JPH03143388A - 敗血症菌に対するワクチンと、敗血症菌の抗原の製造法と、これらの抗原またはワクチン製造用の新規なバクテリアおよびベクター - Google Patents
敗血症菌に対するワクチンと、敗血症菌の抗原の製造法と、これらの抗原またはワクチン製造用の新規なバクテリアおよびベクターInfo
- Publication number
- JPH03143388A JPH03143388A JP2071723A JP7172390A JPH03143388A JP H03143388 A JPH03143388 A JP H03143388A JP 2071723 A JP2071723 A JP 2071723A JP 7172390 A JP7172390 A JP 7172390A JP H03143388 A JPH03143388 A JP H03143388A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- bacteria
- iron
- proteins
- iuta
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 178
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 33
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000000589 Siderophore Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 108010089727 siderophore receptors Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 3
- PMVSDNDAUGGCCE-TYYBGVCCSA-L Ferrous fumarate Chemical compound [Fe+2].[O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O PMVSDNDAUGGCCE-TYYBGVCCSA-L 0.000 claims abstract 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 194
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 113
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 111
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 98
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 50
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 48
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 42
- 101100066562 Escherichia coli (strain K12) fepA gene Proteins 0.000 claims description 38
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 36
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims description 36
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims description 36
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 36
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 36
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- KDHHWXGBNUCREU-HOTGVXAUSA-N Ferric-aerobactin Chemical compound CC(=O)N(O)CCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN(O)C(C)=O KDHHWXGBNUCREU-HOTGVXAUSA-N 0.000 claims description 28
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 22
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 22
- 108010061075 Enterobactin Proteins 0.000 claims description 18
- SERBHKJMVBATSJ-UHFFFAOYSA-N Enterobactin Natural products OC1=CC=CC(C(=O)NC2C(OCC(C(=O)OCC(C(=O)OC2)NC(=O)C=2C(=C(O)C=CC=2)O)NC(=O)C=2C(=C(O)C=CC=2)O)=O)=C1O SERBHKJMVBATSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- SERBHKJMVBATSJ-BZSNNMDCSA-N enterobactin Chemical compound OC1=CC=CC(C(=O)N[C@@H]2C(OC[C@@H](C(=O)OC[C@@H](C(=O)OC2)NC(=O)C=2C(=C(O)C=CC=2)O)NC(=O)C=2C(=C(O)C=CC=2)O)=O)=C1O SERBHKJMVBATSJ-BZSNNMDCSA-N 0.000 claims description 18
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 15
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 14
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 13
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 13
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 12
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 claims description 11
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 11
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 claims description 11
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 claims description 11
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 241000607768 Shigella Species 0.000 claims description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 8
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 claims description 6
- 101150043148 iutA gene Proteins 0.000 claims description 5
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 claims description 3
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 claims description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 claims 1
- 101150098376 fepA gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 2
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 abstract 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 25
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 102100032241 Lactotransferrin Human genes 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 9
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010026206 Conalbumin Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 6
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- -1 iron ions Chemical class 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 101150049209 lutA gene Proteins 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 108010073254 Colicins Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N EtOH Substances CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 4
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 3
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 3
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- GLDQAMYCGOIJDV-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC(O)=C1O GLDQAMYCGOIJDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 2
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 2
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 101710201946 Tegument antigen Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 description 2
- 235000014413 iron hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L iron(ii) hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Fe+2] NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 229910052706 scandium Inorganic materials 0.000 description 2
- SIXSYDAISGFNSX-UHFFFAOYSA-N scandium atom Chemical compound [Sc] SIXSYDAISGFNSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 description 2
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical group [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940082044 2,3-dihydroxybenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,3-dimethyl-7-nitro-4h-isoquinolin-1-one Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C=C2C(=O)N(O)C(C)(C)CC2=C1 NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLXFBGIQYIPIGA-UHFFFAOYSA-N 3-triethylstannylpyrrolidine-2,5-dione Chemical compound CC[Sn](CC)(CC)C1CC(=O)NC1=O DLXFBGIQYIPIGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N Bipyridyl Chemical group N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1 ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- 101150014361 Delta gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100244921 Homo sapiens PRDX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100252165 Mus musculus Rnd2 gene Proteins 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102100029139 Peroxiredoxin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical group OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710186352 Probable membrane antigen 3 Proteins 0.000 description 1
- 101710181078 Probable membrane antigen 75 Proteins 0.000 description 1
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 102100036164 Putative phospholipase B-like 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710200837 Putative phospholipase B-like 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 101710178472 Tegument protein Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 1
- 108010000462 aerobactin receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- BIGPRXCJEDHCLP-UHFFFAOYSA-N ammonium bisulfate Chemical compound [NH4+].OS([O-])(=O)=O BIGPRXCJEDHCLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940058613 bactine Drugs 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052797 bismuth Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 108010028302 enterobactin receptor Proteins 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 239000000797 iron chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 150000004707 phenolate Chemical class 0.000 description 1
- 229940031826 phenolate Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000007152 ring opening metathesis polymerisation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、鉄によって調節された外皮抗原タンパクを多
量に発現する病原菌を含む細菌類に属する細菌に関する
ものである。
量に発現する病原菌を含む細菌類に属する細菌に関する
ものである。
本発明はさらに、これら細菌の製造方法に関するもので
ある。
ある。
本発明はさらに、鉄によって調節された外皮抗原タンパ
クを多量に発現する細菌、この細菌の断片またはこの細
菌によって発現された抗原を有効成分として含む抗菌性
敗血症ワクチンに関するものである。
クを多量に発現する細菌、この細菌の断片またはこの細
菌によって発現された抗原を有効成分として含む抗菌性
敗血症ワクチンに関するものである。
本発明はさらに、上記抗原タンパクを発現可能なベクタ
ー細菌、ウィルス等と、上記抗原タンパりを有効成分と
して含むワクチンとに関するものである。
ー細菌、ウィルス等と、上記抗原タンパりを有効成分と
して含むワクチンとに関するものである。
本発明はさらに、ワクチン接種を受けた生物中で上記抗
原タンパクを発現する再結合性の生きたワクチン、特に
細菌またはウィルスに関するものである。
原タンパクを発現する再結合性の生きたワクチン、特に
細菌またはウィルスに関するものである。
従来の技術
ある種の乳酸桿菌を除くと、細菌を含む全ての生命体に
とって鉄は必須栄養分であるということは知られている
。細菌の場合には、宿主の細胞内で繁殖するために鉄が
必要である。細菌の毒性の主たる因子は生体内での細菌
のこの繁殖力である。
とって鉄は必須栄養分であるということは知られている
。細菌の場合には、宿主の細胞内で繁殖するために鉄が
必要である。細菌の毒性の主たる因子は生体内での細菌
のこの繁殖力である。
鉄は人体内に多量に存在しているが、細菌は、繁殖のた
めに、極めて限定された量の遊離鉄のみしか用いない。
めに、極めて限定された量の遊離鉄のみしか用いない。
動物宿主の鉄の大部分はくフェリチン、ヘモジブリンま
たはへムの形で)細胞間にあまので、近づき難い。また
、体液内に存在する少量の鉄は、極めて安定した錯体の
形でしか存在せず、主とじてに2つのキレ−1・化した
鉄の糖タンパク、すなわち血漿中のトランフェリンおよ
び分泌物中のラクトフェリンによって構成されている。
たはへムの形で)細胞間にあまので、近づき難い。また
、体液内に存在する少量の鉄は、極めて安定した錯体の
形でしか存在せず、主とじてに2つのキレ−1・化した
鉄の糖タンパク、すなわち血漿中のトランフェリンおよ
び分泌物中のラクトフェリンによって構成されている。
鉄に強力、しかも可逆的に結合しているこれらの糖タン
パクの存在によって、鉄が水酸化鉄の形で枕澱するの防
止され、鉄を細胞が利用することがが可能になっている
。
パクの存在によって、鉄が水酸化鉄の形で枕澱するの防
止され、鉄を細胞が利用することがが可能になっている
。
血漿はハプトクロビン−ヘム、セルロフラスミン、フェ
リチン、ラクトフェリンおよびトランスフェリンの形で
鉄の錯体を含んでいる。
リチン、ラクトフェリンおよびトランスフェリンの形で
鉄の錯体を含んでいる。
この鉄の大部分はトランスフェリンによって運ばれる。
このトランスフェリンは主要な3種類:セリン−トラン
スフェリン、ラクトフェリンおよびオボトランスフエリ
ンに分類することができる。
スフェリン、ラクトフェリンおよびオボトランスフエリ
ンに分類することができる。
トランスフェリンは血漿の鉄の約95%を固定し、その
飽和度は健康な個体の場合約35%程度にすぎない。
飽和度は健康な個体の場合約35%程度にすぎない。
ラクトフェリンは鉄の飽和度が極やて低く、広範囲のp
++でキレート特性を保持し、生体の全ての分泌物中で
の存在量、すなわち、微生物が侵入する可能性のある部
位でのそのレベルは、生体の他の場所に比べて大きく制
限されている。
++でキレート特性を保持し、生体の全ての分泌物中で
の存在量、すなわち、微生物が侵入する可能性のある部
位でのそのレベルは、生体の他の場所に比べて大きく制
限されている。
鉄は糖タンパクと錯体化する結果、遊離の三価鉄の量は
極めて僅か(10−” M)であり、この量は細菌が正
常に増殖するためには全く不十分な量である。
極めて僅か(10−” M)であり、この量は細菌が正
常に増殖するためには全く不十分な量である。
細菌は、宿主の体内で繁殖するのに必要な量の鉄を獲得
するための手段をいくつか利用する。
するための手段をいくつか利用する。
ある種の微生物は、細菌の細胞表面と宿主に鉄を結合さ
せている蛋白質との間に直接関与可能な機構によって鉄
を獲得しているようである。しかし、鉄のこの直接獲得
法は、極めて少数の種類の細菌に限定されている。病原
菌を含めて大部分の細菌は、宿主内または好気性環境下
で、担鉄細胞(s 1derophore) と呼ば
れる鉄のキレート化物を作って鉄を獲得しようとしてい
る。
せている蛋白質との間に直接関与可能な機構によって鉄
を獲得しているようである。しかし、鉄のこの直接獲得
法は、極めて少数の種類の細菌に限定されている。病原
菌を含めて大部分の細菌は、宿主内または好気性環境下
で、担鉄細胞(s 1derophore) と呼ば
れる鉄のキレート化物を作って鉄を獲得しようとしてい
る。
この担鉄細胞は、鉄イオンとの親和力が大きい特殊な錯
体を形成する低分子量の分子によって構成されている。
体を形成する低分子量の分子によって構成されている。
このバイオ合或は鉄によって調節され、その機能は細菌
細胞に鉄を補給することにある。
細胞に鉄を補給することにある。
この担鉄細胞は3価の鉄イオンに対する親和力が極めて
高いくその結合定数は約10” M−’)ので、宿主の
蛋白質に結合した鉄を外しかり、水酸化物の形で3価鉄
を可溶化して沈着させる。
高いくその結合定数は約10” M−’)ので、宿主の
蛋白質に結合した鉄を外しかり、水酸化物の形で3価鉄
を可溶化して沈着させる。
現在までに同定された担鉄細胞の大部分は2組の化学種
、すなわち、フェノラートーカテコラー)(2,3−ジ
ヒドロキシ安息香酸からの誘導体)と、ヒドロキサメー
ト (ヒドロキサム酸からの誘導体)に分けることがで
きる。
、すなわち、フェノラートーカテコラー)(2,3−ジ
ヒドロキシ安息香酸からの誘導体)と、ヒドロキサメー
ト (ヒドロキサム酸からの誘導体)に分けることがで
きる。
フェノラートに属する最も良く知られた担鉄細胞はエシ
ェリキア属、クレブシェラ属、ザルモネラ属およびシゲ
ラ属の細菌が排泄するエンテロバクチン(entero
bactine)である。このエンテロバクチンは23
−ジヒドロキシ−N−ベンゾイルL−セリンの環状3量
体からなり、三価鉄イオンに対して公知の最も高い親和
力(Ka=10”M ’)を有する化合物である。
ェリキア属、クレブシェラ属、ザルモネラ属およびシゲ
ラ属の細菌が排泄するエンテロバクチン(entero
bactine)である。このエンテロバクチンは23
−ジヒドロキシ−N−ベンゾイルL−セリンの環状3量
体からなり、三価鉄イオンに対して公知の最も高い親和
力(Ka=10”M ’)を有する化合物である。
ある種の腸内菌は別のヒドロキサメートの担鉄細胞、ア
エロバクチン(aerobact i ne)を合皮す
る。
エロバクチン(aerobact i ne)を合皮す
る。
この担鉄細胞は特に敗血症菌株によって作られるか、C
ol V型プラスミドを含む大腸菌(Escher i
ch i acoli)、ねずみチフス菌(Salm
onella typhymurim)および赤痢菌(
Shigella)の侵入によって生成される。
ol V型プラスミドを含む大腸菌(Escher i
ch i acoli)、ねずみチフス菌(Salm
onella typhymurim)および赤痢菌(
Shigella)の侵入によって生成される。
これらの細菌による担鉄細胞の土台或は外皮の位置での
蛋白合成に関連する。この外皮の中には担鉄細胞のレセ
プタの役目をするものや、細菌内部への鉄の移動と浸透
を可能にする機構の役目をするものがなる。外皮内に作
られたこれらの蛋白質はしばしば鉄調節外皮膜”IRO
MP”(Iron RegulatedOuter M
embrane Protein)と呼ばれている。
蛋白合成に関連する。この外皮の中には担鉄細胞のレセ
プタの役目をするものや、細菌内部への鉄の移動と浸透
を可能にする機構の役目をするものがなる。外皮内に作
られたこれらの蛋白質はしばしば鉄調節外皮膜”IRO
MP”(Iron RegulatedOuter M
embrane Protein)と呼ばれている。
これらの蛋白質に共通な特徴は寸法が70〜90 kD
aで、鉄を制限したインビトロ培地内でも感染した生体
内でも合成されるという点にある。
aで、鉄を制限したインビトロ培地内でも感染した生体
内でも合成されるという点にある。
従って、これらの外被タンパクすなわち担鉄細胞レセプ
タが、細菌が鉄を獲得するためのいわゆる高い親和性機
構の第2要素を構成している(第1要素は担鉄細胞が構
成する)。
タが、細菌が鉄を獲得するためのいわゆる高い親和性機
構の第2要素を構成している(第1要素は担鉄細胞が構
成する)。
この高い親和性機構の他に、多くの細菌は低い親和性の
輸送機構を利用して、水酸化鉄の重合物を用している。
輸送機構を利用して、水酸化鉄の重合物を用している。
鉄のこれらの同化機構は、遺伝子操作の分野で最もよく
知られた微生物である大腸jtJ(Bscherich
iacadi) で特に研究されてきた。
知られた微生物である大腸jtJ(Bscherich
iacadi) で特に研究されてきた。
大腸菌における鉄の高い輸送親和性の細胞内系では担鉄
細胞のエンテロハクチンを利用する。このエンテロバク
チンは、鉄を制限された環境下に大腸菌が置かれた時に
培地中に合皮され、分泌される。従って、三価鉄のエン
テロバクチン錯体は外皮の位置(81kDaのFep
A蛋白質)に捕捉され、細胞質へ向かって送られる。内
部に入った鉄はエンテロバクチンの加水分解によって鉄
が遊離され、次いで二価鉄に還元される。
細胞のエンテロハクチンを利用する。このエンテロバク
チンは、鉄を制限された環境下に大腸菌が置かれた時に
培地中に合皮され、分泌される。従って、三価鉄のエン
テロバクチン錯体は外皮の位置(81kDaのFep
A蛋白質)に捕捉され、細胞質へ向かって送られる。内
部に入った鉄はエンテロバクチンの加水分解によって鉄
が遊離され、次いで二価鉄に還元される。
大腸菌のエンテロバクチン系は少なくとも13の遺伝子
を含み、7つの遺伝子(ent)は担鉄細胞の生合成に
関与し、5つの遺伝子(fep)は輸送蛋白質をコード
する。
を含み、7つの遺伝子(ent)は担鉄細胞の生合成に
関与し、5つの遺伝子(fep)は輸送蛋白質をコード
する。
エンテロバクチン系の他に、大腸菌の敗血症菌株は担鉄
細胞ヒドロキザメートすなわちアエロバクチンを分泌し
、輸送する。
細胞ヒドロキザメートすなわちアエロバクチンを分泌し
、輸送する。
ウィリアムズ(P、H,WILLIAMS) <37)
は1979年1ごある種のCol V型のプラスミドは
、外皮の位置に担鉄細胞アエロバクターと、lut A
蛋白(74kl]aの蛋白質)と呼ばれるそのレセプタ
ーの遺伝子を有しているということを発見した。
は1979年1ごある種のCol V型のプラスミドは
、外皮の位置に担鉄細胞アエロバクターと、lut A
蛋白(74kl]aの蛋白質)と呼ばれるそのレセプタ
ーの遺伝子を有しているということを発見した。
アエロバクチンの鉄イオンとの結合定数はエンテロバク
チンより低いが、トランスフェリンまたはラクトフェリ
ンに結合された鉄を回収する能力が大きいという構造的
特性を持っている。
チンより低いが、トランスフェリンまたはラクトフェリ
ンに結合された鉄を回収する能力が大きいという構造的
特性を持っている。
1979年ニウィリアムズ(P、l−1,IIILLI
八Ms) へ明うかにして以来、アエロバクチンによる
鉄の輸送系が大腸菌やその他多くの病原菌株の閉力に決
定的な役割を果していることが極めて多くの研究によっ
て示された〔グリフイス達(GRIEFFITH) (
13) :]。
八Ms) へ明うかにして以来、アエロバクチンによる
鉄の輸送系が大腸菌やその他多くの病原菌株の閉力に決
定的な役割を果していることが極めて多くの研究によっ
て示された〔グリフイス達(GRIEFFITH) (
13) :]。
担鉄細胞アエロバクチンが存在することは、病原菌株の
閉力に非常に好都合である。
閉力に非常に好都合である。
アエロバクチンはエンテロバクチンより弱いキレート化
剤ではあるが、より多様な環境条件下においても活性が
大きい(エンテロバクチンは酸化とpH変化に対して極
めて敏感である)ため、アエロバクチンは細菌により大
きな適応度を与える。
剤ではあるが、より多様な環境条件下においても活性が
大きい(エンテロバクチンは酸化とpH変化に対して極
めて敏感である)ため、アエロバクチンは細菌により大
きな適応度を与える。
また、アエロバクチンは、大腸菌をキレート化剤の存在
下で培養した場合に、細菌の成長をより大きく刺激し、
恐らく、好ましい遺伝子誘導によって、エンテロバクチ
ンより早く分泌される。
下で培養した場合に、細菌の成長をより大きく刺激し、
恐らく、好ましい遺伝子誘導によって、エンテロバクチ
ンより早く分泌される。
細菌は、アエロバクチンオペロンによって、最小数の補
足遺伝子と、単純な小さな担鉄細胞であるアニロバクチ
ン合成層のみの4つの遺伝子と、外皮のレセプターをコ
ードする1つの遺伝子とにって、極めて効率の高い鉄の
輸送系を獲得する。
足遺伝子と、単純な小さな担鉄細胞であるアニロバクチ
ン合成層のみの4つの遺伝子と、外皮のレセプターをコ
ードする1つの遺伝子とにって、極めて効率の高い鉄の
輸送系を獲得する。
ヒドロキサメートの移動に必要な他の遺伝子は、基本的
に全ての大腸菌に存在している。
に全ての大腸菌に存在している。
外被タンパクと、担鉄細胞レセプターと、対応する担鉄
細胞とをコードする全ての遺伝子の発現は単一の蛋白質
Furによって調節されろ。この蛋白質Forは、鉄が
十分な量使用できる時にはリプレッサーとして作用する
。この中央調節系に加えて、環境条件に応じて各系の発
現を変調する個々の調節系が付加される。
細胞とをコードする全ての遺伝子の発現は単一の蛋白質
Furによって調節されろ。この蛋白質Forは、鉄が
十分な量使用できる時にはリプレッサーとして作用する
。この中央調節系に加えて、環境条件に応じて各系の発
現を変調する個々の調節系が付加される。
他の研究音速は、鉄が欠如した培地中でのIROMPの
発現を増加させるために、ジピリジルのような化学的キ
レート化剤を用いて細菌を培養した[ビンプリー7 (
A、BINDEREIF)達1’Col V担持大腸菌
のクロアシンレセプターはFe”アエロバクチン系の部
分」ジャーナル オブ バクテリオロジー、(J、 B
acteriology) 198(]年、150号、
1472〜1475頁、マロルダ(C1MAROLD^
)達「内部侵入した大腸菌と7レキスナー赤痢菌内での
アニロバクチン鉄取込み系における染色体遺伝子のフラ
ンキングと内部の区域」ジャーナル オブ ミクロバイ
オロジー(J、 GeneralMicrobiolo
gy) 1937年、133号、第2269〜227
8頁、ピンデレーフ(A、 BIN[]BR巳IF)達
rcol Vプラスミドのアエロバクチンを媒介とする
鉄量化系のクローニング」ジャーナル オブバクテリオ
ロジ−(J、 Bacteriology) 1983
年、第153号、11.1.1〜1113頁、ロレンゾ
(口e LORENZO)達「K12大腸菌におけるC
ot V −K30プラスミドのアニロバクチン生合成
と輸送遺伝子」ジャーナルオブ バクテリオロジ−(J
、Bacteriol、) 1986年、5 165号、570〜578頁、ワルナー(P、 War
ner)達「大腸菌の侵入菌株によるCal Vプラス
ミド−特定アエロバクチンの合成」゛′感染と免疫”
(Infect+on and Immunity)1
981年、33号、540〜54.5頁、グリイフィス
(IE、GRIFFITH)達rK−12大腸菌フレス
キナー赤痢閑ハイブリドーマと大腸菌の内部侵入菌株と
によるアエロバクチンおよび76(10)0ダルトンの
鉄調節外被タンパクの合成」゛感染と免疫(Infec
tion and Immunity)” 1985年
、49号、67〜71頁(この研究では、大腸菌の内部
侵入菌株がオボトランスフェリンの存在下で鉄の量を減
少させた培養液中でアエロバクチンおよび76にの外皮
膜蛋白を生成することを示した)]。
発現を増加させるために、ジピリジルのような化学的キ
レート化剤を用いて細菌を培養した[ビンプリー7 (
A、BINDEREIF)達1’Col V担持大腸菌
のクロアシンレセプターはFe”アエロバクチン系の部
分」ジャーナル オブ バクテリオロジー、(J、 B
acteriology) 198(]年、150号、
1472〜1475頁、マロルダ(C1MAROLD^
)達「内部侵入した大腸菌と7レキスナー赤痢菌内での
アニロバクチン鉄取込み系における染色体遺伝子のフラ
ンキングと内部の区域」ジャーナル オブ ミクロバイ
オロジー(J、 GeneralMicrobiolo
gy) 1937年、133号、第2269〜227
8頁、ピンデレーフ(A、 BIN[]BR巳IF)達
rcol Vプラスミドのアエロバクチンを媒介とする
鉄量化系のクローニング」ジャーナル オブバクテリオ
ロジ−(J、 Bacteriology) 1983
年、第153号、11.1.1〜1113頁、ロレンゾ
(口e LORENZO)達「K12大腸菌におけるC
ot V −K30プラスミドのアニロバクチン生合成
と輸送遺伝子」ジャーナルオブ バクテリオロジ−(J
、Bacteriol、) 1986年、5 165号、570〜578頁、ワルナー(P、 War
ner)達「大腸菌の侵入菌株によるCal Vプラス
ミド−特定アエロバクチンの合成」゛′感染と免疫”
(Infect+on and Immunity)1
981年、33号、540〜54.5頁、グリイフィス
(IE、GRIFFITH)達rK−12大腸菌フレス
キナー赤痢閑ハイブリドーマと大腸菌の内部侵入菌株と
によるアエロバクチンおよび76(10)0ダルトンの
鉄調節外被タンパクの合成」゛感染と免疫(Infec
tion and Immunity)” 1985年
、49号、67〜71頁(この研究では、大腸菌の内部
侵入菌株がオボトランスフェリンの存在下で鉄の量を減
少させた培養液中でアエロバクチンおよび76にの外皮
膜蛋白を生成することを示した)]。
細菌による鉄獲得系に関するこれら最近の知識を用いる
ことによって、病原菌に対して戦う新しい方法を開発す
ることが可能になった。
ことによって、病原菌に対して戦う新しい方法を開発す
ることが可能になった。
鉄輸送系を工夫して、細菌細胞内部に入れることができ
るような細菌に有害な担鉄細胞の類似体を合成する方法
が提案されているが、この合成キレート化剤は天然の担
鉄細胞よりも鉄(IIT) に対する親和性が低いた
め、トランスフェリンの鉄を輸送させることは不可能で
ある。
るような細菌に有害な担鉄細胞の類似体を合成する方法
が提案されているが、この合成キレート化剤は天然の担
鉄細胞よりも鉄(IIT) に対する親和性が低いた
め、トランスフェリンの鉄を輸送させることは不可能で
ある。
ロジャース(ROGER3)は、アエロバクチンと3価
金属イオンとの錯体を形成させることによって、天然の
エンテロバクチン−p e 34″錯体に対する抗代謝
物として用いることを提案している。スカンジウム(S
c”)およびインジウム(In”) の錯体のみが抗細
菌活性を示している[ロジャース(ROGEIIS)達
(26)、ロジャース(ROGER3) <27) ]
。
金属イオンとの錯体を形成させることによって、天然の
エンテロバクチン−p e 34″錯体に対する抗代謝
物として用いることを提案している。スカンジウム(S
c”)およびインジウム(In”) の錯体のみが抗細
菌活性を示している[ロジャース(ROGEIIS)達
(26)、ロジャース(ROGER3) <27) ]
。
また、ある種の血清蛋白に担体分子の役目をする芳香族
分子であるフェノラート型の担鉄細胞を吸着させて、担
鉄細胞に対する抗体を誘導する方法も提案されている。
分子であるフェノラート型の担鉄細胞を吸着させて、担
鉄細胞に対する抗体を誘導する方法も提案されている。
すなわち、バイヤー(BYER8) (5)は、魚に発
現した親水性アエロモナス(ヒトと魚の敗血症の原因と
なる細菌)が生産した担鉄細胞フェノラートに対するワ
クチンを記載している。この担鉄細胞は、ヒトアルブミ
ンまたは牛アルブミンと共有結合で結合されていたもの
である。この調製物で免疫した魚は担鉄細胞に対して反
応する抗体を作るが、この抗体が担鉄細胞を無力化する
かどうかは分かっていない。
現した親水性アエロモナス(ヒトと魚の敗血症の原因と
なる細菌)が生産した担鉄細胞フェノラートに対するワ
クチンを記載している。この担鉄細胞は、ヒトアルブミ
ンまたは牛アルブミンと共有結合で結合されていたもの
である。この調製物で免疫した魚は担鉄細胞に対して反
応する抗体を作るが、この抗体が担鉄細胞を無力化する
かどうかは分かっていない。
ボリン(BOLIN)達(4)は、大腸菌により敗血症
から七面鳥の保護する鉄によって調節させれた外被蛋白
に対する抗体によって一定の積極免疫状態での研究結果
を発表している。
から七面鳥の保護する鉄によって調節させれた外被蛋白
に対する抗体によって一定の積極免疫状態での研究結果
を発表している。
しかし、有効なワクチンの開発を目的とした今日までの
試みは、鉄によって調節される外被蛋白を細菌培養によ
って細菌に十分な量で発現させるという点で全て困難な
課題に直面している。
試みは、鉄によって調節される外被蛋白を細菌培養によ
って細菌に十分な量で発現させるという点で全て困難な
課題に直面している。
発明が解決しようとする課題
本発明はこの課題を解するために、有効成分として、鉄
によって調節される外被蛋白を多量に発現する細菌、特
に担鉄細胞のレセプターを、これらレセプターによる担
鉄細胞の特定認識を妨害する抗体の生成を誘導するのに
十分な量でワクチン中で使用するものである。
によって調節される外被蛋白を多量に発現する細菌、特
に担鉄細胞のレセプターを、これらレセプターによる担
鉄細胞の特定認識を妨害する抗体の生成を誘導するのに
十分な量でワクチン中で使用するものである。
本発明の目的の1つは、保護抗原として使用可能な鉄に
よって調節される外皮蛋白(IROMP)を発只 現する細菌を提供することにある。
よって調節される外皮蛋白(IROMP)を発只 現する細菌を提供することにある。
本発明の他の目的は、遺伝子組換えによって鉄によって
調節される外被タンパクを敗血症菌から合成する方法を
提案することにある。
調節される外被タンパクを敗血症菌から合成する方法を
提案することにある。
本発明のさらに他の目的は、遺伝子組替えによるタンパ
ク合成によって、大腸菌およびその他の属を用いて、I
ROMP 5Iut AおよびPep Aタンパク、担
鉄細胞レセプター、アエロバクチンおよびエンテロバク
チンを大量に製造することにある。
ク合成によって、大腸菌およびその他の属を用いて、I
ROMP 5Iut AおよびPep Aタンパク、担
鉄細胞レセプター、アエロバクチンおよびエンテロバク
チンを大量に製造することにある。
本発明のさらに他の目的は、遺伝子組替え、その他の方
法によって得られたIIIOMPおよびJutΔおよび
Pep Aタンパクを外被中に大量に含む細菌または細
菌断片を有効成分として含むウィルスを提供することに
ある。
法によって得られたIIIOMPおよびJutΔおよび
Pep Aタンパクを外被中に大量に含む細菌または細
菌断片を有効成分として含むウィルスを提供することに
ある。
本発明のさらに他の目的は、有効成分として、IRQM
P 、例えばJut Aおよび/またはFep A蛋白
またはこれら蛋白を有する抗原の調製物を含むウィルス
を提供することにある。
P 、例えばJut Aおよび/またはFep A蛋白
またはこれら蛋白を有する抗原の調製物を含むウィルス
を提供することにある。
課題を解決するための手段
本発明は、ウィルス製造に使用可能な鉄によって調節さ
れる外被タンパクを発現する細菌(その一部は担鉄細胞
のレセプターである)を利用する。
れる外被タンパクを発現する細菌(その一部は担鉄細胞
のレセプターである)を利用する。
本発明によるこの細菌の特徴は、外被タンパク、特にト
ランスフエイノンレセプターと担鉄細胞レセプターとを
多量に発現して、これら蛋白質をワクチン中で使用した
時に、これらレセプターによる特定認識機能を妨害し且
つ病原菌への鉄の補給を停止させる抗臓の形成を誘導す
る点にある。
ランスフエイノンレセプターと担鉄細胞レセプターとを
多量に発現して、これら蛋白質をワクチン中で使用した
時に、これらレセプターによる特定認識機能を妨害し且
つ病原菌への鉄の補給を停止させる抗臓の形成を誘導す
る点にある。
本発明で用いる細菌は腸内細菌であるのが好ましく、エ
ンテロバクチンおよび/またはアニロバクチン担鉄細胞
を分泌するものが好ましい。
ンテロバクチンおよび/またはアニロバクチン担鉄細胞
を分泌するものが好ましい。
これらの細菌は大腸菌(Bscherichia co
il)、クレブシェラ(Klebsiel la)、ね
ずみチフス菌(Salmonella thyphim
urim)、赤痢菌(Shige14a)からなる群か
ら選択するのが好ましい。
il)、クレブシェラ(Klebsiel la)、ね
ずみチフス菌(Salmonella thyphim
urim)、赤痢菌(Shige14a)からなる群か
ら選択するのが好ましい。
これらの細菌は、好ましくはアエロバクチンおよびとエ
ンテロバクチン担鉄細胞を一緒に分泌す9 本発明の1実施態様では、これらの細菌は、自然に存在
株または研究用または標本としてで利用可能な菌株を、
外被タンパクの発現が十分に増大するレベルまで鉄の摂
取可能量を減少させた最低培地中で培養することによっ
て得られる。この培養は三価の#(■)を強力にキレー
ト化するタンパク、例えばラクトフェリン等存在化で行
うのが好ましい。上記キレート化剤は、生体内の場合と
同様に、鉄の摂取量を制思する利点をを有している。
ンテロバクチン担鉄細胞を一緒に分泌す9 本発明の1実施態様では、これらの細菌は、自然に存在
株または研究用または標本としてで利用可能な菌株を、
外被タンパクの発現が十分に増大するレベルまで鉄の摂
取可能量を減少させた最低培地中で培養することによっ
て得られる。この培養は三価の#(■)を強力にキレー
ト化するタンパク、例えばラクトフェリン等存在化で行
うのが好ましい。上記キレート化剤は、生体内の場合と
同様に、鉄の摂取量を制思する利点をを有している。
本発明はさらに、ウィルス製造に使用可能な上記細菌の
製造方法に関するものであり、この方法の特徴は、上記
細菌をトランスフエIJンのような三価の鉄(III)
のキレート化タンパク、特に、ラクトフェリンを含む
培地中で培養する点にある。
製造方法に関するものであり、この方法の特徴は、上記
細菌をトランスフエIJンのような三価の鉄(III)
のキレート化タンパク、特に、ラクトフェリンを含む
培地中で培養する点にある。
上記の最低培地としては、例えばシモン(SIMON)
およびテスマン(TBSSMAN) (30)に記載の
培地を使用することができる。
およびテスマン(TBSSMAN) (30)に記載の
培地を使用することができる。
しかし、通常使用されている鉄のキレート化剤の場合に
は、外被タンパクを十分に発現させるた1 めに、培養培地の鉄の含有量を大幅に減少させる必要が
あるため、上記の方法を実施するのは困難である。大抵
の場合、微量の鉄(例えば、−JQにステンレス製の培
養タンクやパイプに由来する鉄)が残るため、外被タン
パクの発現を妨げる。従って、細菌が外被蛋白を発現で
きる量まで鉄の含有量を低下させるためには、かなり複
雑な方法を用いる必要があるため、実施にはコストがか
かる。
は、外被タンパクを十分に発現させるた1 めに、培養培地の鉄の含有量を大幅に減少させる必要が
あるため、上記の方法を実施するのは困難である。大抵
の場合、微量の鉄(例えば、−JQにステンレス製の培
養タンクやパイプに由来する鉄)が残るため、外被タン
パクの発現を妨げる。従って、細菌が外被蛋白を発現で
きる量まで鉄の含有量を低下させるためには、かなり複
雑な方法を用いる必要があるため、実施にはコストがか
かる。
好ましい実施態様である本発明の第2の実施態様では、
外被タンパク、担鉄細胞レセプターを多量に発現する細
菌が組み換えプラスミドにより変換される。
外被タンパク、担鉄細胞レセプターを多量に発現する細
菌が組み換えプラスミドにより変換される。
この遺伝子組み換えによる外被タンパク、担鉄細胞また
はトランスフェリンレセプターの合或は下記のような多
くの利点がある: 〔1)培養培地の鉄の濃度とは無関係にこれらの蛋白を
多量に発現させることが可能である。
はトランスフェリンレセプターの合或は下記のような多
くの利点がある: 〔1)培養培地の鉄の濃度とは無関係にこれらの蛋白を
多量に発現させることが可能である。
(2) 出発菌株の他の構成要素を全て除いたこれら
の蛋白に対する直接的な免疫反応を研究することができ
る。
の蛋白に対する直接的な免疫反応を研究することができ
る。
2
〔3)鉄(ステンレス製の培養タンク、パイプ、各種装
置)が常に存在する環境下において外被蛋白を発現させ
る最も経済的な方法である。
置)が常に存在する環境下において外被蛋白を発現させ
る最も経済的な方法である。
本出願人は、特に、大腸菌てのJut AおよびFep
A蛋白、担鉄細胞レセプター、アよりバクチンおよび
エンテロバクチンの合成に興味を持ったが、以下に説明
する遺伝子組み換え技術は、外被タンパク(l R[]
MP)、担鉄細胞レセプター(アエロバクチンおよびエ
ンテロバクチン)または大腸菌以外の病原菌のトランス
フェリンの合成にも同様に使用できることは理解されよ
う。
A蛋白、担鉄細胞レセプター、アよりバクチンおよび
エンテロバクチンの合成に興味を持ったが、以下に説明
する遺伝子組み換え技術は、外被タンパク(l R[]
MP)、担鉄細胞レセプター(アエロバクチンおよびエ
ンテロバクチン)または大腸菌以外の病原菌のトランス
フェリンの合成にも同様に使用できることは理解されよ
う。
従って、本発明はさらに、遺伝子組み換えによる大腸菌
のjut Aおよび/またはFep A蛋白の製造に関
するものである。
のjut Aおよび/またはFep A蛋白の製造に関
するものである。
このIut A蛋白は下記の方法で合成することができ
る (1)アエロバクチン−オペロンを保持するチフス菌、
赤痢菌またはクレブシェラ病原菌の大腸菌株からプラス
ミドまたは染色体を分離し、(2) iut A遺伝
子を含む断片をプラスミドまたは3 染色体から分離し、 (3) この断片をクローニングベクターと結合させ
、(4)発現ベクター(例えば、プラスミドGTI (
10)1)中にiut A遺伝子と結合したクローンを
挿入し、 (5) クローン培養によってIut A%蛋白を発
現させる。
る (1)アエロバクチン−オペロンを保持するチフス菌、
赤痢菌またはクレブシェラ病原菌の大腸菌株からプラス
ミドまたは染色体を分離し、(2) iut A遺伝
子を含む断片をプラスミドまたは3 染色体から分離し、 (3) この断片をクローニングベクターと結合させ
、(4)発現ベクター(例えば、プラスミドGTI (
10)1)中にiut A遺伝子と結合したクローンを
挿入し、 (5) クローン培養によってIut A%蛋白を発
現させる。
また、上記Fep A蛋白質は下記の方法で合成するこ
とができる 〔1) プラスミド[例えば、ラールド([、八I
RD) とヤング(YOUNG) (19) によっ
て得られるプラスミドpMS ]または大腸菌、チフス
菌またはクレブシェラ閑の染色体からfep A遺伝子
を含む断片を分離し、 (2) この断片をクローニングベクター内でクロー
ニングし、 (3)発現ベクター、好ましくはJut A蛋白の発現
に使用されるベクター(プラスミドGTI (10)1
)中にハルA遺伝子を挿入し、 (4) クローン培養によってFep A蛋白を発現
させ4 る。
とができる 〔1) プラスミド[例えば、ラールド([、八I
RD) とヤング(YOUNG) (19) によっ
て得られるプラスミドpMS ]または大腸菌、チフス
菌またはクレブシェラ閑の染色体からfep A遺伝子
を含む断片を分離し、 (2) この断片をクローニングベクター内でクロー
ニングし、 (3)発現ベクター、好ましくはJut A蛋白の発現
に使用されるベクター(プラスミドGTI (10)1
)中にハルA遺伝子を挿入し、 (4) クローン培養によってFep A蛋白を発現
させ4 る。
Iut A蛋白および/またはFep A蛋白の発現ベ
クターは細菌でよく、発現系が最も良く知られている大
腸菌を使用するのが好ましいが、他のベクター、特に、
当業者には製造方法が知られているウィルスまたは酵母
からなるベクターを使用することもできる。
クターは細菌でよく、発現系が最も良く知られている大
腸菌を使用するのが好ましいが、他のベクター、特に、
当業者には製造方法が知られているウィルスまたは酵母
からなるベクターを使用することもできる。
Jut Aおよび/またはPep A蛋白を発現する上
記細菌クローンは、発現を阻止または制限するのに十分
な低温度、通常32℃未満て、適当な培地中で繁殖させ
ることができる。次いで、温度を4時間上げ、例えば、
42℃にして発現を誘導して1utAおよびfep A
遺伝子を誘導させる。
記細菌クローンは、発現を阻止または制限するのに十分
な低温度、通常32℃未満て、適当な培地中で繁殖させ
ることができる。次いで、温度を4時間上げ、例えば、
42℃にして発現を誘導して1utAおよびfep A
遺伝子を誘導させる。
こうして、Jut AおよびPep A蛋白と、これら
の前駆体である大きな寸法の細胞質を封入した形態のp
rolut AおよびproFep Aとが一体になっ
た細菌が得られる。
の前駆体である大きな寸法の細胞質を封入した形態のp
rolut AおよびproFep Aとが一体になっ
た細菌が得られる。
これらの細菌はワクチン中で有効成分として使用されて
、jut AおよびFep A蛋白に対する抗原の形成
が誘導される。この抗原はこれら蛋白が各5 々のアエロバクチンおよびエンテロバクチンの担鉄細胞
の認識を阻止し且つ細菌への鉄の供給を大幅に減少させ
て、その繁殖を防ぐ役目をする。
、jut AおよびFep A蛋白に対する抗原の形成
が誘導される。この抗原はこれら蛋白が各5 々のアエロバクチンおよびエンテロバクチンの担鉄細胞
の認識を阻止し且つ細菌への鉄の供給を大幅に減少させ
て、その繁殖を防ぐ役目をする。
従って、本発明はさらに、鉄によって調節される外被タ
ンパクを発現させる絹み換え細菌を有効成分として含む
ワクチンにも関するものである。
ンパクを発現させる絹み換え細菌を有効成分として含む
ワクチンにも関するものである。
さらに詳細には、本発明は、有効成分として組み換え遺
伝子または遺伝子の断片、特にJut Aおよび/また
はFep A蛋白および/またはその前駆体prolu
t Aおよび/またはproFep Aを含む外被断片
、もしくは、tut Aおよび/またはFep A蛋白
および/またはその前駆体、例えば、組み換え細菌の細
胞質または外被抽出物を含むワクチンを対象とする。
伝子または遺伝子の断片、特にJut Aおよび/また
はFep A蛋白および/またはその前駆体prolu
t Aおよび/またはproFep Aを含む外被断片
、もしくは、tut Aおよび/またはFep A蛋白
および/またはその前駆体、例えば、組み換え細菌の細
胞質または外被抽出物を含むワクチンを対象とする。
本発明の他の実施態様で提供されるワクチンは、鉄の量
が制限された環境下で培養することによって、jut
Aおよび/またはPep A蛋白および/またはこれら
の前駆体の量が増加した敗血症菌の類縁菌、その断片、
その適当な抽出1+tAおよび/またはFep A蛋白
(および/またはこれらの前駆6 体)を有効成分として含んでいる。
が制限された環境下で培養することによって、jut
Aおよび/またはPep A蛋白および/またはこれら
の前駆体の量が増加した敗血症菌の類縁菌、その断片、
その適当な抽出1+tAおよび/またはFep A蛋白
(および/またはこれらの前駆6 体)を有効成分として含んでいる。
これらのワクチンは、蛋白質型の鉄(III) に対
する強いキレート化剤、特にトランスフェリン、ラクト
フェリンまたはオボフエリンを含む培地中で培養した細
菌を主成分として製造するのが好ましい。
する強いキレート化剤、特にトランスフェリン、ラクト
フェリンまたはオボフエリンを含む培地中で培養した細
菌を主成分として製造するのが好ましい。
本発明は、添付図面を参照して説明する以下の実施例に
よってより明らかとなろう。
よってより明らかとなろう。
7
以下の説明で使用する略号は、次の意味を示す。
Amp’ 抵抗性アンピシリン
C1o″ 敏感性クロアシン
dへTP テ゛ソキンーアデノシンートリフォス
フェート BDTA エチレン−ジアミン−四酢酸Bnt
エントロバクチン E、 OlP、 S、 特殊な病原菌体を除くIPT
G イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド kpb K対塩基 LB ルユリア培養液 OMF 外皮蛋白 PAGB 塩基性ポリアクリルアミドゲルの電気
泳動 pb 塩基対 PBS ホスフェート緩衝液(その食塩水溶液) SO3ドデシル硫酸ナトリウム 8 T T[iMED rys tet’ シモン(Simon) とテスマン(Tessman
)N、 N、 N’ 、 N’ −テトラメチレンジ
アミドリス−ヒドロキシ−アミノメチ ルーメタン 抵抗性テトラザイクリン 材料と方法 1、材料 1、虞巷 第1表に使用した菌株をまとめて示した。使用した病原
菌株は、子牛とひな鶏の敗血症菌株であり、菌研究所ロ
ーヌーメリュー(RHON巳−M[ERIBUX)から
提供された。
フェート BDTA エチレン−ジアミン−四酢酸Bnt
エントロバクチン E、 OlP、 S、 特殊な病原菌体を除くIPT
G イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド kpb K対塩基 LB ルユリア培養液 OMF 外皮蛋白 PAGB 塩基性ポリアクリルアミドゲルの電気
泳動 pb 塩基対 PBS ホスフェート緩衝液(その食塩水溶液) SO3ドデシル硫酸ナトリウム 8 T T[iMED rys tet’ シモン(Simon) とテスマン(Tessman
)N、 N、 N’ 、 N’ −テトラメチレンジ
アミドリス−ヒドロキシ−アミノメチ ルーメタン 抵抗性テトラザイクリン 材料と方法 1、材料 1、虞巷 第1表に使用した菌株をまとめて示した。使用した病原
菌株は、子牛とひな鶏の敗血症菌株であり、菌研究所ロ
ーヌーメリュー(RHON巳−M[ERIBUX)から
提供された。
クローニング、配列および発現に使用した宿主菌株は全
て大腸菌に12由来のものである。
て大腸菌に12由来のものである。
これらの菌は、他の野性の敗血症菌株や研究室の菌株に
容易に変えることができる。
容易に変えることができる。
2、プラスミド
クローニングと発現に使用した菌株の起源と9
特性を第2表に示した。
3、培地
シモン(Sll、l0N) とテスマン(TESSI
、IAN) (30)の最低培地 その組成を、以下に示す NaC15,8g KCI 3.7 g CaC12,2H2(10),15g MgC12,6H2(10),10g NH,CI 1.10 gNa2S0.
0.142 gKH2PO40,272g Trys 11.20 gH20QSl
l 1(10)0 m p)17.4唯一の
炭素源は、最終濃度10 g / 12で添加される琥
珀酸ナトリウムである。
、IAN) (30)の最低培地 その組成を、以下に示す NaC15,8g KCI 3.7 g CaC12,2H2(10),15g MgC12,6H2(10),10g NH,CI 1.10 gNa2S0.
0.142 gKH2PO40,272g Trys 11.20 gH20QSl
l 1(10)0 m p)17.4唯一の
炭素源は、最終濃度10 g / 12で添加される琥
珀酸ナトリウムである。
この培地中での鉄を制限をするために、最終濃度250
μg/rd (5(10)μg/mg以上の濃度が可能
である)のオボトランスフェリン(SIG0 MA>を添加する。
μg/rd (5(10)μg/mg以上の濃度が可能
である)のオボトランスフェリン(SIG0 MA>を添加する。
鉄が豊富な対照培地は、FeCl3・6H20(M E
RCK)を最#濃度40μg / mlで添加すること
によって得られる。
RCK)を最#濃度40μg / mlで添加すること
によって得られる。
マニアティス(MANIATIS)の最低培地(29〉
Na2HPO46,Og KH2PO43,0g NaCI 0.5 gNH4C11
,0g H20qsp 1(10)0 d pH7,
4この基本培地に以下のものを添加する:Mg S O
41M 2mR/ 1(10)0m#グルコー
ス 20% 10mC/1(10)0−CaCL21
M O,1−/ 1(10)0m(1(10)
Oが豊富な培地[マニアティス(MANIATIS)達
(23)] バタトトリプトン 10 g 酵母の抽出物 5g NaC15g H20QSII 101(10)OpH7,4(
2) (3) (4) BTSが豊富な培地(BIOMERIEIIX)バイオ
トリプターゼ 17 g バイオソヤーセ 3g NaC] 5 gK2HP○4
2.5g グルコース 2,5g H2OQSplooo me pH7,3BHIが
豊富な培地(心臓−脳、BID MBRIE[IX)子
牛の脳の注入物 2(10)g 牛の心臓の注入物 250g パイオージェリドン 10 g NaCl 5 gNa2HP 0
4 2.5gグルコース 2.
0g ’820 qsplooo ml pH7,4発
現培地用のrM9 3PJが豊富な培地SP
1(10)d(トリプトン3.2%、酵母抽
出物2%)M9 (6,6Xl縮)15− (0,22μmの濾紙で濾過(1(10)0個の孔)2 Mg S041(10)mM 15me
FeCI30.1 mM 1.5rdビタ
ミンBl (溶液5%>1.5d個体培地は対応する液
体培地と同様の組成てあり、培地llにつき寒天12g
を含む。
Na2HPO46,Og KH2PO43,0g NaCI 0.5 gNH4C11
,0g H20qsp 1(10)0 d pH7,
4この基本培地に以下のものを添加する:Mg S O
41M 2mR/ 1(10)0m#グルコー
ス 20% 10mC/1(10)0−CaCL21
M O,1−/ 1(10)0m(1(10)
Oが豊富な培地[マニアティス(MANIATIS)達
(23)] バタトトリプトン 10 g 酵母の抽出物 5g NaC15g H20QSII 101(10)OpH7,4(
2) (3) (4) BTSが豊富な培地(BIOMERIEIIX)バイオ
トリプターゼ 17 g バイオソヤーセ 3g NaC] 5 gK2HP○4
2.5g グルコース 2,5g H2OQSplooo me pH7,3BHIが
豊富な培地(心臓−脳、BID MBRIE[IX)子
牛の脳の注入物 2(10)g 牛の心臓の注入物 250g パイオージェリドン 10 g NaCl 5 gNa2HP 0
4 2.5gグルコース 2.
0g ’820 qsplooo ml pH7,4発
現培地用のrM9 3PJが豊富な培地SP
1(10)d(トリプトン3.2%、酵母抽
出物2%)M9 (6,6Xl縮)15− (0,22μmの濾紙で濾過(1(10)0個の孔)2 Mg S041(10)mM 15me
FeCI30.1 mM 1.5rdビタ
ミンBl (溶液5%>1.5d個体培地は対応する液
体培地と同様の組成てあり、培地llにつき寒天12g
を含む。
抗性物質は、個体培地と液体培地で以下の最終濃度で使
用される: アンピシリン 24 μg/rd。
用される: アンピシリン 24 μg/rd。
テトラザイクリン 12.5μg/mlイソプロピル
ーβ−D−チオガラクトピラノサイド(IPTG)は、
必要に応じて、最終濃度0.05〜0.4mMで添加さ
れる。
ーβ−D−チオガラクトピラノサイド(IPTG)は、
必要に応じて、最終濃度0.05〜0.4mMで添加さ
れる。
液体および個体培地の殺菌は20分間120℃のオート
クレーブによって実施する。
クレーブによって実施する。
抗性物質、ビタミンB1、コハク酸ナトリウム、M9(
6,6X)、Mg5D1、FeC15、IPTGおよび
オボトランスフェリンの溶液を、濃縮貯蔵液の形で調製
し、孔寸法が0.22μm (1(10)0個の孔)の
濾紙で濾過して殺菌する。
6,6X)、Mg5D1、FeC15、IPTGおよび
オボトランスフェリンの溶液を、濃縮貯蔵液の形で調製
し、孔寸法が0.22μm (1(10)0個の孔)の
濾紙で濾過して殺菌する。
殺菌後、培養培地は室温で保存する。
3
抗性物質、IPTGおよびオボトランスフェリンの貯蔵
液は一20℃に保つ。
液は一20℃に保つ。
その他の溶液は+4℃に保つ。
+1. 方法
1、細菌の培養
+30℃で培養した発現ベクターpGT+ (10)1
の場合を除いて、クローン培養は全て撹拌下に+37℃
で18時間実施する。
の場合を除いて、クローン培養は全て撹拌下に+37℃
で18時間実施する。
必要な場合には細菌の成長を分光光度計ベックマン(B
εCKIIAN) DU 40を使用して6(10
)nmで懸濁液の混濁度を測定することによって評価す
る。
εCKIIAN) DU 40を使用して6(10
)nmで懸濁液の混濁度を測定することによって評価す
る。
培養は通常はコロニー植付は後に容積2−の容積で実施
する。より大容積(20〜1(10)0−)での培養は
、予備培養で静止相に1/1(10)で植付けた後実施
する。
する。より大容積(20〜1(10)0−)での培養は
、予備培養で静止相に1/1(10)で植付けた後実施
する。
4
各々エンテロバタタークロアカエ(Enterobac
t。
t。
er cloacae) DF13と、大腸菌13(
10)の菌株を使用して、デ グラフ(DIEGRAA
F)達く8)と(9)に記載の方法で実施した。
10)の菌株を使用して、デ グラフ(DIEGRAA
F)達く8)と(9)に記載の方法で実施した。
これらの菌株は、BHI培地で、1−37℃で、光学的
濃度が0.5(1cm、 6(10)nm)になるまで
培養される。次に、この培養培地にマイトマイシンCを
添加して、最終濃度を1μg/ml!にし、それによっ
てバタテリオシンの合皮を誘導することができる。培養
は、溶解相まで、6時間の間、+37℃で続行する。細
菌体を遠心分離して(8(10)0G、3(lnm、
+4℃)、上澄み液を回収する。次に、+4℃で、徐々
に硫酸アンモニアを添加して、濃度を365 g /
ffにする。
濃度が0.5(1cm、 6(10)nm)になるまで
培養される。次に、この培養培地にマイトマイシンCを
添加して、最終濃度を1μg/ml!にし、それによっ
てバタテリオシンの合皮を誘導することができる。培養
は、溶解相まで、6時間の間、+37℃で続行する。細
菌体を遠心分離して(8(10)0G、3(lnm、
+4℃)、上澄み液を回収する。次に、+4℃で、徐々
に硫酸アンモニアを添加して、濃度を365 g /
ffにする。
上澄み液をp H7,0の0.05Mホスフェート緩衝
液に取り、この緩衝液を複数の連続した浴で透析する。
液に取り、この緩衝液を複数の連続した浴で透析する。
透析物を0.22μm <1.(10)0個の孔)で濾
過して、−20℃に保つ。
過して、−20℃に保つ。
研究したクローンの約10’個の細菌を適切に選択した
抗生物質を含む寒天上に広げる。この5 液が完全に吸収された後、ぺ) U (Petri)7
5 μlの箱にバタテリオンン溶液の中心に置く。この
滴が乾くい後、ぺ) ’J (Petri)箱を18時
間保温器(場合によって+30℃か+37℃)に置く。
抗生物質を含む寒天上に広げる。この5 液が完全に吸収された後、ぺ) U (Petri)7
5 μlの箱にバタテリオンン溶液の中心に置く。この
滴が乾くい後、ぺ) ’J (Petri)箱を18時
間保温器(場合によって+30℃か+37℃)に置く。
配置された位置で成長阻害を示すクローンが、バタテリ
オシンに対する感受性を獲得したことになる。反対に、
バタテリオシンの毒性作用に耐性のあるクローンは均一
な細菌マツプを示す。
オシンに対する感受性を獲得したことになる。反対に、
バタテリオシンの毒性作用に耐性のあるクローンは均一
な細菌マツプを示す。
3、鉄によって調節される外被タンパクに対する抗血清
の調製 使用した方法はボリン(Bol、IN) とジャンセ
ン(JENSEN) (4)に記載のものである。
の調製 使用した方法はボリン(Bol、IN) とジャンセ
ン(JENSEN) (4)に記載のものである。
鉄によって調節される外被タンパクは、ドデシル硫酸ナ
トリウムの存在下で、ポリアクリルアミドゲルの予備電
気泳動によって分離した。
トリウムの存在下で、ポリアクリルアミドゲルの予備電
気泳動によって分離した。
ゲルの染色後、免疫化する前に、IRQMPを含む帯を
切断し、蒸留水の存在下で次第に直径を小さくした針を
連続的に通過させることによって粉砕した。
切断し、蒸留水の存在下で次第に直径を小さくした針を
連続的に通過させることによって粉砕した。
この粉砕物を第3表に示した手順で、ローヌメリ:z
−(Rhone−Mer 1eux)社が培養したホワ
イト−′−ユージランド(White New 2ea
land)株のε、 o、p、 s、 u、兎に注射す
る。
−(Rhone−Mer 1eux)社が培養したホワ
イト−′−ユージランド(White New 2ea
land)株のε、 o、p、 s、 u、兎に注射す
る。
他の外被タンパクに対する抗原と、リポポリサンカリア
トと、その他の大腸菌抗原とを除去するために、免疫の
ある兎から採取された血清をIRQMPを発現しない大
腸菌株を用いて吸収させた。
トと、その他の大腸菌抗原とを除去するために、免疫の
ある兎から採取された血清をIRQMPを発現しない大
腸菌株を用いて吸収させた。
次いで、血清I−当たり、30分間1(10)℃で熱不
活性化した細菌膜1010を添加し、1時間の間+37
℃でその混合物を培養する。
活性化した細菌膜1010を添加し、1時間の間+37
℃でその混合物を培養する。
遠心分離後、上澄み血清を回収して、孔寸法が0,22
μmのフィルター(ミルポア)で濾過する。
μmのフィルター(ミルポア)で濾過する。
その血清を一20℃に保つ。
5、外被タンパクの抽出
外被タンパクの抽出に使用した方法は、パン−y−イエ
ルー メ7 クヘルト(VAN TIEL−MENKV
ELD)7 達(36)と、フィス(FISS)達〈12)に記載の
方法である。
ルー メ7 クヘルト(VAN TIEL−MENKV
ELD)7 達(36)と、フィス(FISS)達〈12)に記載の
方法である。
遠心分離後、細菌残滓をpH8,0の0.2MのTri
s/HCI緩衝液に入れ、光学的濃度を約10にする。
s/HCI緩衝液に入れ、光学的濃度を約10にする。
次に、氷−エタノール浴に細胞懸濁液を保持して、超音
波を3度3分間撹拌して、音波化によって細菌細胞を破
裂させる。
波を3度3分間撹拌して、音波化によって細菌細胞を破
裂させる。
細胞の破片と無傷の細菌を20分間、+4℃で遠心分離
5(10)0 gによって除去する。
5(10)0 gによって除去する。
上澄み液中に懸濁している細菌膜を、60分間、+4℃
で超遠心分離110.(10)0 g Lで回収する。
で超遠心分離110.(10)0 g Lで回収する。
膜残滓は、シュナイトマン(SCHNAITMAN)
(29)に記載の抽出緩衝液5mlで回収する。この抽
出液はトリトンX−1(10)2%、MgC1z 1[
1mM、 Tris/HCI 50mM pH8,0で
ある。
(29)に記載の抽出緩衝液5mlで回収する。この抽
出液はトリトンX−1(10)2%、MgC1z 1[
1mM、 Tris/HCI 50mM pH8,0で
ある。
室温で、5分間撹拌しながら、30分間培養する。培養
中、細l包質膜タンパクをトリトンX1(10)で可溶
化する。新たに超遠心分離(110,(10)0g %
60mn、 + 4℃)して外皮を回収する。得られ
た残滓を蒸留水で3回洗浄し、最終的に、蒸8 留水1dに再度懸濁させ、保存のため一20℃で凍結さ
せる。
中、細l包質膜タンパクをトリトンX1(10)で可溶
化する。新たに超遠心分離(110,(10)0g %
60mn、 + 4℃)して外皮を回収する。得られ
た残滓を蒸留水で3回洗浄し、最終的に、蒸8 留水1dに再度懸濁させ、保存のため一20℃で凍結さ
せる。
6、蛋白質量の測定
膜抽出物の蛋白質濃度は、ローリイ(LO111’lY
)達(20)に記載の方法による比色分析方法によって
測定した。
)達(20)に記載の方法による比色分析方法によって
測定した。
被測定蛋白質溶液0.5−に下記溶液を2.5me添加
する 1%CuS○、溶液 1− 2%酒石酸す) IJウム溶液 1d2%炭酸ナトリ
ウム溶液 0、lN−Na OH’ [1s1]10分間
室温で培養した後、50%フォリン(polin)反応
剤(メルク(Merck)社)0.25−を添加する。
する 1%CuS○、溶液 1− 2%酒石酸す) IJウム溶液 1d2%炭酸ナトリ
ウム溶液 0、lN−Na OH’ [1s1]10分間
室温で培養した後、50%フォリン(polin)反応
剤(メルク(Merck)社)0.25−を添加する。
30分間室温で培養し、779 nmで展開した青色染
色の光学的濃度を測定する。
色の光学的濃度を測定する。
牛血清アルブミ′ンで用意した標準品を用いてサンプル
の蛋白質濃度を測定する。
の蛋白質濃度を測定する。
光学的濃度は5〜2(10μm/−の範囲では、9
蛋白質濃度に比例する。
ポリアクリルアミドゲルは、ルグテンベルグ(1、+I
GT巳N肝RG)達(21)に記載の特性によって製造
される。
GT巳N肝RG)達(21)に記載の特性によって製造
される。
アラインメントゲルの組成は下記の通りニアクリルアミ
ド−ビスアクリアミド (3010,8p/p) 5% Tris/HCI 130mM pH6,8S
、D3 3.5mM過硫酸アンモニウ
ム 44 mM TEMED 8mM 分離ゲルの組成はアクリルアミド−ビスアクリアミド濃
度(8または10%)と、Tris/HCI緩衝液33
Q mM pH8,8にした以外は上記配列ゲル組成と
同一である)。
ド−ビスアクリアミド (3010,8p/p) 5% Tris/HCI 130mM pH6,8S
、D3 3.5mM過硫酸アンモニウ
ム 44 mM TEMED 8mM 分離ゲルの組成はアクリルアミド−ビスアクリアミド濃
度(8または10%)と、Tris/HCI緩衝液33
Q mM pH8,8にした以外は上記配列ゲル組成と
同一である)。
使用したマイグレーション緩衝液の組成は下記の禮り:
0
グリツツ 14.4 gTris
3.OgSDS 1.
0 gH20Q S I) 1(10)0 ml
II) H8,3電気泳動によって分析または精製す
べき抽出物を少なくとも下記の等しい容積の解離緩衝液
で希釈する: Tris /HCI 1(10)mM pH6
,8グリセロール 20%SDS
70mMβ−メルカプト−エタノー
ル 1(10) mMジブロモェノールブルー 7
5μMこうして希釈した抽出物を5分間1(10)℃に
加熱する。
3.OgSDS 1.
0 gH20Q S I) 1(10)0 ml
II) H8,3電気泳動によって分析または精製す
べき抽出物を少なくとも下記の等しい容積の解離緩衝液
で希釈する: Tris /HCI 1(10)mM pH6
,8グリセロール 20%SDS
70mMβ−メルカプト−エタノー
ル 1(10) mMジブロモェノールブルー 7
5μMこうして希釈した抽出物を5分間1(10)℃に
加熱する。
外被タンパク組成物の分析の場合には各ピット蛋白質3
0〜50μgを置く。
0〜50μgを置く。
予備電気泳動の場合には予備的な単位ピットに蛋白質2
mg以下を入れる。
mg以下を入れる。
マイグレーションは+14℃で、5時間、160Vか、
または、14時間、60Vで実施した(垂直1 ゲル装置LKB)。鉄によって調節される外被タンパク
の溶離を増大させるために、一部の電気泳動は16時間
、電圧1(10)vで実施した。
または、14時間、60Vで実施した(垂直1 ゲル装置LKB)。鉄によって調節される外被タンパク
の溶離を増大させるために、一部の電気泳動は16時間
、電圧1(10)vで実施した。
電気泳動後、蛋白質を固定し、30分間、室温で、メタ
ノール/酢酸/水(50: 10 : 50v/v/v
)混合物中で、クマシー(Coomassie) ブ
ルー1.2mMによって染色する。未固定の染料は37
℃でメタノール/酢酸/水(40: 15 : 145
v/v/v)を用いて、複数の連続した浴で除去する
。発色ゲルを写真に取り、乾燥させる。
ノール/酢酸/水(50: 10 : 50v/v/v
)混合物中で、クマシー(Coomassie) ブ
ルー1.2mMによって染色する。未固定の染料は37
℃でメタノール/酢酸/水(40: 15 : 145
v/v/v)を用いて、複数の連続した浴で除去する
。発色ゲルを写真に取り、乾燥させる。
次に、各菌株の外被タンパクの特性はデンシトメータで
測定することができる[レーザーデンジトメ−LKB
ウルトラスキャン([ILTRASCAN)コ。
測定することができる[レーザーデンジトメ−LKB
ウルトラスキャン([ILTRASCAN)コ。
8、抗IRQMP抗体の検出と分析
抗IROMP比抗体の存在は、マイクロプレートでエリ
ザ(ELTSA)法によって求められる。
ザ(ELTSA)法によって求められる。
[アングハル(ENGVALL) とバール−y 7
(P[iRl、MへN)(10) ;クルトン(CDI
ILTON) (7) ]。固定相に結2 合した抗原はproFep A蛋白またはρro[ut
A蛋白が極めて豊富な分画である。
(P[iRl、MへN)(10) ;クルトン(CDI
ILTON) (7) ]。固定相に結2 合した抗原はproFep A蛋白またはρro[ut
A蛋白が極めて豊富な分画である。
抗IRQMP抗体の確認はペルオキシダーゼに結合した
兎の抗1gG (または、ニワ) IJの抗IgG
)の結合物[ノルデイック(Nord i c)社]を
用いて行う。使用した基質はオルトフェニレンジアミン
である。光学的濃度の測定は492nmで実施した。
兎の抗1gG (または、ニワ) IJの抗IgG
)の結合物[ノルデイック(Nord i c)社]を
用いて行う。使用した基質はオルトフェニレンジアミン
である。光学的濃度の測定は492nmで実施した。
「ウェスタンブロツティンク(Westernblot
ting) 」法(すなワチ免疫測定法)SDSの存在
下でポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって分離さ
れた蛋白質をトービン(T[1lQBIN)達(34)
に記載の方法によって弗化ポリヒニリテン膜(PVDF
、0.45μm、ミクロポア)上で移動させる。
ting) 」法(すなワチ免疫測定法)SDSの存在
下でポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって分離さ
れた蛋白質をトービン(T[1lQBIN)達(34)
に記載の方法によって弗化ポリヒニリテン膜(PVDF
、0.45μm、ミクロポア)上で移動させる。
この移動は、24Vで、1時間、バイオリヨン(BIO
I、YON)の装置で下記の陽極緩衝液と陰極緩衝液と
を使用して実施した 陽極緩衝液 Tris 0.3 gグ
リシン 1.44 gメタノール
1(10)−H20qsp 5(1
0) me陰極緩衝液 Tris O,3gグリシン
1.44 gSDS
0.1g H2Oqsp 5(10) mR移動後、P
VDFの膜を+37℃で1時間、脱脂乳1%を含むPB
S緩衝液中で飽和させた。
I、YON)の装置で下記の陽極緩衝液と陰極緩衝液と
を使用して実施した 陽極緩衝液 Tris 0.3 gグ
リシン 1.44 gメタノール
1(10)−H20qsp 5(1
0) me陰極緩衝液 Tris O,3gグリシン
1.44 gSDS
0.1g H2Oqsp 5(10) mR移動後、P
VDFの膜を+37℃で1時間、脱脂乳1%を含むPB
S緩衝液中で飽和させた。
次に、膜を各電気泳動トラックに対応する帯に切断する
。
。
被検査血清を脱脂乳1%を含むPBS緩衝液に希釈した
後、膜の帯と接触させる(帯当たり希釈された血清4−
)。
後、膜の帯と接触させる(帯当たり希釈された血清4−
)。
37℃で静かに撹拌しながら1時間培養して、室温で、
脱脂乳2%を含むPBS緩衝液で20分間、室温で3回
洗浄する。
脱脂乳2%を含むPBS緩衝液で20分間、室温で3回
洗浄する。
脱脂乳1%を含むPBSで1/1(10)0に希釈した
ペルオキシダーゼに結合させた抗18Gコンジュゲート
を各帯毎に37の割合で添加する。
ペルオキシダーゼに結合させた抗18Gコンジュゲート
を各帯毎に37の割合で添加する。
37℃で静かに撹拌しながら(時間培養して、室温で、
PBS緩衝液で20分間ずつ3回洗浄する。
PBS緩衝液で20分間ずつ3回洗浄する。
次に、30容積の0,1%[(20□をその場で添加し
たpH7,]、5の生理的食塩水に0.1%に希釈した
ジアミノベンジジン基質を添加した後、栗色の帯が被検
査血清中に存在する抗体によって認識される蛋白質の位
置に出現する(5〜20分)。
たpH7,]、5の生理的食塩水に0.1%に希釈した
ジアミノベンジジン基質を添加した後、栗色の帯が被検
査血清中に存在する抗体によって認識される蛋白質の位
置に出現する(5〜20分)。
次に、膜を洗浄して、乾燥させる。
9、プラスミドDNAの製造法
病原菌株が保持する大きなプラスミドをカド(KADO
)達(16)に記載の方法によって抽出する。
)達(16)に記載の方法によって抽出する。
クローニング、部分クローニングおよび発現ベクターの
構築中の各段階で得られたプラスミドをビルンボイム(
BIRNBOIM)の方法[ビルンボイム(BIRNB
OIM>とドリイ(DULY) (3) ] によって
抽出する。いずれかの方法を実施して予備抽5 出抜に得られたプラスミドDNAを塩化セシウム勾配で
精製する[マニアティス(MANIATIS)達(23
>] 、。
構築中の各段階で得られたプラスミドをビルンボイム(
BIRNBOIM)の方法[ビルンボイム(BIRNB
OIM>とドリイ(DULY) (3) ] によって
抽出する。いずれかの方法を実施して予備抽5 出抜に得られたプラスミドDNAを塩化セシウム勾配で
精製する[マニアティス(MANIATIS)達(23
>] 、。
精製後、プラスミドをTris 10mMと、El)T
A1mM pH8,(lの緩衝液に入れ、1μ2当たり
の最終濃度をDNA 1μgにし、貯蔵のため一20℃
で凍結させる。
A1mM pH8,(lの緩衝液に入れ、1μ2当たり
の最終濃度をDNA 1μgにし、貯蔵のため一20℃
で凍結させる。
IQ、DNAの分析と変性方法
クローニング、DNAの消化、アガロースゲルでの制限
断片の分析、制限断片末端の変更、ニトロセルロース膜
上へのDNA移動後の放射能法によるハイブリッド化に
用いた方法は全てマニアティス(MANIATIS)
[マニアテイス(MANIATIS)達(23)] に
記載の方法である。DNAの配列と、オリゴヌクレオチ
ド合或は特殊な方法によって行った。
断片の分析、制限断片末端の変更、ニトロセルロース膜
上へのDNA移動後の放射能法によるハイブリッド化に
用いた方法は全てマニアティス(MANIATIS)
[マニアテイス(MANIATIS)達(23)] に
記載の方法である。DNAの配列と、オリゴヌクレオチ
ド合或は特殊な方法によって行った。
11 DNAの配列
シーケンサ−遺伝子をベクターM13 mp18 と6
mp19で予備クローニングし[ヤニッヒーペロン(Y
ANISCH−PERRON)達(38)] 、ジデソ
キシヌクレチドによる鎖の末端技術[サンジャー(SA
NGER)達(28)] によって配列した。異なる鎖
の標識化は”S dA、TP[アメルンヤム (AM
ER5IIAM)コを用いて行った。
ANISCH−PERRON)達(38)] 、ジデソ
キシヌクレチドによる鎖の末端技術[サンジャー(SA
NGER)達(28)] によって配列した。異なる鎖
の標識化は”S dA、TP[アメルンヤム (AM
ER5IIAM)コを用いて行った。
いわゆる配列(シーケンシング〉 は、」二記反応剤と
、アメルシャム(Amersham)シーケンス化酵素
キットと、シケナーゼ(Sequenase) (U
SB)とを使用して実施した。尿素の存在下でのポリ
アクリルアミドのゲル電気泳動は、セキサン(Sequ
i−Gen)装置で実施した。
、アメルシャム(Amersham)シーケンス化酵素
キットと、シケナーゼ(Sequenase) (U
SB)とを使用して実施した。尿素の存在下でのポリ
アクリルアミドのゲル電気泳動は、セキサン(Sequ
i−Gen)装置で実施した。
シーケンスデータの処理はマイクロジエニイ(Micr
ogenie) (ベックマン(Beckman)を使
用して実施した。
ogenie) (ベックマン(Beckman)を使
用して実施した。
12、オリゴヌクレオチドの合成
発現ベクターまたは変異原での構築に必要な各種オリゴ
ヌクオチドは、アプライドシステム(Applied
Systems>381−A装置でシアノーエチ4フ ルーホスホルアミシト法によって合成した。
ヌクオチドは、アプライドシステム(Applied
Systems>381−A装置でシアノーエチ4フ ルーホスホルアミシト法によって合成した。
これらのオリゴヌクレオチドは、保護基を外した後、エ
タノールで沈澱させて直接使用した。
タノールで沈澱させて直接使用した。
13、向変異原技術
変異原は、エックスティン(ECKSTEIN) [テ
ーラ−(TAYLOR達(33)、ナカマエ(NAKA
MAYE)とエックスティン([ECKSTBIN)
(24) ] に記載の方法によってアメルンヤム(A
mersham)社から市販の向変異原キットを使用し
て実施した。
ーラ−(TAYLOR達(33)、ナカマエ(NAKA
MAYE)とエックスティン([ECKSTBIN)
(24) ] に記載の方法によってアメルンヤム(A
mersham)社から市販の向変異原キットを使用し
て実施した。
亙迷
1、 iut A遺伝子の単離と分析
アエロバクチンオペロンの存在は菌株15393.15
972および16(10)3に担持されたプラスミドか
ら見い出した。
972および16(10)3に担持されたプラスミドか
ら見い出した。
これらのプラスミドを、塩化セシウム勾配で精製した後
、制限酵素Bam II、Hind l[、Pvuおよ
びSal I (Boehringer)によって消化
する。
、制限酵素Bam II、Hind l[、Pvuおよ
びSal I (Boehringer)によって消化
する。
各プラスミドの各種制限断片を0.8%アガロ−III
只 スゲルで分離し、ニトロセルロース膜上でザザーンブロ
ッティング法[ザザーン(SO[ITHERN)(31
)] によって移動させる。次いで、各断片をpcol
V K2Oのアエロバクチンオペロンヲ担持したプラ
スミド制限断片pへBNIから作った2つの放射化プロ
ーブ〈32Pで標識化)を用いてハイプリント化する(
ピンブリーフ(BIND8REIF) とネイランド
(NBILAN[l) (2>]。IutAレセプター
をコードする遺伝子は、[i、6kbのBam Hl
−Ban旧制旧制性断片二の全てのプラスミドに存在す
ることが分かった。この結果から、pColv−に30
に等価の断片からこの遺伝子を二次クローニングした研
究者の研究が確かめられるEクローネ達(KR[]NE
) (17)]。
只 スゲルで分離し、ニトロセルロース膜上でザザーンブロ
ッティング法[ザザーン(SO[ITHERN)(31
)] によって移動させる。次いで、各断片をpcol
V K2Oのアエロバクチンオペロンヲ担持したプラ
スミド制限断片pへBNIから作った2つの放射化プロ
ーブ〈32Pで標識化)を用いてハイプリント化する(
ピンブリーフ(BIND8REIF) とネイランド
(NBILAN[l) (2>]。IutAレセプター
をコードする遺伝子は、[i、6kbのBam Hl
−Ban旧制旧制性断片二の全てのプラスミドに存在す
ることが分かった。この結果から、pColv−に30
に等価の断片からこの遺伝子を二次クローニングした研
究者の研究が確かめられるEクローネ達(KR[]NE
) (17)]。
菌株15393.15972および1.6(10)3の
プラスミドは、Bam旧制限酵素によって消化される。
プラスミドは、Bam旧制限酵素によって消化される。
0.8%アガロースゲル電気泳動後、各プラスミドの9
6、6kbの寸法の断片を含む帯を切断してDNAを電
離する。
離する。
3つの断片Bam 81−Bam旧、6.6kbを、B
am1」1によって消化されたρaT 153ベクター
内で別々に結合させる。3つの結合混合物は、有効細菌
HBIOIを転換するのに用いる(第4表)。
am1」1によって消化されたρaT 153ベクター
内で別々に結合させる。3つの結合混合物は、有効細菌
HBIOIを転換するのに用いる(第4表)。
アンピシリン耐性があり、テトラサイクリン感受性のあ
るクローンからDNAを抽出し[ピルボイム(BIRN
BOIII)とドリイ(DOLY)の技術]、Bam
111で消化して挿入寸法を確認する。6,6kbの断
片を含むクローンをクロアシンDF13に対する感受性
を基に選択する。
るクローンからDNAを抽出し[ピルボイム(BIRN
BOIII)とドリイ(DOLY)の技術]、Bam
111で消化して挿入寸法を確認する。6,6kbの断
片を含むクローンをクロアシンDF13に対する感受性
を基に選択する。
各出発プラスミド用に、クロアシンに感受性のあるクロ
ーンを後の分析と構築のために保持した。そのクローン
を、以下に示す。
ーンを後の分析と構築のために保持した。そのクローン
を、以下に示す。
菌株15393 クローン HB 101ρ5−
15閤株1.5972 クローン HB 101
11 P−13菌株16(10)3 クローン H
B 101 p 4−180 クローンの分析 lut Aレセプターの発現の研究 クロアシンに対する感受性検査によって求めていたクロ
ーンが選択できたという事実は、クロアシンとアエロバ
クチンに対するレセプターの発現があるということを示
ず。断片Dam HIBam l(l 6,6kbに担
持されたiut A遺伝子の発現は、恐らく、この断片
に位置する弱いプロモーターによるものであり[クロー
ネ(KRONB)達(17)] 、アエロバクチンオペ
ロンの主要プロモーターの場合のように鉄濃度によるも
のではない。すなわち、クロアシンへの感受性は、鉄が
豊富な寒天LB−アンピシリンで培養することによって
証明される。
15閤株1.5972 クローン HB 101
11 P−13菌株16(10)3 クローン H
B 101 p 4−180 クローンの分析 lut Aレセプターの発現の研究 クロアシンに対する感受性検査によって求めていたクロ
ーンが選択できたという事実は、クロアシンとアエロバ
クチンに対するレセプターの発現があるということを示
ず。断片Dam HIBam l(l 6,6kbに担
持されたiut A遺伝子の発現は、恐らく、この断片
に位置する弱いプロモーターによるものであり[クロー
ネ(KRONB)達(17)] 、アエロバクチンオペ
ロンの主要プロモーターの場合のように鉄濃度によるも
のではない。すなわち、クロアシンへの感受性は、鉄が
豊富な寒天LB−アンピシリンで培養することによって
証明される。
Jut Aレセプターの発現レベルを研究するために、
各種のクローンをオボトランスフェリンの存在下(5(
10)μg /d)または非存在下でLB−アンピシリ
ン培地で培養した(+37℃で、−夜)。
各種のクローンをオボトランスフェリンの存在下(5(
10)μg /d)または非存在下でLB−アンピシリ
ン培地で培養した(+37℃で、−夜)。
3つのクローンの外被タンパクを抽出し、S1
DSの存在下でポリアクリルアミドゲルで分析した。
クロアシンに感受性のあるクローンでは、培養条件にか
かわらず、76kDaの以上の蛋白質の発現は観察する
ことができなかった。
かわらず、76kDaの以上の蛋白質の発現は観察する
ことができなかった。
制限地図
クローン4−18.5−15およびP−13のプラスミ
ドDNAを多量に抽出して、塩化セシウム勾配で精製す
る。
ドDNAを多量に抽出して、塩化セシウム勾配で精製す
る。
3つの断片Bam III −Bam Hl 6.6k
bの制限地図を、酵素口gl II、 Bst F
II、C1a、 I、 Bco R1,1(pn
1SPst l、 Pvu IfおよびSma l を
使用して作った。
bの制限地図を、酵素口gl II、 Bst F
II、C1a、 I、 Bco R1,1(pn
1SPst l、 Pvu IfおよびSma l を
使用して作った。
これらの3つの地図は、互いに厳密に同一であり、ピン
ブリーフ(BIN[1lERIBF) とネイランズ
(N[EILANO3) (1,2)およびクローネ(
KRONB)達(17)によって発表された地図による
pcolVK30のアエロバクチンオペロンの断片Ba
m HIBam Hl 6.6kbの制限地図に対応す
る。
ブリーフ(BIN[1lERIBF) とネイランズ
(N[EILANO3) (1,2)およびクローネ(
KRONB)達(17)によって発表された地図による
pcolVK30のアエロバクチンオペロンの断片Ba
m HIBam Hl 6.6kbの制限地図に対応す
る。
2
これらの4つの地図を第5表に示した。
iut A遺伝子の配列
3つの断片Bam Hl −Bam Hl 6.6kb
の制限地図と、iut A遺伝子の配列から演縄された
制限地図[クローネ(KRONE)達(18) ] と
を比較すると、iut A遺伝子は、制限断片Bst
E II−口stε■、3、2kb上に完全に局部化さ
れているのが分かる(第4表)。
の制限地図と、iut A遺伝子の配列から演縄された
制限地図[クローネ(KRONE)達(18) ] と
を比較すると、iut A遺伝子は、制限断片Bst
E II−口stε■、3、2kb上に完全に局部化さ
れているのが分かる(第4表)。
この断片を電気溶離によって分離し、T4ファーズのり
ガーゼでそれ自体に再結合させ[ボーリンガ−(Boe
hringer)] 、複数の制限酵素系で消化された
。こうして得られた各種断片(寸法150〜6(10)
pb)をゲネクリーン(Geneclean) (バイ
オ(BioHOl)で分離し、予め適切な酵素で消化さ
れたベクターM13 mp19と、mp19内で二次
クローニングした後、アメルシャム(^mersham
)とシケナーゼ(Sequenase)のシーケンス化
キットを使用して、サンジャー(SANGER)法によ
って各二次クローニングの配列を決定した。
ガーゼでそれ自体に再結合させ[ボーリンガ−(Boe
hringer)] 、複数の制限酵素系で消化された
。こうして得られた各種断片(寸法150〜6(10)
pb)をゲネクリーン(Geneclean) (バイ
オ(BioHOl)で分離し、予め適切な酵素で消化さ
れたベクターM13 mp19と、mp19内で二次
クローニングした後、アメルシャム(^mersham
)とシケナーゼ(Sequenase)のシーケンス化
キットを使用して、サンジャー(SANGER)法によ
って各二次クローニングの配列を決定した。
3
クローンP−13の断片Bst E II −Bst
E II、3、2kklのみが完全に配列される。他の
2つの1utA遺伝子は、Bgl II(1) サ
イトと、Eco Rν2396)サイトとの間で配列さ
れる。
E II、3、2kklのみが完全に配列される。他の
2つの1utA遺伝子は、Bgl II(1) サ
イトと、Eco Rν2396)サイトとの間で配列さ
れる。
クローンP−13のBst E II −Bgl I
[領域を、ut、Aの上流に位置するiuc D遺伝子
の配列と比較し[ヘレッロ(HERRERO)達(14
)] 、このクローンのP、vu II −Bst E
II領領域IS1エレメントの配列と比較した[オー
ツボ(OHTS[IBO) とオーツボ(OHTSU
BO) <25)]。
[領域を、ut、Aの上流に位置するiuc D遺伝子
の配列と比較し[ヘレッロ(HERRERO)達(14
)] 、このクローンのP、vu II −Bst E
II領領域IS1エレメントの配列と比較した[オー
ツボ(OHTS[IBO) とオーツボ(OHTSU
BO) <25)]。
これらの比較並びに3つのiut A遺伝子の配列とp
col V −K2Oのiut A遺伝子の配列との比
較とを第7表に示した。
col V −K2Oのiut A遺伝子の配列との比
較とを第7表に示した。
これらの4つの配列を分析することによって、iut
A遺伝子が分子レベルで極めてよく保持されていること
が分かった。出発動物の大腸菌株に近い1つまたは2つ
の塩基では、3つの1utA遺伝子は互いに同じである
。クローネ(KR[1NE)達(18)によって発表さ
れた配列に対する差異は極めて小さい。
A遺伝子が分子レベルで極めてよく保持されていること
が分かった。出発動物の大腸菌株に近い1つまたは2つ
の塩基では、3つの1utA遺伝子は互いに同じである
。クローネ(KR[1NE)達(18)によって発表さ
れた配列に対する差異は極めて小さい。
4
検査した3つのiut A遺伝子の997%は、pco
l V −K2Oのiut A遺伝子の類縁体である。
l V −K2Oのiut A遺伝子の類縁体である。
差異を確認した領域は第8表に示した(数字は第7表に
示した配列中の塩基の位置を示す)。
示した配列中の塩基の位置を示す)。
2つの重要な領域は厳密に保持されている。
すなわち、ペプチド信号をコード化する配列とTon
Bに機能が依存する外被タンパクレセプタに典型的な交
感配列(Ton 8箱)は厳密に保持されている。
Bに機能が依存する外被タンパクレセプタに典型的な交
感配列(Ton 8箱)は厳密に保持されている。
3つの各遺伝子配列において、Col V−に30のi
ut A遺伝子に対して4つが挿入されたことが明らか
になった。これらの挿入によって、読み取り範囲は一定
の制限された変化が生じる。
ut A遺伝子に対して4つが挿入されたことが明らか
になった。これらの挿入によって、読み取り範囲は一定
の制限された変化が生じる。
従って、使用した菌株から単離されたプラスミドによっ
てコードされたtut A蛋白質の主要構造はpcol
V−に30の蛋白質より少し長くなる(+8アミノ酸
)。使用した菌株から単離されたiut A遺伝子の配
列は、菌株Col V −K2OのポリペプチドのJu
t Aの配列に等しい25個のアミノ酸のペプチド信号
で構成される733個のア5 ミノ酸のポリペプチドをコードする。成熟した蛋白質の
言1算質量は78097ダルトンであり、ゲル(76k
Da) で観察された質量とは僅かに異なる(7’6k
Da)が、主要構造の変化はあまり大きくないので、二
次構造と親水性の特性を変化させることはない。
てコードされたtut A蛋白質の主要構造はpcol
V−に30の蛋白質より少し長くなる(+8アミノ酸
)。使用した菌株から単離されたiut A遺伝子の配
列は、菌株Col V −K2OのポリペプチドのJu
t Aの配列に等しい25個のアミノ酸のペプチド信号
で構成される733個のア5 ミノ酸のポリペプチドをコードする。成熟した蛋白質の
言1算質量は78097ダルトンであり、ゲル(76k
Da) で観察された質量とは僅かに異なる(7’6k
Da)が、主要構造の変化はあまり大きくないので、二
次構造と親水性の特性を変化させることはない。
6
2、 iut A遺伝子とfep Aクローンの発現使
用したベクターの特性 使用した発現ベクターは、アンステイテユ メリs −
(lnstitut Merieux)の遺伝子工学研
究所のによって構築されたプラスミドGT1(10)I
である。
用したベクターの特性 使用した発現ベクターは、アンステイテユ メリs −
(lnstitut Merieux)の遺伝子工学研
究所のによって構築されたプラスミドGT1(10)I
である。
このベクターが有する遺伝子と制限地図を第9表に示し
た。
た。
このプラスミドは、以下のように構築される。
pBR322+ごよって構成されるプラスミドpBRT
AC[ポリバー(F、 Bol i var)達「遺伝
(Gene) J第2号、95〜113頁、1977年
」は、旧ndlIと、BamHlとの間でプロモーター
Tac [アンマン(0,八mmann)達「遺伝(G
ene) 」第25号、167頁、1983年コを増殖
させ、フレノウ(Kleenow)のポリメラーゼによ
ってによって破壊されたプラスミドpBRTacX−を
与えるサイトXhol を有する。このプラスミドはN
colによって消化され、フリーナラ(kleenow
) によって処理れ、次に、アバル(Aval)によ
って消化され、その最も小さな断片がpMC9の断片に
結合される[カサダバン(M、 J、 Ca5adab
an)達「細菌学誌」7 (Journal of Bacteriology)
第143号、971〜980頁、1980年]。このp
MC9は、Mst ■によって消化れ、フレナラによっ
て処理され、次に、Lac i遺伝子とρBR322の
複製原を有するAvalによって消化されたものである
。
AC[ポリバー(F、 Bol i var)達「遺伝
(Gene) J第2号、95〜113頁、1977年
」は、旧ndlIと、BamHlとの間でプロモーター
Tac [アンマン(0,八mmann)達「遺伝(G
ene) 」第25号、167頁、1983年コを増殖
させ、フレノウ(Kleenow)のポリメラーゼによ
ってによって破壊されたプラスミドpBRTacX−を
与えるサイトXhol を有する。このプラスミドはN
colによって消化され、フリーナラ(kleenow
) によって処理れ、次に、アバル(Aval)によ
って消化され、その最も小さな断片がpMC9の断片に
結合される[カサダバン(M、 J、 Ca5adab
an)達「細菌学誌」7 (Journal of Bacteriology)
第143号、971〜980頁、1980年]。このp
MC9は、Mst ■によって消化れ、フレナラによっ
て処理され、次に、Lac i遺伝子とρBR322の
複製原を有するAvalによって消化されたものである
。
その結果生じたプラスミド(pBRl、aciX−と呼
ぶ)は、旧ndlll によって消化され、フレナラに
よって処理され、次に、Pstlによって消化され、2
350塩基対の断片を23(10)塩基対(すなわち’
pb”)断片に結合され、BcoRI によって消化し
て23(10)pbとし、次いで、フレナラによって処
理し、次に、Pstlによって消化したものである。こ
のようにして、プラスミドpBRTaci を製造する
。EcoRl とPStlによる消化によって得られた
このプラスミドpBRTaciの4406pb断片は、
pBR322の配列から誘導された且つpBR322の
テトラサイタリン耐性の遺伝子を有するEcoRl と
Pstlとによって消化された1、688pb断片にに
結合される。
ぶ)は、旧ndlll によって消化され、フレナラに
よって処理され、次に、Pstlによって消化され、2
350塩基対の断片を23(10)塩基対(すなわち’
pb”)断片に結合され、BcoRI によって消化し
て23(10)pbとし、次いで、フレナラによって処
理し、次に、Pstlによって消化したものである。こ
のようにして、プラスミドpBRTaci を製造する
。EcoRl とPStlによる消化によって得られた
このプラスミドpBRTaciの4406pb断片は、
pBR322の配列から誘導された且つpBR322の
テトラサイタリン耐性の遺伝子を有するEcoRl と
Pstlとによって消化された1、688pb断片にに
結合される。
得られたプラスミドは、pBRTaciTetと命名し
た。
た。
このプラスミドの複製源は、BamHI による消化に
8 よって分離され、残った2096pb断片はXholに
よって消化されたpAT153の2(133pbの断片
[ライラグ(A、 J、 Twigg)とシェラット(
D、 5herratt)、の「自然(Nature)
J第283号、216〜218頁、1980年]に結
合されて、プラスミドpATTac iOr iが製造
される。
8 よって分離され、残った2096pb断片はXholに
よって消化されたpAT153の2(133pbの断片
[ライラグ(A、 J、 Twigg)とシェラット(
D、 5herratt)、の「自然(Nature)
J第283号、216〜218頁、1980年]に結
合されて、プラスミドpATTac iOr iが製造
される。
このプラスミドを13coR1によって消化し、フレナ
ラによって処理し、^vatによって消化し、2704
pb断片をプロモータPrと、Pstlによる消化、ヤ
エナリヌクレアーゼによる処理及び^valによる部分
消化によってI]C[lV2から生じた3706pbの
ラムダバクテリオファージのその熱感受性のあるリプレ
ッサーCl857 とに結合させる[クイ−ン((:、
Queen)達「分子適用遺伝字詰 (J、 Mol
、八ppl、Genet、) 、)第2号、1〜10頁
、1983年コ。その結果生じたプラスミドをpGTI
ool と名付ける。
ラによって処理し、^vatによって消化し、2704
pb断片をプロモータPrと、Pstlによる消化、ヤ
エナリヌクレアーゼによる処理及び^valによる部分
消化によってI]C[lV2から生じた3706pbの
ラムダバクテリオファージのその熱感受性のあるリプレ
ッサーCl857 とに結合させる[クイ−ン((:、
Queen)達「分子適用遺伝字詰 (J、 Mol
、八ppl、Genet、) 、)第2号、1〜10頁
、1983年コ。その結果生じたプラスミドをpGTI
ool と名付ける。
このプラスミドの複製源は、tacプロモーターに制御
されており、それによって濃度の多少はあれIPTG
(lac i遺伝子の誘導剤)を含む培地中で細菌を培
養しながら、コピー数を制御することが9 できる。
されており、それによって濃度の多少はあれIPTG
(lac i遺伝子の誘導剤)を含む培地中で細菌を培
養しながら、コピー数を制御することが9 できる。
発現すべき遺伝子は、ファージC1857の強いプロモ
ーター(Pr) (そのリプレッサーは熱感受性がある
)。発現すべき遺伝子のATGは、遺伝子二ATGによ
って置換される。このATGをp GTI (10)1
のBamHI による部分消化に続いて、l・ング ベ
ン(MungBen)ヌクレアーゼによって消化して、
両端が平らな(フランクな)ATGが得られる。
ーター(Pr) (そのリプレッサーは熱感受性がある
)。発現すべき遺伝子のATGは、遺伝子二ATGによ
って置換される。このATGをp GTI (10)1
のBamHI による部分消化に続いて、l・ング ベ
ン(MungBen)ヌクレアーゼによって消化して、
両端が平らな(フランクな)ATGが得られる。
次に、発現すべき遺伝子を上記の平端へTGの端部とX
ho1部位との間に〈第2コドンから)鞘状に挿入する
。このXho1部位のちょうど後方に位置する転写終了
信号は、長すぎるARNメツセンジャーが形式されるの
を防ぐ。
ho1部位との間に〈第2コドンから)鞘状に挿入する
。このXho1部位のちょうど後方に位置する転写終了
信号は、長すぎるARNメツセンジャーが形式されるの
を防ぐ。
iut A遺伝子(またはfep A)を表現すること
のできるこの種の他のプラスミドを得ること、すなわち
、構築は容易である。発現すべき遺伝子がそのリプレッ
サーが熱感受性のあるプロモーターによって制御されて
いるこのようなプラスミドは公知である。
のできるこの種の他のプラスミドを得ること、すなわち
、構築は容易である。発現すべき遺伝子がそのリプレッ
サーが熱感受性のあるプロモーターによって制御されて
いるこのようなプラスミドは公知である。
0
iut A遺伝子の発現ベクターの構築菌株15972
と16(10)3から単離されたiut A遺伝子を、
p GTI (101のBam旧の発現部位(899)
でそれらの配列信号でクローン化する。
と16(10)3から単離されたiut A遺伝子を、
p GTI (101のBam旧の発現部位(899)
でそれらの配列信号でクローン化する。
配列信号の第2番目のアミノ酸で始まる平滑端部5′
を得るために、二重鎖合成オリゴヌクレオチドを用いて
、初期ATGとコード化配列の5・ 位置の単一位置A
cc l との間の領域を置換した。
を得るために、二重鎖合成オリゴヌクレオチドを用いて
、初期ATGとコード化配列の5・ 位置の単一位置A
cc l との間の領域を置換した。
このオリゴヌクレオチドの相補二重鎖が合成した。二重
鎖の形は、NaCl30mM、 TrislOmMSM
gCllomMで、pH7、5の緩衝液で90℃で加熱
し、室温にゆっくりと冷却することによって得られた。
鎖の形は、NaCl30mM、 TrislOmMSM
gCllomMで、pH7、5の緩衝液で90℃で加熱
し、室温にゆっくりと冷却することによって得られた。
菌株15972のiut Δ遺伝子(りo −ンp P
−13)を挿入するための方法を第11表に示した。
−13)を挿入するための方法を第11表に示した。
収率があまり十分でなかったので、方法を変え、菌株1
6(10)3のiut A遺伝子の位相化を採用した。
6(10)3のiut A遺伝子の位相化を採用した。
この新規な方法は、pSB 118のベクター中での中
間構築物のBco R1−Bco R1領域の二次クロ
ーン化を利用する(第12表、第4段階)。このベクタ
ーは、誘導体puc 18である。このベクターは、2
つ1 の部位Eco R1によって囲まれた「ポリリンカー」
を有する。従って、このベクター中の断片Eco R[
εco R1の二次クローン化によって、部分消化を避
けて、iut A遺伝子の位相化が実施される(第12
表)。
間構築物のBco R1−Bco R1領域の二次クロ
ーン化を利用する(第12表、第4段階)。このベクタ
ーは、誘導体puc 18である。このベクターは、2
つ1 の部位Eco R1によって囲まれた「ポリリンカー」
を有する。従って、このベクター中の断片Eco R[
εco R1の二次クローン化によって、部分消化を避
けて、iut A遺伝子の位相化が実施される(第12
表)。
このようにして得られた発現プラスミドGTI R2(
菌株15972のiut A遺伝子)とGTI B−5
(菌株16(10)3のiut A遺伝子)を第13表
に示した。
菌株15972のiut A遺伝子)とGTI B−5
(菌株16(10)3のiut A遺伝子)を第13表
に示した。
二重鎖のオリゴヌクレオチドiut と新たに結合させ
て得られたクローンをiut A遺伝子の八cc 1部
位の保持とp GTI [101のBam旧部位の消滅
に基づいて選択した。次に、この制限特性を示すクロー
ンは、全部、蛋白質1ut Aの発現の位置で制御され
た。
て得られたクローンをiut A遺伝子の八cc 1部
位の保持とp GTI [101のBam旧部位の消滅
に基づいて選択した。次に、この制限特性を示すクロー
ンは、全部、蛋白質1ut Aの発現の位置で制御され
た。
Jut Aの発現の制御
性質上の制御
選択されたクローンは、IPTG 0.4mMの存在
化のM9 SP テトラサイクリン培地で32℃で
培養した。このクローンのクロアンンに対する感受性を
上記の技術によって検査した。
化のM9 SP テトラサイクリン培地で32℃で
培養した。このクローンのクロアンンに対する感受性を
上記の技術によって検査した。
2
25個のうち2つのクローンは、GTl−iut 15
972の構築に陽性である。
972の構築に陽性である。
6個のうち3つのクローンは、GTI−iut 16(
10)3の構築に陽性である。
10)3の構築に陽性である。
クロアンンに感受性のあるクローンをIPTGo 4m
l、lを含むM9 SP テトラサイタリン培地5
Ome中で培養した。
l、lを含むM9 SP テトラサイタリン培地5
Ome中で培養した。
光学的濃度が数値1に達するまで、温度30℃まで培養
を実施した。次に、+42℃で、4時間培養を続けて、
遺伝子iut Aの発現誘導を実施した。
を実施した。次に、+42℃で、4時間培養を続けて、
遺伝子iut Aの発現誘導を実施した。
細菌を遠心分離して、その蛋白質全体をポリアクリルア
ミド−3DSゲルての電気泳動によって分析した。これ
によってJut A蛋白質の製造量を直接測定すること
ができる(第1図)。
ミド−3DSゲルての電気泳動によって分析した。これ
によってJut A蛋白質の製造量を直接測定すること
ができる(第1図)。
クローンCMK 603 GTI P−2の蛋白質の分
析によって、蛋白質1ut Aとその前駆体は、誘導後
、細菌の全蛋白質の25%を占めることが分かった。蛋
白質jut Aだけは、外被タンパク30%を含む。
析によって、蛋白質1ut Aとその前駆体は、誘導後
、細菌の全蛋白質の25%を占めることが分かった。蛋
白質jut Aだけは、外被タンパク30%を含む。
3
fep A遺伝子の発現ベクターの構築初期クローンp
MS 101の特性 ラールド(1,AIRD) どヤング(YOUNG)
(1,9) によって構築されたプラスミドpM3
1.01の6.3kbの断片Bam ll−1l−Ba
R1上にfep A遺伝子が位置することを示唆した
コデール(C[1DERRE:l どイヤーハート(E
ΔRIIART) < 6 >の結果によると、この断
片はBam旧によって消化されたベクターpBll 3
22中で二次クローン化されている。得られたプラスミ
ドの制限地図(F−1) は、プラスミドplTs
1の制限地図(フレミング(Fl、EMING)達(1
1)) に類似していることが分かった(第14表)
。
MS 101の特性 ラールド(1,AIRD) どヤング(YOUNG)
(1,9) によって構築されたプラスミドpM3
1.01の6.3kbの断片Bam ll−1l−Ba
R1上にfep A遺伝子が位置することを示唆した
コデール(C[1DERRE:l どイヤーハート(E
ΔRIIART) < 6 >の結果によると、この断
片はBam旧によって消化されたベクターpBll 3
22中で二次クローン化されている。得られたプラスミ
ドの制限地図(F−1) は、プラスミドplTs
1の制限地図(フレミング(Fl、EMING)達(1
1)) に類似していることが分かった(第14表)
。
fep Aの配列の公開[ルンドリガン(L[INDR
IGAN)とカングー(KANDER)] によって、
この遺伝子をプラスミドF−1の塩基対253 [1の
制限断片Ssp l−3tu 12530上に正確に配
置することができる。
IGAN)とカングー(KANDER)] によって、
この遺伝子をプラスミドF−1の塩基対253 [1の
制限断片Ssp l−3tu 12530上に正確に配
置することができる。
以下の方法を使用して、fep A遺伝子をp GTI
ool に挿入した。
ool に挿入した。
配列を変換するコード化領域の5・ 端部て突然変異を
起こさせた 4 5・ 八TGAACAAG 3 Hpa Iの制限部位で、 MεT 八5lll LYS GTT八八へへ八へ への部位を以下のように平滑端GTT AA [’で切
断する。これによって、fep A遺伝子を直接p G
TIool 中に形成された端部ATGと結合させるこ
とができる。
起こさせた 4 5・ 八TGAACAAG 3 Hpa Iの制限部位で、 MεT 八5lll LYS GTT八八へへ八へ への部位を以下のように平滑端GTT AA [’で切
断する。これによって、fep A遺伝子を直接p G
TIool 中に形成された端部ATGと結合させるこ
とができる。
ファージl mpl、9の複製形での断片Ssp 1−
Ec。
Ec。
R18(10)の二次クローン化後、オリゴヌクレオチ
ドからエックスティン(ECKST[EIN>法によっ
て、突然変異させた(第15表)。
ドからエックスティン(ECKST[EIN>法によっ
て、突然変異させた(第15表)。
突然変異した断片を完全に配列して、その配列は目的の
部位以外は全く変更されていないことを確かめた。
部位以外は全く変更されていないことを確かめた。
fep A遺伝子の組込み方法を第16表及び第17表
に示した。
に示した。
プラスミドGTI (10)1 マノ2350塩基対c
7) 断片Hp a IXholの結合によって得られ
た種々のクローンは、5 17(10)塩基対の断片Eco R1−Eco R1
の存在で選択される。
7) 断片Hp a IXholの結合によって得られ
た種々のクローンは、5 17(10)塩基対の断片Eco R1−Eco R1
の存在で選択される。
Fep Aの発現制御
性質制御
2350塩基対の断片flpal−Xholとプラスミ
ドGTI(10)1の結合混合物は、有効な細菌RII
IB 18を形質転換するのに役立つ。この菌株はfe
p Aであり、コリシンBに耐性がある。
ドGTI(10)1の結合混合物は、有効な細菌RII
IB 18を形質転換するのに役立つ。この菌株はfe
p Aであり、コリシンBに耐性がある。
求めていた制限地図(第17表〉を有するクローンのコ
リシンBに対する感受性を検査した。
リシンBに対する感受性を検査した。
クローン(IFB 18 GTI F−12)は、コリ
シンBの作用に感受性があるのが分かった。
シンBの作用に感受性があるのが分かった。
質的制御
Fep A蛋白とその前駆体の発現は、ポリアクリルア
ミド−3DSゲルで分析したく第2図)。りo −ンC
MK 603 GTI F−12は、Pep Aとその
前駆体を極めて多量(全蛋白質の20%)に発現させる
。
ミド−3DSゲルで分析したく第2図)。りo −ンC
MK 603 GTI F−12は、Pep Aとその
前駆体を極めて多量(全蛋白質の20%)に発現させる
。
Fep A蛋白質は外被タンパクの32%を占める。
6
Jut ΔとFep Aを発現させるクローン培養適性
得られたクローンの培養適性を、1」テトラザイクリン
IPTG培地で、培養温度を変えて検査した。
IPTG培地で、培養温度を変えて検査した。
LBテトラサイクリンIPTG O,1mMの寒天に一
面に接種すると、全クローンは、30〜34℃の範囲の
温度で培養すると、バクテリオシンに感受性のある細菌
じゅうたんを形成する。
面に接種すると、全クローンは、30〜34℃の範囲の
温度で培養すると、バクテリオシンに感受性のある細菌
じゅうたんを形成する。
34℃以上では、細菌じゅうたんは形成されない。
この現象は、また、L8液体培地でも観察されない。
バクテリオシンに対する感受性は、IPTG濃度が0.
05mMで、温度が30℃で発見された。従って、ベク
ターP GTI (10)1の誘導の非存在化でiut
A遺伝子及びfep Aのある程度の発現が存在する
。
05mMで、温度が30℃で発見された。従って、ベク
ターP GTI (10)1の誘導の非存在化でiut
A遺伝子及びfep Aのある程度の発現が存在する
。
形態学的研究
種々のクローンは、Iut A及びfep Aの超発現
の結果として形態の変化を生じる。
の結果として形態の変化を生じる。
4時間、+42℃で誘導した後、相対比の光学顕微鏡で
観察すると、細菌は、かなり長くなってぃ7 る(正常な大腸菌に12の平均の長さの10倍まで)。
観察すると、細菌は、かなり長くなってぃ7 る(正常な大腸菌に12の平均の長さの10倍まで)。
しかし、最も驚異的な特性は、各細菌の体内に1つから
複数の細胞質内挿入の存在である。
複数の細胞質内挿入の存在である。
4時間、+42℃で培養した細菌の切断の陰性染色後電
子顕微鏡で観察すると、光学顕微鏡で観察された挿入が
見られる。
子顕微鏡で観察すると、光学顕微鏡で観察された挿入が
見られる。
この挿入は、細胞質外被の内表面の周辺か近傍である。
3、蛋白質Jut A及びPep Aの免疫学的特性T
ut Δ及びPep Aの免疫原性 大腸菌株15022.15393.16(10)3 と
組み換え大腸菌CMK 603 GTI P−2の外被
から抽出した蛋白質を容易したポリアクリルアミドゲル
によって単離し、前記の方法によって兎に注射した。
ut Δ及びPep Aの免疫原性 大腸菌株15022.15393.16(10)3 と
組み換え大腸菌CMK 603 GTI P−2の外被
から抽出した蛋白質を容易したポリアクリルアミドゲル
によって単離し、前記の方法によって兎に注射した。
各兎が形成する抗体抗jut Aの力価の変化は、抗原
として大腸菌CMK 603 GTI P−2の培養物
から抽出された「グラニユール」 (沈澱した蛋白質p
roIut A)溶液を使用して、エリザ(BLISA
)法によって測定した。
として大腸菌CMK 603 GTI P−2の培養物
から抽出された「グラニユール」 (沈澱した蛋白質p
roIut A)溶液を使用して、エリザ(BLISA
)法によって測定した。
使用した陽性の参照血清は、ビー、ウデガ(B。
01jl)EG八)によって提供された大腸菌Co1V
−に3[)の抗蛋白質Jut Aの兎血清である。
−に3[)の抗蛋白質Jut Aの兎血清である。
同様の方法で、大腸菌株15022とR凶B 18 G
TIF+、2の外被から抽出された蛋白質Fep Aを
検査した。
TIF+、2の外被から抽出された蛋白質Fep Aを
検査した。
どの場合も、兎は蛋白質jut A及びPep Aの注
射に反応し、これらの蛋白質に対する抗原の力価が高く
なった。
射に反応し、これらの蛋白質に対する抗原の力価が高く
なった。
Jut Aと1iep Aの抗原特性
得られた種々の抗原の特性を複数の外被製造(大腸菌1
5(10)2.15393、[、MK 603 GTI
P−2、CMK603 GTI B−5及びRWB
18 GT[F−12の菌株)に対して検査した。この
検査は、「ウエスタンブロッ) (Western B
lot) J法によって実施した。
5(10)2.15393、[、MK 603 GTI
P−2、CMK603 GTI B−5及びRWB
18 GT[F−12の菌株)に対して検査した。この
検査は、「ウエスタンブロッ) (Western B
lot) J法によって実施した。
参照抗jut ACOIV−に30と同様に、生成した
4つの抗jut A血清は、アエロバクタ−系を発現す
る菌株の外被の製造において、特に、76kDaの蛋白
質を認識する。その誘導に使用したjut Δ蛋白が何
でも(天然でも組み換えでも)、同じ血清の抗原は特に
起点が鳥および牛の大腸菌株によって発9 現されるlut A蛋白質と大腸菌CMK 603 G
TI P−2、[MK 603 GTI B−5の組み
換え菌株によって生成する2つの蛋白質1ut Aを認
識する。
4つの抗jut A血清は、アエロバクタ−系を発現す
る菌株の外被の製造において、特に、76kDaの蛋白
質を認識する。その誘導に使用したjut Δ蛋白が何
でも(天然でも組み換えでも)、同じ血清の抗原は特に
起点が鳥および牛の大腸菌株によって発9 現されるlut A蛋白質と大腸菌CMK 603 G
TI P−2、[MK 603 GTI B−5の組み
換え菌株によって生成する2つの蛋白質1ut Aを認
識する。
Jut A蛋白質の前駆体、prolut蛋白質もまた
全ての抗Jut Aに認識される(菌株[:MK 60
3 GTIP−2及びC1,IK 603 GTI B
−5による生成物を精製した「グラニユール」で免疫粉
砕を実施)。
全ての抗Jut Aに認識される(菌株[:MK 60
3 GTIP−2及びC1,IK 603 GTI B
−5による生成物を精製した「グラニユール」で免疫粉
砕を実施)。
蛋白質Fep Aは、抗Jut A血清では認識されず
、逆に抗Fep A血清は蛋白質Jut Aを認識しな
い。
、逆に抗Fep A血清は蛋白質Jut Aを認識しな
い。
発現ベクター6丁+ (10)1内でのiut A及び
ハLム遺伝子のクローニングによって、jut A及び
FepA蛋白質、さらに、その各々の前駆体を多量に製
造することができる。42℃での細菌培養による転写誘
導に続いて合成されたjut A及びFep A蛋白と
それらの前駆体は、細胞質に封入されたくグラニユール
)の形で急速に蓄積される。このグラニユールの寸法は
大きく、位相対比光学顕微鏡でみることができる。誘導
された細菌の断面を電子顕微鏡で観察すると、細胞質膜
の内表面にこれらのグラニユールがびっしり貼り付いて
いることか分0 かった。
ハLム遺伝子のクローニングによって、jut A及び
FepA蛋白質、さらに、その各々の前駆体を多量に製
造することができる。42℃での細菌培養による転写誘
導に続いて合成されたjut A及びFep A蛋白と
それらの前駆体は、細胞質に封入されたくグラニユール
)の形で急速に蓄積される。このグラニユールの寸法は
大きく、位相対比光学顕微鏡でみることができる。誘導
された細菌の断面を電子顕微鏡で観察すると、細胞質膜
の内表面にこれらのグラニユールがびっしり貼り付いて
いることか分0 かった。
Jut A及びFep Aの前駆体の発現量の大きさく
最適化していない条件では平均で総蛋白質の25%〉に
注意しなければならない。成熟した蛋白質は外被の蛋白
質量の35%未満である。このパーセンテージを外被内
のこの種の蛋白質の含有の限界とみることができる。比
較として、天然の大腸菌15022の菌株によって発現
されたlut A及びFepA蛋白は合わせて外被タン
パクの30%である。従って、本発明による組み換え菌
株によるJut A及びPep A蛋白と、それらの前
駆体は、天然の発現を大きく上回ることが分かった。
最適化していない条件では平均で総蛋白質の25%〉に
注意しなければならない。成熟した蛋白質は外被の蛋白
質量の35%未満である。このパーセンテージを外被内
のこの種の蛋白質の含有の限界とみることができる。比
較として、天然の大腸菌15022の菌株によって発現
されたlut A及びFepA蛋白は合わせて外被タン
パクの30%である。従って、本発明による組み換え菌
株によるJut A及びPep A蛋白と、それらの前
駆体は、天然の発現を大きく上回ることが分かった。
Iut A蛋白を発現するクローンでのクロアシンDF
13に対する感受性と、Fep A蛋白を発現するク
ローンでのコリシンBに対する感受性が明らかになって
、外被内でのこれらの蛋白質の合成及び組み込みは正常
に展開することが分かった。
13に対する感受性と、Fep A蛋白を発現するク
ローンでのコリシンBに対する感受性が明らかになって
、外被内でのこれらの蛋白質の合成及び組み込みは正常
に展開することが分かった。
また、遺伝子組み換えによって得られた蛋白質と天然の
蛋白質が同じであるということは、天然のjut A及
びFep A蛋白に対する抗原によるこれ1 らの蛋白質の認識によって示される。これらの抗原は、
また、同じ特殊性で、細胞質内封入物中に沈澱された前
駆体prolut A及びproFep Aを認識する
。
蛋白質が同じであるということは、天然のjut A及
びFep A蛋白に対する抗原によるこれ1 らの蛋白質の認識によって示される。これらの抗原は、
また、同じ特殊性で、細胞質内封入物中に沈澱された前
駆体prolut A及びproFep Aを認識する
。
遺伝子組み換えによって得られたJut A及びFep
A蛋白によって誘導された抗原は、同様に、病原菌であ
る異なる大腸菌株によって発現されたIutA及びFe
p A蛋白を認識する。
A蛋白によって誘導された抗原は、同様に、病原菌であ
る異なる大腸菌株によって発現されたIutA及びFe
p A蛋白を認識する。
発現ベクターでのそれらの遺伝子のクローニングによる
レセプターJut A及びFep Aの超発現によって
、鉄が豊富な培地で、病原菌が生体内で増殖中に発現す
る蛋白質と機能的且つ抗原的に同じ外被タンパクを得る
ことができる。
レセプターJut A及びFep Aの超発現によって
、鉄が豊富な培地で、病原菌が生体内で増殖中に発現す
る蛋白質と機能的且つ抗原的に同じ外被タンパクを得る
ことができる。
従って、遺伝子組み換えによるJut A及びFepA
蛋白の合成には、以下のように多数の利点がある。
蛋白の合成には、以下のように多数の利点がある。
(1)鉄による調節をしないで、蛋白質Jut A及び
FepAを多量に得ることができる。
FepAを多量に得ることができる。
(2) 合成される蛋白質は、病原菌が生体内で増殖
中に発現する蛋白質と機能的且つ抗原的に同2 じであり、抗体の形成を誘導する。
中に発現する蛋白質と機能的且つ抗原的に同2 じであり、抗体の形成を誘導する。
(3) ワクチン中で有効成分として使用すると、鉄
によって調節される細胞、すなわち、担鉄細胞の特定認
識を妨げる抗体の形成を誘導し、それによって鉄の供給
を停止し、宿主内での増殖を防ぐ。従って、敗血症を含
む感染症を予防し、闘うのに極めて有効なワクチンを製
造することができる。
によって調節される細胞、すなわち、担鉄細胞の特定認
識を妨げる抗体の形成を誘導し、それによって鉄の供給
を停止し、宿主内での増殖を防ぐ。従って、敗血症を含
む感染症を予防し、闘うのに極めて有効なワクチンを製
造することができる。
また、それらのワクチンは、表面または壁抗原を主成分
とするワクチンの製造に使用される従来の方法によって
、不活性化した組み換えクローンまたは組み換えクロー
ンを溶解し、続いて、精製して得られた膜フラグメント
から容易に製造することができる。
とするワクチンの製造に使用される従来の方法によって
、不活性化した組み換えクローンまたは組み換えクロー
ンを溶解し、続いて、精製して得られた膜フラグメント
から容易に製造することができる。
IV、鉄を制限した培地での培養によるI ROMPp
圭( (1)菌株: 大腸菌078参照15022 :鶏起源
、(2)培養: 3 培地 培地ST+コハク酸塩(イー、エッチ、シモン(E、
11. Simon) と7 スフ ン(Tesma
nn) (1963) ”プロシーディング オブ
ナチュラル アカデミ・ツクサイエンス(Proc、
Natl、八cad、Sci、) Jアメリカ合衆国
第50号、526〜532頁 ラクトフェリン(250μg /d)を添加して、鉄が
欠乏した培地を得る。
圭( (1)菌株: 大腸菌078参照15022 :鶏起源
、(2)培養: 3 培地 培地ST+コハク酸塩(イー、エッチ、シモン(E、
11. Simon) と7 スフ ン(Tesma
nn) (1963) ”プロシーディング オブ
ナチュラル アカデミ・ツクサイエンス(Proc、
Natl、八cad、Sci、) Jアメリカ合衆国
第50号、526〜532頁 ラクトフェリン(250μg /d)を添加して、鉄が
欠乏した培地を得る。
FeC]+ ・6)+20 (40μM)を添加して
、鉄に富む培地を得る。
、鉄に富む培地を得る。
培養
菌株を鉄に富む培地を3回通過させ、次に、鉄が欠乏し
ている培地を通過させ、最終的に鉄が欠乏している培地
で培養。
ている培地を通過させ、最終的に鉄が欠乏している培地
で培養。
平行して、鉄に富む培地で同じ菌株を培養する。
24時間、37℃で培養を実施する。
(3)分析:
培養後、各培地で、以下の操作を行う。
遠心分離による回収
T++s HCl0.2M pH8及び超音波化に
よる4 残滓の回収 遠心分離<5(10)0 g、30分)再遠心分離によ
るl澄み液(1(to、 ODD g、1時間)Tri
s HCI(50mM 5pH8) 、MgCL(I
OmM>、し口T八l+nlJ、 )リドンX1(1
0(2%)での残滓の回収及び37℃で、20分間撹拌 1時間、1,(10).(10)0 gで遠心分離、次
に、残滓の再回収 脱イオン水で残滓の洗浄 変性条件(メルカプトエタノール、SDS 9で、ポ
リアクリルアミドゲル(PAGE、5DS)での残滓の
分析 (4)結果: ラクトフェリンの存在下で培養された細菌の膜見掛分子
量が8(10)(10)ダルトン(エンテロバクチンレ
セプター、Fep A)及び76(10)0 ダルトン
(アエロバクチンレセプター、tut A)の2つの蛋
白質が多量に存在。
よる4 残滓の回収 遠心分離<5(10)0 g、30分)再遠心分離によ
るl澄み液(1(to、 ODD g、1時間)Tri
s HCI(50mM 5pH8) 、MgCL(I
OmM>、し口T八l+nlJ、 )リドンX1(1
0(2%)での残滓の回収及び37℃で、20分間撹拌 1時間、1,(10).(10)0 gで遠心分離、次
に、残滓の再回収 脱イオン水で残滓の洗浄 変性条件(メルカプトエタノール、SDS 9で、ポ
リアクリルアミドゲル(PAGE、5DS)での残滓の
分析 (4)結果: ラクトフェリンの存在下で培養された細菌の膜見掛分子
量が8(10)(10)ダルトン(エンテロバクチンレ
セプター、Fep A)及び76(10)0 ダルトン
(アエロバクチンレセプター、tut A)の2つの蛋
白質が多量に存在。
鉄に富む培地で培養された細菌膜ニ
ア6(10)0及び8QOQO[]aの帯無し。
■、ワクヂンの製造
本発明による有効成分は、好ましくは、ワクチン中で、
公知のヒトまたは獣医学の抗細菌ワクチンと組み合わせ
られる。特に、@製した蛋白質を使用する場合は、それ
が好ましい。
公知のヒトまたは獣医学の抗細菌ワクチンと組み合わせ
られる。特に、@製した蛋白質を使用する場合は、それ
が好ましい。
これらのワクチンは、非経口路によって投与される従来
の賦形剤中に存在することができる。これらのワクチン
は、例えば、油性の公知の基剤を含むことができる。
の賦形剤中に存在することができる。これらのワクチン
は、例えば、油性の公知の基剤を含むことができる。
/b
−\
f[]
1′−! へ
:==\−「\
ユ
使
賭
坊
賭
−らり7−
aO=J−J (10) 舶 −(10)〜 の
=;;(lll’l旧 第切喝(イ)トドトド的の叩 の−の−の一トートー (holI’T−J−Nトal)+9寸(11tj q
d Ln ln 1111n Q −7)(N N N
N N←I N (N N Ntv+t。
=;;(lll’l旧 第切喝(イ)トドトド的の叩 の−の−の一トートー (holI’T−J−Nトal)+9寸(11tj q
d Ln ln 1111n Q −7)(N N N
N N←I N (N N Ntv+t。
(!I 0
トイ
イト
トイ
<)−
ビlロビ
0 U (10)
に 1= 1−E
已詳訃訃
刺(10)
1:ごごご
重旨旨旨
−GりQ−
唄
尉
月
0翫
にε
0:1(11
0、m
O
跪日
が−1’−−) 、−
震 。
文献
(]) BfNDEREIF A、、 BRAUN V
、、 HANTKE、 J、 Bacteriol。
、、 HANTKE、 J、 Bacteriol。
150、1472−1475 (1,982)(2)
BINDERHTF A、、 NEILANDS 1.
B、、 J、 BactCriol 153゜1111
−1113 (1983) (3) BIRNB(MM H,C,、DOLY J、
、 Nucleic Ac1ds Res、L。
BINDERHTF A、、 NEILANDS 1.
B、、 J、 BactCriol 153゜1111
−1113 (1983) (3) BIRNB(MM H,C,、DOLY J、
、 Nucleic Ac1ds Res、L。
1513−1523 (1979)
(4) BOLTN C,A、、 JHNSBN A、
E、、 Infect、 Tmm、 55゜12
39−1242 (1987) (5) BYER8B、R,、P、 111−116.
”Iron transport in m1cro
bes。
E、、 Infect、 Tmm、 55゜12
39−1242 (1987) (5) BYER8B、R,、P、 111−116.
”Iron transport in m1cro
bes。
plants and animals”、 G、
WINKELMAN、 D、 VAN DERHAL
MJ、B、 NEILANDS、 VCHPublis
bers Weinhcim、 FRG。
WINKELMAN、 D、 VAN DERHAL
MJ、B、 NEILANDS、 VCHPublis
bers Weinhcim、 FRG。
(6) C0DERREP、、 EARHARDT C
,F、、 ”Characterization of
aplasmid carrying the Es
ct+ericl〕ia coli K12. enτ
D、 fep−△、 fe、q ■■ ent Flgenes FHMS Microbio
l、 Letters 25. I ] I−116(
1984)(7) C0ULTON J、W、、 Bi
ochim、 Biophys、 Acta 717.
154.162(1982) (8) DE (3RAAF F、に、、 TI
EZE G、A、、 WENDELAA、RBON
GA S、、 STOUTHAMHRA、H,、J
、 Bacteriol、 95. 631−64
0(1968) (9) DE GR,AAF F、に、、 GO
EDVOLK−DE GROOT。
,F、、 ”Characterization of
aplasmid carrying the Es
ct+ericl〕ia coli K12. enτ
D、 fep−△、 fe、q ■■ ent Flgenes FHMS Microbio
l、 Letters 25. I ] I−116(
1984)(7) C0ULTON J、W、、 Bi
ochim、 Biophys、 Acta 717.
154.162(1982) (8) DE (3RAAF F、に、、 TI
EZE G、A、、 WENDELAA、RBON
GA S、、 STOUTHAMHRA、H,、J
、 Bacteriol、 95. 631−64
0(1968) (9) DE GR,AAF F、に、、 GO
EDVOLK−DE GROOT。
STOUTT(AMERA、H,、Biochim、
Biophys、 Acta、 22]、 566−5
75(1970) (1,0) ENGWALL E、、 PERLMA
NN、 J、 Immunol、 109゜129
−135 (1972) (11,) FLEMING T、P、、 NAHLI
K M、S、、 NEILANDS J、B、、 Me
INTO3HM、A、、 Gene、 34.47−5
4 (1985)(+2) FISS E、H,、ST
ANLEY−8AMUELSON P、、 NEILA
NDSJ、B、、 Biochemislry、 21
、4517−4522 (1982)(13) GR
IFFITI3 E、、 ”Iron and 1
nfection : molecular。
Biophys、 Acta、 22]、 566−5
75(1970) (1,0) ENGWALL E、、 PERLMA
NN、 J、 Immunol、 109゜129
−135 (1972) (11,) FLEMING T、P、、 NAHLI
K M、S、、 NEILANDS J、B、、 Me
INTO3HM、A、、 Gene、 34.47−5
4 (1985)(+2) FISS E、H,、ST
ANLEY−8AMUELSON P、、 NEILA
NDSJ、B、、 Biochemislry、 21
、4517−4522 (1982)(13) GR
IFFITI3 E、、 ”Iron and 1
nfection : molecular。
physiological and che
mical aspecτs”、 JJ、
BULLEN、 E。
mical aspecτs”、 JJ、
BULLEN、 E。
GRIFFITI−I JOI−IN WILEY
& 5ONS LTD、 CHICHESTEREN
GLAND 9′7 (14)HERREROM、、DBLORENZOV、
、NEILANDSJ、B、、JBac+eriol
170.56−64 (1988)(15) HOLL
IFIHLD W、E、、 NEILANDS、 Bi
ochemistry 171922−1.928 (
1978) (16) KADOC,1,、LIU S、T、、 J
、 Bacteriol、 145.1365−137
3(1978) (17) KRONE W、J、A、、 0UDEGA
B、、 5TEGIEHUIS F、、 DEGRA
AF F、に、、 J、 Bactcriol 153
.7+6−721 (1983)(1g) KRONE
W、J、A、、 5THGEHUIS F、、 KO
NINGSTEIN G、。
& 5ONS LTD、 CHICHESTEREN
GLAND 9′7 (14)HERREROM、、DBLORENZOV、
、NEILANDSJ、B、、JBac+eriol
170.56−64 (1988)(15) HOLL
IFIHLD W、E、、 NEILANDS、 Bi
ochemistry 171922−1.928 (
1978) (16) KADOC,1,、LIU S、T、、 J
、 Bacteriol、 145.1365−137
3(1978) (17) KRONE W、J、A、、 0UDEGA
B、、 5TEGIEHUIS F、、 DEGRA
AF F、に、、 J、 Bactcriol 153
.7+6−721 (1983)(1g) KRONE
W、J、A、、 5THGEHUIS F、、 KO
NINGSTEIN G、。
VANDOORNC,、RO3ENDALB、、DEG
RAAFF、に、、0UDEGAB、、 FEMS M
icrobiol、 26.15316] (1985
)(19) LAIRD AJ、 et YOUNG
LG、、 Gene l I、 359−366 (1
950)(20) LOWRY O,1(、、RO
5EBROUG)l N、J、、 FARRA
L、A。
RAAFF、に、、0UDEGAB、、 FEMS M
icrobiol、 26.15316] (1985
)(19) LAIRD AJ、 et YOUNG
LG、、 Gene l I、 359−366 (1
950)(20) LOWRY O,1(、、RO
5EBROUG)l N、J、、 FARRA
L、A。
RANDALL R,J、、 J、 Biol、 Ch
em、 ] 93.265−275 (1951)(2
1) L(JGTENBERG B、、 MEUIER
8J、、 PIF、″F1ミR8R,、VANDERH
OEK P、、VAN A、LPHEN L、、FEB
S T、ett 聾、 254−258(1975) (22) LUNDIGRAN M、D、、 KADN
ERR,J、、 J、 Biol、 Chem261、
10797−1.0801 (1986)(23) M
ANTATTS T、、 FRITSCHE、F、 e
t SAMBROOK J(1982)、 Mo1ec
ular cloning : on 1aborat
ory manual、 Co1d SpringHa
rbor Laboratory、 Co1d Spr
ing Harbor NY。
em、 ] 93.265−275 (1951)(2
1) L(JGTENBERG B、、 MEUIER
8J、、 PIF、″F1ミR8R,、VANDERH
OEK P、、VAN A、LPHEN L、、FEB
S T、ett 聾、 254−258(1975) (22) LUNDIGRAN M、D、、 KADN
ERR,J、、 J、 Biol、 Chem261、
10797−1.0801 (1986)(23) M
ANTATTS T、、 FRITSCHE、F、 e
t SAMBROOK J(1982)、 Mo1ec
ular cloning : on 1aborat
ory manual、 Co1d SpringHa
rbor Laboratory、 Co1d Spr
ing Harbor NY。
(24) NAKAMAYE K、、 ECKSTEI
N、 Nucl、 Ac1cls Res、 14゜9
679−9698 (1986) (25) 0HTSUBOH,、0HTSUBOE、、
Proc、 Natl、 Acad、 Sci。
N、 Nucl、 Ac1cls Res、 14゜9
679−9698 (1986) (25) 0HTSUBOH,、0HTSUBOE、、
Proc、 Natl、 Acad、 Sci。
USA出、 615−619 (197g)(26)
ROGER8H王、 5YNGE C,、WOOD
S V、E、。
ROGER8H王、 5YNGE C,、WOOD
S V、E、。
Antibacterial effect of
scandium and indium c
omplexes ofenteroehelin
on Klebsiella neumoniae、
Antimicrob、 Agents andChe
motherapy ] 8.63−68 (1986
)(27) ROGERNS H,J、、 ”Tron
transport in m1crobes、 p
lants andanimals” G、WINK
ELMAN D、VAN DERHELM、J、B
。
scandium and indium c
omplexes ofenteroehelin
on Klebsiella neumoniae、
Antimicrob、 Agents andChe
motherapy ] 8.63−68 (1986
)(27) ROGERNS H,J、、 ”Tron
transport in m1crobes、 p
lants andanimals” G、WINK
ELMAN D、VAN DERHELM、J、B
。
NHILANDS、 p、 223−233 (198
7)−VCHPublishers、 Weinl]e
im。
7)−VCHPublishers、 Weinl]e
im。
RG
(28) 5ANGERF、、 NTCKLEN S、
、 C0ULSON A、R,、ProcNatl、
Acad、 Sci、 USA 74.5463−54
67 (1977)(29) SCHNATTMAN
C,A、、 J、 BacLeriol 108.54
5−552 (+971)(30)SIMON E、
It、TESSMAN 1.、Proc、Na11.A
cad、5ciUSA頻、 526−532 (196
3)(31) 5OUTHERN H,、J、 Mo1
. Biol、 98.503−517 (1975)
(32)TAYLORJ、W、、SCHMIDT W
、、CRO8STICK R,。
、 C0ULSON A、R,、ProcNatl、
Acad、 Sci、 USA 74.5463−54
67 (1977)(29) SCHNATTMAN
C,A、、 J、 BacLeriol 108.54
5−552 (+971)(30)SIMON E、
It、TESSMAN 1.、Proc、Na11.A
cad、5ciUSA頻、 526−532 (196
3)(31) 5OUTHERN H,、J、 Mo1
. Biol、 98.503−517 (1975)
(32)TAYLORJ、W、、SCHMIDT W
、、CRO8STICK R,。
0KRUSZEK A、、 ECKSTEIN F、、
Nucl、 Ac1ds Res、 13.8749
−8764(1985) (33)TAYLORJ、W、、OUT J、、ECK
STEIN F、Nucl、Ac1dsRes、 13
.8765−8785 (1985)(34)TOWB
IN H,,5TAEHELIN T、、GORDON
J、、ProcNatl、 Acad、 Sci U
SA 76、4350−4354 (1979)(35
)VAN TIEL−MENKVELD G、J、
、 0UDEGA B、。
Nucl、 Ac1ds Res、 13.8749
−8764(1985) (33)TAYLORJ、W、、OUT J、、ECK
STEIN F、Nucl、Ac1dsRes、 13
.8765−8785 (1985)(34)TOWB
IN H,,5TAEHELIN T、、GORDON
J、、ProcNatl、 Acad、 Sci U
SA 76、4350−4354 (1979)(35
)VAN TIEL−MENKVELD G、J、
、 0UDEGA B、。
KEMPER3O,、DE GRAAF F、に、、
FEMS、 Microbiol、 Le+t、 12
゜373−380 (198] ) (36) VAN TIEL−MHNKVHLD GJ
、、 VELTKAMPF E、、 DBORAAF
F、に、、 J、 Bacferiol、 +46.4
]−48(1981)(37) WILLTAMS P
、 H,、1nfect、、 Immun、 26.9
25−932 (1979)(38) YA、Nl5
CH−PERRON C,V丁EIRA、J、、MES
S丁NG J、、Gene引、 103−119 (1
985) It)/
FEMS、 Microbiol、 Le+t、 12
゜373−380 (198] ) (36) VAN TIEL−MHNKVHLD GJ
、、 VELTKAMPF E、、 DBORAAF
F、に、、 J、 Bacferiol、 +46.4
]−48(1981)(37) WILLTAMS P
、 H,、1nfect、、 Immun、 26.9
25−932 (1979)(38) YA、Nl5
CH−PERRON C,V丁EIRA、J、、MES
S丁NG J、、Gene引、 103−119 (1
985) It)/
第1図は、tut A蛋白を発現するクローンの電気泳
動によって得られた蛋白質プロフィルを示し、第2図は
、Fet A蛋白を発現するりr]−ンの電気泳動によ
って得られた蛋白質プロフィルを示す。
動によって得られた蛋白質プロフィルを示し、第2図は
、Fet A蛋白を発現するりr]−ンの電気泳動によ
って得られた蛋白質プロフィルを示す。
Claims (16)
- (1)ワクチン製造に使用可能な一部が担鉄細胞レセプ
ターまたはトランスフェリンである鉄によって調節され
る外被タンパクを発現する細菌の培養方法において、 ラクトフェリンのような鉄の強力なキレート化蛋白を用
いて、鉄の含有量を、上記レセプター蛋白の発現を増加
させることができる量まで減少させた培地中で上記細菌
を培養することによって、細菌をワクチン中で使用した
時に、上記レセプターによる担鉄細胞の特定認識を防ぐ
抗原が形成されるようにしたことを特徴とする方法。 - (2)上記細菌が大腸菌、クレブシェラ、ねずみチフス
菌、赤痢菌に属する腸内バクターによって構成される群
に属することを特徴とする請求項1に記載の方法。 - (3)上記細菌によって分泌される担鉄細胞がアエロバ
クチンおよび/またはエンテロバクチンであることを特
徴とする請求項2に記載の方法。 - (4)発現される蛋白がIutAおよび/またはFep
Aタンパクであることを特徴とする請求項3に記載の方
法。 - (5)鉄によって調節され且つ一部が担鉄細胞レセプタ
ーまたはトランスフェリンレセプターである外被タンパ
クの発現を増加させることのできる量の鉄を含む培地で
培養して得られた細菌全体、これらの細菌の断片、もし
くはトランスフェリンまたは担鉄細胞のレセプター蛋白
質、特にこれら細菌から抽出されたIutAおよびFe
pAタンパクを含む抗原を有効成分として含むことを特
徴とするワクチン。 - (6)上記細菌が請求項1から4のいずれか一項に記載
の方法によって得られた細菌であることを特徴とする請
求項5に記載のワクチン。 - (7)トランスフェリンまたは担鉄細胞のレセプターを
構成する少なくとも1つの鉄によって調節される外被タ
ンパクの発現量が増加した細菌において、上記タンパク
を発現する組換え発現ベクターを含むことを特徴とする
細菌。 - (8)上記ベクターによって発現される遺伝子が、大腸
菌、クレブシェラ、ねずみチフス菌、赤痢菌に属する腸
内バクターによって構成される群の一部を成す鉄によっ
て調節される外被タンパクの発現系に属することを特徴
とする請求項7に記載の細菌。 - (9)上記蛋白がアエロバクチンおよび/またはエンテ
ロバクチンの担鉄細胞系に属することを特徴とする請求
項8に記載の細菌。 - (10)合成されたタンパクがIutAおよび/または
FepAタンパクおよび/またはこれらの前駆体である
ことを特徴とする請求項9に記載の細菌。 - (11)大腸菌またはアエロバクチンオペロンを有する
その他の腸内バクターのプラスミド部分を単離し、この
プラスミド部分から¥iutA¥遺伝子を有する断片を
分離し、この断片をクローニングベクターと結合させ、
クローン化された¥iutA¥遺伝子を発現ベクターに
挿入し、クローン培養によってIutA蛋白質を発現さ
せることによって上記IutAタンパクを得ることを特
徴とする請求項10に記載の細菌。 - (12)IutA蛋白を発現させるために用いる発現ベ
クターの複製の起点が、tacプロモーターの制御下に
あり、発現させる遺伝子が、リプレッサーが感熱性を有
する強力なプロモーターPrによって制御されているこ
とを特徴とする請求項11に記載の細菌。 - (13)FepAタンパクが、請求項11または12に
記載の発現ベクター中で¥fepA¥遺伝子をクローニ
ングすることによって得られることを特徴とする請求項
10に記載の細菌。 - (14)IROMPの合成、特にIutAおよびFep
Aタンパクまたはこれらの前駆体proIutAおよび
proFepAの合成方法において、 適当な培地で、請求項11から13のいずれか一項に記
載の細菌を、先ず32℃未満で、次いで42℃未満で培
養することによってiutAおよびfepA遺伝子を発
現させることを特徴とする方法。 - (15)請求項7から13のいずれか一項に記載の組換
え細菌の外被または細胞質から抽出されたIROMP、
特に、IutAおよび/またはFepA蛋白質および/
またはこれらの蛋白の前駆体を有効成分として含むこと
を特徴とする抗−敗血症菌ワクチン。 - (16)上記組換え細菌またはこれらの細菌の断片を含
むことを特徴とする請求項13に記載のワクチン。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8903626A FR2644346B1 (fr) | 1989-03-20 | 1989-03-20 | Vaccins contre les bacteries septicemiques, preparations d'antigenes de bacteries septicemiques, nouvelles bacteries et vecteurs pour la preparation de ces antigenes ou vaccins |
FR8903626 | 1989-03-20 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03143388A true JPH03143388A (ja) | 1991-06-18 |
Family
ID=9379871
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2071723A Pending JPH03143388A (ja) | 1989-03-20 | 1990-03-20 | 敗血症菌に対するワクチンと、敗血症菌の抗原の製造法と、これらの抗原またはワクチン製造用の新規なバクテリアおよびベクター |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0389347B1 (ja) |
JP (1) | JPH03143388A (ja) |
AT (1) | ATE251666T1 (ja) |
AU (1) | AU5415390A (ja) |
CA (1) | CA2029906A1 (ja) |
DE (1) | DE69034107T2 (ja) |
FR (1) | FR2644346B1 (ja) |
WO (1) | WO1990011349A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018527405A (ja) * | 2015-07-10 | 2018-09-20 | エピトピックス, エルエルシー | タンパク質及びklebsiellaタンパク質を含有する免疫化組成物ならびにその使用方法 |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5292869A (en) * | 1989-04-27 | 1994-03-08 | The Board Of Governors Of The University | Method for isolating and purifying transferrin and lactoferrin receptor proteins from bacteria and the preparation of vaccines containing the same |
ATE177010T1 (de) * | 1990-12-19 | 1999-03-15 | Pfizer | Immunverstärkung von impfstoffen, besonders von impfstoffen gegen schweinepleuropneumonie |
GB9112310D0 (en) * | 1991-06-07 | 1991-07-24 | United Kingdom Government | Fish vaccine |
FR2683147B1 (fr) * | 1991-10-30 | 1995-06-23 | Maingault Philippe | Systeme vehicule de principe actif permettant l'administration voie orale chez les poissons et crustaces. |
US5554507A (en) * | 1992-07-30 | 1996-09-10 | American Cyanamid Company | Bacillus subtilis siderophore genes |
EP0659086B1 (en) * | 1992-09-04 | 1998-11-11 | The University of Saskatchewan | Novel bacterial vaccines using vaccine strains of pathogenic bacteria |
EP0749321B1 (en) * | 1994-02-09 | 2007-01-24 | Epitopix LLC | Active immunization using a siderophore receptor protein |
US5830479A (en) * | 1994-02-09 | 1998-11-03 | Willmar Poultry Company, Inc. | Active immunization using a siderophore receptor protein |
US6682754B2 (en) | 1999-11-24 | 2004-01-27 | Willmar Poultry Company, Inc. | Ovo delivery of an immunogen containing implant |
CA2708949C (en) | 2001-01-03 | 2016-03-08 | Epitopix Llc. | Immunizing compositions and methods of use |
ES2395022T3 (es) | 2003-09-19 | 2013-02-07 | Epitopix, Llc | Polipéptidos de Campylobacter y sus métodos de uso |
US8729013B2 (en) | 2004-08-26 | 2014-05-20 | The University Of Western Ontario | Methods of inhibiting staphylobactin-mediated iron uptake in S. aureus |
WO2010123845A2 (en) | 2009-04-21 | 2010-10-28 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Siderophore conjugate immunogenic compositions and vaccines |
WO2011131789A1 (en) | 2010-04-23 | 2011-10-27 | Intervet International B.V. | A vaccine comprising inactivated cells of haemophilus parasuis bacteria of serotype 5 |
US10166280B2 (en) | 2016-06-08 | 2019-01-01 | Epitopix, Llc | Polypeptides and immunizing compositions containing Bacillus polypeptides and methods of use |
-
1989
- 1989-03-20 FR FR8903626A patent/FR2644346B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-03-19 WO PCT/FR1990/000183 patent/WO1990011349A1/fr active Application Filing
- 1990-03-19 AT AT90400734T patent/ATE251666T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-19 EP EP90400734A patent/EP0389347B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 AU AU54153/90A patent/AU5415390A/en not_active Abandoned
- 1990-03-19 DE DE69034107T patent/DE69034107T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 CA CA002029906A patent/CA2029906A1/en not_active Abandoned
- 1990-03-20 JP JP2071723A patent/JPH03143388A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018527405A (ja) * | 2015-07-10 | 2018-09-20 | エピトピックス, エルエルシー | タンパク質及びklebsiellaタンパク質を含有する免疫化組成物ならびにその使用方法 |
JP2021063084A (ja) * | 2015-07-10 | 2021-04-22 | エピトピックス, エルエルシー | タンパク質及びklebsiellaタンパク質を含有する免疫化組成物ならびにその使用方法 |
US11000582B2 (en) | 2015-07-10 | 2021-05-11 | Epitopix, Llc | Proteins and immunizing compositions containing klebsiella proteins and methods of use |
US11872273B2 (en) | 2015-07-10 | 2024-01-16 | Epitopix, Llc | Proteins and immunizing compositions containing Klebsiella proteins and methods of use |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE251666T1 (de) | 2003-10-15 |
WO1990011349A1 (fr) | 1990-10-04 |
DE69034107T2 (de) | 2004-07-22 |
CA2029906A1 (en) | 1990-09-21 |
FR2644346B1 (fr) | 1994-05-13 |
EP0389347B1 (fr) | 2003-10-08 |
EP0389347A1 (fr) | 1990-09-26 |
AU5415390A (en) | 1990-10-22 |
FR2644346A1 (fr) | 1990-09-21 |
DE69034107D1 (de) | 2003-11-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Cavalieri et al. | Escherichia coli alpha-hemolysin: characteristics and probable role in pathogenicity | |
US5173294A (en) | Dna probe for the identification of haemophilus influenzae | |
JPH03143388A (ja) | 敗血症菌に対するワクチンと、敗血症菌の抗原の製造法と、これらの抗原またはワクチン製造用の新規なバクテリアおよびベクター | |
CA1338705C (en) | Vaccines obtained from antigenic gene products of recombinant genes | |
Guiso et al. | Bordetella adenylate cyclase is a virulence associated factor and an immunoprotective antigen | |
US5747309A (en) | Bacterial vaccines using vaccine strains of pathogenic bacteria | |
JP3031561B2 (ja) | 大腸菌ワクチン | |
Guidolin et al. | Genetics of Vibrio cholerae and its bacteriophages | |
Kasten et al. | Pasteurella multocida produces a protein with homology to the P6 outer membrane protein of Haemophilus influenzae | |
Rodrigues et al. | Development and evaluation of a new recombinant protein vaccine (YidR) against Klebsiella pneumoniae infection | |
EP0656014B1 (en) | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity to many strains of the group b streptococcus; process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition | |
Kong et al. | Regulated delayed expression of rfaH in an attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium vaccine enhances immunogenicity of outer membrane proteins and a heterologous antigen | |
KR100628657B1 (ko) | AroC, OmpF 및 OmpC 유전자 각각에 비복귀돌연변이로 약독화된 백신에 유용한 박테리아 | |
JP4785014B2 (ja) | 蛋白質 | |
JP2004337175A (ja) | 無毒性微生物及びその使用:サルモネラ | |
JP2009022299A (ja) | 変異Shigellaflexneri2a | |
Ogunnariwo et al. | Evidence for non-siderophore-mediated acquisition of transferrin-bound iron by Pasteurella multocida | |
PT90310B (pt) | Processo para a obtencao de preparacoes de adenilato-ciclase | |
Chamberlain et al. | Neisseria gonorrhoeae strain MS11 harbouring a mutation in gene aroA is attenuated and immunogenic | |
DE68916424T2 (de) | Pasteurella-impfstoff. | |
JPS6122A (ja) | 尿路感染症のための化学的に規定されたワクチン | |
JPH01149734A (ja) | 家禽の大腸菌敗血症に対するワクチン | |
Walia et al. | Purification and characterization of novel toxin produced by Vibrio cholerae O1 | |
Bouwer et al. | Cytotoxic-T-lymphocyte responses to epitopes of listeriolysin O and p60 following infection with Listeria monocytogenes | |
EP0389925A1 (en) | A method for purifying an outer membrane protein of Haemophilus influenzae |