DE69233522T2

DE69233522T2 - Für die regulation und reifung von urease notwendige helicobakter pylori-gene und ihre nutzung

Info

Publication number: DE69233522T2
Application number: DE69233522T
Authority: DE
Inventors: Agnès Labigne; Valerie Cussac; Richard Ferrero
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1991-10-03
Filing date: 1992-10-02
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2012-10-03
Also published as: JPH07500010A; WO1993007273A1; US5986051A; FR2682122A1; US6271017B1; EP0610322B1; ATE297467T1; FR2682122B1; DE69233522D1; EP0610322A1; SG52561A1; ES2243920T3; US6027878A; CA2120527A1; JP2004121216A; JP2002315589A; CA2120527C; JP3581352B2

Description

Helicobacter pylori (auch mit dem Ausdruck H. pylori bezeichnet) ist ein Gram-negatives Bakterium, das heute ausschließlich auf der Oberfläche der Magenschleimhaut beim Menschen und in besonderem Maße rings um die Läsionen der Krater der Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüre gefunden wird. Dieses Bakterium wurde anfänglich Campylobacter pyloridis genannt (Warren et al. (1983), Lancet 1., 1273–1275).
Wie die meisten Bakterien ist H. pylori empfindlich gegenüber einem Milieu von saurem pH, kann jedoch dennoch die Säure in der Gegenwart physiologischer Spiegel von Harnstoff ertragen (Marshall et al. (1990), Gastroenterol. 99: 697–702). Man nimmt an, dass die Urease von H. pylori das Überleben des Bakteriums in der sauren Umgebung des Magens erlaubt, indem sie den Harnstoff zu Kohlendioxid und Ammoniak hydrolysiert, die in der Mikroumgebung des Bakteriums erhöht sind. Kürzlich haben Untersuchungen, die an Tiermodellen durchgeführt wurden, Einzelheiten erbracht, die nahelegen, dass die Urease ein wichtiger Faktor bei der Kolonisierung der Magenschleimhaut ist (Eaton et al. (1991), Infect. Immun. 59: 2470–2475). Von der Urease wird auch vermutet, dass sie entweder direkt oder indirekt Schädigungen der Magenschleimhaut verursacht.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist derzeit als das etiologische Agens von Antrumgastritis anerkannt und scheint einer der Cofaktoren zu sein, die für die Entwicklung der Geschwüre erforderlich sind. Im Übrigen scheint es, dass die Entwicklung von Magenkarzinomen mit der Anwesenheit von H. pylori assoziiert sein könnte.
Alle Stämme, die klinisch aus Biopsien oder Magensaft isoliert wurden, synthetisieren eine sehr aktive Urease, die auf der Oberfläche des Bakteriums exponiert ist, die eines der am stärksten immunogenen Proteine von H. pylori ist. Von der Urease wird angenommen, dass sie eine Rolle in dem pathogenen Prozess spielt, eine Tatsache, die durch die Versuche bestätigt wurde, die beim Schwein durchgeführt wurden, die zeigten, dass Stämme, die die Urease schwach produzierten, die durch chemische Mutagenese erhalten wurden, unfähig waren, den Magen des Schweins zu besiedeln. Diese Ergebnisse, die nach chemischer Mutagenese erhalten wurden, erlauben es jedoch nicht, die Verringerung der Produktion der Urease einer Unfähigkeit, den Magen zu besiedeln, mit Bestimmtheit Produktion der Urease einer Unfähigkeit, den Magen zu besiedeln, mit Bestimmtheit zuzuordnen, da andere Gene bei der allgemeinen Mutagenese inaktiviert worden sein können. Es handelt sich also nicht um kontrollierbare Mutationen, und folglich weist diese Technik keinen realen Nutzen bei der Konzeption von Mitteln auf, die dazu bestimmt sind, die nachteiligen Wirkungen der Urease im Fall einer Infektion durch H. pylori zu verringern oder gar diesen vorzubeugen.
Außer dieser Rolle bei der Besiedlung des Magens wurde gezeigt, dass die freigesetzte Urease ebenso wie der freigesetzte Ammoniak eine direkte zytotoxische Wirkung auf die Epithelzellen und eine indirekte Wirkung aufweisen könnten, indem sie eine Entzündungsantwort auslösen könnten, die am Beginn der Magenläsionen stünde.
Die Urease ist somit eine der wichtigsten Pathogenitätsdeterminanten, und die Konstruktion von isogenen Stämmen von H. pylori, die spezifisch in den Genen, die für die Expression der Urease verantwortlich sind, inaktiviert sind, seien es die Strukturgene oder die akzessorischen Gene, ist von vorrangiger Bedeutung, um die Rolle der Urease in dem Besiedlungsschritt zu präzisieren, sowie für eine Anwendung bei der Konstruktion von Stämmen, die verwendet werden können, um die Individuen in einem Impfverfahren zu schützen, zum Beispiel durch die Konstruktion von abgeschwächten Stämmen.
Bisher wurden die Gene der Urease auf einem Fragment von 34 kb des Chromosoms von H. pylori lokalisiert und einer Region von 4,2 kb zugeordnet, die in diesem Fragment vorhanden ist. Vier Gene, die mit den Bezeichnungen ureA, ureB, ureC und ureD bezeichnet wurden, wurden dieser Region von 4,2 kb zugeordnet. Diese Region erlaubte es, einen Urease-positiven Phänotyp zu erhalten, als die DNA von 4,2 kb mittels eines Shuttlevektors in Campylobacter jejuni transferiert wurde.
Jedoch erlaubte die Transformation von Zellen von E. coli mit der DNA von 4,2 kb, die zuvor beschrieben wurde, es nicht, die Expression einer Ureaseaktivität in E. coli zu erhalten.
Den Erfindern ist es gelungen zu bestimmen, welches die Elemente sind, die sowohl aus genetischer Sicht als auch im Hinblick auf die Kulturbedingungen für die Expression einer Ureaseaktivität, wie sie bei H. pylori erhalten wird, in E. coli notwendig sind. Sie haben in dieser Hinsicht festgestellt, dass die Expression der Urease bei E. coli gleichzeitig von der Aktivierung des Stickstoff-Regulationssystems von E. coli und von der Anwesenheit von akzessorischen Genen der Strukturgene der Urease abhing. Sie haben mehrere Gene identifiziert und isoliert, die im Folgenden mitunter durch den Ausdruck „akzessorische Gene" der Urease bezeichnet werden, die die funktionelle Expression der Urease bei E. coli erlauben und die Reifung und die Regulation der Urease bei H. pylori bestimmen.
Die Erfindung betrifft somit eine Gruppe von fünf neuen Genen, die die funktionelle Expression der Urease bei H. pylori und bei E. coli bestimmen oder wenigstens imstande sind, darin einzugreifen, sowie jedes dieser Gene für sich betrachtet und unabhängig von den weiteren Genen. Sie betrifft gleichermaßen diese Gruppe von Genen, die gegebenenfalls modifiziert sind, in Verbindung mit den Strukturgenen der Urease, die mit ureA, ureB, ureC und ureD bezeichnet sind und die in der Publikation (Labigne et al. (1991), J. Bacteriol. 173: 1920–1931) beschrieben sind.
Die Erfindung betrifft im Übrigen neue Mittel für den In-vitro-Nachweis einer Infektion durch H. pylori, sowie Zusammensetzungen, die für den Schutz vor der Infektion durch H. pylori verwendbar sind.
Die Erfindung hat somit eine Nukleotidsequenz zum Gegenstand, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus wenigstens einer der Nukleinsequenzen, die den ureE, ureF, ureG, ureH, ureI genannten Genen entsprechen und den im Folgenden dargestellten Nukleotidketten entsprechen:

oder aus jedem Teil wenigstens einer dieser Nukleinsequenzen besteht oder dass sie diese oder diesen umfasst.
Eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz besteht entweder aus DNA oder aus RNA.
Die Erfindung betrifft auch eine Nukleotidsequenz, die im Vergleich zu der oben beschriebenen Nukleotidsequenz durch Deletion, Addition, Substitution oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in der Weise, dass die funktionellen Eigenschaften der von diesen modifizierten Genen kodierten Polypeptide im Vergleich zu den Eigenschaften der Polypeptide UreE, UreF, UreG, UreH oder UreI, wie sie von H. pylori exprimiert werden, entweder konserviert oder abgeschwächt oder sogar unterdrückt sind, oder in der Weise, dass diese Sequenz kein Polypeptid bei H. pylori exprimiert, modifiziert ist.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung und im Rahmen der vorhergehenden Definition ist eine Nukleotidsequenz dadurch gekennzeichnet, dass sie besteht aus oder dass sie umfasst:

a) die Gruppe der Nukleinsequenzen, die den ureE, ureF, ureG, ureH, ureI genannten Genen entsprechen und den in der 4 dargestellten Nukleotidketten entsprechen, oder
b) die Gruppe, die von den Nukleinsequenzen (Varianten) gebildet ist, die diesen Genen, die unabhängig voneinander modifiziert sind, entsprechen, so dass die Gruppe dieser Varianten für Polypeptide kodiert, die eine funktionelle Homologie mit den Polypeptiden UreE, UreF, UreG, UreH oder UreI, wie sie von H. pylori exprimiert werden, aufweisen, oder im Gegenteil für modifizierte Polypeptide kodiert, um die funktionellen Eigenschaften der wie von H. pylori exprimierten Polypeptide UreE, UreF, UreG, UreH oder UreI abzuschwächen oder sogar zu unterdrücken.

Fragmente (Nukleotidketten) der oben genannten Nukleotidsequenzen sind aus verschiedenen Gründen interessant, und als Beispiel kann man definieren:

– Fragmente der oben genannten Sequenzen, die die Fähigkeit bewahrt haben, für Polypeptide zu kodieren, die eine funktionelle Homologie mit den Polypeptiden aufweisen, wie sie durch die Expression eines Gens, ausgewählt aus ureE, ureF, ureG oder ureI, in H. pylori erhalten werden;
– Fragmente, die für jeden Teil der oben genannten Polypeptide kodieren, wie sie bei H. pylori erhalten werden, und die insbesondere für Peptide oder Teile von Polypeptiden kodieren, die von Antikörpern erkannt werden, die gegen H. pylori gerichtet sind, oder fähig sind, sich wie Haptene oder Immunogene zu verhalten;
– Fragmente der oben genannten Sequenzen ohne die Fähigkeit für die Polypeptide von H. pylori zu kodieren, wie sie ausgehend von den Genen ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI exprimiert werden;
– Fragmente, die für Polypeptide oder Peptide kodieren, die abgeschwächte, oder sogar unterdrückte Eigenschaften im Vergleich zu den Eigenschaften der Polypeptide aufweisen, die von den Genen ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI von H. pylori kodiert werden.

Solche Fragmente weisen vorteilhafterweise wenigstens 15 Nukleotide, vorzugsweise wenigstens 20 Nukleotide auf.
Diese Gene ureE, ureF, ureG, ureH und ureI sind vorzugsweise auf einem Chromosom von H. pylori vorhanden; diese Gene sind Gene, die im Verhältnis zu den Strukturgenen der Urease (ureA, ureB) als akzessorisch bezeichnet werden. Im Gegensatz zu den Strukturgenen sind die akzessorischen Gene für die Bildung des Enzyms Urease nicht notwendig. Dafür greifen sie durch Mittel der Regulation und/oder der Reifung der gebildeten Urease in die funktionelle Expression der Urease, wie sie bei H. pylori exprimiert wird, ein. Die Urease wird nämlich in der Form eines inaktiven Apoenzyms exprimiert, bevor sie einen Reifungsschritt innerhalb von H. pylori erfährt, einen Schritt, der ihr ihre Form eines funktionellen Enzyms verleiht.
Die Erfinder haben im Übrigen festgestellt, dass die Anwesenheit dieser fünf akzessorischen Gene unerlässlich für die Expression der funktionellen Urease in Zellen von E. coli ist, die zuvor mit den Strukturgenen ureA, ureB, ureC und ureD transformiert wurden.
Demgemäß erlaubt es die Identifizierung dieser Gene und ihrer Nukleotidsequenzen, Mittel vorzusehen, um die Ureaseaktivität in Stämmen von H. pylori zu modulieren, insbesondere um abgeschwächte Stämme herzustellen.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung kodieren Nukleotidsequenzen von Interesse für Polypeptide, die eine funktionelle Homologie mit den natürlichen Polypeptiden UreE, UreF, UreG, UreH und UreI aufweisen. Diese Homologie zwischen Polypeptiden wird im Vergleich zu der Fähigkeit dieser Polypeptide, innerhalb von H. pylori wie die natürlichen Polypeptide UreE, UreF, UreG, UreH und UreI zu funktionieren, und folglich, ausgehend von dem Apoenzym, zu der Bildung der funktionellen Urease beizutragen, beurteilt.
Diese funktionelle Homologie kann durch das Durchführen des folgenden Tests nachgewiesen werden: 10⁹ Bakterien werden in 1 ml Harnstoff-Indol-Medium resuspendiert und bei 37 °C inkubiert. Die Hydrolyse des Harnstoffs führt zu der Freisetzung von Ammoniak, der durch die Erhöhung des pHs eine Farbänderung von Orangefarben nach Fuchsinrot induziert.
Im Gegensatz dazu kann man im Rahmen der Erfindung Nukleotidsequenzen einsetzen, die der Gruppe der Nukleinsequenzen entsprechen, die den Genen ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI entsprechen, wobei diese Sequenzen so modifiziert sind, dass die Polypeptide, für die sie kodieren, nicht mehr die Fähigkeit natürlicher Polypeptide besitzen, die Produktion einer funktionellen Urease in H. pylori oder gegebenenfalls in einer anderen Spezies zu erlauben. In diesem Fall versucht man, die funktionellen Eigenschaften der natürlichen Polypeptide, wie sie von H. pylori exprimiert werden, abzuschwächen oder zu unterdrücken. Es wird angenommen, dass die funktionellen Eigenschaften abgeschwächt sind, wenn der Stamm, in den die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen eingeführt werden, eine nicht-pathogene Urease, zum Beispiel in Form eines Apoenzyms, produziert. Diese Pathogenität kann durch das Durchführen des folgenden Tests bewertet werden:
Man testet die Implantation des rekombinanten Stammes in den Magen eines Tieres, vorzugsweise eines gnotobiotischen Ferkels, unter Verwendung der von Eaton et al. (1991 Infect. Immun. 59: 2470–2475) beschriebenen Technik.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung kann eine wie zuvor definierte Nukleotidsequenz mit den Nukleinsequenzen assoziiert sein, die den Strukturgenen ureA und ureB entsprechen, die für die Urease-Untereinheiten bei H. pylori kodieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist diese Nukleotidsequenz mit den Genen ureA, ureB, ureC und/oder ureD assoziiert, die für die Urease bei H. pylori kodieren.
In diesem Fall können die verschiedenen Gene auf verschiedenen Replikons angeordnet sein.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen die Nukleotidsequenzen, die in den Rahmen der vorhergehenden Definition fallen und einer der kodierenden Nukleotidketten entsprechen, die den Genen ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI entsprechen. Diesbezüglich betrifft die Erfindung insbesondere die folgenden Ketten:

– die Kette ureE, die den Nukleotiden 800 bis 1309 der Sequenz der 4 entspricht, oder jedes Fragment dieser Kette, sofern es unter stringenten Bedingungen, das heißt bei 68 °C in 6xSSC-Denhardsmedium oder bei 37 °C in 5xSSC, 50 % Formamid, mit der Kette ureE oder mit der komplementären Sequenz zu dieser Kette hybridisiert,
– die Kette ureF, die den Nukleotiden 1324 bis 2091 der Sequenz der 4 entspricht, oder jedes Fragment dieser Kette, sofern es unter stringenten Bedingungen, das heißt bei 68 °C in 6xSSC-Denhardsmedium oder bei 37 °C in 5xSSC, 50 % Formamid, mit der Kette ureF oder mit der komplementären Sequenz zu dieser Kette hybridisiert,
– die Kette ureG, die den Nukleotiden 2123 bis 2719 der Sequenz der 4 entspricht, oder jedes Fragment dieser Kette, sofern es unter stringenten Bedingungen, das heißt bei 68 °C in 6xSSC-Denhardsmedium oder bei 37 °C in 5xSSC, 50 % Formamid, mit der Kette ureG oder mit der komplementären Sequenz zu dieser Kette hybridisiert,
– die Kette ureH, die den Nukleotiden 2722 bis 3516 der Sequenz der 4 entspricht, oder jedes Fragment dieser Kette, sofern es unter stringenten Bedingungen, das heißt bei 68 °C in 6xSSC-Denhardsmedium oder bei 37 °C in 5xSSC, 50 % Formamid, mit der Kette ureH oder mit der komplementären Sequenz zu dieser Kette hybridisiert,
– die Kette ureI, die den Nukleotiden 211 bis 795 der Sequenz der 4 entspricht, oder jedes Fragment dieser Kette, sofern es unter stringenten Bedingungen, das heißt bei 68 °C in 6xSSC-Denhardsmedium oder bei 37 °C in 5xSSC, 50 % Formamid, mit der Kette ureI oder mit der komplementären Sequenz zu dieser Kette hybridisiert.

Als „komplementäre Sequenzen" werden hierin hinsichtlich der DNA-Sequenzen inverse und komplementäre Sequenzen bezeichnet. Der Ausdruck „invers" bezieht sich auf die Wiederherstellung der 5'-3'-Ausrichtung der Nukleinsäure, die aufgrund der Natur der Nukleotide und zwar im Verhältnis zu einer gegebenen Sequenz komplementär ist.
Die Erfindung betrifft auch eine bestimmte Nukleotidkette, die der folgenden Sequenz entspricht:
GCG AAA ATA TGC TAT GAA ATA GGA AAC CGC CAT
Die Erfindung bezieht sich gleichermaßen auf jede DNA-Sequenz, die diese Nukleotidkette umfasst.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, die den vorhergehenden Definitionen entsprechen, können ein Bestandteil der Zusammensetzung von Sonden sein, wenn sie, zum Beispiel an ihrem 5'- und/oder 3'-Ende, mit einer Substanz, die nachgewiesen werden kann, markiert sind. Als Marker können radioaktive Isotope, Enzyme, chemische oder chemolumineszierende Marker, Fluorochrome, Haptene oder Antikörper, Basenanaloga, oder außerdem physikalische Marker genannt werden. Diese Marker können gegebenenfalls an einen festen Träger fixiert sein, zum Beispiel einen teilchenförmigen oder Membran-Träger, wie magnetische Kugeln.
Als bevorzugter Marker kann das radioaktive Phosphor (³²P) genannt werden, das an dem 5'-Ende der als Sonde verwendeten Sequenz eingebaut ist.
Vorteilhafterweise umfasst eine erfindungsgemäße Nukleotidsonde jedes Fragment der beschriebenen Gene, zum Beispiel Fragmente von in etwa 45 Nukleotiden.
Bevorzugte erfindungsgemäße Sonden sind aus Fragmenten gebildet, die von dem Gen ureH oder vorzugsweise von dem Gen ureI abstammen.
Anhand der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können auch Starter (Primer) definiert werden, die für den In-vitro-Nachweis einer Infektion durch H. pylori verwendet werden können. Ein Starter ist dadurch gekennzeichnet, dass er ein wie von einer zuvor beschriebenen Sequenz abstammendes Nukleotidfragment umfasst, das von in etwa 18 bis in etwa 30, vorzugsweise von in etwa 25 bis in etwa 30, Nukleotide umfasst. Solch ein Starter kann in Genamplifikationsreaktionen, zum Beispiel gemäß einer Kettenpolymerisationstechnik, eingesetzt werden.
Für die Verwendung in einer Amplifizierungstechnik werden erfindungsgemäße Starter paarweise verwendet, so dass sie unter bestimmten Bedingungen mit den jeweiligen 5'- und 3'-Enden des zu amplifizierenden Nukleotidfragments hybridisieren.
Falls die PCR-Technik eingesetzt wird, sind die Bedingungen, die für die spezifische Hybridisierung der Starter mit der nachzuweisenden DNA erforderlich sind, die Bedingungen, die in den Anmeldungen EP 200363 , 201184, 229701 beschrieben wurden, und die Temperatur wird gemäß der Formel T(°C) = [4(C + G) + 2(A + T) – 10]berechnet, in der A, T, C, G jeweils die Anzahl der Nukleotide A, T, C, G in den verwendeten Startern repräsentieren.
Die Amplifizierungstechniken, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden können, umfassen zum Beispiel die in den europäischen Patentanmeldungen von Cetus (Nr. 200363, 201184 und 229701) beschriebene PCR-Technik (Polymerase Chain Reaction) oder auch die in Biotechnology (Bd. 6, Oktober 1988) beschriebene Technik der „Qß-Replicase".
Weitere erfindungsgemäße Nukleotidsequenzen sind Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen, wie sie weiter oben definiert sind, mit einer Sequenz, die auf den vorhergehenden Seiten definiert ist, oder einer komplementären Sequenz zu diesen Sequenzen hybridisieren.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen und Vektoren können auch für die Expression anderer Gene oder Sequenzen von H. pylori oder von anderen Stämmen in H. pylori oder in anderen Wirten, wie E. coli, dem Adenovirus, verwendet werden.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Polypeptid, das dadurch charakterisiert ist, dass es einem der Polypeptide UreE, UreF, UreG, UreH oder UreI, die in der 4 dargestellt sind, jedem Teil von wenigstens einem dieser Polypeptide entspricht. Die Erfindung betrifft insbesondere jedes modifizierte Polypeptid, sofern es eine funktionelle Homologie mit dem ursprünglichen Polypeptid UreE, UreF, UreG, UreH oder UreI aufweist, wie es von H. pylori exprimiert wird, oder im Gegenteil durch Deletion, Addition, Substitution oder Inversion einer oder mehrerer Aminosäuren modifiziert ist, um seine funktionellen Eigenschaften abzuschwächen oder sogar zu unterdrücken, bei denen es sich um die wie von H. pylori exprimierte Ureaseaktivität handelt.
Die Polypeptide UreE, UreF, UreG, UreH und UreI greifen im Besonderen in die Regulation und die Reifung der Urease bei H. pylori ein.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Polypeptid ist dasjenige, das der folgenden Kette von 11 Aminosäuren entspricht:
Ala Lys Ile Cys Tyr Glu Ile Gly Asn Arg His
Die erfindungsgemäßen Polypeptide und insbesondere das Polypeptid, dessen Sequenz oben angegeben ist, können für die Herstellung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper oder für den Nachweis von Antikörpern in einer biologischen Probe, die von H. pylori infiziert ist, verwendet werden.
Monoklonale Antikörper können mittels der Technik der Hybridome oder mittels der bekannten Techniken zur Herstellung humaner Antikörpern hergestellt werden.
Diese Antikörper können gleichermaßen gemäß der von Marks et al. (J. Mol. Biol. 1991, 222, 581–597) beschriebenen Technik hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft auch anti-idiotypische Antikörper.
Antikörper gegen die oben genannte Kette von 11 Aminosäuren könnten im Rahmen einer Reaktion zur Blockierung der Reifung der Urease eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der monoklonalen oder polyklonalen Antikörper in Zusammensetzungen für die Behandlung einer Infektion durch H. pylori.
Die Erfindung hat gleichermaßen rekombinante Vektoren zum Gegenstand, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz enthalten. Derartige rekombinanten Vektoren können zum Beispiel Cosmide oder Plasmide sein.
Ein besonders vorteilhafter Vektor für die Durchführung der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das Plasmid pILL753 handelt, das in E. coli HB 101 enthalten ist, das bei der CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Paris, Frankreich) am 3. Oktober 1991 unter der Nummer I-1148 hinterlegt wurde.
Ein weiterer, besonders vorteilhafter, rekombinanter Vektor ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das Plasmid pILL763 handelt, das in E. coli HB 101 enthalten ist, das bei der CNCM am 3. Oktober 1991 unter der Nummer I-1149 hinterlegt wurde.
Die Erfindung hat auch einen rekombinanten zellulären Wirt (oder einen rekombinanten zellulären Stamm) zum Gegenstand, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er mit einer Nukleotidsequenz transformiert ist, die den zuvor angegebenen Definitionen entspricht. Dieser, so transformierte, zelluläre Wirt soll die Expression der Nukleotidsequenz der akzessorischen Gene der Urease ermöglichen, die gegebenenfalls in Übereinstimmung mit den vorhergehenden Definitionen modifiziert sind.
In bevorzugter Weise ist ein rekombinanter zellulärer Wirt ein Stamm von H. pylori, der durch eine der zuvor definierten Nukleotidsequenzen modifiziert ist und der vorteilhafterweise so modifiziert ist, dass die Produkte der modifizierten akzessorischen Gene, die er exprimiert, dazu beitragen, die Wirkungen der Urease, insbesondere ihre pathogenen Wirkungen, abzuschwächen.
Ein solcher rekombinanter Stamm kann zum Beispiel durch Mutation des Stammes N6 von H. pylori erhalten werden, der bei der NCIMB (National Collections of Industrial and Marine Bacteria LTD) in Großbritannien am 26. Juni 1992 unter der Nummer NCIMB 40512 hinterlegt wurde, wobei die Mutation auf der Ebene wenigstens eines der Gene ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI und/oder auf der Ebene eines oder mehrerer der Strukturgene, zum Beispiel ureA oder ureB, durchgeführt wird.
Vorzugsweise werden im Rahmen der Erfindung rekombinante Stämme und insbesondere rekombinante Stämme von H. pylori, deren Ureaseaktivität in Übereinstimmung mit den zuvor bestimmten Kriterien abgeschwächt wird, gebildet werden.
Somit sind besonders vorteilhafte, rekombinante Stämme N6 diejenigen, die es erlauben, einen Urease-negativen Phänotyp zu erhalten, und die wenigstens eines der Gene ureE, ureF, ureG, ureH oder mutiertes ureI enthalten.
Eine Inaktivierung des Gens ureI erlaubt es zum Beispiel, Urease-negative H. pylori-Stämme herzustellen. Ebenso erlauben es bestimmte Mutationen in ureI, einen Ureasenegativen Phänotyp bei H. pylori zu erhalten, wenn die Produkte der Gene ureA und ureB exprimiert werden. Es handelt sich zum Beispiel um die in den Beispielen beschriebene Mutation Nr. 8.
Eine weitere, besonders interessante Mutation, besonders für die Herstellung von Impfstämmen und insbesondere von Impfstämmen von H. pylori, ist eine Mutation des Gens ureG. Ein rekombinanter Stamm von H. pylori, in dem das Gen ureG mutiert ist, weist die folgenden Eigenschaften auf:

– der so mutierte Stamm bewahrt die Fähigkeit, eine Immunantwort auszulösen;
– der so mutierte Stamm ist ohne Ureaseaktivität.

Es können jedoch weitere Stämme mit den erfindungsgemäßen Sequenzen transformiert werden. Insbesondere wird man auf E. coli zurückgreifen, um Mutationen in den Genen ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI durchzuführen, die zuvor in diesen Stamm, zum Beispiel mittels eines Plasmids, eingeführt wurden. Die so mutierten Gene können anschließend in eine andere Wirtszelle, zum Beispiel in H. pylori, eingeführt werden um einen allelischen Austausch zu ermöglichen und eine Mutation zu erzeugen.
Es wird angemerkt, dass die Deletion des Gens ureI in einer erfindungsgemäßen rekombinanten E. coli-Zelle den Urease-positiven Phänotyp nicht verändert, sofern die übrigen Voraussetzungen für die Expression dieses Phänotyps vorliegen.
Der rekombinante Stamm von E. coli kann im Übrigen verwendet werden, um die Polypeptide UreE, UreF, UreG, UreH oder UreI herzustellen und sie mittels der klassischen Techniken zu reinigen.
Die rekombinanten Stämme von H. pylori mit abgeschwächter Ureaseaktivität können gleichermaßen für den Transport und die Expression heterologer Gene, zum Beispiel von Genen von Cholera oder der Salmonellen, verwendet werden.
Verschiedene Techniken können verwendet werden, um rekombinante Stämme herzustellen. Zum Beispiel wird auf die Technik der Eletroporation, wie sie in den Beispielen dieser Anmeldung beschrieben ist, zurückgegriffen werden.
Diese Technik der Elektroporation kann gegebenenfalls modifiziert werden, indem der Schritt, der darin besteht, dass bei den zu transformierenden Zellen ein Elektroschock durchführt wird, weggelassen wird.
Die Erfindung schlägt Mittel zum Schutz vor einer Infektion durch H. pylori vor und insbesondere mittels der Verabreichung immunogener Zusammensetzungen, die einen rekombinanten zellulären Stamm enthalten, der durch eine abgeschwächte Ureaseaktivität gekennzeichnet ist. Solche immunogenen Zusammensetzungen können in der Humanmedizin verwendet werden.
Eine immunogene Zusammensetzung kann Stämme, so wie Zellen von H. pylori, deren Ureaseaktivität durch Insertion einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz, die wenigstens eine Sequenz umfasst, die den Genen ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI entspricht, die gegebenenfalls modifiziert sind, um die Ureaseaktivität abzuschwächen, in den Stamm abgeschwächt ist, enthalten.
Es kann sich im Allgemeinen um jeden Wirt handeln, der fähig ist, eine Urease, die zum Beispiel durch Mutation der Nukleotidsequenzen eines oder mehrerer Gene ureA, ureB, ureC, ureD, ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI oder durch Expression einer verkürzten Form eines Polypeptids, das in die Struktur, die Reifung oder die Regulation der Urease eingreift, abgeschwächt ist, zu produzieren.
Die Erfindung hat auch ein Kit für die In-vitro-Diagnose einer Infektion durch H. pylori in einer bestimmten biologischen Probe zum Gegenstand, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

– wenigstens ein Paar Nukleotidstarter, die den oben genannten Kriterien entsprechen, die fähig sind, an die 5'- und 3'-Enden eines spezifischen Nukleotidfragments wenigstens einer Nukleinsequenz zu hybridisieren, die einem Gen, ausgewählt aus ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI, entspricht,
– notwendige Reagenzien für die Extraktion der Nukleinsäuren aus der behandelten Probe,
– Reagenzien, um die Polymerisierung des besagten Nukleotidfragments, ausgehend von den Nukleotidstartern, durchzuführen, im Besonderen Polymerisierungsenzyme in einer ausreichenden Menge, um die Amplifizierung des Fragments, das amplifiziert werden soll, durchzuführen,
– wenigstens eine Nukleotidkette, die als Sonde verwendet werden kann und fähig ist, unter bestimmten Bedingungen mit dem amplifizierten DNA-Fragment zu hybridisieren,
– gegebenenfalls Mittel, um die Hybridisierung nachzuweisen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann dem Kit auch

– eine interne Kontrolle der Amplifizierungsreaktion zugegeben werden, die zum Beispiel aus einer Nukleinsäure besteht, die sich eventuell auf einem Plasmid befindet, wobei die besagte Nukleinsäure mittels Hybridisierung leicht nachgewiesen werden kann, zum Beispiel weil sie ein Resistenzgen gegen ein Antibiotikum enthält oder weil sie aus der chromosomalen DNA von N6 besteht, wobei das Fragment außerdem an seinen beiden Enden mit wenigstens einem Amplifizierungsstarter ausgestattet ist, wobei diese Starter wahlweise aus den erfindungsgemäßen Startern ausgewählt sind, und
– eine Sonde zugegeben werden, die fähig ist, mit der Nukleinsäure zu hybridisieren, die in der internen Kontrolle enthalten ist,
– gegebenenfalls eine reverse Transkriptase zugegeben werden, um ausgehend von der RNA, die möglicherweise in der getesteten Probe vorhanden ist, cDNA zu erhalten.

Die Anwesenheit einer internen Kontrolle, die der Probe zugegeben wurde, erlaubt es, die Anwesenheit von „falsch Negativen" unter den Proben zu entdecken. Wenn die Sonde, die spezifisch für die interne Kontrolle ist, kein Amplifizierungsprodukt nachweist, handelt es sich nämlich wahrscheinlich um eine Probe, die einen Inhibitor der Taq-Polymerase enthält, einen Inhibitor, der die Amplifizierung der DNA oder der cDNA von H. pylori behindert. In diesem Fall können verschiedene Verdünnungen der untersuchten Probe den Nachweis der Anwesenheit von Nukleinsäure von H. pylori erlauben.
Wenn die interne Kontrolle eine positive Reaktion zeigt, erlaubt eine negative Reaktion bei der getesteten Probe den Schluss, dass kein H. pylori vorhanden ist.
Es wird angemerkt, dass die Starter, die zu der internen Kontrolle zugegeben werden, nicht notwendigerweise diejenigen der Erfindung sind. Jedoch kann die Auswahl anderer Starter eine Verringerung der Empfindlichkeit zur Folge haben.
Als Beispiel einer biologischen Probe für den Nachweis einer Infektion durch H. pylori beim Menschen werden Proben, wie Biopsien, Magensaft oder eventuell Speichel oder Stuhl, verwendet werden.
Dieses Kit kann auch für Kontrollen von Gewässerverschmutzung oder Kontrollen an Lebensmitteln verwendet werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren für die In-vitro-Diagnose einer Infektion durch H. pylori in einer bestimmten biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst:

a) In-Kontakt-Bringen der Nukleinsäure der Probe, die H. pylori enthalten kann, unter Bedingungen, die die Zugänglichkeit in Form von einzelsträngiger DNA oder von RNA erlauben, mit wenigstens einem Paar erfindungsgemäßer Nukleotidstarter, wobei die Starter mit der Nukleinsäure von H. pylori hybridisieren können, falls sie vorhanden ist, und Beginnen der Synthese des Elongationsprodukts der Starter, wobei jeder Nukleotidsequenzstrang von H. pylori als Vorlage dient, wenn er mit den Startern gepaart wird;
b) Trennen der synthetisierten Nukleinsäurestränge von ihrer Vorlage;
c) Wiederholen der Synthese des Elongationsprodukts, ausgehend von jedem Nukleinsäurestrang, der am Ende von Schritt b) vorhanden ist und mit den Startern hybridisieren kann, bis eine Amplifizierung der gesuchten Nukleinsäure erhalten wird, die ausreicht, um nachgewiesen zu werden,
d) In-Kontakt-Bringen des Produkts von Schritt c) mit einer Nukleotidsonde unter Bedingungen, die den Nachweis der Anwesenheit der amplifizierten gesuchten Nukleinsäure erlauben;
e) Nachweisen der eventuell gebildeten Hybridisierungsprodukte.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des weiter oben definierten, diagnostischen In-vitro-Verfahrens geht dem In-Kontakt-Bringen der getesteten Probe ein Schritt einer Behandlung der Probe voraus, wobei die Nukleinsäure aus ihr extrahiert wird.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren einen Schritt vor dem In-Kontakt-Bringen mit den Startern, der aus einer Behandlung der Nukleinsäure der Probe mit einer reversen Transkriptase besteht, um die Synthese von cDNA ausgehend von RNA, die eventuell in der untersuchten Probe vorhanden ist, zu erreichen.
Die Erfindung betrifft auch ein Kit für die In-vitro-Diagnose einer Infektion durch H. pylori, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

– eine bestimmte Menge an Sonden gemäß der vorhergehenden Definition,
– ein geeignetes Medium für die Durchführung einer Hybridisierungsreaktion zwischen der nachzuweisenden Nukleinsäure von H. pylori und der Sonde,
– Reagenzien für den Nachweis der eventuell gebildeten Hybride.

Ein Verfahren zur Verwendung dieses Kits und für die In-vitro-Diagnose einer Infektion durch H. pylori, ausgehend von einer biologischen Probe, ist dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

– das In-Kontakt-Bringen der zu testenden Probe, deren DNA und/oder RNA zuvor zugänglich gemacht wurde, mit einer zuvor definierten Sonde unter Bedingungen, die die Hybridisierung der Nukleinsäure mit der Sonde erlauben;
– das Nachweisen einer eventuellen Hybridisierungsreaktion zwischen der Nukleinsäure und der Sonde.

Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können entweder durch Extraktion der Nukleinsäure von H. pylori und Spaltung mit ausgewählten Endonukleasen und Reinigung oder durch chemische Synthese erhalten werden.
Als Beispiel für die Synthese solcher Nukleinsäurefragmente kann das wie von Narang, S. A. et al. in Meth. of Enzymol., 68, 90 (1979) beschriebene Phosphotriester-Verfahren genannt werden. Ein anderes, an die Herstellung von Nukleotidfragmenten angepasstes Verfahren, ist das wie von Brown E. L. et al. in Meth. of Enzymol., 68, 109 (1979) beschriebene Phosphotriester-Verfahren.
Diese Herstellung kann auch mittels eines automatisierten Verfahrens durchgeführt werden, zum Beispiel indem die Diethylphosphoramidite als Ausgangsverbindungen verwendet werden, und in diesem Fall kann die Synthese gemäß der Beschreibung von Beaucage et al., Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859–1862, durchgeführt werden.
Weitere Vorteile und Eigenschaften der Erfindung kommen in den folgenden Beispielen und in den Figuren zum Vorschein.
FIGUREN
1: Subklonierung und Transposon-Mutagenese von pILL753
A: Lineare Restriktionskarte des hybriden Cosmids pILL585 und des Plasmids pILL590 (Labigne et al. – 1991). Die grauen Rahmen stellen das DNA-Fragment dar, das für die Expression der Urease in C. jejuni erforderlich ist.
B: Zufällige Insertion des Transposons MiniTn3-Km. Die Zahlen (1 bis 24), ebenso wie die Kreise, entsprechen der Insertionsstelle des Transposons in pILL753; die Zeichen (+) zeigen an, dass das Transposon die Expression der Urease nicht inaktiviert hat, wogegen die Zeichen (–) anzeigen, dass die Expression der Urease ausgeschaltet wurde.
C: Lineare Restriktionskarte der hybriden Plasmide pILL763 und pILL768, die durch Deletion (Δ) innerhalb von pILL753 erzeugt wurden. Die Anordnung der Gene (ureA bis ureH ist durch Rechtecke angegeben. Die Länge der Rechtecke entspricht der Länge der DNA, die für die Expression der Polypeptide erforderlich ist. Die Pfeile beziehen sich auf die Ausrichtung der Transkription. Die Rahmenzahl unter der Figur gibt die Größe der Restriktionsfragmente in Kilobasen an. Die Zahlen in Klammern entsprechen der Größe der DNA-Fragmente von H. pylori, die in einen der Klonierungsvektoren (pILL575, pILL550 oder pILL570) insertiert wurden. B, BamHI; E, EcoRI; P, PstI; H, HindIII; C, ClaI; Sm, SmaI. Die Buchstaben in Klammern geben die Restriktionsschnittstellen an, die zu dem Vektor gehören.
2: Ureaseaktivität, die von E. coli HB101 exprimiert wird, das pILL753 enthält, als Funktion der Zeit
Schalen, die entweder mit einem L-Agar-Medium (ML) oder mit einem M9-Minimalmedium hergestellt waren, die mit 10 mM L-Arginin ergänzt waren (MM), wurden jeweils mit einem Aliquotteil von 100 μl Kultur inokuliert und in sterilem, 0,85%igem NaCl suspendiert (10⁸ Bakterien/ml). Die Schalen wurden in aerobem oder mikroaerobem Milieu bei (A) 30 °C oder (B) 37 °C inkubiert, und die Aktivitätsmessungen wurden zu gewünschten Zeitpunkten durchgeführt. Die Sternchen geben an, dass keine Ureaseaktivität nachgewiesen wurde.
3: DNA-Sequenz der akzessorischen Gene der Urease von H. pylori
A: Strategie für die Sequenzierung der akzessorischen Gene der Ureaseregion des Hybridplasmids pILL753. Die Pfeile entsprechen den Größen der sequenzierten DNA-Fragmente. Die Pfeilspitzen repräsentieren die Oligonukleotide, die verwendet wurden, um die Oligonukleotid-Bestimmung durchzuführen und zu bestätigen.
B: Schematische Darstellung der fünf offenen Leserahmen (ORFs), die ausgehend von der Analyse der Nukleotidsequenz abgeleitet wurden, und ihre Größen in Nukleotiden. ATG entspricht dem Startkodon in Bezug auf jedes der Gene.
C: Die Größen und die berechneten molekularen Massen der fünf zusätzlichen Polypeptide der Urease von H. pylori sind angegeben.
4: Nukleotidsequenz der akzessorischen Gene der Urease von H. pylori
Die Zahlen über der Sequenz geben die Position der Nukleotide an. Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen sind der Reihe nach: UreI (bp 211 bis 795), UreE (bp 800 bis 1309), UreF (bp 1324 bis 2091), UreG (bp 2123 bis 2719) und UreH (bp 2722 bis 3516). Die potenziellen Bindungssequenzen an die Ribosomen (Shine-Dalgarno, SD-Stellen) sind unterstrichen. Die eingerahmten Sequenzen entsprechen den Sequenzen vom Promotorähnlichen Typ (σ54), und die Pfeile über der Sequenz zeigen die schleifenförmigen Strukturen mit den Elementen eines rho-unabhängigen Transkriptionsstopsignals an (Rosenberg et al. (1979), Annu. Rev. Genet. 13: 319–359). Die Punktierungen unter der Aminosäuresequenz entsprechen der DNA- (ureI) oder ATP-Bindungsdomäne des Proteins (ureG) (Higgins et al. (1985), EMBO J. 4: 1033–1040 und Pabo et al. (1984), Ann. Rev. Biochem. 53: 293–321).
5: Genetische Organisation des Urease-Operons
Die relativen Positionen der Gene, die für Polypeptide kodieren, die mit dem Urease-Operon von P. mirabilis (Jones et al. (1989), J. Bacteriol. 171: 6414–6422), von K. aerogenes (Mulrooney et al. – 1990) und von H. pylori assoziiert sind, sind angegeben. Die Prozentsätze beziehen sich auf das Verhältnis identischer Aminosäuren zwischen zwei verwandten Genen. Die weißen Rahmen repräsentieren die Gene, die einzigartig für das Operon sind.
6 und 7: Analyse der parentalen und mutierten Stämme
8: Restriktionsprofile nach enzymatischer Spaltung der Gesamt-DNAs der Stämme 85P, N6 und N6 mutiert (Urease^–)
9 und 10:
Genomische Organisation der 4 ure-Gene in den Genomen der Stämme 85P und N6. Die spezifischen DNA-Fragmente wurden ausgehend von der chromosomalen DNA amplifiziert, die aus den Isolaten 85P und N6 von H. pylori extrahiert wurde, wobei 8 Paare von Startern in Übereinstimmung mit der 10 verwendet wurden. Die Produkte der Amplifikation wurden mittels Elektrophorese auf einem Agarosegel von 1,4 % aufgetrennt. Die Werte auf jeder Seite des Gels entsprechen den Größen (in Kilobasen) der 1-kb-Leiter, die als Standard verwendet wurde.
11: Immunblot mit Hilfe von Antikörpern
12: Mutagenese mittels Transposon: Schematische Darstellung von vier aufeinanderfolgenden Schritten, die für die Konstruktion von Mutanten in einem H. pylori- Bakterium notwendig sind
Konjugation 1: Das transferierbare Plasmid pOX38 der Gruppe IncF, das das Transposon MiniTn3-Km enthält, wird in E. coli HB 101 eingeführt, das 1) das Plasmid pTCA enthält, das die Transposase Tn3 (TnpA) auf konstitutive Weise exprimiert und aufgrund der Anwesenheit der Sequenz Tn3-38bp gegenüber Tn3 immun ist, und 2) den Selbstmord-Konjugationsvektor enthält, der das klonierte Fragment von H. pylori enthält, das mutagenisiert werden soll. Die HB101-Kanamycin-Transkonjuganten werden während 48 Stunden bei 30 °C kultiviert, und die Bakterien werden mit E. coli DH1 (Na1) konjugiert.
Konjugation 2: Die Cointegrate, die aus der Transposition von MiniTn3-Km in das Plasmid, das von pILL570 abgeleitet ist, in der Abwesenheit von Resolvase resultieren, werden als konjugative Kanamycin-Cointegrate in den DH1-Zellen selektioniert.
Konjugation 3: Die Cointegrate werden in den Stamm NS2114 (Rif) eingeführt, der das Gen cre enthält, das fähig ist, mittels spezifischer Rekombination des Cointegrats eine Auflösung in zwei Replikons zu erzeugen, wobei das eine aus dem ursprünglichen Donor des Transposons (pOX38-MiniTn3-Km) besteht und das andere aus dem hybriden Plasmid besteht, das von pILL570 abgeleitet ist, in das MiniTn3-Km insertiert wurde. Die positive Selektion der aufgelösten Formen der Cointegrate wurde durch Selektion der Transkonjuganten NS2114 auf Kanamycin auf einem Medium erreicht, das 300 μg/ml Kanamycin, sowie 300 μg/ml Spectinomycin enthielt. Der letzte Schritt, der aus dem Einführen der mutierten DNA in H. pylori besteht, kann durch Elektroporieren von H. pylori mit der Plasmid-DNA durchgeführt werden, die aus E. coli NS2114 (dem Referenzstamm) extrahiert wurde, die in dem Schritt 3 erhalten wurde.
13: Restriktionskarte von MiniTn3 gemäß Seifert et al. (1986 PNAS, USA, 83: 735–739).
Der Stern zeigt in dem Plasmid pILL570 die Restriktionsstellen an, die während der Konstruktion des Vektors modifiziert wurden.
I. – IDENTIFIZIERUNG DER GENE
MATERIAL UND METHODEN
Bakterielle Stämme, Plasmide und Kulturbedingungen
H. pylori 85P wurde aus einem Patienten isoliert, der an Gastritis erkrankt war, und entspricht dem bei Labigne et al. (J. Bacteriol. 173: 1920–1931 (1991)) beschriebenen Stamm. E. coli MC1061 (Maniatis et al. (1983), Molecular cloning – a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N. Y.) wurde als Wirt in den Klonierungsexperimenten verwendet, und E. coli HB101 (HsdR hsdM reA supE44 lacZ4 LeuB6 proA2 thi-1 Sm) (Boyer et al. (1969), J. Mol. Biol. 41: 459–472) wurde als Wirt für die quantitative Analyse der Expression der Urease verwendet. Die in dieser Studie verwendeten Vektoren und Hybride sind in der Tabelle 1 aufgeführt. Die Stämme von E. coli wurden in Bouillon L ohne Glucose (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 5 g NaCl pro Liter, pH = 7,0) oder auf Schalen mit Agarmedium L (das 1,5 % Agar enthielt) bei 37 °C kultiviert. Die Antibiotika-Konzentrationen für die Selektion der Transformanten waren die folgenden (in Milligramm pro Liter): Kanamycin: 20, Tetracyclin: 8, Ampicillin: 100, Spectinomycin: 100, Carbenicillin: 100. Für die Expression der Ureaseaktivität wurden die E. coli-Bakterien in einem Medium kultiviert, das bezüglich der Konzentration der Stickstoffquelle limitierend war, das aus dem Minimal-Agarmedium M9 ohne Ammonium (pH = 7,4) bestand, das 0,4 % D-Glucose als Kohlenstoffquelle und, soweit nicht anders angegeben, 0,2 % (Gew/Vol) L-Glutamin, das durch Filtration sterilisiert und frisch hergestellt war (Pahel et al. (1982), J. Bacteriol. 150: 202–213), als Stickstoffquelle enthielt.
Molekulare Klonierung und Analysen der DNA
Die Spaltungen mit einer Restriktionsendonuklease, das Auffüllen der Enden und die anderen gebräuchlichen Manipulationen der DNA wurden gemäß den Standardtechniken von Maniatis und Koll. (Maniatis et al. (1983), Molecular cloning – a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N. Y.) durchgeführt. Die unvollständigen Spaltungen mit Sau3A wurden bei 20 °C durchgeführt, um die Enzymaktivität zu verlangsamen. Die Restriktionsendonukleasen, das große Fragment der DNA-Polymerase I, die DNA-Polymerase von T4 (die verwendet wurde, um die Enden der Fragmente stumpf zu machen) und die DNA-Ligase von T4 wurden von Amersham Corp. geliefert. Die alkalische Phosphatase aus Kalbsdarm wurde von Pharmacia geliefert. Die DNA-Fragmente wurden mittels Elektrophorese auf horizontalen Gelblöcken aufgetrennt, die 1 bis 1,4 % Agarose enthielten und in Tris-Acetat- oder Tris-Phosphat-Puffern behandelt wurden (Maniatis et al. (1983), Molecular cloning – a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N. Y.). Eine 1-kb-Leiter (Bethesda Research Laboratories) wurde als Molekulargewichtsstandard verwendet. Die Elektroeluierung der DNA-Fragmente aus den Agarosegelen, die Ethidiumbromid enthielten (0,4 μg/ml), wurde wie zuvor beschrieben (J. Bacteriol. 173: 1920–1931 (1991), Labigne et al.) durchgeführt.
Ureaseaktivität
Der Nachweis der Ureaseaktivität wurde durch Resuspendieren von 10⁹ Bakterien in 1 ml Harnstoff-Indol-Medium (Diagnostic Pasteur) und Inkubation bei 37 °C während variabler Zeitspannen durchgeführt. Die Freisetzung von Ammoniak aufgrund der Ureaseaktivität erhöhte den pH, wobei sie ein Umschlagen von Orangefarben nach Rot verursachte.
Die Ureaseaktivität wurde durch die Reaktion von Berthelot, gemäß einer zuvor beschriebenen (Ferrero et al. (1991), Microb. Ecol. Hlth. Dis. 4: 121–134) Modifizierung der Durchführungsweise gemessen. Kurz gesagt, wurden die Bakterien ausgehend von Agarmedium-Schalen in 2,0 ml steriles, 0,85%iges NaCl aufgenommen und bei 12.000 upm/min während 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Die Sedimente wurden zweimal in 0,85%igem NaCl gewaschen und in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) resuspendiert, der 10 mM EDTA enthielt (PEB). Um die mit Ultraschall behandelten Extrakte herzustellen, wurden die Zellen durch vier Impulse von 30 s mit einem Branson Sonifier Model 450 lysiert, der auf 30 W, Zyklus 50 %, eingestellt war. Die Zelltrümmer wurden vor den Bestimmungen der Urease beseitigt. Den frisch hergestellten Proben (10–50 μl) wurden 200 μl Harnstoff-Substratlösung (50 mM Harnstoff in dem PEB hergestellt) zugegeben, und sie wurden bei der gewöhnlichen Temperatur während 30 Minuten zur Reaktion gebracht. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 400 μl Phenol-Nitrosylprussiat-Reagens und 400 μl alkalisches Hypchlorit-Reagens abgestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 50 °C inkubiert. Leerwerte, in denen die Ureaseaktivität durch 5-minütiges Kochen vor der Zugabe des Substrats inaktiviert wurde, wurden auf ähnliche Weise behandelt. Die Menge des freigesetzten Ammoniaks wurde anhand einer Eichkurve bestimmt, die ein Verhältnis zwischen der A₆₂₅ und der Ammoniumkonzentration (ausgehend von NH₄Cl) herstellte. Die Freisetzung von 2 μmol Ammoniak wurde als äquivalent zu der Hydrolyse von 1 μmol Harnstoff angesehen. Die Ureaseaktivität wurde in μmol hydrolysierter Harnstoff/min/mg bakterielles Protein ausgedrückt.
Bestimmung der Proteine
Die Konzentrationen der Proteine wurden gemäß dem Test von Bradford bestimmt (Sigma Chemicals). Um die Proteine in den Gesamtzell-Extrakten zu solubilisieren, wurden die zellulären Suspensionen, die in TPE hergestellt wurden, zentrifugiert, und die Sedimente wurden in einer Lösung von Octyl-β-D-glucopyranosid resuspendiert, um eine Endkonzentration an Detergens (in dem Farbstoffreagenz) von 0,1–0,2 % (Gew/Vol) zu erhalten.
Transposon-Mutagenese und Konstruktion von Mutanten
Das Einbringungssystem MiniTn3-Km wurde verwendet, um Mutationen durch zufällige Insertion in das in pILL570 klonierte DNA-Fragment zu erzeugen.
Das von Seifert et al. (1986 PNAS USA 83: 735–739) beschriebene System MiniTn3, bei dem das Plasmid pOX38 als Donor des transposierbaren Elements eingesetzt wird und das Plasmid pTCA in trans wirkt und das Enzym Transposase Tn3 liefert (Seifert et al. 1985, Genetic Engineering Principles and Methods, Bd. 8: S. 123–134, Setlow, J. und Hollaeinder, A., Herausgeber, Plenum Press New-York), und der Stamm NS2114, der das cre-Gen enthält, das für die Rekombinase P1 kodiert, die spezifisch für die lox-Stelle ist, wurden mit den folgenden Modifikationen für die Mutagenese von DNA-Fragmenten verwendet:

i) MiniTn3 wurde verändert, indem das BglI-EcoRI-Fragment des Gens, das in dem Plasmid pTn für die β-Lactamase kodiert (Seifert et al. 1986, oben) entfernt und durch die Kanamycin-Kassette ClaI-C. jejuni (1,4 kb Länge, beschrieben von Labigne-Roussel et al. (1988, J. Bacteriol. 170: 1704–1708)) ersetzt wurde. Dieses neue Insertionselement MiniTn3-Km wurde in das, wie von Seifert et al. (1986, oben) beschriebene, transferierbare Plasmid pOX38 transponiert, wodurch das Plasmid pILL553 erhalten wurde;
ii) Der Spectinimycin-konjugative Selbstmordvektor pILL570, der zuvor von Labigne et al. (1991, J. Bacteriol. 173: 1920–1931) beschrieben wurde, wurde für die Klonierung des Fragments verwendet, das für die Mutagenese verwendet wurde. Dieser Selbstmordvektor war von pILL560 (Labigne-Roussel et al. 1988, J. Bacteriol. 170: 1704–1708) abgeleitet, dessen für die Immunität gegenüber Tn3 verantwortliche DNA-Sequenzen deletiert wurden;
iii) das Plasmid IncP, pRK212.1 des „komplementierenden Plasmids" (Figurski et al., 1979, PNAS USA 76: 1648–1652) wurde mittels Konjugation in E. coli, Stamm NS2114, eingeführt, und eine spontane Rifampicin-Mutante von NS2214, die das cre-Gen enthielt, wurde erhalten und für die Selektion der Transkonjuganten verwendet, die das Cointegrat enthielten;
iv) die wirksame Auflösung der Cointegrate (Produkte der Cointegration) wurde dank der hohen Kopienzahl des von pILL570 abgeleiteten Plasmids auf positive Weise selektioniert, indem die dritte erhaltene Mischung auf Schalen auf ein Medium, das 500 μg Kanamycin und 300 μg Spectinomycin enthielt, aufgetragen wurde.

Sequenzierung der DNA
Die entsprechenden DNA-Fragmente wurden in M13mp19 und M13mp18 (Meissing et al. (1982), Gene 19: 269–276) kloniert, um unabhängig voneinander die beiden komplementären Stränge zu lesen. Die Klone, die die Insertionsfragmente enthielten, wurden mit Hilfe von X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) und von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid identifiziert. Die Einzelstränge der rekombinanten Plasmide M13mp18 und M13mp19 wurden gemäß dem Polyethylenglycol-Verfahren (Sanger et al. (1980), J. Mol. Biol. 143: 161–178) erhalten. Die Sequenzierung wurde gemäß dem Kettenabbruchverfahren mit Didesoxynukleotiden (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467) mit Hilfe der notwendige Sequenase (United States Biochemical Corp.) durchgeführt. Die Sequenzierung der doppelsträngigen DNA wurde gleichfalls durch Kettenabbruch mit Didesoxynukleotiden mit der notwendigen Sequenase unter Verwendung von Plasmid-DNA, die über einen Cäsiumchlorid-Gradienten gereinigt war (Zhang et al. (1988), Nucleic Acids Research. 16: 1220), durchgeführt. Proben von 3 μg DNA wurden zunächst mit einer Lösung von 1 M NaOH denaturiert (Gesamtvolumen 20 μl) und anschließend mit 2 μl 2 M Ammoniumacetat (pH 4,6) neutralisiert. Die DNA wurde nach Zugabe von 60 μl 100%igem, eiskaltem Ethanol, Inkubation bei –70 °C während 10 Minuten und Zentrifugation bei 4 °C während 20 Minuten präzipitiert. Nach Waschen mit 60 μl 80%igem, eiskaltem Ethanol wurde das Sediment in 10 μl Sequenzierungspuffer, der 0,5 pmol des Starters enthielt, resuspendiert und während 3 Minuten bei 65 °C inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei der gewöhnlichen Temperatur wurde die Sequenzierung durchgeführt.
ERGEBNISSE
Nachweis der Ureaseaktivität in einem Wirtsstamm von E. coli, der das rekombinante Cosmid pILL585 enthielt
Transformanten von E. coli, die das Cosmid pILL585 enthielten, wurden auf Glucose enthaltendem Minimalmedium M9, dem 0,2 % L-Glutamin (als einzige Stickstoffquelle) zugesetzt wurden, oder Medium L ausgestrichen und bei 37 °C während 48 Stunden inkubiert. Die Transformanten wurden danach mittels eines qualitativen kolorimetrischen Tests, der in Harnstoff-Indol-Medium durchgeführt wurde, auf die Ureaseaktivität gescreent. Die Aktivität wurde nur in den Transformanten von E. coli HB 101 beobachtet, die mehreren Passagen (mehr als 5 Passagen) auf dem Minimalmedium bei 37 °C unter Aerobiose-Bedingungen unterzogen worden waren. Dies sind somit die Bedingungen, die für die qualitative Bestimmung der Expression der Urease in den Klonen von E. coli verwendet wurden. Keine Ureaseaktivität wurde in den Transformanten nachgewiesen, die auf einem Medium kultiviert wurden, das reich an Stickstoff war.
Die Transformation des Stammes E.coli HB101 mit dem Plasmid pILL590, das ein Fragment von 4,2 kb enthält, das als die Minimalregion identifiziert wurde, die für die Expression der Urease in C. jejuni erforderlich ist (Labigne et al. (1991), J. Bacteriol. 173: 1920–1931), in die Zellen von E. coli, auch nach Kultivierung und Passagen in ein Milieu, das die Konzentration der Stickstoffquelle begrenzt. Dies deutet darauf hin, dass die Gene, die auf dem Cosmid vorhanden sind, aber in dem Plasmid pILL590 fehlen, für die Expression der Urease in E. coli erforderlich sind.
Subklonierung der Gene, die für die Ureaseaktivität in einem Stamm von E. coli erforderlich sind
In der Abwesenheit einer nachweisbaren Ureaseaktivität in dem Stamm von E. coli, der das rekombinante Plasmid pILL590 enthält, wurde das Insertionsfragment von 34 kb des Cosmids pILL585 einer unvollständigen Spaltung mit der Endonuklease Sau3A unterzogen, um Fragmente zwischen 7 und 12 kb herzustellen. Sie wurden mit der alkalischen Phosphatase behandelt, um jede Neuordnung des ursprünglichen Genoms zu vermeiden, und an das mit BamHI linearisierte Plasmid pILL570 ligiert. Nach der Transformation in E. coli HB101 wurde jede gegenüber Spectinomycin resistente Transformante einem weiteren Test ihrer Fähigkeit, die Urease unter Induktionsbedingungen zu hydrolysieren, unterzogen. Ein Klon zeigte einen Ureasepositiven Phänotyp. Er enthielt ein rekombinantes Plasmid, das pILL753 genannt wurde. Dieses Plasmid enthielt ein Insertionselement von 11,2 kb. Die BamHI- und HindIII-Erkennungsstellen wurden relativ zu den nur einmal vorkommenden Restriktionsstellen EcoRI und PstI des Vektors pILL570 kartiert (1). Der Vergleich der Restriktionskarte des Plasmids pILL753 mit derjenigen des zuvor beschriebenen rekombinanten Plasmids pILL590 zeigte, dass das Insertionsfragment von pILL753 ein zusätzliches DNA-Fragment von 4,6 kb aufwies, das stromabwärts der vier Gene der Urease, die zuvor in dem Plasmid pILL590 identifiziert wurden (das heißt ureA, ureB, ureC und ureD) angeordnet ist.
Optimierung der Ureaseaktivität in E.coli HB 101
Um die Kulturbedingungen zu definieren, die die optimale Expression der Gene der Urease von H. pylori in E. coli sicherstellen, wurde die Aktivität von Klonen, die pILL753 enthielten, nach der Kultivierung in einem Minimalmedium, dem verschiedene Stickstoffquellen zugesetzt wurden, quantitativ ausgewertet. In allen Fällen wurde ein festes minimales Basalmedium verwendet, denn Studien hatten gezeigt, dass die Ureaseaktivität in den Kulturen, die in einem Flüssigmedium durchgeführt wurden, sehr schwach war.
Die relativen Aktivitäten der Kulturen auf Medien, die mit L-Arginin, L-Glutamin, L-Glutamat, NH₄Cl und Harnstoff komplettiert waren (jedes in einer Endkonzentration von 10 mM) betrugen jeweils: 100 %, 36 %, 27 %, 46 % und 20 %.
Die Ureaseaktivität war in den Kulturen optimal, die in einem Medium durchgeführt wurden, dem L-Arginin zugesetzt wurde. Die Ureaseaktivität wurde nicht in den Kulturen nachgewiesen, die in einem Medium durchgeführt wurden, das reich an Stickstoff war.
Obwohl die Anwesenheit von freien Ni²⁺-Ionen eine Auswirkung auf die Stimulation der Ureaseaktivität haben kann (Mulrooney et al. (1989), J. Gen. Microbiol. 135: 1769–1776 und Mobley et al. (1989), Microbiol. Rev. 53: 85–108), zeigten sich dies nicht bei der Ureaseaktivität der Zellen, die pILL753 enthielten.
Die Analyse im Laufe der Expression der Urease in dem Klon von E. coli, der pILL753 enthielt, der unter verschiedenen Bedingungen kultiviert wurde, zeigte, dass die maximale Ureaseaktivität nach 3 Tagen aerober Kultur bei 37 °C in einem Minimalmedium erhalten wurde, dem L-Arginin zugesetzt wurde (2). Die Ureaseaktivität in den Kulturen, die in einem stickstoffreichen Medium durchgeführt wurden, war nach der Kultivierung bei Mikroaerobiose besser. Dagegen besaßen mikroaerobe Bedingungen eine Repressionswirkung auf die Aktivitäten der Kulturen, die bezüglich des Stickstoffs beschränkt waren.
Die Ureaseaktivität der E. coli-Zellen, die pILL753 enthielten, in Kultur unter aeroben Bedingungen während 3 Tagen bei 37 °C in einem Minimalmedium, dem Arginin zugesetzt wurde, betrug 0,9 ± 0,4 μmol hydrolysierter Harnstoff pro Minute, pro mg Protein. Zum Vergleich hydrolysierte das Isolat von H. pylori, das verwendet wurde, um die Gene der Urease zu klonieren, den Harnstoff mit einer Rate von 23,2 ± 2,3 μmol/min/mg Protein.
Identifizierung und Lokalisierung der erforderlichen Gene für die Ureaseaktivität in einem Wirtsstamm von E. coli
Um die für den Urease-positiven Phänotyp erforderliche DNA-Region zu bestimmen, wurden zuerst Derivate von pILL753, die das transponierbare Element MiniTn3-Km trugen, gemäß einer zuvor beschriebenen Vorgehensweise (siehe Material und Methoden) isoliert. Transformanten von E. coli HB101, die die Transposons enthielten, wurden alle auf die Ureaseaktivität gescreent. Sie wurden pILL753::x genannt, worin x die Insertionsstelle von MiniTn3-Km bezeichnet, wie sie auf der Karte der 1 erscheint. Von den 24 Insertionen, die für die Analyse ausgewählt wurden, hatten 10 Derivate die Fähigkeit Harnstoff zu hydrolysieren vollständig verloren (2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13 und 14), während 14 den Urease-positiven Phänotyp bewahrten. Diese Ergebnisse bestätigen, dass jede Mutation durch Insertion, die eine Kartierung aufweist, die den Genen ureA oder ureB entspricht (Mutanten 2, 3, 4, 5 und 6), die Ureaseaktivität beseitigt, aber zeigen gleichfalls, dass ein DNA-Fragment von 2,6 kb, das weiter stromabwärts des ureB-Gens angeordnet ist, für die Expression eines Urease-positiven Phänotyps in E. coli, das unter Stickstoff-begrenzenden Bedingungen kultiviert wird, notwendig ist. Dagegen hat sich ein DNA-Fragment von 600 bp, das unmittelbar stromabwärts des ureB-Gens angeordnet ist, aufgrund der Ergebnisse betreffend die Transposon-Mutagenese nicht als essenziell für die Expression der Ureaseaktivität in E. coli erwiesen.
Zusätzliche Analysen, die das Einführen von Deletionen in das Insertionsfragment pILL753 umfassten, wurden durchgeführt, um die erforderlichen Bedingungen für die Expression einer aktiven Urease in den Zellen von E. coli besser zu verstehen. Subklone von E. coli, die die Plasmid-Derivate enthielten, bildeten den Gegenstand einer quantitativen Bestimmung der Ureaseaktivität unter den weiter oben definierten, Stickstoff-limitierenden Bedingungen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengefasst. Alle Subklone waren Derivate des gleichen Vektors pILL570, so dass die Ergebnisse verglichen werden können. Einer von ihnen, das Plasmid pILL768, wurde durch Selbstreligation des großen EcoRI-Fragments erhalten, das ausgehend von dem Produkt der Spaltung des Plasmids pILL753::16 durch ein Restriktionsenzym hergestellt wurde (1). Diese Konstruktion führte zu einer Deletion von 2,95 kb am 3'-Ende des Insertionssegments pILL753. Die Zellen, die dieses Plasmid enthalten, exprimieren eine vergleichsweise schwache Ureaseaktivität (Tabelle 2). Das Plasmid pILL763 wurde durch Klonieren des ClaI-PstI-Restriktionsfragments des Plasmids pILL753::1 in den linearisierten Vektor pILL570 erhalten. Diese Konstruktion, in der ein DNA-Fragment von 1,75 kb, das die zuvor beschriebenen Gene ureC und ureD enthielt, unterdrückt wurde, exprimierte eine annähernd zweifach stärkere Ureaseaktivität als diejenige der Zellen, die pILL753 enthielten. In keinem Fall haben Deletionen oder Insertionen zu einer konstitutiven Ureaseaktivität geführt.
Analyse der Sequenz der für die Expression der Urease in E. coli erforderlichen Region
In dem für die Expression der Urease in E. coli erforderlichen Fragment von 11,2-kb wurde gemäß der Strategie der 3 ein DNA-Fragment von 3,2 kb identifiziert, das unmittelbar stromabwärts des ureB-Gens angeordnet ist.

i) Die 1,2-kb-HindIII- und 1,3-kb-BamHI-HindIII-Fragmente wurden unabhängig voneinander nach: a) der Klonierung der oben genannten Restriktionsfragmente, b) der SpHI-BamHI-, SpHI-HindIII-Fragmente, c) der BamHI-HindIII-Fragmente der Plasmide pILL753::12, pILL753::11, pILL753::10 in die DNA der Phagen M13mp18 und M13mp19 sequenziert;
ii) die 1,2-kb-HindIII-, 3,8-kb-BamHI-PstI- und 1,3-kb-BamHI-PvuII-Restriktionsfragmente, die von den (zuvor beschriebenen) Plasmiden pILL753 und pILL589 abstammen, wurden in die DNA der Phagen M13mp18 und M13mp19 kloniert;
iii) zwölf Oligonukleotidstarter wurden synthetisiert, um das Gelesene zu bestätigen und Sequenzen zu erzeugen, die die drei unabhängig voneinander sequenzierten Fragmente überlappen. Diese Starter wurden für Sequenzanalysen doppelsträngiger DNA verwendet.

Die Analyse der Sequenz hat fünf offene Leserahmen (ORFs) aufgedeckt, die ureI, ureE, ureF, ureG und ureH genannt wurden. Diese Gene werden alle in der gleichen Richtung transkribiert, und es wird vorhergesehen, dass sie für Peptide von 195, 170, 256, 199 und 265 Aminosäuren kodieren. Kein ORF von nennenswerter Länge wurde auf dem inversen Komplement der in der 4 gezeigten Sequenz beobachtet. Die fünf ORFs beginnen mit dem charakteristischen Startkodon ATG. Vier der fünf ORFs gingen Stellen voraus, die der Konsensus-Bindungssequenz an das Ribosom (Shine-Dalgarno) von E. coli ähnlich waren (Shine et al. (1974), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 1342–1346).
Die Regionen stromaufwärts jedes ORF waren der Gegenstand einer Suche nach der Anwesenheit der Stellen der Stickstoffregulation mit der Sequenz TGGYAYRN₄YYGCZ, in der Y = T oder C, R = G oder A und Z = A oder T (Morett et al. (1989), J. Mol. Biol. 210: 65–77). Eine einzige Stelle wurde bei 210 bp stromaufwärts des ureG-Locus gefunden. Ihre genaue Position ist in der 4 dargestellt. Konsensussequenzen vom Promotortyp von E. coli (σ70), wurden stromaufwärts der Gene ureI, ureF und ureH beobachtet (TTGACA, –35, und TATAAT, –10).
Tabelle 2: Mutagenese der klonierten DNA von H. pylori und Auswirkung auf die Ureaseaktivität in den Klonen von E. coli HB101, die unter Stickstofflimitierenden Bedingungen kultiviert wurden

(1) Bakterien, die in einem aeroben Milieu während drei Tagen in dem Minimalmedium M9, das mit 0,01 M L-Arginin komplettiert war, bei 37 °C kultiviert wurden.
(2) Zum Vergleich betrug die Ureaseaktivität von H. pylori 85P, dem Isolat, aus dem die DNA kloniert wurde, 23 ± 2,3 μmol Harnstoff/min/mg Protein.
(3) Es wurde keine Ureaseaktivität nachgewiesen.
(4) Ergebnis für eine Einzelmessung: 0,73
(5) Ergebnis für eine Einzelmessung: 0,10

DISKUSSION
Vorliegend wird der erste Fall einer funktionellen Expression von Genen, die aus H. pylori stammen, in Stämmen von E. coli vorgestellt.
Dies war möglich, indem Zellen von E. coli, die das bezüglich der Urease rekombinante Cosmid pILL585 enthielten(Labigne et al., 1991, siehe oben), auf einem Minimalmedium kultiviert wurden, das eine begrenzende Stickstoffquelle enthielt. Die erhaltenen Ergebnisse erlaubten es zu zeigen, dass die Gene der Urease von H. pylori unter der Kontrolle des Stickstoff-Regulationssystems (NTR) stehen konnten; und dass die Ureaseaktivität in den Zellen von E. coli von der Gegenwart einer Gruppe von Genen abhing, die auf den vorstehenden Seiten beschrieben wurden. Diese Gruppe von Genen war unmittelbar stromabwärts der vier Gene ureA, ureB, ureC und ureD angeordnet, die in der oben genannten Publikation von Labigne et al., 1991, beschrieben wurden. Diese neuen Gene sind auf einem Fragment von 3,2 kb angeordnet, das fünf offene Leserahmen enthält, die als ureI, ureE, ureF, ureG und ureH bezeichnet werden.
Die Verwendung von Insertionsmutationen und von Deletionen bei dem DNA-Fragment von 11,2 kb (pILL753), das aus dem Ursprungscosmid subkloniert wurde, hat es ermöglicht zu zeigen, dass die Gene ureA, ureB, ureF, ureG und ureH notwendig für die Expression der Ureaseaktivität in E. coli waren. Im Gegensatz dazu beeinflussten Insertionsmutationen im Inneren des Gens ureI die Ureaseaktivität in den Zellen von E. coli nicht in merklicher Weise. Die Deletion des Gens ureC und des Gens ureD (wie in dem Plasmid pILL763) führte zu Aktivitäten, die signifikant stärker waren als diejenigen, die in den Zellen erhalten wurden, die die Plasmide mit den intakten Loci trugen, was auf eine Regulatorrolle dieser Region des Genclusters der Urease von H. pylori hindeutet.
Es erschien als klar, dass pILL753 wahrscheinlich nicht die Gesamtheit der erforderlichen Elemente für die vollständige Expression der Urease enthält. Der Hauptbeweis dafür ist, dass: zum einen die Zellen von E. coli, die pILL753 enthielten, eine annähernd 25fach schwächere Ureaseaktivität aufwiesen als diejenige des Isolats von H. pylori, das als Ursprung für die Klonierung verwendet wurde; zum anderen führte die Deletion der Region stromabwärts von ureH (pILL768) zu einer beträchtlichen Verringerung der Ureaseaktivität. Es ist interessant zu bemerken, dass C. jejuni die Anwesenheit einer geringeren Anzahl von Genen für die Enzymexpression im Vergleich zu den bei E. coli erhaltenen Ergebnissen erfordert. Folglich muss C. jejuni fähig sein, die Funktionen der klonierten Gene von H. pylori zu komplemenieren.
Die Notwendigkeit akzessorischer Gene wurde gleichermaßen für Providencia stuartii (Mulrooney et al. (1988), J. Bacteriol. 170: 2202–2207), ein Urease-positives E. coli (Collins et al. – 1988), Klesiella pneumonia (Gerlach et al. (1988), FEMS Microbiol. Lett. 50: 131–135), Proteus vulgaris (Mörsdorf et al. (1990), FEMS Microbiol. Lett. 66: 67–74), Staphylococcus saprophyticus (Gatermann et al. (1989), Infect. Immun. 57: 2998–3002), Klebsiella aerogenes (Mulrooney et al. – 1990) und Proteus mirabilis (Jones et al. (1989), J. Bact. 171: 6414–6422 und Walz et al. (1988), J. Bacteriol. 170: 1027–1033) gezeigt.
Die 5 zeigt einen Vergleich von drei Regionen, die bei mehreren Bakterienspezies für die Urease kodieren, und zeigt die Ähnlichkeiten, sowie die Besonderheiten von jeder. Der Grad der Verwandtschaft in Form der genetischen Organisation und von kodierten Polypeptiden ist zwischen P. mirabilis und K. aerogenes stärker als für jedes von diesen im Vergleich zu H. pylori. Während das Polypeptid UreG von H. pylori eine starke Ähnlichkeit mit demjenigen von K. aerogenes aufwies (92 % Konservierung und 59 % Identität) betrugen die Grade der (Konservierung und Identität) zwischen den Polypeptiden UreE und UreF von H. pylori und K. aerogenes: (33 % und 14 %) bzw. (44 % und 11,6 %). Mulrooney et al. stellten fest, dass die Gene von K. aerogenes, die für die akzessorischen Proteine UreE, UreI und UreG kodieren, an der Aktivierung des Apoenzyms durch Inkorporation von Nickel in Untereinheiten der Urease beteiligt sind. Aufgrund der Tatsache der Anwesenheit von Serien von Histidinresten an dem carboxyterminalen Ende des Polypeptids UreE von Klebsiella und von Proteus haben Mulrooney et al. vorgeschlagen, dass UreE mit dem Nickel interagieren könnte, um es anschließend auf das Apoenzym zu übertragen. Eine solche Serie von Resten wurde weder in dem Polypeptid UreE von H. pylori gefunden noch in irgend einem anderen der Produkte der Ureasegene.
Die Ähnlichkeitsrecherche zwischen der Aminosäuresequenz, die von den Genen der Urease von H. pylori abgeleitet wurde, und den Konsensus-Sequenzen, die an einer DNA-Bindungsstelle (Pabo et al. – 1981) oder an ATP-Bindungsstellen (Higgins et al. – 1985) beteiligt sind, hat die Identifizierung einer DNA-Bindungsstelle innerhalb des Produkts des ureI-Gens (4) ermöglicht. Außerdem existiert eine gut konservierte ATP-Bindungsstelle (-GVCGSGKT-) an dem NH2-terminalen Ende des Produkts des ureG-Gens.
Die Region der Urease von H. pylori weist bestimmte, einzigartige Elemente auf, die die folgenden sind: zunächst die Gene ureC, ureD, ureI, die einzigartig für H. pylori sind. Schließlich besteht die Region der Urease aus drei Blöcken von Genen, die in der gleichen Richtung transkribiert werden und eine intergenische Region von 420 bp zwischen ureD und ureA und 200 bp zwischen ureB und ureI aufweisen. Dies deutet auf eine besondere genetische Organisation bei H. pylori hin, in der die drei Blöcke von Genen unabhängig voneinander reguliert werden können.
Es wird allgemein angenommen, dass die Synthese der Urease durch H. pylori in konstitutiver Weise erfolgt. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten dahin, dass die Expression der Gene der Urease von H. pylori tatsächlich unter der Kontrolle eines Regulationssystems stehen könnte. Tatsächlich befindet sich die Expression der Ureasegene von H. pylori, wenn sie einmal in E. coli transferiert wurden, vollständig unter der Kontrolle des Stickstoffregulationssystems (NTR). Es ist möglich, dass die Gene der Urease von H. pylori in direkter Weise von der Synthese der Produkte der Gene ntrA, ntrB, ntrC von E. coli abhängen, aber es kann nicht ausgeschlossen werden, dass sie von der Expression eines oder mehrerer anderer Gene abhängen, die für (ein) regulatorische(s) Proteine) kodieren, das (die) analog zu den ntr-Produkten von E. coli ist (sind). Aufgrund dieser Daten kann angenommen werden, dass physiologische Parameter, wie die Gegenwart eines festen Mediums oder einer microaerophilen Atmosphäre, eine Rolle bei der Expression der Urease bei H. pylori in vitro oder in vivo spielen kann.
II. HERSTELLUNG VON MUTANTENSTÄMMEN

– Stämme, die für die Elektroporationsexperimente verwendet wurden: mehrere aus Biopsien isolierte Stämme wurden auf ihre Eignung getestet, elektroporiert zu werden, einschließlich des Stamms 85P, der in der oben zitierten Publikation von Labigne et al.
– 1991 beschrieben wurde, ausgehend von dem die anfängliche Klonierung der Gene der Urease durchgeführt wurde. Ein einziger, N6 genannter Stamm, der bei der CNCM unter der Nummer I-1150 am 3. Oktober 1991 hinterlegt wurde, ergab positive Ergebnisse.
– Herstellung der Mutanten in dem klonierten Fragment des Chromosoms von H. pylori, Stamm 85P: Die Mutanten werden durch Mutagenese mit Hilfe eines Transposons (MiniTn3-Km) hergestellt, das die zufällige Insertion des Elements erlaubt (Transpositionselement). Die Insertionsstelle jedes der Transpositionselemente wurde durch Restriktionsanalysen der abgeleiteten Plasmide definiert (vgl. 1).
– Elektroporation: 10¹⁰ Zellen von H. pylori wurden auf Blutagar-Medium (10 % Pferdeblut) geerntet, in einer Lösung von Glycerin/Saccharose (15 % Vol/Vol und 9 % Gew/Vol) gewaschen und in einem Volumen von 50 μl bei 4 °C resuspendiert. 500 ng Plasmid-DNA, die über CsCl gereinigt und nachfolgend gegen destilliertes Wasser dialysiert war, wurde in einem Volumen von 1 μl zu den Zellen bei 4 °C zugegeben. Nach einer Minute auf Eis wurden die DNA-Zellen in eine auf –20 °C vorgekühlte Elektroporationsküvette (BioRad Ref: 165–2086, mit 0,2 cm Breite) transferiert, anschließend in das „Gene Pulser Apparatus – BioRad" Gerät gestellt, bei dem die folgenden Parameter eingestellt wurden: 25 F, 2,5 kV und 200 Ohm. Nach der Verabreichung eines elektrischen Impulses mit Zeitkonstanten 4,5 bis 5 msec wurden die Bakterien in 100 μl SOC-Puffer (2 % Bacto-Trypton, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM Glucose) resuspendiert und auf nicht-selektives Blutagar-Medium (ohne Kanamycin, aber enthaltend Vancomycin, Trimethoprim, Polymyxin, Nalidixinsäure, Amphotericin B) während 48 Stunden bei 37 °C unter mikroaerophiler Atmosphäre inokuliert. Danach wurden die Bakterien geerntet, in einem Volumen Brucella-Medium (0,5 ml) resuspendiert, und 100 μl der Suspension wurden auf Schalen mit selektivem Blutagar-Medium (das 20 μg/ml Kanamycin und den oben beschriebenen Antibiotika-Cocktail enthielt) ausgestrichen. Das Wachstum von transformierten und gegen Kanamycin resistenten Bakterien erschien nach 4 Tagen der Inkubation bei 37 °C in mikroaerophiler Atmosphäre.

Die weiteren Techniken, die PCR, Southern und Western einschließen, sind klassische Techniken.
ERGEBNISSE
Zwei Mutationen, die durch Insertion von MiniTn3-Km in das Gen ureB hergestellt wurden, das auf dem Plasmid pILL753 vorhanden war, wurden im Detail untersucht. Es handelt sich um die mit 3 und 4 nummerierten Mutationen. Die genaue Position jeder der Insertionen ist in der 6 angegeben. Die Plasmide, die diesen Insertionen entsprechen, wurden präpariert, gereinigt und konzentriert. Es wurden gegen Kanamycin resistente Bakterien erhalten, die alle Merkmale des Stamms H. pylori N6 aufwiesen, der für die Elektroporation verwendet wurde; sie waren vollständig unfähig, Harnstoff zu hydrolysieren.
Kontrollen erlaubten es zu bestätigen, dass der Mutantenstamm ein isogener Stamm ist:

– Obwohl sie „Urease-negativ" sind, weisen die Stämme die charakteristischen biochemischen Eigenschaften der Bakterien auf, die zu der Spezies H. pylori gehören (Oxidase, Katalyse, Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff);
– Die Mutterbakterien (N6) (CNCM Nr. I-1150) und die isogenen Bakterien N6::TnKm-3 und N6::TnKm-4 weisen nach der enzymatischen Spaltung der Gesamt-DNAs die gleichen Restriktionsprofile auf (vgl. 8);
– Nach der enzymatischen Amplifizierung mit Hilfe der spezifischen Primer für H. pylori und der Sequenzierung des amplifizierten Produkts wurden die gleichen Nukleotidsequenzen gefunden, wogegen unabhängige Stämme von H. pylori niemals die gleiche Sequenz zeigen, sondern im Gegenteil einen beträchtlichen Genpolymorphismus;
– Die Analyse mittels Southern-Typ-Hybridisierung der BamHI- und HindIII-Restriktionsprofile der DNA der Eltern- und mutierten Stämme belegt den Austausch der Gene (7 und ihre Interpretation, 6).
Eine der aufgetretenen Schwierigkeiten stammt daher, dass der transformierte Stamm (N6) nicht derjenige ist, aus dem die Gene der Urease kloniert wurden, wobei letzterer Stamm der Stamm 85P ist, und dass die HindIII- und BamHI-Restriktionsstellen von einem Stamm zum nächsten nicht konserviert sind: Eine Sonde, die dem 8,1-kb-Fragment entspricht, das von pILL590 abstammt (1), zeigt deutlich HindIII-Restriktionsprofile, die sich zwischen N6 und 85P unterscheiden (9), insbesondere durch das Fehlen der Fragmente von 1,25 kb und 1,15 kb. Dagegen sind die 4,1-kb-HindIII- und 5,1- und 1,3-kb-BamHI-Fragmente konserviert. Folglich wurde durch enzymatische Amplifikation (PCR) mit Hilfe von Oligonukleotiden, die über die gesamte Region verteilt waren, die den Genen ureA, ureB, ureC und ureD entspricht, bestätigt, dass die in der 10 gezeigten Amplifikationsprodukte 1 bis 6 in den beiden Stämmen die gleichen waren und dass das Fehlen der HindIII-Restriktionsstellen den Genpolymorphismus und nicht eine größere Umlagerung der Ureaseregion wiederspiegelte. Nach dieser Überprüfung ist es möglich, widerspruchsfrei den Genaustausch des Wildtypallels durch das mutierte Allel in den beiden erzeugten Mutanten zu bestätigen.
– Schließlich wurde durch Immunblotten mit Hilfe von anti-Urease- oder von im Kaninchen hergestellten anti-H. pylori- oder von in dem Serum von Patienten, die mit H. pylori infiziert waren, vorhandenen anti-H. pylori-Antikörpern bestätigt, dass die mutierten Stämme N6::TnKm-3 und N6::TnKm-4 das Polypeptid von 61 kDa, das von dem ureB-Gen kodiert ist, nicht mehr exprimierten und dass somit das ureB-Gen dieser Stämme disruptiert worden war (11).

Claims

Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um (a) eine oder mehrere der Nukleotidsequenzen, die aus den ureE, ureF, ureG, ureH und ureI genannten, wie in der 4 gezeigten Genen bestehen, oder (b) eine Sequenz von wenigstens 15 Nukleotiden, die für jeden Teil eines der Polypeptide UreE, UreF, UreG, UreH oder UreI kodiert, das von gegen H. pylori gerichteten Antikörpern erkannt wird oder fähig ist, sich wie ein Hapten oder ein Immunogen zu verhalten, (c) eine Sequenz von wenigstens 15 Nukleotiden, die homolog zu einer Sequenz eines wie in (a) definierten Gens ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI ist und unter stringenten Bedingungen mit dieser Sequenz hybridisiert, wobei die homologe Sequenz durch Deletion, Addition, Substitution oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in der Weise modifiziert ist, dass das von dieser modifizierten Sequenz kodierte Polypeptid einen gleichen Beitrag zu der Bildung einer funktionellen Urease bei H. pylori bewahrt wie der, der für das entsprechende Polypeptid beobachtet wird, das von der nicht-modifizierten Sequenz des Gens ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI kodiert wird, wie es bei H. pylori exprimiert wird, (d) eine komplementäre Sequenz einer der in (a), (b) oder (c) definierten Nukleotidsequenzen handelt.
Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus der Gruppe der Nukleotidsequenzen der wie in der 4 gezeigten Gene ureE, ureF, ureG, ureH und ureI besteht oder der von Nukleotidsequenz-Varianten gebildeten Gruppe, die diesen Genen entspricht, die durch Deletion, Addition, Substitution oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide unabhängig voneinander in der Weise modifiziert sind, dass die Gruppe dieser Varianten für Polypeptide kodiert, die einen gleichen Beitrag zu der Bildung einer funktionellen Urease bei H. pylori bewahren wie der, der mit der Gruppe der entsprechenden, von den nicht-modifizierten Sequenzen der Gene ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI kodierten Polypeptide beobachtet wird, wie sie bei H. pylori exprimiert werden, oder einer komplementären Sequenz einer der oben definierten Sequenzen.
Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Sequenz mit einer Länge von wenigstens 15 Nukleotiden handelt, die unter stringenten Bedingungen mit einer Sequenz eines Gens ureE, ureF, ureG oder ureH nach Anspruch 1 hybridisiert, oder deren komplementäre Sequenz, wobei die Sequenz durch Deletion, Addition, Substitution oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in der Weise modifiziert ist, dass diese Sequenz die Expression einer funktionellen Urease bei einem Stamm von H. pylori nicht erlaubt, der durch allelischen Austausch seiner Wildtyp-Sequenz durch die genannte entsprechende Nukleotidsequenz mutiert ist.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie für die Expression der funktionellen Urease in Zellen von E. coli erforderlich ist, die zuvor mit den Strukturgenen ureA, ureB, ureC und ureD transformiert wurden.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit den Nukleinsequenzen assoziiert ist, die den Strukturgenen ureA und ureB entsprechen, die für die Urease-Untereinheiten bei H. pylori kodieren.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit den für die Urease bei H. pylori kodierenden Genen ureA, ureB, ureC und/oder ureD assoziiert ist.
Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die Kette ureE handelt, die den Nukleotiden 800 bis 1309 der Sequenz der 4 entspricht, oder um jedes Fragment dieser Kette, sofern es unter stringenten Bedingungen mit der Kette ureE oder mit der komplementären Sequenz hybridisiert.
Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die Kette ureF handelt, die den Nukleotiden 1324 bis 2091 der Sequenz der 4 entspricht, oder um jedes Fragent dieser Kette, sofern es unter stringenten Bedingungen mit der Kette ureF oder mit der komplementären Sequenz hybridisiert.
Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die Kette ureG handelt, die den Nukleotiden 2123 bis 2719 der Sequenz der 4 entspricht, oder um jedes Fragment dieser Kette, sofern es unter stringenten Bedingungen mit der Kette ureG oder mit der komplementären Sequenz hybridisiert.
Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die Kette ureH handelt, die den Nukleotiden 2722 bis 3516 der Sequenz der 4 entspricht, oder um jedes Fragment dieser Kette, sofern es unter stringenten Bedingungen mit der Kette ureH oder mit der komplementären Sequenz hybridisiert.
Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die Kette ureI handelt, die den Nukleotiden 211 bis 795 der Sequenz der 4 entspricht, oder um jedes Fragment dieser Kette, sofern es unter stringenten Bedingungen mit der Kette ureI oder mit der komplementären Sequenz hybridisiert.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die folgende Nukleotidkette handelt oder dass sie diese Kette umfasst: GCG AAA ATA TGC TAT GAA ATA GGA AAC CGC CAT.
Nukleotidsonde, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Nukleotidsequenz nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12 besteht, wobei die Sequenz markiert ist.
Nukleotidstarter, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Nukleotidfragment mit einer Sequenz nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12 umfasst, wobei das Fragment in etwa 18 bis in etwa 30, vorzugsweise in etwa 25 bis in etwa 30 Nukleotide umfasst und fähig ist, an die 5'- und 3'-Enden eines Nukleotidfragments zu hybridisieren, das spezifisch für wenigstens ein Gen, ausgewählt aus ureE, ureF, ureG, oder ureH ist, zur Verwendung in einer Genamplifikations-Reaktion.
Verwendung eines Starters nach Anspruch 14 für den In-vitro-Nachweis einer Infektion durch H. pylori, ausgehend von einer biologischen Probe und nach Genamplifikations-Reaktionen.
Verwendung einer Sonde nach Anspruch 13 für den In-vitro-Nachweis einer Infektion durch H. pylori in einer biologischen Probe, gegebenenfalls nach Genamplifikations-Reaktionen.
Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um i) eines der in 4 gezeigten Polypeptide UreE, UreF, UreG, UreH oder UreI, oder ii) jeden Teil wenigstens eines der in (i) definierten Polypeptide, der einen eigenen Beitrag zu der Bildung einer funktionellen Urease bei H. pylori bewahrt wie der, der bei den entsprechenden nicht-modifizierten, wie bei H. pylori exprimierten Polypeptiden UreE, UreF, UreG, UreH und UreI beobachtet wird, iii) jeden Teil wenigstens eines der in (i) definierten Polypeptide, der von gegen H. pylori gerichteten Antikörpern erkannt wird oder fähig ist, sich wie ein Hapten oder ein Immunogen zu verhalten, handelt.
Polypeptid nach Anspruch 17, das durch Deletion, Addition, Substitution oder Inversion einer oder mehrerer Aminosäuren modifiziert ist, sofern es einen eigenen Beitrag zu der Bildung einer funktionellen Urease bei H. pylori bewahrt wie der, der bei den Polypeptiden UreE, UreF, UreG, UreH und UreI beobachtet wird, wie sie bei H. pylori exprimiert werden.
Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Sequenz nach Anspruch 3 enthält.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Cosmid oder um ein Plasmid handelt.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das in E. coli HB101 enthaltene, bei der CNCM am 3. Oktober 1991 unter der Nummer I-1148 hinterlegte Plasmid pILL753 handelt.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das in E. coli HB101 enthaltene, bei der CNCM am 3. Oktober 1991 unter der Nummer I-1149 hinterlegte Plasmid pILL763 handelt.
Rekombinanter Stamm von H. pylori, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Mutation auf der Stufe wenigstens eines Gens aufweist, das aus den in der 4 gezeigten Genen ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI ausgewählt ist, unter solchen Bedingungen, dass der rekombinante Stamm einen Urease-negativen Phenotyp exprimiert oder eine Verringerung der Ureaseaktivität im Vergleich zu dem gleichen, nicht-mutierten Stamm aufweist.
Rekombinanter Stamm von H. pylori nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass er auf der Stufe des Gens ureG mutiert ist.
Rekombinanter Stamm von H. pylori nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um den mutierten Stamm N6 (NCIMB Nr. 40512) handelt.
Rekombinanter Stamm von H. pylori nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 3 umfasst.
Rekombinanter Stamm von H. pylori nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Stamm N6 handelt, der auf der Stufe wenigstens eines der Gene ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI durch allelischen Austausch seiner Wildtyp-Sequenz durch die modifizierte entsprechende Sequenz nach Anspruch 3 in der Weise mutiert ist, dass seine Ureaseaktivität im Vergleich zu dem gleichen nicht-mutierten Stamm abgeschwächt ist.
Rekombinanter zellulärer Wirt, verschieden von H. pylori, dadurch gekennzeichnet, dass er mit einer Sequenz nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12 oder einem rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 19 bis 22 unter Bedingungen, die seine Expression in dem Wirt erlauben, transformiert ist.
Rekombinanter zellulärer Wirt nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen rekombinanten Stamm von E. coli handelt.
Immunogene Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen rekombinanten zellulären Wirt nach einem beliebigen der Ansprüche 28 bis 29 oder einen rekombinanten Stamm von H. pylori nach einem beliebigen der Ansprüche 23 bis 27 enthält.
Kit für die In-vitro-Diagnose einer Infektion durch H. pylori in einer bestimmten biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – wenigstens ein Paar Nukleotidstarter nach Anspruch 14, die fähig sind, an die 5'- und 3'-Enden eines spezifischen Nukleotidfragments wenigstens eines Gens ausgewählt aus ureE, ureF, ureG, ureH oder ureI zu hybridisieren, – erforderliche Reagenzien für die Extraktion von Nukleinsäuren, ausgehend von der behandelten Probe, – Reagenzien für die Durchführung der Polymerisation des Nukleotidfragments, ausgehend von den Nukleotidstartern, inbesondere Polymerisierungsenzyme, in ausreichender Menge, um die Amplifizierung des Fragments durchzuführen, das man zu amplifizieren wünscht, – wenigstens eine Nukleotidkette, die als Sonde verwendet werden kann und fähig ist, unter bestimmten Bedingungen mit dem amplifizierten Nukleotidfragment zu hybridisieren, – gegebenenfalls Mittel, um die Hybridisierung festzustellen.
Kit für die In-vitro-Diagnose einer Infektion durch H. pylori, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – eine bestimmte Menge Sonde nach Anspruch 13, – ein geeignetes Medium für die Durchführung einer Hybridisierungsreaktion zwischen der nachzuweisenden Nukleinsäure von H. pylori und der Sonde, – Reagenzien für den Nachweis von eventuell gebildeten Hybriden.
Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 17 oder 18 erkennt.
Zusammensetzung für die Behandlung einer Infektion durch H. pylori, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Antikörper nach Anspruch 33 enthält.
Polypeptid, bestehend aus der Kette: Ala Lys Ile Cys Tyr Glu Ile Gly Asn Arg His.