBOMP−１の遺伝子でないことは明らかである。従
って、pAA130によりコードされるPBOMP遺伝子をPBOMP−
２と呼んだ。
6.8. 組換えE.コリにより発現されたPBOMPのリポタン
パク質としての特性決定 6.1.2節に示したように、H.インフルエンザエから単
離されたPBOMP−１はラウリン酸、パルミチン酸および
パルミチン酸誘導体を含む脂肪酸に共有結合しており、
それ故、細菌性リポタンパク質として分類し得る。組換
えE.コリにより発現されたPBOMPもまたリポタンパク質
として存在するか否かを調べるため以下の実験を行なっ
た。二つの異なるインビボ法を使用して、発現されたPB
OMPリポタンパク質を調べた。
一連の実験に於いて、PBOMPを発現する組換えプラス
ミドを含有する細胞を、放射性標識した脂肪酸の存在下
に培養した。かかる条件下で、共有結合した脂肪酸を含
有する生成リポタンパク質は特異的に放射性標識されよ
う。
PBOMP−１を発現するプラスミドpAA152またはPBOMP−
２を発現するプラスミドpAA130を含有するE.コリJM83細
胞を50μCi/mlの14C−パルミチン酸を含有するM9−最小
培地中で２時間増殖させた。全細胞溶解物（10,000トリ
クロロ酢酸沈殿可能のcpm/レーン）を30mAの定電流で15
％SDS−PAGEゲル上電気泳動した。ゲルにサリチル酸ナ
トリウム（５×ゲル容積×1M溶液で20分間）を含浸さ
せ、乾燥しそしてXAR−５フィルム（Eastman Kodak Com
pany,Rochester,N.Y.）上に−70℃で露出させた。同様
に培養した正常なE.コリJM83細胞の全細胞溶解物を対照
として実験した。得られた結果を図17に示す。
図17に示されるように、約15,000ダルトンの放射性標
識タンパク質がpAA152およびpAA130を含有するE.コリの
溶解物中で観察されたがこれは対照E.コリ細胞の溶解物
中には観察されなかった。このようにして組換えE.コリ
により発現されたPBOMP−１およびPBOMP−２が特異的に
放射性標識された。
もう一つの一連の実験に於いては、PBOMPを発現する
組換えプラスミドを含有する細胞を、リポタンパク質シ
グナルペプチターゼを阻害することにより全ての既知細
菌性リプロタンパク質のプロセシングを特異的に阻止す
ることが知られている抗生物質であるグロボマイシンの
存在下で培養した（Inukaiら、1978,J.Antibiotics（東
京）31:1203−1205）。
pAA152またはpAA130を含有するE.コリJM83細胞を25μ
g/mlのグロボマイシン（Robert Woods Johnson Medical
Dental School,Piscataway,M.J.のDr.M.Inouyeから入
手）の存在下で１時間培養した。グロボマイシンで処理
しなかった同様の培養物を対照として用いた。全細胞溶
解物を15％SDS−PAGEゲルで電気泳動し、ニトロセルロ
ースに移しそしてポリクローナル抗PBOMP−１抗血清で
プローブした。得られた結果を図18に示す。
図18に示されるように、PBOMP−１またはPBOMP−２の
いずれかを発現するグロボマイシン処理細胞の溶解物中
で、約16,500ダルトンのバンド（これは対称即ち未処理
細胞の溶解物中では検出されなかった）が観察された。
両方の一連のインビボ実験で得られた結果に基づけば
PBOMP遺伝子を含有する組換えE.コリにより発現されたP
BOMP−１タンパク質およびPBOMP−２タンパク質はリポ
タンパク質である。
7. PBOMP−１およびPBOMP−２サブユニットワクチンの
効能 7.1. PBOMP−１およびPBOMP−２により誘導された抗血
清の殺菌活性 6.2節に記載のようにして調製された抗PBOMP−１ポリ
クローナルウサギ抗血清をインビトロ補体媒介殺菌アッ
セイ系（Musherら、1983,Infect.Immun.39:297−304頁:
Andersonら、1972,J.Clin.Invest.51:31−38頁参照）に
おいてHibおよびHiを殺傷するそれらの能力に関して試
験した。このアッセイ系に使用した補体源は、既存のす
べての抗ヘモフィルス抗体を除去するために非類型的Hi
株、S2を予め吸着させた初乳授与前の仔ウシ血清（PCC
S）または正常ウサギ血清（NRS）であった。PCCSを希釈
しないで使用し、NRSはHibに関して1:4そして非類型的H
iに関して1:8の希釈度で使用した。全ての希釈物はリン
酸塩緩衝食塩水〔20mMリン酸塩緩衝液（pH7.4）、0.15m
M MgCl2含有0.15M NaClおよび0.5mM CaCl2（PCM）〕を
使用して調製した。検査すべき細菌株を、それらが490n
mでの光学濃度により測定して１×109細胞/mlの濃度に
達するまで、BHI−XV中で増殖させた。細菌をPCM中に12
50細胞/20μｌの最終濃度となるまで希釈した。PCM中の
適当な抗体希釈物20μｌを24ウエルマイクロタイタプレ
ート（Costar）のウエル中氷上で補体源20μｌと混合し
た。マイクロタイタプレートを氷から取り出し、試験希
釈細菌20μｌを各ウエルに添加した。抗体を含まないウ
エルを陰性対照として用いた。37℃で30分間インキュベ
ーション後、56℃の0.75％寒天含有BHI−XV 800μｌを
各ウエルに添加し、室温で凝固させた。プレートを37℃
で一夜インキュベートし、翌日に読み取りを行った。
抗血清のBC力価は非抗体対照ウエルと比較して試験細
菌の50％を殺傷しうる最大希釈度の逆数として読み取っ
た。
抗PBOMP−１を幾つかのHib臨床単離物および実験室単
離物に対する殺菌（BC）活性に関して試験し、結果を表
３に示す。
表３からわかるとおり、抗PBOMP−１抗体は類型的
（例えばａ、ｂ、ｃ）および非類型的H.インフルエンザ
エ株の両方の多種の臨床単離株に対してBC活性を有して
いた。112のHib臨床単離株のうち112が抗PBOMP−１抗血
清により死滅した。これらの株は米国南西部、米国北東
部およびカナダ西部で単離された。
死滅が抗LPS抗体の結果であるという可能性を排除す
るため、各ウエル中で免疫原調製に使用したHib株から
のLPS 200ngを用いてBSアッセイを行なった。これらの
実験の結果を表４に示す。
LPSは抗PRPの力価を1/2に低下させ、Hiに対する抗PBO
MP−１の力価を1/4に低下させ、Hibに対する抗PBOMP−
１の力価を全く低下させなかった。LPSはPBOMP−１のBC
活性を減少させたが、それを排除しなかった。観察され
た減少の幾つかは、抗PRP BC力価の減少により示される
ように、粉れもなくLPSの抗補体活性の結果であった。
6.2節に記載のようにして調製された抗PBOMP−２抗体
をヘモフィルス・インフルエンザエS2株に対する殺菌
（BC）活性に関して試験し、結果を表５に示す。接種
前、および初回免疫化の７週間後および10週間後に血清
を採った。下記に示す如く、抗PBOMP−２抗血清のBC活
性は接種７週後に著しく増加することが判明した。接種
10週後ではそれ以上の増加は観察されなかった。
7.2. H.インフルエンザエからの幼若ラットの保護 Smithら（1973,Infec.Immun.8:278−290）に従って、
幼若ラットの保護の研究を行なった。Sprague−Dawley
幼若ラットをPCM中のウサギ抗血清の種々の希釈物0.1ml
で生後４日目に腹腔内接種することにより受動免疫化し
た。免疫化18時間後、ラットにPCM0.1ml中の104〜106個
のHib細胞を用い腹腔内に抗原挑戦した。感染72時間後
の挑戦されたラットの生存が保護を示した。これらの実
験結果を表６に示す。
表６中の結果は、幼若ラットが受動移入された抗PBOM
P−１抗体により致死量のHibによる挑戦に対して保護さ
れることを示す。別の臨床Hib株を幼若ラット髄膜炎モ
デルに於いて挑戦株として使用して、抗−PBOMP−１が
異種Hib臨床単離株に対して防御するという保護を例示
した。
抗PBOMP−１が抗PRPの防御作用が阻止するか、または
相加的な作用を有するかどうかを判定するため、幼若ラ
ットをそれらの保護終末点を越えて希釈された抗PRPお
よび抗PBOMP−１で受動免疫化した。Hibでの挑戦後に、
抗血清は一緒になって上記のいずれか一つよりも高希釈
物を防御できた（表７）。表７に示されたこれらの結果
は、抗PBOMP−１抗体および抗PRP抗体が互いに干渉せず
そして幼若ラット髄膜炎モデルに対し相加的な防御を与
え得ることを示している。
7.3. ヒト成人に於けるPBOMP−１の免疫原性 ６人のヒト成人志願者に一回の予防接種のみを受けた
１個体を除いて、１ヶ月間隔で（ミョウバンを含まない
PBOMP−1 5.2μｇ）、6.1節記載のようにしてH.インフ
ルエンザエから単離されたPBOMP−１を含有するワクチ
ン製剤を２回予防接種した。最初の予防接種の直前およ
びその後１月間隔で血液試料を得た。予防接種した成人
の特異的な抗体応答を、H.インフルエンザエPBOMP（ELI
SA）、ジフテリアトキソイド（ELISA）（ELISAアッセイ
の一般的な説明に関してEngvallら、1972,J.Immunol.10
9:129−135参照）、およびHib PRP多糖（Farr型RIA）
（Far型RIAの説明に関してFarr,1958,J,Infect.Dis.10
3:239−262参照）に対する抗体力価の測定により評価し
た。PBOMP−1 ELISAアッセイに於いて得られた結果を図
19に示す。
図19に示されるように、６個体のうち３個体がPBOMP
−１に対する抗体力価の有意な上昇を示した。抗体力価
のこの上昇は免疫原として使用されたPBOMP−１に対し
て高度に特異的であった。何となれば、ジフテリアトキ
ソイドまたはHib PRPに特異的な抗体の力価に何ら有意
な変化が観察されなかったからである（結果は示され
ず）。
7.4. シグナルレスPBOMP−１により誘導された抗血清
の殺菌活性 下記8.1節記載のプラスミドpPX167を含有するE.コリP
R13細胞から得られた組換えシグナルレスPBOMP−１（本
明細書中、rPBOMP−１と称する）を免疫原として使用し
て白ニュージーランドラットを免疫化した。rPBOMP−１
を不完全フロインドアジュバント（IFA）中に乳化する
か、または水酸化アルミニウムに結合させた。0.85％食
塩水中500μg/ml濃度のrPBOMP−１を500μg/ml濃度のミ
ョウバンと1:1の比で混合することにより、rPBOMP−１
をミョウバンに結合させた。この混合物を37℃で３時間
振盪しそしてミョウバンを遠心分離によりペレット化し
た。上清を、未結合タンパク質に関してBCAタンパク質
アッセイ（Pierce Chem.Co.Chicago.IL）によりアッセ
イした。何も検出されなかった。ミョウバンを生理食塩
水中に500μg/mlで再懸濁した。rPBOMP−１をIFA（Difc
o）中に1:1の比で乳化した。動物を、いずれの調製物50
μｇで４週間の間隔で筋肉内免疫化した。動物から、０
週目、６週目および各免疫化前に採血した。
得られた抗−rPBOMP−１ポリクローナルウサギ抗血清
を、前記7.1節記載のインビトロ補体媒介殺菌アッセイ
系でHiを殺す能力に関して試験した。抗血清を第一回免
疫化直前である０週目、および第２回目の免疫化２週間
後である第６週目に試験した。抗血清の殺菌（BC）活性
を、H.インフルエンザエから単離されたPBOMP−１
（「天然型PBOMP−１」と称する）に対して生成された
抗血清の殺菌活性と比較した。試験細菌は非類型的H.イ
ンフルエンザエ株Ｓ−２であった。結果を表８に示す。
抗血清のBC力価は非−抗体対照ウエルと比較して、試
験細菌の50％を殺傷できる最高希釈度の逆数として読み
取った。
両方のウサギは免疫化前には低レベルのBC活性、1:5
および1:10の力価、を有していたが、６週目に得られた
血清のBCはBC活性はかなり増大していた。IFA中のrPBOM
P−１で免疫化したウサギは1:160の力価を有しそしてミ
ョウバン上のrPBOMP−１で免疫化したウサギは1:80の力
価を有していた。高度免疫抗血清はウサギが天然型PBOM
P−１の多重量を受けた後に得られた。高度免疫ウサギ
抗PBOMP−１血清は1:160の力価を有していた。これらの
結果は、rPBOMP−１がヘモフィルス中の天然型PBOMP−
１を認識する抗体を誘発することができかつ殺菌アッセ
イ系に於いて生物学的に活性であることを明らかにして
いる。
8. E.コリ中のPBOMP発現増強のための新規プラスミド 8.1. E.コリ中におけるPBOMP−１の発現増強 PBOMP−１タンパク質はpAA152の737bp BamH I−Bgl I
Iフラグメントからおそらくはその天然型プロモーター
の制御下で発現される。この配列は良好なコンセンサス
リボソーム結合部位およびPBOMP−１遺伝子の開始コド
ンを含有する。このフラグメントを含有するプラスミド
を有するE.コリ中で発現されたPBOMP−１は、ウエスタ
ンブロット分析により容易に検出されたが、生産された
かかるタンパク質の量は細胞タンパク質の１％未満であ
り、即ち天然型遺伝子を含有するH.インフルエンザエ細
胞中でつくられたPBOMP−１量より少なかった。
E.コリ中で高レベルのPBOMP−１を生産するための初
期の試みとして、クローン化した遺伝子を多量のタンパ
ク質を生産することが知られているプロモーターlacお
よびラムダPLの制御下に置いた。これらプロモーターは
PBOMP−１開始コドンの上流のBstN I部位に連結した
（図4A）。この部位に於ける切断による天然型PBOMP−
１プロモーターが除去されるが、リボソーム結合部位は
無傷のまま残る。
これらの構築は以下のようにして行なった。まず、PB
OMP−１遺伝子を担持するpAA152の739bp BamH I−Bgl I
IフラグメントをプラスミドpUC19のlacプロモーターのB
amH I部位にクローン化した。lacプロモーターと同じ方
向でPBOMP−１遺伝子を担持する一つのクローンをpPX16
0と称した。E.コリJM103中のpPX160からのPBOMP−１の
発現はlacの調節下ではなく、天然型プロモーターの制
御下にある。これは明らかにBgl II部位とPBOMP−１の
翻訳開始コドンとの間の240bp中の転写終結シグナルに
よる。次にプラスミドpPX160をBstN Iで切断した。これ
はPBOMP−１開始コドンと遺伝子のコンセンサス翻訳開
始部位との間を切断するが、リボソーム結合部位をコー
ド領域に結合されたまま残す。末端をE.コリDNAポリメ
ラーゼＩ（クレノウフラグメント）で充填し、線状にし
たプラスミドをBamH Iで切断した。プロモーターのない
PBOMP−１遺伝子を担持する577bp BstN I−Bgl IIフラ
グメントをHinc IIおよびBamH I切断pUC19と連結したpP
X166と呼ばれる生成プラスミドはウエスタンブロットに
よればE.コリJM103中のlacプロモーターの制御下でPBOM
P−１を発現することが判明した。
PBOMP−１をE.コリJM103またはHB101株中のlacプロモ
ーターまたはPLプロモーターから発現させた場合、ごく
低レベルのPBOMP−１しか発現されなかった。これら細
胞からの溶解物を、成熟PBOMP−１のアミノ末端20アミ
ノ酸に結合するモノクローナル抗体Ｇ−204を用いてウ
エスタンブロット分析すると、このモノクローナル抗体
により認識される4000〜5000ダルトンペプチドの存在が
示された（図20）。誘導されたPLプロモーターの制御下
でPBOMP−１を発現する細胞中では、90％をこえるＧ−2
04結合活性がこの想定された分解産物中にあり、このこ
とはE.コリ中で高レベルで発現されたPBOMP−１が不安
定であることを示している。
プラスミドpPX160およびpPX166を、外来タンパク質を
安定化すると報告されている突然変異を含有する幾つか
のE.コリ株中に形質転換した。これらには、ATP依存性
プロテアーゼ（lon-）突然変異、熱衝撃応答（htp）、
およびmRAN−安定化突然変異（pnp）が包含される。加
えて、PBOMP−１のリポタンパク質としてのプロセッシ
ングはその安定性を増強し得る可能性があるので、主要
な天然型E.コリリポタンパク質、ムレインリポタンパク
質を欠くE.コリ株（lpp-）中にプラスミドを入れた。試
験した全ての株中で、モノクローナル抗体Ｇ−204によ
り認識されるPBOMP−１分解産物はほぼ同じレベルで存
在した。それ故、E.コリ中におけるPBOMP−１の分解が
或種の他の未確認活性によるものであることは明らかで
ある。
第二の方法として、遺伝子の天然型シグナル配列を除
去することにより修飾PBOMP−１遺伝子を生成させた。
かかる構築により天然型PBOMP−１タンパク質に比較し
て二つの潜在的な利点が付与される。まず、シグナルレ
スPBOMP−１は膜に輸送されないであろうしそれ故、PBO
MP−１の過剰発現による毒素作用が軽減されよう。第二
に、それは極度に疎水性の高い脂質基により修飾されな
いので、シグナルレスPBOMP−１は溶液中の単離または
貯蔵のための界面活性剤の使用を必要としないであろ
う。
PBOMP−１のシグナルレス形態物の作製を図21に示
す。図21に示されるように、プラスミドpPX160からのPB
OMP−１遺伝子をAlu I制限エンドヌクレアーゼを用いて
コドン19で切断した。生成するフラグメントをpUC19ポ
リリンカー領域内のSma I制限部位に連結した。生成す
る遺伝子は、天然型PBOMP−１の全アミノ酸配列＋アミ
ノ末端でpUCポリリンカーからの付加的な18アミノ酸を
含有するハイブリッドタンパク質を発現した。このプラ
スミドをpPX167と称した。
図21に更に示されるように、PBOMP−１を発現する第
二の組換えプラスミドがプラスミドpPX167からポリリン
カー中のBamH I部位での切断およびそのフラグメントの
プラスミドpIN III−ompA3のBamH I部位中へのクローン
化により誘導された。生成するプラスミドpPX168は、E.
コリOMP Aタンパク質のシグナル配列にアミノ末端に連
結された成熟PBOMP−１をコードするハイブリッド遺伝
子を含有する。このハイブリッド産物はOMP Aシグナル
配列を介して膜によりプロセッシングされて、リポタン
パク修飾を欠き、そのアミノ末端で８個の付加的アミノ
酸を含有する成熟PBOMP−１を生成する。
プラスミドpPX167およびpPX168をE.コリJM103中に形
質転換しそして組換えPBOMP−１合成に関して試験し
た。SDS−PAGEウエスタンブロット分析によれば、両方
のプラスミドはポリクローナルおよびモノクローナル抗
PBOMP−１抗血清により認識されるタンパク質をコード
することが示された。pPX167から合成された修飾PBOMP
−１はイソプロピルチオ−β−ｄ−ガラクトピラノシド
（IPTG）で誘導可能であり、細胞質中に存在しそして界
面活性剤の非存在下で可溶性であった。修飾されたPBOM
P−１はIPTG誘導細胞からの全細胞溶解物のクーマシー
ブルー染色によっては検出できず、全細胞タンパク質の
１％未満しか占めていなかった。pPX168から合成された
修飾PBOMP−１もIPTGで（ハイブリッドlilacプロモータ
ーの制御下で）誘導可能であり、培地中に排出され、そ
して同じく界面活性剤の非存在下で可溶性であった。充
分に誘導された場合、この修飾PBOMP−１は約１〜2mgの
細胞レベルで生産された。
プラスミドpPX167およびpPX168を、発現のレベルに関
して種々のE.コリ株中でも試験した。試験した最も成功
した組合せは、mRNAを安定化する突然変異pnpを含有す
る株であるE.コリPR13中に形質転換されたpPX167キメラ
プラスミドであった。この株中で、組換えPBOMP−１はl
acプロモーター制御下でlac誘導後に全細胞タンパク質
の約２〜３％で発現される。この組換えPBOMP−１はlac
アルファペプチドからの約17アミノ酸およびPBOMP−１
遺伝子のアミノ末端に融合した多重クローニング配列を
含有する細胞質融合タンパク質として発現される。
8.1.1. シグナルレスPBOMP−１の精製および特性決定 シグナルレスPBOMP−１（本明細書中、rPBOMP−１と
称する）を精製し特性決定するために、以下の実験を行
なった。
細胞質抽出物の単離 37℃でLuriaブロス中で増殖させ
たpPX167含有E.コリpR13の一夜の培養からの細胞をGSA
ローター中8,000rpmで４℃で10分間ペレット化した。こ
のペレットを1/10容量の10mMトリス−HCl、pH7.5中で洗
浄しそして10μg/mlのDNアーゼおよび10μg/mlのRNアー
ゼを含有する1/100容量の10mMトリス、pH7.5中に再懸濁
した。細胞を氷の上での40Wで10分間の音波処理による
かまたは20,000psiでフレンチプレスセス中に３回通す
ことにより破砕した。未破壊細胞はSS−34ローラー中４
℃で10,000rpmで10分間遠心分離することにより除去し
た。全細胞膜を60Tiローター中４℃で55,000rpmで30分
間の遠心分離により除去した。膜を捨て、上清を保持し
た。
細胞質抽出物DEAE分別化 上清を、10mMトリス、pH7.5
で平衡化したイオン交換DEAE−Biogel A（Biorad Labor
atorie,Richmond,CA）カラムに通した。実質的に全ての
タンパク質がこれらの条件下でカラムに結合された。結
合したrPBOMP−１および他のタンパク質は80mM NaClを
含有する10mMトリス、pH7.5を用いて段階的に溶離され
た。この緩衝液により溶離された全タンパク質をプール
し、４℃で60％飽和硫酸アンモニウムによる沈殿により
濃縮した。ペレットを遠心分離により集め、10mMトリ
ス、pH7.5に溶解させ続いて同じ緩衝液で透析すること
により残留硫酸アンモニウムを除去した。
rPBOMP−１の逆相クロマトグラフィー rPBOMP含有上清
を、dH2O中0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）を含有する緩
衝液中に希釈後、4.6×15mmのＣ−４逆相HPLCカラムに
流した。同じ緩衝液を用い、カラムを2ml/分の流量で操
作した。大部分のタンパク質がこれらの条件下でカラム
に結合された。結合されたrPBOMP−１は、0.1％TFA中の
０〜95％アセトニトリル濃度勾配により20分間で単一ピ
ークとして溶離された。rPBOMP−１を含有する大きなピ
ーク（図22、ピーク１参照）を集め、フラクションをプ
ールしそして溶媒の蒸発により濃縮した。乾燥rPBOMP−
１をdH2O中に再溶解した。
プラスミドpPX167を含有するE.コリPR13細胞から得ら
れた細胞質抽出物、DEAE溶出物および逆相溶出物に関し
て、本分に前記したようにしてSDS−PAGEを行なった。
電気泳動後、ゲルを約２時間にわたってクーマシーブリ
リンアントブルー染色により染色した。また、モノクロ
ーナル抗体GD204を用いるウエスタンブロット分析も行
なった。得られた結果を図23AおよびＢに示す。
図23Aに示されるように、クーマシー染色で染色され
た場合（図23A、レーン１）、rPBOMP−１はプラスミドp
PX167を含有するE.コリPR13細胞質抽出物中に存在する
主要タンパク質である。ウエスタンブロット反応性によ
り概算されるようにrPBOMP−１の95％より多くが細胞質
抽出物中に存在する。細胞質抽出物の調製に何ら界面活
性剤を使用しなかったので、これらの結果はこれらの細
胞から得られたrPBOMP−１が界面活性剤を含有しない10
mMトリス−HCl、pH7.5に可溶性であることを示してい
る。このことはリポタンパク質としてHib細胞から得ら
れたPBOMP−１との相違を表わす。
細胞質抽出物を使用する予備実験では、pPX167を含有
するE.コリPR13細胞から得られたrPBOMP−１がそれ自体
とのまたは他の細胞質タンパク質との複合体として水溶
液中に存在する可能性が示された。アクリルアミド−ア
ガロースポリマーまたはセファデックスビーズを使用す
るゲル濾過クロマトグラフィーをこのrPBOMP−１を用い
て実施した場合、rPBOMP−１は100,000ダルトンより大
きい見かけ分子量で抽出した（データは示さず）。DEAE
−Biogel A Biorad Laboratories,Richmond,CA）を用い
るイオン交換クロマトグラフィーでは、rPBOMP−１が特
定の塩濃度で単一ピークとして溶出しないことが示され
た。rPBOMP−１は10mMトリス、pH7.5中で約20mM〜75mM
のNaCl濃度範囲で溶出した。溶出したrPBOMP−１は80mM
NaCl洗浄で溶離される多くのタンパク質の一つである
が、かなりの数の細胞質タンパク質が80mMより高い塩濃
度でカラムに結合されたままであった。こうして、上記
のDEAEクロマトグラフィーを予備工程として使用してrP
BOMP−１からかなりの数の混入タンパク質を除去した。
図23Aに示されるように、DEAEクロマトグラフィーは
細胞質物質中に見出される多数のタンパク質を大巾を減
少させ（図23A、レーン２）そしてモノクローナル抗体
とのrPBOMP−１の反応性を変化させなかった（図23B、
レーン２）。
pPBOMP−１のアミノ酸配列は、それが比較的疎水性の
タンパク質である筈であることを示している。それは界
面活性剤を含有しない細胞質抽出物中で可溶性であった
が、rPBOMP−１は大部分の細胞タンパク質よりも疎水性
が高いであろうことが予想された。従って、rPBOMP−１
を含有するDEAE溶出物を前記のようにしてＣ−４疎水性
相互作用カラムでクロマトグラフィーしそして漸増量の
アセトニトリル濃度勾配を用いて溶離した。この系に於
いて、比較的疎水性の高いタンパク質はカラムに緊密に
結合される筈あり、従って比較的高濃度のアセトニトリ
ル中で溶出する筈である。ｒ−PBOMP−１は大部分の混
入タンパク質よりも緊密に結合してそれらの大部分より
後に溶出すると考えられた。rPBOMP−１を含有するフラ
クションをＣ−４カラムでクロマトグラフィーした場
合、PBOMP−１はカラムから溶出した主要ピークである
ことが判明し（図21）そして驚くべきことにそれはアセ
トニトリルの最低濃度で最初に溶出した。
図23A、レーン３に示されるように、rPBOMP−１ピー
クはSDS−PAGE後の10μｇタンパク質のクーマシー・ブ
リリアント・ブルーＲ−250染色により測定して純粋で
あった。このピークはクーマシー染色で二つのバンド、
即ち主要バンドおよび少量バンドを示し、その両方がPB
OMP−１アミノ末端20アミノ酸を認識するPBOMP−１のモ
ノクローナル抗体と反応した（図23B、レーン３）。ま
た、完全サイズrPBOMP−１より約2000キロダルトン小さ
い少量バンドはPR13（pPX167）の全細胞抽出物中に存在
しており、このことは小さい方のタンパク質が精製工程
の副生物ではないことを示している。培養の蒸発による
濃縮後に、精製rPBOMP−１は界面活性剤を含有しない水
性溶媒に可溶性であった。
ウサギの免疫化 ニュージーランド白ウサギを、不完全
フロインドアジュバント中に乳化するかまたは水酸化ア
ルミニウムに結合させたpPX167を含有E.コリPR13細胞か
ら得られたrPBOMP−１を用いて免疫化した。rPBOMP−１
は0.85％食塩水中の500μg/ml濃度のrPBOMP−１を500μ
g/ml濃度のミョウバンと1:1の比で混合することにより
ミョウバンに結合させた。この混合物を37℃で３時間振
盪しそしてミョウバンを遠心分離によりペレット化し
た。上清をBCAタンパク質アッセイ（Pierce Chem.CO.,C
hicago,IL）により未結合タンパク質に関してアッセイ
した。何も検出されなかった。ミョウバンを500μg/ml
で生理食塩水中に再懸濁した。rPBOMP−１を不完全フロ
インドアジュバント（Difco）中に1:1の比で乳化した。
動物を、いずれかの調製物50μｇで４週間間隔で筋肉内
免疫化した。動物から、免疫化０週目、６週目および各
免疫前に採血した。ELISAおよびウエスタンブロット分
析を用いて血清を抗−PBOMP−１および抗−rPBOMP−１
抗体に関してアッセイした。
組換えPBOMP−１での免疫化によりELISAアッセイによ
り測定して組換えPBOMP−１およびH.インフルエンザエ
から得られたPBOMP−１（天然型PBOMP−１と称する）に
対して抗体力価が誘発された。結果を表９に示す。
表９に示されるように、ミョウバンまたはIFA中のrPB
OMP−１で動物を免疫化すると、免疫化６週後でrPBOMP
−１および天然型PBOMP−１の両方と反応性の抗体がか
なりの力価で誘発された。
8.2. E.コリ中のPBOMP−２の発現増強 PBOMP−２もプラスミドpAA130から低レベル（細胞タ
ンパク質の１％未満）で発現される。PBOMP−２の発現
は明らかにその天然型プロモーターの制御下にある。
PBOMP−２の収率を改良するため、pAA130中のPBOMP−
２遺伝子をPBOMP−２開始コドンの５塩基５′側にある
固有のSsp I制限部位で切断しそしてpUC19のSma I部位
に連結した（図24）。この連結により全PBOMP−2 ORF
（シグナル配列を含む）＋pUC19からの18コドンおよび
遺伝子融合部位からのコドンを含有するハイブリッド読
み取り枠（ORF）が生成する。この融合遺伝子のタンパ
ク質産物は17,999ダルトンの予想分子量を有し、かつla
cプロモーターの制御下で発現される。このプラスミド
をpPX163と称する。
プラスミドpPX163をE.コリJM103に形質転換しそしてI
PTGで誘導した場合、17,500ダルトンの見かけの分子量
を有するタンパク質が発現された。更に、15,000ダルト
ン分子量を有するタンパク質ダブレットが観察された。
全３種のタンパク質がウエスタンブロットで抗PBOM−１
抗血清により認識された（図25）。SD−PAGEのクーマシ
ーブルー染色により、三つの形態の組換えPBOMP−２はl
ac誘導後の全細胞タンパク質の約15％を占めた（図25、
レーン３）。pPX163から発現された三つの形態の組換え
PBOMP−２を単離しそしてＮ末端ペプチド分析すると以
下のことが明らかである、すなわち 1. 17,500ダルトン見かけ分子量バンドは予想されたpU
C19/PBOMP−２ハイブリッドタンパク質である。
2. 上方の15,000ダルトン分子量バンドはPBOM−２シグ
ナル配列の第一メチオニン残基（すなわち、PBOMP−2 O
RFの開始コドン）で開始しそして明らかにこの位置での
翻訳の再開始によるものであり、そして 3. 下方の15,000ダルトン分子量バンドはＮ末端分析に
対して遮断されておりそして14C−パルミテートで標識
できる。それ故、このバンドはリポタンパク質プロセッ
シングされたPBOMP−２からなる。
9. PBOMP−１のエピトープ決定基のマッピング 9.1. 合成ペプチドおよび切断 大部分の抗体は、一次配列中ではなく空間中で隣接す
る残基により形成された、コンホーメーション特異的で
あるタンパク質上の抗原決定基を認識する。小数の抗体
がタンパク質分子の線状部分を認識する。これら線状も
しくは連続するエピトープは、通常約５〜10アミノ酸か
らなり、そしてタンパク質表面から突出して分子の隅部
または曲がりを形成し、リバースターンまたはループ構
造をとる。大部分に関しては連続エピトープは親水性で
ありそして表面で接近可能である。HoppおよびWood（19
81,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:3824−3828）並びにChou
およびFasman（1978,Ann.Rev.Biochem.47:251−276）の
コンピューターアルゴリズムを用いて、夫々テトラペプ
チド移動平均に基いてリバースターン（図26中に実線の
矢印により示される）を含有するPBOMP−１（アミノ酸
配列は図11に示される）の幾つかの親水性領域（図26
中、斜交平行線つき長方形により示される）を同定し
た。このコンピューター調査によりPBOMP−１のアミノ
およびカルボキシル末端領域付近を支配する親水性ター
ンを明らかになった。
二つの末端に相応する５つのペプチド、P1〜P5を選択
して化学合成した。ペプチドP1は成熟タンパク質のＮ末
端残基１〜20に相当する（図26および27参照）。残りの
４つのペプチド、P2〜P5はPBOMP−１のＣ末端から入れ
子状に重なったシリーズである。これらの中で最も長い
ものはP5、即ち成熟タンパク質の残基97〜134を含有す
る38アミノ酸配列である。合成ペプチドはアミノ酸アル
ギニン、アスパラギンおよびグルタミン（これらに関し
ては１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルが使用
された）以外は対称無水物カップリング化学を使用して
Merrifield（1964,J.Am.Chem.Soc.85:2149−2154）の固
相法により調製した。合成はApplied Biosystems（形式
430A）自動ペプチド合成装置を用いて実施した。各アミ
ノ酸を二重カップリングして、ニンヒドリン試験で示さ
れるように99.5％より高い段階収率を生じた。ペプチド
を無水フッ化水素により樹脂から切断した。
PBOMP−１のタンパク質分解フラグメントは種々のプ
ロテアーゼで消化することにより得られた。エンドLys
−Ｃ消化により、成熟タンパク質の大きな63アミノ酸ペ
プチド（残基１〜63）が生成された。Tyr87−Glu121は
スタフィロコッカス（Staphylococcus）V8プロテアーゼ
での消化により得られそしてGly−18−Arg85はエンドAr
g−Ｃ消化から誘導された。
化学合成されたプチドおよびタンパク分解フラグメン
トの両方を、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）を含有する
アセトニトリル／水濃度勾配を用いてVydac C4カラムで
の逆相HPLCにより分析した。全ての場合に合成ペプチド
の純度はアミノ酸配列決定により確認して95％を越え
た。
9.2. モノクローナル抗体（Mab） 6.2.2節記載のようにしてモノクローナル抗体を生産
し精製した。簡単に云えば、PBOMP−１に対する抗体を
分泌するハイブリドーマ細胞系は、マウスミエローマ細
胞系、X63.Ag 8,6543とPBOMP−１で免疫化したC57/B1マ
ウスから得た脾臓細胞との融合により得た。所望のハイ
ブリドーマを限界希釈法により再クローン化しそしてウ
エスタンブロットによりPBOMP−１との反応性に関して
スクリーニングした。選択したハイブリド ーマをBalb/cマウスに注射し腹水として増殖させた。
抗PBOMP−１抗体を分泌する合計43のハイブリドーマ
クローンが融合実験から得られた。競合ELISAを用い
て、我々は広範な交差競合がMab間に存在し、従ってそ
れらが重複もしくは非常に近接した抗原決定基を認識す
ることを示していることを例証した。Mabをそれらの反
応性プロフィールに従って７群に分類した。これらの群
からの代表的なMabをさらに実験に使用してワクチン製
剤に有用な連続するエピトープを決定し特定した。
9.3. Mabを用いるエピトープマッピング 9.3.1. 直接ELISAアッセイによる合成ペプチドの反応
性 直接ELISA分析を使用して、PBOMP−１の合成ペプチド
へのMabの結合を測定した。表10に示されるように二つ
のMab、すなわちG204−２およびG194−３のみがP1ペプ
チドと直接反応した。これらの二つのMabは、それらが
競合結合実験で互いに競合したので（データは示されて
いない）、同一エピトープを明らかに認識する。残りの
Mabはマイクロタイタープレートを覆うのに使用した条
件下ではペプチドのいずれとも反応しなかった。
9.3.2. 合成ペプチドの阻害活性 マイクロタイタープレートに塗布されたPBOMP−１へ
の種々のMabの結合を阻害する合成ペプチドの相対能力
を表11に示す。競合ELISA（その操作の詳細に関しては
6.2.2節参照）に使用したモノクローナル抗体は全てPBO
MP−１と反応した。ペプチドP1は天然型PBOMP−１へのM
ab G204−２およびG194−３の結合を阻害するのに100％
有効であった。これらMabの両方はまたP1ペプチドとも
直接反応した（前記参照）。従って、Mab G204−２およ
びG194−３により認識される一種またはそれ以上のエピ
トープは、PBOMP−１の最初の20個のアミノ酸中に存在
する。
PBOMP−１へのMab G196−３、G212−６、G214−３、
およびG190−８の結合はＣ末端ペプチドP2〜P5の全てに
より有効に（100％）阻害された（表11参照）。これら
４つのMabは、P2ペプチド、即ちAsp120Tyr134にわたる1
5アミノ酸の配列中に含有される一種またはそれ以上の
エピトープを認識しているに相違ない。
Mab G187−１およびG216−３の両方がP4およびP5ペプ
チドにより、プレートに塗布されたPBOMP−１への結合
を強く阻害された（表11）。一方、P3およびP2ペプチド
の両方がPBOMP−１へのこれらの２つのMabの結合を阻害
するのに最低の効果しかなかった。これらの阻害データ
により、10アミノ酸領域（成熟タンパク質の残基103〜1
13であるＫ−Ｌ−Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｅ−Ｅ−
Ｋ）がMab G187−１およびG216−３により認識されるエ
ピトープを含有することが示された。この10アミノ酸領
域は、Mab G216−３およびG187−１が二つの非交差反応
性グループからのものであるので、二つの部位を含有し
得ることが可能である。
9.3.3. タンパク分解により切断されたPBOMP−１フラ
グメントとのMabの反応性 タンパク分解による切断により生成したPBOMP−１ペ
プチドフラグメントを、直接ドットブロットおよびウエ
スタンイムノブロット分析により、限定された数の抗PB
OMP−1 Mabとの反応性に関して試験した。エンドLys−
Ｃ消化により得られた大きな63アミノ酸ペプチド（成熟
タンパク質の残基１〜63）はMab G204−２と反応した。
Ｎ末端20アミノ酸配列がこの切断ペプチド中に含まれる
ので、この観察は驚くべきことではなかった。V8消化か
ら得られたペプチドであるTyr87−Glu121はMab G216−
３と反応した。このMabは成熟タンパク質の残基103〜11
3（これはこのV8ペプチドに包含される）である10アミ
ノ酸配列を認識することが示されている（上記参照）。
最後に、合成ペプチドのいずれとも結合しなかったMab
G219−３は、エンドArg−Ｃ消化から誘導された68アミ
ノ酸ペプチド、Gly18−Arg85と反応することが示され
た。
要約すると、合成ペプチドおよびタンパク分解的消化
により生成したペプチドへのMabの結合を伴なうこれら
の研究では、PBOMP−１の４つの連続する抗原領域の存
在が明らかになった。Mabにより認識されるエピトープ
のマッピングを表わす概略図を図28に示す。４つの決定
基のうちの二つは鎖末端、即ち成熟タンパク質のＮ−末
端残基１−20およびＣ末端120−134に所在限定された。
Mab G216−３およびG187−１により認識される第三の抗
原領域は、成熟タンパク質の残基103〜113にわたる小さ
いアミノ酸配列（10アミノ酸）に所在限定された。最後
に、Mab G219−３により認識される比較的大きな抗原領
域は残基Gly18−Arg85に包含される。このペプチドは実
に大きいので、エピトープはコンホーメーション依存性
である可能性がある。何となれば、それを小さくしよう
とするこれまでの試みは抗原性の喪失をもたらしたから
である。
9.4. MABの機能活性 Mabの機能活性はH.インフルエンザエ株S2に対する殺
菌測定で試験した。使用した補体は、洗浄したS2全細胞
に２倍に吸着された初乳授与前の仔ウシ血清（PCCS）で
あった。細菌を、10μg/mlヘミンおよび２μg/ml NAD
（BEIXV）を補添した脳−心臓浸出（BHI）ブロス中で一
夜増殖させ、次に新しいブロス中に1:15で希釈しそして
37℃で通気しながらインキュベーションした。細胞を、
490nmでのOD0.9（約10CFU/ml）となるまで増殖させた。
細菌は0.15mM CaCl2,0.5mM MgCl2を含有しそして0.5％
ウシ血清アルブミンを含有する無菌の燐酸緩衝食塩水
（PCMA）中に連続希釈することにより40,000倍に希釈し
た。最終希釈度はPCCS含有PCMA中で4:1の比で行なっ
た。
腹水液を、まず緩衝液中で10倍に希釈し、次に10,000
カットオフ膜を用いるCentricon微量濃縮ユニットを使
用することによりもとの容量まで戻し濃縮することによ
り、PCMA中で洗浄した。モノクローナルマウス抗血清を
４℃で35％最終濃度で飽和硫酸アンモニウムと一夜反応
させた。試料をエッペンドルフテーブル−トップ遠心器
中４℃で10分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを
もとの血清容量の10倍のPCMA中に再懸濁した。試料を、
10,000カットオフ膜を用いるCentriconユニットを用い
てもとの容量まで戻した。試料を更に４回洗浄して硫酸
アンモニウムをすべて除去した。
血清試料15μｌを、氷の上に保持された無菌の96ウエ
ルＵ字底マイクロタイタープレートの第一ウエル中に入
れた。PCMAを使用する２倍連続希釈物を残りのウエル中
で行なった。プレートを氷から取り出し、細胞／補体懸
濁液15μｌをウエル中の血清に添加した。プレートを37
℃で45分間インキュベートした。各ウエルからの試料10
μｌずつをBHIXVプレートに塗布して拡げ37℃で一夜イ
ンキュベートした。殺菌力価は、非抗体含有対照と比較
してCFUの数を50％減少し得る最高希釈度の逆数として
報告された。
これらの殺菌アッセイ結果を表12に示す。試験した10
の抗PBOMP Mabのうち、G102−５、G56−５、G216−３、
およびG204−２は殺菌活性に関して陽性であった。無関
係のウイルスMabは活性を示さなかった。興味あること
に、PBOMP−１の４つの特定の抗原決定基のうちの二
つ、即ち成熟タンパク質のＮ末端残基１−20および103
−113は二つの殺菌性Mab、即ちG204−２およびG216−３
のそれぞれにより別々に認識された。これらの二つのMa
bの殺菌活性は、これらの二つの領域が細菌表面上に露
出されているという主張を裏書きしている。驚くべきこ
とに、予備阻害データにより、Mab G204−２が天然型PB
OMP−１に対してよりも合成Ｎ末端ペプチドに対してよ
り強い反応性を示すことが示唆された。これは、全タン
パク質に対する抗体で測定された場合、合成ペプチドに
関連する通常は低い抗原活性と顕著に対照的である。明
らかに、溶液中の遊離のＮ末端ペプチドは成熟PBOMP−
１分子中のこのペプチド配列構造を模していてそして立
体的に抗体結合を受け易いのであろう。Mab G204−２お
よびG216−３の他に、二つの他のMab、G102−５およびG
56−５がヘモフィルス生物に対して殺菌性であることが
判明している。それらは合成ペプチドまたは切断ペプチ
ドと反応しなかったので、これらの殺菌性Mabは不連続
（またはコンホーメーション）エピトープを認識してい
ると考えられた。
10. PBOMP−１の合成Ｎ末端ペプチドの接合体による生
物学的機能を有する抗体の誘導 10.1. ペプチド−タンパク質接合体の化学的特性決定 この研究において合成用に選択されたペプチドは、9.
1節記載の操作を用いるＮ末端20アミノ酸配列、即ち成
熟PBOMP−１のCys1−Tyr20（P1）に相当した。また、9.
1節記載のように、このペプチドは逆相HPLCにより精製
した。合成ペプチドの最終純度（95％）はApplied Bios
ystem型式477Aタンパク質シークエネーターを用いる直
接アミノ酸配列決定により確認した。
接合体は架橋剤としてMBS（３−マレイミド安息香酸
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Pierce Chemi
cal Co.,Rockport,IL）を用いて調製した（Liuら、197
9,Biochemistry,18:690−697頁）。接合法は段階的に進
行した。初めに、BSA（またはチログロブリン）の表面
リジニル残基のエプシロンアミノ基を過剰のMBSでＮ−
アシル化した。カップリング反応は、タンパク質キャリ
アーをMBSと1:100のモル比で混合することにより、燐酸
緩衝食塩水中室温で行なった。反応混合物をセファデッ
クス−Ｇ−50で脱塩して過剰のMBS試薬を除去した。第
二に、アミノ末端システイニル残基を担持するペプチド
P1をホウ水素化ナトリウムで還元して反応性スルフヒド
リル基を確保した。第三に、還元されたペプチドを、BS
A−MBSまたはチログロブリン−MBS誘導体を含有する溶
液に添加しそして共有結合反応を一夜行なわせることに
より、接合を達成した。凍結乾燥に先立ち透析を行なっ
て過剰の未反応ペプチドを除去した。共有結合性はSDS
ゲルでの分子量シフトおよびウエスタンブロット分析に
より実証された。分子量シフトは、BSA分子当り７モル
のペプチドおよびチログロブリン分子当り25モルのペプ
チドに相当した。更に、この接合体バンドはウエスタン
ブロットで抗PBOMP−１および抗ペプチド抗血清の両方
と反応した。
免疫原性を増強するために、HOPP（1984,Mol.Immuno.
21:13−16）の方法によりＮ末端ペプチドをパルミチル
基を用いて脂肪酸アシル化した。実質的に、ペプチドは
アミノ末端でジグリシンスペーサー続いてリジル残基に
より延長された。Ｎ−末端リジンのαアミノ基およびε
−アミノ基の両方を、対称無水物カップリング操作によ
りパルミチン酸でアシル化した。脂肪酸アシル化の完結
は（１）リジルアミノ基の完全な誘導体化を示す陰性ニ
ンヒドリン試験、（２）Ｎ末端が遮断されるゆえのペプ
チドのアミノ酸配列決定困難性、および（３）疎水性増
大ゆえに逆相カラムを用いるHPLC溶離時間がより長くな
ること、により確認された。
10.2. ポリクローナル抗PBOMP−1N末端（Ｎ−１−20）
ペプチド抗血清の調製 生後少なくとも６週令であるSwiss−Websterマウスを
Taconic Farms（Germantown,NY）から入手した。５匹の
マウスの群を、予め採血し、完全フロインドアジュバン
ト（CFA）を用いるかまたは用いずして（Ｎ−１−20）
キャリアーペプチド接合体１μｇまたは10μｇで筋肉内
に予防接種した。動物を、ブースターに使用したと同量
のワクチンで４週目にブースターした。CFAで初回免疫
したマウスは不完全フロインドアジュバント（IFA）中
の接合体でブースターした。マウスを４週目および６週
目に採血した。
Taconic Farms（Germantown,NY）から入手したウサギ
を10μｇのペプチド−接合体で免疫化し、上記と同じ予
防接種スケジュールに従って採血した。
10.3. PBOMP−1 N末端（Ｎ−１−20）ペプチドに対す
るモノクローナル抗体の調製 PBOMP−1 N末端ペプチド−キャリアー接合体に対する
抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系は、6.2.2節記載
のようにしてマウスミエローマ細胞系X63.Ag8.6543を
（Ｎ−１−20）−キャリアー接合体で免疫化したC57/B1
マウスから得た脾臓細胞と融合させることにより得た。
所望のハイブリドーマを限界希釈法により再クローン化
し（その操作の詳細な説明に関しては6.2.2節参照）そ
してウエスタンブロットにより（Ｎ−１−20）−キャリ
アー接合体との反応性に関してスクリーニングした。選
択されたハイブリドーマを標準操作（Brodeurら、上
記）によりBalb/cマウスに注射して腹水として増殖させ
た。
10.4. PBOMP−1 N末端（Ｎ−１−20）ペプチド−キャ
リアー接合体の免疫原性 PBOMP−1 N末端（Ｎ−１−20）ペプチド接合体の免疫
原性を一つの研究で調べた。マウスおよびウサギを、CF
A中で乳化した（Ｎ−１−20）ペプチド−キャリアー接
合体（またはPBOMP−１）10μｇで皮下免疫化し、その
４週間後IFA中のブースター注射で免疫化した。最後の
注射の14日後に動物から採血した。
動物抗血清の抗（Ｎ−１−20）ペプチド活性を上記6.
2.2節記載のELISA法により測定した。簡単に云えば、96
ウェルポリスチレンプレート（NUNC Intermed,Thousand
Oaks,CA）に、PBOMP−１または（Ｎ−１−20）−ペプ
チド−キャリアー接合体、即ち（Ｎ−１−20）−ペプチ
ド−BSAをPBS中１μg/mlの濃度で被覆した。プレートを
加湿室中37℃で一夜インキュベートした。予防接種前血
清を常に陰性対照として使用しそしてポリクローナル抗
PBOMP−１血清を陽性対照として使用した。IgG抗マウス
抗血清にカップリングしたアルカリホスファターゼを二
次抗体として使用した。反応はジエタノールアミン緩衝
液中1mg/mlのｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いて
発色させた。Bio−Tek310オートリーダーを用いて、410
nmおよび690nmで光学濃度（OD）を読み取った。結果を
表13に示す。
ELISA結果は、（Ｎ−１−20）−キャリアー接合体が
ペプチド（BSAキャリアーに接合）および天然型PBOMP−
１を認識する能力を有するマウスおよびウサギ抗ペプチ
ド抗体を誘発するのに高度に効果的であることを示した
（表13参照）。（Ｎ−１−20）−キャリアー接合体で免
疫化したマウスは1:1,024,000の高い抗ペプチド力価応
答を示した。また、マウス抗ペプチド抗体はELISA中の
親PBOMP−１を1:512,000で強く認識した。これらの抗ペ
プチド抗体はＮ−末端ペプチドに対して特異的であるこ
とが明らかである。何となれば、ごく微量のこれら抗体
しかBSAと反応しなかったからである。
最高のウサギ抗ペプチド力価はウサギ＃２で1:4,096,
000で得られた。ウサギ＃１も1:256,000の強い抗ペプチ
ド力価を有していた。両方のウサギ抗ペプチド血清がウ
サギ＃１およびウサギ＃２の免疫前力価と比較した力価
のそれぞれ32倍および512倍の増加により判るとおり、
天然型PBOMP−１を認識できた。興味あることに、PBOMP
−１に対して生成された抗タンパク質抗体は1:256,000E
LISA力価以上でＮ末端ペプチドと反応し、このことはＮ
末端エピトープが免疫優性であることを示唆している。
SDS/ウエスタンブロット技術を（Ｎ−１−20）−キャ
リアー接合体に対して生成された抗ペプチド血清の評価
にも使用した。抗ペプチド抗体およびマウス抗−PBOMP
−１ポリクローナル血清は、両方の接合体、即ちペプチ
ド−BSAおよびペプチド−チログロブリンと反応し、ま
たイムノブロットで天然型PBOMP−１とも反応すること
が観察された。また、ウエスタンブロットの結果では、
例えあったとしてもわずかな抗体しかMBS−スペーサー
に対して生成されないことが明らかになった。というの
はこれら抗ペプチド血清はMBSスペーサーを介してBSAに
連結された「ナンセンス」ペプチド（等しい大きさの）
からなる対照接合体とは反応しなかったからである。
遊離ペプチド（10μｇ量）はFCAと共に投与した場合
ですらも免疫原性ではなかった。他の知見（Hopp,1984,
Mol.Immuno.21:13−16）とは対照的に、パルミチル−ペ
プチド接合体もマウスで免疫原性でなかった。有用な抗
体応答を惹起するため、Ｎ−末端ペプチドをタンパク質
キャリアー、例えばチログロブリンにカップリングさせ
た。
10.5. 機能アッセイ：抗（Ｎ−１−20）ペプチド抗体
の殺菌活性 H.インフルエンザエS2株に対するマウス抗（Ｎ−１−
20）ペプチド抗血清の殺菌活性（BC）を、上記9.4.節記
載の操作を用いて測定した。
結果を表14に示す。
マウス抗−（Ｎ−１−20）ペプチド接合体抗体は1/40
の希釈度でS2生物を殺滅でき、これはマウス抗−PBOMP
−１ポリクローナル血清の1/80希釈に匹敵する。対照群
として、遊離ペプチド（非接合、CFA中で投与）で免疫
したマウスは有効な殺菌性抗血清を生じなかった（表1
4）。事実、対照群ではＮ−末端（Ｎ−１−20）ペプチ
ドに対する有意な（２倍以上）免疫応答は何ら観察され
なかった。
２個体のウサギ抗−（Ｎ−１−20）ペプチド抗血清の
殺菌活性もまた表14に示す。たとえこの２つの免疫前血
清が殺菌活性を有していたとしても、免疫後の血清はH.
インフルエンザエの補体依存性殺滅を媒介するのにより
効率的であった。ウサギ＃１は1/2560の殺菌（BC）力価
を生じ、これは免疫前レベルの８倍上昇を示しており、
一方ウサギ＃２は４倍増の1/1280の生物力価を生じた。
我々は、より高い抗−（Ｎ−１−20）力価を有していた
ウサギ＃２抗血清がより高いBC活性を示すと予想した
が、ウサギ＃１抗血清の方がより良好な殺菌効果を示し
た。
11. 組み換えDNA由来PBOMP−2:PBOMP−１融合タンパク
の単離および特性決定 11.1. E.coli中におけるPBOMP−2:PBOMP−１発現のた
めのプラスミドpPX183の作製 lacプロモーターの制御下におけるPBOMP−2:PBOMP−
１融合タンパク発現のためのプラスミドpPX183の作製を
以下に記載しそして図30に概略して示す。
PBOMP−１およびPBOMP−２遺伝子を含むDNAフラグメ
ントはそれぞれプラスミドpPX167およびpPX163に由来す
る。これらプラスミドそれぞれの単離は前出の8.1節お
よび8.2節に記載される。プラスミドpPX163およびpPX16
7の精製DNAフラグメントをそれぞれ別々にSca Iで完全
に消化した。次にpPX163消化物をさらにHind IIIで処理
して部分消化物を得た。複製起点、1acプロモーターお
よびPBOMP−２遺伝子を包含する生成する2.7kb Sca I−
Hind IIIフラグメントを前記6.4.2節に記載されるよう
にしてアガロースゲルから単離した。PBOMP−１遺伝子
および調節配列を含む1.4kb Sca I−Hind IIIフラグメ
ントをpPX167の完全なSca I−Hind III消化物から同様
な方法で単離した。次にこの２つのSca I−Hind IIIフ
ラグメントを6.4.3節記載の操作を用いて連結した。ア
ンピシリン抵抗性形質転換体を選択することにより活性
β−ラクタマーゼ遺伝子（Sca I部位により中断）の再
形成が確保された。この操作により4.1kbプラスミドが
生成され、このものはpPX183と呼ばれた。このプラスミ
ドは図30に示されるように２つのPBOMP遺伝子が枠内連
結したPBOMP−2:PBOMP−１融合タンパクをコードする。
11.2. PBOMP−2:PBOMP−１融合タンパクの発現 プラスミドpPX183をE.コリJM103中に形質転換しそし
て生成した株を1ac調節の下における組み換え融合タン
パクの生産について検査した。プラスミドpPX183を含有
するIPTG誘導JM103細胞の全細胞抽出物のクーマシーブ
ルー染色SDS−ポリアクリルアミドゲルによれば、全細
胞タンパクの１−２％を占める約30,000ダルトン分子量
を有するタンパクが示された。ウエスタンブロット分析
では、この組換え融合タンパクがPBOMP−１特異的モノ
クローナル抗体ともそしてまたPBOMP−２特異的モノク
ローナル抗体とも反応することが示された。このよう
に、プラスミドpPX183によりコードされる融合タンパク
生産物はPBOMP−１とPBOMP−２両方のエピトープを担持
する。
11.3. PBOMP−2:PBOMP−１融合タンパクを発現するプ
ラスミドpPX199の作製 プラスミドpPX183はハイブリッドPBOMP−1/PBOMP−２
タンパクすなわち融合タンパクをコードするが、このプ
ラスミドにより発現されるタンパク質はpUC19ベクター
によりコードされる付加的なアミノ酸を含有する。詳し
くは、pPX183のヌレオチド配列はpPX163からの18個の付
加的なコドンを５′末端でそして融合接合点で13個の付
加的なコドン、すなわちpUC19ベクター由来の31コドン
を含有する。この余分な情報の大部分を有しない新たな
融合遺伝子が以下のとおり作製された。
初めに、PBOMP−２遺伝子を含有するpAA130の誘導体
を、PBOMP−２の開始コドンの５ヌクレオチド５′側で
切断するSsp Iで消化し、次にPBOMP−２遺伝子をコドン
148、すなわちこの遺伝子の３′末端からの６コドン目
を切断するHind IIIで消化した。配列分析によれば、こ
のフラグメントはプラスミドpUC8に連結できそしてSma
IおよびHind IIIで消化されて「天然型」遺伝子の５′
末端に７コドンが融合し３′末端で６アミノ酸が欠失し
た組換えPBOMP−２遺伝子を生成できることが示され
た。この方法でプラスミドが生成され、そしてpPX195と
呼ばれた（図31参照）。
次にPBOMP−１遺伝子を含有するプラスミドpPX167
（前出の8.1節参照）を以下の方法で改変した。すなわ
ちこの遺伝子の３′末端のBamH I部位をBamH Iでの部分
消化により除きそしてE.コリDNAポリメラーゼＩ（クレ
ノウフラグメント）での処理により再連結した。pX188
と呼ばれる生成するプラスミドは制限分析およびrPBOMP
−１の生産により証明された（図31参照）。pPX188のrP
BOMP−１遺伝子の５′末端を、pUC19ポリリンカー領域
からのHind III−BamH Iフラグメントの除去、およびHi
nd IIIおよびBamH I付着端ならびにPBOMP−２の６個の
３′コドンを有する合成オリゴヌクレオチドの挿入によ
り修飾した。この作製物はDNA配列分析により証明され
そしてこのプラスミドをpPX198と呼んだ。
プラスミドpPX195およびpPX198をHind IIIおよびSca
Iで消化しそしてそれぞれPBOMP−２およびPBOMP−１遺
伝子を担持するフラグメントを単離して連結した。生成
するプラスミドをpX199と呼んだ（図31）。プラスミドp
X199は５′末端に７個の付加的なコドン（pUC8から）そ
して融合接合点で２個有するPBOMP−2:PBOMP−１融合遺
伝子を発現する。この融合タンパクはSDS−PAGE（図32
参照）によれば見かけの分子量約32000ダルトンを有
し、そしてPBOMP−１、PBOMP−２、PBOMP−2 Mab61−１
（6.2.2節参照）および種々のPBOMP−1 Mabに対するポ
リクローナル抗血清によりウエスタンブロットで認識さ
れる。
11.4. シグナルレスPBOMP−2:PBOMP−１融合タンパク
の発現 pPX199のPBOMP−2:PBOMP−１融合タンパク遺伝子はPB
OMP−２シグナルペプチドをコードしており、そして生
成する融合タンパクはリポタンパクとして修飾されそし
てそれを発現するE.リコ細胞の外層膜と緊密に結合され
る。この融合タンパクは膜から分離困難で水性溶媒中に
あまり溶解しない。シグナルレスPBOMP−2:PBOMP−１融
合タンパクを発現するプラスミドの構築は図33に示され
ている。
初めに、PBOMP−２遺伝子のシグナルレス形を以下の
方法で作製する。すなわちPBOMP−２タンパクをコード
するプラスミドpPX163の660bp EcoR I/Sal I制限フラグ
メントを単離し、そしてその遺伝子のヌクレオチド91の
特有のHph I部位で切断してPBOMP−２のカルボキシ末端
125アミノ酸をコードする545bp Hph I/EcoR Iフラグメ
ントを単離した。
次にPBOMP−２遺伝子の修飾された５′末端を修復す
るために下記合成オリゴヌクレオチドリンカーを構築し
た。
このリンカーは下記特徴を有する修飾されたPBOMP−
２遺伝子を生成させるために設計された。
（１） シグナルペプチドコード配列の非存在、 （２） Ｎ−末端システイン残基（メチオニンにより置
換）を除く全成熟PBOMP−２配列の修復、 （３） 開始コドンでの新たな特有のNcoI制限部位、 （４） コード領域のヌクレオチド12で新たな特有のEc
oRV制限部位を生成させるためのゆらぎ塩基変化、 （５） 新たな翻訳開始部位（SDボックス）、および （６） lac翻訳読み進みを阻止するための上流の枠内
終止コドン（TAA）。
このリンカーをpPX163からのHph I/EcoR Iフラグメン
トおよびXba IおよびEcoR I切断pUC19DNAと1:1:1のモル
比で混合し連結させた。この連結混合物をE.コリDH5 la
q Iqに形質転換しそしてAmpRコロニーをPBOMP−２生産
に関してMab61−１を用いて検索した。陽性コロニーが
いくつか見出され、そしてその構成を制限分析およびDN
A配列分析により証明した。単離物の一つをpPX510と呼
んだ。
プラスミドpPX510はSDS−PAGEによれば14000ダルトン
の見かけの分子量を有するタンパクをコードしており、
このタンパクはポリクローナル抗PBOMP−２血清および
抗PBOMP−2 Mab61−１の両方によって認識された。シグ
ナルレス組換えPBOMP−２の発現はlac調節の下にあり、
そして充分に誘導された細胞がこの構造物を全細胞タン
パクの約５％として発現した。
シグナルレス融合遺伝子を次にpPX510およびpPX198か
らpPX199の構築と同様の方法で製作した（前記11.3節参
照）。要約すれば、この２つのプラスミドをHind IIIお
よびSca Iで消化しそしてPBOMP−１およびPBOMP−２フ
ラグメントを連結した。生成するプラスミドをE.コリDH
5α（BRL,Gaithersburg,MD）に形質転換して、これをpP
X512と呼んだ。pPX512により発現されたシグナルレス融
合タンパクはSDS−PAGEによれば見かけの分子量30000ダ
ルトンを有しておりそしてPBOMP−１およびPBOMP−２の
両方に対するポリクローナル抗血清により認識された。
この融合タンパクはまた、PBOMP−2 Mab61−１およびウ
エスタンブロット分析で検査されたすべてのPBOMP−1 M
abによっても認識された。
12. 融合タンパクサブユニットワクチンの効力 12.1. 抗PBOMP−2:PBOMP−１抗体の調製 pPX183（前記11.1節参照）を含有するE.コリJM103の
細胞抽出物のSDS−PAGEゲルから実質的に純粋なPBOMP−
2:PBOMP−１を単離した。調製用SDS−PAGEゲル上の融合
タンパクバンドの位置はゲルの端から切断したストリッ
プのクーマシーブルー染色により推定した。融合タンパ
クを含有する切片をゲル溶離緩衝液（0.2M NaCl、0.05M
トリス、pH8.0、0.1％ SDSおよび0.1mM EDTA）中におだ
やかに動かしながら室温で一夜浸漬した。抽出されたタ
ンパクは標準物としてBSAを用いるLowry Proteinアッセ
イにより概算された。
２匹の雌のニュージーランド白ウサギを当初の免疫原
性調査に用いた。免疫前血清源として予防接種に先立ち
予備採血（第０週）した。50μｇの実質的に純粋なPBOM
P−2:PBOMP−１融合タンパク（容量100μに調整）を
同量のCFAと混合しそしてウサギの多量部位に筋肉内注
射した。３週間後に血液試料をとり、そして第４週にウ
サギをIFA中に乳濁した50μｇの融合タンパクで再免疫
した。第７週に血液試料をとり、血清を調製してELISA
および殺菌アッセイを行った。ELISAおよび殺菌活性ア
ッセイの結果を表15に示す。
組換え融合タンパクPBOMP−2:PBOMP−１での免疫化に
より、ELISAアッセイで判定されるようにPBOMP−１およ
びPBOMP−２の両方への抗体応答が惹起され、そしてこ
れら抗血清は莢膜被包されてないH.インフルエンザエ株
S2に対する殺菌活性を有した（表15）。これらの結果
は、PBOMP−2:PBOMP−１融合タンパクがPBOMP−１およ
びPBOMP−２の両方に対する抗体応答を誘発させるのに
高度に有効であること、およびこの免疫原性応答が殺菌
アッセイにおいて生物学的に機能することを示してい
る。
もう一つの実験シリーズにおいては、サブユニットワ
クチン製剤としてのPBOMP−1:PBOMP−２融合タンパクの
免疫原性および効力をさらに証明するための試験系とし
て成体チンチラが用いられた。チンチラはH.インフルエ
ンザエに感染した場合ヒトに見られると非常によく似た
耳炎を生ずるので、モデル動物系として用いられる。
（Barenkampら、1986,Infect,Immun.52:572−78参
照）。
11.3節に記載されるようにpPX199を含有するE.コリJM
103により発現されたPBOMP−2:PBOMP−１融合タンパク
はリポタンパクとして修飾され、そしてE.コリ宿主細胞
の外層膜と緊密に結合される。実質的に純粋なPBOMP−
2:PBOMP−１はE.コリ宿主細胞の内層膜および外層膜タ
ンパクの分画界面活性剤抽出を要する下記方法により、
pPX199を含有するE.コリJM103から単離された。要約す
れば、E.コリの内層膜タンパクを10mMトリス−HCl pH
8、5mM EDTA中の１％サルコシルを用いて抽出すると不
溶性の外層膜−細胞壁複合体が残る。
他の外層膜−細胞壁成分の分画界面活性剤抽出によ
り、PBOMP−2:PBOMP−１融合タンパクが富化されたサブ
フラクションが得られた。サルコシル不溶性外層膜細胞
壁成分から10mMトリス−HCl pH8、5mM EDTA、１％デオ
キシコレート中の１％ Zwittergent3−12TM、１％Zwitt
ergent3−14TMを用いて60℃で連続抽出することにより
外層膜タンパクが抽出された。PBOMP−2:PBOMP−１融合
タンパクが富化した不溶性物質が遠心分離後に得られ
た。PBOMP−2:PBOMP−１融合タンパクはPBOMP−2:PBOMP
−１富化フラクションを１％ Zwittergent3−14、50mM
トリス−HCl、5mM EDTA、pH8.0、6M尿素を用いて80℃で
45分間抽出することにより可溶化した。可溶化後、尿素
を含有しない同じ緩衝液で室温で一夜透析することによ
り、抽出された融合タンパクから尿素を除去した。
可溶化された融合タンパクの見かけの純度は75〜80％
であった。約25mgのタンパクが約10〜20gの湿潤重量融
合タンパクから可溶化された。主要タンパクは無傷の融
合タンパクと確認された。主要な低分子量タンパクも融
合タンパクから誘導された、なぜならこのものはエピト
ープ分析により判定してPBOMP−２タンパクに融合したP
BOMP−１タンパクのＮ−末端領域を含有したからであ
る。PBOMP−１のＣ−末端2/3がこのタンパクから失われ
ていた。これは恐らくは誘導期間中のタンパク分解的分
解の結果であるか、または時期尚早の翻訳終止によるの
であろう。この調製物の純度を図32に示す。
５匹の成体チンチラを１つの動物実験に用いた。予防
接種に先立ち心臓穿刺により得られた予備採血物（第０
日）を免疫前血清源として用いた。前記したプラスミド
pPX199を含有するE.コリ細胞から得られた実質的に純粋
なPBOMP−2:PBOMP−１融合タンパク25μｇを明ばんに吸
収させたものをチンチラに筋肉内注射した。30日後に血
液試料をとり、そして動物を第30日目に明ばん上の精製
融合タンパク25μｇで再び免疫した。第60日目に心臓穿
刺により再び血液試料をとった。血清を調製してELISA
および殺菌アッセイを行った。実質的に純粋なPBOMP−
１（抗−PBOMP−１）またはPBOMP−２（抗−PBOMP−
２）の組換え形のいずれかを抗原として用いて前記のよ
うにしてELISAアッセイを行った。血清試料の殺菌活性
はH.インフルエンザエP860295 Dr.Charles Bluestone,C
hildren's Hospital Pittsburgh,PA,から入手した臨床
的非類型的菌株）を用い、前記7.1節記載のようにして
検査した。ELISAおよび殺菌活性アッセイの結果を表16
に示す。
25μｇの融合タンパクPBOMP−2:PBOMP−１での免疫化
により、我々の実験室でヘモフィルスの外層膜に対して
かつて観察された最高力価の一つであるBC活性が惹起さ
れた。PBOMP−１およびPBOMP−２の両方に対するELISA
アッセイで観察された高レベルの活性と一緒になって、
表16の結果はPBOMP−2:PBOMP−１融合タンパクがチンチ
ラにPBOMP−１およびPBOMP−２の両方に対する抗体応答
を誘発するのに驚くほど高い効果があることを示してい
る。これらの結果はさらに、この融合タンパクがH.イン
フルエンザエの臨床株に対する殺菌アッセイにおいて生
物学的に活性な免疫応答を惹起することをも示してい
る。
12.2. Ｅタンパクと組み合せたPBOMP−2:PBOMP−１融
合タンパクは抗ヘモフィルス抗体を誘導する Ｈタンパクは分子量約28,000ダルトンを有するH.イン
フルエンザエのもう一つの外層膜タンパクである。Ｅタ
ンパクはH.インフルエンザエの他の外層膜タンパクと結
合してリポタンパクとして存在する。
H.インフルエンザエからのＥタンパクは1989年３月９
日出願の米国特許出願第07/320,971号に記載されるよう
にして実質的に純粋な形態で得られた。要約すれば10μ
g/mlのヘミンおよび１μg/mlのNADを含有する脳心臓浸
出培地（BHI/XV）またはmMIC（Herriorttらの改良、197
0,J.Bacteriol.,101:513−516培地）のいずれかの上で
生育したHib株Eagan細胞から細胞エンベロープを単離し
た。細胞は10,000×ｇ、４℃で10分間遠心することによ
り液体培養物から回収した。細胞ペレットを秤量して、
細胞の湿潤重量の５倍容量の10mM HEPES−HaOH（pH7.
4）、1mM EDTA中に再懸濁した。この細胞をGaulinホモ
ナイザーを用いて破壊した。この破壊した細胞懸濁液を
10,000×ｇで４℃で５分間遠心して未破壊細胞および大
きな細胞層を除去した。上清フラクションを確保してNa
Clを0.5Mまで加えた。100,000×ｇで４℃で約１時間遠
心することにより細胞膜をペレット化した。
全膜フラクションを10mM HEPES−NaOH、1mM MgCl2、p
H7.4中の２％トリトンＸ−100を用いて反復して抽出す
ることにより、全膜フラクションから内層膜を除去して
外層膜−細胞壁複合物を得た。外層膜−細胞壁複合物を
含有する不溶性残留物を350,000×ｇで４℃で30分間遠
心することによりペレット化した。次にこの複合物を50
mMトリス−HCl、5mM Na2 EDTA、pH8中に再懸濁して４℃
で貯蔵した。
混入タンパクは以下のように分画界面活性剤抽出する
ことによりH.インフルエンザエ細胞エンベロープから可
溶化した。前記のようにして調製された細胞エンベロー
プを50mMトリス−HCl、5mM Na2 EDTA、pH8中の１％サル
コシルを用いて２回連続して抽出した。この抽出を３回
反復した。可溶化されたタンパクＥを含有するフラクシ
ョンをプールして、50mMトリス−HCl、5mM Na2 EDTA、p
H8で平衡化したDEAEカラムに通した。これらの条件下で
Ｅタンパクは保持されないが主要タンパク混入物は保持
された。次にＥタンパクを含有する流下フラクションを
50mMトリス−HCl、pH8で平衡化したヒドロキシルアパタ
イトカラムに通した。Ｅタンパクはこれらの条件下に保
持された。Ｅタンパクを吸着したヒドロキシルアパタイ
トカラムを次に１カラム容量の50mMトリス−HCl、pH8で
洗浄した。Ｅタンパクは0.3M二塩基性燐酸塩、pH8中の
１％ Zwitter−gent3−14TMを用いてヒドロキシルアパ
タイトから溶離された。タンパクＥを含有するフラクシ
ョンをプールし、透析濾過（diafiltration）により濃
縮し、そしてエタノールで沈澱させた。沈澱したＥタン
パクを次に分画界面活性剤抽出により再び可溶化した。
沈澱をはじめに50mMトリス−HCl、pH8中の１％オクチル
グルコシドで抽出しそして不溶性Ｅタンパクが沈澱中に
残った。次にタンパクＥを50mMトリス−HCl、5mM Na2 E
DTA、pH8中の１％ Zwittergent3−14TMで可溶化した。
上記のようにして調製されたＥタンパクは実質的に純粋
であって実質的に内毒素を有しない。
この実質的に純粋なＥタンパクの25μｇを前記12.1節
に記載のようにして得られた実質的に純粋なPBOMP−2:P
BOMP−１融合タンパク25μｇと混合し、0.85％食塩水中
に希釈しそして明ばんに吸収させた。
成体チンチラにPBOMP−2:PBOMP−１融合タンパク25μ
ｇおよびＥタンパク25μｇを含有する混合物量を筋肉内
注射した。血液試料は第０日目に第１回の免疫化の直
前、第30日目に第２の免疫化前に、そして第60日目に採
った。ELISAアッセイは抗原としてPBOMP−2:PBOMP−１
またはＥタンパクを用いて前記のようにして行った。殺
菌アッセイはH.インフルエンザエP860295を試験菌株と
して用いて前記と同様に実施した。ELISAおよび殺菌ア
ッセイの結果を表17に示す。
ELISA検査結果は、Ｅタンパクに対する応答が非常に
高く、融合タンパクのPBOMP−２部分のそれに匹敵する
レベルに達していることを示している。Ｅタンパクと融
合タンパクとの間には何ら阻止作用は観察されなかっ
た。抗血清の生物活性はBCアッセイを用いて測定され
た。25μｇのＥは我々の実験室でヘモフィルスのOMPに
対する抗体でかって見られた最高BC力価の一つを惹起し
た。BC力価は融合タンパクのみを与えられたチンチラの
それより大きかった。混合ワクチン抗血清のBC活性が相
乗作用または相加作用を示したと記載することはできな
いが、この混合物の活性は融合単独のそれと同じかまた
はそれより良好である。これらの結果はヘモフィルスに
対するワクチンとしての、精製Ｅタンパクと組み合せた
融合タンパク混合物の使用を強く支持している。
13. 微生物の寄託 列記するプラスミドを担持する下記E.コリ株がAgricu
tural Research Culture Collection（NRRL）,Peoria,I
L.に寄託されておりそして下記受託番号が割当てられ
た。
E.コリ株 プラスミド 受託番号 JM 83 pAA152 Ｂ−18155 JM 83 pAA130 Ｂ−18154 JM 83 pGD103 Ｂ−18153 JM 103 pPX163 Ｂ−18285 JM 13 pPX167 Ｂ−18286 JM 103 pPX168 Ｂ−18287 JM 103 pPX183 Ｂ−18377 JM103 pPX199 Ｂ−18530 DH5 α pPX152 Ｂ−18531 本発明は寄託された微生物により範囲を限定されるべ
きではない、何故なら寄託された様態は本発明の一観点
の一つの説明として意図されたものであり、そして機能
的に均等な多くの微生物が本発明の範囲内にある。事
実、ここに示され記載されたものに加え本発明の種々の
改変がこれまでの記載および添付図面から当業者には明
白となろう。かかる改変は添付の請求の範囲に該当する
ことが意図される。
また、ヌクレオチドについて示されたすべての塩基対
寸法は概数でありそして記述のために用いられているこ
とも理解されるべきである。
Agricultural Research 寄託所在地:1815 North University Street Peoria,IL
61604 U.S.A. 寄 託 日 受 託 番 号 1986年12月24日 Ｂ−18153 1986年12月24日 Ｂ−18154 1986年12月24日 Ｂ−18155 1987年12月 9日 Ｂ−18285 1987年12月９日 Ｂ−18286 1987年12月９日 Ｂ−18287 1989年８月10日 Ｂ−18530 1989年８月10日 Ｂ−18531
フロントページの続き 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８１５４ 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８１５５ 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８２８５ 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８２８６ 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８２８７ 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８３７７ 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８５３０ 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１８５３１ (72)発明者 デイチ，ロバート，エー. アメリカ合衆国 ニューヨーク州 14625，ロチェスター，フォールブルッ ク サークル 10 (72)発明者 ズロトニック，ゲーリー，ダヴリュー. アメリカ合衆国 ニューヨーク州 14526，ペンフィールド，レッドウッド ドライヴ 17 (72)発明者 グリーン，ブルース，エー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 14534，ピッツフォード，ノースフィー ルド ゲート 49 (56)参考文献 国際公開88／4932（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 19/00 A61K 39/102 C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）図11に示されるアミノ酸配列のアミ
    ノ酸残基20−153、及び（ｂ）図15に示されるアミノ酸
    配列のアミノ酸残基19−154、を含んでなる実質的に純
    粋である約30000ダルトンの分子量を有するヘモフィル
    ス・インフルエンザの融合タンパク質。
  2. 【請求項２】（ａ）図15に示されるアミノ酸配列のアミ
    ノ酸残基20−153、及び（ｂ）図11に示されるアミノ酸
    配列のアミノ酸残基19−154、を含んでなる実質的に純
    粋である約30000ダルトンの分子量を有するヘモフィル
    ス・インフルエンザの融合タンパク質。
  3. 【請求項３】請求の範囲１又は２に記載の融合タンパク
    質の有効量を製剤上の担体と混合した免疫原を含んでな
    るサブユニットワクチン製剤。
  4. 【請求項４】請求の範囲１又は２に記載の融合タンパク
    質をコードするDNA塩基配列からなる組換えベクター。
  5. 【請求項５】請求の範囲４に記載の組換えベクターを含
    むエシェリヒア・コリ細菌。
JP01510093A 1988-09-01 1989-08-31 ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のためのワクチンおよび診断アッセイ Expired - Lifetime JP3073212B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/239,572 US5098997A (en) 1987-12-11 1988-09-01 Vaccines for Haemophilus influenzae
US39657289A 1989-08-21 1989-08-21
US396,572 1989-08-21
US239,572 1989-08-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH04502147A JPH04502147A (ja) 1992-04-16
JP3073212B2 true JP3073212B2 (ja) 2000-08-07

Family

ID=26932683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP01510093A Expired - Lifetime JP3073212B2 (ja) 1988-09-01 1989-08-31 ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のためのワクチンおよび診断アッセイ

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0432220B1 (ja)
JP (1) JP3073212B2 (ja)
KR (2) KR0170752B1 (ja)
AT (1) ATE124420T1 (ja)
AU (2) AU631378B2 (ja)
CA (1) CA1340888C (ja)
DE (1) DE68923286T2 (ja)
DK (1) DK174965B1 (ja)
WO (1) WO1990002557A1 (ja)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5300632A (en) * 1986-11-18 1994-04-05 Research Foundation Of State University Of New York Method for purifying an outer membrane protein of Haemophilus influenzae
AU623353B2 (en) * 1987-12-10 1992-05-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the production of haemophilus influenzae type b major outer membrane protein antigens
US5843463A (en) * 1990-12-21 1998-12-01 Antexbiologics, Inc. Adhesin-oligosaccharide conjugate vaccine for Haemophilus influenzae
JPH07500819A (ja) * 1991-08-13 1995-01-26 バイオテック　オーストラリア　ピーティーワイ　リミテッド 免疫刺激
GB9202219D0 (en) * 1992-02-03 1992-03-18 Connaught Lab A synthetic heamophilus influenzae conjugate vaccine
US5843664A (en) * 1996-06-11 1998-12-01 Institut Pasteur Method of selection of allelic exchange mutants
US6258570B1 (en) * 1998-04-17 2001-07-10 University Of Pittsburgh PCR assay for bacterial and viral meningitis
CA2370887A1 (en) * 1999-06-25 2001-01-04 Benjamin J. Metcalf Production of the lipidated form of the peptidoglycan-associated lipoproteins of gram-negative bacteria
CA2960659C (en) 2007-11-09 2021-07-13 The Salk Institute For Biological Studies Use of tam receptor inhibitors as immunoenhancers and tam activators as immunosuppressors
EP2984932A1 (en) 2014-08-15 2016-02-17 RÜTGERS Organics GmbH A composition of a timber formulation comprising cu salts and organic cyclic ingredients for the preservation of timber for decks
CN112206317B (zh) * 2020-10-12 2023-09-22 浙江省淡水水产研究所 一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4261968A (en) * 1979-05-10 1981-04-14 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4722840A (en) * 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
JP2534529B2 (ja) * 1986-07-24 1996-09-18 ブリティシュ・テレコミュニケ−ションズ・パブリック・リミテッド・カンパニ 放射発生器
WO1990010458A1 (en) * 1989-03-09 1990-09-20 Praxis Biologics, Inc. Vaccines for nontypable haemophilus influenzae

Also Published As

Publication number Publication date
EP0432220B1 (en) 1995-06-28
CA1340888C (en) 2000-02-01
WO1990002557A1 (en) 1990-03-22
DK35891D0 (da) 1991-02-28
AU651030B2 (en) 1994-07-07
DE68923286D1 (de) 1995-08-03
AU3379693A (en) 1993-04-29
JPH04502147A (ja) 1992-04-16
KR0170752B1 (ko) 1999-10-01
AU4228889A (en) 1990-04-02
AU631378B2 (en) 1992-11-26
KR0162488B1 (ko) 1998-11-16
ATE124420T1 (de) 1995-07-15
KR900701291A (ko) 1990-12-01
DK35891A (da) 1991-04-30
EP0432220A1 (en) 1991-06-19
DK174965B1 (da) 2004-04-05
DE68923286T2 (de) 1996-03-07
EP0432220A4 (en) 1991-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100188323B1 (ko) 비타입성 헤모필루스 인플렌자에 대한 백신
EP0449958B2 (en) Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine
Von Specht et al. Protection of immunocompromised mice against lethal infection with Pseudomonas aeruginosa by active or passive immunization with recombinant P. aeruginosa outer membrane protein F and outer membrane protein I fusion proteins
KR960016208B1 (ko) 인플루엔자균(Haemophilus influenzae)의 백신 및 진단방법.
US5098997A (en) Vaccines for Haemophilus influenzae
US5110908A (en) Haemophilus influenzae peptides and proteins
JP3073212B2 (ja) ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のためのワクチンおよび診断アッセイ
US5196338A (en) Recombinant vectors for Haemophilus influenzae peptides and proteins
US5108744A (en) Vaccines for Haemophilus influenzae
CA2007248C (en) Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090602

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090602

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100602

Year of fee payment: 10

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100602

Year of fee payment: 10