DK174965B1 - Praktisk taget rent, antigenisk peptid eller protein med en epitop af Haemophilus influenzae samt underenhedsvaccineformeluring, hvori immungenet indeholder peptidet eller proteinet - Google Patents

Description

i DK 174965 B1 1. Qpfindelsens område.

Den foreliggende opfindelse angår sammensætninger af proteiner og peptider associeret med ydermembranen på Haemophilus influenzae. Nærmere betegnet angår opfindelsen sammen-5 sætninger af proteiner og peptider med relation til en klasse af ydermembranproteiner med en molekylvægt på ca. 16.000 dalton af H. influenzae type b og ikke-typebestemmelig H. influenzae, herunder PBOMP-1 og PBOMP-2. Proteinerne og peptiderne anvendes som immunogener i vaccinepræparater til 10 aktiv immunisering.

Opfindelsen angår således et praktisk taget rent antigenisk peptid eller protein med en epitop af Haemophilus influenzae, der er ejendommeligt ved det i krav l's kendetegnende del angivne. En udføreIsesform herfor er angivet i 15 krav 2. Opfindelsen angår også et praktisk taget rent, antigenisk peptid eller protein som angivet i krav 3-4; et praktisk taget rent, antigenisk peptid eller protein som angivet i krav 5; samt en underenhedsvaccineformulering som angivet i krav 6.

20 2. Opfindelsens baggrund.

2.1. Rekombinant-DNA-teknologi og qenekspression.

Rekombinant-DNA-teknologi indebærer indsættelse af specifikke DNA-sekvenser i en DNA-grundmasse (vektor) til 25 dannelse af et rekombinant-DNA-molekyle, som kan réplikere i en værtscelle. Almindeligvis er den indsatte DNA-sekvens fremmed for recipient-DNA-grundmassen, dvs. den indsatte DNA-sekvens og DNA-vektoren stammer fra organismer, som ikke udveksler genetisk information i naturen, eller den 30 indsatte DNA-sekvens kan være helt eller delvis fremstillet syntetisk. Der er udviklet adskillige, almene metoder, som muliggør konstruktion af rekombinant-DNA-molekyler. F.eks. er der i US patentskrift nr. 4.237.224 beskrevet fremstilling af sådanne rekombinantplasmider ved anvendelse af spaltnings-35 processer med restriktionsenzymer og sammenknytning med DNA-ligase ved kendte ligateringsmetoder. Ved hjælp af trans- 2 DK 174965 B1 formation indføres disse rekombinantplasmider derefter i éncellede kulturer, herunder procaryotiske organismer og eucaryotiske celler dyrket i vævskultur, og replikeres deri.

På grund af den almene anvendelighed af den deri beskrevet 5 teknik skal der her henvises til US patentskrift nr. 4.237.224.

En anden metode til indføring af rekombinant-DNA-molekyler i éncellede organismer er beskrevet i US patentskrift nr. 4.304.863, hvortil der også skal henvises. Denne 10 metode udnytter et emballerings/transduktions-system med bakteriophagvektorer (cosmider).

Rekombinantgener kan også indføres i vira, såsom vacciniavirus. Rekombinantvira kan frembringes ved transfek-tion af plasmider ind i celler inficeret med virus.

15 Uanset den anvendte konstruktionsmetode skal rekom- binant-DNA-molekylet være foreneligt med værtscellen, dvs. i stand til autonom replikation i værtscellen eller være stabilt integreret i et af værtscellens chromosoraer. Rekom-binant-DNA-molekylet eller -viruset (f.eks. en vacciniavi-20 rusrekombinant) bør også have en mærkestoffunktion, som tillader udvælgelsen af et eller flere af de ønskede rekom-binant-DNA-molekyler eller vira. Endvidere vil det fremmede gen, hvis alle de hensigtsmæssige replikations-, transcriptions- og translationssignaler er arrangeret korrekt på 25 rekombinant-DNA-molekylet, blive rigtigt eksprimeret i de transformede bakterieceller, således som det er tilfældet med bakterieekspressionsplasmider, eller i fakultative cellelinier inficeret med et rekombinantvirus eller et rekom-binantplasmid, som bærer en eucaryotisk replikationsoprin-30 delse.

Forskellige genetiske signaler og behandlingsbegivenheder kontrollerer mange niveauer af genekspression, f.eks. DNA-transcription og translation af budbringer-RNA (mRNA). Transcription af DNA er afhængig af tilstedeværelsen af en 35 promotor, som er en DNA-sekvens, som dirigerer bindingen af RNA-polymerase og derved fremmer mRNA-syntese. DNA-sekven- 3 DK 174965 B1 serne i eucaryotiske promotorer afviger fra sekvenserne i procaryotiske promotorer. Desuden kan eucaryotiske promotorer og ledsagende, genetiske signaler eventuelt ikke blive erkendt i eller eventuelt ikke fungere i et procaryotisk sy-

5 stem, og endvidere erkendes procaryotiske promotorer ikke V

og fungerer ikke i eucaryotiske celler.

Tilsvarende afhænger translation af mRNA i procaryoter af tilstedeværelsen af de rigtige, procaryotiske signaler, som afviger fra signalerne i eucaryoter. Effektiv translation 10 af mRNA i procaryoter kræver et ribosombindingssted betegnet Shine-Dalgarno-sekvensen (SD) på mRNA. Denne sekvens er en kort nucleotidsekvens i mRNA, som er placeret før startco-donen, sædvanligvis AUG, som koder proteinets aminoterminale methionin. SD-sekvenserne er komplementære til 3'-enden i 15 l6S-rRNA (ribosomal-RNA) og fremmer formodentlig binding af mRNA til ribosomer ved dupleksering med rRNA for at tillade korrekt placering af ribosomet. En oversigt over maksimering af genekspression findes i Roberts og Lauer, 1979, Methods in Enzymology 68, 473.

20 Mange andre faktorer komplicerer ekspressionen af fremmede gener i procaryoter, selv efter at de rigtige signaler er indsat og placeret hensigtsmæssigt. En sådan faktor er tilstedeværelsen af et aktivt, proteolytisk system i E. coli og andre bakterier. Dette proteinsønderdelende system 25 ser ud til selektivt at ødelægge "unormale" eller fremmede proteiner. En umådelig anvendelighed ville derfor blive tilvejebragt ved udviklingen af et middel til beskyttelse af eucaryotiske proteiner eksprimeret i bakterier mod proteolytisk sønderdeling. En strategi er at konstruere hybrid-30 gener, hvori den fremmede sekvens er ligateret i fase (dvs. i den korrekte læseramme) med procaryotisk gen. Ekspression af dette hybridgen resulterer i et fusionsproteinprodukt (et protein, som er et hybrid af procaryotiske og fremmede aminosyresekvenser).

35 Resultatrig ekspression af et klonet gen kræver ef fektiv transcription af DNA, translation af mRNA og i visse 4 DK 174965 B1 tilfælde post-translationel modifikation af proteinet. Ekspressionsvektorer er blevet anvendt til eksprimering af gener i en egnet vært og til forøgelse af proteinproduktion.

Det klonede gen bør placeres ved siden af en stærk promotor, 5 som kan kontrolleres, således at transcription kan sættes i gang, når det er nødvendigt. Celler kan dyrkes til en høj tæthed, hvorefter promotoren kan tilskyndes til forøgelse af antallet af transcriptioner. Disse vil, hvis de er effektivt translateret, resultere i høje udbytter af protein.

10 Dette er specielt værdifuldt system, hvis det fremmede protein er skadeligt for værtscellen.

2.1.1. E. coli som et værtssvstem for ekspression.

De fleste plasmidkloningsvektorer, som gængs anvendes 15 i E. coli, er derivater af repliconer af ColEl-typen (yderligere information findes i Oka et al., 1979, Mol. Gen. Genet. 172, 151-159). ColEl-plasmiderne opretholdes stabilt i stammer af E. coli som monomere molekyler med et kopiantal på ca. 15-20 kopier pr. chromosom. Der er blevet opnået 20 forskellige niveauer af ekspression af humane og animalske proteinprodukter af fremmede gener indsat i disse plasmider.

Der bør imidlertid opnås meget høje ekspressionsniveauer, for at systemet kan blive økonomisk lønnende til produktion af fremmede proteinprodukter.

25 En metode til opnåelse af store mængder af et givet genprodukt er at klone et gen på et plasmid, som har et meget højt kopiantal i bakteriecellen. Ved forøgelse af antallet af kopier af et specielt gen bør mRNA-niveauerne i teorien også vokse, hvilket bør føre til forøget produktion 30 af rekombinantproteinet.

2.1.2. Vacciniavirus som en ekspressionsvektor.

Vacciniavirus kan anvendes som en klonings- og ekspressionsvektor. Viruset indeholder et lineært, dobbeltstren- 35 get DNA-genom på ca. 187 kilobasepar, som replikerer i cyto-plasmaet i inficerede celler. Disse vira indeholder et kom- 5 DK 174965 B1 plet transcriptionsenzymsystem (herunder maskerings-, methy-lerings- og polyadenyleringsenzymer) i viruskernen, hvilket er nødvendigt for virussmitsomhed. Vacciniavirustranscrip-tionsreguleringssekvenser (promotorer) tillader initiering 5 af transcription ved hjælp af vaccinia-RNA-polymerase, men * ikke ved hjælp af eucaryotisk RNA-polymerase.

Ekspression af fremmed DNA i rekombinantvira kræver fusionen af vacciniapromotorer til protein, som koder sekvenser i det fremmede gen. Der er blevet konstrueret plas-10 midvektorer, også betegnet indsættelsesvektorer, til indsættelse af det chimere gen i vacciniavirus. En type indsættelsesvektor er sammensat af (1) en vacciniaviruspromotor omfattende transcriptionsinitieringsstedet, (2) flere, særegne restriktionsendonucleasekloningssteder med strømmen fra 15 transcriptionsstartstedet til indsættelse af fremmede DNA-fragmenter, (3) ikke-essentiel vacciniavirus-DNA (såsom TK-genet) flankerende den promotor og de kloningssteder, som dirigerer indsættelse af det chimere gen i den homologe ikke-essentielle region af virusgenomet, og (4) en bakteriel 20 replikationsoprindelse og et antibiotisk resistensmærkestof til replikation og udvælgelse i E. coli. Eksempler på sådanne vektorer er beskrevet af MacKett (1984, J. Virol. 49: 857-864) .

Rekombinantvira produceres, ved at rekombinantbak-25 terieindsættelsesplasmider indeholdende det fremmede gen transficeres ind i celler inficeret med vacciniavirus. Homolog rekombination finder sted i de inficerede celler og resulterer i indsættelsen af det fremmede gen i virusgenomet. Rekombinantvira kan screenes og derefter isoleres ved anven-30 delse af immunologiske teknikformer, DNA-plaquehybridisering eller genetisk udvælgelse. Disse vacciniarekombinanter bibeholder deres essentielle funktioner og smitsomhed og kan konstrueres til optagelse af ca. 35 kb af fremmed DNA.

35 Ekspression af et fremmed gen kan påvises ved en zymatiske eller immunologiske afprøvninger, f.eks. immuno- 6 DK 174965 B1 udfældning, enzymbundet immunosorbentafprøvning (ELISA), radioimmunoafprøvning eller immunopletning. Endvidere glyco-syleres naturligt forekommende membranglycoproteiner produceret ud fra celler inficeret med rekombinantvaccinia, og 5 de kan transporteres til celleoverfladen. Høje ekspressionsniveauer kan opnås ved anvendelse af stærke promotorer eller * kloning af mange kopier af et enkelt gen i hensigtsmæssige vektorer og egnede værter.

10 2.1.3. Baculovirus som en ekspressionsvektor.

Et baculovirus, såsom Autographica californica ker-nepolyhedrosisvirus (AcNPV), kan også anvendes som en klonings- eller ekspressionsvektor. Den smitsomme form af AcNPV findes normalt i en virusokklusion. Denne struktur er stort 15 set sammensat af polyhedrinpeptid, hvori viruspartikler er indlejret. Polyhedringenekspression sker meget sent i infek-tionscyclusen, efter at der er dannet modne viruspartikler.

Derfor er polyhedringenekspression en funktion, som der kan ses bort fra, dvs. ikke-okkluderede viruspartikler produceret 20 i fravær af polyhedringenekspression er fuldt ud aktive og i stand til at inficere celler i kultur. Ifølge EP patentansøgning nr. 84.105.841.5 fremstilles der en rekombinant-baculovirusekspressionsvektor, ved at baculovirus-DNA spaltes til frembringelse af et fragment omfattende et polyhedringen 25 eller en del deraf, dette fragment indsættes i en kloningsgrundmasse, hvorefter det gen, som skal eksprimeres, indsættes således, at det er under kontrol af polyhedringenpromotoren. Den på denne måde dannede rekombinantoverføringsvektor blandes med hjælper-DNA fra baculovirus og anvendes til 30 transfektion af insektceller i kultur til opnåelse af rekombination og inkorporering af det udvalgte gen ved polyhedrin-genstedet på baculovirusgenomet. Det resulterende rekom-binantbaculovirus anvendes til infektion af modtagelige insekter eller dyrkede insektceller.

35 2.2. Haemophilus influenzae og sygdom.

H. influenzae opdeles i to grupper. De stammer, som 7 DK 174965 B1 har en kendt kapsel, typeinddeles ved hjælp af den serologiske reaktion af kapslen med referenceantisera. Typerne a-f er blevet identificeret. Stammer, som ikke reagerer med noget referenceantiserum, er kendte som ikke-typebestem-5 melige.

H. influenzae type b (Hib) er den hyppigste årsag til neonatal meningitis og andre invaderende infektioner i USA, jf. Fraser et al., 1974, Am. J. Epidemiol. 100, 29-34.

Den største hyppighed af børnemeningitis forekommer i alderen 10 1 til 5 år. 60% af de meningitistilfælde, som skyldes Hib, forekommer hos børn, hvis alder er under 2, jf. Fraser et al., supra.

Det er nu godt fastslået, at ikke-typebestemmeligt H. influenzae (Hi) også fremkalder sygdomme, herunder pneu-15 monia, bacteremia, meningitis, postpartum sepsis og akut, febril tracheobronchitis hos voksne, jf. Murphy et al., 1985, J. Infect. Diseases 152. 1300-1307. Ikke-typebestem-meligt Hi er en hyppig, etiologisk årsag til mellemørebetændelse hos børn og unge voksne, idet det forårsager ca. 20 20 til 40% af alle tilfælde af mellemørebetændelse. Børn kan få flere infektioner forårsaget af samme organisme, da infektion ikke giver nogen langvarig immunitet. Gængs terapi for kronisk eller gentagen fremkomst af mellemørebetændelse omfatter indgivelse af antibiotika og indsættelse af rør til 25 dræning af det indre øre. Hi-stammer har også være impliceret som en primær årsag til sinusitis, jf. J.D. Cherry og J.P. Dudley, 1981, i Textbook of Pediatric Infectious Diseases, Feigin og Cherry, udg., side 103-105. Desuden forårsager ikke-typebestemmeligt Hi neonatal sepsis.

30 Det er blevet vist, at antiserum, som er produceret imod kapselpolysaccharidet i H. influenzae type b (Hib), og som omfatter polyribosylribitolphosphat (PRP), er bakteri-cidt og beskyttende imod Hib, jf. Smith et al., 1973, Pediatrics 52, 637-644; Anderson, et al., 1972, J. Clin. Inv.

35 51, 31-38. Anti-PRP-antistof er ineffektivt imod infektioner af ikke-typebestemmeligt H. influenzae.

8 DK 174965 B1 2.3. Vacciner imod H. influenzae.

Den ideelle kandidat for en Haemophilusvaccine ville have tre egenskaber: a) den ville være immunogen hos 2-6 måneder gamle børn, b) den ville frembringe et antistof, 5 som ville beskytte imod infektioner forårsaget af typebestemt og ikke-typebestemmeligt H. influenzae, og c) den ville frembringe et antistof imod en determinant, som findes på overfladen af alle stammer af H. influenzae.

De for tiden tilgængelige vacciner, som beskytter 10 imod Hib-infektioner, består i alt væsentligt af PRP, kap-selpolysaccharidet af type b. Renset PRP-polysaccharid er immunogent hos børn, som er mere end 18 måneder gamle, men frembringer ikke en beskyttende antistofreaktion hos børn, som er yngre end 18 måneder. Det er alment blevet vist, at 15 polysaccharider er dårlige immunogener hos børn, som er under ca. 18 månederne gamle.

For at løse dette problem har forskellige laboratorier påbegyndt studier, ved hvilke PRP enten kemisk kobles til et proteinbærestofmolekyle, jr. Anderson et al., 1985, Ped.

20 Res. 18, 252A, eller blandes med proteinmolekyler, jf. Monji et al., 1986, Infect. Immun. 51, 865-871, og indgives til dyr eller mennesker. Det er blevet vist, at konjugation af PRP til protein frembringer en anti-PRP-antistofreaktion hos menneskebørn så unge som 6 måneder, medens en blanding 25 af PRP med nogle proteiner har produceret anti-PRP-antistof hos dyrebørn, jf. Monji et al., supra.

Selv om konjugat- og blandingsvaccineformuleringerne løser en vanskelighed ved PRP-vacciner, dvs. deres manglende evne til beskyttelse af børn, som er yngre end 18 måneder, 30 løser de ikke et andet hovedproblem ved PRP-vaccinen. Anti-PRP-antistof er ineffektivt imod ikke-typebestemmeligt H. influenzae, som pr. definition mangler PRP-kapslen. Derfor eksisterer der et længe erkendt behov for en vaccine, som vil frembringe en beskyttende immunreaktion hos børn, som 3 5 er ca. 18 måneder gamle og yngre, imod både typebe s temmeligt, herunder type b, og ikke typebestemmeligt H. influenzae.

9 DK 174965 B1

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en vaccineformulering, som frembringer en beskyttende immunreaktion imod typebestemmeligt H. influenzae, herunder type b, og ikke-typebestemmeligt H. influenzae 5 hos børn, som er under 6 måneder gamle, samt hos ældre børn og voksne. Løsningen ifølge den foreliggende opfindelse er at vaccinere med et protein eller et fragment deraf, som er blotlagt på overfladen af Haemophilus. Den bedste kandidat er et ydre membranprotein {OMP) fra H. influenzae. Ydermem-10 branproteiner er sædvanligvis overfladeblotlagte molekyler.

De er sammensat af protein, som normalt er immunogent hos børn, og det er blevet vist, at de kan frembringe beskyttende antistof i andre bakteriesystemer, jf. Sugasawara et al., 1983, Infect. Immun. 42, 980-985.

15 Desuden er det blevet vist, at Hi- og Hib-stammer har tilsvarende OMP-profiler, jf. Loeb og Smith, 1980, Infect. Immun. 30, 709-717. Antistof imod et OMP fra Haemophilus kunne være både baktericidt og opsonisk, eftersom det er blevet vist, at anti-PRP er baktericidt og opsonisk for 20 Hib, jf. Anderson, et al., 1972, J. Clin. Inv. 51, 31-38:

Cates et al., 1985, Infect. Immun. 48, 183-189. Et yder- membranprotein har den yderligere fordel, at det er fælles for Hi og Hib og kunne beskytte imod begge bakterietyper.

25 3. Resume af opfindelsen.

Den foreliggende opfindelse omhandler som nævnt peptider og proteiner beslægtet med et ydermembranprotein i Haemophilus influenzae, som har en molekylvægt på ca. 16.000 dalton, og som er identificeret af ansøgerne og betegnet 30 "Praxis Biologies Outer Membrane Protein-1" (PBOMP-1), og angår et antigenisk beslægtet ydermembranprotein fra Haemophilus influenzae, som har en molekylvægt på ca. 16.000 dalton, og som også er idenficeret af ansøgerne og betegnet "Praxis Biologies Outer Membrane Protein-2" (PBOMP-2). Den 35 foreliggende opfindelse vedrører også peptider og proteiner beslægtet med et PBOMP-1:PBOMP-2- eller PBOMP-2:PBOMP-1-fu- 10 DK 174965 B1 sionsprotein. Peptiderne eller proteinerne ifølge opfindelsen kan anvendes som immunogener i vaccineformuleringer mod H. influenzae.

Peptiderne eller proteinerne ifølge opfindelsen kan 5 oprenses fra H. influenzae eller produceres ved anvendelse af rekombinant-DNA-teknik i et vilkårligt vektor-vært-system eller syntetiseres ved kemiske metoder. I overensstemmelse hermed beskrives her tillige konstruktionen af hidtil ukendte DNA-sekvenser og vektorer, herunder plasmid-DNA og virus-10 DNA, såsom humanvira, dyrevira, insektvira eller bakterio-phager, som kan anvendes til at dirigere ekspressionen af PBOMP-1- og PBOMP-2-beslægtede peptider eller proteiner samt PBOMP-1:PBOMP-2- eller PBOMP-2:PBOMP-1-beslægtede peptider eller proteiner i hensigtsmæssige værtsceller, hvorfra 15 peptiderne og proteinerne kan renses. Kemiske metoder til syntesen af PBOMP-1- og PBOMP-2-beslægtede peptider og proteiner er beskrevet.

PBOMP-1-, PBOMP-2-, PBOMP-1:PBOMP-2- og PBOMP-2:PBOMP-1-beslægtede peptider og proteiner kan anven-20 des som immunogener i underenhedsvaccineformuleringer til anvendelse imod alle pathogene H. influenzae, herunder både type b og ikke-typebestemmeligt H. influenzae. PBOMP-1- og PBOMP-2-beslægtede proteiner eller peptider til underen-hedsvaccinepræparater kan fås ved kemisk syntese, rensning 25 fra H. influenzae eller rensning fra rekombinantekspres-sionsvektorsystemer. PBOMP-1:PBOMP-2- og PBOMP-2: PBOMP-l-be-slægtede peptider eller proteiner til underenhedsvaccinepræ-parater kan fås ved rensning fra rekombinantekspressionsvek-torsystemer eller ved kemisk syntese. Alternativt kan rekom-30 binantvira, som i sig selv producerer de PBOMP-1-, PBOMP-2-, PBOMP-1:PBOMP-2- eller PBOMP-2:PBOMP-1-beslægtede peptider, eller proteiner eller ekstrakter af celler inficeret med sådanne rekombinantvira anvendes som immunogener i virusvac-cineformuleringer. Da PBOMP-1- eller PBOMP-2-proteinet eller 35 PBOMP-1:PBOMP-2- eller PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsprotein vil blive erkendt som "fremmed" i værtsdyret, vil der blive 11 DK 174965 B1 tilskyndet en humoral og muligvis en cellemedieret immunreaktion rettet imod henholdsvis PBOMP-1, PBOMP-2, PBOMP-l:PBOMP-2 og PBOMP-2:PBOMP-1. I en korrekt fremstillet vaccineformulering burde dette beskytte værten imod efter-5 følgende infektioner af H. influenzae. Desuden vil de her omhandlede underenhedsvaccineformuleringer være forenelige med for tiden tilgængelige PRP-vacciner.

4. Kortfattet beskrivelse af tegningen.

10 Den foreliggende opfindelse vil forstås mere fuld stændigt under henvisning til den efterfølgende, detaljerede beskrivelse og eksemplerne på specifikke udførelsesformer samt den tilhørende tegning, på hvilken:

Fig. 1 viser natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gel-15 elektroforetisk (SDS-PAGE) analyse af PBOMP-1. Prøver og geler er fremstillet som beskrevet i afsnit 6.1. Kolonne A indeholder ca. 5 PBOMP-1. Kolonne B indeholder i forvejen farvede standarder med lav molekylvægt: ovalbumin, α-chymo-trypsinogen, S-lactoglobulin, lysozym, oksetrypsininhibitor 20 og insulin (A- og B-kæder) . De relative molekyvægte [i kilodalton (kd)] er vist i højre side.

Fig. 2 (A og B) viser reaktiviteten af helcellelysater af E. coli og H. influenzae med polyklonalt anti-PBOMP-1-antistof og et monoklonalt anti-PBOMP-l-antistof (Gl-1). I 25 fig. 2A er lysaterne blevet omsat med polyklonalt anti-PBOMP-l-antistof. Kolonnerne er som følger: (1) E. coli HB101; (2) E. coli JM83; (3) molekylvægtstandarder; (4) renset PBOMP-1 opnået fra dyrkede celler af H. influenzae.

I fig. 2B er lysaterne blevet omsat med monoklonalt anti-30 PBOMP-1-antistof. Kolonnerne er som beskrevet for fig. 2A.

Fig. 3 viser et restriktionskort over pGD103, et derivat af pLG339, jf. Stoker et al., 1982, Gene 18, 335-341.

Fig. 4 (A og B) viser kort over pAA152, som omfatter et fragment på 4,2 Kb af DNA fra H. influenzae klonet ind i 35 pGD103. Et gen, som koder PBOMP-1, er lokaliseret til et Bglll-BamHI-fragment på 737 bp. Fig. 4A viser et cirkulært 12 DK 174965 B1 restriktionskort over pAA152. Fig. 4B viser udeladelsesanalyse af det indsatte fragment i pAA152. Den tilbageværende DNA fra H. influenzae i udeladelsesderivaterne er vist ved sorte linier. PBOMP-phenotypen er angivet til højre.

5 Fig. 5 viser reaktiviteten af helcellelysater af E.

coli JM83 indeholdende pAA152 med individuelle, monoklonale antistoffer, som reagerer med forskellige epitoper i PBOMP-1. Kolonnerne er som følger: (A) monoklonalt antistof Gl-1; (B) monoklonalt antistof G94-3; (C) monoklonalt antistof 10 G18-3; (D) monoklonalt antistof 25-2; og (E) monoklonalt antistof G2-3.

Fig. 6 viser autoradiografisk analyse af DS410-mini-celler indeholdende rekombinantplasmiderne pAA130 og pAA152. Molekylvægtstandarder er angivet til venstre for figuren.

15 Kolonnerne repræsenterer: (A) DS410 (pAA130); (B) DS410 (pGD103); (C) DS410 (pAA152). Placeringen af kanamycinamino-glycosidase er vist til højre for figuren.

Fig. 7 (A og B) viser kort over pAA130, som omfatter et fragment på 5,7 Kb af DNA fra H. influenzae klonet ind i 20 pGD103. Fig. 7A viser et cirkulært restriktionskort over pAA130. Fig. 7B viser udeladelsesanalyse af det indsatte fragment af H. influenzae pAA130. Ubrudte, sorte linier angiver tilbageværende DNA fra H. influenzae i udeladelsesderivaterne. PBOMP-phenotypen er angivet til højre. Et gen, 25 som koder PBOMP-2, er lokaliseret til et BstEII-Xmnl-fragment på 781 bp.

Fig. 8 viser reaktiviteten af helcellelysater af E. coli JM83 og E. coli JM83 indeholdende pAA130 med polyklonalt anti-PBOMP-1-antiserum. Kolonnerne repræsenterer: (A) JM83 30 indeholdende pAA130; (B) JM83 indeholdende pAA130; (C) JM83; (D) JM83; (E) molekylvægtstandarder som vist i kilodalton i højre side af figuren; (F) Hi-S-2.

Fig. 9 viser DNA-sekvenseringsstrategien i indsættelsesfragmentet på 737 bp i pAA152, idet oprindelsen, retningen 35 og udstrækningen af sekvens bestemt ud fra de forskellige kloner er vist. Pilen nederst viser placeringen af den vig- 13 DK 174965 B1 tigste, åbne læseramme (ORF).

Fig. 10 viser nucleotidsekvensen i det fragment på 737 bp, som indeholder PBOMP-1-genet. Den forudsagte, åbne læseramme (ORF) er vist ved den understregede sekvens, og 5 transcriptionsretningen er vist ved hjælp af pilehovedet.

Fig. 11 viser den afledte aminosyresekvens i PBOMP-1. Nucleotidsekvensen er vist på den øverste linie og den tilsvarende aminosyresekvens nedenunder. Den aminosyre, som findes i den lukkede ramme repræsenterer den forudsagte, N-10 terminale aminosyre i proteinets modne form.

Fig. 12 viser overensstemmelsen mellem den delvise aminosyresekvens i et peptid stammende fra PBOMP-1 (nederst) med en del af den afledte aminosyresekvens i PBOMP-l-genet (øverst). Rester i lukkede rammer repræsenterer manglende 15 overensstemmelse.

Fig. 13 viser sekvenseringsstrategien for BstEII-Xmnl-fragmentet på 789 bp i pAA130 og viser oprindelsen, retningen og udstrækningen af sekvens bestemt ud fra hver enkelt klon. Pilen nederst viser placeringen af den væsent-20 ligste, åbne læseramme (ORF).

Fig. 14 viser nucleotidsekvensen af det BstEII-Xmnl-fragment på 789 bp i pAA130, som indeholder PBOMP-2-genet.

Den forudsagte ORF er vist ved den understregede sekvens. Transcriptionsretningen er angivet ved hjælp af pilespidsen.

25 De to baser betegnet "N” repræsenterer ukendte nucleotider.

Fig. 15 viser den afledte aminosyresekvens i PBOMP-2. Nucleotidsekvensen er vist på den øverste linie og den til- I

svarende aminosyresekvens nedenunder. Den aminosyre, som findes i den lukkede ramme repræsenterer den forudsagte, N-30 terminale aminosyre i proteinets modne form.

Fig. 16 viser et chromatogram, opnået ved anvendelse af gas-væske-chromatografi, af fedtsyrerne i PBOMP-1. Nona-decansyre (C 19) er medtaget som en intern standard.

Fig. 17 viser autoradiografisk SDS-PAGE-analyse af 35 celler af E. coli JM83 indeholdende rekombinantplasmider pAA130 og pAA152 samt kontrolceller af E. coli JM83 indehol- 14 DK 174965 B1 dende pGD103. Kolonnerne repræsenterer: (1) pAAl30; (2) pAA.152; (3) pGD103. Placeringen af et bånd med en molekylvægt på ca. 15.000 dalton er vist til venstre for figuren.

Fig. 18 (A og B) viser Western-pletgelanalyse af 5 helcellelysater af E. coli JM83 indeholdende pAA130 eller pAAi52 i nærvær eller fravær af globomycin. Molekylvægtstandarder er angivet til venstre i fig. 18 (A og B) . Fig. 18A viser lysater af celler indeholdende pAA152, som indeholder PBOMP-1-genet. Kolonnerne repræsenterer: (1) globomycin fra-10 værende og (2) globomycin til stede.

Fig. 18B viser lysater af celler indeholdende pAA130, som indeholder PBOMP-2-genet. Kolonnerne repræsenterer: (1) globomycin fraværende og (2) globomycin til stede.

Fig. 19 viser grafisk den antistofreaktion, som er 15 opnået, når en vaccineformulering omfattende PBOMP-1 (5,2 /xg) er blevet indgivet til voksne mennesker.

Fig. 20 viser reaktiviteten af helcellelysater af E. coli JM101 eller JM103 med monoklonalt antistof G-204. Kolonnerne repræsenterer: (A) JM103 indeholdende ρΡΧΙβδ; (B) 20 JM103 indeholdende pPX160; (C) JM101 indeholdende pUC19; (D) molekylvægtstandard vist i kilodalton på venstre side af figuren; (E) nativt PBOMP-1 fra H. influenzae.

Fig. 21 viser skematisk konstruktionen af plasmider indeholdende den PBOMP-1-proteinkodende sekvens, som mangler 25 PBOMP-1-signalsekvensen. I plasmid pPX167 indsættes det PBOMP-1-gen, som mangler signalsekvensen, med strømmen fra lac-promotoren. Plasmid pPX168 er blevet konstrueret ved spaltning af den PBOMP-1-kodende sekvens i pPX167 ved BamHI-stedet i polylinkeren og kloning af det resulterende fragment 30 ind i BamHI-stedet i plasmid pINIII-ompA3. Plasmid pPX168 indeholder en chimer sekvens, som koder for modent PBOMP-1 bundet ved aminoterminus til signalsekvensen i ompA-proteinet fra E. coli.

Fig. 22 viser et chromatogram opnået ved anvendelse 35 af C-4-væskechromatografi med omvendt fase og høj ydeevne af den ovenstående fraktion af en cytoplasmisk ekstrakt af 15 DK 174965 B1 E. coli stamme PR13 indeholdende plasmid pPX167.

Fig. 23A viser SDS-PAGE-analyse af signalfrit PBOMP-1 opnået ud fra E. coli PR13 indeholdende plasmid pPX167 farvet med "Coomassie®"-farve. Kolonnerne repræsenterer: (1) cyto-5 plasmisk fraktion; (2) DEAE-eluat; (3) eluat fra omvendt fase. Molekylvægtstandarder er blevet kørt i kolonnen til venstre for kolonne 1, og de relative molekylvægte (i kilodalton) er vist til venstre for figuren. Fig. 23B viser reaktiviteten af fraktionerne med monoklonalt anti-PBOMP-l-anti-10 stof. Kolonnerne er som i fig. 23A.

fig. 24 vier skematisk konstruktionen af plasmid pPX163 indeholdende hele kodesekvensen i PBOMP-2-protein indsat med strømmen fra lac-promotoren.

Fig. 25 viser en SDS-PAGE-analyse af helcellelysater 15 af E. coli JM103 indeholdende pPX163 dyrket i nærvær eller fravær af IPTG. Kolonnerne viser: (1) molekylvægtstandarder i kilodalton; (2) lysat af JM103 indeholdende pPX163 dyrket uden IPTG; (3) som kolonne 2, men dyrket i nærvær af IPTG (5 mM) i 4 timer. Pile viser placeringen af tre PBOMP-2-20 reaktive bånd tilskyndet af IPTG.

Fig. 26 viser skematisk strukturen af PBOMP-1, hvor skraveringer angiver hydrofile regioner i proteinet, og pile angiver modsatte snoninger til stede i den sekundære struktur af proteinet. Placeringen og størrelsen af kemisk 25 syntetiserede, PBOMP-1-beslægtede peptider i PBOMP-l-se-kvenser er vist underneden.

Fig. 27 viser aminosyresekvenserne af de fem kemisk syntetiserede, PBOMP-1-beslægtede peptider.

Fig. 28 viser et kort over epitoper på PBOMP-l-pro-30 teinet erkendt af monoklonale antistoffer mod PBOMP-1.

Fig. 29 viser reaktiviteten af helcellelysater af celler af E. coli JM103 inficeret med den kapselmanglende H. influenzae stamme S2 (kolonne 4) eller af de klinisk ikke-typebestemmelige H. influenzae-stammer 0045E (kolonne 35 5), 1939 (kolonne 6), HST31 (kolonne 7) og Hib Eagan (kolonne 8) med monoklonalt anti-PB0MP-2-antistof 61-1. Molekylvægt- 16 DK 174965 B1 standarder (kilodalton) er vist i kolonne 2. Reaktiviteterne af PBOMP-2 og PBOMP-1 med det monoklonale anti-PB0MP-2-anti-stof 61-1 er vist i kolonnerne henholdsvis 1 og 3.

Fig. 30 viser skematisk konstruktionen af et plasmid 5 indeholdende den sekvens, som koder PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsproteinet. Plasmid pPX183 konstrueres ved separat digerering af plasmideme pPX163 og pPX167 med Seal til fuldstændighed. Scal-digereringen af pPX163 behandles yderligere med Hindlll til opnåelse af en delvis digerering, og Scal-digereringen 10 af pPXl67 digereres fuldstændigt med Hindlll. Scal-Hindlll-fragmentet på 2,7 kb fra pPX163 og Seal-Hindlll-fragmentet på 1,4 kb fra pPxl67 isoleres og gelrenses. Derefter liga-teres de to Seal-Hindlll-fragmenter sammen.

Fig. 31 viser skematisk konstruktionen af plasmid 15 pPX199 indeholdende kodesekvensen for PBOMP-2 -.PBOMP-1-fusionsproteinet . Detaljer ved konstruktionen findes i teksten.

Fig. 32 viser SDS-PAGE-analyse af det fedtacylerede PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsprotein eksprimeret af celler af E. coli indeholdende plasmid pPX199. Ca. 5μg af det rensede 2 0 fusionsprotein analyseres i en 15%'s gel (kolonne 2) . I for vejen farvede standarder med lav molekylvægt køres til sammenligning og bestemmelse af molekylvægten (kolonne 1).

fig. 33 viser skematisk konstruktionen af plasmid pPX512 indeholdende den kodesekvens for PBOMP-2:PBOMP-1-25 fusionsproteinet, som mangler PBOMP-2-signalsekvensen. I plasmid pPX512 er det PBOMP-2-gen, som mangler signalsekvensen, indsat med strømmen fra lac-promotoren. Plasmid pPX512 indeholder en chimer sekvens, som koder for den modne PBOMP-2-sekvens, bortset fra at det N-terminale cystein er 3 0 erstattet af methionin, bundet ved carboxyterminus til PBOMP- 1-sekvensen. Detaljer ved konstruktionen findes i teksten. 1

Detaljeret beskrivelse af opfindelsen.

Den foreliggende opfindelse angår som nævnt proteiner 35 og peptider med relation til epitoper i et ydermembranprotein med en molekylvægt på ca. 16.000 dalton fra H. influenzae, 17 DK 174965 B1 dvs. PBOMP-1, og i et beslægtet ydermembranprotein med en molekylvægt på ca. 16.000 dalton fra H. influenzae, dvs. PBOMP-2. Opfindelsen angår endvidere fusionsproteiner omfattende epitoper i andre, vigtige proteiner fra H. influen-5 zae, herunder IgA-protease-, fimbri- og ydermembranproteiner.

Den foreliggende opfindelse angår også proteiner og peptider med relation til epitoper i et PBOMP-1:PBOMP-2- eller PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsprotein. De tilsyneladende molekylvægte som bestemt ved anvendelse af SDS-PAGE genspejler de totale 10 molekylvægte af de modne (dvs. proteolytisk behandlede) former, herunder eventuelle post-translationelle modifikationer, f.eks. fedtacylering eller acetylering. Proteinerne og peptiderne ifølge opfindelsen kan fremstilles ved anvendelse af rekombinant-DNA-metoder eller ved kemisk syntese.

15 Desuden kan PBOMP-1- og/eller PBOMP-2-proteinerne og -peptiderne ifølge opfindelsen fås i praktisk taget ren form ud fra kulturer af H. influenzae ved anvendelse af hidtil ukendte og forbedrede metoder til isolering og rensning. De epitoper fra H. influenzae, som specificerer PBOMP-1-, PBOMP-2-, 20 PBOMP-1:PBOMP-2- og PBOMP-2:PBOMP-1-proteiner og -peptider, kan anvendes som immunogener i forskellige vaccineformuleringer til beskyttelse imod infektion med H. influenzae, en etiologisk årsag til f.eks. bakteriel hjernehindebetændelse, mellemørebetændelse, strubelågsbetændelse og lungebetændelse.

25 Vaccineformuleringerne er effektive imod både typebestem-melige stammer af H. influenzae, herunder typer a, b, c, d, e og f, og imod ikke-typebestemmelige stammer af H. influenzae .

Den foreliggende opfindelse angår endvidere amino-30 syresekvenserne i PBOMP-1-, PBOMP-2-, PBOMP-1:PBOMP-2- og PBOMP-2:PBOMP-1-proteiner og polypeptidfragmenter deraf, j f. krav 2 og 4.

Ved en udførelsesform anvendes der rekombinant-DNA-teknik til indsættelse af nucleotidsekvenser, som koder 35 PBOMP-1-, PBOMP-2-, PBOMP-1:PBOMP-2- og PBOMP-2:PBOMP-1-epitoper, i ekspressionsvektorer, som vil dirigere ekspres- 18 DK 174965 B1 sionen af disse sekvenser i hensigtmæssige værtsceller.

Disse ekspressionsvektor-værtscelle-systemer kan anvendes til produktion af PBOMP-1-, PBOMP-2-, PBOMP-1:PB0MP-2- og PBOMP-2:PBOMP-l-proteiner og beslægtede proteiner og pep-5 tider. Genprodukterne kan renses fra celler i kultur og anvendes som immunogener i underenhedsvaccineformuleringer. Alternativt kan aminosyresekvensen i PBOMP-1- og PBOMP-2-proteiner og -peptider afledes enten (1) fra det praktisk taget rene PBOMP-1-protein isoleret fra H. influenzae som 10 her beskrevet eller (2) fra de nucleotidsekvenser fra H. influenzae, som er indeholdt i rekombinanter, som eksprimerer immunogene, PBOMP-1-, PBOMP-2-, PBOMP-1:PBOMP-2- eller PBOMP-2:PBOMP-1-beslægtede peptider og proteiner. Disse proteiner og peptider kan derefter syntetiseres kemisk og 15 anvendes i syntetiske underenhedsvaccineformuleringer.

Hvor den ekspressionsvektor, som eksprimerer en eller flere PBOMP-1-, PBOMP-2-, PBOMP-1:PBOMP-2- eller PBOMP-2:PBOMP-1-sekvenser, er et rekombinantvirus, kan selve viruset anvendes som en vaccine. Smitsomme rekombinantvira, 20 som eksprimerer PBOMP-1- og/eller PBOMP-2-proteinerne og -peptiderne og PBOMP-1:PBOMP-2- og/eller PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsproteiner og -peptider, og som ikke forårsager sygdom hos en vært, kan anvendes i levende virusvaccinepræparater til tilvejebringelse af praktisk taget immunitet. Alternativt 25 kan der fremstilles inaktiverede virusvacciner ved anvendelse af "dræbte" rekombinantvira, som eksprimerer PBOMP-1-, PBOMP-2-, PBOMP-1:PBOMP-2- og/eller PBOMP-2:PBOMP-1-proteiner og peptider.

Den omhandlede fremgangsmåde kan opdeles i følgende 30 trin: (1) isolering og rensning af PBOMP-1-protein; (2) delvis aminosyresekvensering af PBOMP-1; (3) skabelse af PBOMP-1- og/eller PBOMP-2-beslægtede peptider, som omfatter en eller flere immunogene regioner i henholdsvis PBOMP-1 eller PBOMP-2; (4) molekylær kloning af gener eller genfrag-35 menter, som koder PBOMP-1 og PBOMP-2 samt PBOMP-1:PBOMP-2-og/eller PBOMP-2 :PBOMP-1-fusionsprotein, herunder indsættelse 19 DK 174965 B1 af generne eller genfragmenterne i ekspressionsvektorer og identifikation og rensning af rekombinantgenprodukterne,- (5) nucleotidsekvensering af de gener, som koder PBOMP-l og PBOMP-2; (6) bestemmelse af immunostyrken af PBOMP-l-, 5 PBOMP-2-, PBOMP-l:PBOMP-2- og/eller PBOMP-2:PBOMP-l-proteiner og beslægtede produkter ved produktion af antistoffer imod rensede og rekombinerede protein- og peptidprodukter. Metoden omfatter endvidere (7) formulering af vacciner.

10 5.1. Isolering og rensning af PBOMP-l.

I H. influenzae b Eagan og andre stammer af H. influenzae er ydermembranproteinet PBOMP-l associeret med ydermembran-cellevæg-komplekset. Et nødvendigt trin ved rensningen af PBOMP-l er itubrydning af de bindinger, som 15 holder ydermembranproteinerne i tæt associering med ydermembranen og cellevæggen. Dette kan opnås ved hjælp af den hidtil ukendte og forbedrede, her omhandlede fremgangsmåde, som omfatter følgende to trin: (1) isolering af en PBOMP-l-beriget, uopløselig cellevægsfraktion fra fysisk itubrudte 20 celler af H. influenzae og derefter (2) opløseliggørelse af PBOMP-l fra cellevægsfraktionen ved opvarmning i nærværelse af et detergens, som er egnet til indgivelse til et menneske, eller digerering af cellevægsfraktionen med lysozym, enten i nærvær eller fravær af detergens.

25 Den hidtil ukendte, forbedrede metode, der her er beskrevet, undgår anvendelsen af denatureringsmidler og reduktionsmidler, såsom natriumdodecylsulfat og 2-mercapto-ethanol, jf. Munson et al., 1984, Infect. Immun. 49, 544- 549, som eventuelt kunne ødelægge vigtige epitoper, og som 30 ikke er egnede komponenter i vaccineformuleringer til indgivelse til mennesker.

5.1.1. Isolering af PBOMP-1-beriget. uopløseligt cellevægs-materiale fra H. influenzae.

35 En total cellemembranfraktion kan opnås ved differen tiel sedimentering efter opbrydning af celler af H. influen- 20 DK 174965 B1 zae ved metoder, som omfatter, men som ikke er begrænset til sonikering, formaling, udslyngning fra en fransk presse eller et andet homogeniseringsapparatur. Den totale membranfraktion kan fraktioneres yderligere i inder- og ydermembra-5 ner ved vægtfyldegradientsedimentering eller ved differentiel opløseliggørelse af indermembranen ved hjælp af visse deter-genser, såsom "Triton® X-100" eller N-lauroylsarcosinnatri-umsalt ("Sarcosyl®"). Ydermembraner fremstilles fortrinsvis ved differentiel opløseliggørelse af indermembraner i 1%'s 10 (vægt/vol) "Sarcosyl®" i 10 mM HEPES-NaOH, pH 7,4. En underfraktion beriget på PBOMP-1 kan fremstilles ved differentiel detergensekstraktion af andre ydermembran-cellevægs-komponenter. Denne berigelse kan f.eks. opnås ved sekventiel ekstraktion af ydermembran-cellevæg-komplekset (som bliver 15 tilbage efter ekstraktion med "Triton® X-100" eller "Sarcosyl®" som ovenfor beskrevet) med 1% octylglucosid, no-nylglucosid, "Zwittergent 3-14" eller "Zwittergent 3-16" efterfulgt af ekstraktion af det uopløselige materiale med 1%'s "Sarcosyl®" og derefter centrifugering til isolering 20 af det PBOMP-1-berigede, uopløselige materiale.

5.1.2. Opløseligqørelse af PBOMP-1 fra det PBOMP-1-berigede, uopløselige cellevægsmateriale.

Opløseliggørelse af PBOMP-1 fra ydermembran-cellevæg-25 komplekset kan opnås på flere forskellige måder ved anvendelse af en af følgende tilnærmelser eller en kombination deraf. (1) PBOMP-l kan opløseliggøres ved ekstraktion af den PBOMP-1-berigede fraktion med et eller en vilkårlig kombination af flere detergenser, herunder, men ikke begræn-30 set til deoxycholat, "Triton® X-100", "Tween® 80", "CHAPS", "CHAPSO", dodecylmaltosid, "Zwittergent 3-14" og "Zwittergent 3-16", ved 55-60°C i 1 time. (2) PBOMP-1 kan opløseliggøres ved opbrydning af cellevæggen i den PBOMP-1-berigede fraktion med lysozym, enten i nærvær eller fravær af detergens. Ifølge 35 en foretrukket udførelsesform er detergenset udvalgt fra deoxycholat og polyethoxylatsorbitanmonooleat ("Tween® 80").

21 DK 174965 B1

Alternativt kan PBOMP-1 isoleres ved ekstraktion af hele celler fra H. influenzae, ydermembraner eller underfraktioner deraf med et eller en kombination af detergenser, herunder, men ikke begrænset til "Triton® X-100", "Sarco-5 syl®", octylglucosid, nonylglucosid, "Zwittergent 3-14" I

eller "Zwittergent 3-16". Denne ekstraktion kan gennemføres ved 55-60°C eller ved stuetemperatur i et hensigtsmæssigt puffersystem.

Efter opløseliggørelse kan yderligere rensning af 10 PBOMP-1 opnås ved standardmetoder, som er kendt på området, herunder, men ikke begrænset til ionbytnings- eller molekyl-sigtechromatografi, hydrofob chromatografi eller chromato-grafi med omvendt fase, affinitetschromatografi, chromatofo-kusering, isoelektrisk fokusering og præparativ elektrofo-15 rese.

5.2. Karakterisering af PBOMP-1 ved aminosvreanalvse oa sekvensering af PBOMP-oeptider.

PBOMP-1 opnået fra H. influenzae kan karakteriseres 20 ved aminosyreanalyse i kombination med delvis aminosyrese-kvensering af peptidfragmenter. Til minimering af ødelæggelsen og/eller modifikationen af aminosyrer i det rensede protein foretrækkes det at hydrolysere PBOMP-l i methansulfon-syre indeholdende tryptamin, jf. Simpson et al., 1976, J.

25 Biol. Chem. 251, 1936-1940. Ved et forsøgseksempel ifølge opfindelsen er en sådan aminosyreanalyse blevet kombineret med aminosyresekvensering af tryptiske peptidfragmenter af PBOMP-1 til karakterisering af det hidtil ukendte peptid isoleret som beskrevet, se afsnit 6.1.1.

30 Vanskeligheder, som er mødt under indledende forsøg på sekvensering af PBOMP-1 ved Edman-kemi, har antydet, at N-terminus i ydermembranproteinet i Haemophilus er blokeret.

Studier af Braun, 1970, Eur. J. Biochem. 14, 387-391, har vist, at fedtsyrer er bundet til den N-terminale cysteinyl-35 rest i Braun's lipoprotein fra Escherichia coli. En pal-mitylgruppe er amidbundet til det N-terminale cystein, og 22 DK 174965 B1 to yderligere fedtsyrer er også knyttet til samme cysteinyl-rest via en glycerylgruppe, som danner en thioetherbinding i Braun-lipoproteinet fra E. coli, jf. Id. Derfor er PBOMP-1 opnået ud fra H. influenzae blevet yderligere karakteriseret 5 ved fedtsyreanalyse. En sådan undersøgelse har vist, at N-terminalresterne i ydermembranproteinet og peptiderne ifølge opfindelsen kan have fedtsyrerester covalent tilknyttet.

Ved et forsøgseksempel ifølge opfindelsen har en sådan fedtsyreanalyse afsløret tilstedeværelsen af tre hovedfedtsyrer, 10 nemlig laurinsyre, palmitinsyre og et derivat af palmitin-syre. De acetylerede proteiner og peptider ifølge opfindelsen med en fedtsyregruppe covalent tilknyttet vil være af særlig anvendelighed til vaccineformuleringer imod H. influenzae.

15 5.3. Skabelse af PBOMP-1- οα/eller PBOMP-2-beslægtede pep tider.

PBOMP-1- og/eller PBOMP-2-beslægtede peptider, som indeholder en eller flere antigeniske eller immunogene regioner af henholdsvis PBOMP-1 eller PBOMP-2, kan frembringes 20 ved proteolytisk spaltning af hele PBOMP-1- eller PBOMP-2-proteinet eller ved kemisk syntese af peptidfragmenter. Ved sidstnævnte metode kan peptidfragmenter syntetiseres kemisk f.eks. ved anvendelse af en automatisk peptidsyntetisator.

PBOMP-1- eller PBOMP-2-beslægtede peptider ifølge 25 opfindelsen frembragt enten ved proteolytisk digerering eller kemisk syntese kan renses ved standardmetoder, som er kendt på området, herunder, men ikke begrænset til højtryks-væskechromatografi eller kolonnechromatografi ved anvendelse af ionbytning, molekylstørrelse, hydrofobe kolonner eller 30 kolonner med omvendt fase, affinitetskolonner eller chroma-tofokusering, isoelektrisk fokusering eller præparativ gel-elektroforese.

Sekvensen i proteolytiske digereringer af PBOMP-1 eller PBOMP-2 eller kemisk syntetiseret PBOMP-1 eller PBOMP-2 3 5 bestemmes ved teknik, som er kendt på området, og som omfatter, men ikke er begrænset til en automatisk sekvensator 23 DK 174965 B1 under udnyttelse af Edman-sønderdelingsmetoden eller metoden med aminosyreanalyse, som indebærer hydrolyse af peptidbindinger, jf. Simpson et al., 1976, J. Biol. Chem. 251, 1936-1940.

5 5.4 Molekylær kloning af gener eller genfraktioner, som koder PBOMP-1 og PBOMP-2.

5.4.1. Isolering af gener, som koder PBOMP-1 og beslægtede 10 PBOMP1 er.

Der er blevet påvist et OMP med en molekylvægt på 16.000 dalton, både ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) og Western-pletanalyse, i alle afprøvede stammer af H. influenzae (i øjeblikket flere hun-15 drede). Monoklonale antistofdata viser, at dette protein er stærkt bevaret, jf. Murphy et al., 1986, Infect. Immun. 54, 747-749. En vilkårlig stamme af H. influenzae ville derfor kunne tjene som kilden for PBOMP-generne. Da mange stammer af H. influenzae ingen påviselige plasmider eller tilskyn-20 delige prophager indeholder, er PBOMP-generne sandsynligvis chromosomale. I overensstemmelse hermed er det første trin ved den molekylære kloning af DNA-sekvenser, som koder PBOMP'er, isoleringen af sådanne sekvenser fra chromosom-DNA fra H. influenzae. I det følgende vil DNA, som koder 25 gener i H. influenzae, blive betegnet som "Hi-DNA", og DNA, som koder sekvenser i PBOMP'er, vil blive betegnet som "PBOMP-DNA".

Til frembringelse af Hi-DNA-fragmenter kan Hi-DNA spaltes på specifikke steder ved anvendelse af forskellige 30 restriktionsenzymer. Alternativt kan der anvendes lave koncentrationer af DNase I til fragmentering af DNA, eller DNA kan opskæres fysisk, f.eks. ved sonikering. De lineære DNA-fragmenter kan derefter adskilles efter størrelse ved standardteknik, herunder, men ikke begrænset til agarose- og 35 polyacrylamid-gelelektroforese, kolonnechromatografi (f.eks. chromatografi med molekylsigte eller ionbytning) eller has- 24 DK 174965 B1 tighedssedimentering i saccharosegradienter.

Et vilkårligt restriktionsenzym eller en vilkårlig kombination af restriktionsenzymer kan anvendes til frembringelse af et eller flere Hi-DNA-fragmenter indeholdende 5 PBOMP-sekvenserne, forudsat at enzymet eller enzymerne ikke ødelægger immunostyrken hos PBOMP-genprodukterne. F.eks. kan det antigeniske sted i et protein bestå af fra ca. 7 til ca. 14 aminosyrer. Derfor kan et protein med størrelsen af PBOMP-peptiderne have mange adskilte antigeniske steder, 10 og derfor ville mange delvise PBOMP-polypeptidgensekvenser kunne kode for et antigenisk sted. Følgelig kan der anvendes mange restriktionsenzymkombinationer til frembringelse af DNA-fragmenter, som efter indsættelse i en hensigtsmæssig vektor er i stand til at dirigere produktionen af PBOMP-15 specifikke aminosyresekvenser omfattende forskellige antigeniske determinanter.

Når først DNA-fragmenterne er frembragt, kan identifikation af det specifikke DNA-fragment, som indeholder PBOMP-genet, gennemføres på en række måder.

20 De DNA-sekvenser, som indeholder PBOMP-generne, kan identificeres ved hybridisering af Hi-DNA-fragmenterne med en syntetisk oligonucleotidsonde. En overflod af syntetiske oligonucleotidsonder konstrueres baseret på aminosyresekven-sen i peptidfragmenter af PBOMP-proteinet. F.eks. kan der 25 fremstilles syntetiske oligonucleotidsonder baseret på ami-nosyresekvensen i det praktisk taget rene PBOMP-1-protein isoleret fra H. influenzae som beskrevet i afsnit 5.1. Disse syntetiske sonder kan radiomærkes med ^p-adenog^tj-iphosphat og anvendes til screening af Hi-DNA-biblioteker for kloner 30 indeholdende PBOMP-specifikke gensekvenser, jf. Anderson et al., 1983, Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 80, 6838-6842.

Alternativt kan PBOMP-gen-DNA identificeres og isoleres efter indsættelse i en kloningsvektor ved en "haglgevær" -metode. En lang række vektor-værts-systemer, som er kendt 35 på området, kan anvendes. Vektorsystemer kan være enten plasmider eller modificerede vira. Egnede kloningsvektorer 25 DK 174965 B1 omfatter, men er ikke begrænset til virusvektorer, såsom λ-vektorsystem gtll, gt WES.tB, Charon 4, og plasmidvektorer, såsom pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKClOl og andre tilsvarende 5 systemer. Vektorsystemet skal være foreneligt med den anvendte værtscelle. Rekombinantmolekyler kan indføres i celler via transformation, transfektion eller infektion.

Når Hi-DNA indeholdende et PBOMP-gen eller -genfragment indsættes i en kloningsvektor og anvendes til transfor-10 mation af hensigtsmæssige værtsceller, kan der frembringes mange kopier af PBOMP-genet eller -genfragmentet. Dette kan opnås ved.ligatering af Hi-DNA-fragmentet i en kloningsvektor, som har komplementære, cohæsive termini. Hvis de komplementære restriktionssteder imidlertid ikke er til stede, 15 kan enderne af DNA-molekylerne modificeres. En sådan modifikation omfatter frembringelse af stumpe ender ved til-bagedigerering af enkeltstrengede DNA-termini eller ved udfyldning af de enkeltstrengede termini, således at enderne kan stumpendeligateres. Alternativt kan ethvert ønsket sted 20 frembringes ved ligatering af nucleotidsekvenser (linkere) på DNA-termini. Disse ligaterede linkere kan omfatte specifikke, kemisk syntetiserede oligonucleotider, som koder restriktionsstéderkendelsessekvenser. Ifølge DNA-modifika-tionsmetoden ifølge Maniatis, jfr. Maniatis et al., 1982, 25 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, side 107-114, behandles f.eks. opskåret DNA med en restriktionsme-thylase, f.eks. M. EcoRI, og ligateres til syntetiske DNA-linkere, som koder et restriktionssted for dette enzym. Derefter behandles DNA med restriktionsendonuclease til 30 fraspaltning af de terminale linkere, men ikke de modificerede, interne restriktionssteder, og ligateres til de hensigtsmæssige vektorarme. Ved en alternativ metode kan den spaltede vektor og PBOMP-DNA-fragmentet modificeres ved homopolymerhaledannelse.

35 Identifikation af et klonet PBOMP-gen kan opnås ved etablering af en chromosomgenbank af Hi i et vektorsystem 26 DK 174965 B1 og screening af individuelle kloner for produktionen af PBOMP-1 eller PBOMP-1-beslægtet protein ved en vilkårlig af de her beskrevne metoder, herunder, men ikke begrænset til specifik reaktion med polyklonale eller monoklonale antistof-5 fer imod PBOMP'er.

5.4.2. Indsættelse af PBOMP-cener i ekspressionsvektorer.

De nucleotidsekvenser, som koder for PBOMP'er eller dele deraf, indsættes i en hensigtsmæssig ekspressionsvektor, 10 dvs. en vektor, som indeholder de nødvendige elementer for transcriptionen og translationen af de indsatte, proteinkodende sekvenser. Ved en speciel udførelsesform for opfindelsen indsættes de nucleotidsekvenser, som koder for både PBOMP-l og PBOMP-2 eller dele deraf, i en hensigtsmæssig 15 vektor som beskrevet i det forudgående punktum. En mangfoldighed af vært-vektor-systemer kan anvendes til eksprimering af den eller de proteinkodende sekvenser. Primært skal vektorsystemet være foreneligt med den anvendte værtscelle. Vært-vektor-systemer omfatter, men er ikke begrænset til 20 følgende: Bakterier transformeret med bakteriophag-DNA, plasmid-DNA eller cosmid-DNA; mikroorganismer, såsom gær indeholdende gærvektorer; pattedyrcellesystemer inficeret med virus, f.eks. vacciniavirus eller adenovirus; insektceller inficeret med virus, f.eks. baculovirus. Ekspressions-25 elementerne i disse vektorer varierer i deres styrke og specificiteter. Afhængigt af det anvendte vært-vektor-system kan et vilkårligt af en række egnede transcriptions- og translationselementer anvendes.

Til opnåelse af effektiv ekspression af genet (eller 30 en del af genet) skal en promotor være til stede i ekspressionsvektoren. RNA-polymerase binder normalt til promotoren og initierer transcription af et gen eller en gruppe af sammenknyttede gener og reguleringselementer (betegnet en operon). Promotorer varierer i deres "styrke", dvs. deres 35 evne til at fremme transcription. Med det formål at ekspri-mere et klonet gen er det ønskeligt at anvende stærke pro- 27 DK 174965 B1 motorer til opnåelse af et højt niveau af transcription og derved ekspression af genet. Afhængigt af det anvendte værtscellesystem kan en vilkårlig af en række egnede promotorer anvendes. Når der klones i E. coli, dens bakteriophager 5 eller plasmider, kan der til dirigering af høje niveauer af transcription af tilstødende DNA-segmenter anvendes sådanne promotorer som lac-promotoren, trp-promotoren, recA-promo-toren, den ribosomale RNA-promotor, Pr- og P^-promotorerne i coliphag-λ og andre, herunder, men ikke begrænset til f.eks. lacUV5, ompF, bla og lpp. Desuden kan en hybrid-trp-lacUV5-promotor (tac-promotor) eller andre promotorer fra E. coli produceret ved rekombinant-DNA- eller en anden syntetisk DNA-teknik anvendes til tilvejebringelse af transcription af det indsatte gen.

15 Der kan vælges bakterielle værtscellestammer og eks pressionsvektorer, som inhiberer virkningen af promotoren, medmindre den specifikt tilskyndes. Ved visse operoner er tilsætningen af specifikke tilskyndere nødvendig til effektiv transcription af den indsatte DNA, f.eks. tilskyndes lac-20 operonen ved tilsætningen af lactose eller IPTG (isopropyl-thio-S-D-galactosid). Flere andre operoner, f.eks. trp og pro, er under forskellige kontroller. trp-Operonen tilskyndes, når der mangler tryptophan-i vækstmediet, og PL-promo-toren i λ kan tilskyndes ved en stigning i temperatur i 25 værtsceller indeholdende en temperaturfølsom λ-repressor, f.eks. cI857. På denne måde kan mere end 95% af den promotordirigerede transcription inhiberes i ikke-tilskyndede celler.

Ekspression af det genetisk konstruerede PBOMP-protein 30 eller peptidet deraf kan således kontrolleres. Dette er vigtigt, hvis proteinproduktet fra det klonede gen er dødeligt eller skadeligt for værtsceller.' I sådanne tilfælde kan transformanter dyrkes under sådanne betingelser, at promotoren ikke tilskyndes, og når cellerne når en hensigts-35 mæssig tæthed i vækstmediet, kan promotoren tilskyndes til produktion af proteinet.

28 DK 174965 B1

Et sådant promotor/operator-system er det såkaldte "tac" eller trp-lac-promotor/operator-system, jf. Russell og Bennett, 1982, Gene 20, 231-243; EP patentansøgning nr.

67.540, indleveret 18. maj 1982. Denne hybridpromotor kon-5 strueres ved kombination af de -35 bp (-35-regionen) i trp-promotoren og de -10 bp (-10-regionen eller Pribnow-kassen) i lac-promotoren (de sekvenser i DNA, som er RNA-polymerase-bindingsstedet). Ud over at opretholde de stærke promotoregenskaber hos tryptophanpromotoren kontrolleres tac også 10 af lac-repressoren.

Ved kloning i en eucaryotisk værtscelle kan forstærkersekvenser (f.eks. tandemgentagelsen på 72 bp i SV40-DNA eller de retrovirale, lange terminalgentagelser eller LIR'er) indsættes til forøgelse af transcript ionseffektiviteten. For-15 stærkersekvenser er et sæt eucaryotiske DNA-elementer, som ser ud til at forøge transcriptionseffektiviteten på en måde, som er relativt uafhængig af deres stilling og orientering i forhold til et nærliggende gen. Til forskel fra de klassiske promotorelementer (f.eks. polymerasebindingsstedet 20 og Goldberg-Hogness-"TATA"-kassen), som skal være placeret umiddelbart 5' i forhold til genet, har forstærkersekvenser en bemærkelsesværdig evne til at fungere imod strømmen fra, i eller med strømmen fra eucaryotiske gener, og derfor er placeringen af forstærkersekvensen i forhold til det indsatte 25 gen mindre kritisk.

Specifikke initieringssignaler er også nødvendige til effektiv gentranscription og -translation i procaryotiske celler. Disse transcriptions- og translationsinitieringssignaler kan variere i "styrke" som målt ved henholdsvis mængden 3 0 af genspecifik budbringer-RNA og syntetiseret protein. DNA-ekspressionsvektoren, som indeholder en promotor, kan også indeholde en vilkårlig kombination af forskellige, "stærke" transcriptions- og/eller translationsinitieringssignaler. F.eks. kræver effektiv translation i E. coli en Shine-Dal-35 garno-sekvens (SD) ca. 7-9 baser 5' i forhold til initie-ringscodonen (ATG) til tilvejebringelse af et ribosombin- 29 DK 174965 B1 dingssted. En vilkårlig SD-ATG-kombination, som kan udnyttes af værtscelleribosomer, kan således anvendes. Sådanne kombinationer omfatter, men er ikke begrænset til SD-ATG-kom-binationen fra cro-genet eller N-genet i coliphag-λ eller 5 fra tryptophan E-, D-, C-, B- eller A-gener i E. coli. Endvidere kan enhver SD-ATG-kombination, som produceres af rekom-binant-DNA eller andre teknikformer, som indebærer inkorporering af syntetiske nucleotider, anvendes.

Enhver af de metoder, som tidligere er beskrevet til 10 indsættelsen af DNA-fragmenter i en vektor, kan anvendes til ligatering af en promotor og andre kontrolelementer ind i specifikke steder i vektoren.

I overensstemmelse hermed kan genetiske sekvenser fra H. influenzae indeholdende de regioner, som koder for 15 PBOMP-proteinerne eller -peptiderne, ligateres ind i en ekspressionsvektor på et specifikt sted i forhold til vektorpromotoren og kontrolelementerne, således at den fremmede genetiske sekvens, når højkombinant-DNA-molekylet indføres i en værtscelle, kan eksprimeres (dvs. transcriberes og 20 translateres) af værtscellen. Ved en specifik udførelsesform for opfindelsen kan regioner, som koder for både PBOMP-1-og PBOMP-2-proteiner eller -peptider, ligateres ind i en ekspressionsvektor. Relationen eller orienteringen af PBOMP-sekvenserne i forhold til vektorpromotoren og kontrolelemen-25 terne vil afgøre, om den eksprimerede, genetiske sekvens er et PBOMP-1:PBOMP-2- eller PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsprotein eller peptidfragmenter deraf. Rekombinant-DNA-molekylet kan indføres i hensigtsmæssige værtsceller (herunder, men ikke begrænset til f.eks. bakterie-, virus-, gær- og pattedyr-30 celler) ved transformation, transduktion eller transfektion (afhængigt af vektor/værtscelle-systemet). Der udvælges transformanter baseret på ekspressionen af et eller flere hensigtsmæssige genmærkestoffer, som normalt er til stede i vektoren, såsom ampicillinresistens eller tetracyclinresi-35 stens i pBR322 eller thymidinkinaseaktivitet i eucaryotiske værtssystemer. Ekspression af sådanne mærkestofgener skulle 30 DK 174965 B1 angive, at rekombinant-DNA-molekylet er intakt og replikeres. Ekspressionsvektorer kan være afledt fra kloningsvektorer, som sædvanligvis indeholder en mærkestoffunktion. Sådanne kloningsvektorer kan omfatte, men er ikke begrænset til 5 følgende: SV40 og adenovirus, vacciniavirusvektorer, in- sektvira, såsom baculovira, gærvektorer, bakteriophagvek-torer, såsom λ-gt-WES-X-B, Charon 28, Charon 4A, X-gt-l-X-BC, X-gt-1-λ-Β, M13mp7, M13mp8, M13mp9, eller plasmid-DNA-vektorer, f.eks. pBR322, pACl05, pVA51, pACYCl77, pKH47, 10 pACYC184, pUBHO, pMB9, pBR325, Col El, pSCIOl, pBR313, pML21, RSF2124, pCRl, RP4 og pBR328.

Overføring af medikamentresistensfaktorer mellem H. influenzae og E. coli via konjugation, jf. Stuy, 1979, J.

Bact. 139, 520-529, og transformation, jf. Mann, 1979, Plas-15 mid 2, 503-505, og kloning af Haemophilus-chromosomgener i E. coli, jf. Mann et al., 1980, Gene 3, 97-112, viser, at i det mindste nogle gener kan eksprimeres effektivt i begge organismer, og at de grundlæggende mekanismer for transcriptions- og translationskontrol eventuelt kan være ens.

20 Ved den specielle udførelsesform i eksemplerne ifølge opfindelsen er et plasmidsystem fra E. coli blevet udvalgt som ekspressionsvektoren. Opfindelsen er imidlertid ikke begrænset til anvendelsen af en sådan ekspressionsvektor fra E. coli.

25 Genetisk konstruktionsteknik kan også anvendes til yderligere karakterisering og/eller tilpasning af det klonede gen. F.eks. kan steddirigeret mutagenese af det gen, som koder et PBOMP-protein, anvendes til identifikation af regioner i proteinet, som er ansvarlige for skabelsen af be-30 skyttende antistofreaktioner. Den kan også anvendes til modifikation af proteinet i regioner uden for de beskyttende domæner, f.eks. til forøgelse af proteinets opløselighed for at tillade lettere rensning.

31 DK 174965 B1 5.4.3. Identifikation og rensning af de eksprimerede genprodukter.

Ekspressionsvektorer indeholdende fremmede genindsæt-ninger kan identificeres ved tre almene metoder: (1) DNA- 5 DNA-hybridisering ved anvendelse af sonder omfattende sekvenser, som er homologe til det fremmede, indsatte gen; (2) nærvær eller fravær af "mærkestof"-genfunktioner (f.eks. resistens mod antibiotika, transformationsphenotype og thy-midinkinaseaktivitet); (3) ekspression af indsatte sekvenser 10 baseret på genproduktets fysiske, immunologiske eller funktionelle egenskaber.

Når først en rekombinant, som eksprimerer et PBOMP-gen, er identificeret, skal genproduktet analyseres. Immunologisk analyse er særlig vigtig, fordi slutmålet er at 15 anvende de genprodukter eller rekombinantvira, som eksprimerer sådanne produkter, i vaccineformuleringer og/eller som antigener ved diagnostiske immunoafprøvninger.

Flere antisera er til rådighed til analyse af produktets immunoreaktivitet, herunder, men ikke begrænset til 20 polyvalente antisera og monoklonale antistoffer beskrevet i nedenstående afsnit 6.2.

Identifikation af proteinerne og peptiderne ifølge opfindelsen kræver, at det PBOMP-beslægtede protein eller peptid er immunoreaktivt mod flere antistoffer rettet imod 25 PBOMP eller dens analoge og derivater.

Proteinet eller peptidet må være immunoreaktivt, uanset om det er resultatet af ekspressionen af en hel PBOMP-gensekvens, en del af gensekvensen eller af to eller flere gensekvenser, som er ligateret til dirigering af produktionen 30 af fusionsproteiner. Denne reaktivitet kan påvises ved immunologisk standardteknik, såsom radioimmunoudfældning, radioimmunkonkurrence, ELISA eller immunopletter.

Når først det med PBOMP fra H. influenzae beslægtede protein er identificeret, kan det isoleres og renses ved 35 standardmetoder, herunder chromatografi {f.eks. ionbytter-, affinitets- og størrelseskolonnechromatografi), centrifuge- 32 DK 174965 B1 ring, forskellig opløselighed eller ved en vilkårlig anden standardteknik til rensning af proteiner.

Alternativt kan, når først et immunoreaktivt, med PBOMP fra H. influenzae beslægtet protein produceret ved 5 hjælp af en rekombinant er identificeret, aminosyresekvensen i det immunoreaktive protein udledes ud fra nucleotidsekven-sen af det chimere gen, som er indeholdt i rekombinant en.

Som resultat heraf kan proteinet syntetiseres ved kemiske standardmetoder, som er kendt på området, jf. f.eks. Hunka-10 piller et al., 1984, Nature 310, 105-111.

Ved en speciel udførelsesform for opfindelsen omfatter sådanne peptider, uanset om de er produceret ved rekombinant -DNA-teknik eller ved kemiske syntesemetoder, uden at de dog er begrænset hertil, alle eller en del af de aminosyrese-15 kvenser, som i alt væsentligt er som vist i fig. 11 og/eller fig. 15, herunder ændrede sekvenser, hvori funktionelt ækvivalente aminosyrerester indgår i stedet for rester i sekvensen, hvilket resulterer i en tavs ændring. F.eks. kan en eller flere aminosyrerester i sekvensen være ombyttet med 20 en anden aminosyre med en tilsvarende polaritet, som virker som et funktionelt ækvivalent, og som resulterer i en tavs ændring. Erstatninger for en aminosyre i sekvensen kan udvælges fra andre medlemmer af den klasse, hvortil aminosyren hører. F.eks. omfatter de ikke-polære (hydrofobe) aminosyrer 25 glycin, alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, phenylala-nin, tryptophan og methionin. De polære, neutrale aminosyrer omfatter serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin. De positivt ladede (basiske) aminosyrer omfatter arginin, lysin og histidin. De negativt ladede (sure) amino-30 syrer omfatter asparaginsyre og glutaminsyre.

5.5 Nucleotidsekvensering af PBOMP-aener.

Når først de fragmenter i DNA, som indeholder PBOMP-generne, er blevet identificeret, kan den faktiske nucleo-35 tidsekvens i disse gener fastlægges ved sekvensanalyse af DNA. Sekvensrækkefølgen af baseparrene kan bestemmes ved en 33 DK 174965 B1 vilkårlig af to metoder, metoden ifølge Maxam og Gilbert, jf. Maxam og Gilbert, 1980, Methods in Enzymology, 65, 49, eller dideoxymetoden, jf. Sanger et al., 1977, Proc. Nat'l,

Acad. Sci. USA 74, 5463. De faktiske start- og stopsignaler 5 i PBOMP-generne kan fastlægges ved analyse af nucleotidse-kvensen for åbne læserammer, jf. Rosenberg et al., 1979,

Ann. Rev. Genet. 13, 319. Hvis der findes mere end én åben læseramme på et specielt DNA-fragment, har identiteten af det faktiske gen kunnet bekræftes ved sammenligning af gen-10 produktets forudsagte aminosyre sekvens med aminosyresekvensen i PBOMP. Placeringen af den rigtige læseramme kan også bestemmes ved anvendelse af genfusioner.

5.6. Bestemmelse og immunostvrke af PBOMP'er oa PBOMP-15 associerede peptider.

Erfaring med antistoffer mod kapselpolysaccharidet i Haemophilus influenzae type b, dvs. PRP, viser, at evnen hos antistofferne til udryddelse af bakterien ved afprøvninger in vitro og til beskyttelse imod infektion med Hib i 20 dyremodelsystemer er tæt korreleret med evnen til frembringelse af en beskyttende immunreaktion hos mennebørn.

Anti-PBOMP-antistoffer frembragt som reaktion på PBOMP-proteinerne og -peptiderne ifølge opfindelsen, som omfatter, men ikke er begrænset til PBOMP-1- og/eller 25 PBOMP-2-proteiner og/eller PBOMP-1:PBOMP-2- og PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsproteiner, kan afprøves ved anvendelse af tilsvarende afprøvningssystemer in vitro og dyremodelsystemer til påvisning af evnen til udryddelse af både Hi- og Hib-celler og til beskyttelse mod infektion med Hib i dyremodel systemer.

30 Ved specielle udførelsesformer for opfindelsen kan antistoffer frembringes som reaktion på kemisk syntetiserede PBOMP-peptider eller PBOMP-peptider frembragt ved proteolytisk spaltning af PBOMP-proteinet. Ved en foretrukket udførelsesform vil sådanne PBOMP-peptidfragmenter være koblet til et 35 proteinbærestof, f.eks. thyroglobulin, okseserumalbumin, diphtheriatoxin eller detoxificeret diphtheriatoxin 34 DK 174965 B1 (diphtheriatoxoid), tetanustoxin eller -toxoid, pseudomonas-toxin eller -toxoid, staphylococcustoxin eller -toxoid, pertussistoxin eller -toxoid eller CRM197. CRM197 adskiller sig fra nativt diphtheriatoxin ved en enkelt aminosyre.

5 Immunologisk kan CRM197 og nativt diphtheriatoxin imidlertid ikke skelnes fra hinanden. En detaljeret beskrivelse af CRM197 findes i US patentskrift nr. 4.673.574 og litteraturhenvisninger deri. Resultaterne af disse systemer bør vise en tilsvarende korrelering med potentialet hos hvert enkelt 10 PBOMP til frembringelse af beskyttende immunreaktion og til at tjene i en vaccine for spædbørn, børn og voksne mennesker.

Et komplementmedieret, baktericidt afprøvningssystem in vitro, jf. Musher et al., 1983, Infect. Immun. 39, 297-304; Anderson, et al., 1972, J. Clin. Inv. 51, 31-38, som 15 tidligere er blevet anvendt til måling af baktericid ak tivitet af antistoffer af PRP og lipopolysaccharid (LPS) imod H. influenzae kan anvendes til at bestemme, om antistof rettet imod et specielt PBOMP-peptid eller et fragment deraf har eller ikke har baktericid aktivitet imod H. influenzae 20 type b og ikke typebestemmeligt H. influenzae. Disse afprøvninger kan gennemføres imod et relativt stort antal kliniske isolater af begge bakterietyper for at bestemme, om et bredt interval af stammer udryddes. Illustrative eksempler på sådanne, baktericide afprøvninger in vitro findes i neden-25 stående afsnit 7.1., 9.4. og 10.5.

Yderligere data om evnen hos et PBOMP eller fragment deraf til frembringelse af en beskyttende antistofreaktion kan tilvejebringes ved anvendelse af meningitismodelsystemet hos spæde rotter, jf. Smith et al., 1973, Infect. Immun. 8, 30 278-290. Spæde rotter inficeret før den 6. levedag med en egnet dosis af H. influenzae type b udvikler bakteremi og en fatal meningitis mage til den, som ses hos spædbørn.

Hvis antistof, som er baktericidt imod en inficerende stamme, anvendes til passiv immunisering af spæde rotter før infek-35 tion, er de derefter beskyttet mod meningitis og død. Antistoffer rettet imod den gængse vaccine for Haemophilus ty- 35 DK 174965 B1 pe b, PRP, er beskyttende i modelsystemet med spæde rotter. Passiv beskyttelse imod Haemophilus meningitis type b har kunnet påvises ved immunisering af spæde rotter med poly-klonalt kanin-anti-PBOMP-antistof og efterfølgende infektion 5 af rotterne med en dødelig dosis af H. influenzae type b.

Et illustrativt eksempel på en sådan beskyttende antistof -reaktion in vivo frembragt af proteinerne og peptiderne ifølge den foreliggende opfindelse findes i nedenstående afsnit 7.2.

10 -Data om evnen hos antistof mod et specielt PBOMP til beskyttelse imod Hi har kunnet opnås ved anvendelse af dyremodelsystemet med mellemørebetændelse hos chinchilla, jf. Barenkamp et al., 1986, Infect. Immun. 52, 572-578. Ved denne dyremodel inficeres chinchillaer ved podning af den 15 indre øregang med Hi. Der udvikles en mellemørebetændelse, som er meget lig den, som ses hos mennesker. Chinchillaer, som er blevet immuniseret, enten aktivt med Hi-OMP'er eller passivt med antistof rettet imod Hi-OMP'er, er beskyttet imod øreinfektion med Hi, jf. Barenkamp et al., supra. Dette 20 dyremodelsystem har kunnet anvendes til påvisning af evnen hos antistof mod et PBOMP til beskyttelse imod Hi.

Det er muligt at påvise, at anti-PBOMP-antistoffer er i stand til additiv beskyttelse sammen med anti-PRP-anti-stoffer ved anvendelse af dyremodellen med spæde rotter.

25 Anti-PBOMP-1-antistoffer fortyndet til et punkt, hvor de ikke mere er i stand til at beskytte spæde rotter imod infektion med Hib, kan blandet med en tilsvarende fortynding af anti-PRP-antistoffer udvise additiv beskyttelse og derved forhindre, at spæde rotter dør. Denne additive beskyttelse 30 kunne være værdifuld til en potentiel kombinationsvaccine sammensat af PRP, eller et fragment eller konjugat deraf, og PBOMP eller et fragment deraf.

5.7. Formulering af en vaccine.

35 Mange metoder kan anvendes til indføring af de neden for beskrevne vaccineformuleringer i et menneske eller et dyr. Disse metoder omfatter, men er ikke begrænset til in tradermale, intramuskulære, intraperitoneale, intravenøse, subcutane og intranasale indgiftsveje.

36 DK 174965 B1 5 5.7.1. Underenhedsvaccineformuleringer.

Et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe proteiner eller polypeptidfragmenter beslægtet med ydermembranproteiner hos H. influenzae, PBOMP’er, herunder PBOMP-l, PBOMP-2 og beslægtede proteiner og peptider 10 samt PBOMP-l:PBOMP-2- og PBOMP-2:PBOMP-l-fusionsproteiner og beslægtede peptider, som anvendes som immunogener i en underenhedsvaccine til beskyttelse imod meningitis og andre sygdomssymptomer på infektioner med H. influenzae. Underenhedsvacciner omfatter udelukkende det relevante, immunogene 15 materiale, som er nødvendigt til immunisering af en vært. Vacciner fremstillet ud fra genetisk konstruerede immunogener, kemisk syntetiserede immunogener og/eller immunogener omfattende autentiske, praktisk taget rene PBOMP'er fra H. influenzae, som er isoleret som her beskrevet, og som er i 20 stand til at frembringe en beskyttende immunreaktion, er særligt fordelagtige, fordi der ikke er nogen risiko for infektion af modtagerne. Det PBOMP-beslægtede protein eller fragmentet deraf kan således renses fra rekombinanter, som eksprimerer PBOMP-epitoperne. Sådanne rekombinanter omfatter 25 vilkårlige af de ovenfor beskrevne bakterietransformanter, gærtransformanter eller dyrkede celler inficeret med rekom-binantvira, som eksprimerer PBOMP-epitoperne, jf. ovenstående afsnit 5.4. og 5.5. Alternativt kan det PBOMP-beslægtede protein eller peptid syntetiseres kemisk. Til dette formål 30 kan aminosyresekvensen af et sådant protein eller peptid afledes ud fra nucleotidsekvensen af det gen, som dirigerer dens ekspression, jr. ovenstående afsnit 5.5. Ved endnu en alternativ udførelsesform isoleres det PBOMP-beslægtede protein eller peptid i praktisk taget ren form fra kulturer 35 af H. influenzae, se f.eks. ovenstående afsnit 5.1.

Uanset om immunogenet er renset fra rekombinanter 37 DK 174965 B1 eller syntetiseret kemisk, indstilles slutproduktet på en hensigtsmæssig koncentration og formuleres med et vilkårligt, egnet vaccineadjuvans. Egnede adjuvanser omfatter, men er ikke begrænset til overfladeaktive stoffer, f.eks. hexade-5 cylamin, octadecylamin, octadecylaminosyreestere, lysoleci-thin, dimethyl-dioctadecyl-ammoniumbromid, N,N-dioctadecyl-N’,N-bis-(2-hydroxyethylpropandiamin), methoxyhexadecylglycerol og pluroniske polyoler,- polyaminer, f.eks. pyran, dextransulfat, poly-IC, polyacrylsyre, "Carbopol®"; peptider, 10 f.eks. muramyldipeptid, dimethylglycin, tuftsin; olieemulsioner; mineralgeler, f.eks. aluminiumhydroxid og aluminium-phosphat. Immunogenet kan også inkorporeres i liposomer eller konjugeres til polysaccharider og/eller andre polymere til anvendelse i en vaccineformulering.

15 Ved endnu en udførelsesform for opfindelsen er det PBOMP-beslægtede protein eller peptid et hapten, dvs. et molekyle, som er antigent, idet det reagerer specifikt eller selektivt med cognatantistoffer, men som ikke er immunogent, idet det ikke kan frembringe en immunreaktion. I et sådant 20 tilfælde kan haptenet være covalent bundet til et bærestof eller et immunogent molekyle. F.eks. vil et stort protein, såsom proteinserumalbumin, give det hapten, som er koblet dertil, immugenicitet. Hapten-bærestoffet kan formuleres til anvendelse som en underenhedsvaccine.

25 5.7.2. Virusvaccineformulerinoer.

Et andet formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe enten en levende rekombinantvirusvaccine eller en inaktiveret rekombinantvirusvaccine, som anvendes 30 til beskyttelse imod meningitis og andre sygdomssymptomer på H. influenzae. Til dette formål fremstilles rekombinant-vira, som eksprimerer PBOMP-beslægtede epitoper, se ovenstående afsnit 5.4. og 5.5. Hvor rekombinantviruset er smitsomt for den vært, som skal immuniseres, men ikke forårsager 35 sygdom, foretrækkes en levende vaccine, fordi formering i værten fører til en langvarig stimulans og derfor giver en 38 DK 174965 B1 i praksis langvarig immunitet. Når det smitsomme rekombi-nantvirus indføres i en vært, kan det eksprimere det PBOMP-beslægtede protein eller polypeptidfragment ud fra sit chi-mere gen og derved frembringe en immunreaktion imod antigener 5 fra H. influenzae. I de tilfælde, hvor en sådan immunreaktion er beskyttende imod efterfølgende infektion af H. influenzae, kan selve det levende rekombinantvirus anvendes i en fore-byggende vaccine imod infektion af H. influenzae. Produktion af et sådant rekombinantvirus kan indebære systemer både in 10 vitro (f .eks. vævskulturceller) og in vivo (f .eks. et naturligt værtsdyr). F.eks. kan konventionelle metoder til fremstilling og formulering af koppevaccine tilpasses til formuleringen af en levende rekombinantvirusvaccine, som eks-primerer et PBOMP-beslægtet protein eller polypeptid.

15 Multivalente, levende virusvacciner kan fremstilles ud fra et enkelt eller nogle få smitsomme rekombinantvira, som eksprimerer epitoper af organismer, som forårsager sygdom, ud over epitoperne i PBOMP'er fra H. influenzae. P.eks. kan der konstrueres et vacciniavirus, som indeholder kodende 20 sekvenser for andre epitoper ud over dem i PBOMP'er fra H. influenzae. Et sådant rekombinantvirus kan i sig selv anvendes som immunogenet i en multivalent vaccine. Alternativt kan en blanding af vacciniavirus eller andre vira, som hver især eksprimerer et forskelligt gen, som koder for forskel-25 lige epitoper i PBOMP'er og/eller andre epitoper fra andre, sygdomsforårsagende organismer, formuleres i en multivalent vaccine.

Uanset om rekombinantviruset er smitsomt for den vært, som skal immuniseres, eller ej, kan der fremstilles 30 en inaktiveret virusvaccineformulering. Inaktiverede vacciner er "døde" i den forstand, at deres smitsomhed er blevet ødelagt, sædvanligvis ved kemisk behandling, f.eks. med formaldehyd. Ideelt ødelægges smitsomheden af viruset uden påvirkning af de proteiner, som bærer virusets immunogeni-35 citet. Til fremstilling af inaktiverede vacciner skal store mængder af det rekombinantvirus, som eksprimerer det PBOMP- 39 DK 174965 B1 beslægtede protein eller polypeptid, dyrkes i kultur til tilvejebringelse af den nødvendige mængde relevante antigener. En blanding af inaktiverede vira, som eksprimerer forskellige epitoper, kan anvendes til formuleringen af "mul-5 tivalente" vacciner. I visse tilfælde kan disse "multivalen-te", inaktiverede vacciner være at foretrække fremfor en levende vaccineformulering på grund af potentielle vanskeligheder med gensidig interferens af levende vira, som indgives sammen. I begge tilfælde bør den inaktiverede rekom-10 binantvirus eller blandingen af vira være formuleret i et hensigtsmæssigt adjuvans til forøgelse af den immunologiske reaktion på antigenerne. Egnede adjuvanser omfatter, men er ikke begrænset til overfladeaktive stoffer, f.eks. hexade-cylamin, octadecylamin, octadecylaminosyreestere, lysoleci-15 thin, dimethyl-dioctadecyl-ammoniumbromid, Ν,Ν-dioctadecyl-N1,N-bis-(2-hydroxyethylpropandiamin), methoxyhexadecylgly-cerol og pluroniske polyoler; polyaminer, f.eks. pyran, dextransulfat, poly-IC, polyacrylsyre, "Carbopol®"; peptider, f.eks. muramyldipeptid, dimethylglycin, tuftsin; olieemul-20 sioner; mineralgeler, f.eks. aluminiumhydroxid og aluminium-phosphat.

Den efterfølgende eksempelrække er medtaget med det formål at illustrere opfindelsen.

25 6. Eksempler: Isolering oa karakterisering af naturlige PBOMP'er og PBOMP'er stammende fra rekombinant-DNA.

6.1. Isolering, rensning og analyse af PBOMP-1.

I en forsøgsrække er PBOMP-1, som er praktisk frit 30 for andre cellevægskomponenter, blevet opnået ud fra H. influenzae som følger: H. influenzae Eagan dyrkes natten over på enten hjerne-hjerte- infusionsmedium indeholdende 10 ^g/ml hemin og 1 /ig/ml NAD (BHI-XV) eller mMIC-medium (modifikation af 35 Herriott et al., 1970, J. Bacteriol. 101, 513-516). Efter centrifugering ved 10.000 x g i 15 minutter ved 4°C kasseres 40 DK 174965 B1 den ovenstående væske i "Rocal II"-desinfektionsmiddel. Celleperlen vejes og suspenderes i 10 mM HEPES-NaOH (pH 7,4), 1 mM EDTA, med et volumen puffer, som er lig med ca. fem gange den våde vægt af cellerne. Derefter sonikeres 5 cellesuspensionen i 5 minutter i et isbad i 100 ml portioner med en "Branson" model 350 sonifikatorcelleopbryder (Branson Sonic Power, Danbury, CT) ved en styrke på 60% på en pulsindstilling. Efter sonikering centrifugeres suspensionen af opbrudte celler ved 10.000 x g i 5 minutter ved 4°C til 10 fjernelse af ubrudte celler. Derefter vejes de sedimenterede, ubrudte celler og sonikeres igen som før i et volumen af 10 mM HEPES-NaOH, pH 7,4, 1 mM EDTA, ækvivalent til ca. fem gange den våde vægt af de ubrudte celler. Den totale membranfraktion fås som en perle efter tilsætning af tilstrækkeligt 15 NaCl til tilvejebringelse af en slutkoncentration på 0,5 M NaCl og ultracentrifugering af det itubrudte cellemateriale ved 100.000 x g i ca. 1 time.

Derefter fås et ydermembran-cellevæg-kompleks ved fjernelse af indermembrankomponenterne fra den totale mem-20 branfraktion ved gentagen ekstraktion af den totale membranfraktion med 1% "Sarcosyl®" i 10 mM HEPES-NaOH, pH 7,4. Den uopløselige rest, som indeholder ydermembran-cellevæg-fraktionen, isoleres ved centrifugering ved 350.000 x g i 30 minutter, suspenderes i 50 mM Tris, pH 8,0, 5 mM EDTA, og 25 opbevares natten over ved 4°C.

Et PBOMP-l-cellevæg-kompleks isoleres fra resten af de andre proteiner i ydermembranfraktionen ved sekventiel ekstraktion af ydermembran-cellevæg-fraktionen med octyl-glucosid (to gange) efterfulgt af "Sarcosyl®" (to gange).

30 Begge detergenser anvendes i 1% (vægt/vol) i 50 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8,0. Ekstraktionerne gennemføres ved stuetemperatur (20°C) i 30 minutter hver især. Derefter centrifugeres blandingen ved 100.000 x g i 1 time. Det uopløselige, sedimenterede materiale, som er tilbage efter ekstraktion med oc-35 tylglycosid og "Sarcosyl®", er et PBOMP-l-cellevæg-kompleks.

PBOMP-1 er blevet gjort opløseligt ved to metoder: 41 DK 174965 B1 (1) opvarmning til 60°C i 1 time i nærværelse af et af flere detergenser eller (2) opbrydning af cellevæggen ved lysozym-digerering ved 37°c i 1 time i nærvær eller fravær af deter-gens. Efter enten (1) eller (2) er opløseligt PBOMP-1 blevet 5 skilt fra uopløseligt materiale ved centrifugering ved 100.000 x g i 1 time ved 15°C. I ingen af metoderne (1) eller (2) er det specielt udvalgte detergens kritisk for opløseliggørelsen. Faktisk er alle indtil nu afprøvede detergenser (herunder deoxycholat, "Triton® X-100", "Tween® 10 80", "CHAPS", "CHAPSO", dodecylmaltosid, "Zwittergent 3-14" og "Zwittergent 3-16" effektive ved den varmeafhængige oplø-seliggørelse og ved den lysozymfrembragte opløseliggørelse. Desuden er octylglucosid meget effektivt ved de lysozymfrem-bragte opløseliggørelser og er blevet anvendt rutinemæssigt 15 i en slutkoncentration på 1% (vægt/vol) . Ud fra celler med en våd vægt på 40 g har det typisk været muligt at isolere ca. 8 mg PBOMP-1, praktisk taget frit for andre cellevægskomponenter. Dette praktisk taget rene PBOMP-1-præparat er blevet analyseret i et SDS-PAGE-system til bestemmelse af den 20 relative molekylvægt af den reducerede, denaturerede form af dette protein og til vurdering af dets renhed (fig. 1).

Prøver er blevet fremstillet til analyse ved SDS-PAGE, ved at de er blevet indstillet på 0,1 M Tris-HCl, pH

7,0, 25 mM dithiothreitol og 2% SDS med fem gange koncentre-25 ret prøvepuffer, hvorefter de er blevet opvarmet i 5 minutter til 100°C. Før elektroforese er alle prøver blevet indstillet på 6% (vægt/vol) saccharose og 0,001% bromphenolblåt. De fleste rutineanalyser er blevet gennemført ved anvendelse af "Bio-Rad"-miniproteingelsystemet (Redmond, CA) . Gelerne 3 0 er 1,5 mm tykke, og den adskillende gel indeholder 15% acryl-amid med et forhold mellem acrylamid og bis på 30:0,8, 0,375 M Tris-HCl (pH 8,8) og 0,1% SDS. Stablingsgelen indeholder 4,8% acrylamid med samme mængdeforhold mellem acrylamid og bis, 125 mM Tris-HCl (pH 7,0) og 0,1% SDS pr. gel. Efter 35 elektroforese farves gelerne i mindst 1 time med 0,125% (vægt/vol) "Coomasie®"-blåt i ethanol .-eddikesyre:vand (5:1:5) 42 DK 174965 B1 og affarves derefter i samme opløsningsmiddelsystem uden det blå farvestof. I forvejen farvede standarder med lav molekylvægt, som omfatter følgende: ovalbumin, 43.000; a-chymotrypsinogen, 25.700; β-lactoglobulin, 18.400; lysozym, 5 14.300; oksetrypsininhibitor 6.200; insulin (A- og B-kæder) , 2.300 og 3.400 (BRL, Bethesda, MD) , er blevet anvendt som assistance ved bestemmelsen af den relative molekylvægt af PBOMP-1.

Yderligere rensning af PBOMP-1 kan opnås ved stan-10 dardmetoder, f.eks. ionbytterchromatografi, chromatografi med molekyl sigter, hydrofob chromatograf i eller chromatograf i med omvendt fase, chromatofokusering og gelelektroforese.

6.1.1. Karakterisering af PBOMP-1 ved aminosyresammensætning 15 og -sekvens.

Aminosyreanalyse er blevet gennemført ved metoden ifølge Simpson et al., 1976, J. Biol. Chem. 251, 1936-1940. Hydrolyse sker ved opvarmning af 0,5-1 mg protein i 0,1 ml 4 N methansulfonsyre under vakuum i et tykvægget, forseglet 20 glasrør ved 100°C i 22 timer. Mængden af hver enkelt aminosyre fås ved sammenligning af arealerne under de forskellige spidser med arealer opnået ved anvendelse af kendte mængder af standardaminosyrer. De opnåede resultater er vist i tabel I.

43 DK 174965 B1

Tabel I

Aminosvresammensætning af PBOMP-la 5 Aminosvrerester Antal

Asparaginsyre (Asp+Asn) 15

Threonin 6

Serin 7

Glutaminsyre (Glu+Gln) 12 10 Prolin 3

Glycin 18

Alanin 19

Cystein 1

Valin 10 15 Methionin 0

Isoleucin 4

Leucin 11

Tyrosin 13

Phenylalanin 4 20 Lysin 8

Histidin 2

Arginin 7

Tryptophan 0 1 a Den tilsyneladende molekylvægt af PBOMP-1 er 15.057 dalton. Det totale antal aminosyrerester er 140.

44 DK 174965 B1

Indledende forsøg på sekvensering af PBOMP-1 ved anvendelse af Edman-kemi har ikke givet tilfredsstillende resultater på grund af en blokeret, N-terminal rest. Til opnåelse af delvis information om aminosyresekvensen har 5 det været nødvendigt enzymatisk at digerere PBOMP med en molekylvægt på 16.000 dalton med proteolytiske enzymer til opnåelse af peptidfragmenter, som er følsomme for sekvensanalyse .

En proteolytisk digerering af det PBOMP-1 på 16.000 10 dalton, som er opnået ved anvendelse af trypsin, ved 27°C i 1 time adskilles ved højtryksvæskechromatografi med omvendt fase (RP-HPLC) ved anvendelse af en "C18"-kolonne. En stor, hydrofob peptidspids (T9) isoleres og immobiliseres derefter på et polybreneovertrukket glasfiberpapir før starten af 15 aminosyresekvenseringen.

T9-peptidet sekvenseres ved Edman-sønderdeling, jf.

Edman et al., 1967, Eur. J. Biochem. 1, 80-91. Hver cyclus fra sekvensatoren frembringer en anilinothiazolinon-phenyl-thiohydantoin (PTH)-aminosyre. Analyse gennemføres på en 20 "C18"-HPLC-patronkolonne med omvendt fase med et væskechro- matografisystem. PTH'erne elueres ved stuetemperatur med en natriumacetat-acetonitril-gradient og påvises ved 270 nanometer med en detektor for variabel UV-bølgelængde.

Sekvensanalysen af T9-peptidet er vist nedenfor: 2 5 Tyr-Asn-Thr-Val -Tyr- Phe-Gly- Phe-Asp-Lys-Tyr-Asp-Ile-Thr-Gly-Phe-Tyr-Val -Thr-Ile-Asp-Ala-Asp-Ala-Ala-Tyr-Leu-Asn-Ala-Thr-Pro-Ala-Ala.

T9-peptidet er meget hydrofobt, idet det indeholder 8 aromatiske aminosyrer (5 Tyr, 3 Phe) og 5 aminosyrer med 30 aliphatisk sidekæde (1 Leu, 2 Val, 2 Ile). Tyrosinindholdet i dette peptid er højt, men er i overensstemmelse med den totale aminosyresammensætning af PBOMP-1 (tabel I) . Endvidere er PBOMP-l usædvanligt, fordi det indeholder 13 tyrosin, men intet methionin eller tryptophan.

35 45 DK 174965 B1 6.1.2. Karakterisering af PBOMP-1 ved fedtsvreanalvse.

Som angivet i afsnit 6.1.1. har indledende forsøg på sekvensering af PBOMP-1 ved Edtnan-sønderdeling ikke givet tilfredsstillende resultater på grund af en blokeret, N-5 terminal rest. Fedtsyreanalyse af renset PBOMP-1 fra H. influenzae er blevet gennemført for-at undersøge, om der på PBOMP-1-peptidet kan identificeres covalent bundne fedtacyl-grupper.

Forud for fedtsyreanalyse ekstraheres PBOMP-1-protein 10 isoleret som ovenfor beskrevet i afsnit 6.1. grundigt med en blanding af organiske opløsningsmidler, dvs. chloroform:-methanol (2:1), og med deoxycholatdetergens til fjernelse af alle sporurenheder af f .eks. endogene lipider og phospho-lipider. Det blotlagte protein fås enten ved acetoneudfæld-15 ning eller ved grundig dialyse og tørres ved lyofilisering.

En kendt mængde nonadecansyre tilsættes som en intern standard til det tørrede, rensede PBOMP-1 (1-3 mg) , og blandingen hydrolyseres med 200 μΐ 4 N HC1 ved 110°C i 4 timer under en nitrogenatmosfære. En sådan syrehydrolyse frigør amid-20 eller esterbundne fedtsyrer. Hydrolysatet, fortyndet til 2 ml med vand, ekstraheres tre gange med samme volumen hexan.

Den kombinerede hexanfase vaskes to gange med samme volumen saltopløsning og tørres derefter over natriumsulfat. Fedtsyrerne omdannes til de tilsvarende methylestere med diazo-25 methan, jf. Schlenk, 1960, Anal. Chem. 32, 1412-1414, før de indsprøjtes i en Perkin Elmer Model 8500 gas-væskechroma-tograf. Adskillelse af fedtsyremethylestere gennemføres på en "SPB-l"-kapillærkolonne med brændt siliciumoxid (Supelco,

Inc., Belefonte, PA). De resulterende spidser identificeres 30 ved sammenligning med kendte standarder. De opnåede resultater er vist i fig. 16.

Som vist i fig. 16 er der tre hovedfedtsyrer forbundet med PBOMP-1, nemlig laurinsyre (C12), palmitinsyre (C16) og et derivat af palmitinsyre (C161), som endnu ikke er iden-35 tificeret definitivt. 016' er måske en fedtsyre med forgrenet kæde og 16 carbonatomer.

DK 174965 B1 4 6 6.2. Fremstilling af anti-PBOMP-1- og anti-PBOMP-2-antistof fer .

6.2.1. Fremstilling af polvklonalt anti-PBOMP-1- oa anti-5 PBOMP-2-antiserum.

Praktisk taget rent PBOMP-1 anvendes som et immunogen til fremstilling af anti-PBOMP-1-antistoffer. Delvist rensede fraktioner beriget på PBOMP-1, fremstillet som beskrevet i afsnit 6.1., elektroforeseres på 15%'s SDS-PAGE-geler ved 10 en konstant strøm på 35 mA ved 10°C. Proteinbåndene fikseres og farves som beskrevet i afsnit 6.1.1. PBOMP-1-bånd udskæres fra gelerne og dialyseres imod phosphatpufret saltopløsning (PBS) (20 mM natriumphosphat, 150 mM NaCl pH 7,4), indtil de er ækvilibreret. Acrylamidgelfraktionerne indeholdende 15 PBOMP-1 hakkes fint, ved at de ledes gennem en nål nr. 25 i PBS. Fragmenterne injiceres intramuskulært i hvide New Zealand kaniner på flere steder. Hver kanin får i alt ca. 20 /xg PBOMP-1. Kaninerne immuniseres igen 2 uger og 3 uger efter den indledende immunisering. Blodprøver udtages fra dyrene 20 1 uge efter sidste immunisering, og serumet indsamles. Dyrene forstærkes med 20 μg PBOMP-1 i acrylamid hveranden måned til opretholdelse af høje titere af anti-PBOMP-1-antistoffer.

Alternativt blandes PBOMP-1, isoleret som beskrevet i afsnit 5.1., med Freund's ukomplette adjuvans og emulgeres.

25 Kaniner injiceres intramuskulært med ca. 20 μg PBOMP-1 i Freund's adjuvans. Dyrene immuniseres igen 2 uger og 3 uger efter den indledende immunisering, og blodprøver udtages 1 uge efter den sidste immunisering.

Praktisk taget rent PBOMP-2 anvendes som et immunogen 30 til fremstilling af anti-PB0MP-2-antistoffer. Delvist rensede fraktioner beriget på PBOMP-2, fremstillet som beskrevet i afsnit 6.1., elektroforeseres på 15%'s SDS-PAGE-geler ved en konstant strøm på 35 mA ved 10°C. Proteinbåndene fikseres og farves som beskrevet i afsnit 6.1.1. PBOMP-2-bånd udskæres 35 fra gelerne og dialyseres imod phosphatpufret saltopløsning (PBS), indtil de er ækvilibreret. Acrylamidgelfraktionerne 47 DK 174965 B1 indeholdende PBOMP-1 hakkes fint, ved at de ledes gennem en nål nr. 25 i PBS. De finthakkede PB0MP-2-gelfragmenter blandes med Freund's komplette adjuvans og emulgeres. Kaniner injiceres intramuskulært med ca. 10 PBOMP-2 i Freund's 5 adjuvans. Dyrene forstærkes med 10 μg af samme præparat i Freund's ukomplette adjuvans 4 uger efter den primære podning .

6.2.2. Produktion af monoklonale anti-PBOMP-1- oa anti-10 PBOMP-2-antistoffer.

Hybridomacellelinier, som udskiller antistoffer imod PBOMP-1 eller PBOMP-2, fås ved fusion af musemyelomacel-lelinien X63.Ag8.6543 med miltceller opnået fra en C57/B1-mus immuniseret imod H. influenzae som følger: En C57-B1-15 hunmus injiceres intraperitonealt fire gange i løbet af en periode på to måneder med 1 x 106 celler fra H. influenzae stamme S2. Tre måneder senere immuniseres musen med praktisk taget rent PBOMP-1 eller PBOMP-2 isoleret fra et SDS-PAGE-bånd som beskrevet i afsnit 6.2.1. En måned senere får musen 20 en intravenøs injektion af totale ydermembraner fra S2. Cellefusion gennemføres på 4. dagen efter intravenøs injektion ved standardmetoder, som er gængse for fagfolk på området, jf. f.eks. Gefter et al., 1977, Somat. Cell. Genet.

3, 231-236.

25 Ovenstående hybridomacellekulturvæsker screenes ved en standard-ELISA ved anvendelse af ydermembraner fra H. influenzae som antigener. Afprøvninger gennemføres i polystyrenplader med 96 huller overtrukket natten over ved 4°C med OMP'er.

30 Pladerne blokeres med 40 mM Tris (pH 8,0), 150 mM

NaCl, 5% fedtfri tørmælk ("BLOTTO") (se afsnit 6.4.4.) og vaskes med PBS/0,1% "Tween®-20". Ovenstående kulturvæsker fortyndet 1:10 i PBS/"Tween®-20" tilsættes, inkuberes i 60 minutter ved 25°C og vaskes som før. Bundne antistoffer 35 påvises med alkalisk phosphatase-gede-F(ab')2~anti-muse-(IgG, IgM)-substrat og alkalisk phosphatasesubstrat. Posi- 48 DK 174965 B1 tive, ovenstående væsker screenes derefter ved punktpletana-lyse med renset PBOMP-1, OMP'er fra E. coli og S2-lipopoly-saccharid (LPS). Ønskede hybridomaer klones igen ved begrænsende fortynding, jf. McKearn, 1980, i Monoclonal Antibodies, 5 Kennett, McKearn og Bechtol, udg., Plenum Press, side 374, og screenes ved Western-plet med Hib OMP'er. Udvalgte hybridomaer injiceres i Balb/c-mus til vækst som ascites ved standardmetoder, jf. Brodeur et al., 1984, J. Immunol. Meth.

71, 265-272.

10 Sytten af de hybridomaer, som er frembragt ved fusi onen af musemyelomaceller med miltceller fra C7/Bl-mus immuniseret med PBOMP-2, screenes for deres reaktivitet over for PBOMP-2 ved anvendelse af standard-ELISA-afprøvningen.

Et af disse hybridomaer, betegnet 61-1, viste sig at være 15 specifikt for PBOMP-2. Western-pletmetoder, som er beskrevet nedenfor i afsnit 6.5.5., ved anvendelse af 61-1 som det primære antistof har vist, at PBOMP-2 eller et PBOMP-2-agtigt protein er blevet bevaret og eksprimeret i de tre kliniske, ikke-typebestemmelige stammer af H. influenzae 0045E, 1939 20 og HST31, jf. fig. 29.

6.3. Reaktivitet af anti-PBOMP-1- og anti-PBOMP-2-antistof fer med E, coli.

Western-pletanalyse af reaktiviteten af anti-PBOMP-1-25 og anti-PBOMP-2-antiserum er blevet gennemført som beskrevet i nedenstående afsnit 6.4.4. 10 μΐ af en nattegammel bakteriekultur lyseret i prøvepræparatpuffer indeholdende 2-mercaptoethanol påføres hver kolonne af en 15% SDS-PAGE-gel. Efter elektroforese og overføring til nitrocellulose 30 sonderes pletterne med fortyndinger 1:250 af polyklonalt kanin-anti-PBOMP-1. Inkubering med peberrodperoxidasekon-jugeret gede-anti-kanin-IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) har vist, at anti-PBOMP-1-antisera har erkendt PBOMP-1 i Haemophilus og et protein på 18.000 dalton 35 i E. coli (fig. 2A).

49 DK 174965 B1

For at få bekræftet, at en epitop i PBOMP-1 krydsreagerer med et protein på 18.000 dalton i E. coli, er mono-klonale antistoffer fremstillet imod PBOMP-1 blevet screenet for reaktivitet imod proteiner fra E. coli. Selv om de fleste 5 af de screenede, monoklonale antistoffer ikke har reageret med E. coli, har én klasse af monoklonale antistoffer, eksemplificeret ved det monoklonale antistof Gl-1, reageret stærkt med PBOMP-1 i Haemophilus og med et protein på 18.000 dalton i E. coli (fig. 2B). Dette viser, at mindst én epitop 10 til stede på PBOMP-1 krydsreagerer med en epitop på et protein fra E. coli. Dette antyder, at et antiserum imod PBOMP-1 fra H. influenzae eventuelt også kan beskytte imod visse infektioner af E. coli. Det monoklonale anti-PBOMP-2-antistof 61-1 har vist sig at krydsreagere svagt med et protein på 15 ca. 15.000 dalton fra E. coli, men har ikke vist nogen påviselig krydsreaktivitet med PBOMP-1.

6.4. Almene metoder anvendt til fremstilling af rekom- binantplasmider.

20 6.4.1. Betingelser for restriktionsenzvmdiqererinqer.

Restriktionsendonucleaser er blevet indkøbt fra BRL (Bethesda, MD) , ΙΒΪ (New Haven, CT) , New England Biolabs (Beverly, MA) eller US Biochemical Corporation (Cleveland, 25 OH).

Restriktionsenzymdigereringer er blevet gennemført, ved at DNA suspenderes i den hensigtsmæssige restriktionspuffer, restriktionsendonuclease tilsættes, og der inkuberes i et hensigtsmæssigt tidsrum til sikring af fuldstændig 30 digerering. En enhed af enzym er defineret som den mængde, som er nødvendig til fuldstændig digerering af 1,0 μg phag-λ-DNA i løbet af 1 time i en total reaktionsblanding med et volumen på 20 μΐ. Puffere anvendt sammen med de forskellige enzymer er anført i det følgende: 35 Puffer med lavt saltindhold anvendt til Clal-, Hpal-,

Hpall- og Kpnl-digereringer består af 10 mM Tris (pH 8,0), 50 DK 174965 B1 10 mM MgCl2 og 10 mM dithiothreitol (DTT).

Puffer med middelhøjt saltindhold anvendt til Alul-, Aval-, EcoRII-, EcoRV-, Haell-, Haelll-, HincIII-, Hindlll-, PstI-, Sau3AI-, Sphl-, SstI-, Sstll-, Taql- og Xhol-digere-5 ringer består af 50 mM Tris (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 50 mM

NaCl og 10 mM DTT.

Puffer med højt saltindhold anvendt til BamHI-,

EcoRI-, Pvul-, Sall- og Xbal-digereringer består af 50 mM Tris (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl og 10 mM DTT.

10 Pufferen anvendt til Smal-digereringer består af 10 mM Tris (pH 8,0), 20 mM KCl, 10 mM MgCl2 og 10 mM DTT. Pufferen anvendt til Seal-digereringer er 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT. Alle restriktionsdigerer inger er blevet gennemført ved 37°C bortset fra 15 Taql, som er gennemført ved 60°C.

6.4.2. Gelrensning af DNA-fragmenter.

Efter restriktionsenzymdigereringer adskilles DNA-fragmenter af varierende størrelser og renses ved anvendelse 20 af gelelektroforese i agarose, som smelter ved lav tenperatur (FMC LGT-agarose) ved anvendelse af 50 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA-puffer, pH 7,8, ved 10 volt/cm. Agarosekoncentrationerne varierer fra 0,8% til 1,5% afhængigt af størrelsen af fragmenter, som skal udvindes. DNA-bånd gøres synlige ved ethi-25 diumbromidfluorescens og udskæres af gelen. DNA udvindes ved smeltning af agarosen ved 65°C, tilsætning af volumener af 0,65 M NaCl, 10 M Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, således at blandingen bringes op på en slutkoncentration på 0,5 M NaCl, fyldning af DNA på en "NACS"-kolonne (BRL, Bethesda, MD) 30 ækvilibreret med 0,5 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA (belastningspuffer), vask af kolonnen med 3-5 volumener belastningspuffer og eluering med 2-3 volumener 2 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA. DNA-eluatet fortyndes 1:1 med dobbeltdestilleret H2O og udfældes med 3 volumener ethanol.

35 Pellet'en vaskes med 70%'s ethanol, vakuumtørres og resus-penderes i 10 mM Tris-HCl-puffer, pH 7,5, indeholdende l mM

51 DK 174965 B1 EDTA (TE-puffer).

6.4.3. DNA-ligaterino.

Alle ligateringer er blevet gennemført ved anvendelse 5 af T4-DNA-ligase. T4-DNA-ligase er blevet indkøbt fra BRL (Bethesda, MD), United States Biochemicals (Cleveland, OH) eller Boehringer (Indianapolis, IN) . En enhed af T4-DNA-ligase er defineret som den mængde, som er nødvendig til opnåelse af 50% ligatering af Hindlll-fragmenter af bak-10 teriophag-X-DNA i løbet af 30 minutter ved 16°C i et volumen på 20 μΐ ligasepuffer ved en 5'-DNA-terminikoncentration på 0,12 μΜ (300 μg/ml). DNA-ligateringer er blevet udført i ligasepuffer bestående af 50 mM Tris (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM adenosintriphosphat. Normalt er der anvendt 15 en DNA-koncentration varierende fra 20 til 30 μg/ml og et molært forhold mellem vektor og indsætning på 1:1. T4-DNA-ligase er blevet tilsat i et forhold på én enhed pr. 20 μΐ reaktionsvolumen. Inkuberinger er blevet gennemført i 18-24 timer. De anvendte temperaturer har været 15°C for liga-20 teringer af cohæsive ender og 22°C for ligateringer af stumpe ender. Hvis tilstrækkeligt materiale har været til rådighed, er ligateringerne blevet kontrolleret ved analyse af en portion af reaktionsblandingen ved agarosegelelektroforese.

25 6.4.4. Proteinimmunopletanalvse (Western-plet).

Proteiner er blevet fikseret til nitrocelluloseark til immunopletanalyse ved forskellige teknikformer, afhængigt af den specielle anvendelse. Phagplaques er blevet overført fra agarplader, ved at en steril nitrocelluloseskive med en 30 diameter på 8,1 cm forsigtigt er blevet placeret på overfladen af en phagtiterplade med en diameter på 10 cm. Arket har fået lov at blive fuldstændigt gennemvædet, stillingerne er blevet markeret ved perforering gennem filtret med en steril nål, og filtret er blevet løftet efter 2 minutter.

35 Kolonipletninger er blevet udført ved overføring af bakteriekolonier til et nitrocelluloseark, idet kolonierne 52 DK 174965 B1 har fået lov at vokse, ved at arket (kolonisiden opad) er blevet placeret på næringsagar i 4-6 timer, og arket er blevet udsat for chl oro formdamp i 30 minutter til lyse af kolonierne. Proteingeloverføringer er blevet udført, ved at 5 en SDS-PAGE-gel indeholdende den proteinblanding, som skal analyseres, er blevet placeret på et nitrocelluloseark, og vandret elektroforese er blevet påført i et Hoeffer Trans-phor-apparat ved 0,5 A i 14 timer i en puffer af 25 mM Tris, 0,38 M glycin, pH 8,8.

10 Når først proteinoverføringen er fuldstændig, gennem vædes filtrene i 50 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 5% fedtfri tørmælk ("BLOTTO") ved 37eC i 1 time i alle tilfælde bortset fra kolonipletninger. Når kolonipletninger udføres, gennemvædes filtrene natten over ved 4°C i "BLOTTO" indeholdende 15 1 mg/ml lysozym til digerering af cellerester. Derefter absorberes filtrene med en første antistofsonde i en hensigtsmæssig fortynding (bestemt ved forsøgsfejlmetoden) i "BLOTTO" i 3 timer ved 37°C, vaskes tre gange i 15 minutter med "BLOTTO", absorberes med peberrodperoxidasekonjugeret, 20 andet antistof (Kirkegaard og Perry, Gaithersburg, MD) i en fortynding på 1:500 i "BLOTTO" i 1 time ved 37°C og vaskes med "BLOTTO" tre gange i 15 minutter. Filtrene placeres i 50 mM Tris (pH 7,0), 150 mM NaCl, 0,01% hydrogenperoxid; og 0,06% 4-chlor-l-naphthol (Sigma Chemical Co., St. Louis, 25 MO) i methanol tilsættes. Hvis der ikke udvikles en blå farve i løbet af 20 minutter, betragtes reaktionen som negativ. Reaktionen standses, ved at filtret overføres til destilleret vand og duppes tørt.

30 6.4.5. Genfusioner.

Fusioner af et gen eller genfragment, som koder et PBOMP-protein eller et peptid deraf, til et andet gen, såsom det gen, som koder alkalisk phosphatase (PhoA), gennemføres som beskrevet af Manoil og Beckwith, 1985, Proc. Nat11.

35 Acad. Sci. USA 82, 8129-8133. Rekombinantplasmider indføres i en stamme af E. coli indeholdende en udeladelse af det 53 DK 174965 B1 native PhoA-gen og bærende et derivat af transposon Tn5 (TnPhoA),' som indeholder et alkalisk phosphatasegen, som mangler både en promotor og en membrantransport signalsekvens, og som er indsat i den venstre terminalgentagelse af Tn5 på 5 et F-primeplasmid. Produktion af aktivt alkalisk phosphata-seenzym kræver derfor transposition af TnPhoA, således at PhoA-genet fusioneres i ramme ind i et aktivt transcriberet gen indeholdende et membrantransportsignalpeptid. Sådanne transpositioner er blevet påvist ved plettering af celler i 10 nærvær af 40 /ig/ml 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat (XP,

Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). i nærvær af dette farvestof viser kolonier, som producerer aktivt alkalisk phos-phataseenzym, sig intens blå i farve, medens kolonier, som mangler aktiv alkalisk phosphatase, viser sig hvide.

15 6.4.6. DNA-filterhvbridiseringsanalvse (Southern-olet).

DNA-filterhybridiseringsanalyse er blevet gennemført ifølge metoden ifølge Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98, 508. DNA, som skal analyseres ved filterhybridisering, dige-20 reres med en eller flere hensigtsmæssige restriktionsendo-nucleaser og adskilles ved agarosegelelektroforese i 0,8%'s agarose (SeaKem Portland, ME) ved anvendelse af en puffer af 90 mM Tris-borat, 8 mM EDTA, og 10 volt/cm. DNA i gelen · denatureres, ved at gelen gennemvædes i 1,5 M NaCl/0,5 M 25 NaOH i 1 time og neutraliseres ved gennemvædning i 1,5 M NaCl/1,0 M Tris-HCl i 1 time. Denatureret DNA overføres til nitrocellulosefilterpapir ved pletdannelse. Efter overføring af DNA vaskes filtret med 6 x SSC (fremstillet ved fortynding ud fra en 20 x SSC-stamopløsning indeholdende 175,5 g NaCl 30 og 88,2 g natriumcitrat pr. liter) og lufttørres. DNA-fragmenter fikseres til filtret ved ovntørring ved 80°C i 2 timer under vakuum.

DNA-hybridiseringssonder fremstilles ved indskæringstranslation ved metoden ifølge Rigby et al., 1977, J. Mol.

35 Biol., 113, 237-244. DNA til sonden (1-2 /zg) opløses i 100 μΐ indskæringstranslationspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 54 DK 174965 B1 mM MgS04, 10 mM DTT, 5 Mg/ral okseserumalbumin og 20 μΜ af hver af dGTP, dCTP og dTTP. Til denne reaktionsblanding sættes 100 μΟί af ar-32p-dA*rp (Amersham, 2000-3000 Ci/mmol) , 1,0 ng deoxyribonuclease I (Sigma Chemical Co., St. Louis, 5 MO) og 10 enheder DNA-polymerase I fra E. coli (Boehringer), og blandingen inkuberes ved 15°C i 45 minutter. Reaktionen standses ved tilsætning af EDTA til 50 mM og opvarmning til 65°C i 10 minutter til inaktivering af enzymerne. Den mærkede DNA udfældes ved tilsætning af tre volumener ethanol og 10 resuspenderes til 50 μΐ i 0,3 M ammoniumacetat (NH4OAc). Prøven fyldes på en 1 ml "Biogel® P-50"-spinkolonne ækvili-breret med 0,3 M NH40Ac og elueres ved centrifugering ved 500 x g i 5 minutter. Kolonnen vaskes med 100 μΐ 0,3 M NH4OAc, og eluaterne slås sammen og udfældes med tre volume-15 ner ethanol. Den mærkede DNA-pellet vakuumtørres, resuspenderes i TE-puffer, og den radioaktive inkorporering måles i en "Beckman®" (LS9000) scintillationstæller ved Cherenkov-spredning.

Til hybridisering fugtes filtre med bundet DNA med 6 20 x SSC og præhybridiseres med 6 x SSC/0,5%'s SDS/5 x Den-hardt1 s opløsning/100 μg/ml tRNA ved 68°C i 2 timer til blokering af overskydende bindingskapacitet i filtret (1 x Denhardt's opløsing er 0,02% "Ficoll®", 0,02% polyvinylpyr-rolidon, 0,02% okseserumalbumin i vand). Hybridiseringsreak-25 tionen gennemføres i samme puffer, hvortil der sættes 0,01 M EDTA og en mærket sonde med 5-10.000.000 CPM (Cherenkov). Sondeopløsningen opvarmes til 90°C i 10 minutter før påføring til denaturering af DNA-strengene, afkøles til 68°C og inkuberes med filtret ved 68eC i 18-24 timer. Efter hybridi-30 sering vaskes filtrene med adskillige udskiftninger af 0,1 x SSC/0,5%'s SDS ved 68°C til fjernelse af ikke-specifikt bundet sonde. Under de anvendte betingelser vil DNA-homolo-gier på mere end eller lig med 90% udvise positiv binding af DNA-sonden. Filtrene lufttørres og eksponeres på "Kodak® 35 XAR"-film ved -70eC under anvendelse af Dupont "CRONEX" "Lightning Plus" intensiveringsskærme.

55 DK 174965 B1 6.5. Kloning af PBOMP-geneme fra H. influenzae.

Kilden til chromosom-DNA fra H. influenzae til kloning til PBOMP-generne er enten H. influenzae KW20b (HiKW20b) , et derivat af en ikke-indkapslet Rd-stamme af Hi transforme-5 ret til type b+ ved hjælp af DNA fra stamme b-Eagan, jf.

Moxon et al., 1984, Clin. Invest. 73, 298-306, eller H.

influenzae S2, Hi-S2, en spontan, kapselmanglende mutant af Hib-Eagan.

Til skabelse af et phag-\-bibliotek opskæres chromo-10 s om-DNA fra Hi til en gennemsnitlig længde på ca. 15.000 basepar (bp), gøres stumpendede ved behandling med T4-DNA-polymerase, modificeres med EcoRI-DNA-methylase, ligateres til syntetiske EcoRI-linkere og klones ind i rekombinant-λ-phagvektoren Charon 4.

15 Til skabelse af et plasmidbibliotek spaltes chromosom- DNA fra Hi-S2 delvist med Sau3A, og de således frembragte restriktionsfragmenter med en længde på 3,8 kilobase (kb) isoleres og ligateres ind i plasmidvektoren pGD103 ved BamHI-restriktionsstedet. Dette plasmid er et derivat af pLG339 20 (se fig. 3; jf. også Stoker et al., 1982, Gene 18, 335-341) og udføres i 6-8 kopier/celle. Det indeholder også lac-Z-a-peptidet og polylinkerregionen fra plasmid pUC8, og derfor tillader det, hvis det transformeres ind i en hensigtsmæssig stamme af E. coli (såsom JM83), udvælgelse af rekombinant-25 plasmider ved screening for tab af Lac+-phenotypen. Klonet i den rigtige orientering er det også muligt, at et klonet gen, som eksprimeres dårligt i E. coli, kunne komme under kontrol af den stærke, regulerede lac-promotor. E. coli indeholdende rekombinantplasmider screenes for produktion 30 af PBOMP’er ved anvendelse af en puljeblanding af monoklonale antistoffer eller polyklonalt anti-PBOMP-l-antiserum.

6.5.1. Konstruktion af Hi-plasmidbibliotek.

Det er muligt, at PBOMP-1-proteinet ikke eksprimeres 35 på eller er uforeneligt med λ-phag. Til afprøvning af dette er der blevet konstrueret et plasmidchromosombibliotek af 56 DK 174965 B1

Hi-S2. Kloning af OMP-gener fra E. coli på plasmider med højt kopiantal har vist sig at være toksisk, jf. f.eks.

Beck et al., 1980, Nucleic Acid Res. 8, 3011-3024. For at undgå dette problem er der blevet anvendt plasmidet pGD103 5 med lavt kopiantal (se fig. 3).

Chromosom-DNA fra Hi-S2 digereres delvis med restrik-tionsendonucleasen Sau3A (BRL, Bethesda, MD) . 500 μg DNA

digereres i 5 ml restriktionspuffer med 50 enheder Sau3A i 1 time ved 37°C. Fragmenter adskilles ved hastighedssedimen-10 tering i en "Beckman® SW28"-rotor på 10-40%'s saccharosegra-

dienter indeholdende 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 1 M

NaCl, ved 140.0 00 x g i 24 timer. Der opsamles fraktioner på 2 mm, og portioner analyseres ved agarosegelelektroforese. Fraktioner indeholdende restriktionsfragmenter med en længde 15 på 3-8 kb slås i pulje og koncentreres i TE-puffer. DNA fra plasmid pGD103 digereres med BamHI-endonuclease og behandles med alkalisk kalvephosphatase (Boehringer, Indianapolis, IN) (1 enhed/^g DNA, 37°C, 30 minutter i restriktionspuffer).

DNA renses fra reaktionsblandingen ved phenolekst rakt ion og 20 ethanoludfældning og resuspenderes i TE-puffer. Da restriktionsenzymerne BamHI og Sau3A danner cohæsive ender, er ingen yderligere behandling af DNA før ligatering nødvendig.

Ca. 25 μg af hver af Sau3A-digereret DNA fra Hi-S2 og pGD103/BamHI/CAP-digereret DNA blandes i 500 ml ligate-25 ringspuffer indeholdende 25 enheder T4-ligase (Boehringer, Indianapolis, IN) og inkuberes ved 15°C i 18 timer. En portion på 20 μΐ af reaktionsblandingen analyseres ved agarosegelelektroforese til verifikation af ligateringsreaktionen (udgangsmateriale køres i en tilstødende kolonne). Derefter 30 transformeres ligateringsblandingen ind i kompetent E. coli JM83, jf. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, side 250, inkuberes i 1 time i LB-næringssuppe ved 37°C og pletteres på LB-agarplader indeholdende 50 μg/ml kanamycin-sulfat (Sigma Chemical Co., 35 St. Louis, MO) og 40 μg/ml 5-brom-4-chlor-3-endolyl-S-D-galactopyranosid ("X-gal", BRL, Bethesda, MD) og inkuberes 57 DK 174965 B1 i 24 timer ved 37°C. Ca. 50% af de kanamycinresistente (kanR) kolonier, som udvikles, er hvide (Lac-), hvilket angiver indsættelse af S2-DNA i BamHI-stedet i lac-regionen i pGD103 (Lac+, ikke-rekombinanter, er blå). 10 hvide kolonier udvæl-5 ges tilfældigt, forstærkes og vises at indeholde plasmider, som er 4-8 kb større end pGD103, og som har indsættelser ved vektor-BamHI-stedet.

1525 hvide kolonier udvælges, forstærkes individuelt og opbevares frosset ved -70°C i LB-nærings suppe indeholdende 10 80% sterilt glycerol i mikrotiterskåle med 96 huller.

6.5.2. Konstruktion af Hib-λ-genbank.

Chromosom-DNA med høj molekylvægt fra Hi KW20b suspenderes i TE-puffer i en koncentration på 200 μg/ml og 15 opskæres til en gennemsnitlig længde på 15.000 bp ved passage gennem en nål nr. 25. Udragende ender fjernes ved behandling med T4-DNA-polymerase i 50 mM Tris, (pH 8,8), 10 mM MgCl2, 20 mM (NH4)2S04, 10 mM DTT, 50 μΜ dATP, dCTP. dGTP og dTTP ved 37°C i 20 minutter. Derefter modificeres DNA med EcoRI-20 DNA-methylase (1 enhed/Vg DNA) (BRL, Bethesda, MD) i 100 mM Tris (pH 8,0), 10 mM EDTA, 0,1 mM S-adenosylmethionin, i 3 timer ved 37°C. Methylering af DNA verificeres, ved at 1 μg DNA udtages fra reaktionen, blandes med 1 μg umodificeret λ-DNA og digereres i 20 μΐ restriktionspuffer med højt salt-25 indhold med 5 enheder EcoRI i 1 time ved 37°C. Under disse betingelser digereres den modificerede Hi-DNA ikke, medens den tilsatte λ-DNA digereres til fuldstændighed.

20 μg modificeret Hi-DNA ligateres til 1 μg kemisk syntetiserede EcoRI-linkere (BRL, Bethesda, MD) i 100 μΐ 30 reaktionsblanding indeholdende 5 enheder T4-DNA-ligase.

Efter 18 timer standses reaktionen ved opvarmning til 60°C i 20 minutter, NaCl tilsættes til en slutkoncentration på 150 mM, og blandingen digereres med 10 enheder EcoRI i 6 timer. Modificeret Hi-DNA plus linker adskilles fra spal-35 tede og ikke-ligaterede linkere ved agarosegelelektroforese som ovenfor beskrevet.

58 DK 174965 B1

Præpareret Hi-DNA blandes med venstre og højre EcoRl-fragment i λ-Charon 4-DNA i et molforhold på 1:1:1 og liga-teres med T4-DNA-polymerase i 18 timer. Den ligaterede DNA-blanding indpakkes i λ-phagpartikler ved anvendelse af en 5 indpakningsreaktion in vitro. 5 μg ligateret DNA i 4 μΐ H2O sættes til 7 μΐ 20 mM Tris {pH 8), 10 mM 2-mercaptoethanol (2-ME) , 3 mM MgCl2, 1 μΐ 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM spermidin, 2 mM putrescin, 10 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 5 mM 2ME og 5 μΐ sonisk ekstrakt fra E. coli BHB2690-lysat (-1 imm 434, clts, 10 b2.red3, Earn 15, Sam7), jf. Hohn et al., 1977, Proc. Nat'l.

Acad. Sci. 74, 3259. Reaktionsblandingen inkuberes ved 22°C i 1 time, og indpakkede phager fraskilles ved centrifugering i en tringradient af fra 3 M til 5 M CsCl [i 10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 0,02% gelatine (TMG-puffer)] ved 250.000 15 x g i 4 timer i en rotor "Beckman® SW50.1” . Phag fjernes fra skillefladen og dialyseres imod TMG. Titrering af den således fremstillede phag angiver, at der er blevet frembragt et bibliotek på fra 25.000 til 30.000 uafhængige kloner af Hi-genomet. Phagbiblioteket forstærkes ved pladeforstærkning 20 ved anvendelse af E. coli KH802 som en phagvært til opnåelse af 5 ml phagsuspension indeholdende 109 plaquedannende enheder (PFU)/ml.

6.6. Isolering af PBOMP-qener.

25 6.6.1. Isolering af et PBOMP-aen. som koder et protein, som reagerer med monoklonale antistoffer imod PBOMP-1. Hi-plasmidbiblioteket overføres til nitrocelluloseark på agar med 50 μg/ml LB-kanamycin, dyrkes i 24 timer ved 30 37°C og analyseres ved kolonipletmetoden ved anvendelse af en blanding af fem ikke-konkurrerende, monoklonale antistoffer imod PBOMP-l som sonde. En klon, som reagerer på den blandede, monoklonale sonde, isoleres, og plasmidet betegnes pAA152. Fig. 4 viser et restriktionskort over pAA152, som i 35 vektor pGD103 indeholder en Hi-DNA-indsætning på 4,2 kb. Western-pletanalyse har verificeret, at klon pAA152 ekspri- 59 DK 174965 B1 merer et protein på 16.000 dalton, som erkendes af poly-klonalt anti-PBOMP-1 og ligeledes af monoklonale antistofsonder i pulje. Det er derefter blevet vist, at klon pAA152 producerer et protein, som erkendes af hvert enkelt-, in-5 dividuelt, monoklonalt antistof, som er anvendt i den indledende pulje (fig. 5).

Det har vist sig, at Sau3A-indsætningen i pAA152 har regenereret BamHI-stedet i polylinkerregionen ved den ene ende af indsætningen. Udeladelser fra dette BamHI-sted 10 til enten det eneste Bglll-sted eller det eneste Xbal-sted i Hi-DNA har resulteret i tab af ekspression af det PBOMP, som er påvist i Western-pletter. Udeladelser fra HincII-stedet i polylinkeren til enten Xbal- eller Bglll-stedet i Hi-indsætning-DNA har bevaret PBOMP-ekspression (fig. 4) .

15 Ud fra disse resultater er der draget den konklusion, at det gen, som koder dette PBOMP, ligger i Bglll-BamHI-frag-mentet på 737 basepar inden i Hi-DNA-indsætningen i pAA152. Analyse af miniceller, jf. Achtman et al., 1979, Proc. Nat'l.

Acad. Sci. USA 76, 4837-4841, som bærer pAA152, har vist, 20 at den klonede Hi-DNA koder to proteiner med en molekylvægt på henholdsvis 16.000 og 40.000 dalton (fig. 6). Westernpletter af JM83 (pAA152) viser, at monoklonale antistoffer i pulje frembragt imod PBOMP-1 reagerer med et protein på 16.000 dalton. Der ses ingen krydsreaktion i regionen med 25 en molekylvægt på 40.000 dalton.

6.6.2. Isolering af et PBOMP-qen. som koder et protein, som reagerer med polvklonale anti-PBOMP-1-antisera.

Det forstærkede phagbibliotek, som er fremstillet 30 som beskrevet i afsnit 6.5.1., fortyndes til 1-2000 PFU i 1 ml TMG, og 50 μΐ E. coli KH802 (5 x 10^ celler/ml) tilsæt tes. Blandingen inkuberes ved 37°C i 20 minutter og anbringes med 3 ml blød agar på agarplader indeholdende NZYCM-medium: 10 g NZ amin A, 5,0 g NaCl, 2,0 g MgS04.7H20, 5 g gæreks-35 trakt, 1 g casaminosyrer (pr. liter). Pladerne inkuberes natten over, afkøles til 4°C i 30-60 minutter, og plaques 60 DK 174965 B1 overføres til nitrocellulose. Filtrene sonderes med poly-klonalt anti-PBOMP-i som ovenfor beskrevet i afsnit 6.4.4. Adskillige positive plagues påvises på denne måde. Der påvises imidlertid ingen positive plaques, når monoklonale 5 PBOMP-1-antistoffer anvendes som sonde. Positive plaques udplukkes fra pladen og forstærkes ved vækst i E. coli KH802. Kloner verificeres ved SDS-PAGE-gel/Western-pletanalyse af phaglysater. Alle positive kloner eksprimerer et protein med en tilsyneladende molekylvægt på 16.000 dalton, som 10 reagerer med et polyklonalt antistof imod PBOMP-1. Dette protein er ikke til stede i kontrollysater af Charon 4-phag.

Ved tilsvarende forsøg har lysater fra de positive kloner ikke kunnet reagere med monoklonale antistoffer imod PBOMP-1.

15 Én positiv phag, betegnet λ-16-3, er blevet udvalgt til yderligere analyse. Dette phagisolat er blevet forstærket ved vækst i E. coli KH802 i NZYCM-nærings suppe, udvundet ved udfældning med 20% polyethylenglycol 6000 og opdelt i bånd i caesiumchloridligevægtsgradienter (4 M CsCl i TMG, 20 rotor "Beckman® SW50.1", 300.000 x g i 24 timer). Phag-DNA isoleres ved behandling med 0,1% SDS og 20 Mg/ml proteinase K (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ved 55°C i 1 time efterfulgt af ekstraktion med phenol og ethanoludfældning.

X-16-3-DNA digereres med EcoRI, og et delvist fysisk 25 kort over Hi-chromosomindsætningen opnås. EcoRI-fragmenter af indsætningen isoleres og underklones ind i plasmidvektoren pGD103. Kloner, som bærer fragmenter, som eksprimerer det PBOMP-1-krydsreakt i ve protein på 16.000 dalton, identificeres ved Western-pletoverføringsanalyser af cellelysater. Ét af 30 disse betegnes pAA130. Fig. 7 viser et restriktionskort over dette plasmid med et fragment på 5,7 kb fra Hi-DNA klonet ind i pGD103-plasmid.

Monoklonale antistoffer imod PBOMP-1 reagerer ikke med det protein på 16.000 dalton som eksprimeres ud fra 35 pAA130 (data ikke vist). Det protein, som eksprimeres af dette rekombinantplasmid, erkendes imidlertid af polyklonale 61 DK 174965 B1 anti-PBOMP-1-antisera (se f.eks. fig. 8).

Analyse af miniceller, jf. Achtman et al., supra, som bærer pAA130, viser, at den klonede Hib-DNA koder for proteiner med tilsyneladende molekylvægte på 16.000 og 17.000 5 dalton. Det mærkede protein på 16.000 dalton immunoudfældes specifikt ved hjælp af polyklonalt anti-PBOMP-1 (data ikke vist) . Plasmid pAA130 dirigerer således for ekspressionen af et PBOMP med en molekylvægt på 16.000 dalton.

En intern udeladelse frembragt ved udskæring af DNA 10 indsat mellem det eneste Pstl-sted i indsætningen og den enkelte PstI i polylinkeren påvirker ikke ekspressionen af det krydsreagerende protein. Xbal-fragmentet af dette plasmid udelades ved en tilsvarende metode, og ekspression af det PBOMP-krydsreagerende protein bibeholdes (fig. 7). Et yder-15 ligere udeladelsesderivat af dette plasmid frembringes ved religatering af de to interne Bglll-steder, og dette derivat bibeholder ligeledes ekspression af det PBOMP-krydsreaktive protein.

BstII-Xmnl-fragmentet på 781 basepar klones, ved at 20 fragmentet isoleres fra en agarosegel med lavt smeltepunkt, BstEII-enden udfyldes med Klenow-fragment af DNA-polymerase I, og fragmentet klones ind i HincII-stedet i pGD103. We-stern-pletanalyse ved anvendelse af polyklonalt anti^PBOMP-1 har vist, at dette plasmid bibeholder ekspression af PBOMP 25 på 16.000 dalton. Som med pAA130 har PBOMP produceret ud fra dette plasmid ikke kunnet reagere, med monoklonale antistoffer imod PBOMP-1.

Som en uafhængig metode til verifikation af placeringen af dette PBOMP-gen er det store EcoRI-PvuII-fragment af 30 pAA130 blevet ligateret med EcoRI-PvuII-fragmentet af pLG339 til skabelse af et nyt, tetracyclinresistent plasmid, som betegnes pAA136. Dette plasmid eksprimerer PBOMP som verificeret ved Western-pletter. Dette plasmid transformeres ind i en stamme af E. coli med udeladelse af det alkaliske phos-35 phatasechromosomgen (PhoA) og bærende det transposible element TnPhoA. Tre uafhængige transpositioner af TnPhoA-ele- 62 DK 174965 B1 mentet ind i pAA136, som har genoprettet den alkaliske phos-phataseaktivitet, er blevet isoleret. Stederne for TnPhoA-indsættelserne i pAA136 er blevet bestemt ved anvendelse af det særegne Dral-restriktionssted nær ved den venstre ter-5 minalregion i TnPhoA og Hindlll-, BstEII-, Xmnl- og Pstl-stederne i pAA136. Det er blevet bestemt, at alle tre indsætninger falder inden i BstEII-Xmnl-fragmentet i pAA136.

Alle tre TnPho-indsættelser er i samme orientering, hvilket viser, at transcription af PBOMP-genet dirigeres fra BstEII-10 stedet hen imod XmnI-stedet i pAA136. Alle tre TnPhoA-trans-positioner har resulteret i tab af det protein på 16.000 dalton, som er påvist ved hjælp af polyklonalt anti-PBOMP-1-antiserum som påvist ved Western-pletter. Én fusion har frembragt et nyt bånd på Western-pletter ved 60.000 dalton, 15 som er blevet påvist ved hjælp af polyklonalt anti-PBOMP-1-antiserum. Denne størrelse ligger i det forudsagte område for fusionsproteiner, som eventuelt kunne frembringes ved fusion af alkalisk phosphatase (molekylvægt 45.000 dalton) til et protein med en molekylvægt på 16.000 dalton. Genop-20 rettelse af PhoA-aktivitet i disse transpositioner verificerer, at PBOMP-proteinet indeholder et peptidsignal for membrantransport, og derfor er det sandsynligvis et membranprotein .

TnPho-fusionerne er blevet sekvensere.t ved underklo-25 ning af forbindelsen mellem TnPhoA-sekvenserne og de klonede Hi-DNA-sekvenser ind i M13. I alle tilfælde er det blevet bestemt, at de PhoA-kodende sekvenser er i ramme med den forudsagte åbne læseramme for PBOMP-2-genet i pAA130 (se nedenstående afsnit 6.7.2.).

30 35 63 DK 174965 B1 6.7. Bestemmelse af nucleotidsekvensen i PBOMP-gener.

6.7.1. Sekvenserinosstrateoi for det PBOMP-qen, som ekspri-meres af PAA152.

5 Nucleotidsekvensen i det PBOMP-gen, som eksprimeres af pAA152, er blevet opnået ved dideoxynucleotidsekvensering, jf. Sanger et al., 1977, Proc. Nat'l, Acad. Sci. USA 74, 54 63, af BgllI-BamHI-fragmentet på 737 bp i pAA152 efter underkloning ind i enkeltstrengede phager af familien M13, 10 dvs. M13-mpl8 og mpl9.

Placeringen og retningen af sekvenser bestemt ud fra disse underkloner er vist i fig. 9. Den komplette nucleotid-sekvens af Bglll-BamHI-fragmentet er vist i fig. 10.

BgllI-BamHI-fragmentet på 737 bp i pAA152 indeholder 15 en enkelt, åben læseramme (ORF), som koder for et polypeptid på 153 aminosyrer (fig. 11) . Aminosyresammensætningen af PBOMP-genet bestemt ud fra DNA-sekvensen passer snævert til aminosyresammensætningen af det rensede PBOMP-1-protein (se tabel I og II).

Tabel II

64 DK 174965 B1

Afledte aminosvresammensaetninqer af modent PBOMP-1 οα PBOMP-2 5

Modent PBOMP-1 Modent PBOMP-2 Aminosyrerester i pAA152a i pAA130^ 10 Asparaginsyre 9 6

Asparagin 8 4

Threonin 7 5

Serin 6 13

Glutaminsyre 7 5 15 Glutamin 5 7

Prolin 3 1

Glycin 16 24

Alanin 21 16

Cystein 1 1 20 Valin 10 18

Methionin 0 1

Isoleucin 3 13

Leucin 9 5

Tyrosin 11 2 25 Phenylalanin 3 2

Lysin 7 7

Histidin 2 0

Arginin 6 6

Tryptophan 0 0 3 0 _ a Den tilsyneladende molekylvægt af moden PBOMP-1 er 14.238 dalton. Antallet af aminosyrerester er 134.

35 b Den tilsyneladende molekylvægt af moden PBOMP-2 er 13.461 dalton. Antallet af aminosyrerester er 136.

65 DK 174965 B1

Desuden har PBOMP-l-genet en intern peptidsekvens (aminosyrerne 48-81), hvori 30 ud af 33 aminosyrer er på linie med aminosyresekvensen i det interne T9-peptid i PBOMP-1, hvis der ses bort fra Leu-68-resten, som mangler i 5 sekvensen i T9-peptidet (fig. 12). Den aminoterminale region i PBOMP-1 indeholder også en aminosyresekvens, som udviser ligheder med andre membrantransportpeptidsekvenser, jf. Watson, 1984, Nucleic Acids Res. 12, 5145-5164. Ud fra disse data og ud fra bindingsdata for monoklonalt antistof er der 10 draget den slutning, at dette gen koder PBOMP-1-proteinet.

6.7.2. Sekvenserinqsstrateai for PBOMP-aenet i PAA130.

Nucleotidsekvensen i PBOMP-genet i pAA130 er blevet bestemt ved dideoxynucleotidsekvensering, jf. Sanger et 15 al., supra, af BstEII-Smnl-fragmentet på 789 basepar i pAA130 efter underkloning ind i M13-mpl8- og mpl9-phag. Disse re-kombinantphager betegnes henholdsvis M18001 og M19001. Uni-versaloligonucleotidsekvenseringsprimeren på 17 baser (New England Biolabs) er blevet anvendt til bestemmelse af sekven-20 sen fra begge ender af BstEII-Smnl-fragmentet (se fig. 13).

To yderligere oligonucleotider er blevet syntetiseret og anvendt som primere for dideoxynucleotidsekvenseringen (M18PRI, M19PR2). Alle andre sekvenseringsprimere er blevet fremstillet hos Praxis Biologies, Rochester, N.Y., på en 25 DNA-syntetisator Applied Biosystems 380 B. Primerne er blevet fremstillet med β-cyanoethylphosphatbeskyttelsesgruppekemi på en 1 μιηοΐ kontrolleret poreglaskolonne. Udbyttet af oligo-nucleotid er tilstrækkeligt rent til at tillade anvendelsen af primerne direkte fra kolonnen uden yderligere rensning.

30 De to syntetiske oligonucleotidprimere binder til sekvenser ca. 200 nucleotider inde fra hver ende af fragmentet som vist i fig. 13. Den totale DNA-sekvens på 789 bp af BstEI-Xmnl-fragmentet i pAA130 er vist i fig. 14. ORF er understreget som vist i fig. 15. ORF koder således et polypeptid 35 på 154 aminosyrer. Det aminoterminale peptid på 18 rester ligner en membrantransportsignalsekvens, som er bestemt for 66 DK 174965 B1 andre proteiner, jf. Watson, 1984, supra. Desuden har sekvensdata fra TnPhoA-fusionerne i pAA130 vist, at alle tre transpositioner er i læserammen af polypeptidet på 154 aminosyrer .

5 Aminosyresammensætningen af det foreslåede, modne genprodukt som afledt fra DNA-sekvensen af ORF i pAA130 afviger signifikant fra den, som er bestemt ved aminosyre-analyse af renset PBOMP-1 (tabel I og II). Der findes ingen signifikant homologi, når aminosyresekvensen i PBOMP-genet 10 i pAA130 sammenlignes med den i det tryptiske peptid T9 ud fra renset PBOMP-1-protein. Endvidere erkendes det produkt, som kodes af dette gen, selv om det erkendes af polyklonale anti-PBOMP-l-antisera, ikke af monoklonale antistoffer imod PBOMP-1. Ud fra disse iagttagelser er det klart, at det Hi-15 gen, som eksprimeres af pAA130, ikke er genet for PBOMP-1. Derfor er det PBOMP-gen, som kodes af pAA130, blevet betegnet PBOMP-2.

6.8. Karakterisering af PBOMP'er eksprimeret af rekom-20 binant-E- coli som lipooroteiner.

Som vist i afsnit 6.1.2. har PBOMP-1 isoleret for H. influenzae covalent tilknyttet fedtsyrer, herunder laurinsyre, palmitinsyre og et derivat af palmitinsyre, og det kan derfor klassificeres som et bakterielipoprotein. De 25 efterfølgende forsøg er blevet gennemført for at undersøge, om PBOMP’er eksprimeret af rekombinant-E. coli også eksisterer som lipoproteiner. To forskellige metoder in vivo er blevet anvendt til verifikation af lipoproteinnaturen af de eksprimerede PBOMP'er.

30 I en forsøgsrække er celler indeholdende rekombinant- plasmider, som eksprimerer PBOMP'er, blevet dyrket i nærværelse af en radioaktivt mærket fedtsyre. Under sådanne betingelser vil eventuelt dannet lipoprotein indeholdende den covalent tilknyttede fedtsyre være specifikt radiomærket.

35 Celler af E. coli JM83 indeholdende enten plasmid pAA152, som eksprimerer PBOMP-1, eller plasmid pAA130, som 67 DK 174965 B1 eksprimerer PBOMP-2, er blevet dyrket i 2 timer i M9-minimalt medium indeholdende 50. ^Ci/ml 14C-palmitinsyre. Helcellely-sater (10.000 trichloreddikesyreudfældelige cpm/kolonne) er blevet elektroforeseret på 15%'s SDS-PAGE-geler ved en kon-5 stant strøm på 35 mA. Gelerne imprægneres med natriumsalicy-lat (5 x gelvolumen x 1 M opløsning i 20 minutter), tørres og eksponeres ved -70°C på "XAR-5n-film (Eastman Kodak Company, Rochester, N.Y.). Helcellelysater af normale celler af E. coli JM83 dyrket på samme måde køres som kontroller. De 10 opnåede resultater er illustreret i fig. 17.

Som vist i fig. 17 iagttages der i lysater af E. coli indeholdende pAA152 og pAA130 et radiomærket protein på ca. 15.000 dalton, som ikke iagttages i lysater af kontrolceller af E. coli. PBOMP-1 og PBOMP-2, som eksprimeres 15 af rekombinant-E. coli, er således specifikt radiomaerket.

I en anden forsøgsrække er celler indeholdende rekom-binantplasmider, som eksprimerer PBOMP'er, blevet dyrkes i nærvær af globomycin, et antibiotikum, som er kendt for specifikt at blokere behandling af alle kendte bakterielipo-20 proteiner ved inhibering af lipoproteinsignalpeptidasen, jf. Inukai et al., 1978, J. Antibiotics (Tokyo) 31, 1203-1205.

Celler af E. coli JM83 indeholdende enten pAA152 eller pAA130 er blevet dyrket i nærvær af 25 μg/ml globomycin 25 (opnået fra Dr. M. Inouye, Robert Woods Johnson Medical Dental School, Piscataway, N.J.) i 1 time. Tilsvarende kulturer, som ikke er behandlet med globomycin, har tjent som kontroller. Helcellelysater elektroforeseres på 15%'s SDS-PAGE-geler, overføres til nitrocellulose og sonderes med 30 polyklonale anti-PBOMP-l-antisera. De opnåede resultater er vist i fig. 18.

Som vist i fig. 18 iagttages der i lysater af globo-mycinbehandlede celler, som eksprimerer enten PBOMP-1 eller PBOMP-2, et bånd på ca. 16.500 dalton, som ikke påvises i 35 lysater af kontrolceller eller ubehandlede celler.

Baseret på resultater i begge forsøgsrækker in vivo 68 DK 174965 B1 er de PBOMP-1- og PBOMP-2-proteiner, som eksprimeres af rekombinant-E. coli indeholdende PBOMP-gener, lipoproteiner.

7. Effektivitet af PBOMP-1- og PBOMP-2-underenhedsvacciner.

5 7.1. Baktericid aktivitet af anti-sera fremkaldt af PBOMP-1 oa PBOMP-2.

Polyklonale anti-PBOMP-1-kanin-antisera, fremstillet som beskrevet i afsnit 6.2., er blevet undersøgt for deres 10 evne til udryddelse af Hib og Hi ved et komplementmedieret, baktericidt afprøvningssystem in vitro, jr. Musher et al., 1983, Infect. Immun. 39, 297-304; Anderson, et al., 1972, J. Clin. Inv. 51, 31-38. Kilder til komplement, som er anvendt til afprøvningssystemet, er enten præcolostral kal-15 veserum (PCCS) eller normalt kaninserum (NRS), som i forvejen er blevet absorberet med en ikke-typebestemmelig Hi-stamme, S2, til fjernelse af eventuelt i forvejen eksisterende anti-Haemophilus-antistoffer. PCCS anvendes ufortyndet, og NRS anvendes i et fortynding på 1:4 for Hib og 1:8 for ikke-20 typebestemmeligt Hi. Alle fortyndinger fremstilles ved anvendelse af phosphatpufret saltopløsning [20 mM phosphatpuf-fer (pH 7,4), 0,15 M NaCl indeholdende 0,15 mM MgCl2 og 0,5 mM CaCl2 (PCM)]. Bakteriestammer, som skal afprøves, dyrkes i BHI-XV, indtil de når en koncentration på 1 x 109 25 celler/ml som målt ved den optiske tæthed ved 490 nm. Bakterier fortyndes til en slutkoncentration på 1250 celler/-20 /il i PCM. 20 μΐ af en hensigtsmæssig antistof fortynding i PCM blandes med 20 μΐ komplementkilde på is i huller i en mikrotiterplade med 24 huller (Costar). Mikrotiterpladen 30 fjernes fra is, og 20 μΐ forsøgsfortyndede bakterier sættes til hvert enkelt hul. Huller uden noget indhold af antistof har tjent som negative kontroller. Efter 30 minutters in-kubering ved 37°C sættes der til hvert hul 800 μΐ BHI-XV, indeholdende 0,75% agar ved 56°C, og det får lov at størkne 35 ved stuetemperatur. Pladerne inkuberes natten over ved 37°C og aflæses næste dag.

69 DK 174965 B1 BC-titeren af et antiserum aflæses som den reciprokke værdi af den højeste fortynding, som er i stand til udryddelse af 50% af forsøgsbakterierne sammenlignet med kontrol-huller uden antistof.

5 Anti-PBOMP-Γ er blevet afprøvet for baktericid (BC) aktivitet imod flere kliniske og laboratorieisolater af Hib, og resultaterne er vist i tabel III.

Tabel III

10 BC-Aktivitet af anti-PBOMP-1-antisera imod laboratorie- & kliniske stammer af Haemophilus influenzae.

Laboratoriestammer Udryddet af anti-PBOMP-1 15 H. influenzae, type a, HST-l +a/ H. influenzae, type c, HST-5 +/-k/ H. influenzae, type b, HST-3 + H. influenzae, type b, HST-10 + H. influenzae, type b, HST-12 + 20 I.T. H. influenzae, S-2 + I. T., Kliniske stammer I.T. H. influenzae, HST-31 + I.T. H. influenzae, HST-35 + 25

Kliniske Hib-stammer 112 stammer afprøvet 112 stammer udryddet a + = mere end 50%'s udryddelse af forsøgsbakterier.

30 b +/- = ca. 50% af forsøgsbakterierne overlever.

Som det kan ses af tabel III, har anti-PBOMP-l-anti-stof haft BC-aktivitet imod en bred mangfoldighed af kliniske isolater, både typebestemmelige (f.eks. a, b, c) og ikke-35 typebestemmelige stammer af H. influenzae. 112 ud af 112 kliniske Hib-isolater er blevet udryddet af anti-PBOMP-1- 70 DK 174965 B1 antisera. Disse stammer er blevet isoleret i det sydvestlige USA, det nordøstlige USA og det vestlige Canada.

Til eliminering af den mulighed, at udryddelsen er resultatet af anti-LPS-antistof, er BC-afprøvningen blevet 5 gennemført med 200 ng LPS fra den Hib-stamme, som er anvendt til fremstilling af immunogenet i hvert enkelt hul. Resultater af disse forsøg er vist i tabel IV.

Tabel IV

10

Baktericid aktivitet af antisera absorberet med LPS

Antiserum LPSa Forsøgsbakterie Titer*5 PBOMP-1 + I.T. H. influenzae 40 15 - I.T. H. influenzae 160 + Hib Eagan 40

Hib Eagan 40 20 PRP-CRM + I.T. H. influenzae 10 I.T. H. influenzae 10 + Hib Eagan 400

Hib Eagan 800 25 a NUL eller 200 ng LPS fra Hib Eagan anvendt pr. hul.

b Udtrykt som den reciprokke værdi af den højeste fortynding 30 af antisera, som viser 50% bakterieoverlevelse.

LPS sænker titeren af anti-PRP to gange, titeren af 35 anti-PBOMP-1 imod Hi fire gange og sænker slet ikke titeren af anti-PBOMP-1 imod Hib. Selv om LPS sænker BC-aktiviteten af anti-PBOMP-1, eliminerer det den ikke. Noget af den iagttagne sænkning er utvivlsomt resultatet af anti-komplementær aktivitet af LPS, som vist ved reduktionen af anti-PRP-BC-40 titeren.

Anti-PBOMP-2-antistof fremstillet som beskrevet i afsnit 6.2. er blevet afprøvet for baktericid (BC) aktivitet imod S2-stammen Haemophilus influenzae, og resultaterne er 71 DK 174965 B1 vist i tabel V. Sera er indsamlet før inokulering og 7 og 10 uger efter indledende immunisering. Som vist nedenfor viser BC-aktiviteten af anti-PBOMP-2-antisera en signifikant stigning 7 uger efter inokulering. Der iagttages ingen yder-5 ligere stigning 10 uger efter inokulering.

Tabel V

BC-Aktivitet af anti-PBOMP-2-antisera 10 imod S2-stammen af Haemophilus influenzae

Serum fra uae Baktericid titer Gange stigning i titer 0 1/20 7 1/160 8x 15 10 1/160 8x 7.2. Beskyttelse af spæde rotter imod H. influenzae.

Beskyttelsesstudier på spæde rotter er blevet gennemført ifølge Smith et al., 1973, Infect. Immun. 8, 278-20 290. Spæde Sprague-Dawley-rotter er blevet passivt immuni seret med 0,1 ml af forskellige fortyndinger af kaninantisera i PCM ved intraperitoneal inokulering på den fjerde levedag.

Atten timer efter immunisering inficeres rotterne intraperi-tonealt med 104-106 Hib-celler i 0,1 ml PCM. Overlevelse af 25 inficerede rotter 72 timer efter infektion har vist beskyttelse. Resultaterne af disse forsøg er vist i tabel VI.

72 DK 174965 B1

Tabel VI

Beskyttelse af spæde rotter med anti-PBOMP-1 5 Hib-stamme Antiserum til infek- passivt Antiserum- Infektions- tion overført fortynding dosis Overlevende/totalt HST-60 NRS 1/10 106 0/6 10 PBOMP-1 1/10 106 5/5 PBOMP-1 1/30 106 6/6 PBOMP-1 1/90 106 6/6 HST-61 NRS 1/10 105 0/5 PBOMP-1 1/10 105 6/6 15 PBOMP-1 1/30 105 6/6 PBOMP-1 1/90 105 3/5

Eagan NRS 1/10 104 0/4 PBOMP-1 1/10 104 3/5 PBOMP-1 1/30 104 5/5 20 PBOMP-1 1/90 104 0/5 73 DK 174965 B1

Resultaterne i tabel VI viser, at spæde rotter er beskyttet imod infektion med en fatal dosis af Hib ved passiv overføring af anti-PBOMP-l-antistof. De yderligere, kliniske Hib-stammer, som er blevet anvendt som infektionsstammer 5 ved meningitismodellen med spæde rotter, er anvendt til påvisning af, at anti-PBOMP-1 beskytter imod heterologe, kliniske Hib-isolater.

Til bestemmelse af, om anti-PBOMP-1 blokerer beskyttelsesvirkningerne af anti-PRP eller har additive virkninger, 10 er spæde rotter blevet passivt immuniseret med anti-PRP og anti-PBOMP-1 fortyndet ud over deres beskyttende slutpunkter.

Ved en infektion med Hib har antisera sammen været i stand til at beskytte ved højere fortyndinger end ovenfor (tabel VII) . De i tabel VII viste resultater viser, at anti-PBOMP-1-15 antistof og anti-PRP-antistof ikke griber ind i hverandre og er i stand til at give additiv beskyttelse ved meningitismodellen med spæde rotter.

Tabel VII

'20 Anti-PBOMP-1- + anti-PRP-studier (spæde rotter), sera injiceret 2 5 Anti-PBOMP-1 (l:100)a Ant i - PRP*3 Overlevende/totalt0 0/6 + - 1/6 1:2000 2/6 + 1:1000 6/6 30 + 1:3000 5/6 + 1:4000 4/6 a Polyklonalt kanin-anti-PBOMP-1 fortyndet i PCM. b Polyklonalt kanin-anti-PRP:CRM^97-konjugat.

35 c Spæde Sprague-Dawley-rotter, som overlever 72 timer efter infektion.

74 DK 174965 B1 7.3. Immuqenicitet af PBOMP-1 hos voksne mennesker.

6 frivillige, voksne mennesker får to vaccinationer med vaccineformuleringer omfattende PBOMP-1 isoleret fra H. influenzae som beskrevet i afsnit 6.1. {5,2 ^g PBOMP-1 uden 5 alun) med mellemrum på 1 måned, bortset fra et individ, som kun får en enkelt vaccination. Blodprøver udtages umiddelbart før den indledende vaccination og derefter med mellemrum på 1 måned. Den specifikke antistofreaktion hos vaccinerede voksne vurderes ved måling af antistoftitere imod PBOMP fra 10 H. influenzae (ELISA), imod diphtheriatoxoid (ELISA), jf. Engvall et al., 1972, J. Immunol. 109, 129-135, med en almen beskrivelse af ELISA-afprøvninger, og imod Hib-PRP-polysac-charid (Farr-type RIA), jf. Farr, 1958, J. Infect. Dis.

103, 239-262, med beskrivelse af RIA af Farr-typen. De re-15 sultater, som er opnået ved PBOMP-1-ELISA, er vist i fig. 19.

Som vist i fig. 19 har tre af de seks individer vist en signifikant stigning i antistoftiter imod PBOMP-1. Denne stigning i antistoftiter er yderst specifik for det som immunogen anvendte PBOMP-1, eftersom der ikke er iagttaget 20 nogen signifikant ændring i titeren af antistof, som er specifikt for enten diphtheriatoxoid eller Hib-PRP (resultater ikke vist).

7.4. Baktericid aktivitet af antisera frembragt ved hiælo 25 af signalfrit PBOMP-1.

Et signalfrit rekombinant-PBOMP-1 (her betegnet rPBOMP -1) opnået ud fra celler fra E. coli PR13 indeholdende plasmid pPXl67 som beskrevet nedenfor i afsnit 8.1. er blevet anvendt som immunogen til immunisering af hvide New Zealand 30 kaniner. rPBOMP-1 emulgeres enten i Freund's ukomplette adjuvans (IFA) eller bindes til aluminiumhydroxid. rPBPMP-1 bindes til alun, ved at rPBOMP-1 i en koncentration på 500 //g/ml i 0,85%'s saltopløsning blandes med alun ved en koncentration på 500 /ig/ml i et mængdeforhold på 1:1. Blan-35 dingen omrystes ved 37°C i 3 timer, og alun pelletiseres ved centrifugering. Ovenstående væske afprøves ved BCA-pro- 75 DK 174965 B1 teinafprøvningen (Pierce Chem. Co., Chicago, IL) for ubundet protein. Der påvises intet. Alun resuspenderes i fysiologisk saltopløsning med 500 /ig/ml. rPBOMP-1 emulgeres i IFA (Difco) i et mængdeforhold på 1:1. Dyrene immuniseres intramuskulært 5 med 50 μg af begge præparater med mellemrum på 4 uger. Der udtages blodprøver i ugerne 0 og 6 og før hver immunisering.

De opnåede, polyklonale anti-rPBOMP-l-kaninantisera undersøges for evnen til udryddelse af Hi i et komplementmedieret, baktericidt afprøvningssystem in vitro som be-10 skrevet ovenfor i afsnit 7.1. Antisera er blevet afprøvet fra umiddelbart før første immunisering, uge 0, og 2 uger efter en anden immunisering, uge 6. Den baktericide (BC) aktivitet af disse antisera er blevet sammenlignet med aktiviteten af antisera fremstillet imod PBOMP-1 isoleret fra 15 H. influenzae (betegnet "nativt PBOMP-1"). Forsøgsbakterien er den ikke typebestemmelige stamme S-2 af H. influenzae. Resultaterne er vist i tabel VIII.

Tabel VIII

20 BC-Aktivitet af antisera imod rPBOMP-la

Antiserum imod 25 Antiserum*3 Nativt PBOMP-1 rPBOMP-1 (IFA) rPBOMP-1 (alun)

Uge 0 ΓΤ5 175 1:10

Uge 6 NT ' 1:160 1:80

Hyperimmuntc 1:160 NT NT

30 _ a Forsøgsorganisme: ikke-typebestemmeligt H. influenzae S-2.

b Detaljer om immuniseringer anvendt til opnåelse af antisera 35 findes i teksten.

c Hyperimmunt antiserum er blevet fremstillet imod multipel doser af nativt PBOMP-1.

BC-titeren af et antiserum er blevet aflæst som den reciprokke værdi af den højeste fortynding, som har været i 40 76 DK 174965 B1 stand til at udrydde 50% af forsøgsbakterierne sammenlignet med kontrolhuller uden antistof.

Selv om begge kaniner har haft lave niveuer af BC-aktivitet før immunisering, titere på 1:5 og 1:10, har BC 5 af sera opnået ved uge 6 haft signifikante stigninger i BC-aktivitet. Den kanin, som er immuniseret med rPBOMP-1 i IFA, har haft en titer på 1:160, og den kanin, som er immuniseret med rPBOMP-1 på alun har haft en titer på 1:80. Hyperimmunt antiserum er opnået, efter at kaninen har fået multipel 10 doser af nativt PBOMP-1. Det hyperimmune kanin-anti-PBOMP-1-serum har haft en titer på 1:160. Disse resultater viser tydeligt, at rPBOMP-1 er i stand til at frembringe antistof, som erkender det native PBOMP-1 i Haemophilus, og som er biologisk aktivt i det baktericide afprøvningssystem.

15 8. Hidtil ukendte plasmider til forøget ekspression af PBOMP'er i E. coli.

8.1. Forøget ekspression af PBOMP-1 i E. coli.

20 PBOMP-1-proteinet eksprimeres ud fra BamHI-Bglll- fragmentet på 737 bp i pAA152, formodentlig under kontrol af dets native promotor. Sekvensen indeholder et godt overensstemmende ribosombindingssted og initieringscodon af PBOMP-l-genet. Medens PBOMP-1 eksprimeret i E. coli med 25 plasmider indeholdende dette fragment let er blevet påvist ved Western-pletanalyse, er den producerede mængde af et sådant protein under 1% af celleprotein, dvs. mindre end den mængde PBOMP-1, som er frembragt i celler af H. influenzae indeholdende det native gen.

30 Som et indledende forsøg på produktion af højere niveauer af PBOMP-1 i E. coli er det klonede gen blevet placeret under kontrol af promotorer lac og X-PL, som vides at give høj proteinproduktion. Promotorerne bindes til BstNI-stedet imod strømmen fra PBOMP-1-initieringscodonen (fig.

35 4A) . Spaltning på dette sted fjerner den native PBOMP-1- promotor, men efterlader ribosombindingsstedet intakt.

77 DK 174965 B1

Disse konstruktioner er blevet gennemført som følger.

Først klones det BamHI-Bglll-fragment på 737 bp i pAA152, som bærer PBOMP-1-genet, ind i BamHI-stedet i lac-promotoren i plasmid pUC19. Én klon, som bærer PBOMP-l-genet i samme 5 orientering som lac-promotoren, er blevet betegnet pPX160. Ekspression af PBOMP-1 ud fra pPXISO i E. coli JM103 er under regulering af den native promotor, ikke under lac-re-gulering, formodentlig på grund af et transcriptionstermi-neringssignal i de 240 bp mellem Bglll-stedet og transla-10 tionsinitieringscodonen i PBOMP-1. Derefter spaltes plasmid pPX160 med BstNI, som spalter mellem PBOMP-1-initieringsco-donen og det samstemmende translationsinitieringss'ted i genet, men efterlader ribosombindingsstedet knyttet til koderegionen. Enderne udfyldes med DNA-polymerase I fra E.

15 coli (Klenow-fragment), og det lineariserede plasmid spaltes med BamHI. Det BstNI-BglII-fragment på 577 bp, som bærer det promotorfrie PBOMP-l-gen, ligateres til pUC19 spaltet med Hindi og BamHI. Det resulterende plasmid, som betegnes pPX166, viser sig ved Western-plet at eksprimere PBOMP-1 20 under regulering af lac-promotoren i E. coli JM103.

Når PBOMP-1 eksprimeres fra lac- eller PL-promotorer i stammerne JM103 eller HB101 af E. coli, eksprimeres der kun lave niveauer af PBOMP-1. Western-pletanalyse af lysater fra disse celler med monoklonalt antistof G-204, som binder 25 til de aminoterminale 20 aminosyrer i modent PBOMP-1, har vist tilstedeværelsen af et peptid på 4000-5000 dalton erkendt af dette monoklonale antistof (fig. 20) . I celler, som eksprimerer PBOMP-1 under regulering af den tilskyndede PL~promotor, er mere end 90% af G-204-bindingsaktiviteten i 30 dette formodede nedbrydningsprodukt, hvilket antyder, at PBOMP-l eksprimeret i høje niveauer i E. coli er ustabilt.

Plasmiderne pPXISO og pPX166 er blevet transformeret ind i flere stammer af E. coli indeholdende mutationer, som er rapporteret som stabiliserende fremmede proteiner. Disse 35 omfatter ATP-afhængige proteasemultationer (Ion-), varme-chokreaktion (htp) og en mRNA-stabiliserende mutation (pnp).

78 DK 174965 B1

Desuden er plasmiderne, da behandling af PBOMP-1 som et lipoprotein kan forøge dets stabilitet, blevet placeret i en stamme af E. coli, som mangler det native hovedprotein i E. coli, mureinlipoproteinet (lpp~). I alle afprøvede stammer 5 er det PBOMP-1-nedbrydningsprodukt, som erkendes af det mo-noklonale antistof G-204, til stede i omtrent sammt niveau.

Det ser derfor ud til, at nedbrydningen af PBOMP-1 i E. coli skyldes en anden, uidentificeret aktivitet.

Som en anden tilnærmelse er der blevet skabt et modi-10 ficeret PBOMP-l-gen ved fjernelse af genets native signalsekvens. En sådan konstruktion giver to potentielle fordele i forhold til nativt PBOMP-1-protein. For det første kan det signalfrie PBOMP-1 ikke transporteres til membranen, og derfor kan toksicitetsvirkninger på grund af overekspression 15 af PBOMP-1 nedsænkes. For det andet kan signalfrit PBOMP-1, da det ikke er modificeret med de ekstremt hydrofobe lipid-grupper, eventuelt gøre anvendelsen af detergenter til isolering eller opbevaring i opløsning unødvendige.

Konstruktion af en signalfri form af PBOMP-1 er il-20 lustreret i fig. 21. Som vist i fig. 21 spaltes PBOMP-1-genet fra plasmid pPX160 ved codon 19 med Alul-restriktions-endonuclease. Det resulterende fragment ligateres til Smal-restriktionsstedet i pUC19-polylinkerregionen. Det resulterende gen eksprimerer et hybridprotein indeholdende hele 25 aminosyresekvensen i nativt PBOMP-1 plus yderligere 18 aminosyrer fra pUC19-polylinkerregionen ved aminoterminus.

Dette plasmid er blevet betegnet pPX167.

Som yderligere vist i fig. 21 er et andet rekombinant-plasmid, som eksprimerer PBOMP-1, blevet afledt ud fra plas-30 mid pPX167 ved spaltning ved BamHI-stedet i polylinkeren og kloning af fragmentet ind i BamHI-stedet i plasmid pINIII-ompA3. Det resulterende plasmid pPX168 indeholder et hybridgen, som koder modent PBOMP-1 bundet ved aminoterminus til signalsekvensen i OMP-A-protein fra E. coli. Dette hybrid-35 produkt behandles gennem membranen via OMP-A-signal sekvensen til frembringelse af et modent PBOMP-1, som mangler lipopro- 79 DK 174965 B1 teinmodifikation, og som indeholder yderligere otte aminosyrer ved sin aminoterminus.

Plasmider pPX167 og pPXl68 transformeres ind i E. coli JM103 og afprøves for rekombinant-PBOMP-1-syntese. Ved 5 SDS-PAGE-Western-pletanalyse er det. blevet vist, at begge piamider koder proteiner, som erkendes af polyklonale og monoklonale anti-PBOMP-1-antisera. Det modificerede PBOMP-1, som syntetiseres ud fra pPX167, er tilskyndeligt med isopropyl thio-fi-D-galactopyranosid (IPTG), er placeret i cellecy-10 toplasmaet og er opløseligt i fravær af detergenser. Det modificerede PBOMP-1 er ikke påviseligt ved "Coomassie® blue"-farvning af helcellelysater fra IPTG-tilskyndede celler og udgør under 1% af det totale celleprotein. Det modificerede PBOMP-1, som syntetiseres ud fra pPX168, er også til-15 skyndeligt med IPTG (under kontrol af hybrid-lilac-promoto-ren), udskilles i mediet og er også opløseligt i fravær af detergenser. Fuldt tilskyndet produceres dette modificerede PBOMP-1 af celler i et niveau på fra ca. 1 til ca. 2 mg.

Plasmider pPX167 og pPX168 er også afprøvet i en 2 0 mangfoldighed af stammer af E. coli for ekspressionsniveauer.

Den mest resultatrige af de afprøvede kombinationer er det chimere pPX167-plasmid transformeret ind i E. coli PR13, en stamme som indeholder den mRNA-stabiliserende mutation pnp.

I denne stamme eksprimeres rekombinant-PBOMP-1 under kontrol 25 af lac-promotoren i ca. 2-3% af det totale celleprotein efter lac-tilskyndelse. Dette rekombinant-PBQMP-1 eksprimeres som et cytoplasmisk fusionsprotein indeholdende ca. 17 aminosyrer fra lac-a-peptidet og multipel kloningssekvens fusioneret til aminoterminus i PBOMP-1-genet.

30 8.1.1. Rensning og karakterisering af signalfrit PBOMP-1.

De efterfølgende forsøg er blevet gennemført til rensning og karakterisering af det signalfrie PBOMP-l (her betegnet rPBOMP-1).

35 Isolering af cytoplasmisk ekstrakt. Celler fra nat- tegamle kulturer af E. coli PR13 indeholdende pPX167 dyrket 80 DK 174965 B1 i Luria-nsringssuppe ved 37°C pelletiseres ved 4°C i en GSA-rotor ved 8000 omdr. pr. minut i 10 minutter. Disse pellets vaskes i 1/10 volumen 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, og resus-penderes i 1/100 volumen 10 mM Tris, pH 7,5, indeholdende 10 5 /zg/ml DNase og 10 Mg/ml RNase. Cellerne itubrydes enten ved sonikering ved 40W i 10 minutter på is eller ved tre passager gennem en fransk trykcelle ved 1400 kg/cm2. Ubrudte celler fjernes ved centrifugering ved 10.000 omdr. pr. minut i en SS-34-rotor ved 4°C i 10 minutter. Totale cellemembraner 10 fjernes ved centrifugering ved 55.000 omdr. pr. minut i en 60Ti-rotor i 30 minutter ved 4°C. Membranerne kasseres, og den ovenstående væske bevares.

DEAE-fraktionering af cvtoplasmisk ekstrakt. Den ovenstående væske ledes hen over en ionbytterkolonne af 15 DEAE-"Biogel® A" (Biorad Laboratories, Richmond, CA) ækvili-breret med 10 mM Tris, pH 7,5. Praktisk taget alle proteiner bindes til kolonnen under disse betingelser. Bundet rPBOMP-1 og andre proteiner elueres trinvis med 10 mM Tris, pH 7,5, indeholdende 80 mM NaCl. Alle proteiner elueret ved hjælp 20 af denne puffer slås i pulje og koncentreres ved udfældning med 60% mættet ammoniumsulfat ved 4°C. Pellet'en samles ved centrifugering og opløses i 10 mM Tris, pH 7,5, efterfulgt af dialyse imod samme puffer til fjernelse af eventuelt tilbageværende ammoniumsulfat.

2 5 Chromatoqrafi med omvendt fase af rPBOMP-1. Den rPBOMP-1-holdige, ovenstående væske køres over en 4,6 x 15 mm 11C-4"-HPLC-kolonne med omvendt fase efter fortynding i puffer indeholdende 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) i cU^O. Kolonnen køres med en strømningshastighed på 2 ml/min ved 30 anvendelse af samme puffer. De fleste af proteinerne binder til kolonnen under disse betingelser. Bundet rPBOMP-1 elueres som en enkelt spids ved hjælp af en 0-95% acetonitrilgradient i 0,1% TFA i løbet af 20 minutter. Den store spids indeholdende rPBOMP-1 (se fig. 22, spids 1) opsamles, og fraktio-35 nerne slås i pulje og koncentreres ved afdampning af opløsningsmidlet. Tørret rPBOMP-1 genopløses i d^O.

81 DK 174965 B1 SDS-PAGE gennemføres som ovenfor beskrevet på den cytoplasmiske ekstrakt, DEAE-eluatet og eluatet fra omvendt fase opnået fra cellerne af E. coli PR13 indeholdende plasmid pPX167. Efter elektroferese farves gelerne med "Coomassie® 5 brilliant blue"-farvning i ca. 2 timer. Western-pletanalyse ved anvendelse af monoklonalt antistof GD204 gennemføres ligeledes. De opnåede resultater er vist i fig. 23A og 23B.

Som vist i fig. 23A er rPBOMP-1 hovedproteinet til stede i den cytoplasmiske ekstrakt af celler af E. coli 10 PR13 indeholdende plasmid pPX167, når der farves med "Coomassie®" -farvning (fig. 23A, kolonne 1). Som bestemt ved Western-pletreaktivitet er mere end 95% af rPBOMP-1 placeret i den cytoplasmiske ekstrakt. Da der intet detergens er anvendt ved fremstillingen af den cytoplasmiske ekstrakt, 15 viser resultaterne, at rPBOMP-1 opnået ud fra disse celler er opløseligt i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, uden detergens.

Dette repræsenterer en afvigelse fra PBOMP-1 opnået ud fra Hib-celler som et lipoprotein.

Foreløbige forsøg ved anvendelse af den cytoplasmiske 20 ekstrakt har vist, at rPBOMP-1 opnået ud fra celler af E. coli PR13 indeholdende pPX167 kan eksistere i vandige opløsninger som et kompleks med sig selv eller med andre, cytoplasmiske proteiner. Når der gennemføres gelfiltreringschro-matografi ved anvendelse af acrylamid-agarose-polymere eller 25 "Sephadex®"-perler ved anvendelse af dette rPBOMP-1, elueres rPBOMP-1 ved en tilsyneladende molekylmasse på over 1000 dalton (data ikke vist). Ionbytningschromatografi ved anvendelse af DEAE-"Biogel® A" (Biorad Laboratories, Richmond, CA) har vist, at rPBOMP-1 ikke elueres som en enkelt spids 30 ved en speciel saltkoncentration. rPBOMP-1 elueres over et interval af NaCl-koncentrationer fra ca. 20 mM til 75 mM i 10 mM Tris, pH 7,5. Når det eluerede rPBOMP-1 er et af mange eluerede proteiner i vasken med 80 mM NaCl, forbliver et signifikant antal cytoplasmiske proteiner bundet til kolonnen 35 ved saltkoncentrationer over 80 mM. Derfor er DEAE-chromato-grafi som ovenfor beskrevet blevet anvendt som et foreløbigt 82 DK 174965 B1 trin til fjernelse af et signifikant antal forurenende proteiner fra rPBOMP-1.

Som vist i fig. 23A har DEAE-chromatografi stærkt reduceret antallet af proteiner, som findes i det cytoplas-5 miske materiale (fig. 23A, kolonne 2) , og har ikke ændret reaktiviteten af rPBOMP-1 med monoklonalt antistof <fig.

23B, kolonne 2).

Aminosyresekvensen af rPBOMP-1 viser, at det må være et relativt hydrofobt protein. Selvom det har været opløse-10 ligt i den cytoplasmiske ekstrakt uden detergenser, er det blevet forventet, at rPBOMP-1 ville være mere hydrofobt end de fleste af de cytoplasmiske proteiner. DEAE-eluatet indeholdende rPBOMP-1 er derfor blevet chromatograferet på en hydrofob vekselvirkningskolonne "C-4" som ovenfor be-15 skrevet og elueret ved anvendelse af en gradient med stigende acetonitril. I dette system skulle mere hydrofobe proteiner være bundet kraftigere til kolonnen og således elueres i højere koncentrationer af acetonitril. Det er blevet antaget, at rPBOMP-1 ville bindes kraftigere end de fleste af de 20 forurenende proteiner og elueres efter de fleste af disse.

Når den rPBOMP-1-holdige fraktion chromatograferes på en "C-4"-kolonne, viser det sig, at PBOMP-1 er den hovedspids, som elueres fra kolonnen (fig. 21) , og overraskende nok elueres det først ved den laveste koncentration af acetoni-25 tril.

Som vist i fig. 23A, kolonne 3, er rPBOMP-1-spidsen ren som bestemt ved farvning med "Coomassie® brilliant blue R-250" af 10 μg protein efter SDS-PAGE. Spidsen viser to bånd, et hovedbånd og et mindre bind, ved farvning med "Coo-30 massie®", og begge bånd reagerer med monoklonalt antistof imod PBOMP-1, som erkender de 20 aminoterminale aminosyrer i PBOMP-1 (fig. 23B, kolonne 3). Det mindre bånd, ca. 2.000 kilodalton mindre end rPBOMP-1 af fuld størrelse, er også til stede i helcelleekstrakter af PR13(pPX167), hvilket 35 viser, at det mindre protein ikke er et biprodukt fra rensningsprocessen. Efter koncentrering ved afdampning af opløs- 83 DK 174965 B1 ningsmidlet er det rensede rPBOMP-1 opløseligt i vandige opløsningsmidler uden detergens.

Immunisering af kaniner.

5 Hvide New Zealand kaniner immuniseres med rPBOMP-1 opnået ud fra celler af E. Coli PR13 indeholdende pPX167 enten emulgeret i Freund's ukomplette adjuvans eller bundet til aluminiumhydroxid. rPBPMP-1 bindes til alun, ved at rPBOMP-1 i en koncentration på 500 /zg/ml i 0,85%'s saltop-10 løsning blandes med alun ved en koncentration på 500 μg/ml i et mængdeforhold på 1:1. Blandingen omrystes ved 37°C i 3 timer, og alun pelletiseres ved centrifugering. Ovenstående væske afprøves ved BCA-proteinafprøvningen (Pierce Chem.

Co., Chicago, IL) for ubundet protein. Der påvises intet.

15 Alun resuspenderes i fysiologisk saltopløsning med 500 μg/ml. rPBOMP-1 emulgeres i IFA (Difco) i et mængdeforhold på 1:1. Dyrene immuniseres intramuskulært med 50 μg af begge præparater med mellemrum på 4 uger. Der udtages blodprøver i ugerne 0 og 6 og før hver immunisering. Sera afprøves for 20 anti-PBOMP-1- og anti-rPBOMP-l-antistof ved anvendelse af ELISA- og Western-pletanalyse.

Immunisering med rekombinant-PBOMP-1 har frembragt antistoftitere imod rekombinant-PBOMP-1 og PBOMP-1 opnået ud fra H. influenzae (betegnet nativt PBOMP-1) som bestemt 25 ved ELISA-afprøvninger. Resultater er vist i tabel IX.

84 DK 174965 B1

TABEL IX

ELISA-TITERE AF ANTISERA IMOD rPBOMP-1 ANTI -rPBOMP-1 - -ELISA-titera imod- 5 -antisera_ Adjuvans rPBOMP-1 Nativt PBOMP-1

Uge 0 Alun 800 800

Uge 6 Alun 12.800 12.800

Uge 0 IFA 800 800 10 uge 6 IFA 12.800 12.800 a ELISA-titer repræsenterer den reciprokke værdi af den højeste fortynding af antiserum, som giver det dobbelte af baggrundsniveauet.

15

Som vist i tabel IX frembringer immunisering af dyrene med rPBOMP-1 i enten alun eller IFA signifikante titere af antistof, som er reaktivt med både rPBOMP-l og nativt PBOMP-1 6 uger efter immunisering.

20 8.2. Forøget ekspression af PBOMP-2 i E. coli.

PBOMP-2 eksprimeres også i lave niveauer {under 1% af celleprotein) fra plasmid pAA130. Ekspression af PBOMP-2 er tilsyneladende under kontrol af dets native promotor.

25 Til forbedring af udbyttet af PBOMP-2, er PBOMP-2-ge- net i pAA130 blevet spaltet ved det eneste Sspl-restriktionssted 5 baser 5’ i forhold til PBOMP-2 - initieringscodonen og ligateret til Smal-stedet i pUC19 (fig. 24). Ligateringen resulterer i et hybrid med en åben læserramme (ORF) indehol-30 dende hele PBOMP-2-ORF (herunder signalsekvensen) plus 18 codoner fra pUC19 og 2 codoner fra genfusionsstedet. Proteinproduktet fra dette fusionsgen har en forudsagt molekylvægt på 17.999 dalton og eksprimeres under regulering af lac-pro-motor. Dette plasmid er blevet betegnet pPX163.

35 Når plasmid pPX1663 tranformeres ind i E. coli JM103 og tilskyndes med IPTG, eksprimeres der et protein med en tilsyneladende molekylvægt på 17.500 dalton. Desuden iagttages der en proteindublet ved en molekylvægt på 15.000 dalton.

85 DK 174965 B1

Alle tre proteiner erkendes af anti-PBOMP-l-antisera på Western-plet (fig. 25) . Ved "Coomassie® blue"-farvning af SDS-PAGE udgør de tre former af rekombinant-PBOMP-2 ca. 15% af totalt celleprotein efter lac-tilskyndelse (fig. 25, 5 kolonne 3) . De tre former af rekombinant-PBOMP-2 eksprimeret fra pPX163 er blevet isolereret, og N-terminalpeptidanalyse afslører, at l. båndet med en tilsyneladende molekylvægt på 17.500 dalton er det forudsagte pUC19/PBOMP-2-hybridprotein; 10 2. det øverste bånd med en molekylvægt på 15.000 dalton starter ved den første methioninrest i PBOMP-2-sig-nalsekvensen (dvs. initieringscodonen i PB0MP-2-0RF) og skyldes tilsyneladende reinitiering af translation på dette punkt; og 15 3. det nedre bånd med en molekylvægt på 15.000 dalton er blokeret for N-terminalanalyse og kan mærkes med 14C-pal-mitat, og dette bånd består af lipoproteinbehandlet PBOMP-2.

9. Kortlægning af epitopdeterminanter i PBOMP-l.

20 9.1. Syntetiske peptider og spaltningspeotider.

De fleste antistoffer erkender antigendeterminanter på proteiner, som er konformationsspecifikke, dannet af rester, som er tæt sammen i rummet, men ikke i primær sek-25 vens. En lille mængde af antistoffer erkender lineære dele af proteinmolekylet. Disse lineære eller kontinuerte epito-per består sædvanligvis af ca. 5-10 aminosyrer og springer frem fra proteinoverfladen, idet de danner hjørnet eller bøjninger af molekylet og antager omvendte snoninger eller 30 sløjfestrukturer. For størstedelens vedkommende er kontinuerte epitoper hydrofile og overfladetilgængelige. Computeralgoritmer ifølge Hopp og Wood, 1981, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 78, 3824-3828, og Chou og Fasman, 1978, Ann. Rev. Biochem. 47, 251-276, er blevet anvendt til identifikation 35 af flere hydrofile regioner (vist ved skraverede, rektangulære kasser i fig. 26) i PBOMP-l (aminosyresekvensen er 86 DK 174965 B1

vist i fig. 11) , som indeholder omvendte snoninger (vist I

ved pile i fig. 26) ; hver især baseret på et tetrapeptidflyttende gennemsnit. Denne computerundersøgelse har afsløret hydrofile snoninger, som dominerer nær ved de amino- og 5 carboxylterminale regioner i PBOMP-1.

Fem peptider, P1-P5, som svarer til de to endetermini er blevet udvalgt til kemisk syntese. Peptid PI svarer til de N-terminale rester 1-20 i det modne protein (se fig. 26 og 27). De resterende fire peptider, P2-P5, er en redefuld 10 i række fra den C-terminale ende af PBOMP-1. Den længste af disse er P5, en sekvens på 38 aminosyrer indeholdende resterne 97-134 i det modne protein. Syntetiske peptider er blevet fremstillet ved fastfasemetoden ifølge Merrifield, 1964, J.

Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, ved anvendelse af symmetrisk 15 anhydridkoblingskemi, bortset fra aminosyrerne arginin, asparagin og glutamin, for hvilke der er anvendt 1-hydroxy-benzotriazolestere. Syntesen er blevet gennemført med en automatisk peptidsyntetisator fra Applied Biosystems (Model 43OA). Hver enkelt aminosyre er blevet dobbeltkoblet, hvilket 20 har resultereret i trinvise udbytter på over 99,5%, som angivet ved ninhydrinprøven. Peptiderne er blevet spaltet fra harpiksen ved hjælp af vandfrit hydrogenfluorid.

Proteolytiske fragmenter af PBOMP-1 er blevet opnået ved digerering med en mangfoldighed af proteaser. EndoLys-25 -C-digerering har resulteret i frembringelsen af et stort peptid på 63 aminosyrer (resterne 1-63) i det modne protein.

Tyr 87-Glu 121 er opnået ud fra en digerering med protease fra Staphylococcus V8, og Gly 18-Arg 85 er afledt ud fra en endoArg-C-digerering.

30 Både kemisk syntetiserede peptider og proteolytiske fragmenter er blevet analyseret ved HPLC med omvendt fase på en "Vydac® C4"-kolonne ved anvendelse af en acetonitril/-vand-gradient med 0,1% trifluoreddikesyre (TFA). I alle tilfælde har renheden af de syntetiske peptider oversteget 35 95% som bekræftet ved aminosyresekvensering.

87 DK 174965 B1 9.2. Monoklonale antistoffer (Mab'er).

Monoklonale antistoffer er blevet fremstillet og renset som beskrevet i afsnit 6.2.2. Kort fortalt er hybri-domacellelinier, som udskiller antistoffer imod PBOMP-l, 5 blevet opnået ved fusion af musemyelomacellelinien X63. Ag8,6543 med miltceller opnået ud fra en C57/Bl-mus immuniseret med PBOMP-l. ønskede hybridomaer klones igen ved begrænsede fortynding og screenes for reaktivitet for PBOMP-l ved Western-plet. Udvalgte hybridomaer injiceres i Balb/c-mus 10 til vækst som ascites.

I alt 43 hybridomakloner, som udskiller anti-PBOMP--1-antistoffer, er blevet opnået ud fra fusionsforsøgene.

Ved anvendelse af konkurrende ELISA er det blevet påvist, at der mellem Mab'er eksisterer udstrakt krydskonkurrence, 15 hvilket viser, at de har erkendt overlappende eller meget nære antigendeterminanter. Mab'er er i overensstemmelse med deres reaktivitetsprofiler blevet katagoriseret i syv grupper. Repræsentative Mab'er fra disse grupper er blevet anvendt ved yderligere forsøg til bestemmelse og afgrænsning 20 af værdifulde, tilstødende epitoper til vaccineformuleringer.

9.3. Eoitopkortlægning med Mab'er.

9.3.1. Reaktivitet af syntetiske peptider via direkte ELISA-25 afprøvninger.

En direkte ELISA-afprøvning er blevet anvendt til bestemmelse af bindingen af Mab'er til syntetiserede peptider i PBOMP-l. Som vist i tabel X har kun to Mab'er, G204-2 og G194-3, reageret direkte med peptidet PI. Disse to Mab'er 30 erkender øjensynligt samme epitop, da de har konkurreret med hinanden ved konkurrencebindingsforsøg (data ikke vist).

De resulterende Mab'er har ikke reageret med noget af peptiderne under de betingelser, som er anvendt til overtrækning af mikrotiterpladerne.

88 DK 174965 B1 ro i

O I I I I I

ro

rH

m I I I I I i

Ln ΛΙ id m 2 ®

y. O I I 1 I I

* h S

g a .5 s <*»

Irt O I

jrt CQ -s« + i i i i H ftj σ\ n 1—1

Λ »w JD

m ns « u ε ?

ni C) IM rr I I I I I

s s * s 1 g .s x p σ s-» vo 55 o as ·

f, Ώ CO OO 1 I I I I

a ω Ό IH

g|ii ° "

Η Λ Q

.0) ro h Q 1 ,. «Λ i i i i i 0) r—( σ ·* ™ S ” g u ro 5 as i £ xj co i i i i i g β ^ £ g

5 Η OO

as -H 1 + “J JJ ^ +1111 I s

•H

M m * 7

VD I I l I I

σι

rH

^ ** ^ ro ro ro ΓΟ rH i—I rH O H & d Di

OO tf >H >H >H

ce! >h E-* H E-i ?h H i i i Η i ro ro o i r~ o h oo

rH Q\ rH rH rH

Ό CO W W W Qj

•H >1 >-l >H CO

.u u J J J < a <D ri 1/1 «1 ro Ol

Ov cx, cu a, a, o, 89 DK 174965 B1 9.3.2. Inhibitorisk aktivitet af syntetiske peptider.

De relative evner hos de syntetiske peptider til inhibering af bindingen af de forskellige Mab'er til PBOMP-1, overtrukket på mikrotiterpladerne, er vist i tabel XI. Alle 5 de monoklonale antistoffer, som er anvendt ved konkurren-ce-ELISA (se afsnit 6.2.2. for detaljeret beskrivelse af metoden) har reageret med PBOMP-1. Peptid PI er 100% effektivt ved inhibering af bindingen af Mab'er G204-2 og G194-3 til nativt PBOMP-1. Begge disse Mab'er har også reageret 10 direkte med peptidet PI (se ovenfor). Derfor ligger den eller de epitoper, som erkendes af Mab'er G204-2 og G194-3, inden for de første tyve aminosyrer i PBOMP-1.

Bindingen af Mab’er G196-3, G212-6, G214-3 og G190-8 til PBOMP-1 er blevet effekt inhiberet (100%) af alle de 15 C-terminale peptider P2-P5 (tabel XI). Disse fire Mab'er erkender altså en eller flere epitoper indeholdt i peptidet P2, en sekvens på 15 aminosyrer, som spænder over Aspl20--Tyrl34.

Begge Mab’er GI87-1 og G216-3 er blevet stærkt in-20 hiberet fra binding til PBOMP-1 overtrukket på plade af peptiderne P4 og P5 (tabel XI). På den anden side har begge peptiderne P3 og P2 været minimalt effektive ved inhibering af bindingen af disse to Mab'er til PBOMP-1. Disse inhibe-ringsdata viser, at regionen på 10 aminosyrer (K-L-G-T-V-S-25 Y-G-E-E-K, resterne 103-113 i det modne protein) indeholder en epitop, som erkendes af Mab'er G187-1 og G216-3. Det er muligt, at denne region på 10 aminosyrer kan indeholde to steder, da Mab'er G216-3 og G187-1 er fra to ikke-krydsreagerende grupper.

30 35 90 DK 174965 B1 ro i o o o o o <J\ S ™ u

C rH

0) ” C I O CO tH o o σ £ a; ^ * ^ w £ J n o W i og o o rH o- rf vø og o o og h

η Ό £) rH H rH

u 0) (0 og

dj ^ S

m Λ u-ι ro

J (i (0 I O O rH O O

"A S TT O rH

ΛΙ 1 (71 Ot <H

S M c rH

ΪΠ I H

M £ A Ό S g 2 C oi ^ O -H i o og o o% o j π CQ X5 ^ O rH og

a § ftg O rH

3 <4Η og 2 rH ·Η Λ 5 v -u

H g c m CO

S nj C i ooooo

o -H O O O O O

rrt^H in σ» rH rH rH rH

go O rH

Ή X)

c -rH

gj rH r Γ0

“J I C I OOOOO

A -H HT OOOO

<*t 21 rH rH rH rH rH

p O do og = o S “

P W I OOOOO

ijl (0 og oooo

i. rH T—I rH r—I r—I

u " *C 00 r! i o o o o o

^ CO OOOO

rH rH i—I rH

H

^ \n rr n ro ro

Γ0 H rH rH

O rH a a K

og oi >h ?h >i — Pi >h Η H Eh

rH >H £h i i I

E Η i m m o \ i o- o rH og CT) rH ON t—i i—i i—i

Ό 3. 03 CO CO C/} A

•H >h >g >h >h 03 JJ O CJ J J J <

CLi O

O) og h in d n in

A ^ A A A A A

91 DK 174965 B1 9.3.3. Reaktivitet af Mab'er med proteolytisk spaltede PBMOP- 1-fragmenter.

PBOMP-1-peptidfragmenter frembragt ved proteolytisk spaltning er blevet afprøvet for reaktivitet med et begrænset 5 antal anti-PBOMP-l-Mab1 er ved direkte prikplet- og Western--immunopletanalyse. Et stort peptid på 63 aminosyrer (resterne 1-63 i det modne protein) opnået ud fra endoLys-C-dige-rering har reageret med Mab G204-2. Denne iagttagelse er ikke overraskende, da den N-terminale sekvens på 20 amino-10 syrer er indeholdt i dette spaltningspeptid. Et peptid, Tyr87-Glul21, opnået ud fra en V8-digerering, har reageret med Mab G216-3. Det er blevet vist (se ovenfor), at dette Mab erkender en sekvens på 10 aminosyrer, resterne 103-113 i det modne protein, som er omfattet af dette VSrpeptid.

15 Endelig er det blevet vist, at Mab G219-3, som ikke binder med noget af de syntetiske peptider, reagerer med et peptid på 68 aminosyrer, Glyl8-Arg85, stammende fra en endaJUrg-C-di-gerering.

Til sammen har disse studier, som involverer bindingen 20 af Mab'er til syntetiske peptider og peptider frembragt ved proteolytisk digerering, afsløret tilstedeværelsen af fire tilstødende, antigeniske regioner i PBOMP-1. Et skematisk diagram, som viser kortlægningen af epitoper erkendt af Mab'er, er vist i fig. 28. To af de fire determinanter er 25 lokaliseret ved kædetermini, dvs. de N-terminale rester 1-20 og de C-terminale rester 120-134, i det modne protein.

Den tredje antigeniske region, erkendt af Mab G216-3 og G187-1, er lokaliseret til en lille aminosyresekvens (10 aminosyrer), som spænder over resterne 103-113 i det modne 30 protein. Endelig er en ret stor antigenisk region, erkendt af Mab G219-3, omfattet af resterne Glyl8-Arg85. Da sidstnævnte peptid er ret stort, vil epitopen sandsynligvis kunne være konformationsafhængig, da forsøg indtil nu på at indsnævre den har resulteret i tab af antigenicitet.

35 92 DK 174965 B1 9.4. Funktionel aktivitet af Mab'er.

Den funktionelle aktivitet af disse Mab'er er blevet afprøvet ved en baktericid afprøvning imod stamme S2 af H. influenzae. Det anvendte komplement er præcolostral kal-5 veserum (PCCS) adsoberet 2 x med vaskede helceller af S2. Bakterierne dyrkes natten over i hjerne-hjerte-infusionsnæ-ringssuppe (BHI) suppleret med 10 μg/ml hemin og 2 Mg/ml NAD (BHIXV) , derefter fortyndet 1:15 i frisk næringssuppe og inkuberet ved 37°C under gennemluftning. Cellerne dyrkes 10 til en optisk tætning ved 490 nm på 0,9 (ca. 10 CFU/ml) . Bakterierne fortyndes 40.000 gange ved en række af fortyndinger i steril, phosfatpufret saltopløsning indeholdende 0,15 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2 og indeholdende 0,5% okseserum-albumin (PCMA). Slutfortyndingen foretages i PCMA med PCCS 15 i et forhold på 4:1.

Ascitesfluidum vaskes i PCMA, ved at det først fortyndes 10 gange i pufferen og derefter koncentreres tilbage til det oprindelige volumen ved anvendelse af en "Centricon®" mikrokoncentrationsenhed med en membran, som afskærer ved 20 10.000. Monoklonalt museantiserum omsættes med mættet am moniumsulfat ved en slutkoncentration på 35% ved 4°C natten over. Prøven centrifugeres i 10 minutter ved 4°C i en Eppen-dorf-centrifuge med pladetoppe. Den ovenstående væske kasseres, og pelleten resuspenderes i 10 gange det oprindelige 25 serumvolumen af PCMA. Prøven føres tilbage til det oprindelige volumen ved anvendelse af en "Centricon®"-enhed med en membran, som afskærer ved 10.000. Prøven vaskes fire gange mere til fjernelse af evt. ammoniumsulfat.

Femten μΐ af serumprøven placeres i første hul på en 30 steril mikrotiterplade med 96 huller og U-bund, som holdes på is. To ganges seriefortyndinger ved anvendelse af PCMA foretages i de resterende huller. Pladerne fjernes fra isen, og 15 μΐ af celle/komplement-suspensionen sættes til serumet i hullerne. Pladerne inkuberes ved 37°C i 45 minutter. En 35 prøve på 10 μΐ fra hvert enkelt hul udspredes på en BHIXV--plade og inkuberes natten over ved 37°C. Den baktericide 93 DK 174965 B1 titer angives som den reciprokke værdi af den højeste fortynding, som kan nedsætte antallet af CFU'er med 50% sammenlignet med en kontrol uden indhold af antistof.

Resultaterne af disse baktericide afprøvninger er 5 vist i tabel XII. Af de ti afprøvede anti-PBOMP-Mab' er har G102-5, G56-5, G216-3 og G204-2 været positive for baktericid aktivitet. Et ubeslægtet virus-Mab viste ingen aktivitet.

Det er interessant, at to af de fire definerede antigendeterminanter i PBOMP-1, de N-terminale rester 1-20 og resterne 10 103-113 i det modne protein, erkendes separat af to bak tericide Mab'er, nemlig henholdsvis G204-2 og G216-3. Den baktericide aktivitet af disse to Mab'er understøtter den påstand, at disse to regioner er overfladeblottet på bakterien. Det er overraskende, at foreløbige inhiberingsdata 15 har antydet, at Mab G204-2 udviser en stærkere reaktivitet med det syntetiske N-terminale peptid end med nativt PBOMP-1.

Dette er en bemærkelsesværdig kontrast til den sædvanligvis lave, antigeniske aktivitet, som er forbundet med syntetiske peptider, når der måles med antistoffer imod hele proteinet.

20 Det er indlysende, at det frie, N-terminale peptid i opløsning efterligner strukturen af denne peptidsekvens i det modne PBOMP-1-molekyle og kan være sterisk mere tilgængeligt for antistofbinding. Ud over Mab'er G204-2 og G216-3 har to andre Mab'er, G102-5 og G56-5, vist sig at være baktericide 25 for Haemophilus-organismer. Da de ikke reagerer med syntetiske peptider eller spaltningspeptider, formodes det, at disse baktericide Mab'er erkender diskontinuerte (eller konformationelle) epitoper. 1 35 94 DK 174965 B1

TABEL XII

Baktericid aktivitet af monoklonale anti-PBOMP-l-antistoffer imod ikke-typebestemmeligt H. influenzae stamme S2a.

5 Mab1 er Gruppe Resultater G102 VI + G56-5 II + G216-3 - +

G146 II

10 G204-2 VII +

G125-6 I

G196-3 III

G64 VI

G25-2 III

15 G219-3

G130-3 II

L7-4 viral a De til den baktericide afprøvning anvendte betingelser 20 er beskrevet i teksten. Af de 11 anti-PBOMP-l-Mab'er har 4 været positive for baktericid afprøvning imod en ikke-typebestemmelig stamme S2 af Haemophilus. Et ubeslægtet, monoklonalt virusantistof har ikke udvist nogen aktivitet.

25 10. Frembringelse af et biologisk funktionelt antistof ved hiælp af et koniugat af et syntetisk. N-terminalt peptid i PBOMP-1.

30 10.1. Kemisk karakterisering af peptid-protein-koniugater.

Det peptid, som er udvalgt til syntese ved dette studium, har svaret til den N-terminale sekvens på 20 aminosyrer Cysl-Tyr20 (PI) i det modne PBOMP-l ved anvendelse af de i afsnit 9.1. beskrevne metoder. Som også beskrevet i 35 afsnit 9.1. er peptidet blevet renset ved HPLC med omvendt fase. Slutrenheden (95%) af de syntetiske peptider er blevet bekræftet ved direkte aminosyresekvensering med en protein- 95 DK 174965 B1 sekvensator Applied Biosystem model 477A.

Konjugater er blevet fremstillet ved anvendelse af MBS (3-maleimidobenzoesyre-N-hydroxysuccinimidester, Pierce Chemical Co, Rockport, IL) som tværbindingsreagenset, jf.

5 Liu et al., 1979, Biochemistry 18, 690-697. Konjugerings- processen skrider frem på trinvis måde. Først N-acyleres * €-aminogrupperne i overfladelysinylrester i BSA (eller thyro- globulin) med et overskud af MBS. Koblingsreaktionen gennemføres ved stuetemperatur i phosfatpufret saltopløsning, 10 pH 7,3, ved blanding af proteinbærestoffet med MBS i et molforhold på 1:100. Reaktionsblandingen afsaltes over "Se-phadex®-G-50" til fjernelse af overskydende MBS-reagenser.

For det andet reduceres peptidet PI, som bærer en aminoter-minal cysteinylrest, med natriumborhydrid til sikring af en 15 en reaktiv sulfhydrylgruppe. For det tredje gennemføres konjugering, ved at reducerede peptid sættes til opløsningen indeholdende BSA-MBS- eller thyrogiobulin-MBS-derivatet, og den covalente reaktion får lov at finde sted natten over. Dialyse gennemføres til fjernelse af overskydende, uomsat 20 peptid før frysetørring. Covalens påvises ved et skift i molekylvægt på SDS-geler og ved Western-pletanalyse. Skiftet i molekylvægt svarer til 7 molekyler peptid pr. BSA-molekyle og 25 molekyler peptid pr. thyroglobulinmolekyle. Desuden reagerer konjugatbåndene med både anti-PBOMP-1- og anti-pep-25 tid-antisera på en Western-plet.

Til forøgelse af immunogeniciteten fedtsyreacyleres det N-terminale peptid med palmitylgrupper ved metoden ifølge Hopp, 1984, Mol. Immuno. 21, 13-16. Essentielt er peptidet forlænget ved aminoterminus med diglycinafstandsgiver efter-30 fulgt af en lysylrest. Både ot- og e-aminogrupperne i N-ter-minalt lysin acyleres med palmintinsyre ved koblingsmetoden med symmetrisk anhydrid. Fuldstændighed af fedtsyreacylerin-gen verificeres ved (1) en negativ ninhydrinprøve, som viser fuldstændig derivatisering af lysylaminogrupper, (2) mod- 35 standsevne hos peptidet imod aminosyresekvensering på grund af blokeret N-terminus og (3) længere HPLC-elueringstid ved 96 DK 174965 B1 anvendelse af en kolonne med omvendt fase på grund af forøget hydrofobicitet.

10.2. Fremstilling af polvklonalt anti-PBOMP-l-N-terminalt 5 peptid-antiserum (N-l-20).

Swiss-Webster-mus, som er mindst 6 uger gamle, fremskaffes fra Taconic Farms (Germantown, NY) . Fra grupper på » 5 mus udtages en forudgående blodprøve, og de vaccineres intramuskulært med et eller 10 //g af et (N-l-20) -bærestof-10 peptid-konjugat, med og uden Freund’s komplette adjuvans (CFA). Dyrene forstærkes ved uge 4 med samme dosis vaccine, som er anvendt til priming. Mus, som er primet med CFA, forstærkes med konjugat i Freund's ukomplette adjuvans (IFA) .

Der udtages blodprøver fra musene i ugerne 4 og 6.

15 Kaniner fremskaffet fra Taconic Farms (Germantown, NY) immuniseres med 10 μg peptid-konjugat og får udtaget blodprøver efter samme vaccinationsskema som ovenfor beskrevet .

20 10.3. Fremstilling af monoklonale antistoffer imod PBOMP- 1-N-terminalt peptid (N-l-20).

Hybridomacellelinier, som udskiller antistoffer imod PBOMP-l-N-terminalt peptid-bærestof-konjugatet fås ved fusion af musemyelomacellelinien X63.Ag8.6543 med miltceller opnået 25 fra en C57/Bl-mus immuniseret med (N-l-20)-bærestof-konjugat som beskrevet i afsnit 6.2.2. Ønskede hybridomaer klones igen ved begrænsende fortynding (se afsnit 6.2.2. for en detaljeret beskrivelse af proceduren) og screenes for reaktivitet med (N-l-20)-bærestof-konjugat ved Western-plet.

30 Udvalgte hybridomaer injiceres i Balb/c-mus til vækst som ascites ved standardmetoder, jf. Brodeur et al., supra.

10.4. Immunogenicitet af PBOMP-l-N-terminalt peptid-bærestof -koniugat (N-l-20).

35 Immunogeniciteten af et PBOMP-l-N-terminalt peptid- -konjugat (N-l-20) er blevet undersøgt ved et studium. Mus 97 DK 174965 B1 og kaniner immuniseres subcutant med 10 μg af (N-l-20) -peptid-bærestof -konjugatet (eller PBOMP-1) emulgeret i CFA efterfulgt 4 uger senere med en forstærkningsinjektion i IFA. Blodprøver udtages fra dyrene 14 dage efter sidste 5 injektion.

Anti-(N-l-20) -peptidaktiviteten af de animalske an-' tisera bestemmes ved ELISA-metoden som beskrevet i ovenstå ende afsnit 6.2.2. Kort fortalt overtrækkes polystyrenplader med 96 huller (NUNC Intermed, Thousand Oaks, CA) med PBOMP-1 10 eller et (N-l-20)-peptid-bærestof-konjugat, dvs. (N-l-20)--peptid-BSA, i en koncentration på 1 μg/π\l i PBS. Pladerne inkuberes natten over ved 37°C i et fugtekammer. Prævaccinationsserum anvendes altid som en negativ kontrol, og et polyklonalt anti-PBOMP-l-serum anvendes som en positiv kon-15 trol. Alkalisk phosfatase koblet til IgG-anti-muse-antisera anvendes som sekundært antistof. Reaktionen fremkaldes med p-nitrophenylphosfat ved 1 mg/ml i diethanolaminpuffer. Optisk tæthed (OD) ved 410 og 690 nm aflæses ved anvendelse af en "Bio-Tek 310"-autoaflæser. Resultaterne er vist i 20 tabel XIII.

TABEL XIII

Antistofreaktion imod N-terminalt peptid som målt ved ELISA. Muse-anti-(N-l-20)-seraa (N-l-20):BSA PBOMP-1 BSA 25 Uge 0 <1:100 1:400 <1:500

Uge 6 1:1.024.000 1:512.000 <1:4000

Kanin-anti-(N-l-20)-sera

Nr. 1 uge 0 1:400 <1:1000 <1:100

Nr. 2 uge 0 1:200 <1:1000 <1:100 30 Nr. 1 uge 6 1:256.000 1:32.000 <1:100

Nr. 2 uge 6 1:4.096.000 1:512.000 <1:100

Muse-anti-PBOMP-1-sera3

Uge 0 <1:100 <1:100 <1:500

Uge 6 1:256.000 1:512.000 <1:500 . 3 Musesera er sera fra fem dyr slået·i pulje.

35 98 DK 174965 B1 ELISA-resultaterne viser, at (N-l-20)-bærestof-kon-jugatet er yderst effektivt til frembringelse af muse- og kanin-anti-peptid-antistoffer, som har evnen til erkendelse af peptidet (knyttet til BSA-bærestof) og nativt PBOMP-1 5 (se tabel XIII). Mus immuniseret med (N-l-20)-bærestof-kon-jugat har givet en høj anti-peptid-titerreaktion på 1:1.024.000. Muse-anti-peptid-antistofferne har også stærkt / erkendt stam-PBOMP-l ved ELISA ved 1:512.000. Disse anti--peptid-antistoffer ser ud til at være specifikke for det 10 N-terminale peptid, da kun negligerbare mængder af disse antistoffer har reageret med BSA.

Den maksimale kanin-anti-peptidtiter er opnået med kanin nr. 2 ved 1:4.096.000. Kanin nr. 1 har også haft en stærk anti-peptidtiter på 1.256.000. Begge disse kanin-anti-15 -peptidsera har været i stand til at erkende nativt PBOMP-1, således som det ses af stigningen i titere på 32 gange og 512 gange sammenlignet med præimmuniseringstiterne for henholdsvis kanin nr. 1 og kanin nr. 2. Det er interessant, at der frembringes antiprotein-antistoffer imod PBOMP-1, som 20 reagerer med det N-terminale peptid ved mere end ELISA-tite-ren på 1:256.000, hvilket antyder, at den N-terminale epitop er immunodominerende.

SDS/Western-plet-teknikken er også blevet anvendt til vurdering af de muse-antipeptidsera, som er frembragt 25 imod (N-l-20)-bærestof-konjugatet. Det er blevet iagttaget, at antipeptidantistoffet og de polyklonale muse-anti-PBOMP--l-sera reagerer med begge konjugater, peptid-BSA og peptid- thyroglobulin, og ligeledes med nativt PBOMP-1 på immunopiet ter. Western-pletresultaterne har også afsløret, at 30 der kun er frembragt små mængder, om overhovedet nogen, antistoffer imod MBS-afstandsgiveren, da disse antipeptidsera ikke har reageret med et kontroikonjugat bestående af "nonsense" -peptid (af en ækvivalent størrelse) bundet til BSA gennem MBS-afstandsgiveren.

35 Det frie peptid (dosis 10 μg) er ikke immunogent, selv ikke når det indgives med FCA. I modsætning til andre 99 DK 174965 B1 fund, jf. Hopp, 1984, Mol. Immuno. 21, 13-16, er palmityl-peptid-konjugatet heller ikke immunogent i mus. Til udløsning af en anvendelig antistofreaktion er det N-terminale peptid koblet til et proteinbærestof, f.eks. thyroglobulin.

5 10.5. Funktionelle afprøvninger.· Baktericid aktivitet af ' anti-(N-l-20)-peptidantistoffer.

Den baktericide aktivitet (BC) af muse-anti-(N-l-20)--peptidantisera imod stammen S2 af H. influenzae er blevet 10 målt ved anvendelse af metoder, som er beskrevet i ovenstående afsnit 9.4.

Resultaterne er vist i tabel XIV.

TABEL XIV

15 Baktericid aktivitet af antipeotid-antistoffer imod N-terminalt peptid i PBOMP-1.

BC-titera 20 Mus immuniseret med Blodprøve i forvejen Uge 6

Frit (N-l-20)-peptid 1/5 1/10

Peptid-bærer-konjugat 1/5 1/40

Nativt PBOMP-1 1/5 1/80 25 Kaniner immuniseret med peptid-bærer-koniuqat

Kanin 1 1/320 1/2560

Kanin 2 1/320 ' 1/1280 30 a Den baktericide aktivitet er målt imod en ikke-typebe-stemmelig stamme S2 af H. influenzae.

Muse-anti-(N-l-20)-peptid-konjugat-antistofferne er i stand til udryddelse af S2-organismer i en fortynding på 35 1/40, sammenlignet med polyklonale muse-anti-PBOMP-1-sera ved 1/80. Som kontrolgruppe har mus immuniseret med frit peptid (ukonjugeret, indgivet i CFA) ikke givet et effektivt, 100 DK 174965 B1 baktericidt antiserum (tabel XIV). Faktisk er der i kontrolgruppen ikke blevet iagttaget nogen signifikant (større end to gange) immunreaktion på det N-terminale (N-l-20)-peptid.

De baktericide aktiviteter af de to individuelle 5 kanin-anti-(N-l-20)-peptid-antisera er også vist i tabel XIV. Selvom de to sera før immunisering har haft baktericid aktivitet, er sera efter immunisering mere effektive ved i mediering af komplementafhængig udryddelse af H. influenzae.

Kanin nr. 1 har givet en baktericid (BC) titer på 1/2560, 10 hvilket repræsenterer en stigning på otte gange i forhold til niveauet før immunisering, medens kanin nr. 2 har givet en titer på 1/1280, hvilket repræsenterer en stigning på fire gange. Det forventes, at antisera fra kanin nr. 2, som har den højere anti-(N-l-20)-titer, har den højeste BC-ak-15 tivitet, men antiserum fra kanin nr. 1 udviser imidlertid en bedre udryddelsesvirkning.

11. Isolering og karakterisering af det af rekombinant- -DNA- afledte PBOMP-2:PBOMP-l-fusionsprotein.

20 11.1. Konstruktion af plasmid pPX183 til ekspressionen af PBOMP-2:PBOMP-l i E. coli.

Konstruktionen af plasmid pPX183 til ekspressionen af PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsproteinet under kontrol af lac-25 -promotoren er beskrevet i det følgende og vist i diagramform i fig. 30.

DNA-fragmenter omfattende PBOMP-1- og PBOMP-2-generne stammer fra plasmiderne henholdsvis pPX167 og pPX163. Isoleringen af hvert enkelt af disse plasmider er beskrevet i 30 ovenstående afsnit 8.1. og 8.2. Rensede DNA-fragmenter af plasmiderne pPX163 og pPX167 digereres hver især separat med Seal til fuldstændighed. Derefter behandles pPX163-dige-reringen yderligere med Hindlll til opnåelse af en delvis digerering. Et resulterende Seal-Hindlll-fragment på 2,7 Kb 35 omfattende replikat ionsoprindelsen, 1 ae-promotoren og PBOMP-2-genet isoleres fra en agarosegel som beskrevet i 101 DK 174965 B1 ovenstående afsnit 6.4.2. Et Scal-HindlII-fragment på 1,4 Kb, omfattende PBOMP-l-genet og reguleringssekvenser, isoleres på samme måde fra en fuldstændig Scal-Hindlll-digere-ring af pPX167. De to isolerede Scal-Hindlll-fragmenter 5 ligateres derefter sammen ved anvendelse af metoder, som er beskrevet i afsnit 6.4.3. Udvælgelse af ampicillinresistente r transformanter sikrer gendannelsen af et aktivt β-lactamase- gen (afbrudt af Seal-stedet). Denne proces har givet et plasmid på 4,1 Kb, som er blevet betegnet pPX183. Dette 10 plasmid koder et PBOMP-2: PBOMP-1-fusionsprotein med de to PBOMP-gener ligateret i ramme som vist i fig. 30.

11.2. Ekspression af PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsproteinet.

Plasmid pPX183 transformeres ind i E. coli JM103, og 15 den resulterende stamme afprøves for produktion af et rekom-binantfusionsprotein under lac-regulering. Med "Coomassie®

Blue" farvede SDS-polyacrylamid-geler af totale celleekstrakter af IPTG-tilskyndede celler af JM103 indeholdende plasmid pPXl83 har afsløret et nyt protein med en molekylvægt på 20 ca. 30.000 dalton, som udgør 1-2% af det totale celleprotein. Western-pletanalyse har vist, at dette rekombinantfusions-protein reagerer med monoklonale antistoffer, som er specifikke for PBOMP-1, og ligeledes med sådanne, som er specifikke for PBOMP-2. Derfor bærer det fusionsproteinprodukt, som 2 5 kodes af plasmid pPX183, epitoper af både PBOMP-1 og PBOMP-2.

11.3. Konstruktion af plasmid pPX199, som eksprimerer PBOMP-2:PBOMP-l-fusionsorotein.

Selvom plasmid pPX183 koder et hybrid-PBOMP-1/PBOMP-30 -2-protein, dvs. et fusionsprotein, indeholder det protein, som eksprimeres af dette plasmid, yderligere aminosyrer kodet af vektoren pUC19. Specifikt indeholder nucleotidsekvensen i pPX183 yderligere 18 codoner ved 5'-enden fra pPX163 og 13 yderligere codoner ved fusionsforbindelsespunktet, dvs.

35 31 codoner stammende fra vektoren pUC19. Et nyt fusionsgen, som mangler det meste af denne overskydende information, er 102 DK 174965 B1 blevet konstrueret som følger: Først er et derivat af pAA130 indeholdende PBOMP-2--genet blevet digereret med Sspl, som spalter 5 nucleotider 5' i forhold til initieringscodonen i PBOMP-2, og derefter 5 med Hindlll, som spalter PBOMP-2-genet ved codon 148, dvs.

6 codoner fra genets 3'-ende. Sekvensanalyse har vist, at dette fragment har kunnet ligateres ind i plasmid pUC8 og digereres med Smal og Hindi 11 til skabelse af et rekombinant--PBOMP-2-gen med syv codoner fusioneret til 5'-enden af det 10 "native" gen og seks aminosyrer manglende ved 3'-enden. Et plasmid er blevet produceret på denne måde og betegnet pPX195 (se fig. 31).

Dernæst er plasmid pPX167 indeholdende PBOMP-1-genet (se ovenstående afsnit 8.1.) blevet modificeret på følgende 15 måde: BamHI-stedet ved 3'-enden af genet fjernes ved delvis digerering med BamHI og religateres ved behandling med DNA--polymerase I fra E. coli (Klenow-fragment) . Det resulterende plasmid betegnet pPX188 verificeres ved restriktionsanalyse og produktion af rPBOMP-1 (se fig. 31). 5'-Enden af rPBOMP-20 -1-genet i pPX188 modificeres ved fjernelse af HindiII-BamHI--fragmentet fra pUC19-polylinkerregionen og indsættelse af et syntetisk oligonucleotid med klæbrige Hindlll- og BamHl--ender ved de seks codoner 3' i PBOMP-2. Denne konstruktion er blevet verificeret ved DNA-sekvensanalyse, og plasmidet 25 betegnes pPX198.

Plasmiderne pPX195 og pPX198 digereres med Hindlll og Seal, og de fragmenter, som bærer henholdsvis PBOMP-2-og PBOMP-1-generne, isoleres og ligateres sammen. Det resulterende plasmid betegnes pPX199 (fig. 31) . Plasmidet pPX199 30 eksprimerer et PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsgen med syv yderligere codoner (fra pUC8) ved 5'-enden og to ved fusionsforbindelsespunktet. Fusionsproteinet har en tilsyneladende molekylvægt på ca. 32.000 dalton ved SDS-PAGE (se fig. 32) og erkendes på Western-pletter af polyklonale antisera imod 35 PBOMP-1, PBOMP-2, PBOMP-2 Mab 61-1 (se afsnit 6.2.2.) og en mangfoldighed af PBOMP-1-Mab'er.

103 DK 174965 B1 11.4. Ekspression af sianalfrit PBOMP-2:PBOMP-l-fusions-protein.

PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsproteingenet i pPX199 koder PB0MP-2-signalpeptidet, og det resulterende fusionsprotein 5 er modificeret som et lipoprotein og kraftigt associeret med ydermembranen i celler af E. coli, som eksprimerer det.

Dette fusionsprotein er vanskeligt at adskille fra membranen og dårligt opløseligt i vandige opløsningsmidler. Konstruktion af et plasmid, som eksprimerer et signalfrit PBOMP-2:-10 PBOMP-1-fusionsprotein, er vist i fig. 33.

Først konstrueres en signalfri form af PBOMP-2-genet på følgende måde: Det EcoRI/Sall-restriktionsfragment på 660 bp af plasmid pPX163, som koder PBOMP-2-proteinet, isoleres og spaltes ved det eneste HphI-sted ved nucleotid 91 15 i genet, og det HphI/EcoRI-fragment på 545 bp, som koder de 125 carboxyterminale aminosyrer i PBOMP-2, isoleres.

Følgende, syntetiske oligonucleotidlinker konstrueres derefter til genoprettelse af en modificeret 5'-ende i PBOMP--2-genet: 20

Xbal SD-kasse Ncol EcoRV Hphl CTAGAATAAAGGAAACAAACCATGGCAAATACTGATATCTTCAGCGGTGATGTTTATA TTATTTCCTTTGTTTGGTACCGTTTATGACTATAGAAGTCGCCACTACAAATATC 25 Met.................................

Linkeren er konstrueret til skabelse af et modificéret PBOMP-2-gen med følgende karakteristika: (1) Mangel på de signalpeptidkodende sekvenser.

30 (2) Genoprettelse af hele den modne PBOMP-2-sek vens, bortset fra den N-terminale cysteinrest (erstattet af methionin).

(3) Et nyt og eneste Ncol-restriktionssted ved initieringscodonen.

35 (4) En usikker baseændring til frembringelse af et nyt og eneste EcoRV-restriktionssted ved nucleotid 12 i koderegionen.

104 DK 174965 B1 (5) Et nyt translationsinitieringssted (SD-kassen) .

(6) En stopcodon (TAA) imod strømmen og i ramme for at forhindre lac-translationel gennemlæsning.

5

Linkeren blandes i et molært mængdeforhold på 1:1:1 med HphI/EcoRI-fragmentet fra pPX163 og pUC19-DNA spaltet med Xbal og EcoRI og ligateres. Ligateringsblandingen transformeres ind i E. coli DH5 lacl^, og AmpR-kolonier screenes 10 for PBOMP-2-produktion med Mab 61-1. Der findes adskillige positive kolonier, og konstruktionen verificeres ved restriktionsanalyse og DNA-sekvensanalyse. Et af isolateme betegnes pPX510.

Plasmid pPX510 koder et protein med en tilsyneladende 15 molekylvægt på 14.000 dalton ved SDS-PAGE, hvilket protein erkendes af både polyklonale ant i-PBOMP-2-sera og anti-PBOMP--2-Mab 61-1. Ekspression af det signalfrie rekombinant PBOMP-2 er under lac-regulering, og fuldt tilskyndede celler eksprimerer konstruktionen som ca. 5% af det totale cel-20 leprotein.

Derefter konstrueres et signalfrit fusionsgen ud fra pPX510 og pPX198 på en måde, som er analog med konstruktionen af pPX199 (se ovenstående afsnit 11.3.). Kort fortalt dige-reres de to plasmider med Hindlll og Seal, og PBOMP-1- og 25 PBOMP-2-fragmenterne ligateres sammen. Det resulterende plasmid transformeres ind i E. coli DH 5a (BRL, Gaithersburg, MD) og betegnes pPX512. Det signalfrie fusionsprotein ekspri-meret af pPX512 har en tilsyneladende molekylvægt på 30.000 dalton ved SDS-PAGE og erkendes af polyklonale antisera 30 imod både PBOMP-1 og PBOMP-2. Fusionsproteinet erkendes også af PBOMP-2-Mab 61-1 og alle PBOMP-1-Mab'er afprøvet ved Western-pletanalyse.

35 105 DK 174965 B1 12. Effektivitet af fusionsproteinunderenhedsvacciner.

12.1. Fremstilling af anti-PBOMP-2:PBOMP-l-antistoffer.

Praktisk taget rent PBOMP-2:PBOMP-1 isoleres fra en 5 SDS-PAGE-gel af celleekstrakter af E. coli JM103 indeholdende pPX183 (se ovenstående afsnit 11.1.). Positionen af fusionsproteinbåndet på den præparative SDS-PAGE-gel er blevet afledt ved farvning med "Coomassie® Blue" af strimler udskåret fra kanterne af gelen. Udskæringer indeholdende fusions-10 proteinet gennemvædes i gelelueringsp'uffer (0,2 M NaCl, 0,05 M Tris, pH 8,0, 0,1% SDS og 0,1 mM EDTA) natten over ved stuetemperatur med svag omrøring. Ekstraheret protein bestemmes ved en Lowry-proteinafprøvning med BSA som standard.

15 To hvide New Zealand hunkaniner anvendes ved et ind ledende immunogenicitetsstudium. Forudgående blodprøver (ved uge 0) udtages før vaccination som en kilde til præimmune sera. 50 μg praktisk taget rent PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsprotein (indstillet på et volumen på 100 μΐ) blandes 2 0 med samme volumen CFA og injiceres intramuskulært i kaninerne på flere steder. Blodprøver indsamles 3 uger senere, og kaninerne immuniseres igen i uge 4 med 50 μg fusionsprotein emulgeret i IFA. Derefter indsamles blodprøver i uge 7, og sera præpareres til ELISA og baktericide afprøvninger. Re-25 sultaterne af ELISA og den baktericide aktivitetsafprøvning er vist i tabel XV. 1 35 106 DK 174965 B1

TABEL XV

Reaktion af polyklonalt kanin--anti-PBOMP-2:PBOMP-1-antisera3 5 -

Stigning i ELISA-titer

Kanin- Stigning i Anti- Antiserum Blodprøve BC-titer -PBOMP-1 -PBOMP-2 10 1 uge 3C 32x 750X 80x uge 128x 2000X 2000x 2 uge 3C 32x 40x 25x 15 uge 7d 128x 400x 250x 3 Detaljer ved inununiseringerne findes i teksten. b Stigning i forhold til titer i uge 0 ved BC imod H. influenzae S2.

20 c Blodprøve udtaget efter én immunisering.

^ Blodprøve udtaget efter to immuniseringer.

Immunisering med rekombinantfusionsproteinet PBOMP--2:PBOMP-1 har udløst antistofreaktioner imod både PBOMP-1 25 og PBOMP-2 som bestemt ved ELISA-afprøvninger, og disse antisera har haft baktericid aktivitet imod den ikke-ind-kapslede stamme S2 af H. influenzae (tabel XV) . Disse resultater viser, at PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsprotein er yderst effektivt ved fremkaldelse af en antistofreaktion imod både 30 PBOMP-1 og PBOMP-2, og at denne immunogene reaktion er biologisk funktionel ved en baktericid afprøvning.

Ved en anden forsøgsrække er voksne chinchillaer blevet anvendt som et prøvesystem til yderligere påvisning af immunogeniciteten og effektiviteten af PBOMP-1:PBOMP-2-35 -fusionsproteinet som en underenhedsvaccineformulering. Chinchillaen tjener som et modeldyresystem, fordi dette dyr, når det inficeres med H. influenzae, udvikler en mellemørebetændelse, som er meget lige den, som ses hos mennesker, jf. Barenkamp et al., 1986, Infect. Immun. 52, 572-578.

107 DK 174965 B1

Som nævnt i afsnit 11.3. er PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsproteinet, som eksprimeres af E. coli JM103 indeholdende pPX199, modificeret som et lipoprotein og er kraftigt associeret med ydermembranen i værtscellerne af E. coli. Prak-5 tisk rent PBOMP-2:PBOMP-1 isoleres fra E. coli JM103 indeholdende pPX199 ved følgende metode, som indebærer differentiel detergensekstraktion af inder- og ydermembranproteineme i værtscellerne af E. coli. Kort fortalt ekstraheres inder-membranproteinerne i E. coli ved anvendelse af 1% "Sarcosyl®1’ 10 i 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, hvilket efterlader et uopløseligt ydermembran-cellevæg-kompleks.

En underfraktion beriget på PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsprotein opnås ved differentiel detergensekstraktion af andre ydermembran - cellevæg - komponenter. Ydermembranproteineme 15 ekstraheres fra de "Sarcosyl®"-uopløselige ydermembran-cellevæg -komponent er ved sekventiel ekstraktion med en 1% "Zwit-tergent 3-12", 1% "Zv/ittergent 3-14" i 10 mM Tris-HCl., pH 8, 5 mM EDTA, 1% deoxycholat, ved 60°C. Det på PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsprotein berigede, uopløselige materiale fås efter 20 centrifugering. PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsproteinet gøres opløseligt ved ekstraktion af den PBOMP-2:PBOMP-1-berigede fraktion med 1% "Zwittergent 3-14", 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 6 M urinstof, ved 80°C i 45 minutter. Efter opløsel iggørelse fjernes urinstoffet fra det ekstraherede fu-25 sionsprotein ved dialyse ved stuetemperatur natten over imod samme puffer uden urinstof.

Den tilsyneladende renhed af det opløseliggjorte fusionsprotein er i området 75-80%. Ca. 25 mg protein gøres opløseligt ud fra ca. 10-20 g fusionsprotein (våd vægt).

30 Hovedproteinet er blevet identificeret som det intakte fusionsprotein. Hovedproteinet med lavere molekylvægt er også afledt ud fra fusionsproteinet, da det indeholder den N-terminale region i PBOMP-1-proteinet fusioneret til PBOMP-2--proteinet, som bestemt ved epitopanalyse. 2/3 af det C-ter-35 minale af PBOMP-1 er gået tabt fra dette protein. Dette kan have været resultatet af proteolytisk sønderdeling, muligvis 108 DK 174965 B1 under tilskyndelse, eller af for tidlig afslutning af translation. Renheden af dette præparat er vist i fig. 32.

Fem voksne chinchillaer er blevet anvendt ved ét dyreforsøg. Forudgående blodprøver (på dag 0) opnået via 5 hjertepunktur før vaccination er blevet anvendt som en kilde til præimmune sera. 25 μg praktisk taget rent PBOMP-2:PBOMP--1-fusionsprotein, opnået ud fra celler af E. coli indeholdende plasmid pPX199 som ovenfor beskrevet, absorberet på alun injiceres intramuskulært i chinchillaeme. Blodprøver 10 indsamles 30 dage senere, og dyrene immuniseres igen på dag 30 med 25 ^g renset fusionsprotein på alun. Blodprøver indsamles igen via hjertepunktur på dag 60. Sera præpareres til ELISA- og baktericide afprøvninger. ELISA-afprøvninger gennemføres som ovenfor beskrevet ved som antigen at anvende 15 enten praktisk taget renset PBOMP-l (anti-PBOMP-l) eller en rekombinant form af PBOMP-2 (anti-PBOMP-2). Den baktericide aktivitet af serumprøverne afprøves som beskrevet ovenfor i afsnit 7.1. ved anvendelse af H. influenzae P860295, en klinisk, ikke-typebestemmelig stamme fremskaffet fra Dr.

20 Charles Bluestone, Children's Hospital of Pittsburgh, PA. Resultaterne af ELISA- og de baktericide aktivitetsafprøvninger er vist i tabel XVI.

TABEL XVI

25 Reaktion af chinchilla- -anti-PBOMP-2:PBOMP-l-antiseraa _ELISA-titer_

Blodprøve*3 Anti-PBOMP-lc Anti-PBOMP-2 BC-titer 30 Før 466 799 1:5

Efter 1* 970 20.297 1:40

Efter 2* 9.675 109.480 al:1280 a Detaljer ved immuniseringerne findes i teksten.

35 b Blodprøver er udtaget på dag 0 (før); på dag 30 (efter 1*) og på dag 60 (efter 2*). c Baktericid aktivitet imod H. influenzae P860295.

109 DK 174965 B1

Immunisering med 25 μg af fusionsproteinet PBOMP-2: PBOMP-1 har udløst en af de højeste titere af BC-aktivitet, som nogensinde er iagttaget i ansøgernes laboratorium, imod en ydermembran hos Haemophilus. Sammen med det høje niveau 5 af aktivitet, som er iagttaget ved ELISA-afprøvningerne imod både PBOMP-1 og PBOMP-2, viser resultaterne i tabel XVI, at PBOMP-2:PBOMP-1-fusionsproteinet er overraskende højt effektivt til fremkaldelse af en antistofreaktion imod både PBOMP-1 og PBOMP-2 hos chinchillaer. Disse resultater viser 10 endvidere, at fusionsproteinet frembringer en immunreaktion, som er biologisk aktiv ved en baktericid afprøvning imod en klinisk stamme af H. influenzae.

12.2. PBOMP-2 :PBOMP-1-fusionsprotein frembringer i kombina-15 tion med E-protein anti-Haemophilus-antistoffer.

E-proteinet er et andet ydermembranprotein hos H. influenzae, som har en molekylvægt på ca. 28.000 dalton. E-proteinet eksisterer som et lipoprotein i forbindelse med andre ydermembranproteiner hos H. influenzae..

20 E-protein fra H. influenzae er opnået i praktisk taget ren form som beskrevet i internationalt offentliggørelsesskrift nr. wo 90/10458. Kort fortalt isoleres cellehylstre fra celler af Hib stamme Eagan dyrket på enten hjerne-hjerte-infusionsmedium indeholdende 10 /^g/ml hemin 25 og l Mg/ml NAD (BHI/XV) eller mMIC (modifikation af mediet ifølge Herriott et al., 1970, J. Bacteriol. 101, 513-516). Celler høstes fra væskekulturer ved centrifugering ved 10.000 x g, 4°C i 10 minutter. Cellepelleten vejes og resuspenderes i 10 raM HEPES-NaOH (pH 7,4), 1 mM EDTA, med et volumen, som 30 er lig med 5 gange den våde vægt af cellerne. Cellerne itu-brydes ved anvendelse af en "Gaulin"-homogenisator. Suspensionen af itubrudte celler centrifugeres ved 10.000 x g i 5 minutter ved 4°C til fjernelse af ubrudte celler og store rester. Den ovenstående fraktion udvindes, og der tilsættes 35 NaCl til 0,5 M. Cellemembraner pelleteres ved centrifugering ved 100.000 xg i ca. 1 time ved 4eC.

110 DK 174965 B1

Et ydermembran-cellevæg-kompleks opnås ved fjernelse af indermembranerne fra den totale membranfraktion ved gentagen ekstraktion af den totale membranfraktion med 2% "Triton® X-100" i 10 mM HEPES-NaOH, 1 mM MgCl2, pH 7,4. Den 5 uopløselige rest, som indeholder ydermem-brancellevæg-kom-plekset, pelletiseres ved centrifugering ved 350.000 x g i 30 minutter ved 4°C. Dette kompleks resuspenderes derefter i 50 mM Tris-HCl, 5 mM Na2EDTA, pH 8, og opbevares ved 4°C.

Forurenende proteiner opløseliggøres fra cellehylstre 10 af H. influenzae ved differentiel detergensekstraktion som følger. Cellehylstre fremstillet som ovenfor beskrevet ek-straheres sekventielt to gange med 1% "Sarcosyl®" i 50 mM Tris-HCl, 5 mM Na2EDTA, pH 8. Denne ekstraktion gentages tre gange. De opløseliggjorte, protein E-holdige fraktioner 15 slås i pulje og ledes gennem en DEAE-kolonne ækvilibreret med 50 mM Tris-HCl, 5 mM Na2EDTA, pH 8. E-proteinet tilbageholdes ikke under disse betingelser, men hovedurenhedeme af protein tilbageholdes. De fraktioner, som falder igennem, og som indeholder E-protein, ledes derefter over en hydroxyl-20 apat i tkolonne, som er blevet ækvilibreret med 50 mM Tris-HCl, pH 8. E-proteinet tilbageholdes under disse betingelser. Hydroxylapatitkolonnen med det adsorberede E-protein vaskes derefter med ét kolonnevolumen 50 mM Tris-HCl, pH 8. E-proteinet elueres fra hydroxylapatitet med 1% "Zwittergent 25 3-14" i 0,3 M dibasisk phosfat, pH 8. Fraktioner indeholdende protein E slås i pulje, koncentreres ved diafiltrering og udfældes med ethanol. Det udfældede E-protein gøres derefter igen opløseligt ved differentiel detergensekstraktion. Udfældningen ekstraheres først med 1% octylglucosid i 50 mM 30 Tris-HCl, pH 8, og det uopløselige E-protein bliver tilbage i udfældningen. Derefter gøres protein E opløseligt med 1% "Zwittergent 3-14" i 50 mM Tris-HCl, 5 mM Na2EDTA, pH 8. E-protein fremstillet som ovenfor beskrevet er praktisk taget rent og i alt væsentligt frit for endotoxin.

35 25 μg af det praktisk taget rene E-protein blandes med 25 μg praktisk rent PBOMP-2 : PBOMP-1-fusionsprotein opnået 111 DK 174965 B1 som beskrevet i ovenstående afsnit 12.1., fortyndet i 0,85%'s saltopløsning og absorberet med alun.

Voksne chinchillaer injiceres intramuskulært med en portion af blandingen indeholdende 25 μg PBOMP-2:PBOMP-1-fu-5 sionsprotein og 25 μg E-protein. Blodprøver indsamles på dag 0 umiddelbart før første immunisering, på dag 30 før anden immunisering og på dag 60. ELISA-afprøvninger gennemføres som ovenfor beskrevet ved anvendelse af PBOMP-2:-PBOMP-1 eller E-protein som antigen. Baktericide afprøvninger 10 gennemføres som ovenfor ved anvendelse af H. influenzae P860295 som forsøgsstamme. Resultaterne af ELISA- og baktericide afprøvninger er vist i tabel XVII.

TABEL XVII 15

Reaktion af chinchilla--anti-PBOMP-2:PBQMP-l-anti-E-seraa _ELISA-titer_ 20 Blodprøve*3 Ant i -PBOMP-1 Ant i-PBOMP-2 Anti-E BC-titerc Før 385 578 <100 <5

Efter 1* 1423 64283 1137 160

Efter 2* 134988 277204 206959 >1280 25 a Detaljer ved immuniseringerne findes i teksten.

b Blodprøver er udtaget på dag 0 (før); på dag 30 (efter 1*) og på dag 60 (efter 2*). c Baktericid aktivitet imod H. influenzae P860295.

30 Resultater af ELISA-studierne viser, at reaktionen på E-protein er meget høj, idet der opnås niveauer, som kan sammenlignes med niveauet af PBOMP-2-delen af fusionsproteinet . Der iagttages ingen blokeringsvirkninger mellem E-protein og fusionsprotein. Biologisk aktivitet af disse antisera 35 måles ved anvendelse af BC-afprøvningen. 25 μg E har udløst en af de højeste BC-titere, som nogensinde er set i ansøgernes laboratorium, med antistoffer imod OMP'er af Haemophilus.

112 DK 174965 B1 BC-titeren er større end den hos de chinchillaer, som kun har fået fusionsprotein. Selvom det ikke er muligt at fastslå, at BC-aktiviteten af vaccinen med blandede antisera har udvist en synergistisk eller additiv virkning, er blan-5 dingens aktivitet lige så effektiv eller bedre end aktiviteten af fusionsproteinet alene. Disse resultater understøtter stærkt anvendelsen af en blanding af fusionsproteinet i kombination med det rensede E-protein som en vaccine imod Haemophilus.

10 13. Deponering af mikroorganismer.

De efterfølgende stammer af E. coli, som bærer de viste plasmider, er blevet deponeret hos Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL, og er blevet 15 tildelt følgende accessionsnumre: E. coli-stamme Plasmid Accessionsnummer JM 83 pAA152 B-18155 JM 83 pAA130 B-18154 20 JM 83 pGD103 B-18153 JM 103 pPX163 B-18285 PR 13 pPX167 B-18286 JM 103 pPX168 B-18287 JM 103 pPX183 B-18377 25 JM 103 pPX199 B-18530 DH5a pPX512 B-18531

Det vil forstås, at alle størrelser af basepar, som er angivet for nucleotider, er tilnærmelsesvise.

Claims (6)

113 DK 174965 B1 PATENTKRAV·

1. Praktisk taget rent, antigenisk peptid eller protein med en epitop af Haemophilus influenzae, kendetegnet ved, at peptidet eller proteinet er et fusions- 5 protein PBOMP-1:PBOMP-2 med en molekylvægt på ca. 30.000 dalton.

2. Peptid eller protein ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har en aminosyresekvens, som omfatter (a) en aminosyresekvens som vist i fig. 11 fra aminosyre- 10 rest 20 til aminosyrerest 153 og (b) en aminosyresekvens som vist i fig. 15 fra aminosyrerest 19 til aminosyrerest 154.

3. Praktisk taget rent, antigenisk peptid eller protein med en epitop af Haemophilus influenzae, kende- 15 tegnet ved, at peptidet eller proteinet er et fusionsprotein PBOMP-2:PBOMP-1 med en molekylvægt på ca. 30.000 dalton.

4. Peptid eller protein ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det har en aminosyresekvens, som omfat- 20 ter (a) en aminosyresekvens som vist i fig. 15 fra aminosyrerest 20 til aminosyrerest 153 og (b) en aminosyresekvens som vist i fig. 11 fra aminosyrerest 19 til aminosyrerest 154.

5. Praktisk taget rent, antigenisk peptid eller pro- 25 tein med en epitop af Haemophilus influenzae, kendetegnet ved, at det er et peptid eller protein ifølge krav 3, som er produceret af en bakterie Escherichia coli, som er deponeret hos NRRL og tildelt accessionsnummer B--18377.

6. Underenhedsvaccineformulering, kendeteg net ved, at immunogenet omfatter en effektiv mængde af peptidet eller proteinet ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5 blandet med et farmaceutisk bærestof.