PL177219B1

PL177219B1 - Szczepionka do ochrony świń przed zakażeniem Streptococcus suis

Info

Publication number: PL177219B1
Application number: PL94303482A
Authority: PL
Inventors: Antonius A.Ch. Jacobs
Original assignee: Akzo Nobel Nv
Priority date: 1993-05-17
Filing date: 1994-05-16
Publication date: 1999-10-29
Also published as: JP3578799B2; HU9401511D0; ATE183241T1; SK281324B6; US5612042A; ES2137310T3; DE69419966D1; EP0626452A1; EP0626452B1; HUT69796A; JPH0710774A; PL303482A1; CZ117594A3; GR3031698T3; TW494103B; DE69419966T2; DK0626452T3; HU218154B; CZ289302B6; SK56394A3

Abstract

1. Szczepionka do ochrony swin przed zakazeniem Streptococcus suis. znamienna tym, ze zawiera jako substancje czynna izolowany i oczyszczony polipeptyd Streptococcus suis albo jego immunogenny fragment, który w natywnej postaci ma na N-koncu sekwen- cje aminokwasowa Asp-Ser-Lys-Gln-Asp-Ile-Asn-Gln-Tyr-Phe-Gln-Ser-Leu-Thr-Tyr-Glu, jes bialkiem sekrecyjnym, ma mase czasteczkowa okolo 54000, moze byc aktywowany prze tiol, moze byc hamowany przez cholesterol i posiada aktywnosc hemolityczna, i ewentual- nie konwencjonalne substancje pomocnicze. RZECZPOSPOLITA POLSKA Urzad Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka do ochrony świń przed zakażeniem Streptococcus suis.

Streptococcus suis został zidentyfikowany jako główna przyczyna choroby zakaźnej świń, która charakteryzuje się artretyzmem, posocznicą, zapaleniem opon mózgowych, zapaleniem osierdzia, zapaleniem wsierdzia, zapaleniem błon surowiczych i/lub zapaleniem płuc (Clifton-Hadley, FA; Br. Vet. Journ. 139: 1-5 (1983), Vecht i wsp., Vet. Quarterly 7: 315-321 (1985), Windsor, R.S; Vet. rec. 101: 378-379 (1977), Higgins i wsp.; Can. J. Vet. Res. 54: 170-173 (1990), Devriese i wsp., Vet. Rec. 127: 68 (1990)).

Zachorowalność jest specjalnie wysoka zwłaszcza u prosiąt między 3-12 tygodniami życia (Windsor,· R.S. i Elliot, S,D.; J. Hyg. Camb., 75: 69-78 (1975), Guise i wsp.: Vet. Rec. 117: 43-44 (1985), Hoffman, L. J. i Henderson; L. M. Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians 28^th Ann. Proc. 201-210 (1985). Chociaż na ten czynnik bakteryjny podatne są świnie w różnym wieku, śmiertelność świń powyżej 14-tygodniowych jest niska. (Guise i in., Vet. Rec. 117: 43-44 (1985), Hoffman, L.J. and Henderson L.M. , Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians 28°¹ Ann. Proc. 201-210 (1985)).

W niektórych przypadkach organizm ten jest również związany z chorobą u innych gatunków zwierząt i człowieka (Devriese i wsp.; Vet. Rec. 127: 68 (1990), Homez i wsp.; Vet. Rec. 123: 626-627 (1988), Arends i wsp.; Rev. Infect. Dis. 10: 131-137 (1988), Gottschalk i wsp.; J. Clinic. Microbiolo. 27: 2633-2636 (1989), Arends, J. P. i Zanen, H. C.; Rev. Infect. Dis. 10: 131-137 (1988)). Zakażenia w tych przypadkach często zachodzą poprzez uszkodzenia skóry.

Chorobę spowodowaną przez S. suis po raz pierwszy opisał w Holandii DeMoor (DeMoor, C. E.; Antonie van Leevenhoek 29: 272-280 (1963)). Od tamtego czasu inni badacze donieśli o wybuchach epidemii w innych krajach, zarówno w Kanadzie, Stanach Zjednoczonych jak i Australii (Sanford, E. i Tilker, M. E.; J. Am. Vet. Med. Assoc. 23: 5-97 (1982),

Perch i wsp.; J. Clin. Microbiol. 17: 993-996 (1983), Larson, D. J. i Kott, B.; Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians 28^th Ann. Proc.: 121-130 (1985), Guise et al.; Vet. Rec. 117: 43-44 (1985), Clifton-Hadley, F. A.; Br. Vet. Journ. 09: 1-5 (1983)). Szczepy Streptococcus suis podzielono na wiele różnych serotypów.

Określenie serotypu opiera się na wielocukrowcowym antygenie otoczki (Koehne i wsp.; Am. J. Vet. Res. 40: 1640-1641 (1979), Perch i wsp.; J. Clin. Microbiol. 17: 993-996 (1983)). Do tej pory na świecie wykryto 29 różnych serotypów. Jednakże istnieje pewna przewaga kilku serotypów w wyróżnionych krajach. W krajach skandynawskich znacznie przeważa serotyp 7, podczas gdy w Austrii zwykle znajduje się serotyp 9. Najczęściej znajdowanym serotypem na świecie jest serotyp 2 (Gogolewski i wsp.; Aust.Vet. J. 67: 202-204 (1987), Boetner i wsp.; Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B 95: 233-239 (1987)).

Niewiele wiadomo o patogenezie, czynnikach zjadliwości i antygenach ochronnych Streptococcus suis. Powoduje to, ze nie ma wskazówki co do tego, które czynniki są potrzebne do skutecznego zaszczepienia przeciw czynnikowi zakaźnemu.

Jednym z powszechnie stosowanych sposobów otrzymania szczepionki przeciw chorobie bakteryjnej jest przygotowanie i sprawdzenie preparatu szczepionki z całych komórek. Zrobiono to również dla Streptococcus suis i okazało się, że szczepionki z całych komórek powodują znaczącą ochronę u świń przed homologicznymi czynnikami zakażającymi (Holt i wsp.; Res. Vet. Sci. 48: 23-27 (1990)).

Jednakże wydaje się prawdopodobne (Kebede i wsp.; Vet. Microbiol. 22: 249- 257 (1990)), że ochrona uzyskana dzięki preparatom z całych komórek jest specyficzna w stosunku do serotypu. Innymi ogólnymi i powszechnie znanymi niedogodnościami szczepionek z całych komórek są:

a) niepożądane reakcje w miejscu i obok miejsca wstrzyknięcia, i

b) duża ilość podawanego niespecyficznego białka w porównaniu z ilością materiału, rzeczywiście odpowiedzialnego za wywołanie ochrony.

Dany fakt, że obecnie na podstawie wielocukrowcowej otoczki znanych jest już 29 różnych serotypów Streptococcus suis, implikuje, że szczepionki oparte na całych komórkach powinny zawierać wiele serotypów w celu uzyskania szerokiego zakresu ochrony. Taką szczepionkę skonstruowano rzeczywiście w celu ochrony ludzi przed zapaleniem płuc. spowodowanym przez Streptococcus pneumonia (Boulnois, G. J.; Journ. Gen. Microbiol. 138: 249-259 (1992)). Szczepionka ta zawiera 23 wielocukry z najczęściej spotykanych serotypów. Szczepionka ta ma, oprócz swojego kompleksowego działania, znaczące niedociągnięcia, polegające na niskim stopniu immunogenności otoczkowych polisacharydów.

Zatem uczyniono wiele prób w celu określenia wyróżnionych czynników, które być może odgrywają rolę w patogenezie Streptococcus suis.

Hemaglutyniny i fimbrie opisano jako potencjalnie zjadliwe czynniki, lecz ich dokładna rola lub funkcja w patogenezie nie jest znana i nie zidentyfikowano odpowiednich cząsteczek lub białek (Jacques i wsp.; J. Bacteriol 172: 2833-2838 (1990), Gottschałk i wsp.; J. Clin. Microbiol. 28: 2156-2158 (1990)). Zatem zaproponowano cztery białka jako potencjalne zjadliwe czynniki:

a) białko 44 000 (Gottschalk i wsp.; Vet. Microb. 30: 59-71 (1992))

b) białko 94 000 (Holt i wsp.; J. Comp. Path. 1003: 85-94 (1990))

c) białko 110 000(C(zynnik) Z(ewnątrzkomórkowy)) (Vecht i wsp.; Infect. Immun. 59: 3156-3162 (1991), Vecht i wsp.; Infect. Immun. 60: 550-556 (1992), Smith i Vecht; zgłoszenie PCT WO 92/16630).

d) białko 136 000 (B(iałko) U(walniające) M(uraminidazę) (Vecht i wsp.; Infect. Immun. 59: 3156-3162 (1991), Vecht i wsp.; Infect. Immun. 60: 550-556 (1992), Smith i Vecht; zgłoszenie PCT WO 92/16630).

Białko 44 000 znaleziono w serotypie 2 chorobotwórczych szczepów S. suis, natomiast nieobecne jest w niechorobotwórczych szczepach mutantach. Antysurowica przeciwko szczepowi mutantowi, który nie zawiera białka 44 000 nie wystarczała do pełnej ochrony przed szczepem macierzystym. Przypuszcza się zatem, że jest ono czynnikiem zjadliwości.

177 219

Wykazano, że antysurowica, otrzymana u królików przeciw białku 94 000 z serotypu 2 S. suis wywołuje u myszy ochronę przeciw homologicznej prowokacji.

Wydaje się, że białka 110 000 i 136 000 są obecne w bardzo chorobotwórczych szczepach i nieobecne w szczepach niechorobotwórczych, natomiast białko 110 000 wydaje się być nieobecne w szczepach o niskiej chorobotwórczości. Może to sugerować, że białka 110 000 i 136 000 biorą udział w patogenezie. Z drugiej strony, jak dotąd nie opublikowano eksperymentów nad właściwościami ochronnymi preparatów tych białek.

Podsumowując, ze wszystkich określonych dotąd potencjalnych zjadliwych czynników tylko w przypadku białek 44 000 i 94 000 pokazano, że odgrywają one rolę w ochronie przeciw serotypowi 2. Ochronę tę zademonstrowano tylko u myszy w przypadku homologicznej prowokacji. W dodatku, jak dotąd obecność wspomnianych wyżej czterech białek wykazano tylko w szczepach Streptococcus suis o serotypie 2.

Jak wspomniano wyżej, dana duża liczba różnych serotypów, niezależny od serotypu i serologicznie reagujący krzyzowo antygen ochronny w sposób oczywisty mógłby być najkorzystniejszą podstawą do opracowania szczepionki. Nie opisano takiego antygenu dla Streptococcus suis.

Obecnie niespodziewanie stwierdzono, ze pewne szczepy Streptococcus suis wydzielają polipeptyd o masie cząsteczkowej około 54 000, który może być aktywowany przez tiol, może być hamowany przez cholesterol i wykazuje aktywność hemolityczną.

Hemolityczne toksyny charakteryzuje zdolność do uszkadzania komórek ssaków przez przerywanie integralności i/lub funkcji błony komórkowej. Przerywanie to zachodzi prawdopodobnie przez formowanie struktury porów przez oligomeryczne formy toksyny, zaraz włączane w błonę komórkową.

Pokazano, że hemolitycznym polipeptydcm stosowanym w wynalazku jest toksyna aktywowana przez tiol. Toksyny aktywowane tiolem są aktywne tylko w stanie zredukowanym i w sposób odwracalny tracą swoją aktywność pod wpływem utlenienia (Smyth, C. J. i Duncan, J. L.; Bacterial Toxins and Cell Membranes; Jeljaszewicz, J. i Wadstrom, T. (wyd.) London, Academic Press: 129-183 (1978)). Chociaż rola grupy tiolowej nie jest jasna, to podejrzewa się, ze jest ona ważną częścią motywu sekwencji ważnego dla wywoływania uszkodzeń w błonach. Mechanizm cytolitycznego działania pewnych grup hemolizyn przypuszczalnie polega na wiązaniu hemolitycznego polipeptydu z cholesterolem w błonie komórki ssaków. Skoro tylko białko przyłączy się do komórki, wnika w warstwę lipidową błony. Następnie powstają oligomeryczne kompleksy hemolizyny, które przypuszczalnie tworzą pory przechodzące przez błonę.

Pokazano, że aktywność hemolityczną polipeptydu stosowanego w niniejszym wynalazku należy do grupy hemolizyn, które mogą być hamowane przez cholesterol. Wydaje się, że cholesterol odgrywa kluczową rolę w wiązaniu hemolizyny do wrażliwych komórek. Zaproponowano parę modeli, w których cholesterol jest pierwszym miejscem wiązania toksyny z komórką.

Wolny cholesterol jest potencjalnym inhibitorem aktywności cytolitycznej, co można wyjaśnić w taki sposób, że jeżeli miejsce wiązące sterol w toksynie jest zajęte przez (wolny) cholesterol, nie może ono związać się z (związanym z błoną) cholesterolem (Boulnois i wsp.; Mol. Microbiol. 5: 2611-2616 (1991)).

Masę cząsteczkowa hemolitycznego polipeptydu określonego wyżej oznaczono na około 54 000. Do określenia masy cząsteczkowej zastosowano standardowe metody z użyciem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, jak to opisano w przykładzie II. Ścieżka C na figurze 1 pokazuje oczyszczony polipeptyd w otoczeniu cząsteczek znacznikowych (ścieżki A i D). Następnie scharakteryzowano polipeptyd hemolityczny jednego ze szczepów Streptococcus suis, szczepu P1/7, przez określenie jego sekwencji aminokwasowej na N-końcu. SEQ ID NO: 1: (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1) reprezentuje N-końcową sekwencję polipeptydu. Polipeptydy hemolityczne można izolować z niektórych, lecz nie ze wszystkich szczepów Streptococcus suis. Mogą występować niewielkie zmiany w sekwencji kwasu nukleinowego genu kodującego hemolityczny polipeptyd w odpowiednich szczepach S. suis, wytwarzających hemolityczny polipeptyd. Zmiany te mogą nie mieć żadnego wpływu na se177 219 kwencję aminokwasową polipeptydu w tych przypadkach, w których nowa trójka koduje ten sam aminokwas. Tak jest na przykład w przypadku, w którym G w trójce CTG, kodującej leucynę, jest zastąpione przez C i taka trójka również koduje leucynę. Jednakże jeżeli T byłoby zastąpione przez C, nowo powstała trójka kodowałaby prolinę zamiast leucyny. Mogłoby to leżeć u podstaw zmienności w sekwencji aminokwasowej w hemolitycznym polipeptydzie.

Zmienność sekwencji aminokwasowej może być rezultatem zastąpienia jednego lub więcej aminokwasów przez ich funkcjonalne odpowiedniki lub, rzadziej, przez wprowadzenie kodonu STOP lub, w przypadku delecji/insercji w sekwencji kwasu nukleinowego, wypadnięcia lub wstawienia jednego lub więcej aminokwasów. Zastąpienia przez funkcjonalne odpowiedniki są często widoczne. Przykłady opisane przez Neurath i wsp. (The Proteins, Academic Press, Nowy Jork (1979), strona 14, figura 6) obejmują między innymi zastąpienie aminokwasu alaniny przez serynę; Ala/Ser lub Val/Ile, Asp/Glu, i tak dalej. Oprócz zmienności polegających na zastąpieniu przez funkcjonalny odpowiednik aminokwasu, jak wspomniano wyżej, można znaleźć zmienności, w których aminokwas został zastąpiony przez inny aminokwas, który nie jest jego funkcjonalnym odpowiednikiem. Ten rodzaj zmienności różni się od podstawienia funkcjonalnymi równoważnikami tym, że w jego wyniku otrzymuje się białko o niewielkich zmianach w strukturze przestrzennej.

Wynalazek odnosi się do szczepionki chroniącej świnie przed zakazeniem Streptococcus suis, zawierającej wspomniany wyżej hemolityczny polipeptyd lub jego część, zdolną do wywołania odpowiedzi odpornościowej przeciwko hemolitycznemu polipeptydowi S. suis Szczepionka według wynalazku zawiera jako substancję czynną izolowany i oczyszczony polipeptyd Streptococcus suis albo jego immunogenny fragment, który w natywnej postaci ma na N-końcu sekwencję aminokwasową Asp-Ser-Lys-Gln-Asp-Ile-Asn-Gln-Tyr-Phe-GlnSer-Leu-Thr-Tyr-Glu, jest białkiem sekrecyjnym, ma masę cząsteczkową około 54 000, może być aktywowany przez tiol, może być hamowany przez cholesterol i posiada aktywność hemoliiycznąi ewentualnie konwencjonalne substancje pomocnicze.

Taką szczepionkę można na przykład wykonać używając syntetycznego polipeptydu naśladującego polipeptyd określony wyżej lub części tego polipeptydu, która jest zdolna do wywoływania odpowiedzi odpornościowej przeciw hemolitycznemu polipeptydowi S. suis.

Innym sposobem przygotowania takiej szczepionki jest biochemiczne oczyszczenie hemolitycznego polipeptydu z hodowli bakterii. Można to wykonać na przykład przez wirowanie bakterii i użycie kolumn do filtracji w żelu w celu oddzielenia hemolitycznego polipeptydu od innych składników. Dalsze oczyszczenie można na przykład przeprowadzić przez selektywne wytrącanie siarczanem amonu, a następnie wirowanie i rozpuszczanie osadu w odpowiednim buforze. Taką szczepionkę można również wykonać za pomocą technik klonowania molekularnego. Za pomocą tych technik sekwencję kwasu nukleinowego, kodującą polipeptyd określony wyżej lub jego część, która jest zdolna do wywoływania odpowiedzi odpornościowej przeciw hemolitycznemu polipeptydowi S. suis, można sklonować w wektorze ekspresyjnym i następnie uzyskać jej ekspresję w odpowiednim układzie ekspresyjnym. Produkt ekspresji może być następnie użyty w szczepionce. Możliwymi układami ekspresyjnymi są bakterie, drożdże, grzyby, komórki owadów i ssaków.

Innym sposobem wykonania polipeptydu jest sklonowanie informacji genetycznej dla tego polipeptydu w odpowiednim wektorze wirusowym i użycie komórki, która jest gospodarzem dla wirusa do ekspresji białka. Takimi układami są na przykład wektor zbudowany z wirusa ospy bydlęcej w połączeniu z odpowiednimi komórkami ssaka lub wektor zbudowany z bakulowirusa z komórkami Spodoptera frugiperda. Jako podstawy szczepionki można użyć nieoczyszczonych lub oczyszczonych lizatów zawierających polipeptyd ulegający ekspresji. Jeszcze innym podejściem jest użycie wirusów, dla których gospodarzem jest świnią, tak zwanych „przyżyciowych wirusowych nośników rekombinacyjnych” (ang. Live Recombinant Carrier virus). LRC jest wirusem, w którym sklonowano dodatkową informację genetyczną. Zwierzęta, zakażone tym zrekombinowanym wirusem, będą wytwarzały odpowiedź odpornościową nie tylko przeciwko immunogenom wirusa-wektora, lecz również przeciw immunogennym częściom polipeptydu(-ów), których sekwencje kodujące sklonowano dodatkowo w zrekombinowanym wirusie.

177 219

Wirusem, którego w szczególności używa się jako ,,przyzyciowego wektora rekombinacyjnego” do przenoszenia informacji genetycznej z obcych organizmów chorobotwórczych świń, jest wirus Pseudorabies (wirus wścieklizny rzekomej). Wirusa tego użyto wcześniej z powodzeniem jako LRC, na przykład do wykonania szczepionki złożonej z wirusa wścieklizny rzekomej i wirusa cholery świń.

W korzystnym przykładzie, szczepionka według niniejszego wynalazku obejmuje również inne immunogeny Streptococcus suis. Stwierdzono, że surowice przeciw hemolitycznemu polipeptydowi z serotypu 2 S. suis, reagują z hemolizynami wszystkich innych szczepów S. suis wytwarzających hemolizyny, bez względu na ich serotyp.

Nie stwierdzono tego dla wspomnianych wyżej polipeptydów 44 000, 94 000, 110 000 i 136 000. Tym niemniej, szczepionka według niniejszego wynalazku i dodatkowo zawierająca jeden z nich lub każdy inny z immunogenów Streptococcus suis, wykazuje nawet lepszą skuteczność. Większa skuteczność może być na przykład rezultatem efektu synergistycznego. Może to stanowić podstawę do produkcji bardziej skutecznych szczepionek, nawet z mniejszą zawartością antygenu.

W bardziej korzystnej formie, szczepionka według niniejszego wynalazku zawiera również nośnik sprzężony z polipeptydem określonym wyżej. Jako nośników można używać innych cząsteczek, takich jak hemocyjanina ze skałoczepa, albumina z surowicy wołowej, ale również i cząsteczek cukrów złożonych.

W jeszcze bardziej nawet korzystnej formie, szczepionka według niniejszego wynalazku zawiera wielocukier otoczki sprzężony z polipeptydem określonym wyżej. Metody kowalencyjnego wiązania polipeptydów do węglowodanów opisali między innymi Dick, W. E. i Beurt, M.; Contrib. Microbiol. Immunol. 10: 48-114 (1989). Jest jasne, ze inne typy nośników lub inne metody łączenia polipeptydu z węglowodanem również wchodzą w zakres niniejszego wynalazku.

W następnej formie, szczepionka według niniejszego wynalazku obejmuje również antygeny z innych organizmów i wirusów chorobotwórczych dla świń. Takimi organizmami i wirusami są na przykład Actinobacillus pleuropneumoniae, wirus wścieklizny rzekomej (Pseudorabies virus), wirus grypy świń, Parvovirus, wirus zakaźnego nieżytu żołądka i jelit, rotawirus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida i Bordetella bronchiseptica.

Szczepionka według niniejszego wynalazku w korzystnej formie może zawierać również adiuwant. Ogólnie, adiuwanty obejmują substancje, które wzmagają odpowiedź odpornościową gospodarza w nieswoisty sposób. Jest znanych wiele różnych adiuwantów Przykładami adiuwantów są kompletny i niekompletny adiuwant Freunda, witamina E, niejonowe polimery blokowe, muramylodipeptydy, Quill A® (saponina, Superfos Biosector, Dania), olej mineralny, na przykład Bayol® (olej mineralny, Exxon, Houston, USA) lub Marko® (olej mineralny, Esso, Haga, Holandia), olej roślinny i Carbopol® (karbomer, Goodrich, Brecksville, USA), (homopolimer) lub Diluvac® Forte (witamina E, Intervet, Broxmeer, Holandia). Szczepionka może również obejmować tak zwany „nośnik”. Nośnik jest związkiem, do którego przylega polipeptyd, bez kowalencyjnego wiązania są z nim. Często używanymi związkami nośnikowymi są na przykład wodorotlenek, fosforan lub tlenek glinu, krzemionka, kaolin i bentonit.

Specjalna forma takiego nośnika, w którym antygen jest częściowo osadzony w nośniku, jest tak zwany ISCOM (kompleks pobudzający odporność) (EP 109.942, Ep 180.564 EP 242.380).

Dodatkowo, szczepionka może zawierać jeden lub więcej odpowiedników powierzchniowo-aktywnych związków lub emulgatorów, na przykład Span ® (ester kwasu tłuszczowego i sorbitanu, ICI, Wilmington, USA) lub Tween® (ester kwasu tłuszczowego i polioksoetylenosorbitanu, ICI, Wilmington, USA).

Często szczepionka jest związana ze stabilizatorami, na przykład w celu ochrony przed degradacją podatnych na nią polipeptydów, w celu wydłużenia trwałości szczepionki lub podniesienia skuteczności liofilizacji. Pożytecznymi stabilizatorami są między innymi SpGA (ośrodek do liofilizacji zawierający sacharozę, fosforan, glutaminian i albuminę, Intervet, Boxmeer, Holandia) (Bovamik i wsp.; J. Bacteriology 59: 509 (1950)), węglowodany, na przykład sorbitol, mannitol, trehaloza, skrobia, sacharoza, dekstran lub glukoza, białka takie jak,

177 219 albumina lub kazeina lub produkty ich degradacji oraz bufory takie jak, fosforany metali alkalicznych. Dodatkowo szczepionka może być zawieszona w fizjologicznie dopuszczalnym rozpuszczalniku.

W innym przykładzie, w celu uzyskania biernej odporności używa się przeciwciał nieswoiście reagujących z polipeptydem niniejszego wynalazku lub ich części wiążących się z antygenem. Przeciwciała monospecyficzne są przeciwciałami, które są zdolne do swoistego reagowania z polipeptydem 54 000 wg. niniejszego wynalazku lub z jego częścią, bez swoistego reagowania z innymi antygenami Streptococcus suis.

Przeciwciał przeciw czynnikom chorobotwórczym można z powodzeniem używać do biernej immunizacji. Zaletą tego rodzaju leczenia jest, że przeciwciała są dostępne do zastosowania w momencie pojawienia się zakażenia. W tym momencie nie traci się czasu na czekanie, aż układ odpornościowy gospodarza zostanie pobudzony i wytworzy dostatecznie wysoki poziom obrony. Szczególnie w przypadku zakażenia, do którego właśnie doszło i kiedy choroba postępuje, natychmiastowe zastosowanie przeciwciał leczy zwierzęta z czynnika zakaźnego i trucizn wytwarzanych przez ten czynnik. Szczepionka zdolna do ochrony świń przed chorobą po zakażeniu Streptococcus suis na bazie przeciwciał przeciw hemolitycznemu polipeptydowi z S. suis, również jest włączona do niniejszego wynalazku.

Szczepionkę zdolną ochronić zwierzęta przed zakażeniem Streptococcus suis zawierającą opisany wyżej polipeptyd można wytworzyć przez zmieszanie polipeptydu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, adiuwantem lub rozpuszczalnikiem.

Przykład I

Szczepy bakterii

Szczepów Pl/7 i 688/9 S. suis typu 2 dostarczył dr T. Alexander, Uniwersytet w Cambridge, Wielka Brytania. Szczepy 4005, D282, 392/, 3977, 3889 i T/5 typu 2 otrzymano od dr U. Vecht, CD1-DLO, Lelystad, Holandia. Szczepów /068/, /0727 i /439/ typu 7 dostarczył dr B. Nielsen, Intervet Scandinavia, Kopenhaga, Dania. Referencje do szczepów /-22 otrzymano od dr Henrichsena, Statens Serum Institute, Kopenhaga, Dania. Szczep B /0 o serotypie /, ostatnio wyizolowany w terenie, otrzymano z .,Gezondheidsdient voor dieren, OostNederland” w Deventer, Holandia. Szczepy NV92/09 o serotypie 8, 22089KM o serotypie 9 i 22089/GV o serotypie /4 są ostatnimi izolatami terenowymi, pochodzącymi od chorych świń.

Hodowle bakterii

Szczepy bakterii wyszczepiano na agar zawierający krew owcy i hodowano przez 24 godziny w 37°C. W celu określenia produkcji hemolizyny w poszczególnych partiach hodowli, paroma koloniami zaszczepiano /00 ml bulionu Todd Hewitt (Difco) i hodowano w 37°C do końca logarytmicznej fazy wzrostu (zwykle przez 5-6 godzin). Następnie komórki usuwano przez wirowanie /0 000 x g przez /0 minut i nadsącz przechowywano w -20°C do użycia.

Test inhibicji hemolizyny

W celu ustalenia miana inhibicji hemolizyny przez surowicę, przygotowano serię dwukrotnych rozcieńczeń (75 pl) testowanych surowic na płytkach z głębokimi dołkami używając jako rozpuszczalnika roztworu soli zbuforowanego /0 mM Tris o pH 7,4. Następnie do każdego dołka dodawano po 75 pl roztworu hemolizyny zawierającego 2⁵ jednostek hemolitycznych. Po inkubacji w 20°C przez /0 minut dodawano do każdego dołka po /50 pl 2% (przemytej) zawiesiny końskich erytrocytów i test przeprowadzano jak opisano wyżej w przypadku miareczkowania aktywności hemolitycznej. Miano zdefiniowano jako najwyzsze rozcieńczenie powodujące minimalnie 50% inhibicji hemolizy. Pojemność swoistej surowicy świni P399 w stosunku do oczyszczonej hemolizyny (pochodzącej z typu 2 S. suis) testowano pod względem aktywności hamującej hemolizynę, (wytwarzaną przez różne (serotypowo) szczepy) w pojedynczych dołkach, używając 75 pl uprzednio rozcieńczonej w stosunku /:/28 surowicy P399 i 75 pl nierozcieńczonych nadsączy z hodowli różnych szczepów. Test przeprowadzano jak opisano wyżej. Preimmunizowanej surowicy, również uprzednio rozcieńczonej w stosunku /:/28, używano jako kontroli ( maksymalna hemoliza). Neutralizacja krzyzowa była widoczna, jeżeli surowica P399 hamowała hemolizę w stopniu większym niz 50% w porównaniu z preimmunizowaną surowicą. Próbki z mianem hemolizyny <2⁴ nie dawały wy8

177 219 ników w tym teście, ponieważ maksymalna hemoliza (surowica preimmunizowana) nie osiągała dwukrotnej wielkości tła (surowica P399)

Przykład II

Oczyszczenie hemolizyny

250 ml całonocnej hodowli szczepu P1/5 hodowano w warunkach beztlenowych przez 6 godzin w 12 litrach bulionu Todd Hewitt w 37°C, po czym komórki usuwano przez ciągłe wirowanie przepływowe. Nadsącz z hodowli oziębiano do 4°C, przepuszczano przez filtr 0,8 pm i następnie zagęszczano do 150 ml na filtrze PTCG 10 000 NMWL. Po przesączeniu przez 0,2 pm filtr, porcje po 1,0 ml poddawano filtracji na kolumnie Superose-12 (FPLC, Pharmacia) i wymywano 40 mM roztworem soli zbuforowanym fosforanami o pH 7,2, zawierającym 0,5 M NaCl. Zbierano 0,5 ml frakcje i analizowano za pomocą rozdziału elektroforetycznego w zelu SDS-PAGE, przenoszono na filtr i przeprowadzano test oznaczania hemolizyny. Szczyt aktywności hemolitycznej wymywano we frakcjach 35-45 (Fig. 2).

Analiza różnych frakcji z kolumny w żelu SDS-PAGE i na immunoblotach pokazała, ze aktywność hemolityczna migrowała razem z pojedynczym antygenem w obszarze odpowiadającym 54 000 (Fig. 3). Łączono frakcje 35-45 o aktywności hemolitycznej i niewielkie zanieczyszczenia usuwano przez selektywne wytrącanie 50% (NHą)2 SO4 w 4°C przez 3 godziny. Po wirowaniu osad zawieszano w 20 ml zbuforowanego fosforanami roztworu soli o pH 7,2. Końcowy preparat pojawia się jako pojedynczy rodzaj polipeptydu w obszarze odpowiadającym 54 000 w zelu SDS-PAGE po barwieniu błękitem Coomasiego (Fig. 1) i posiadał swoistą aktywność równą około 0,7 x 10⁶ jednostek hemolitycznych/mg po redukcji β-merkaptoetanolem.

Określenie białka

Stężenie białka mierzono metodą Lowry’ego i wsp. (Lowry i wsp.; J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)), używając albuminy z surowicy wołowej jako standardu.

Elektroforeza w żelach SDS-PAGE i metoda immunoblotów Westerna

9% płytkowe żele SDS-PAGE i przygotowanie próbek wykonywano ściśle według opisu Laemmliego (Laemmli, Wielka Brytania; Nature 227: 680-685 (1970)). Po rozdziale elektroforetycznym polipeptydy barwiono błękitem Coomasiego R250 lub próbki przenoszono za pomocą energii elektrycznej na filtr Immobilon PVDF. Jako sondy do filtrów używano poliklonalnej surowicy królika R2089 lub poliklonalnej surowicy mysiej M189 (patrz rozdział surowica przeciw hemolizynie). Po odpłukaniu, związane przeciwciała uwidaczniano używając peroksydazy chrzanowej sprzężonej odpowiednio z surowicą kozy przeciw królikowi lub surowicą kozy przeciw myszy oraz dwuaminobenzydyny jako substratu.

Aktywność hemolityczna po różnym traktowaniu

W przypadku wszystkich traktowań używano porcji po 0,5 ml oczyszczonej hemolizyny w 40 mM roztworze soli zbuforowanym fosforanami o pH 7,2, które miały miano 2⁷.

Wpływ różnej temperatury mierzono w teście oznaczania hemolizyny po inkubacji hemolizyny w odpowiednich temperaturach, to znaczy -20°C, 4°C, 20°C, 37°C i 100°C. W celu sprawdzenia wpływu traktowania proteinazą-K, 5 μl stężonego roztworu enzymu (2 mg/ml) dodawano do 0,5 ml roztworu hemolizyny i inkubowano przez 10 minut w 20°C. Następnie każdą pozostałą aktywność hemolityczną mierzono w oznaczeniu aktywności hemolizyny.

W celu sprawdzenia wpływu redukcji β-merkaptoetanolem 5 pl 10% (objętościowoobjętościowy) roztworu β-merkaptoetanolu dodawano do 0,5 ml roztworu hemolizyny i inkubowano przez 10 minut w 20°C. a następnie aktywność mierzono w teście oznaczania hemolizyny.

W celu sprawdzenia wpływu utleniania H2O2 5 pl 10% roztworu H2O2 dodawano do roztworu hemolizyny i inkubowano przez 10 minut w 20°C. Następnie każdą pozostałą aktywność mierzono w teście oznaczania hemolizyny.

Wpływ alkilacji każdej z grup tiolowych za pomocą TLCK (chlorometyloketon N-A-ptosylo-L-lizyny, Sigma) określano przez dodanie 5 pl 10% (wagowo-objętościowy) roztworu TLCK do 0,5 ml roztworu hemolizyny i inkubację przez 10 minut w 20°C. Następnie każdą pozostałą aktywność mierzono w teście oznaczania hemolizyny.

177 219

Wpływ cholesterolu oznaczano przez dodanie 10 μ) 5% cholesterolu (w 10% etanolu) do 0,5 ml roztworu hemolizyny. następnie inkubowano w 20°C przez 10 minut, po czym każdą pozostałą aktywność mierzono w teście oznaczania hemolizyny. Odwracalność redukcji po niektórych traktowaniach sprawdzano przez dodanie nadmiaru β-merkaptoetanolu (2% stężenie końcowe) do części mieszanin reakcyjnych, następnie inkubację w 20°C przez 10 minut i miareczkowanie aktywności hemolitycznej.

Wpływy różnych traktowań na aktywność hemolityczną pokazano w tabeli 1. Wyniki pokazują, ze hemolizyna jest wrażliwa na ciepło, trawienie proteinazą-K, utlenianie H2O2 i alkilację przez TLCK. Ponadto, aktywność hemolityczną jest hamowana przez cholesterol. Po inkubacji z β-merkaptoetanolem stwierdzono wzrost aktywności i dodanie nadmiaru βmerkaptoetanolu do preparatu utlenionego H2O2 powodowało odzyskanie aktywności hemolitycznej. Dodanie nadmiaru β-merkaptoetanolu do preparatu potraktowanego TLCK powodowało częściowe odzyskanie aktywności hemolitycznej. To częściowe odzyskanie aktywności można by wyjaśnić obecnością utlenionych grup tiolowych, które nie reagują z TLCK. Działania temperatury i cholesterolu nie mogłyby być odwrócone przez dodanie β-merkaptoetanolu.

Na powtórzone próbki, w których pominięto odpowiednie odczynniki lub, w których pominięto hemolizynę, nie działały odpowiednie metody oznaczania aktywności hemolitycznej albo (odpowiednio) odczynniki z testu z erytrocytami.

Wrażliwość erytrocytów, pochodzących z różnych gatunków, na hemolizynę

Wrażliwość erytrocytów, pochodzących z różnych gatunków, to znaczy od człowieka, krowy, indyka, gołębia, myszy, kury, świnki morskiej, królika, kota, psa i świni, testowano używając zredukowanego (0,1% β-merraptoetanolem) preparatu hemolizyny o mianie 2⁸. Oznaczenia przeprowadzano jak opisano niżej w: „Miareczkowaniu aktywności hemolitycznej”. Wszystkie erytrocyty wykazywały mniej więcej taką samą wrażliwość na hemolizynę. Miana różniły się od 2⁷ (mysz, kot i indyk) do 2¹⁰ (człowiek).

Sekwencja aminokwasowa na N-końcu

Sekwencję pierwszych 16 reszt aminokwasowych oczyszczonej hemolizyny, otrzymanej ze szczepu P1/7, określono za pomocą automatycznej degradacji Edmana i podano w SeQ ID NO:1;.

Przewaga cząsteczek hemolizyny w różnych szczepach S. suis

Wszystkie dostępne szczepy, obejmujące szczepy o serotypach 1-22. hodowano w bulionie Todd Hewitt do końca logarytmicznej fazy wzrostu (5-6 godzin), następnie komórki usuwano przez wirowanie. Obecność cząsteczek hemolizyny w nadsączu z hodowli określano w teście oznaczania aktywności hemolizyny i za pomocą immunoblottingu. Wiele, lecz nie wszystkie, szczepy wykazywały produkcję różnych ilości aktywności hemolitocznej w nadsączach komórkowych (tabela 2).

Okazało się, ze wszystkie hemolityczne próbki, włącznie z próbkami o niskiej aktywności, są hamowane przez cholesterol i H2O2. Ponadto, dodanie nadmiaru β-merkaptoetanolu do preparatów utlenionych H2O2 powoduje całkowite odzyskanie aktywności hemolitycznej. Podsumowując, wiele sprawdzanych szczepów wydaje się wytwarzać aktywność hemolityczną w nadsączach z hodowli, która biochemicznie i immunologicznie odpowiada hemolizynie i nie ma żadnych przesłanek, że znaleziono inne, nieoporrewnione hemolizyny.

Przykład III

Szczepionki

Ze szczepu P1/7 przygotowano cztery szczepionki oparte na oczyszczonej hemolizynie, zagęszczonym nadsączu z hodowli lub frakcji 19-31, zebranych z kolumny euperose-12 oraz szczepionkę placebo.

Dla porównania wykonano szczepionkę opartą na oczyszczonym EF (czynnik zewnątrzkomórkowy, Vecht i in., Inf. Immun. 59: 3156-3162 (1991); Inf. Immun. 60: 550-556 (1992). Jedną szczepionkę przygotowano ze szczepu B10 w oparciu o zagęszczony nadsącz z hodowli.

177 219

Szczepionki przygotowano jak następuje:

Oczyszczoną hemolizynę (40 pg białka/ml) mieszano w stosunku 1:1 z adiuwantem Diluvac Forte® dopóki nie otrzymano jednorodnej mikroemulsji. Szczepionkę tę nazwano VAC-SLY.

W przypadku szczepionki zawierającej zagęszczony nadsącz z hodowli, część koncentratu z PTCG (filtr z polieterosulfonu, ciężar cząsteczkowy odcięcia 10000; Millipore, Bedford, USA) (1,9 mg bialka/ml) mieszano z adiuwantem Diluvac Forte® dopóki nie otrzymano jednorodnej zawiesiny. Szczepionkę tę nazwano VAC-CCS.

Trzecią szczepionkę przygotowano przez mieszanie (1:1) połączonych i zagęszczonych frakcji 19-31 z kolumny Superose-12 (zawierających 2 mg białka/ml) z adiuwantem Diluvac Forte® dopóki nie otrzymano jednorodnej zawiesiny. Frakcje 19-31 zawierały najwięcej wydzielanych na zewnątrz komórki białek, wytwarzanych przez szczep S. suis P1/7, lecz były zasadniczo wolne od hemolizyny. Szczepionkę tę nazwano VAC-SCF.

Czwartą szczepionkę przygotowano przez przepuszczenie nadsączu z hodowli przez 0,2 μ filtr, następnie przez strącanie nasyconym w 60% (NH^SO^i przez 16 godzin w 0°C. Po odwirowaniu osad zawieszano w PBS (roztwór fizjologiczny soli buforowany fosforanem) do otrzymania preparatu, który jest 100 razy zatężony w stosunku do nadsączu z hodowli.

Szczepionkę placebo przygotowano jak opisano wyżej, z tym, że roztwór antygenu zastąpiono 40 mM roztworem soli zbuforowanym fosforanami o pH 7,2.

Szczepu B10 użyto do przygotowania szczepionki opartej o strącanie nasyconym w 60% (NH^hSOi przez 16 godzin w 0°C jak opisano wyżej.

Szczepionkę EF otrzymano po chromatografii hydrofobowej (szybkoprzepływowa kolumna Phenyl Sepharose, z dużą liczbą podstawników) nadsączu z hodowli szczepu P1/7, używając zstępującego gradientu (NH4ESO4. Ostatecznie oczyszczony preparat EF (po dializie i rozcieńczeniu) zawierał około 150 pg EF/ml. Na podstawie rozdziału elektroforetycznego w zelu SDS-PAGE i barwienia błękitem Coomasiego określono, że czystość preparatu jest >95%.

Surowica przeciw hemolizyme

Swoistą poliklonalną surowicę świni (P399) do oczyszczania hemolizyny otrzymano jak następuje. 4-tygodniowe świnie immunizowano domięśniowo (zastrzyk w szyję) 2 ml szczepionki VAC-SLY. Za dwa tygodnie po pierwszej immunizacji reakcję świń wzmacniano używając tej samej (ilości) szczepionki i tego samego sposobu podania. Po upływie dwóch tygodni od podania dawki wzmacniającej świnie skrwawiano i surowicę przechowywano w -20°C do użycia.

Test ochrony myszy

Czterotygodniowe myszy Balb-C podzielono na cztery grupy i zaszczepiono podskórnie 0,5 ml VAC-CCS, VAC-SCF, VAC-SLY lub szczepionką placebo. Za dwa tygodnie po pierwszej immunizacji reakcję myszy wzmacniano używając tych samych szczepionek i tego samego sposobu podania. Po upływie dwóch tygodni od podania dawki wzmacniającej myszy prowokowano przez dootrzewnowe podanie 0,5 ml 6-godzinnej hodowli szczepu P1/7 w bulionie Todd Hewitt, zawierającej 4 x 10⁹ komórek/ml. Po prowokacji badano śmiertelność w ciągu 7 dni.

Wyniki

Po prowokacji, myszy zaszczepione szczepionką placebo padały w ciągu 3 dni, podczas gdy myszy, którym podano szczepionki VAC-CCS i VAC-SLY okazały się w zupełności chronione (tabela 3). VAC-SCF dawała tylko częściową ochronę. Szczepionka ta zawierała większość wydzielanych na zewnątrz komórki antygenów szczepu P1/7, lecz była zasadniczo wolna od hemolizyny.

Wnioski

Zatem wyciągnięto wniosek, ze szczepionka, zawierająca oczyszczoną hemolizynę według niniejszego wynalazku pełni rolę ochronną u myszy, co wskazuje, ze hemolizyna jest czynnikiem zjadliwym i ze neutralizacja tego pojedynczego zjadliwego czynnika wystarczy do ochrony myszy przed szkodami, powodowanymi przez zakażenie S. suis typu 2.

177 219

Doświadczenie, dotyczące różnych sposobów ochrony myszy

Zwierzęta doświadczalne

Używano Myszy BALB/c (w wieku 4 tygodni) otrzymanych od Iffa Credo.

Układ doświadczalny

Grupę 30 myszy (2 x 15) szczepiono raz podskórnie 0,4 ml odpowiednich szczepionek lub zostawiano niezaszczepione (jedna grupa 30 myszy) jak pokazano w tabeli 6. Po czterech tygodniach po szczepieniu połowę myszy z każdej grupy prowokowano przez dootrzewnowe podanie 0,5 ml sześciogodzinnej hodowli szczepu B10 (typ 1) i drugąpołowę szczepem P1/7 (typ 2).

Przez 7 dni obserwowano śmiertelność. Szczep B10 jest mniej chorobotwórczy dla myszy (około 20% śmiertelność) w porównaniu ze szczepem P1/7 (100% śmiertelność). Zatem wśród grupy myszy zarażonych B10 rejestrowano również liczbę chorych myszy. Bezpośrednio przed prowokacją pobierano próbki krwi i łączono grupy surowic do testowania za pomocą immunoblotów.

Wyniki

W teście oznaczania hemolizyny nadsącz ze szczepu B10 (serotyp 1) wykazywał aktywność hemolityczną 2^9?, podczas gdy nadsącz ze szczepu P1/7 (serotyp 2) wykazywał aktywność 2' . Ten szczep B10 wytwarzał około 5x więcej aktywności hemolizyny w porównaniu ze szczepem P1/7.

Na podstawie rozdziału elektroforetycznego w żelu SDS-PAGE i barwienia błękitem Coomasiego okazało się, ze oba zatężone nadsącze z hodowli szczepów B10 i P1/7 zawierają białko 54 000 (SLY) i że zatężony nadsącz z hodowli szczepu B10 zawiera więcej białka 54 000, co pozostaje w zgodzie z jego większą aktywnością..

Oczyszczony EF nie zawiera białka 54 000. Po zakażeniu okazało się, że szczepionki zawierąjące nadsącz wywołują zarówno homologiczną jak i niehomologiczną ochronę u myszy (patrz tabela 6).

Kiedy sprawdzano połączone surowice za pomocą immunoblotów używając nadsączu z hodowli szczepu P1/7 lub B10 jako antygenu, okazało się, że obie szczepionki, złożone z nadsączu hodowli wywoływały powstawanie przeciw SLY (tabela 6). Reakcja na przeciwciała przeciw nadsączowi z hodowli B10 była silniejsza niż reakcja na przeciwciała przeciw nadsączowi z hodowli P1/7. Gdy sprawdzono za pomocą immunoblotów układ heterologiczny (przeciwciała przeciw nadsączowi z hodowli B10 przeciwko nadsączowi z hodowli P1/7 i przeciwciała przeciw nadsączowi z hodowli P1/7 przeciwko nadsączowi z hodowli B10), okazało się, ze antygen 54 000 jest w większości lub jest jedynym reagującym antygenem.

Okazało się, że myszy szczepione oczyszczonym EF, chociaż podano go w wysokich dawkach, nie są chronione przed homologiczną lub heterologiczną prowokacją, chociaż wytwarzają przeciwciała (tabela 6).

Wnioski

Obie szczepionki zawierające nadsącz z hodowli wywołują zarówno homologiczną, jak i heterologiczną ochronę u myszy. Fakt, że antygen 54 000 jest jedynym lub głównym reagującym antygenem w immunoblotach, kiedy jest sprawdzany heterologicznie, jasno pokazuje, że SLY jest krzyzowo chroniącym czynnikiem dla myszy.

Doświadczenie, dotyczące ochrony świń

VAC-SLY, VAC-SCF i PLACEBO przygotowano jak opisano wyżej. VAC-SLY zawierała 20 pg/ml oczyszczonej hemolizyny w adiuwancie Diluvac Forte®. VAC-SCF (2 mg białka/ml) zawierał większość wydzielanych na zewnątrz białek Streptococcus suis w adiuwancie Diluvac Forte®, lecz był zasadniczo wolny od hemolizyny.

Czterotygodniowe świnie podzielono na 3 grupy po 3 świnie i szczepiono (domięśniowo w szyję) 2 ml VAC-SLY, VAC-SCF lub PLACEBO. Po dwóch tygodniach po pierwszej immunizacji reakcję świń wzmacniano używając tej samej szczepionki i sposobu szczepienia. Dwa tygodnie po wzmocnieniu świniom podawano prowokacyjną dawkę dożylną 0,5 ml 6godzinnej hodowli szczepu P1/7 w bulionie Todd Hewitt, zawierającym 4 x 10⁹ jednostek tworzących kolonie CFU/ml. Bezpośrednio przed immunizacją i prowokacją pobierano próby krwi i surowicę przechowywano w -20°C do użycia.

177 219

Ponowna izolacja bakterii

Podczas sekcji padłych zwierząt wycinki pobierano z mózgu, płuc i kości stępu, jeśli to możliwe z najbardziej dotkniętego obszaru. Wzrost bakterii określano jako 0, /, 2, 3, 4 w zależności od rozmiaru, jaki osiągał.

Wyniki

Po prowokacji u świń zaszczepionych PLACEBO rozwinęły się ostre objawy kliniczne, charakteryzujące się powłóczeniem nogami, obejmującym kilka stawów, złym wyglądem i wysoką temperaturą. Dwie z trzech szczepionych PLACEBO świń miało objawy neurologiczne i było tak silnie dotkniętych chorobą, że poddano je eutanazji. Świnie zaszczepione VAC-SCF wykazywały te same objawy kliniczne jak kontrolne, lecz w mniejszym stopniu. Jedna ze świń tej grupy wykazywała objawy neurologiczne i poddano ją eutanazji. Najmniej dotknięte chorobą były świnie zaszczepione VAC-SLY. Świnie z tej grupy wykazywały tylko lekkie objawy, które zanikały szybciej w porównaniu z dwoma innymi grupami. Wyniki kliniczne podsumowano w tabeli 4. Na sekcjach świnie szczepione PLACEBO wykazywały ciężki poliartretyzm w większości stawów (tabela 5). Świnie szczepione VAC-SCF miały również poliartretyzm, ale o mniejszym zasięgu, podczas gdy stawy świń szczepionych VAC-SLY wyglądały normalnie (tabela 5).

Streptococcus suis wyizolowano w różnych ilościach i z różnych tkanek z dwóch spośród 3 świń zaszczepionych PLACEBO i ze wszystkich 3 świń zaszczepionych VAC-SCF, lecz nie ze świń szczepionych VAC-SLY (liczby poniżej „całkowitej liczby punktów reizolacji” reprezentują względną ilość bakterii, wyizolowaną z całkowitej liczby zwierząt w każdej grupie) (tabela 5).

Histologiczne badanie próbek z mózgu (tabela 5) wykazało zapalenie opon mózgowych u dwóch świń szczepionych VAC-SCF i u dwóch świń szczepionych PLACEBO.

Wnioski

Chociaż świnie szczepione VAC-SLY wykazywały kliniczne objawy w ciągu kilku dni. objawy te były znacznie mniej ciężkie i krócej trwały w porównaniu z objawami u świń szczepionych VAC-SCF i PLACEBO. Na sekcji artretyzm włóknikowy był mniej ciężki i rzadziej obserwowany u świń szczepionych VAC-SLY w porównaniu ze świniami szczepionymi VACSCF lub PLACEBO. Dodatkowo dwie świnie szczepione SCF i dwie świnie szczepione PLACEBO chorowały na zapalenie opon mózgowych, podczas gdy nie chorowała na to żadna ze świń zaszczepionych VAC-SLY. Ponadto, płuca, stawy i mózgi świń szczepionych VACSLY okazały się sterylne, podczas gdy z większości tych organów dwóch innych grup reizolowano Streptococcus suis typu 2. W immunoblotach surowice świń szczepionych VAC-SLY (pobrane w dniu prowokacji) reagowały z antygenem w pojedynczym prążku wielkości 54 000, w całym nadsączu z hodowli, co potwierdzało, że hemolizyna jest immunogenna i że jej preparat jest dobrze oczyszczony.

Wyniki wskazują na to, ze hemolizyna Streptococcus suis jest ważnym czynnikiem i ze neutralizacja tego jednego czynnika wy starczy do ochrony świń w sposób znaczący przed szkodliwymi skutkami zakażenia Streptococcus suis i do usunięcia bakterii z różnych organów i tkanek.

Tabela 1

Aktywność oczyszczonej hemolizyny po różnym traktowaniu

Traktowanie	Czas traktowania	2 log miana hemolizyny	2 log miana hemolizyny po dodaniu 2% β-merkaptoetanolu
/	2	3	4
-20°C	7 dm	7	ND
4°C	7 dni	6	ND
20°C	7 dni	3	ND
37°C	7 dni	0	0

177 219 cd tabeli I

1	2	3	4
100°C	5 min	0	0
20°C	10 min.	7	ND
proteinaza-K (20 pg/ml)	10 min , 20°C	0	ND
β-merkaptoetanol (0,1%)	10 min., 20°C	0	ND
H2O (0,1%)	10 min, 20°C	0	12
TLCK (0,1%)	10 min., 20°C	2	6
Cholesterol (0,1%)	10 min., 20°C	0	0

ND' = nieokreślony

Tabela 2

Rozpowszechnienie cząsteczek podobnych do hemolizyny w nadsączach z hodowli różnych szczepów S suis.

- szczep, 2 - serotyp; 3 - szczep odniesienia (R), 4 - fenotyp^a, 5 - 2log miana hemolizyny^b, 6 - inhibicja hemolizyny przez 0,1% cholesterol; 7 - odwracalna maktywacja przez utlemanie/redukcjęb, 8 - inhibicja hemolizyny przez surowicę P399b; 9 - obecność białka 54 kD w immunoblocie b

1	2	3	4	5	6	7	8	9
S428	1	R		5	+		+-
RS 2651	1/2	R		6	+	+	+	-
R735	2	R	MRFEF	5	+	+	+
P1/7	2		MRP^TER-	8	+	+		4-
688/9	2		MRP'EF'	6	+	+-	4-	*
4005	2		MRP’EF	5	-f-	+	-i-
D282	2		mrp⁴ef-	7	+	+	fi-	_L
3921	2		MRP+EF	4	+	T	p	-
3977	2		MRP'EF	2	+-		#	-
3889	2		MRPEF	6	+	+	+
T-15	2		MRP'EF	6	+-	+	+	-U
4961	3	R		0	ND^d	ND	MD	ND
6407	4	R		4	+	+	4-	-
11538	5	R		4	+	+-	#	-
2524	6	R		2	+	+	#	-
8074	7	R		0	ND	ND	ND	-
10681	7			0	ND	MD	ND	-
10727	7			0	ND	ND	ND	-

177 219 cd tabeli 2

1	2	3	4	5	6	7	8	9
14391	7			2	ND	ND	ND	-
14636	8	R		5	+	+	4-	-
NV92109	8			3	+	+	#	-
22083	9	R		0	ND	ND	ND	-
220891 KM	9					4-	#	-
4417	10	R		2	T	—	#	—
12814	11	R		2	T	+	#	-
8830	12	R		0	ND	ND	ND	-
10581	13	R		2	-t-	-t-		-
13730	14			6	—	4-	—	-
220891GV	14			6	-	—
T639	15	R		6	-f-	-H	—	—
2726	16	R		0	ND	ND	ND	-
93A	17	R		4	—	-	—	-
NT77	18	R		6	—	-	—
42A	19	R		3	T	—
865192	20	R		0	ND	ND	ND	-
14A	21	R		0	ND	ND	ND	-
88/1861	22	R		2	4-	—	#	-

a Dla szczepów typu 2 przedstawiono fenotypy opisane przez Vecht i wsp (26 27) ^b Miareczkowanie aktywności hemolitycznej. inhibicię aktywności hemolitycznej przez 0,1% cholesterol odwracanie inaktywacji hemolitycznej przez inkubację z H2O2 i β-merkaptoetanolem. inhibicję aktywności hemolitycznej przez swoistą surowicę świni P399 oraz inimunoblotting wykonywano zgodnie z opisem zamieszczonym w materiałach i metodach ^c# =test przeprowadzono, lecz nie otrzymano wyników z powodu zbyt niskiej aktywności hemolitycznei,

ND = nieokreślony

Tabela 3

Wpływ immunizacji różnymi szczepionkami na przeżywalność myszy prowokowanych dootrzewnowo szczepem P1/7 S. suis

Szczepionka	Przeżywalność
VAC-CCS^a	9/9
VAC-SCF^b	6/10
VAC-SLYc	10/10
PLACEBO	0/10

’ szczepionka zawierająca zatężony nadsącz z hodowli b szczepionka zawierająca trakcie 19-31 z kolumny wypełnionej Superose c szczepionka zawierająca oczyszczoną suilizynę

177 219

Tabela 4

Tabela podsumowująca, pokazująca sumę punktowych ocen klinicznych w dniu prowokacji i I - 7 dni po prowokacji

Szczepionka	Punktowa ocena kliniczna po dniu prowokacji
0	1’	2^a	₃a	4’	5	6	7	suma
VAC-SLY	0	3,7	3	1,7	0,8	0,3	0,3	0,3	10,2
VAC-SCF	0	4,7	4,2	5,5	5,5	5	4,7	4,7	34,3
PLACEBO	0	5,7	5,8	6	7,8	7,7	7,3	7,7	48

a’ Punkty w dniach 1 - 4 dotyczą dwóch badań - przed i po południu

Tabela 5

Tabela podsumowująca, pokazująca objawy kliniczne w dniu sekcji, makroskopowe obserwacje sekcji, dane dotyczące reizolacji i liczbę przypadków zapalenia opon mózgowych

Szczepionka	Sekcja po dniu prowokacji	Artretyzm oceniony w punktach	Reizolacja oceniona w punktach	Zapalenie opon mózgowych
VAC-SLY	7	3,5	0	0
VAC-SCF	7	8	7	2
PLACEBO	4	12	9	2

Grupy po 15 myszy szczepiono raz podskórnie 0,4 ml różnych szczepionek w adiuwancie GNE (emulsja zespołu Gumboro Newcastle Eggdrop, Intervet. Boxmeer, Holandia). Cztery tygodnie po zaszczepieniu myszy poddawano prowokacji, podając im dootrzewnowo 0,5 ml 6godzinnej hodowli szczepu P1/7 lub szczepu B10, zawierającej 3 x 109 bakterii/ml. Bezpośrednio przed prowokacją pobierano próby krwi i połączone grupy surowic sprawdzano na immunoblotach pod względem obecności przeciwciał anty-SLY lub anty-EF, używając jako antygenu nadsączu z hodowli szczepu P1/7 lub B10.

Objaśnienia do figur

Figura 1: Rozdział elektroforetyczny w żelu SDS-PAGE wzorców o małej masie cząsteczkowej (ścieżka A), zagęszczony nadsącz z hodowli (ścieżka B), oczyszczona hemolizyna ze Streptococcus suis (ścieżka C) i wzorce o dużej masie cząsteczkowej.

Figura 2: Profil emulsyjny chromatografii w Superose-12 zatężonego nadsączu z hodowli szczepu P1/7 S. suis typu 2. Linia ciągła; absorpcja przy 280 nm, linia przerywana; miano hemolizyny.

Figura 3: Biot Westerna białek wzorcowych (ścieżka A), zatężony nadsącz z hodowli szczepu P1/7 (ścieżka B), frakcje z kolumny z Superose-12 (ścieżki C-N). Ścieżka C: frakcja 15, ścieżka D: frakcja 18, ścieżka E: frakcja 20, ścieżka F: frakcja 23', ścieżka G: frakcja 26, ścieżka H: frakcja 28, ścieżka I: frakcja 30, ścieżka J: frakcja 32, ścieżka K: frakcja 34, ścieżka L: frakcja 36, ścieżka M: frakcja 38, ścieżka N: frakcja 40.

Białka wzorcowe (ścieżka A) barwiono błękitem Coomasiego. Antygeny S. suis (ścieżki B-N) badano za pomocą surowicy królika przy użyciu przeciwciała kozła przeciw królikowi sprzężonego z dwuaminobenzy dyną jako substratem. Masy molekularne białek wzorcowych podano po lewej stronie.

177 219

Tabela 6

Wyniki doświadczenia, dotyczącggo heterologicznej ochrony myszy

Obecnoś j anty-EF w połączonej grupij surow^y w immungblgeie określona za pomocą antygenu	Nadsącz B10	1	1	1
Nadsązz P1/7	1	+		1
Obecnoćć EF w szczepionce okreśLna za pomocą SDSPAGE i barwienia Cggmassiegg	1	+ +	+ + +	1
j Obecnoć, anty-SLY w połączonej grupie surowmy w immungblgeie okreś^n j za pom^ąą antygenu	Nadsązz B10 i	+ -t- +	+ +	1
Nadsącz P177	+ +	+	1	1
Obecnoćj SLL w szczepionce (rkreślona za pgιτlocą SDS PAGE i barwienia Cggmassiegg 1	+	-ł-	1	1
Wynikj po prowokac^ B10	Wskaźnika zachorowań 3 dma po prowokacji	co	o	r-	ΓΊ
Śmiertelność	—	o	-	CO
Wynikj po prowokacji P1/7 śmiertelność			•o·	MO
Szczepionka zawierająca	nadsązz B10	nadsącz P1/7	P1/7EF	kontrole

177 219

0.20

AuAziioui9q oudi^ o

o

O mu 082 ofDUDqjosqy e<?

<»F=J

177 219

Η I J K L Μ N

116 kD 97 kD kD kD

i ' i ng.<5

177 219

A B C D

200 kD

Ϊ

97	kD	Et			ęs2§$^ t <&$&&)&> ;	116 97
69	kD	ii	7 ' ąi . fi 5	' ' -	, 1	67
45	kD	Sf		•&SSiSK£&»		45

kD kD kD kD

Łaj_L U kD <.

/N I f* ^J ·>&

Z 1 KU

4 kD gj

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 70 egz Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Szczepionka do ochrony świń przed zakażeniem Streptococcus suis, znamienna tym, że zawiera jako substancję czynną izolowany i oczyszczony polipeptyd Streptococcus suis albo jego immunogenny fragment, który w natywnej postaci ma na N-końcu sekwencję aminokwasową Asp-Ser-Lys-Gln-Asp-lle-Asn-Gln-Tyr-Phe-Gln-Ser-Leu-Thr-Tyr-Glu, jest białkiem sekrecyjnym, ma masę cząsteczkową około 54000, może być aktywowany przez tiol, może być hamowany przez cholesterol i posiada aktywność hemolityczną, i. ewentualnie konwencjonalne substancje pomocnicze.
2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera izolowany i oczyszczony polipeptyd Streptococcus suis albo jego immunogenny fragment sprzężony z nośnikiem.
3. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że jako nośnik zawiera polisacharyd z otoczki.
4. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera adiuwant.
5. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera dodatkowy immunogen, pochodzący z chorobotwórczego wirusa świń lub mikroorganizmu.
6. Szczepionka według zastrz. 5, znamienna tym, ze zawiera immunogen wybrany z grupy obejmującej, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, wirus wścieklizny rzekomej (Pseudorabies virus), wirus grypy świń, Parvovirus, wirus zakaźnego nieżytu żołądka i jelit, rotawirus, Escherichia coli, Erysipelothirix rhusiopathiae, Pasteurella multocida i Bordetella bronchiseptica.