JPH03143388A - 敗血症菌に対するワクチンと、敗血症菌の抗原の製造法と、これらの抗原またはワクチン製造用の新規なバクテリアおよびベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、鉄によって調節された外皮抗原タンパクを多
量に発現する病原菌を含む細菌類に属する細菌に関する
ものである。

本発明はさらに、これら細菌の製造方法に関するもので
ある。

本発明はさらに、鉄によって調節された外皮抗原タンパ
クを多量に発現する細菌、この細菌の断片またはこの細
菌によって発現された抗原を有効成分として含む抗菌性
敗血症ワクチンに関するものである。

本発明はさらに、上記抗原タンパクを発現可能なベクタ
ー細菌、ウィルス等と、上記抗原タンパりを有効成分と
して含むワクチンとに関するものである。

本発明はさらに、ワクチン接種を受けた生物中で上記抗
原タンパクを発現する再結合性の生きたワクチン、特に
細菌またはウィルスに関するものである。

従来の技術 ある種の乳酸桿菌を除くと、細菌を含む全ての生命体に
とって鉄は必須栄養分であるということは知られている
。細菌の場合には、宿主の細胞内で繁殖するために鉄が
必要である。細菌の毒性の主たる因子は生体内での細菌
のこの繁殖力である。

鉄は人体内に多量に存在しているが、細菌は、繁殖のた
めに、極めて限定された量の遊離鉄のみしか用いない。

動物宿主の鉄の大部分はくフェリチン、ヘモジブリンま
たはへムの形で）細胞間にあまので、近づき難い。また
、体液内に存在する少量の鉄は、極めて安定した錯体の
形でしか存在せず、主とじてに２つのキレ−１・化した
鉄の糖タンパク、すなわち血漿中のトランフェリンおよ
び分泌物中のラクトフェリンによって構成されている。

鉄に強力、しかも可逆的に結合しているこれらの糖タン
パクの存在によって、鉄が水酸化鉄の形で枕澱するの防
止され、鉄を細胞が利用することがが可能になっている
。

血漿はハプトクロビン−ヘム、セルロフラスミン、フェ
リチン、ラクトフェリンおよびトランスフェリンの形で
鉄の錯体を含んでいる。

この鉄の大部分はトランスフェリンによって運ばれる。

このトランスフェリンは主要な３種類：セリン−トラン
スフェリン、ラクトフェリンおよびオボトランスフエリ
ンに分類することができる。

トランスフェリンは血漿の鉄の約９５％を固定し、その
飽和度は健康な個体の場合約３５％程度にすぎない。

ラクトフェリンは鉄の飽和度が極やて低く、広範囲のｐ
＋＋でキレート特性を保持し、生体の全ての分泌物中で
の存在量、すなわち、微生物が侵入する可能性のある部
位でのそのレベルは、生体の他の場所に比べて大きく制
限されている。

鉄は糖タンパクと錯体化する結果、遊離の三価鉄の量は
極めて僅か（１０−”　Ｍ）であり、この量は細菌が正
常に増殖するためには全く不十分な量である。

細菌は、宿主の体内で繁殖するのに必要な量の鉄を獲得
するための手段をいくつか利用する。

ある種の微生物は、細菌の細胞表面と宿主に鉄を結合さ
せている蛋白質との間に直接関与可能な機構によって鉄
を獲得しているようである。しかし、鉄のこの直接獲得
法は、極めて少数の種類の細菌に限定されている。病原
菌を含めて大部分の細菌は、宿主内または好気性環境下
で、担鉄細胞（ｓ　１ｄｅｒｏｐｈｏｒｅ）　　と呼ば
れる鉄のキレート化物を作って鉄を獲得しようとしてい
る。

この担鉄細胞は、鉄イオンとの親和力が大きい特殊な錯
体を形成する低分子量の分子によって構成されている。

このバイオ合或は鉄によって調節され、その機能は細菌
細胞に鉄を補給することにある。

この担鉄細胞は３価の鉄イオンに対する親和力が極めて
高いくその結合定数は約１０”　Ｍ−’）ので、宿主の
蛋白質に結合した鉄を外しかり、水酸化物の形で３価鉄
を可溶化して沈着させる。

現在までに同定された担鉄細胞の大部分は２組の化学種
、すなわち、フェノラートーカテコラー）（２，３−ジ
ヒドロキシ安息香酸からの誘導体）と、ヒドロキサメー
ト　（ヒドロキサム酸からの誘導体）に分けることがで
きる。

フェノラートに属する最も良く知られた担鉄細胞はエシ
ェリキア属、クレブシェラ属、ザルモネラ属およびシゲ
ラ属の細菌が排泄するエンテロバクチン（ｅｎｔｅｒｏ
ｂａｃｔｉｎｅ）である。このエンテロバクチンは２３
−ジヒドロキシ−Ｎ−ベンゾイルＬ−セリンの環状３量
体からなり、三価鉄イオンに対して公知の最も高い親和
力（Ｋａ＝１０”Ｍ　’）を有する化合物である。

ある種の腸内菌は別のヒドロキサメートの担鉄細胞、ア
エロバクチン（ａｅｒｏｂａｃｔ　ｉ　ｎｅ）を合皮す
る。

この担鉄細胞は特に敗血症菌株によって作られるか、Ｃ
ｏｌ　Ｖ型プラスミドを含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ　ｉ
　ｃｈ　ｉ　ａｃｏｌｉ）、ねずみチフス菌（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｙｍｕｒｉｍ）および赤痢菌（
Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の侵入によって生成される。

これらの細菌による担鉄細胞の土台或は外皮の位置での
蛋白合成に関連する。この外皮の中には担鉄細胞のレセ
プタの役目をするものや、細菌内部への鉄の移動と浸透
を可能にする機構の役目をするものがなる。外皮内に作
られたこれらの蛋白質はしばしば鉄調節外皮膜”ＩＲＯ
ＭＰ”（Ｉｒｏｎ　ＲｅｇｕｌａｔｅｄＯｕｔｅｒ　Ｍ
ｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれている。

これらの蛋白質に共通な特徴は寸法が７０〜９０　ｋＤ
ａで、鉄を制限したインビトロ培地内でも感染した生体
内でも合成されるという点にある。

従って、これらの外被タンパクすなわち担鉄細胞レセプ
タが、細菌が鉄を獲得するためのいわゆる高い親和性機
構の第２要素を構成している（第１要素は担鉄細胞が構
成する）。

この高い親和性機構の他に、多くの細菌は低い親和性の
輸送機構を利用して、水酸化鉄の重合物を用している。

鉄のこれらの同化機構は、遺伝子操作の分野で最もよく
知られた微生物である大腸ｊｔＪ（Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃａｄｉ）　で特に研究されてきた。

大腸菌における鉄の高い輸送親和性の細胞内系では担鉄
細胞のエンテロハクチンを利用する。このエンテロバク
チンは、鉄を制限された環境下に大腸菌が置かれた時に
培地中に合皮され、分泌される。従って、三価鉄のエン
テロバクチン錯体は外皮の位置（８１ｋＤａのＦｅｐ　
Ａ蛋白質）に捕捉され、細胞質へ向かって送られる。内
部に入った鉄はエンテロバクチンの加水分解によって鉄
が遊離され、次いで二価鉄に還元される。

大腸菌のエンテロバクチン系は少なくとも１３の遺伝子
を含み、７つの遺伝子（ｅｎｔ）は担鉄細胞の生合成に
関与し、５つの遺伝子（ｆｅｐ）は輸送蛋白質をコード
する。

エンテロバクチン系の他に、大腸菌の敗血症菌株は担鉄
細胞ヒドロキザメートすなわちアエロバクチンを分泌し
、輸送する。

ウィリアムズ（Ｐ、Ｈ，ＷＩＬＬＩＡＭＳ）　＜３７）
は１９７９年１ごある種のＣｏｌ　Ｖ型のプラスミドは
、外皮の位置に担鉄細胞アエロバクターと、ｌｕｔ　Ａ
蛋白（７４ｋｌ］ａの蛋白質）と呼ばれるそのレセプタ
ーの遺伝子を有しているということを発見した。

アエロバクチンの鉄イオンとの結合定数はエンテロバク
チンより低いが、トランスフェリンまたはラクトフェリ
ンに結合された鉄を回収する能力が大きいという構造的
特性を持っている。

１９７９年ニウィリアムズ（Ｐ、ｌ−１，ＩＩＩＬＬＩ
八Ｍｓ）　へ明うかにして以来、アエロバクチンによる
鉄の輸送系が大腸菌やその他多くの病原菌株の閉力に決
定的な役割を果していることが極めて多くの研究によっ
て示された〔グリフイス達（ＧＲＩＥＦＦＩＴＨ）　（
１３）　：］。

担鉄細胞アエロバクチンが存在することは、病原菌株の
閉力に非常に好都合である。

アエロバクチンはエンテロバクチンより弱いキレート化
剤ではあるが、より多様な環境条件下においても活性が
大きい（エンテロバクチンは酸化とｐＨ変化に対して極
めて敏感である）ため、アエロバクチンは細菌により大
きな適応度を与える。

また、アエロバクチンは、大腸菌をキレート化剤の存在
下で培養した場合に、細菌の成長をより大きく刺激し、
恐らく、好ましい遺伝子誘導によって、エンテロバクチ
ンより早く分泌される。

細菌は、アエロバクチンオペロンによって、最小数の補
足遺伝子と、単純な小さな担鉄細胞であるアニロバクチ
ン合成層のみの４つの遺伝子と、外皮のレセプターをコ
ードする１つの遺伝子とにって、極めて効率の高い鉄の
輸送系を獲得する。

ヒドロキサメートの移動に必要な他の遺伝子は、基本的
に全ての大腸菌に存在している。

外被タンパクと、担鉄細胞レセプターと、対応する担鉄
細胞とをコードする全ての遺伝子の発現は単一の蛋白質
Ｆｕｒによって調節されろ。この蛋白質Ｆｏｒは、鉄が
十分な量使用できる時にはリプレッサーとして作用する
。この中央調節系に加えて、環境条件に応じて各系の発
現を変調する個々の調節系が付加される。

他の研究音速は、鉄が欠如した培地中でのＩＲＯＭＰの
発現を増加させるために、ジピリジルのような化学的キ
レート化剤を用いて細菌を培養した［ビンプリー７　（
Ａ、ＢＩＮＤＥＲＥＩＦ）達１’Ｃｏｌ　Ｖ担持大腸菌
のクロアシンレセプターはＦｅ”アエロバクチン系の部
分」ジャーナル　オブ　バクテリオロジー、（Ｊ、　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　１９８（］年、１５０号、
１４７２〜１４７５頁、マロルダ（Ｃ１ＭＡＲＯＬＤ＾
）達「内部侵入した大腸菌と７レキスナー赤痢菌内での
アニロバクチン鉄取込み系における染色体遺伝子のフラ
ンキングと内部の区域」ジャーナル　オブ　ミクロバイ
オロジー（Ｊ、　ＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ）　　１９３７年、１３３号、第２２６９〜２２７
８頁、ピンデレーフ（Ａ、　ＢＩＮ［］ＢＲ巳ＩＦ）達
ｒｃｏｌ　Ｖプラスミドのアエロバクチンを媒介とする
鉄量化系のクローニング」ジャーナル　オブバクテリオ
ロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　１９８３
年、第１５３号、１１．１．１〜１１１３頁、ロレンゾ
（口ｅ　ＬＯＲＥＮＺＯ）達「Ｋ１２大腸菌におけるＣ
ｏｔ　Ｖ　−Ｋ３０プラスミドのアニロバクチン生合成
と輸送遺伝子」ジャーナルオブ　バクテリオロジ−（Ｊ
、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　　１９８６年、５ １６５号、５７０〜５７８頁、ワルナー（Ｐ、　Ｗａｒ
ｎｅｒ）達「大腸菌の侵入菌株によるＣａｌ　Ｖプラス
ミド−特定アエロバクチンの合成」゛′感染と免疫”　
（Ｉｎｆｅｃｔ＋ｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）１
９８１年、３３号、５４０〜５４．５頁、グリイフィス
（ＩＥ、ＧＲＩＦＦＩＴＨ）達ｒＫ−１２大腸菌フレス
キナー赤痢閑ハイブリドーマと大腸菌の内部侵入菌株と
によるアエロバクチンおよび７６（１０）０ダルトンの
鉄調節外被タンパクの合成」゛感染と免疫（Ｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）”　１９８５年
、４９号、６７〜７１頁（この研究では、大腸菌の内部
侵入菌株がオボトランスフェリンの存在下で鉄の量を減
少させた培養液中でアエロバクチンおよび７６にの外皮
膜蛋白を生成することを示した）］。

細菌による鉄獲得系に関するこれら最近の知識を用いる
ことによって、病原菌に対して戦う新しい方法を開発す
ることが可能になった。

鉄輸送系を工夫して、細菌細胞内部に入れることができ
るような細菌に有害な担鉄細胞の類似体を合成する方法
が提案されているが、この合成キレート化剤は天然の担
鉄細胞よりも鉄（ＩＩＴ）　　に対する親和性が低いた
め、トランスフェリンの鉄を輸送させることは不可能で
ある。

ロジャース（ＲＯＧＥＲ３）は、アエロバクチンと３価
金属イオンとの錯体を形成させることによって、天然の
エンテロバクチン−ｐ　ｅ　３４″錯体に対する抗代謝
物として用いることを提案している。スカンジウム（Ｓ
ｃ”）およびインジウム（Ｉｎ”）　の錯体のみが抗細
菌活性を示している［ロジャース（ＲＯＧＥＩＩＳ）達
（２６）、ロジャース（ＲＯＧＥＲ３）　＜２７）　］
。

また、ある種の血清蛋白に担体分子の役目をする芳香族
分子であるフェノラート型の担鉄細胞を吸着させて、担
鉄細胞に対する抗体を誘導する方法も提案されている。

すなわち、バイヤー（ＢＹＥＲ８）　（５）は、魚に発
現した親水性アエロモナス（ヒトと魚の敗血症の原因と
なる細菌）が生産した担鉄細胞フェノラートに対するワ
クチンを記載している。この担鉄細胞は、ヒトアルブミ
ンまたは牛アルブミンと共有結合で結合されていたもの
である。この調製物で免疫した魚は担鉄細胞に対して反
応する抗体を作るが、この抗体が担鉄細胞を無力化する
かどうかは分かっていない。

ボリン（ＢＯＬＩＮ）達（４）は、大腸菌により敗血症
から七面鳥の保護する鉄によって調節させれた外被蛋白
に対する抗体によって一定の積極免疫状態での研究結果
を発表している。

しかし、有効なワクチンの開発を目的とした今日までの
試みは、鉄によって調節される外被蛋白を細菌培養によ
って細菌に十分な量で発現させるという点で全て困難な
課題に直面している。

発明が解決しようとする課題 本発明はこの課題を解するために、有効成分として、鉄
によって調節される外被蛋白を多量に発現する細菌、特
に担鉄細胞のレセプターを、これらレセプターによる担
鉄細胞の特定認識を妨害する抗体の生成を誘導するのに
十分な量でワクチン中で使用するものである。

本発明の目的の１つは、保護抗原として使用可能な鉄に
よって調節される外皮蛋白（ＩＲＯＭＰ）を発只 現する細菌を提供することにある。

本発明の他の目的は、遺伝子組換えによって鉄によって
調節される外被タンパクを敗血症菌から合成する方法を
提案することにある。

本発明のさらに他の目的は、遺伝子組替えによるタンパ
ク合成によって、大腸菌およびその他の属を用いて、Ｉ
ＲＯＭＰ　５Ｉｕｔ　ＡおよびＰｅｐ　Ａタンパク、担
鉄細胞レセプター、アエロバクチンおよびエンテロバク
チンを大量に製造することにある。

本発明のさらに他の目的は、遺伝子組替え、その他の方
法によって得られたＩＩＩＯＭＰおよびＪｕｔΔおよび
Ｐｅｐ　Ａタンパクを外被中に大量に含む細菌または細
菌断片を有効成分として含むウィルスを提供することに
ある。

本発明のさらに他の目的は、有効成分として、ＩＲＱＭ
Ｐ　、例えばＪｕｔ　Ａおよび／またはＦｅｐ　Ａ蛋白
またはこれら蛋白を有する抗原の調製物を含むウィルス
を提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明は、ウィルス製造に使用可能な鉄によって調節さ
れる外被タンパクを発現する細菌（その一部は担鉄細胞
のレセプターである）を利用する。

本発明によるこの細菌の特徴は、外被タンパク、特にト
ランスフエイノンレセプターと担鉄細胞レセプターとを
多量に発現して、これら蛋白質をワクチン中で使用した
時に、これらレセプターによる特定認識機能を妨害し且
つ病原菌への鉄の補給を停止させる抗臓の形成を誘導す
る点にある。

本発明で用いる細菌は腸内細菌であるのが好ましく、エ
ンテロバクチンおよび／またはアニロバクチン担鉄細胞
を分泌するものが好ましい。

これらの細菌は大腸菌（Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｉｌ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ　ｌａ）、ね
ずみチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｈｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｍ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅ１４ａ）からなる群か
ら選択するのが好ましい。

これらの細菌は、好ましくはアエロバクチンおよびとエ
ンテロバクチン担鉄細胞を一緒に分泌す９ 本発明の１実施態様では、これらの細菌は、自然に存在
株または研究用または標本としてで利用可能な菌株を、
外被タンパクの発現が十分に増大するレベルまで鉄の摂
取可能量を減少させた最低培地中で培養することによっ
て得られる。この培養は三価の＃（■）を強力にキレー
ト化するタンパク、例えばラクトフェリン等存在化で行
うのが好ましい。上記キレート化剤は、生体内の場合と
同様に、鉄の摂取量を制思する利点をを有している。

本発明はさらに、ウィルス製造に使用可能な上記細菌の
製造方法に関するものであり、この方法の特徴は、上記
細菌をトランスフエＩＪンのような三価の鉄（ＩＩＩ）
　のキレート化タンパク、特に、ラクトフェリンを含む
培地中で培養する点にある。

上記の最低培地としては、例えばシモン（ＳＩＭＯＮ）
およびテスマン（ＴＢＳＳＭＡＮ）　（３０）に記載の
培地を使用することができる。

しかし、通常使用されている鉄のキレート化剤の場合に
は、外被タンパクを十分に発現させるた１ めに、培養培地の鉄の含有量を大幅に減少させる必要が
あるため、上記の方法を実施するのは困難である。大抵
の場合、微量の鉄（例えば、−ＪＱにステンレス製の培
養タンクやパイプに由来する鉄）が残るため、外被タン
パクの発現を妨げる。従って、細菌が外被蛋白を発現で
きる量まで鉄の含有量を低下させるためには、かなり複
雑な方法を用いる必要があるため、実施にはコストがか
かる。

好ましい実施態様である本発明の第２の実施態様では、
外被タンパク、担鉄細胞レセプターを多量に発現する細
菌が組み換えプラスミドにより変換される。

この遺伝子組み換えによる外被タンパク、担鉄細胞また
はトランスフェリンレセプターの合或は下記のような多
くの利点がある： 〔１）培養培地の鉄の濃度とは無関係にこれらの蛋白を
多量に発現させることが可能である。

（２）　　出発菌株の他の構成要素を全て除いたこれら
の蛋白に対する直接的な免疫反応を研究することができ
る。

２ 〔３）鉄（ステンレス製の培養タンク、パイプ、各種装
置）が常に存在する環境下において外被蛋白を発現させ
る最も経済的な方法である。

本出願人は、特に、大腸菌てのＪｕｔ　ＡおよびＦｅｐ
　Ａ蛋白、担鉄細胞レセプター、アよりバクチンおよび
エンテロバクチンの合成に興味を持ったが、以下に説明
する遺伝子組み換え技術は、外被タンパク（ｌ　Ｒ［］
ＭＰ）、担鉄細胞レセプター（アエロバクチンおよびエ
ンテロバクチン）または大腸菌以外の病原菌のトランス
フェリンの合成にも同様に使用できることは理解されよ
う。

従って、本発明はさらに、遺伝子組み換えによる大腸菌
のｊｕｔ　Ａおよび／またはＦｅｐ　Ａ蛋白の製造に関
するものである。

このＩｕｔ　Ａ蛋白は下記の方法で合成することができ
る （１）アエロバクチン−オペロンを保持するチフス菌、
赤痢菌またはクレブシェラ病原菌の大腸菌株からプラス
ミドまたは染色体を分離し、（２）　　ｉｕｔ　Ａ遺伝
子を含む断片をプラスミドまたは３ 染色体から分離し、 （３）　　この断片をクローニングベクターと結合させ
、（４）発現ベクター（例えば、プラスミドＧＴＩ　（
１０）１）中にｉｕｔ　Ａ遺伝子と結合したクローンを
挿入し、 （５）　　クローン培養によってＩｕｔ　Ａ％蛋白を発
現させる。

また、上記Ｆｅｐ　Ａ蛋白質は下記の方法で合成するこ
とができる 〔１）　　プラスミド［例えば、ラールド（［、八Ｉ　
ＲＤ）　　とヤング（ＹＯＵＮＧ）　（１９）　によっ
て得られるプラスミドｐＭＳ　］または大腸菌、チフス
菌またはクレブシェラ閑の染色体からｆｅｐ　Ａ遺伝子
を含む断片を分離し、 （２）　　この断片をクローニングベクター内でクロー
ニングし、 （３）発現ベクター、好ましくはＪｕｔ　Ａ蛋白の発現
に使用されるベクター（プラスミドＧＴＩ　（１０）１
）中にハルＡ遺伝子を挿入し、 （４）　　クローン培養によってＦｅｐ　Ａ蛋白を発現
させ４ る。

Ｉｕｔ　Ａ蛋白および／またはＦｅｐ　Ａ蛋白の発現ベ
クターは細菌でよく、発現系が最も良く知られている大
腸菌を使用するのが好ましいが、他のベクター、特に、
当業者には製造方法が知られているウィルスまたは酵母
からなるベクターを使用することもできる。

Ｊｕｔ　Ａおよび／またはＰｅｐ　Ａ蛋白を発現する上
記細菌クローンは、発現を阻止または制限するのに十分
な低温度、通常３２℃未満て、適当な培地中で繁殖させ
ることができる。次いで、温度を４時間上げ、例えば、
４２℃にして発現を誘導して１ｕｔＡおよびｆｅｐ　Ａ
遺伝子を誘導させる。

こうして、Ｊｕｔ　ＡおよびＰｅｐ　Ａ蛋白と、これら
の前駆体である大きな寸法の細胞質を封入した形態のｐ
ｒｏｌｕｔ　ＡおよびｐｒｏＦｅｐ　Ａとが一体になっ
た細菌が得られる。

これらの細菌はワクチン中で有効成分として使用されて
、ｊｕｔ　ＡおよびＦｅｐ　Ａ蛋白に対する抗原の形成
が誘導される。この抗原はこれら蛋白が各５ 々のアエロバクチンおよびエンテロバクチンの担鉄細胞
の認識を阻止し且つ細菌への鉄の供給を大幅に減少させ
て、その繁殖を防ぐ役目をする。

従って、本発明はさらに、鉄によって調節される外被タ
ンパクを発現させる絹み換え細菌を有効成分として含む
ワクチンにも関するものである。

さらに詳細には、本発明は、有効成分として組み換え遺
伝子または遺伝子の断片、特にＪｕｔ　Ａおよび／また
はＦｅｐ　Ａ蛋白および／またはその前駆体ｐｒｏｌｕ
ｔ　Ａおよび／またはｐｒｏＦｅｐ　Ａを含む外被断片
、もしくは、ｔｕｔ　Ａおよび／またはＦｅｐ　Ａ蛋白
および／またはその前駆体、例えば、組み換え細菌の細
胞質または外被抽出物を含むワクチンを対象とする。

本発明の他の実施態様で提供されるワクチンは、鉄の量
が制限された環境下で培養することによって、ｊｕｔ　
Ａおよび／またはＰｅｐ　Ａ蛋白および／またはこれら
の前駆体の量が増加した敗血症菌の類縁菌、その断片、
その適当な抽出１＋ｔＡおよび／またはＦｅｐ　Ａ蛋白
（および／またはこれらの前駆６ 体）を有効成分として含んでいる。

これらのワクチンは、蛋白質型の鉄（ＩＩＩ）　　に対
する強いキレート化剤、特にトランスフェリン、ラクト
フェリンまたはオボフエリンを含む培地中で培養した細
菌を主成分として製造するのが好ましい。

本発明は、添付図面を参照して説明する以下の実施例に
よってより明らかとなろう。

７ 以下の説明で使用する略号は、次の意味を示す。

Ａｍｐ’　　　　抵抗性アンピシリン Ｃ１ｏ″　　　敏感性クロアシン ｄへＴＰ　　　　テ゛ソキンーアデノシンートリフォス
フェート ＢＤＴＡ　　　　エチレン−ジアミン−四酢酸Ｂｎｔ　
　　　エントロバクチン Ｅ、　ＯｌＰ、　Ｓ、　　特殊な病原菌体を除くＩＰＴ
Ｇ　　　　イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド ｋｐｂ　　　　Ｋ対塩基 ＬＢ　　　　　ルユリア培養液 ＯＭＦ　　　　外皮蛋白 ＰＡＧＢ　　　　塩基性ポリアクリルアミドゲルの電気
泳動 ｐｂ　　　　　塩基対 ＰＢＳ　　　　ホスフェート緩衝液（その食塩水溶液） ＳＯ３ドデシル硫酸ナトリウム ８ Ｔ Ｔ［ｉＭＥＤ ｒｙｓ ｔｅｔ’ シモン（Ｓｉｍｏｎ）　　とテスマン（Ｔｅｓｓｍａｎ
）Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ’　　−テトラメチレンジ
アミドリス−ヒドロキシ−アミノメチ ルーメタン 抵抗性テトラザイクリン 材料と方法 １、材料 １、虞巷 第１表に使用した菌株をまとめて示した。使用した病原
菌株は、子牛とひな鶏の敗血症菌株であり、菌研究所ロ
ーヌーメリュー（ＲＨＯＮ巳−Ｍ［ＥＲＩＢＵＸ）から
提供された。

クローニング、配列および発現に使用した宿主菌株は全
て大腸菌に１２由来のものである。

これらの菌は、他の野性の敗血症菌株や研究室の菌株に
容易に変えることができる。

２、プラスミド クローニングと発現に使用した菌株の起源と９ 特性を第２表に示した。

３、培地 シモン（Ｓｌｌ、ｌ０Ｎ）　　とテスマン（ＴＥＳＳＩ
、ＩＡＮ）　（３０）の最低培地 その組成を、以下に示す ＮａＣ１５，８ｇ ＫＣＩ　　　　　　　　３．７　　ｇ ＣａＣ１２，２Ｈ２（１０），１５ｇ ＭｇＣ１２，６Ｈ２（１０），１０ｇ ＮＨ，ＣＩ　　　　　　１．１０　　ｇＮａ２Ｓ０．　
　　　　０．１４２　ｇＫＨ２ＰＯ４０，２７２ｇ Ｔｒｙｓ　　　　　　　１１．２０　　ｇＨ２０ＱＳｌ
ｌ　　　　１（１０）０　ｍ　　　ｐ）１７．４唯一の
炭素源は、最終濃度１０　ｇ　／　１２で添加される琥
珀酸ナトリウムである。

この培地中での鉄を制限をするために、最終濃度２５０
μｇ／ｒｄ　（５（１０）μｇ／ｍｇ以上の濃度が可能
である）のオボトランスフェリン（ＳＩＧ０ ＭＡ＞を添加する。

鉄が豊富な対照培地は、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２０（Ｍ　Ｅ
ＲＣＫ）を最＃濃度４０μｇ　／　ｍｌで添加すること
によって得られる。

マニアティス（ＭＡＮＩＡＴＩＳ）の最低培地（２９〉
Ｎａ２ＨＰＯ４６，Ｏｇ ＫＨ２ＰＯ４３，０ｇ ＮａＣＩ　　　　　　　　　０．５　　ｇＮＨ４Ｃ１１
，０ｇ Ｈ２０ｑｓｐ　　　　１（１０）０　ｄ　　　ｐＨ７，
４この基本培地に以下のものを添加する：Ｍｇ　Ｓ　Ｏ
４１Ｍ　　　　　２ｍＲ／　１（１０）０ｍ＃グルコー
ス　２０％　　１０ｍＣ／１（１０）０−ＣａＣＬ２１
　Ｍ　　　　Ｏ，１−／　１（１０）０ｍ（１（１０）
Ｏが豊富な培地［マニアティス（ＭＡＮＩＡＴＩＳ）達
（２３）］ バタトトリプトン　　　１０　　　ｇ 酵母の抽出物　　　　　５ｇ ＮａＣ１５ｇ Ｈ２０ＱＳＩＩ　　　　１０１（１０）ＯｐＨ７，４（
２） （３） （４） ＢＴＳが豊富な培地（ＢＩＯＭＥＲＩＥＩＩＸ）バイオ
トリプターゼ　１７　　　ｇ バイオソヤーセ　　　　３ｇ ＮａＣ］　　　　　　　　　　５　　　ｇＫ２ＨＰ○４
２．５ｇ グルコース　　　　　　　２，５ｇ Ｈ２ＯＱＳｐｌｏｏｏ　ｍｅ　　　ｐＨ７，３ＢＨＩが
豊富な培地（心臓−脳、ＢＩＤ　ＭＢＲＩＥ［ＩＸ）子
牛の脳の注入物　　２（１０）ｇ 牛の心臓の注入物　　２５０ｇ パイオージェリドン　　１０　　ｇ ＮａＣｌ　　　　　　　　　　５　　ｇＮａ２ＨＰ　０
４　　　　　　２．５ｇグルコース　　　　　　　２．
０ｇ ’８２０　　ｑｓｐｌｏｏｏ　ｍｌ　　　ｐＨ７，４発
現培地用のｒＭ９　３ＰＪが豊富な培地ＳＰ　　　　　
　　　　　１（１０）ｄ（トリプトン３．２％、酵母抽
出物２％）Ｍ９　　（６，６Ｘｌ縮）１５− （０，２２μｍの濾紙で濾過（１（１０）０個の孔）２ Ｍｇ　Ｓ０４１（１０）ｍＭ　　　　　　　　１５ｍｅ
ＦｅＣＩ３０．１　ｍＭ　　　　　　　１．５ｒｄビタ
ミンＢｌ　（溶液５％＞１．５ｄ個体培地は対応する液
体培地と同様の組成てあり、培地ｌｌにつき寒天１２ｇ
を含む。

抗性物質は、個体培地と液体培地で以下の最終濃度で使
用される： アンピシリン　　　　２４　　μｇ／ｒｄ。

テトラザイクリン　　１２．５μｇ／ｍｌイソプロピル
ーβ−Ｄ−チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）は、
必要に応じて、最終濃度０．０５〜０．４ｍＭで添加さ
れる。

液体および個体培地の殺菌は２０分間１２０℃のオート
クレーブによって実施する。

抗性物質、ビタミンＢ１、コハク酸ナトリウム、Ｍ９（
６，６Ｘ）、Ｍｇ５Ｄ１、ＦｅＣ１５、ＩＰＴＧおよび
オボトランスフェリンの溶液を、濃縮貯蔵液の形で調製
し、孔寸法が０．２２μｍ　（１（１０）０個の孔）の
濾紙で濾過して殺菌する。

殺菌後、培養培地は室温で保存する。

３ 抗性物質、ＩＰＴＧおよびオボトランスフェリンの貯蔵
液は一２０℃に保つ。

その他の溶液は＋４℃に保つ。

＋１．　方法 １、細菌の培養 ＋３０℃で培養した発現ベクターｐＧＴ＋　（１０）１
の場合を除いて、クローン培養は全て撹拌下に＋３７℃
で１８時間実施する。

必要な場合には細菌の成長を分光光度計ベックマン（Ｂ
εＣＫＩＩＡＮ）　　ＤＵ　　４０を使用して６（１０
）ｎｍで懸濁液の混濁度を測定することによって評価す
る。

培養は通常はコロニー植付は後に容積２−の容積で実施
する。より大容積（２０〜１（１０）０−）での培養は
、予備培養で静止相に１／１（１０）で植付けた後実施
する。

４ 各々エンテロバタタークロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ
ｔ。

ｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）　　ＤＦ１３と、大腸菌１３（
１０）の菌株を使用して、デ　グラフ（ＤＩＥＧＲＡＡ
Ｆ）達く８）と（９）に記載の方法で実施した。

これらの菌株は、ＢＨＩ培地で、１−３７℃で、光学的
濃度が０．５（１ｃｍ、　６（１０）ｎｍ）になるまで
培養される。次に、この培養培地にマイトマイシンＣを
添加して、最終濃度を１μｇ／ｍｌ！にし、それによっ
てバタテリオシンの合皮を誘導することができる。培養
は、溶解相まで、６時間の間、＋３７℃で続行する。細
菌体を遠心分離して（８（１０）０Ｇ、３（ｌｎｍ、　
＋４℃）、上澄み液を回収する。次に、＋４℃で、徐々
に硫酸アンモニアを添加して、濃度を３６５　ｇ　／　
ｆｆにする。

上澄み液をｐ　Ｈ７，０の０．０５Ｍホスフェート緩衝
液に取り、この緩衝液を複数の連続した浴で透析する。

透析物を０．２２μｍ　＜１．（１０）０個の孔）で濾
過して、−２０℃に保つ。

研究したクローンの約１０’個の細菌を適切に選択した
抗生物質を含む寒天上に広げる。この５ 液が完全に吸収された後、ぺ）　Ｕ　（Ｐｅｔｒｉ）７
５　μｌの箱にバタテリオンン溶液の中心に置く。この
滴が乾くい後、ぺ）　’Ｊ　（Ｐｅｔｒｉ）箱を１８時
間保温器（場合によって＋３０℃か＋３７℃）に置く。

配置された位置で成長阻害を示すクローンが、バタテリ
オシンに対する感受性を獲得したことになる。反対に、
バタテリオシンの毒性作用に耐性のあるクローンは均一
な細菌マツプを示す。

３、鉄によって調節される外被タンパクに対する抗血清
の調製 使用した方法はボリン（Ｂｏｌ、ＩＮ）　　とジャンセ
ン（ＪＥＮＳＥＮ）　（４）に記載のものである。

鉄によって調節される外被タンパクは、ドデシル硫酸ナ
トリウムの存在下で、ポリアクリルアミドゲルの予備電
気泳動によって分離した。

ゲルの染色後、免疫化する前に、ＩＲＱＭＰを含む帯を
切断し、蒸留水の存在下で次第に直径を小さくした針を
連続的に通過させることによって粉砕した。

この粉砕物を第３表に示した手順で、ローヌメリ：ｚ　
−（Ｒｈｏｎｅ−Ｍｅｒ　１ｅｕｘ）社が培養したホワ
イト−′−ユージランド（Ｗｈｉｔｅ　Ｎｅｗ　２ｅａ
ｌａｎｄ）株のε、　ｏ、ｐ、　ｓ、　ｕ、兎に注射す
る。

他の外被タンパクに対する抗原と、リポポリサンカリア
トと、その他の大腸菌抗原とを除去するために、免疫の
ある兎から採取された血清をＩＲＱＭＰを発現しない大
腸菌株を用いて吸収させた。

次いで、血清Ｉ−当たり、３０分間１（１０）℃で熱不
活性化した細菌膜１０１０を添加し、１時間の間＋３７
℃でその混合物を培養する。

遠心分離後、上澄み血清を回収して、孔寸法が０，２２
μｍのフィルター（ミルポア）で濾過する。

その血清を一２０℃に保つ。

５、外被タンパクの抽出 外被タンパクの抽出に使用した方法は、パン−ｙ−イエ
ルー　メ７　クヘルト（ＶＡＮ　ＴＩＥＬ−ＭＥＮＫＶ
ＥＬＤ）７ 達（３６）と、フィス（ＦＩＳＳ）達〈１２）に記載の
方法である。

遠心分離後、細菌残滓をｐＨ８，０の０．２ＭのＴｒｉ
ｓ／ＨＣＩ緩衝液に入れ、光学的濃度を約１０にする。

次に、氷−エタノール浴に細胞懸濁液を保持して、超音
波を３度３分間撹拌して、音波化によって細菌細胞を破
裂させる。

細胞の破片と無傷の細菌を２０分間、＋４℃で遠心分離
５（１０）０　ｇによって除去する。

上澄み液中に懸濁している細菌膜を、６０分間、＋４℃
で超遠心分離１１０．（１０）０　ｇ　Ｌで回収する。

膜残滓は、シュナイトマン（ＳＣＨＮＡＩＴＭＡＮ）　
（２９）に記載の抽出緩衝液５ｍｌで回収する。この抽
出液はトリトンＸ−１（１０）２％、ＭｇＣ１ｚ　１［
１ｍＭ、　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　５０ｍＭ　ｐＨ８，０で
ある。

室温で、５分間撹拌しながら、３０分間培養する。培養
中、細ｌ包質膜タンパクをトリトンＸ１（１０）で可溶
化する。新たに超遠心分離（１１０，（１０）０ｇ　％
　６０ｍｎ、　＋　４℃）して外皮を回収する。得られ
た残滓を蒸留水で３回洗浄し、最終的に、蒸８ 留水１ｄに再度懸濁させ、保存のため一２０℃で凍結さ
せる。

６、蛋白質量の測定 膜抽出物の蛋白質濃度は、ローリイ（ＬＯ１１１’ｌＹ
）達（２０）に記載の方法による比色分析方法によって
測定した。

被測定蛋白質溶液０．５−に下記溶液を２．５ｍｅ添加
する １％ＣｕＳ○、溶液　　　　　　１− ２％酒石酸す）　ＩＪウム溶液　　１ｄ２％炭酸ナトリ
ウム溶液 ０、ｌＮ−Ｎａ　ＯＨ’　　　　　［１ｓ１］１０分間
室温で培養した後、５０％フォリン（ｐｏｌｉｎ）反応
剤（メルク（Ｍｅｒｃｋ）社）０．２５−を添加する。

３０分間室温で培養し、７７９　ｎｍで展開した青色染
色の光学的濃度を測定する。

牛血清アルブミ′ンで用意した標準品を用いてサンプル
の蛋白質濃度を測定する。

光学的濃度は５〜２（１０μｍ／−の範囲では、９ 蛋白質濃度に比例する。

ポリアクリルアミドゲルは、ルグテンベルグ（１、＋Ｉ
ＧＴ巳Ｎ肝ＲＧ）達（２１）に記載の特性によって製造
される。

アラインメントゲルの組成は下記の通りニアクリルアミ
ド−ビスアクリアミド （３０１０，８ｐ／ｐ）　　　５％ Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　　１３０ｍＭ　　　　ｐＨ６，８Ｓ
、Ｄ３　　　　　　　　　３．５ｍＭ過硫酸アンモニウ
ム　　４４　ｍＭ ＴＥＭＥＤ　　　　　　　８ｍＭ 分離ゲルの組成はアクリルアミド−ビスアクリアミド濃
度（８または１０％）と、Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ緩衝液３３
Ｑ　ｍＭ　ｐＨ８，８にした以外は上記配列ゲル組成と
同一である）。

使用したマイグレーション緩衝液の組成は下記の禮り： ０ グリツツ　　　　　　　１４．４　　ｇＴｒｉｓ　　　
　　　　　　　３．ＯｇＳＤＳ　　　　　　　　　１．
０　　ｇＨ２０Ｑ　Ｓ　Ｉ）　　１（１０）０　ｍｌ　
　ＩＩ）　Ｈ８，３電気泳動によって分析または精製す
べき抽出物を少なくとも下記の等しい容積の解離緩衝液
で希釈する： Ｔｒｉｓ　／ＨＣＩ　　１（１０）ｍＭ　　　　ｐＨ６
，８グリセロール　　　　　　　　２０％ＳＤＳ　　　
　　　　　　　　　７０ｍＭβ−メルカプト−エタノー
ル　１（１０）　ｍＭジブロモェノールブルー　　　７
５μＭこうして希釈した抽出物を５分間１（１０）℃に
加熱する。

外被タンパク組成物の分析の場合には各ピット蛋白質３
０〜５０μｇを置く。

予備電気泳動の場合には予備的な単位ピットに蛋白質２
ｍｇ以下を入れる。

マイグレーションは＋１４℃で、５時間、１６０Ｖか、
または、１４時間、６０Ｖで実施した（垂直１ ゲル装置ＬＫＢ）。鉄によって調節される外被タンパク
の溶離を増大させるために、一部の電気泳動は１６時間
、電圧１（１０）ｖで実施した。

電気泳動後、蛋白質を固定し、３０分間、室温で、メタ
ノール／酢酸／水（５０：　１０　：　５０ｖ／ｖ／ｖ
）混合物中で、クマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）　　ブ
ルー１．２ｍＭによって染色する。未固定の染料は３７
℃でメタノール／酢酸／水（４０：　１５　：　１４５
　ｖ／ｖ／ｖ）を用いて、複数の連続した浴で除去する
。発色ゲルを写真に取り、乾燥させる。

次に、各菌株の外被タンパクの特性はデンシトメータで
測定することができる［レーザーデンジトメ−ＬＫＢ　
　ウルトラスキャン（［ＩＬＴＲＡＳＣＡＮ）コ。

８、抗ＩＲＱＭＰ抗体の検出と分析 抗ＩＲＯＭＰ比抗体の存在は、マイクロプレートでエリ
ザ（ＥＬＴＳＡ）法によって求められる。

［アングハル（ＥＮＧＶＡＬＬ）　　とバール−ｙ　７
（Ｐ［ｉＲｌ、ＭへＮ）（１０）　；クルトン（ＣＤＩ
ＩＬＴＯＮ）　（７）　］。固定相に結２ 合した抗原はｐｒｏＦｅｐ　Ａ蛋白またはρｒｏ［ｕｔ
　Ａ蛋白が極めて豊富な分画である。

抗ＩＲＱＭＰ抗体の確認はペルオキシダーゼに結合した
兎の抗１ｇＧ　　（または、ニワ）　ＩＪの抗ＩｇＧ　
）の結合物［ノルデイック（Ｎｏｒｄ　ｉ　ｃ）社］を
用いて行う。使用した基質はオルトフェニレンジアミン
である。光学的濃度の測定は４９２ｎｍで実施した。

「ウェスタンブロツティンク（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
ｔｉｎｇ）　」法（すなワチ免疫測定法）ＳＤＳの存在
下でポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって分離さ
れた蛋白質をトービン（Ｔ［１ｌＱＢＩＮ）達（３４）
に記載の方法によって弗化ポリヒニリテン膜（ＰＶＤＦ
、０．４５μｍ、ミクロポア）上で移動させる。

この移動は、２４Ｖで、１時間、バイオリヨン（ＢＩＯ
Ｉ、ＹＯＮ）の装置で下記の陽極緩衝液と陰極緩衝液と
を使用して実施した 陽極緩衝液 Ｔｒｉｓ　　　　　　　　　　　　　　０．３　　ｇグ
リシン　　　　　　　　１．４４　ｇメタノール　　　
　　　　１（１０）−Ｈ２０ｑｓｐ　　　　　　５（１
０）　ｍｅ陰極緩衝液 Ｔｒｉｓ　　　　　　　　　　　Ｏ，３ｇグリシン　　
　　　　　　１．４４　　ｇＳＤＳ　　　　　　　　　
　０．１ｇ Ｈ２Ｏｑｓｐ　　　　　　５（１０）　ｍＲ移動後、Ｐ
ＶＤＦの膜を＋３７℃で１時間、脱脂乳１％を含むＰＢ
Ｓ緩衝液中で飽和させた。

次に、膜を各電気泳動トラックに対応する帯に切断する
。

被検査血清を脱脂乳１％を含むＰＢＳ緩衝液に希釈した
後、膜の帯と接触させる（帯当たり希釈された血清４−
）。

３７℃で静かに撹拌しながら１時間培養して、室温で、
脱脂乳２％を含むＰＢＳ緩衝液で２０分間、室温で３回
洗浄する。

脱脂乳１％を含むＰＢＳで１／１（１０）０に希釈した
ペルオキシダーゼに結合させた抗１８Ｇコンジュゲート
を各帯毎に３７の割合で添加する。

３７℃で静かに撹拌しながら（時間培養して、室温で、
ＰＢＳ緩衝液で２０分間ずつ３回洗浄する。

次に、３０容積の０，１％［（２０□をその場で添加し
たｐＨ７，］、５の生理的食塩水に０．１％に希釈した
ジアミノベンジジン基質を添加した後、栗色の帯が被検
査血清中に存在する抗体によって認識される蛋白質の位
置に出現する（５〜２０分）。

次に、膜を洗浄して、乾燥させる。

９、プラスミドＤＮＡの製造法 病原菌株が保持する大きなプラスミドをカド（ＫＡＤＯ
）達（１６）に記載の方法によって抽出する。

クローニング、部分クローニングおよび発現ベクターの
構築中の各段階で得られたプラスミドをビルンボイム（
ＢＩＲＮＢＯＩＭ）の方法［ビルンボイム（ＢＩＲＮＢ
ＯＩＭ＞とドリイ（ＤＵＬＹ）　（３）　］　によって
抽出する。いずれかの方法を実施して予備抽５ 出抜に得られたプラスミドＤＮＡを塩化セシウム勾配で
精製する［マニアティス（ＭＡＮＩＡＴＩＳ）達（２３
＞］　、。

精製後、プラスミドをＴｒｉｓ　１０ｍＭと、Ｅｌ）Ｔ
Ａ１ｍＭ　ｐＨ８，（ｌの緩衝液に入れ、１μ２当たり
の最終濃度をＤＮＡ　１μｇにし、貯蔵のため一２０℃
で凍結させる。

ＩＱ、ＤＮＡの分析と変性方法 クローニング、ＤＮＡの消化、アガロースゲルでの制限
断片の分析、制限断片末端の変更、ニトロセルロース膜
上へのＤＮＡ移動後の放射能法によるハイブリッド化に
用いた方法は全てマニアティス（ＭＡＮＩＡＴＩＳ）　
［マニアテイス（ＭＡＮＩＡＴＩＳ）達（２３）］　に
記載の方法である。ＤＮＡの配列と、オリゴヌクレオチ
ド合或は特殊な方法によって行った。

１１　　ＤＮＡの配列 シーケンサ−遺伝子をベクターＭ１３　ｍｐ１８　と６ ｍｐ１９で予備クローニングし［ヤニッヒーペロン（Ｙ
ＡＮＩＳＣＨ−ＰＥＲＲＯＮ）達（３８）］　、ジデソ
キシヌクレチドによる鎖の末端技術［サンジャー（ＳＡ
ＮＧＥＲ）達（２８）］　によって配列した。異なる鎖
の標識化は”Ｓ　　ｄＡ、ＴＰ［アメルンヤム　（ＡＭ
ＥＲ５ＩＩＡＭ）コを用いて行った。

いわゆる配列（シーケンシング〉　は、」二記反応剤と
、アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）シーケンス化酵素
キットと、シケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）　　（Ｕ
　ＳＢ）とを使用して実施した。尿素の存在下でのポリ
アクリルアミドのゲル電気泳動は、セキサン（Ｓｅｑｕ
ｉ−Ｇｅｎ）装置で実施した。

シーケンスデータの処理はマイクロジエニイ（Ｍｉｃｒ
ｏｇｅｎｉｅ）　（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使
用して実施した。

１２、オリゴヌクレオチドの合成 発現ベクターまたは変異原での構築に必要な各種オリゴ
ヌクオチドは、アプライドシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　
Ｓｙｓｔｅｍｓ＞３８１−Ａ装置でシアノーエチ４フ ルーホスホルアミシト法によって合成した。

これらのオリゴヌクレオチドは、保護基を外した後、エ
タノールで沈澱させて直接使用した。

１３、向変異原技術 変異原は、エックスティン（ＥＣＫＳＴＥＩＮ）　［テ
ーラ−（ＴＡＹＬＯＲ達（３３）、ナカマエ（ＮＡＫＡ
ＭＡＹＥ）とエックスティン（［ＥＣＫＳＴＢＩＮ）　
（２４）　］　に記載の方法によってアメルンヤム（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）社から市販の向変異原キットを使用し
て実施した。

亙迷 １、　ｉｕｔ　Ａ遺伝子の単離と分析 アエロバクチンオペロンの存在は菌株１５３９３．１５
９７２および１６（１０）３に担持されたプラスミドか
ら見い出した。

これらのプラスミドを、塩化セシウム勾配で精製した後
、制限酵素Ｂａｍ　ＩＩ、Ｈｉｎｄ　ｌ［、Ｐｖｕおよ
びＳａｌ　Ｉ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）によって消化
する。

各プラスミドの各種制限断片を０．８％アガロ−ＩＩＩ
　　只 スゲルで分離し、ニトロセルロース膜上でザザーンブロ
ッティング法［ザザーン（ＳＯ［ＩＴＨＥＲＮ）（３１
）］　によって移動させる。次いで、各断片をｐｃｏｌ
　Ｖ　Ｋ２Ｏのアエロバクチンオペロンヲ担持したプラ
スミド制限断片ｐへＢＮＩから作った２つの放射化プロ
ーブ〈３２Ｐで標識化）を用いてハイプリント化する（
ピンブリーフ（ＢＩＮＤ８ＲＥＩＦ）　　とネイランド
（ＮＢＩＬＡＮ［ｌ）　（２＞］。ＩｕｔＡレセプター
をコードする遺伝子は、［ｉ、６ｋｂのＢａｍ　Ｈｌ　
−Ｂａｎ旧制旧制性断片二の全てのプラスミドに存在す
ることが分かった。この結果から、ｐＣｏｌｖ−に３０
に等価の断片からこの遺伝子を二次クローニングした研
究者の研究が確かめられるＥクローネ達（ＫＲ［］ＮＥ
）　（１７）］。

菌株１５３９３．１５９７２および１．６（１０）３の
プラスミドは、Ｂａｍ旧制限酵素によって消化される。

０．８％アガロースゲル電気泳動後、各プラスミドの９ ６、６ｋｂの寸法の断片を含む帯を切断してＤＮＡを電
離する。

３つの断片Ｂａｍ　８１−Ｂａｍ旧、６．６ｋｂを、Ｂ
ａｍ１」１によって消化されたρａＴ　１５３ベクター
内で別々に結合させる。３つの結合混合物は、有効細菌
ＨＢＩＯＩを転換するのに用いる（第４表）。

アンピシリン耐性があり、テトラサイクリン感受性のあ
るクローンからＤＮＡを抽出し［ピルボイム（ＢＩＲＮ
ＢＯＩＩＩ）とドリイ（ＤＯＬＹ）の技術］、Ｂａｍ　
１１１で消化して挿入寸法を確認する。６，６ｋｂの断
片を含むクローンをクロアシンＤＦ１３に対する感受性
を基に選択する。

各出発プラスミド用に、クロアシンに感受性のあるクロ
ーンを後の分析と構築のために保持した。そのクローン
を、以下に示す。

菌株１５３９３　　　クローン　ＨＢ　　１０１ρ５−
１５閤株１．５９７２　　　クローン　ＨＢ　　１０１
１１　Ｐ−１３菌株１６（１０）３　　　クローン　Ｈ
Ｂ　　１０１　ｐ　４−１８０ クローンの分析 ｌｕｔ　Ａレセプターの発現の研究 クロアシンに対する感受性検査によって求めていたクロ
ーンが選択できたという事実は、クロアシンとアエロバ
クチンに対するレセプターの発現があるということを示
ず。断片Ｄａｍ　ＨＩＢａｍ　ｌ（ｌ　６，６ｋｂに担
持されたｉｕｔ　Ａ遺伝子の発現は、恐らく、この断片
に位置する弱いプロモーターによるものであり［クロー
ネ（ＫＲＯＮＢ）達（１７）］　、アエロバクチンオペ
ロンの主要プロモーターの場合のように鉄濃度によるも
のではない。すなわち、クロアシンへの感受性は、鉄が
豊富な寒天ＬＢ−アンピシリンで培養することによって
証明される。

Ｊｕｔ　Ａレセプターの発現レベルを研究するために、
各種のクローンをオボトランスフェリンの存在下（５（
１０）μｇ　／ｄ）または非存在下でＬＢ−アンピシリ
ン培地で培養した（＋３７℃で、−夜）。

３つのクローンの外被タンパクを抽出し、Ｓ１ ＤＳの存在下でポリアクリルアミドゲルで分析した。

クロアシンに感受性のあるクローンでは、培養条件にか
かわらず、７６ｋＤａの以上の蛋白質の発現は観察する
ことができなかった。

制限地図 クローン４−１８．５−１５およびＰ−１３のプラスミ
ドＤＮＡを多量に抽出して、塩化セシウム勾配で精製す
る。

３つの断片Ｂａｍ　ＩＩＩ　−Ｂａｍ　Ｈｌ　６．６ｋ
ｂの制限地図を、酵素口ｇｌ　ＩＩ、　　Ｂｓｔ　　Ｆ
　　ＩＩ、Ｃ１ａ、　Ｉ、　Ｂｃｏ　Ｒ１，１（ｐｎ　
１ＳＰｓｔ　ｌ、　Ｐｖｕ　ＩｆおよびＳｍａ　ｌ　を
使用して作った。

これらの３つの地図は、互いに厳密に同一であり、ピン
ブリーフ（ＢＩＮ［１ｌＥＲＩＢＦ）　　とネイランズ
（Ｎ［ＥＩＬＡＮＯ３）　（１，２）およびクローネ（
ＫＲＯＮＢ）達（１７）によって発表された地図による
ｐｃｏｌＶＫ３０のアエロバクチンオペロンの断片Ｂａ
ｍ　ＨＩＢａｍ　Ｈｌ　６．６ｋｂの制限地図に対応す
る。

２ これらの４つの地図を第５表に示した。

ｉｕｔ　Ａ遺伝子の配列 ３つの断片Ｂａｍ　Ｈｌ　−Ｂａｍ　Ｈｌ　６．６ｋｂ
の制限地図と、ｉｕｔ　Ａ遺伝子の配列から演縄された
制限地図［クローネ（ＫＲＯＮＥ）達（１８）　］　と
を比較すると、ｉｕｔ　Ａ遺伝子は、制限断片Ｂｓｔ　
Ｅ　ＩＩ−口ｓｔε■、３、２ｋｂ上に完全に局部化さ
れているのが分かる（第４表）。

この断片を電気溶離によって分離し、Ｔ４ファーズのり
ガーゼでそれ自体に再結合させ［ボーリンガ−（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ）］　、複数の制限酵素系で消化された
。こうして得られた各種断片（寸法１５０〜６（１０）
ｐｂ）をゲネクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）　（バイ
オ（ＢｉｏＨＯｌ）で分離し、予め適切な酵素で消化さ
れたベクターＭ１３　　ｍｐ１９と、ｍｐ１９内で二次
クローニングした後、アメルシャム（＾ｍｅｒｓｈａｍ
）とシケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）のシーケンス化
キットを使用して、サンジャー（ＳＡＮＧＥＲ）法によ
って各二次クローニングの配列を決定した。

３ クローンＰ−１３の断片Ｂｓｔ　Ｅ　ＩＩ　−Ｂｓｔ　
Ｅ　ＩＩ、３、２ｋｋｌのみが完全に配列される。他の
２つの１ｕｔＡ遺伝子は、Ｂｇｌ　　ＩＩ（１）　　サ
イトと、Ｅｃｏ　Ｒν２３９６）サイトとの間で配列さ
れる。

クローンＰ−１３のＢｓｔ　Ｅ　ＩＩ　−Ｂｇｌ　　Ｉ
［領域を、ｕｔ、Ａの上流に位置するｉｕｃ　Ｄ遺伝子
の配列と比較し［ヘレッロ（ＨＥＲＲＥＲＯ）達（１４
）］　、このクローンのＰ、ｖｕ　ＩＩ　−Ｂｓｔ　Ｅ
　ＩＩ領領域ＩＳ１エレメントの配列と比較した［オー
ツボ（ＯＨＴＳ［ＩＢＯ）　　とオーツボ（ＯＨＴＳＵ
ＢＯ）　＜２５）］。

これらの比較並びに３つのｉｕｔ　Ａ遺伝子の配列とｐ
ｃｏｌ　Ｖ　−Ｋ２Ｏのｉｕｔ　Ａ遺伝子の配列との比
較とを第７表に示した。

これらの４つの配列を分析することによって、ｉｕｔ　
Ａ遺伝子が分子レベルで極めてよく保持されていること
が分かった。出発動物の大腸菌株に近い１つまたは２つ
の塩基では、３つの１ｕｔＡ遺伝子は互いに同じである
。クローネ（ＫＲ［１ＮＥ）達（１８）によって発表さ
れた配列に対する差異は極めて小さい。

４ 検査した３つのｉｕｔ　Ａ遺伝子の９９７％は、ｐｃｏ
ｌ　Ｖ　−Ｋ２Ｏのｉｕｔ　Ａ遺伝子の類縁体である。

差異を確認した領域は第８表に示した（数字は第７表に
示した配列中の塩基の位置を示す）。

２つの重要な領域は厳密に保持されている。

すなわち、ペプチド信号をコード化する配列とＴｏｎ　
Ｂに機能が依存する外被タンパクレセプタに典型的な交
感配列（Ｔｏｎ　８箱）は厳密に保持されている。

３つの各遺伝子配列において、Ｃｏｌ　Ｖ−に３０のｉ
ｕｔ　Ａ遺伝子に対して４つが挿入されたことが明らか
になった。これらの挿入によって、読み取り範囲は一定
の制限された変化が生じる。

従って、使用した菌株から単離されたプラスミドによっ
てコードされたｔｕｔ　Ａ蛋白質の主要構造はｐｃｏｌ
　Ｖ−に３０の蛋白質より少し長くなる（＋８アミノ酸
）。使用した菌株から単離されたｉｕｔ　Ａ遺伝子の配
列は、菌株Ｃｏｌ　Ｖ　−Ｋ２ＯのポリペプチドのＪｕ
ｔ　Ａの配列に等しい２５個のアミノ酸のペプチド信号
で構成される７３３個のア５ ミノ酸のポリペプチドをコードする。成熟した蛋白質の
言１算質量は７８０９７ダルトンであり、ゲル（７６ｋ
Ｄａ）　で観察された質量とは僅かに異なる（７’６ｋ
Ｄａ）が、主要構造の変化はあまり大きくないので、二
次構造と親水性の特性を変化させることはない。

６ ２、　ｉｕｔ　Ａ遺伝子とｆｅｐ　Ａクローンの発現使
用したベクターの特性 使用した発現ベクターは、アンステイテユ　メリｓ　−
（ｌｎｓｔｉｔｕｔ　Ｍｅｒｉｅｕｘ）の遺伝子工学研
究所のによって構築されたプラスミドＧＴ１（１０）Ｉ
である。

このベクターが有する遺伝子と制限地図を第９表に示し
た。

このプラスミドは、以下のように構築される。

ｐＢＲ３２２＋ごよって構成されるプラスミドｐＢＲＴ
ＡＣ［ポリバー（Ｆ、　Ｂｏｌ　ｉ　ｖａｒ）達「遺伝
（Ｇｅｎｅ）　Ｊ第２号、９５〜１１３頁、１９７７年
」は、旧ｎｄｌＩと、ＢａｍＨｌとの間でプロモーター
Ｔａｃ　［アンマン（０，八ｍｍａｎｎ）達「遺伝（Ｇ
ｅｎｅ）　」第２５号、１６７頁、１９８３年コを増殖
させ、フレノウ（Ｋｌｅｅｎｏｗ）のポリメラーゼによ
ってによって破壊されたプラスミドｐＢＲＴａｃＸ−を
与えるサイトＸｈｏｌ　を有する。このプラスミドはＮ
ｃｏｌによって消化され、フリーナラ（ｋｌｅｅｎｏｗ
）　　によって処理れ、次に、アバル（Ａｖａｌ）によ
って消化され、その最も小さな断片がｐＭＣ９の断片に
結合される［カサダバン（Ｍ、　Ｊ、　Ｃａ５ａｄａｂ
ａｎ）達「細菌学誌」７ （Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
第１４３号、９７１〜９８０頁、１９８０年］。このｐ
ＭＣ９は、Ｍｓｔ　■によって消化れ、フレナラによっ
て処理され、次に、Ｌａｃ　ｉ遺伝子とρＢＲ３２２の
複製原を有するＡｖａｌによって消化されたものである
。

その結果生じたプラスミド（ｐＢＲｌ、ａｃｉＸ−と呼
ぶ）は、旧ｎｄｌｌｌ　によって消化され、フレナラに
よって処理され、次に、Ｐｓｔｌによって消化され、２
３５０塩基対の断片を２３（１０）塩基対（すなわち’
ｐｂ”）断片に結合され、ＢｃｏＲＩ　によって消化し
て２３（１０）ｐｂとし、次いで、フレナラによって処
理し、次に、Ｐｓｔｌによって消化したものである。こ
のようにして、プラスミドｐＢＲＴａｃｉ　を製造する
。ＥｃｏＲｌ　とＰＳｔｌによる消化によって得られた
このプラスミドｐＢＲＴａｃｉの４４０６ｐｂ断片は、
ｐＢＲ３２２の配列から誘導された且つｐＢＲ３２２の
テトラサイタリン耐性の遺伝子を有するＥｃｏＲｌ　と
Ｐｓｔｌとによって消化された１、６８８ｐｂ断片にに
結合される。

得られたプラスミドは、ｐＢＲＴａｃｉＴｅｔと命名し
た。

このプラスミドの複製源は、ＢａｍＨＩ　による消化に
８ よって分離され、残った２０９６ｐｂ断片はＸｈｏｌに
よって消化されたｐＡＴ１５３の２（１３３ｐｂの断片
［ライラグ（Ａ、　Ｊ、　Ｔｗｉｇｇ）とシェラット（
Ｄ、　５ｈｅｒｒａｔｔ）、の「自然（Ｎａｔｕｒｅ）
　Ｊ第２８３号、２１６〜２１８頁、１９８０年］に結
合されて、プラスミドｐＡＴＴａｃ　ｉＯｒ　ｉが製造
される。

このプラスミドを１３ｃｏＲ１によって消化し、フレナ
ラによって処理し、＾ｖａｔによって消化し、２７０４
ｐｂ断片をプロモータＰｒと、Ｐｓｔｌによる消化、ヤ
エナリヌクレアーゼによる処理及び＾ｖａｌによる部分
消化によってＩ］Ｃ［ｌＶ２から生じた３７０６ｐｂの
ラムダバクテリオファージのその熱感受性のあるリプレ
ッサーＣｌ８５７　とに結合させる［クイ−ン（（：、
　Ｑｕｅｅｎ）達「分子適用遺伝字詰　（Ｊ、　Ｍｏｌ
、八ｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、）　、）第２号、１〜１０頁
、１９８３年コ。その結果生じたプラスミドをｐＧＴＩ
ｏｏｌ　と名付ける。

このプラスミドの複製源は、ｔａｃプロモーターに制御
されており、それによって濃度の多少はあれＩＰＴＧ　
（ｌａｃ　ｉ遺伝子の誘導剤）を含む培地中で細菌を培
養しながら、コピー数を制御することが９ できる。

発現すべき遺伝子は、ファージＣ１８５７の強いプロモ
ーター（Ｐｒ）　（そのリプレッサーは熱感受性がある
）。発現すべき遺伝子のＡＴＧは、遺伝子二ＡＴＧによ
って置換される。このＡＴＧをｐ　ＧＴＩ　（１０）１
のＢａｍＨＩ　による部分消化に続いて、ｌ・ング　ベ
ン（ＭｕｎｇＢｅｎ）ヌクレアーゼによって消化して、
両端が平らな（フランクな）ＡＴＧが得られる。

次に、発現すべき遺伝子を上記の平端へＴＧの端部とＸ
ｈｏ１部位との間に〈第２コドンから）鞘状に挿入する
。このＸｈｏ１部位のちょうど後方に位置する転写終了
信号は、長すぎるＡＲＮメツセンジャーが形式されるの
を防ぐ。

ｉｕｔ　Ａ遺伝子（またはｆｅｐ　Ａ）を表現すること
のできるこの種の他のプラスミドを得ること、すなわち
、構築は容易である。発現すべき遺伝子がそのリプレッ
サーが熱感受性のあるプロモーターによって制御されて
いるこのようなプラスミドは公知である。

０ ｉｕｔ　Ａ遺伝子の発現ベクターの構築菌株１５９７２
と１６（１０）３から単離されたｉｕｔ　Ａ遺伝子を、
ｐ　ＧＴＩ　（１０１のＢａｍ旧の発現部位（８９９）
でそれらの配列信号でクローン化する。

配列信号の第２番目のアミノ酸で始まる平滑端部５′　
を得るために、二重鎖合成オリゴヌクレオチドを用いて
、初期ＡＴＧとコード化配列の５・　位置の単一位置Ａ
ｃｃ　ｌ　との間の領域を置換した。

このオリゴヌクレオチドの相補二重鎖が合成した。二重
鎖の形は、ＮａＣｌ３０ｍＭ、　ＴｒｉｓｌＯｍＭＳＭ
ｇＣｌｌｏｍＭで、ｐＨ７、５の緩衝液で９０℃で加熱
し、室温にゆっくりと冷却することによって得られた。

菌株１５９７２のｉｕｔ　Δ遺伝子（りｏ　−ンｐ　Ｐ
−１３）を挿入するための方法を第１１表に示した。

収率があまり十分でなかったので、方法を変え、菌株１
６（１０）３のｉｕｔ　Ａ遺伝子の位相化を採用した。

この新規な方法は、ｐＳＢ　１１８のベクター中での中
間構築物のＢｃｏ　Ｒ１−Ｂｃｏ　Ｒ１領域の二次クロ
ーン化を利用する（第１２表、第４段階）。このベクタ
ーは、誘導体ｐｕｃ　１８である。このベクターは、２
つ１ の部位Ｅｃｏ　Ｒ１によって囲まれた「ポリリンカー」
を有する。従って、このベクター中の断片Ｅｃｏ　Ｒ［
εｃｏ　Ｒ１の二次クローン化によって、部分消化を避
けて、ｉｕｔ　Ａ遺伝子の位相化が実施される（第１２
表）。

このようにして得られた発現プラスミドＧＴＩ　Ｒ２（
菌株１５９７２のｉｕｔ　Ａ遺伝子）とＧＴＩ　Ｂ−５
（菌株１６（１０）３のｉｕｔ　Ａ遺伝子）を第１３表
に示した。

二重鎖のオリゴヌクレオチドｉｕｔ　と新たに結合させ
て得られたクローンをｉｕｔ　Ａ遺伝子の八ｃｃ　１部
位の保持とｐ　ＧＴＩ　［１０１のＢａｍ旧部位の消滅
に基づいて選択した。次に、この制限特性を示すクロー
ンは、全部、蛋白質１ｕｔ　Ａの発現の位置で制御され
た。

Ｊｕｔ　Ａの発現の制御 性質上の制御 選択されたクローンは、ＩＰＴＧ　　０．４ｍＭの存在
化のＭ９　　ＳＰ　　テトラサイクリン培地で３２℃で
培養した。このクローンのクロアンンに対する感受性を
上記の技術によって検査した。

２ ２５個のうち２つのクローンは、ＧＴｌ−ｉｕｔ　１５
９７２の構築に陽性である。

６個のうち３つのクローンは、ＧＴＩ−ｉｕｔ　１６（
１０）３の構築に陽性である。

クロアンンに感受性のあるクローンをＩＰＴＧｏ　４ｍ
ｌ、ｌを含むＭ９　　ＳＰ　　テトラサイタリン培地５
Ｏｍｅ中で培養した。

光学的濃度が数値１に達するまで、温度３０℃まで培養
を実施した。次に、＋４２℃で、４時間培養を続けて、
遺伝子ｉｕｔ　Ａの発現誘導を実施した。

細菌を遠心分離して、その蛋白質全体をポリアクリルア
ミド−３ＤＳゲルての電気泳動によって分析した。これ
によってＪｕｔ　Ａ蛋白質の製造量を直接測定すること
ができる（第１図）。

クローンＣＭＫ　６０３　ＧＴＩ　Ｐ−２の蛋白質の分
析によって、蛋白質１ｕｔ　Ａとその前駆体は、誘導後
、細菌の全蛋白質の２５％を占めることが分かった。蛋
白質ｊｕｔ　Ａだけは、外被タンパク３０％を含む。

３ ｆｅｐ　Ａ遺伝子の発現ベクターの構築初期クローンｐ
　ＭＳ　１０１の特性 ラールド（１，ＡＩＲＤ）　　どヤング（ＹＯＵＮＧ）
　（１，９）　　によって構築されたプラスミドｐＭ３
１．０１の６．３ｋｂの断片Ｂａｍ　ｌｌ−１ｌ−Ｂａ
　Ｒ１上にｆｅｐ　Ａ遺伝子が位置することを示唆した
コデール（Ｃ［１ＤＥＲＲＥ：ｌ　どイヤーハート（Ｅ
ΔＲＩＩＡＲＴ）　＜　６　＞の結果によると、この断
片はＢａｍ旧によって消化されたベクターｐＢｌｌ　３
２２中で二次クローン化されている。得られたプラスミ
ドの制限地図（Ｆ−１）　　は、プラスミドｐｌＴｓ　
１の制限地図（フレミング（Ｆｌ、ＥＭＩＮＧ）達（１
１））　　に類似していることが分かった（第１４表）
。

ｆｅｐ　Ａの配列の公開［ルンドリガン（Ｌ［ＩＮＤＲ
ＩＧＡＮ）とカングー（ＫＡＮＤＥＲ）］　によって、
この遺伝子をプラスミドＦ−１の塩基対２５３　［１の
制限断片Ｓｓｐ　ｌ−３ｔｕ　１２５３０上に正確に配
置することができる。

以下の方法を使用して、ｆｅｐ　Ａ遺伝子をｐ　ＧＴＩ
ｏｏｌ　に挿入した。

配列を変換するコード化領域の５・　端部て突然変異を
起こさせた ４ ５・　八ＴＧＡＡＣＡＡＧ　　　３ Ｈｐａ　Ｉの制限部位で、 ＭεＴ　八５ｌｌｌ　　ＬＹＳ ＧＴＴ八八へへ八へ への部位を以下のように平滑端ＧＴＴ　ＡＡ　［’で切
断する。これによって、ｆｅｐ　Ａ遺伝子を直接ｐ　Ｇ
ＴＩｏｏｌ　中に形成された端部ＡＴＧと結合させるこ
とができる。

ファージｌ　ｍｐｌ、９の複製形での断片Ｓｓｐ　１−
Ｅｃ。

Ｒ１８（１０）の二次クローン化後、オリゴヌクレオチ
ドからエックスティン（ＥＣＫＳＴ［ＥＩＮ＞法によっ
て、突然変異させた（第１５表）。

突然変異した断片を完全に配列して、その配列は目的の
部位以外は全く変更されていないことを確かめた。

ｆｅｐ　Ａ遺伝子の組込み方法を第１６表及び第１７表
に示した。

プラスミドＧＴＩ　（１０）１　マノ２３５０塩基対ｃ
７）　断片Ｈｐ　ａ　ＩＸｈｏｌの結合によって得られ
た種々のクローンは、５ １７（１０）塩基対の断片Ｅｃｏ　Ｒ１−Ｅｃｏ　Ｒ１
の存在で選択される。

Ｆｅｐ　Ａの発現制御 性質制御 ２３５０塩基対の断片ｆｌｐａｌ−Ｘｈｏｌとプラスミ
ドＧＴＩ（１０）１の結合混合物は、有効な細菌ＲＩＩ
ＩＢ　１８を形質転換するのに役立つ。この菌株はｆｅ
ｐ　Ａであり、コリシンＢに耐性がある。

求めていた制限地図（第１７表〉を有するクローンのコ
リシンＢに対する感受性を検査した。

クローン（ＩＦＢ　１８　ＧＴＩ　Ｆ−１２）は、コリ
シンＢの作用に感受性があるのが分かった。

質的制御 Ｆｅｐ　Ａ蛋白とその前駆体の発現は、ポリアクリルア
ミド−３ＤＳゲルで分析したく第２図）。りｏ　−ンＣ
ＭＫ　６０３　ＧＴＩ　Ｆ−１２は、Ｐｅｐ　Ａとその
前駆体を極めて多量（全蛋白質の２０％）に発現させる
。

Ｆｅｐ　Ａ蛋白質は外被タンパクの３２％を占める。

６ Ｊｕｔ　ΔとＦｅｐ　Ａを発現させるクローン培養適性 得られたクローンの培養適性を、１」テトラザイクリン
ＩＰＴＧ培地で、培養温度を変えて検査した。

ＬＢテトラサイクリンＩＰＴＧ　Ｏ，１ｍＭの寒天に一
面に接種すると、全クローンは、３０〜３４℃の範囲の
温度で培養すると、バクテリオシンに感受性のある細菌
じゅうたんを形成する。

３４℃以上では、細菌じゅうたんは形成されない。

この現象は、また、Ｌ８液体培地でも観察されない。

バクテリオシンに対する感受性は、ＩＰＴＧ濃度が０．
０５ｍＭで、温度が３０℃で発見された。従って、ベク
ターＰ　ＧＴＩ　（１０）１の誘導の非存在化でｉｕｔ
　Ａ遺伝子及びｆｅｐ　Ａのある程度の発現が存在する
。

形態学的研究 種々のクローンは、Ｉｕｔ　Ａ及びｆｅｐ　Ａの超発現
の結果として形態の変化を生じる。

４時間、＋４２℃で誘導した後、相対比の光学顕微鏡で
観察すると、細菌は、かなり長くなってぃ７ る（正常な大腸菌に１２の平均の長さの１０倍まで）。

しかし、最も驚異的な特性は、各細菌の体内に１つから
複数の細胞質内挿入の存在である。

４時間、＋４２℃で培養した細菌の切断の陰性染色後電
子顕微鏡で観察すると、光学顕微鏡で観察された挿入が
見られる。

この挿入は、細胞質外被の内表面の周辺か近傍である。

３、蛋白質Ｊｕｔ　Ａ及びＰｅｐ　Ａの免疫学的特性Ｔ
ｕｔ　Δ及びＰｅｐ　Ａの免疫原性 大腸菌株１５０２２．１５３９３．１６（１０）３　と
組み換え大腸菌ＣＭＫ　６０３　ＧＴＩ　Ｐ−２の外被
から抽出した蛋白質を容易したポリアクリルアミドゲル
によって単離し、前記の方法によって兎に注射した。

各兎が形成する抗体抗ｊｕｔ　Ａの力価の変化は、抗原
として大腸菌ＣＭＫ　６０３　ＧＴＩ　Ｐ−２の培養物
から抽出された「グラニユール」　（沈澱した蛋白質ｐ
ｒｏＩｕｔ　Ａ）溶液を使用して、エリザ（ＢＬＩＳＡ
）法によって測定した。

使用した陽性の参照血清は、ビー、ウデガ（Ｂ。

０１ｊｌ）ＥＧ八）によって提供された大腸菌Ｃｏ１Ｖ
−に３［）の抗蛋白質Ｊｕｔ　Ａの兎血清である。

同様の方法で、大腸菌株１５０２２とＲ凶Ｂ　１８　Ｇ
ＴＩＦ＋、２の外被から抽出された蛋白質Ｆｅｐ　Ａを
検査した。

どの場合も、兎は蛋白質ｊｕｔ　Ａ及びＰｅｐ　Ａの注
射に反応し、これらの蛋白質に対する抗原の力価が高く
なった。

Ｊｕｔ　Ａと１ｉｅｐ　Ａの抗原特性 得られた種々の抗原の特性を複数の外被製造（大腸菌１
５（１０）２．１５３９３、［、ＭＫ　６０３　ＧＴＩ
　Ｐ−２、ＣＭＫ６０３　ＧＴＩ　Ｂ−５及びＲＷＢ　
１８　ＧＴ［Ｆ−１２の菌株）に対して検査した。この
検査は、「ウエスタンブロッ）　（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂ
ｌｏｔ）　Ｊ法によって実施した。

参照抗ｊｕｔ　ＡＣＯＩＶ−に３０と同様に、生成した
４つの抗ｊｕｔ　Ａ血清は、アエロバクタ−系を発現す
る菌株の外被の製造において、特に、７６ｋＤａの蛋白
質を認識する。その誘導に使用したｊｕｔ　Δ蛋白が何
でも（天然でも組み換えでも）、同じ血清の抗原は特に
起点が鳥および牛の大腸菌株によって発９ 現されるｌｕｔ　Ａ蛋白質と大腸菌ＣＭＫ　６０３　Ｇ
ＴＩ　Ｐ−２、［ＭＫ　６０３　ＧＴＩ　Ｂ−５の組み
換え菌株によって生成する２つの蛋白質１ｕｔ　Ａを認
識する。

Ｊｕｔ　Ａ蛋白質の前駆体、ｐｒｏｌｕｔ蛋白質もまた
全ての抗Ｊｕｔ　Ａに認識される（菌株［：ＭＫ　６０
３　ＧＴＩＰ−２及びＣ１，ＩＫ　６０３　ＧＴＩ　Ｂ
−５による生成物を精製した「グラニユール」で免疫粉
砕を実施）。

蛋白質Ｆｅｐ　Ａは、抗Ｊｕｔ　Ａ血清では認識されず
、逆に抗Ｆｅｐ　Ａ血清は蛋白質Ｊｕｔ　Ａを認識しな
い。

発現ベクター６丁＋　（１０）１内でのｉｕｔ　Ａ及び
ハＬム遺伝子のクローニングによって、ｊｕｔ　Ａ及び
ＦｅｐＡ蛋白質、さらに、その各々の前駆体を多量に製
造することができる。４２℃での細菌培養による転写誘
導に続いて合成されたｊｕｔ　Ａ及びＦｅｐ　Ａ蛋白と
それらの前駆体は、細胞質に封入されたくグラニユール
）の形で急速に蓄積される。このグラニユールの寸法は
大きく、位相対比光学顕微鏡でみることができる。誘導
された細菌の断面を電子顕微鏡で観察すると、細胞質膜
の内表面にこれらのグラニユールがびっしり貼り付いて
いることか分０ かった。

Ｊｕｔ　Ａ及びＦｅｐ　Ａの前駆体の発現量の大きさく
最適化していない条件では平均で総蛋白質の２５％〉に
注意しなければならない。成熟した蛋白質は外被の蛋白
質量の３５％未満である。このパーセンテージを外被内
のこの種の蛋白質の含有の限界とみることができる。比
較として、天然の大腸菌１５０２２の菌株によって発現
されたｌｕｔ　Ａ及びＦｅｐＡ蛋白は合わせて外被タン
パクの３０％である。従って、本発明による組み換え菌
株によるＪｕｔ　Ａ及びＰｅｐ　Ａ蛋白と、それらの前
駆体は、天然の発現を大きく上回ることが分かった。

Ｉｕｔ　Ａ蛋白を発現するクローンでのクロアシンＤＦ
　１３に対する感受性と、Ｆｅｐ　Ａ蛋白を発現するク
ローンでのコリシンＢに対する感受性が明らかになって
、外被内でのこれらの蛋白質の合成及び組み込みは正常
に展開することが分かった。

また、遺伝子組み換えによって得られた蛋白質と天然の
蛋白質が同じであるということは、天然のｊｕｔ　Ａ及
びＦｅｐ　Ａ蛋白に対する抗原によるこれ１ らの蛋白質の認識によって示される。これらの抗原は、
また、同じ特殊性で、細胞質内封入物中に沈澱された前
駆体ｐｒｏｌｕｔ　Ａ及びｐｒｏＦｅｐ　Ａを認識する
。

遺伝子組み換えによって得られたＪｕｔ　Ａ及びＦｅｐ
Ａ蛋白によって誘導された抗原は、同様に、病原菌であ
る異なる大腸菌株によって発現されたＩｕｔＡ及びＦｅ
ｐ　Ａ蛋白を認識する。

発現ベクターでのそれらの遺伝子のクローニングによる
レセプターＪｕｔ　Ａ及びＦｅｐ　Ａの超発現によって
、鉄が豊富な培地で、病原菌が生体内で増殖中に発現す
る蛋白質と機能的且つ抗原的に同じ外被タンパクを得る
ことができる。

従って、遺伝子組み換えによるＪｕｔ　Ａ及びＦｅｐＡ
蛋白の合成には、以下のように多数の利点がある。

（１）鉄による調節をしないで、蛋白質Ｊｕｔ　Ａ及び
ＦｅｐＡを多量に得ることができる。

（２）　　合成される蛋白質は、病原菌が生体内で増殖
中に発現する蛋白質と機能的且つ抗原的に同２ じであり、抗体の形成を誘導する。

（３）　　ワクチン中で有効成分として使用すると、鉄
によって調節される細胞、すなわち、担鉄細胞の特定認
識を妨げる抗体の形成を誘導し、それによって鉄の供給
を停止し、宿主内での増殖を防ぐ。従って、敗血症を含
む感染症を予防し、闘うのに極めて有効なワクチンを製
造することができる。

また、それらのワクチンは、表面または壁抗原を主成分
とするワクチンの製造に使用される従来の方法によって
、不活性化した組み換えクローンまたは組み換えクロー
ンを溶解し、続いて、精製して得られた膜フラグメント
から容易に製造することができる。

ＩＶ、鉄を制限した培地での培養によるＩ　ＲＯＭＰｐ
圭（ （１）菌株：　大腸菌０７８参照１５０２２　：鶏起源
、（２）培養： ３ 培地 培地ＳＴ＋コハク酸塩（イー、エッチ、シモン（Ｅ、　
１１．　Ｓｉｍｏｎ）　　と７　スフ　ン（Ｔｅｓｍａ
ｎｎ）　（１９６３）　　”プロシーディング　オブ　
ナチュラル　アカデミ・ツクサイエンス（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、）　　Ｊアメリカ合衆国
　第５０号、５２６〜５３２頁 ラクトフェリン（２５０μｇ　／ｄ）を添加して、鉄が
欠乏した培地を得る。

ＦｅＣ］＋　　・６）＋２０　（４０μＭ）を添加して
、鉄に富む培地を得る。

培養 菌株を鉄に富む培地を３回通過させ、次に、鉄が欠乏し
ている培地を通過させ、最終的に鉄が欠乏している培地
で培養。

平行して、鉄に富む培地で同じ菌株を培養する。

２４時間、３７℃で培養を実施する。

（３）分析： 培養後、各培地で、以下の操作を行う。

遠心分離による回収 Ｔ＋＋ｓ　　ＨＣｌ０．２Ｍ　　ｐＨ８及び超音波化に
よる４ 残滓の回収 遠心分離＜５（１０）０　ｇ、３０分）再遠心分離によ
るｌ澄み液（１（ｔｏ、　ＯＤＤ　ｇ、１時間）Ｔｒｉ
ｓ　　ＨＣＩ（５０ｍＭ　５ｐＨ８）　、ＭｇＣＬ（Ｉ
ＯｍＭ＞、し口Ｔ八ｌ＋ｎｌＪ、　　）リドンＸ１（１
０（２％）での残滓の回収及び３７℃で、２０分間撹拌 １時間、１，（１０）．（１０）０　ｇで遠心分離、次
に、残滓の再回収 脱イオン水で残滓の洗浄 変性条件（メルカプトエタノール、ＳＤＳ　　９で、ポ
リアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ、５ＤＳ）での残滓の
分析 （４）結果： ラクトフェリンの存在下で培養された細菌の膜見掛分子
量が８（１０）（１０）ダルトン（エンテロバクチンレ
セプター、Ｆｅｐ　Ａ）及び７６（１０）０　ダルトン
（アエロバクチンレセプター、ｔｕｔ　Ａ）の２つの蛋
白質が多量に存在。

鉄に富む培地で培養された細菌膜ニ ア６（１０）０及び８ＱＯＱＯ［］ａの帯無し。

■、ワクヂンの製造 本発明による有効成分は、好ましくは、ワクチン中で、
公知のヒトまたは獣医学の抗細菌ワクチンと組み合わせ
られる。特に、＠製した蛋白質を使用する場合は、それ
が好ましい。

これらのワクチンは、非経口路によって投与される従来
の賦形剤中に存在することができる。これらのワクチン
は、例えば、油性の公知の基剤を含むことができる。

／ｂ −＼ ｆ［］ １′−！　　へ ：＝＝＼−「＼ ユ 使 賭 坊 賭 −らり７− ａＯ＝Ｊ−Ｊ　　　（１０）　　舶　−（１０）〜　の
　＝；；（ｌｌｌ’ｌ旧　第切喝（イ）トドトド的の叩 の−の−の一トートー （ｈｏｌＩ’Ｔ−Ｊ−Ｎトａｌ）＋９寸（１１ｔｊ　ｑ
ｄ　Ｌｎ　ｌｎ　１１１１ｎ　Ｑ　−７）（Ｎ　Ｎ　Ｎ
　Ｎ　Ｎ←Ｉ　Ｎ　（Ｎ　Ｎ　Ｎｔｖ＋ｔ。

（！Ｉ　０ トイ イト トイ ＜）− ビｌロビ ０　Ｕ　（１０） に　１＝　　１−Ｅ 已詳訃訃 刺（１０） １：ごごご 重旨旨旨 −ＧりＱ− 唄 尉 月 ０翫 にε ０：１（１１ ０、ｍ Ｏ 跪日 が−１’−−）　、− 震　　　　。

文献 （］）　ＢｆＮＤＥＲＥＩＦ　Ａ、、　ＢＲＡＵＮ　Ｖ
、、　ＨＡＮＴＫＥ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１５０、１４７２−１４７５　（１，９８２）（２）　
ＢＩＮＤＥＲＨＴＦ　Ａ、、　ＮＥＩＬＡＮＤＳ　１．
Ｂ、、　Ｊ、　ＢａｃｔＣｒｉｏｌ　１５３゜１１１１
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１５１３−１５２３　（１９７９） （４）　ＢＯＬＴＮ　Ｃ，Ａ、、　ＪＨＮＳＢＮ　Ａ、
Ｅ、、　　Ｉｎｆｅｃｔ、　　Ｔｍｍ、　　５５゜１２
３９−１２４２　（１９８７） （５）　ＢＹＥＲ８Ｂ、Ｒ，、Ｐ、　１１１−１１６．
　”Ｉｒｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｉｎ　ｍ１ｃｒｏ
ｂｅｓ。

ｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　ａｎｉｍａｌｓ”、　Ｇ、　　
ＷＩＮＫＥＬＭＡＮ、　Ｄ、　　ＶＡＮ　ＤＥＲＨＡＬ
ＭＪ、Ｂ、　ＮＥＩＬＡＮＤＳ、　ＶＣＨＰｕｂｌｉｓ
ｂｅｒｓ　Ｗｅｉｎｈｃｉｍ、　ＦＲＧ。

（６）　Ｃ０ＤＥＲＲＥＰ、、　ＥＡＲＨＡＲＤＴ　Ｃ
，Ｆ、、　”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ
　ａｐｌａｓｍｉｄ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｅｓ
ｃｔ＋ｅｒｉｃｌ〕ｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２．　ｅｎτ
Ｄ、　ｆｅｐ−△、　ｆｅ、ｑ　■■ ｅｎｔ　Ｆｌｇｅｎｅｓ　ＦＨＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２５．　Ｉ　］　Ｉ−１１６（
１９８４）（７）　Ｃ０ＵＬＴＯＮ　Ｊ、Ｗ、、　Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　７１７．
１５４．１６２（１９８２） （８）　ＤＥ　　（３ＲＡＡＦ　　Ｆ、に、、　　ＴＩ
ＥＺＥ　　Ｇ、Ａ、、　　ＷＥＮＤＥＬＡＡ、ＲＢＯＮ
ＧＡ　　Ｓ、、　　ＳＴＯＵＴＨＡＭＨＲＡ、Ｈ，、Ｊ
、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　９５．　６３１−６４
０（１９６８） （９）　ＤＥ　　ＧＲ，ＡＡＦ　　Ｆ、に、、　　ＧＯ
ＥＤＶＯＬＫ−ＤＥ　　ＧＲＯＯＴ。

ＳＴＯＵＴＴ（ＡＭＥＲＡ、Ｈ，、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　２２］、　５６６−５
７５（１９７０） （１，０）　ＥＮＧＷＡＬＬ　Ｅ、、　　ＰＥＲＬＭＡ
ＮＮ、　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１０９゜１２９
−１３５　（１９７２） （１１，）　ＦＬＥＭＩＮＧ　Ｔ、Ｐ、、　ＮＡＨＬＩ
Ｋ　Ｍ、Ｓ、、　ＮＥＩＬＡＮＤＳ　Ｊ、Ｂ、、　Ｍｅ
ＩＮＴＯ３ＨＭ、Ａ、、　Ｇｅｎｅ、　３４．４７−５
４　（１９８５）（＋２）　ＦＩＳＳ　Ｅ、Ｈ，、ＳＴ
ＡＮＬＥＹ−８ＡＭＵＥＬＳＯＮ　Ｐ、、　ＮＥＩＬＡ
ＮＤＳＪ、Ｂ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｌｒｙ、　２１
　、４５１７−４５２２　（１９８２）（１３）　ＧＲ
ＩＦＦＩＴＩ３　Ｅ、、　　”Ｉｒｏｎ　　ａｎｄ　１
ｎｆｅｃｔｉｏｎ　　：　　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ。

ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　　ａｎｄ　　　ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　　　ａｓｐｅｃτｓ”、　　　ＪＪ、　　
　ＢＵＬＬＥＮ、　　　Ｅ。

ＧＲＩＦＦＩＴＩ−Ｉ　　ＪＯＩ−ＩＮ　ＷＩＬＥＹ　
＆　５ＯＮＳ　ＬＴＤ、　　ＣＨＩＣＨＥＳＴＥＲＥＮ
ＧＬＡＮＤ ９′７ （１４）ＨＥＲＲＥＲＯＭ、、ＤＢＬＯＲＥＮＺＯＶ、
、ＮＥＩＬＡＮＤＳＪ、Ｂ、、ＪＢａｃ＋ｅｒｉｏｌ　
１７０．５６−６４　（１９８８）（１５）　ＨＯＬＬ
ＩＦＩＨＬＤ　Ｗ、Ｅ、、　ＮＥＩＬＡＮＤＳ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７１９２２−１．９２８　（
１９７８） （１６）　ＫＡＤＯＣ，１，、ＬＩＵ　Ｓ、Ｔ、、　Ｊ
、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４５．１３６５−１３７
３（１９７８） （１７）　ＫＲＯＮＥ　Ｗ、Ｊ、Ａ、、　０ＵＤＥＧＡ
　Ｂ、、　５ＴＥＧＩＥＨＵＩＳ　Ｆ、、　ＤＥＧＲＡ
ＡＦ　Ｆ、に、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｃｒｉｏｌ　１５３
．７＋６−７２１　（１９８３）（１ｇ）　ＫＲＯＮＥ
　Ｗ、Ｊ、Ａ、、　５ＴＨＧＥＨＵＩＳ　Ｆ、、　ＫＯ
ＮＩＮＧＳＴＥＩＮ　Ｇ、。

ＶＡＮＤＯＯＲＮＣ，、ＲＯ３ＥＮＤＡＬＢ、、ＤＥＧ
ＲＡＡＦＦ、に、、０ＵＤＥＧＡＢ、、　ＦＥＭＳ　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２６．１５３１６］　（１９８５
）（１９）　ＬＡＩＲＤ　ＡＪ、　ｅｔ　ＹＯＵＮＧ　
ＬＧ、、　Ｇｅｎｅ　ｌ　Ｉ、　３５９−３６６　（１
９５０）（２０）　　ＬＯＷＲＹ　　Ｏ，１（、、ＲＯ
５ＥＢＲＯＵＧ）ｌ　　Ｎ、Ｊ、、　　ＦＡＲＲＡ　　
Ｌ、Ａ。

ＲＡＮＤＡＬＬ　Ｒ，Ｊ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ｅｍ、　］　９３．２６５−２７５　（１９５１）（２
１）　Ｌ（ＪＧＴＥＮＢＥＲＧ　Ｂ、、　ＭＥＵＩＥＲ
８Ｊ、、　ＰＩＦ、″Ｆ１ミＲ８Ｒ，、ＶＡＮＤＥＲＨ
ＯＥＫ　Ｐ、、ＶＡＮ　Ａ、ＬＰＨＥＮ　Ｌ、、ＦＥＢ
Ｓ　Ｔ、ｅｔｔ　　聾、　２５４−２５８（１９７５） （２２）　ＬＵＮＤＩＧＲＡＮ　Ｍ、Ｄ、、　ＫＡＤＮ
ＥＲＲ，Ｊ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ２６１、
１０７９７−１．０８０１　（１９８６）（２３）　Ｍ
ＡＮＴＡＴＴＳ　Ｔ、、　ＦＲＩＴＳＣＨＥ、Ｆ、　ｅ
ｔ　ＳＡＭＢＲＯＯＫ　Ｊ（１９８２）、　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ｏｎ　１ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＮＹ。

（２４）　ＮＡＫＡＭＡＹＥ　Ｋ、、　ＥＣＫＳＴＥＩ
Ｎ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｃｌｓ　Ｒｅｓ、　１４゜９
６７９−９６９８　（１９８６） （２５）　０ＨＴＳＵＢＯＨ，、０ＨＴＳＵＢＯＥ、、
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ出、　６１５−６１９　（１９７ｇ）（２６）　
ＲＯＧＥＲ８Ｈ王、　　５ＹＮＧＥ　　Ｃ，、ＷＯＯＤ
Ｓ　　Ｖ、Ｅ、。

Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　
　ｓｃａｎｄｉｕｍ　　ａｎｄ　　ｉｎｄｉｕｍ　　ｃ
ｏｍｐｌｅｘｅｓ　　ｏｆｅｎｔｅｒｏｅｈｅｌｉｎ　
ｏｎ　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｎｅｕｍｏｎｉａｅ、　
Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄＣｈｅ
ｍｏｔｈｅｒａｐｙ　］　８．６３−６８　（１９８６
）（２７）　ＲＯＧＥＲＮＳ　Ｈ，Ｊ、、　”Ｔｒｏｎ
　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｉｎ　ｍ１ｃｒｏｂｅｓ、　ｐ
ｌａｎｔｓ　ａｎｄａｎｉｍａｌｓ”　　Ｇ、ＷＩＮＫ
ＥＬＭＡＮ　　Ｄ、ＶＡＮ　　ＤＥＲＨＥＬＭ、Ｊ、Ｂ
。

ＮＨＩＬＡＮＤＳ、　ｐ、　２２３−２３３　（１９８
７）−ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｗｅｉｎｌ］ｅ
ｉｍ。

ＲＧ （２８）　５ＡＮＧＥＲＦ、、　ＮＴＣＫＬＥＮ　Ｓ、
、　Ｃ０ＵＬＳＯＮ　Ａ、Ｒ，、ＰｒｏｃＮａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５４６３−５４
６７　（１９７７）（２９）　ＳＣＨＮＡＴＴＭＡＮ　
Ｃ，Ａ、、　Ｊ、　ＢａｃＬｅｒｉｏｌ　１０８．５４
５−５５２　（＋９７１）（３０）ＳＩＭＯＮ　　Ｅ、
Ｉｔ、ＴＥＳＳＭＡＮ　１．、Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．Ａ
ｃａｄ、５ｃｉＵＳＡ頻、　５２６−５３２　（１９６
３）（３１）　５ＯＵＴＨＥＲＮ　Ｈ，、Ｊ、　Ｍｏ１
．　Ｂｉｏｌ、　９８．５０３−５１７　（１９７５）
（３２）ＴＡＹＬＯＲＪ、Ｗ、、ＳＣＨＭＩＤＴ　　Ｗ
、、ＣＲＯ８ＳＴＩＣＫ　　Ｒ，。

０ＫＲＵＳＺＥＫ　Ａ、、　ＥＣＫＳＴＥＩＮ　Ｆ、、
　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３．８７４９
−８７６４（１９８５） （３３）ＴＡＹＬＯＲＪ、Ｗ、、ＯＵＴ　Ｊ、、ＥＣＫ
ＳＴＥＩＮ　Ｆ、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１３
．８７６５−８７８５　（１９８５）（３４）ＴＯＷＢ
ＩＮ　Ｈ，，５ＴＡＥＨＥＬＩＮ　Ｔ、、ＧＯＲＤＯＮ
　Ｊ、、ＰｒｏｃＮａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　Ｕ
ＳＡ　７６、４３５０−４３５４　（１９７９）（３５
）ＶＡＮ　　ＴＩＥＬ−ＭＥＮＫＶＥＬＤ　　Ｇ、Ｊ、
、　　０ＵＤＥＧＡ　　Ｂ、。

ＫＥＭＰＥＲ３Ｏ，、ＤＥ　ＧＲＡＡＦ　Ｆ、に、、　
ＦＥＭＳ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅ＋ｔ、　１２
゜３７３−３８０　（１９８］　） （３６）　ＶＡＮ　ＴＩＥＬ−ＭＨＮＫＶＨＬＤ　ＧＪ
、、　ＶＥＬＴＫＡＭＰＦ　Ｅ、、　ＤＢＯＲＡＡＦ　
Ｆ、に、、　Ｊ、　Ｂａｃｆｅｒｉｏｌ、　＋４６．４
］−４８（１９８１）（３７）　ＷＩＬＬＴＡＭＳ　Ｐ
、　Ｈ，、１ｎｆｅｃｔ、、　Ｉｍｍｕｎ、　２６．９
２５−９３２　（１９７９）（３８）　　ＹＡ、Ｎｌ５
ＣＨ−ＰＥＲＲＯＮ　Ｃ，Ｖ丁ＥＩＲＡ、Ｊ、、ＭＥＳ
Ｓ丁ＮＧ　Ｊ、、Ｇｅｎｅ引、　１０３−１１９　（１
９８５） Ｉｔ）／

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｔｕｔ　Ａ蛋白を発現するクローンの電気泳
動によって得られた蛋白質プロフィルを示し、第２図は
、Ｆｅｔ　Ａ蛋白を発現するりｒ］−ンの電気泳動によ
って得られた蛋白質プロフィルを示す。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）ワクチン製造に使用可能な一部が担鉄細胞レセプ
   ターまたはトランスフェリンである鉄によって調節され
   る外被タンパクを発現する細菌の培養方法において、 ラクトフェリンのような鉄の強力なキレート化蛋白を用
   いて、鉄の含有量を、上記レセプター蛋白の発現を増加
   させることができる量まで減少させた培地中で上記細菌
   を培養することによって、細菌をワクチン中で使用した
   時に、上記レセプターによる担鉄細胞の特定認識を防ぐ
   抗原が形成されるようにしたことを特徴とする方法。
2. （２）上記細菌が大腸菌、クレブシェラ、ねずみチフス
   菌、赤痢菌に属する腸内バクターによって構成される群
   に属することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. （３）上記細菌によって分泌される担鉄細胞がアエロバ
   クチンおよび／またはエンテロバクチンであることを特
   徴とする請求項２に記載の方法。
4. （４）発現される蛋白がＩｕｔＡおよび／またはＦｅｐ
   Ａタンパクであることを特徴とする請求項３に記載の方
   法。
5. （５）鉄によって調節され且つ一部が担鉄細胞レセプタ
   ーまたはトランスフェリンレセプターである外被タンパ
   クの発現を増加させることのできる量の鉄を含む培地で
   培養して得られた細菌全体、これらの細菌の断片、もし
   くはトランスフェリンまたは担鉄細胞のレセプター蛋白
   質、特にこれら細菌から抽出されたＩｕｔＡおよびＦｅ
   ｐＡタンパクを含む抗原を有効成分として含むことを特
   徴とするワクチン。
6. （６）上記細菌が請求項１から４のいずれか一項に記載
   の方法によって得られた細菌であることを特徴とする請
   求項５に記載のワクチン。
7. （７）トランスフェリンまたは担鉄細胞のレセプターを
   構成する少なくとも１つの鉄によって調節される外被タ
   ンパクの発現量が増加した細菌において、上記タンパク
   を発現する組換え発現ベクターを含むことを特徴とする
   細菌。
8. （８）上記ベクターによって発現される遺伝子が、大腸
   菌、クレブシェラ、ねずみチフス菌、赤痢菌に属する腸
   内バクターによって構成される群の一部を成す鉄によっ
   て調節される外被タンパクの発現系に属することを特徴
   とする請求項７に記載の細菌。
9. （９）上記蛋白がアエロバクチンおよび／またはエンテ
   ロバクチンの担鉄細胞系に属することを特徴とする請求
   項８に記載の細菌。
10. （１０）合成されたタンパクがＩｕｔＡおよび／または
    ＦｅｐＡタンパクおよび／またはこれらの前駆体である
    ことを特徴とする請求項９に記載の細菌。
11. （１１）大腸菌またはアエロバクチンオペロンを有する
    その他の腸内バクターのプラスミド部分を単離し、この
    プラスミド部分から￥ｉｕｔＡ￥遺伝子を有する断片を
    分離し、この断片をクローニングベクターと結合させ、
    クローン化された￥ｉｕｔＡ￥遺伝子を発現ベクターに
    挿入し、クローン培養によってＩｕｔＡ蛋白質を発現さ
    せることによって上記ＩｕｔＡタンパクを得ることを特
    徴とする請求項１０に記載の細菌。
12. （１２）ＩｕｔＡ蛋白を発現させるために用いる発現ベ
    クターの複製の起点が、ｔａｃプロモーターの制御下に
    あり、発現させる遺伝子が、リプレッサーが感熱性を有
    する強力なプロモーターＰｒによって制御されているこ
    とを特徴とする請求項１１に記載の細菌。
13. （１３）ＦｅｐＡタンパクが、請求項１１または１２に
    記載の発現ベクター中で￥ｆｅｐＡ￥遺伝子をクローニ
    ングすることによって得られることを特徴とする請求項
    １０に記載の細菌。
14. （１４）ＩＲＯＭＰの合成、特にＩｕｔＡおよびＦｅｐ
    Ａタンパクまたはこれらの前駆体ｐｒｏＩｕｔＡおよび
    ｐｒｏＦｅｐＡの合成方法において、 適当な培地で、請求項１１から１３のいずれか一項に記
    載の細菌を、先ず３２℃未満で、次いで４２℃未満で培
    養することによってｉｕｔＡおよびｆｅｐＡ遺伝子を発
    現させることを特徴とする方法。
15. （１５）請求項７から１３のいずれか一項に記載の組換
    え細菌の外被または細胞質から抽出されたＩＲＯＭＰ、
    特に、ＩｕｔＡおよび／またはＦｅｐＡ蛋白質および／
    またはこれらの蛋白の前駆体を有効成分として含むこと
    を特徴とする抗−敗血症菌ワクチン。
16. （１６）上記組換え細菌またはこれらの細菌の断片を含
    むことを特徴とする請求項１３に記載のワクチン。