PT90310B - Processo para a obtencao de preparacoes de adenilato-ciclase - Google Patents
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Description
Processo para a obtenção de preparações de adenilato-ciclase
A presente invenção refere-se a um método para a obtenção de antígenos protectores contra os processos tóxicos e infecciosos da Bordetella.
Sabe-se que a B. pertussis e a B. parapertussis são ambas agentes etiológicos dos acessos de coqueluche.
Estudos dos factores de virulência predominantemente envolvidos na patogénese da coqueluche levam a considerar dois produtos principais de B. pertussis, a hemaglutinina filamentosa (ΈΉΑ) e a toxina pertussis (Ptx) como os determinantes principais da patogénese e como imunogénios eficazes.
Num trabalho anterior (pedido de patente de invenção francesa n^ 8615968 de 10 de Novembro de 1986 em nome de Institut Pasteur e Inserm), os inventores utilizaram anticorpos que se lançaram contra um outro produto sintetisado pela
B. pertussis, o adenilato-ciclase (AC), para demonstrar a função desta molécula como a toxina principal no síndroma pulmonar citopático, conforme se pôs em evidência pela indução de uma alveolite edematosa hemorrágica (ΑΞΗΑ) em ratos, e, deste modo, como um potencial antígeno protector.
Actualmente, os inventores têm vindo a investigar a função da adenilato-ciclase produzida e libertada por outras espécies de Bordetella e, têm investigado a sua função na patogénese e imunidade numa infecção experimental no rato.
Deste modo, constitui um dos objectivos da presente invenção, utilizar espécies de Bordetella, diferentes da B. pertussis, para proporcionar preparações de adenilato-ciclase úteis como antigenos de protecção contra a coqueluche.
método da presente invenção para a obtenção de adenilato-ciclase e/ou uma proteína de reacção cruzada, embora inactiva, caracteriza-se pela utilização de B. parapertussis ou suas variantes.
Deve ter-se em atenção que os termos activa ou inactiva utilizados na presente descrição se referem à actividade enzimática da adenilato-ciclase.
A adenilato-ciclase activa possui um peso molecular de, aproximadamente, 43^ 4,3 - 45 - 4,5 Kda (intervalo de peso molecular, de acordo com o que se determinou para a ovalbumina que se utilizou como padrão). Ê reconhecida de um modo específico pelos anticorpos monoclonais e policlonais anti- B. pertussis AC.
A referida adenilato ciclase é capaz de reagir antigenicamente de modo cruzado com a B. pertussis AC.
A referida adenilato-ciclase que é uma citotoxina responsável pelas lesões pulmonares localizadas que ocorrem na coqueluche é, vantajosamente, dotada de propriedades antigénicas.
Descreve-se a proteína inactiva no pedido de patente de invenção europeia depositado no mesmo dia, em nome da Requerente, e referida como Immunoprotective antigenic protein against pathogenic bactéria.
A referida proteína inactiva é reconhecida especificamente pelos anticorpos policlonais anti-AC lançados contra as preparações de AC purificadas, e encontra-se desprovida de actividade susceptível de ser activada pela adenilato-ciclase CaM e de afinidade para CaM. Também é capaz de reagir antigenicamente de modo cruzado com a B, pertussis AC.
Assim, obtém-se um complexo de associação entre a adenilato-ciclase activa e a proteína com actividade cruzada, inactiva, a partir da B. pertussis ou de variantes que expressem proteínas com reactividade cruzada.
As formas activas e inactivas podem, deste modo, isolar-se, segundo as técnicas de purificação usuais.
Surpreendentemente, as referidas preparações de adelinato-ciclase obtiveram-se a partir da B. parapertussis embora se tenha admitido que não existe imunidade cruzada entre as infecções de B. pertussis e B, parapertussis.
Este aspecto da presente invenção reveste-se de grande interesse, uma vez que a B. parapertussis não expressa, como é bem conhecido, Ptx, e que a referida toxina apenas é expressa pela B. pertussis.
Em concordância com o anteriormente exposto, a presente invenção, proporciona os meios para se obterem preparações antigénicas de adenilato-ciclase desprovidas de efeitos secundários associados com Ptx, tais como os riscos de encefalites alérgicas.
De acordo com o método da presente invenção, obtêm-se as preparações antigénicas de Ac isentas de Ptx, a partir de clones hly+ de B. pertussis. Seleccionam-se esses clones in vitro
ou recuperam-se a partir de homogenatos de pulmões após a agressão e, são capazes de induzir alveolites edematosas hemorrágicas agudas.
Um clone hly+ específico, que expressa, vantajosamente, grandes quantidades de AC activa, recuperou-se a partir de pulmões e consiste no clone 63-2S que foi depositado sob o número 1-749, na Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), em 15 de Abril de 1988.
Os sobrenadantes de cultura de 65-2S e que correspondem às suspensões bacterianas normalizadas a 10^ CFU/ml possuem uma actividade enzimática de AC de cerca de 20-25 unidades .
Podem injectar-se, por via intra-nasal,em ratos, os clones hly+ que possuam uma expressão espontânea de AC mais baixa e, voltar a isolá-los a partir dos pulmões no sentido de aumentar a actividade de AC.
Incluem-se no âmbito da presente invenção, os clones derivados que mantenham a expressão fenotípica de AC+, hly+. Por exemplo, obteve-se o clone 63-2TCS (triptocaseína-soja) a partir da estirpe 63-2S, desenvolvida num meio não específico, no que diz respeito à Bordetellae, com a mesma produção e mantendo a expressão AC+, hly+.
Tornou-se evidente uma imunidade cruzada entre a B. pertussis e a B. parapertussis por protecçâo cruzada passiva com anticorpos anti-adenilato-ciclase de B.pertussis.
Os trabalhos realizados com preparações de adenilato-ciclase obtida, de acordo com a presente invenção, demonstraram que estas moléculas são antígenos protectores.
-ο-Z“'
De acordo com o anteriormente exposto, as referidas preparações de adenilato-ciclase utilizam-se, com vantagem, de acordo com a presente invenção, para se fabricarem preparações de vacinas, com a condição de que elas não proporcionem reacções cruzadas com a adenilato-ciclase do hospedeiro.
As preparações de adenilato-ciclase são constituídas pelas proteínas activa e inactiva, ou apenas por uma das referidas proteínas.
As referidas vacinas que, deste modo, se elaboram, a partir das preparações de adenilato-ciclase obtidas a partir da B. parapertussis, são vacinas moleculares e são capazes de evitár as infecções e os efeitos tóxicos da Bordetella nos seres humanos e nos animais. Utilizam-se de modo vantajoso as doses e as formas de administração habituais. De preferência, as vacinas encontram-se sob a forma de preparações intra-nasais, orais ou parentéricas.
Nas composições de vacinas, as preparações de adenilatociclase podem estar associadas ou não com FHA no mesmo inóculo. Pode administrar-se FHA em simultâneo com a preparação de adenilato-ciclase ou em períodos diferentes. Obtêm-se de um modo vantajoso, as preparações de FHA, de acordo com o método, por exemplo de Safo et al, in Infect. Immun, 41, 1985, 315-520 ou, de Imaizumi et al, Journal of Microbiol. Methods, 2, 1984, 334-347.
Também se podem associar as referidas preparações de adenilato-ciclase com preparações de AC purificada, de acordo com o descrito no referido pedido de patente de invenção francesa N2 8615983 de 17 de Novembro de 1986 e, opcionalmente
com FHA.
De um modo vantajoso, as composiçoes de vacina, da presente invenção, evitam a infecção causada pela Bordetella tal como B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchisnetica e,
B. avium.
De acordo com outro aspecto, as vacinas de células integralmente bacterianas, são elaboradas a partir da B. parapertussis . Tais vacinas apresentam um efeito protector contra a B, parapertussis e a B, pertussis.
Outras características e vantagens da presente invenção, indicar-se-ão no exemplo que se segue, com referência às Figuras, em que:
- A Figura 1 representa o efeito cinético da infecção pulmonar com clones de B. parapertussis,
- A Figura 2 representa manchas imunológicas de extractos de B. parapertussis e de B. pertussis, contendo AC, com anticorpos policlonais anti- B. pertussis AC.
Os materiais e métodos que se utilizam no exemplo, foram os seguintes:
a - Estirpes bacterianas e condiçoes de cultura:
Colocaram-se a B. pertussis 18323 (ATCC 9797) θ a B. parapertussis (CIP63-2) em meio de agar de Bordet Gengou enriquecido com sangue de cavalo desfibrinizado (a uma concentração final de 15%) (BG), para se seleccionarem os clones (hly) hemolíticos ou não hemolíticos, os quais se subcultivaram em caldo de cultura Stainer Scholte”.
b - Ensaios para AC e Ftx:
Os métodos para a detecção de AC e de Ftx, a partir da actividade enzimática ou a partir da actividade biológica, ou através de análise de mancha Western, foram descritos por
White A.A. et al, Methods Enzymol., 38C, 4-1-46, 1974-, assim como através das modificações introduzidas por Hanoune et al.
J. Biol Chem, 252, 2039-2046, 1977.
c - Infecção de ratos
Adquiriram-se na Ferme Experimentale de Rennemoulin (Institut Pasteur, 78 Villepreux, França, ratos fêmeas 0F1 Swiss, sem doenças específicas, com três semanas de idade, pesando 16g+l, e mantiveram-se em grupos de cinco, em gaiolas encimadas por filtros tampões (Techniplast, UAR, França) sobre palha esterilizada e alimentaram-se com alimentos esterilizados por raios gama (granulados R03, UAR, França) e água fornecida por uma autoclave. Infectaram-se os ratos, às quatro semanas de idade, após uma curta anestesia com éter, por injecção intra-nasal de uma inoculação bacteriana normalizada (num volume de 50 microlitros) a partir da estirpe Kendrick 18323 de B, pertussis (estirpe com o número de depósito no ATCC 9797), ou com a B. parapertussis CIP 63-2.
d - Histopatologia
Recolheram-se em intervalos de tempo seleccionados os pulmões dos ratos infectados, fixaram-se em formaldeído a 10%, embeberam-se em parafina e efectuaram-se cortes em série antes de se corarem com hematoxilina e cosina ou Giemsa, para exame num microscópio de luz.
Resultados :
EFEITOS CINÉTICOS DA INFECÇÃO PULMONAR COM B. PARAPERTUSSIS
Infectaram-se dois grupos de ratos, por via intra-nasal, com um inoculado preparado a partir de um clone hly+ seleccionado de BG (63-2H) ou do referido clone hly+ depositado sob ο n^ I 748 recuperado a partir do homogenato dos pulmões dos ratos 3 dias depois da agressão (63-2S).
Na Figura 1 referem-se os efeitos, em função da dose, da infecção intra-nasal, a qual proporciona as variações de log1Q CFU/pulmões (unidades que formam colónias) em função dos dias, com 63-2H (curva*...#) e 63-2S (A.. A ). As barras verticais representam médias aritméticas de 5 ratos + SEM.
Conforme se indica na Figura 1, ambos os inoculados possuiam idêntica virulência (no que respeita à relação crescimento bacteriano/sobreviventes), enquanto o clone 63-2S se manifestou significativamente mais patogénico do que o clone 63—2H. A injecção intra-nasal de 10 CFU correspondeu ao LD50%, no caso de 63-2S e ao LD25%, apenas, no caso de 63-2H.
DESCOBERTAS HIST0PAT0LÓGICA5
Os pulmões dos ratos mortos 24 horas após a agressão, apresentaram o AEHA caracteristico observado com um clone hly+ AC+, derivado da B. pertussis 18323, conforme referido por Brézin C. et al. em FEMS Microbiol. Lett. 42, 1987, 75-80.
ACTIVIDADE DE AC
Doses de AC em sobrenadantes de cultura de 63-2S e de
63-2H que correspondiam a suspensões bacterianas normalizadas a 10 CFU/ml, demonstraram que as actividades enzimáticas de
AC foram de 20-25 unidades e de 4—7 unidades, respectivamen— te.
IMUNIDADE CRUZADA ENTRE A B. PERTUSSIS E A B. PARAPERTUSSIS
Resposta imunológica dos ratos infectados com B. parapertussis a AC:
Efectuou-se a análise da mancha Western de extractos de ureia de B. parapertussis, com anticorpos policlonais específicos anti-AC.
Obtiveram-se os extractos de ureia conforme se segue:
Homogeneizaram-se agregados bacterianos em tampão A (Tris-HCl 25 mM, MgCl2 6 mM, NP40 a 0,1%, pH 8), (1/3; peso/ /fceso) e adicionou-se a mesma quantidade, de ureia 8 M ao tampão A. Agitou-se o meio durante 40 minutos, a 30°C. Efectuou-se a diálise do tampão A, seguindo-se a sua centrifugação (5000g), durante 30 minutos, a 6°C. Recuperou-se o sobrenadante que constitui o extracto de ureia.
Obteve-se o anti-AC policlonal, imunizando animais com preparações de AC purificada obtida a partir da B. pertussis e recuperando os anticorpos lançados contra as preparações a partir dos soros imunológicos.
As preparações preferidas de AC, que se utilizam contra os anticorpos consistem nas preparações de AC purificado descritas no pedido de patente de invenção francesa n2 86/15963, depositado em 17 de Novembro de 1986 em nome da Requerente, e
- -LU referido como Purified AC preparation, a method for obtaining the same and their biological applications.
Estas preparações caracterizam-se pelo facto de terem um elevado grau de pureza e de serem total e virtualmente desprovidas de substâncias bacterianas contaminantes, em especial de toxinas pertussis, lipopolissacarídeos (ou LPS) e hemaglutinina filamentosa (ou FHA). Assim, AC encontra-se desponível sob uma forma homogénea, sedimentando com um coeficiente S igual a 3,6, num gradiente de densidade de sacarose, a qual existe sob duas formas moleculares estruturalmente relacionadas de 45 e de 43 Kda, respectivamente.
De acordo com um outro aspecto, as preparações de AC caracterizam-se pelo facto de possuirem uma actividade que pode atingir e mesmo exceder 1600 micromoles de cAMP min-^. mg-1.
Obtiveram-se as referidas preparações de AC purificadas, colocando em contacto com calmodulina um sobrenadante previamente concentrado de culturas bacterianas que expressam adenilato-ciclase ou um extracto destas bactérias.
Produziram-se os anticorpos policlonais, por exemplo, imunizando, animais tais como o coelho ou o rato por meio das preparações de AC em questão nas quais AC se encontra livre ou sob a forma de um complexo com proteínas eucariotas, especialmente com calmodulina e por recuperação dos anti-soros que contêm os anticorpos e depois recuperando os próprios anticorpos segundo métodos normalizados.
Obtiveram-se os anticorpos monoclonais pela fusão de células de mieloma de rato com linfócitos esplénicos derivados /
i ί
{ de um rato imunizado com adenil-ciclase purificada.
Utilizam-se, em especial, os anticorpos monoclonais (8-25). Eles originam a imunoprecipitação de um tripleto de 50, 45 e 43 Kda bem como de uma proteína de peso molecular superior a 100 Kda em extractos brutos e em preparações do enzima purificado a partir de células bacterianas.
Depositou-se a estirpe de hibridoma produtora dos anticorpos monoclonais na National Collection of Cultures of Microorganisms sob o N2 1-610 em 9 de Outubro de 1986.
Apresentam-se os resultados na Figura 2 em que as pistas 1 a 4, correspondem, respectivamente, a:
1. Extractos de B, parapertussis, revelados com anticorpo anti-AC da B.pertussis,
2. AC purificado da B. pertussis que se revelou através do soro de ratos infectados com B. parapertussis,
3. Extracto de B. parapertussis, revelado com soro de ratos infectados com B. parapertussis,
4. AC da B. parapertussis revelado num extracto de B. parapertussis com anticorpos anti-AC da B, pertussis.
A referida análise da mancha Western revelou a presença de um antígeno de Mr 43-45 Kda que reage de modo cruzado com a AC da B. pertussis (Figura 2).
Para além disso, a comparação de manchas imunológicas de AC purificado de B. pertussis com soros de ratos convalescentes de uma infecção com B. parapertussis, recolhidas 27 dias após a agressão por via intranasal (Figura 1), revelou a presença de anticorpos anti-AC de B. pertussis.
ACÇÃO PROTECTORA DOS ANTICORPOS ANTI-AC DA Bt PERTUSSIS CONTRA A INPECÇÃO RESPIRATÓRIA LETAL DO RATO COM B. PARAPERTUSSIS
a) Incubou-se previamente o inoculado de B, parapertussis com anticorpos monoclonais ou policlonais anti-AC da B, pertussis .
Apresentam-se
Anticorpos log10 diluição os resultados no Quadro 1,
QUADRO 1
Soro Normal
N° de sobreviventes/ 2/12 /fotal seguir:
Anticorpo
Policlonal
-1 -2 -3
8/12 6/12 5/12
Anticorpo
Monoclonal
-1 -2 -3
11/12 9/12 7/12
Conforme indicado no Quadro, o referido inóculo de B. parapertussis incubado com anticorpos policlonais ou monoclonais anti-AC de B. pertussis inibiu a agressão letal, de um modo dependente da dose.
Estabeleceu-se a imunogicidade cruzada entre a B. parapertussis e a B. pertussis por vacinação cruzada, conforme indicado no Quadro 2.
QUADRO 2
VACINAÇÃO CRUZADA CONTRA A B. PERTUSSIS OU A B. PARAPERTUSSIS
| Imunogénioa | BP AC + | BP AC | BPP | Controle |
| Agente de | BP AC + | BP AC+ | BP AC+ | BP AC+ |
| Agressão | BPP | BPP | BPP | BPP |
| Número de Sobreviventes/ /Total | 9/12 7/12 | 4/12 1/12 | 7/12 9/12 | 0/12 1/12 |
a Aqueceram-se as suspensões bacterianas a 56°C, durante g
minutos; duas injecções com 5 dias de intervalo de 1,2 x 10 B.pertussis AC+ (BPAC+), 2,5 χ 10θ B.pertussis AC (BPAC ) ou de 2,2 x 10^ B.parapertussis 63-2S (BPP).
b η +
Injecção intra-nasal de 5 x 10 CFU de BPAC ou de 8 x
O
CFU de BPP.
Claims (8)
- Reivindicações1. - Processo para a obtenção de preparações de adenilato ciclase, caracterizado pelo facto de se utilizar B. parapertussis ou variantes.
- 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de as preparações de adenilato-ciclase obtidas a partir de B.parapertussis ou variantes serem constituídas por uma adenilato-ciclase activa, com um peso molecular (Mr) de cerca de 43+4,3 - 45+4,5 KDa, especificamente identificada por anticorpos anti-B.pertussis AC monoclonais e policlonais específicos, e susceptíveis de reacção cruzada antigenicamente com a 3.pertussisAC, e/ou uma proteína inactiva com um peso molecular Mr de cerca de 43 + 4,3 KDa, identificada especificamente por anticorpos anti-AC policlonais excitados contra preparações AC purificadas e destituídos de actividade indutível por adenilato-ciclase CaM e de afinidade com CaM, sendo a referida proteína susceptivel de reacção cruzada com a B.pertussis AC.
- 3.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de incluir a fase adicional que consiste na separação e recuperação da proteína inactiva e da adenilato-ciclase activa, respectivamente.
- 4.- Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 caracterizado pelo facto de se obterem as preparações de adenilato-ciclase a partir de clones . hly+ de B.parapertussis susceptivel de induzir alveolites hemorrágicas adematosas agudas, sendo os clones particularmente seleccionados ou in vitro ou a partir de homogenatos de pulmão após o estímulo.
- 5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o referido clone hly+ ser o .clone 63-25 depositado sob o n? I 749 em 15 de Abril de 1988, e por os clones derivados manterem a expressão de fenotipo AC+,hly+.
- 6. - Processo de acordo com as reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo facto de os sobrenadantes da cultura correspondendo as suspensões bacterianas normalizadas a 10 CFU/ml terem uma acti^ vidade enzimática AC de cerca de 20 a 25 unidades.
- 7. - Processo para a preparação de composições de vacina , para evitar infecções provocadas pelas Bordetella, caracterizado pelo facto de se utilizar preparações de adenilato-ciclase tal como obtidas de acordo com o método segundo uma qualquer das reivindicações 1 a 7, eventualmente associadas no mesmo inoculum ou não com FHA e/ou AC purificado.
- 8, - Processo para a preparação de uma vacina de células totalmente bacterianas, caracterizado pelo facto de se utilizar a B. parapertussis,
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