DE10239629A1

DE10239629A1 - Nicht-rekombinate Subunit-Vakzine gegen Streptococcus suis-Infektionen des Schweines

Info

Publication number: DE10239629A1
Application number: DE10239629A
Authority: DE
Inventors: Ralph Dr.med.vet. Goethe; Peter Prof. Dr.med.vet. Valentin-Weigand
Original assignee: IDT IMPFSTOFFWERK DESSAU TORNA; IDT IMPFSTOFFWERK DESSAU-TORNAU GmbH
Current assignee: IDT IMPFSTOFFWERK DESSAU TORNA; IDT IMPFSTOFFWERK DESSAU-TORNAU GmbH
Priority date: 2002-08-23
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2004-04-08
Also published as: AU2003266180A1; PL373595A1; WO2004020618A1; EP1534824A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine nichtrekombinante Subunit-Vakzine gegen Sc.suis-Infektionen des Schweines und ein Verfahren zu deren Herstellung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine nichtrekombinante Subunit-Vakzine gegen Sc.suis-Infektionen des Schweines und ein Verfahren zu deren Herstellung. Anwendungsbereich der Erfindung sind die pharmazeutische Industrie und die Veterinärmedizin.

Streptococccus (Sc.) suis ist ein wichtiger Infektionserreger beim Schwein, der Meningitiden, Polyarthritiden, Septikämien und respiratorische Erkrankungen hervorrufen kann. In seltenen Fällen kann er zu einer Zoonose beim Menschen führen. Die wichtigste Verbreitungsquelle stellen inapparente Keimträger dar. Der Nachweis des Erregers ist nicht gleichbedeutend mit einer vorliegenden Infektion. Dies ist begründet in seiner ausgeprägten Heterogenität, die Sc. suis bezüglich seiner Virulenz aufweist. Potentielle Virulenzfaktoren sind die Polysaccharidkapsel (Grundlage der Serotypisierung), das MRP (Muramidase Released Protein), der EF (Extrazellulärfaktor) und Hämolysine wie das Suilysin.

Das Hauptproblem bei der Bekämpfung von Sc.suis-Infektionen ist das Fehlen einer geeigneten Vakzine, die einen serotypübergreifenden Schutz erzeugt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es eine Vakzine zur Verfügung zu stellen, welches die genannten Nachteile des Standes der Technik überwindet.

Die Aufgabe wird gelöst durch das Protein AdiS mit der Aminosäuresequenz:

Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die wenigstens zu 90 % der Aminosäuresequenz des Proteins AdiS homolog ist.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist ferner auch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, wobei das Protein AdiS durch den folgenden Sequenzabschnitt kodiert ist:

Erfindungsgemäß bevorzugt ist ferner ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, wobei das Protein OCTS durch den folgenden Sequenzabschnitt kodiert ist:

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein ADS-Operon das die Regionen umfasst, welche die Proteine OCTS, AdiS und CKS kodiert mit folgender Nukleotidsequenz:

Erfindungsgemäß bevorzugt ist dabei ein Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz besitzt, die wenigstens zu 90 der Sequenz des erfindungsgemäßen ADS-Operons homolog ist.

Ein weitere Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins AdiS, wobei dieses durch Stressanzucht erhalten wird.

Dabei ist es erfindungsgemäß besonders bevorzugt, dass während der Anzucht ein Temperaturwechsel von 32 auf 42 °C und/ oder ein Wechsel von aeroben Bedingungen auf einen erhöhten CO₂-Partialdruck angewendet wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Nicht-rekombinante Subunit-Vakzine gegen Streptococcus suis-Infektionen beim Schwein, welche das erfindungsgemäße Protein AdiS und/oder das Protein OCTS und/oder ein erfindungsgemäßes homologes Protein umfasst.

Bevorzugt ist dabei eine Nicht-rekombinante Subunit-Vakzine welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie ein Adjuvanz und/oder andere Hilfs- und Trägerstoffe enthält.

Dabei ist es insbesondere bevorzugt, dass das Adjuvanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mineralöl und Aluminiumhydroxid.

Die Aufgabe wird durch die Identifizierung von Virulenzfaktoren, die zum einen serotypunabhängig und zum anderen immunogen sind, sowie deren Darstellung und Verwendung in einem Impfstoff gelöst. Dies hat den Vorteil, dass durch eine Impfung eine Immunisierung gegen in Europa gängige Serotypen von Sc. suis möglich wird und sich dadurch die Kosten eine Immunisierung erheblich senken lassen.

Überraschenderweise konnte die Induktion potenzieller „in vivo" Virulenzfaktoren durch habitattypische Signale „in vitro" ausgelöst werden. Dazu wurden "in vitro" induzierende Signale (Stress-Signale) eingesetzt, wie z.B. Temperaturschwankungen und verschiedene Sauerstoffspannungen, um habitatspezifische Bedingungen zu imitieren und dadurch induzierte Proteine zu identifizieren.

Zwei neuartige, durch Temperatur und CO₂ induzierte Proteine wurden in der die Murein-assoziierten Oberflächenkomponenten enthaltenden Protoplasten-Überstands-Fraktion von Sc.suis identifiziert.

Eines der Proteine, das OCTS, zeigte auf Protein- und DNA-Ebene eine hohe Homologie zu einer Ornithin-Carbamoyltransferase (OCT) von Sc. pyogenes. Das andere Protein, AdiS, zeigte eine ausgeprägte Homologie mit dem „Streptococcal Acid Glykoprotein" (SAGP) von Sc. pyogenes. SAGP ist eine Arginin-Deiminase (AD), die hemmend auf die Proliferation von Phagozyten wirkt und möglicherweise am intrazellulären Überleben der Streptokokken beteiligt ist.

Durch Northernblotanalysen konnte belegt werden, dass die für das OCTS und AdiS kodierenden Gene bei Sc. suis auf einem Operon lokalisiert sind. Darüber hinaus bestätigten die Northernblotanalysen die Regulation auf transkriptioneller Ebene.

Mit Hilfe von Southernblotanalysen konnte ein SAGP-Homolog bei 42 weiteren, den in Deutschland und Europa (ausser U.K.) am häufigsten auftretenden Serotypen 2 und 9 angehören Sc. suis-Stämmen nachgewiesen werden. An beispielhaft ausgewählten 8 Stämmen dieser 42 Stämme wurde das Protein auch im Westernblot nachgewiesen und eine entsprechende AD-Enzymaktiviät gezeigt.

Die Homologie des AdiS mit dem SAGP wurde ausserdem durch Westernblotanalysen unter Verwendung eines spezifischen Anti-SAGP-Antiserums nachgewiesen. Schliesslich zeigte sich in Westernblotanalysen mit Rekonvaleszenzseren von Sc.suis-infizierten Schweinen, dass beide Proteine Bestandteil einer durch Stressinduktion erzeugten Proteinfraktion sind, die im Schwein immunogen ist. Aus dieser Fraktion werden die Impfantigene gewonnen.

Die Proteine OCTS und AdiS wurden durch gewebe- bzw. krankheitstypische Stress-Signale induziert. Sie sind an der Oberfläche lokalisiert, treten unabhängig von der Zugehörigkeit zu den beiden mit Abstand wichtigsten Serotypen (2 und 9) in Europa bei allen getesteten Sc. suis-Stämmen auf und sind Bestandteil einer durch Stressinduktion erzeugten Proteinfraktion, die im Schwein immunogen ist. Weiterhin weisen sie hohe Homologien zu einem potentiellen Virulenzfaktor von Sc. pyogenes auf. Hieraus er gibt sich, dass die Proteine OCTS und AdiS von Sc.suis für die Entwicklung eines Impfstoffes geeignet sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Impfstoffe, welche das erfindungsgemäße Protein AdiS enthalten. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Impfstoffe erfolgt in an sich bekannter Weise. Dazu wird eine erfindungsgemäße nicht rekombinante Subunitvakzine zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, Trägerstoffen, Lösemitteln und/oder Adjuvantien gemischt und sterilisiert. Die Verfahren sind dem Fachmann bekannt.

Für den experimentellen Ansatz wurde ein hochvirulentes Sc. suis-Feldisolat (I9841/1) ausgewählt, das aus dem ZNS isoliert und als Serotyp 2, MRP+/EF+ und Suilysin+ charakterisiert wurde. Die Anzucht von Sc. suis erfolgt unter nicht-induzierenden Standardbedingungen bei 32°C oder 37°C bis zur mittleren logarithmischen Wachstumsphase. Die eine Hälfte der Kultur wurde unter nichtinduzierenden Bedingungen weiterinkubiert, und die andere Hälfte der Kultur wurde für eine Stunde einer Temperaturerhöhung auf 42°C bzw. einem erhöhten CO₂-Partialdruck ausgesetzt.
Nach Ernte der Kulturen wurden die drei Proteinfraktionen Kultur-Überstand, Protoplasten-Überstand und Protoplasten gewonnen. Der Kultur-Überstand wurde durch Zentrifugation der Bakterienkultur bei 10.000 x g für 10 min gewonnen. Das Bakterienpellet wurde mit einer Muramidase behandelt, um die mureinassozierten Oberflächenproteine von der Zellwand abzulösen. Nach anschließender Zentrifugation bei 10.000 x g für 10 min wurde der Überstand vom Pellet abgetrennt. Die Proteinfraktionen wurden dann in der folgenden Proteomanalyse untersucht.
Die differenziell exprimierten Proteine wurden mit Hilfe der ein- und zweidimensionalen Gelelektrophorese identifiziert. Die eindimensionale Gelelektrophorese erfolgt im Polyacrylamidgel. Für die erste Dimension der zweidimensionalen Gelelektrophorese wurden Immobiline DryStrip gels (pH 3-10) verwendet. Die zweite Dimension findet ebenfalls im Polyacrylamidgel statt. Zwei induzierte Proteinbanden mit relativen Molekulargewichten von ca. 47 (OCTS) und 53 Kilodalton (AdiS) wurden nach Durchführung eines Westernblotes ausgeschnitten und N-terminal die ersten 15 Aminosäuren ansequenziert. Die Sequenz der ersten 15 Aminosäuren beider Proteine wurde zur Homologiesuche auf bekannte Proteine bzw. Gene in eine Datenbank eingegeben.
Mit Hilfe der hieraus ermittelten Nukleotidsequenz konnte eine passende Sonden konstruiert werden. Hierfür wurde ein Primer generiert und mit der DNA des Sc. suis-Ausgangsstammes eine PCR durchgeführt. Das Produkt wurde kloniert und anschließend zur Kontrolle sequenziert. Die so gewonnene Sonde wurde anschließend in Northern- und Southernanalysen eingesetzt.

Claims

Protein AdiS mit der Aminosäuresequenz:
Protein, mit einer Aminosäuresequenz, die wenigstens zu 90 % der Aminosäuresequenz des Proteins AdiS homolog ist.
Polynukleotid gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein AdiS durch den folgenden Sequenzabschnitt kodiert ist:
Polynukleotid gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein OCTS durch den folgenden Sequenzabschnitt kodiert ist:
ADS-Operon das die Regionen umfasst, welche die Proteine OCTS, AdiS und CKS kodiert mit folgender Nukleotidsequenz:
Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz besitzt, die wenigstens zu 90 % der Sequenz des ADS-Operons gemäß Anspruch 3 homolog ist.
Verfahren zur Herstellung des Proteins AdiS gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Stressanzucht erhalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Anzucht eine Temperatur von 32 bis 42 °C und/ oder ein erhöhter CO₂-Partialdruck angewendet wird.
Nicht-rekombinante Subunit-Vakzine gegen Streptococcus suis-Infektionen beim Schwein, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Protein AdiS gemäß Anspruch 1 und/oder das Protein OCTS und/oder ein Protein gemäß Anspruch 2 umfasst.
Nicht-rekombinante Subunit-Vakzine gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Adjuvanz und/oder andere Hilfs- und Trägerstoffe enthält.
Nicht-rekombinante Subunit-Vakzine gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Adjuvanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mineralöl und Aluminiumhydroxid.