DE69434784T2

DE69434784T2 - Bakterielle ausscheidungsproteine und darauf beruhende azelluläre impfstoffe

Info

Publication number: DE69434784T2
Application number: DE69434784T
Authority: DE
Inventors: H. Robert New York MASURE; Barbara J New York PEARCE; Elaine New York TUOMANEN
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1993-09-01
Filing date: 1994-09-01
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2014-09-02
Also published as: CA2170726A1; US5928900A; PT721506E; FI960977A; AU7680994A; DE69434784D1; WO1995006732A2; WO1995006732A3; NO321826B1; EP0721506B1; NO960839L; EP0721506A1; JPH09504686A; ES2267096T3; US5981229A; FI960977A0; AU709405B2; NO960839D0; ATE332376T1; NZ273497A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung von bakteriellen freigesetzten bzw. exportierten Proteinen und der Gene, die solche Proteine kodieren. Die Erfindung betrifft auch auf azelluläre Impfstoffe, um Schutz vor bakterieller Infektion unter Verwendung solcher Proteine bereitzustellen und Antikörper gegen solche Proteine zur Verwendung in der Diagnostik und passiven Immuntherapie.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Exportierte Proteine in Bakterien nehmen an vielen verschiedenen und essenziellen Zellfunktionen, wie Motilität, Signal Transduktion, makromolekularer Transport und Zusammenbau, und an der Aufnahme von essenziellen Nährstoffen teil. Für pathogene Bakterien sind viele exportierte Proteine Virulenz Determinanten, die als Adhäsine, um zu kolonialisieren und somit den Wirt zu infizieren oder als Toxine wirken, um die Bakterien gegen das Immunsystem des Wirtes zu schützen (für eine Zusammenfassung, siehe Hoepelman und Tuomanen, 1992, Infect. Immun. 60:1729-33).
Seit der Entwicklung der Pockenimpfung durch Jenner im 18. Jahrhundert ist die Impfung eine wichtige Waffe in dem Arsenal gegen infektiöse Mikroorganismen. Vor der Einführung von Antibiotika war die Impfung die größte Hoffnung für den Schutz der Bevölkerung gegen virale oder bakterielle Infektion. Mit dem Aufkommen der Antibiotika im frühen 20. Jahrhundert wurde die Impufung gegen bakterielle Infektionen wesentlich weniger wichtig. Jedoch hat das kürzliche Auftreten von Antibiotika resistenten Stämmen von infektiösen Bakterien zu der erneuten Etablierung der Wichtigkeit von antibakteriellen Impfstoffen geführt.
Eine Möglichkeit für einen antibakteriellen Impfstoff ist die Verwendung von abgetöteten oder attenuierten Bakterien. Jedoch gibt es einige Nachteile von ganzen bakteriellen Impfstoffen, einschließlich der Möglichkeit einer Reversion von abgetöteten oder attenuierten Bakterien zu Virulenz aufgrund der unvollständigen Abtötung oder Attenuation und den Einschluss von toxischen Bestandteilen als Kontaminanten.
Eine andere Impfstoff Alternative ist es, mit der bakteriellen Kohlenhydrat Kapsel zu immunisieren. Gegenwärtig verwenden Impfstoffe gegen Streptococcus pneumoniae Konjugate, die aus den Kapseln der 23 häufigsten Serotypen dieses Bakteriums zusammengesetzt sind. Diese Impfstoffe sind in Individuen, die am empfänglichsten gegenüber einer pathologischen Infektion sind, unwirksam – den Jugendlichen, den älteren Personen und den Personen mit geschwächtem Immunsystem – aufgrund ihrer Unfähigkeit, eine T-Zell-Immunantwort zu zeigen. Eine kürzliche Studie hat gezeigt, dass dieser Impfstoff nur zu 50 % protektiv in diesen Individuen ist (Shapiro et al., 1991, N. Engl. J. Med. 325:1453-60).
Eine Alternative zu ganzen bakteriellen Impfstoffen sind azelluläre Impfstoffe oder Untereinheiten bzw. Subunit Impfstoffe, in denen das Antigen ein bakterielles Oberflächen Protein einschließt. Diese Impfstoffe könnten möglicherweise die Nachteile der ganzen bakteriellen oder auf der Kapsel beruhenden Impfstoffen überwinden. Darüber hinaus sind diese Proteine, aufgrund der Wichtigkeit der exportierten Proteine für bakterielle Virulenz, ein wichtiges Ziel für die therapeutische Intervention. Von besonderer Wichtigkeit sind Proteine, die ein gemeinsames Antigen von allen Stämmen einer bestimmten Spezies von Bakterien für die Verwendung in einem Impfstoff repräsentieren, der gegen alle Stämme der Bakterien schützen würde. Jedoch wurden bis heute nur eine kleine Anzahl von exportierten Proteinen von Gram-positiven Bakterien identifiziert, und keines davon repräsentiert ein gemeinsames Antigen für eine bestimmte Spezies von Bakterien.
Eine Strategie für die genetische Analyse von exportierten Proteinen in E. coli wurde vorgeschlagen, indem der Beschreibung von translationalen Fusionen an ein verkürztes Gen aus alkalischer Phosphatase (phoA), dem eine funktionelle Signalsequenz fehlt, gefolgt wurde (Hoffman und Wright, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:5107-5111). In dieser Studie wurde Enzym Aktivität einfach in Stämmen nachgewiesen, die Gen Fusionen zwischen den kodierenden Regionen von heterologen Signalsequenzen und phoA aufwiesen, was anzeigte, dass die Translokation über die cytoplasmatische Membran für die Enzym Aktivität benötigt wurde. Anschließend wurde ein modifiziertes Transposon, TnphoA, konstruiert, um das schnelle Screenen hinsichtlich translationaler Gen Fusionen zu erleichtern (Manoil und Beckwith, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:8129-8133). Dieses starke Werkzeug wurde modifiziert und in vielen Gram-negativen Pathogenen, wie Escherichia coli (Guitierrez et al., 1987, J. Mol. Biol. 195:289-297), Vibrio cholera (Taylor et al., 1989, J. Bacteriol. 171:1870-1878), Bordetella pertussis (Finn et al., 1991, Infect Immun. 59:3273-9; Knapp und Mekalanos, 1988, J. Bacteriol. 170:5059-5066) und Legionella pneumophila (Albano et al., 1992, Mol. Microbiol. 6:1829-39) verwendet, um eine Fülle von Informationen aus der Identifizierung und Charakterisierung von exportierten Proteinen zu erhalten. Eine ähnliche Strategie, die auf Gen Fusionen von einer verkürzten Form des Gens für β-Lactamase beruht, wurde mit demselben Zweck verwendet (Broome-Smith et al., 1990, Mol. Microbiol. 4:1637-1644). Eine direkte Strategie für die Kartierung der Topologie von exportierten Proteinen wurde auch beruhend auf "Sandwich" Gen Fusionen mit phoA entwickelt (Ehrmann et al., 1990, 87:7574-7578).
Aus einer Vielzahl von Gründen wurde die Verwendung von Gen Fusionen als ein genetischer Screen für exportierte Proteine in Gram-positiven Organismen mit beschränktem Erfolg durchgeführt. Es wurden Plasmid Vektoren, die zwei- oder dreiteilige translationale Fusionen mit Genen für alkalische Phosphatase, β-Lactamase und α-Amylase bilden, für Bacillus subtilis und Lactococcus lacti entworfen (Payne und Jackson, 1991, J. Bacteriol. 173:2278-82; Perez et al., 1992, Mol. Gen. Genet. 234:401-11; Smith et al., 1987, J. Bacteriol. 169:3321-3328; Smith et al., 1988, Gene 70:351-361). Gen Fusionen zwischen phoA und dem Gen für Protein A (spa) von Staphylococcus aureus wurden verwendet, um die zelluläre Lokalisation dieses Proteins zu bestimmen (Schneewind et al., 1992, Cell. 70:267-81). In dieser Studie wurde jedoch nicht über die Enzym Aktivität für alkalische Phosphatase berichtet.
Mutagenese Strategien in einigen Streptokokken Spezies sind ebenfalls aus verschiedenen Gründen beschränkt. Wirksame Transposons, die jenen ähnlich sind, die das Hauptwerkzeug für die Untersuchung von Gram-negativen Bakterien bilden, wurden für Streptokokkus nicht entwickelt. Die Insertionsduplikationsmutagenese mit nicht replizierenden Plasmid Vektoren war eine erfolgreiche Alternative für Streptococcus pneumoniae (Chen und Morrison, 1988, Gene. 64:155-164; Morrison et al., 1984, J. Bacteriol. 159:870). Diese Strategie hat zu der Mutagenese, Isolierung und Klonierung von einigen pneumokokkalen Genen geführt (Alloing et al., 1989, Gene. 76:363-8; Berry et al., 1992, Microb. Pathog. 12:87-93; Hui und Morrison, 1991, J. Bacteriol. 173:372-81; Lacks und Greenberg, 1991, Gene. 104:11-7; Laible et al., 1989, Mol. Microbiol. 3:1337-48; Martin et al., 1992, J. Bacteriol. 174:4517-23; McDaniel et al., 1987, J. Exp. Med. 165:381-94; Prudhomme et al., 1989, J. Bacteriol. 171:5332-8; Prudhomme et al., 1991, J. Bacteriol. 173:7196-203; Puyet et al., 1989, J. Bacteriol. 171:2278-2286; Puyet et al., 1990, J. Mol. Biol. 213:727-38; Radnis et al., 1990, J. Bacteriol. 172:3669-74; Sicard et al., 1992, J. Bacteriol. 174:2412-5; Stassi et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:7028-7032; Tomasz et al., 1988, J. Bacteriol. 170:5931-5934; Yother et al., 1992, J. Bacteriol. 174:610-8).
Bemerkenswert in der Suche nach exportierten pneumokokkalen Proteinen, die attraktive Ziele für einen Impfstoff sein könnten, ist das pneumokokkale Oberflächen Protein A (PspA) (siehe Yother et al., 1992, supra). Von PspA wurde berichtet, dass es ein Kandidat für einen S. pneumoniae Impfstoff sein könnte, weil es bis heute in allen Pneumococci gefunden wurde; das gereinigte Protein kann verwendet werden, um eine protektive Immunität in Mäusen hervorzurufen; und Antikörper gegen das Protein verleihen passive Immunität in Mäusen (Talkington et al., 1992, Microb. Pathog. 13:343-335). Jedoch zeigt PspA antigene Variabilität zwischen Stämmen in der N-terminalen Hälfte des Proteins, welche die immunogenen und Schutz verleihenden Epitope enthält (Yother et al., 1992, supra). Dieses Protein stellt kein gemeinsames Antigen für alle Stämme von S. pneumoniae dar, und deshalb ist es kein optimaler Impfstoff Kandidat.
Kürzlich wurden apparente Fusionsproteine mit PhoA in Spezies von Grampositiven und Gram-negativen Bakterien exportiert (Pearce und Masure, 1992, Abstr. Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol. 92:127, Abstract D-188). Dieses Abstract berichtet über die Insertion von pneumokokkaler DNA oberhalb des E. coli phoA Gens, das seine Signalsequenz und seinen Promotor nicht aufweist, in einem Shuttle Vektor, der zur Expression in sowohl E. coli als auch in S. pneumoniae befähigt ist, und liegt nahe, dass ähnliche Wege für die Translokation von exportierten Proteinen über die Plasma Membranen in beiden Spezies von Bakterien gefunden werden müssen.
Kürzliche Studien haben gezeigt, dass der genetische Transfer in einigen bakteriellen Spezies auf einem Signal Antwortmechanismus zwischen einzelnen Zellen beruht. Konjugaler Plasmid Transfer wird durch Homoserin Lacton in Agrobacterium tumifaciens (Zhang et al., 1993, Science 362:446-448) und durch kleine sekretierte Polypeptide in Enterococcus faecalis (für einen Übersichtsartikel, siehe Clewell, 1993, Cell 73:9-12) vermittelt wird. Es wurden Peptid Aktivatoren mit niedrigem Molekulargewicht beschrieben, welche die Transformation in S. pneumoniae (Tomasz, 1965, Nature 208:155-159; Tomasz, 1966, J. Bacteriol. 91:1050-61; Tomasz und Mosser, 1996, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 55:58-66) und Streptococcus sanguis (Leonard und Cole, 1972, J. Bacteriol. 110:273-280; Pakula et al., 1962, Acta Microbiol. Pol. 11:205-222; Pakula und Walczak, 1963, J. Gen. Microbiol. 31:125-133) induzieren. Ein Peptid Aktivator, der sowohl Sporulation als auch Transformation reguliert, wurde für B. subtilis beschrieben (Grossman und Losick, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4369-73). Darüber hinaus legt der genetische Beweis nahe, dass Peptid Permeasen diese Vorgänge in sowohl E. faecalis (Ruhfel et al., 1993, J. Bacteriol. 175:5253-59; Tanimoto et al., 1993, J. Bacteriol. 175:5260-64) als auch B. subtilis (Rudner et al., 1991, J. Bacteriol. 173:1388-98) vermitteln können.
In S. pneumoniae findet die Transformation als ein programmiertes Ereignis während eines physiologisch definierten "kompetenten" Zustandes statt. Induziert durch ein unbekanntes Signal in einer Dichte abhängigen Weise zeigen die Zellen eine einzelne Kompetenzwelle zwischen 5 × 10⁶ und 1 – 2 × 10⁷ cfu/ml, was am Beginn des logarithmischen Wachstums liegt (Tomasz, 1996, supra). Mit der Induktion wird ein einzigartiger Satz von Kompetenz assoziierten Proteinen exprimiert. Morrison und Baker, 1979, Nature 282:215-217 schlagen die globale Regulation von Transformations assoziierten Genen vor. Kompetente Bakterien binden und transportieren exogene DNA, die, falls sie homolog ist, durch Rekombination in das Genom der Empfängerzelle eingebaut wird. Innerhalb von ein oder zwei Zellteilungen sind die Bakterien nicht mehr kompetent. Wie bei der Induktion findet die Inaktivierung der Kompetenz durch einen unbekannten Mechanismus statt.
Das Zitieren von Referenzen soll hier nicht als eine Einlassung ausgelegt werden, dass diese Stand der Technik für die vorliegende Erfindung sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Gene, die für exportierte Proteine in einem Gram-positiven Bakterium kodieren, und Proteine, die durch solche Gene kodiert werden. Insbesondere betrifft die Erfindung ein rekombinantes DNA Molekül, das eine Nukleinsäure umfasst, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2 kodiert, und das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2.
Die Erfindung betrifft ferner einen Impfstoff zum Schutz eines tierischen Patienten bzw. Subjekts vor der Infektion mit einem Gram-positiven Bakterium umfassend einen Vektor, der ein Gen enthält, welches ein freigesetztes bzw. exportiertes Protein eines Gram-positiven Bakteriums kodiert, das funktionell mit einem Promotor, der befähigt ist, die Expression des Gens in dem Subjekt zu steuern, assoziiert ist, wobei das exportierte Protein eine Permease ist, wobei das Gen eine Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1 enthält.
In einem anderen Aspekt ist die Erfindung auf einen Impfstoff zum Schutz eines tierischen Subjekts vor einer Infektion mit einem Gram-positiven Bakterium gerichtet, umfassend eine immunogene Menge eines exportierten Proteins eines Grampositiven Bakteriums, und einen Hilfsstoff, wobei das exportierte Protein eine Permease ist, wobei das exportierte Protein eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2 enthält. Vorzugsweise enthält ein solcher Impfstoff das Protein kovalent konjugiert an eine bakterielle Kapsel oder Kapseln von einem oder mehreren Bakterienstämmen. Weiter bevorzugt sind die Kapseln von allen der gewöhnlichen Stämme einer Spezies von Bakterien in den Impfstoff eingeschlossen.
Alternativ dazu kann das Protein verwendet werden, um ein geeignetes Tier zu immunisieren, um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu bilden, wie detailliert unten beschrieben wird. Somit betrifft die Erfindung weiterhin Antikörper, die mit exportierten Proteinen von Gram-positiven Bakterien reagieren. Solche Antikörper können in Immunassays verwendet werden, um eine Infektion mit einem bestimmten Stamm oder einer Spezies von Bakterien zu diagnostizieren. In einem besonderen Aspekt ist die Spezies das Bakteriums S. pneumoniae. Die Antikörper können auch für passive Immunisierung verwendet werden, um eine Infektion mit Gram-positiven Bakterien zu behandeln.
Somit ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Gene bereitzustellen, die exportierte Proteine von Gram-positiven Bakterien kodieren.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, einen azellulären Impfstoff gegen ein Grampositives Bakterium bereitzustellen, wodurch die Nachteile von ganzen abgetöteten oder attenuierten bakteriellen Impfstoffen und verkapselten Impfstoffen überwunden werden.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen verkapselten Impfstoff bereitzustellen, der eine Helfer T-Zell-Immunantwort zeigt.
Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung ein Diagnostikum für eine Infektion mit einem Gram-positiven Bakterium bereitzustellen.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, eine passive Immuntherapie für eine Grampositive bakterielle Infektion bereitzustellen, insbesondere für eine Infektion durch ein Antibiotikum resistentes Bakterium.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Konstruktion von PhoA Fusionsvektoren, die für die Mutation und genetische Identifizierung von exportierten Proteinen in S. pneumoniae gestaltet wurden. (A) Das 2,6 kB Fragment von pPHO7 enthaltend eine verkürzte Form von phoA wurde in entweder die SmaI oder BamHI Stellen von pJDC9 inseriert, um jeweils pHRM100 und pHRM104 zu bilden. T1T2 sind Transkriptionsterminatoren, und die Pfeile zeigen die Gen Orientierung. (B) Mechanismus der Insertionsdupliktionsmutagenese, gekoppelt mit Gen Fusion. Die PhoA Aktivität hängt von der Klonierung eines inneren Gen Fragments ab, das sich im selben Leserahmen und unterhalb eines Gens befindet, das ein exportiertes Protein kodiert. Die Transformation in S. pneumoniae führt zu der Duplikation des Zielfragments und der anschließenden Gen Zerstörung.
2. Nachweis und Trypsin Empfänglichkeit von PhoA Fusionen in S. pneumoniae. Gesamt Zelllysate (50 μg Protein) aus R6x (Spur 1; Ausgangsstamm): SPRU98 (Spur 2); SPRU97 (Spur 3); und SPRU96 (Spur 4) wurden auf ein 8–25 % SDS Polyacrylamid Gel aufgetragen. Die Proteine wurden auf Nitrocellulose Membrane transferiert und mit einem anti-PhoA Antikörper als Sonde behandelt. Die Antigen-Antikörper Komplexe wurden durch verstärkte Chemilumineszenz mit einem geeigneten Peroxidase konjugierten sekundären Antikörper nachgewiesen. SPRU96 und 97 enthält die Plasmide pHRM100 und pHRM104 zufällig in das Chromosom integriert. Die Molekulargewichtstandards sind auf der linken Seite angegeben. Ganze Bakterien des Stamms SPRU98 wurden mit (Spur 5) und ohne (Spur 6) 50 μg/ml Trypsin für 10 Min. bei 37°C behandelt. Beide Proben wurden mit einem 40-fachen molaren Überschuss von Sojabohnen Trypsin Inhibitor behandelt. Die Gesamtzelllysate (50 μg Protein) wurden hinsichtlich immunreaktiven Materials gegenüber PhoA, wie oben beschrieben, als Sonde behandelt. Die Molekulargewichtsstandards sind an der linken Seite angegeben.
3. Die PhoA Fusionsprodukte sind stabiler, wenn die Bakterien in der Anwesenheit von Disulfidoxidans angezogen werden. Kulturen von SPRU98 wurden in der Anwesenheit von entweder 600 μM 2-Hydroxyethyldisulfid (Spur 1), 10 μM DsbA (Spur 2) oder ohne irgendwelche Zusätze (Spur 3) angezogen. Die Gesamtzelllysate (50 μg Protein) wurden auf ein 8–25 % SDS Polyacrylamid Gel aufgetragen. Die Proteine wurden anschließend hinsichtlich immunreaktiven Materials mit anti PhoA Antikörper als Sonde, wie in 2 beschrieben, behandelt.
4. Abgeleitete Aminosäuresequenzen für die genetischen Loci, die aus PhoA⁺ pneumokokkalen Mutanten gewonnen wurden. Jedes der Plasmide, das aus den neun PhoA⁺ Stämmen von S. pneumoniae (siehe Tabelle 1) gewonnen wurde, wurde in E. coli transformiert und wies 400 bis 700 Basenpaar Inserts auf. Unter Verwendung eines Primers gegen das 5' Ende von phoA wurden ungefähr 200 bis 500 Basenpaare pneumokokkaler DNA unmittelbar oberhalb von phoA aus jedem Plasmid sequenziert, und eine innerhalb des Leserahmens liegende Region mit PhoA wurde etabliert. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für die Fusionen sind für Exp1 [SEQ ID NR: 2], Exp2 [SEQ ID NR: 24], Exp3 [SEQ ID NR: 6], Exp4 [SEQ ID NR: 8], Exp5 [SEQ ID NR: 10], Exp6 [SEQ ID NR: 12], Exp7 [SEQ ID NR: 14], Exp8 [SEQ ID NR: 16] und Exp9a [SEQ ID NR: 18] angegeben. Die abgeleitete Sequenz von dem 5' Ende des Inserts von Exp9 wird auch in Exp9b [SEQ ID NR: 20] dargestellt.
5. Sequenz Alignments der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von den Exp Loci, die aus PhoA⁺ Mutanten gewonnen wurden. Die höchste Überein stimmung für jedes Insert ist angegeben. Die prozentuale Identität (% ID) und die prozentuale Ähnlichkeit (engl.: percent similarity (% SIM)) für jedes Alignment ist auf der rechten Seite angebeben. (A) Exp1 [SEQ ID NR: 2] und AmiA aus S. pneumoniae [SEQ ID NR: 23] (Alloing et al., 1990, Mol. Microbiol. 4:633-44). B) Exp2 [SEQ ID NR: 24] und PonA von S. pneumoniae [SEQ ID NR: 24] (Martin et al., 1992, J. Bacteriol. 174:4517-23). C) Exp3 [SEQ ID NR: 25] und PilB aus N. gonorrhoeae [SEQ ID NR: 26] (Taha et al., 1988, EMBO J. 7.4367-4378). Das konservierte Histidin (H₄₀₈) in PilB ist nicht in Exp3 anwesend, sondern ist durch Asparagin (N₁₂₄) ausgetauscht. D) Exp4 [SEQ ID NR: 27] und CD4B aus Tomate [SEQ ID NR: 28] (Gottesman et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3513-7). E) Exp5 [SEQ ID NR: 29] und PtsG aus B. subtilis [SEQ ID NR: 30] (Gonzy-Tréboul et al., 1991, Mol. Microbiol. 5:1241-1294). F) Exp6 [SEQ ID NR: 31] und GlpD aus B.subtilis [SEQ ID NR: 32] (Holmberg et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136:2367-2375). G) Exp7 [SEQ ID NR: 33] und MgtB aus S. typhimurium [SEQ ID NR: 34] (Snavely et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:815-823). Die konservierte Asparaginsäure (D₅₅₄), die für Autophosphorylierung benötigt wird, ist auch in Exp7 (D₃₇) anwesend. H) Exp8 [SEQ ID NR: 35] und CyaB aus B. pertussis [SEQ ID NR: 36] (Glaser et al., 1988, Mol. Microbiol. 2:1930; Glaser etal., 1988, EMBO J. 7:3997-4004). I) Exp9 und DeaD aus E. coli (Toone et al., 1991, J. Bacteriol. 173:3291-3302). Die obere Sequenz von Exp9 [SEQ ID NR: 37] ist von dem 5' Ende des gewonnen Plasmid Inserts abgeleitet und wird mit DeaD 135-220 [SEQ ID NR: 38] verglichen. Die untere Sequenz aus Exp9 [SEQ ID NR: 20] ist von dem 3' Ende des gewonnenen Plasmid Inserts unmittelbar oberhalb von phoA abgeleitet und wird mit DeaD 265-342 [SEQ ID NR: 39] verglichen. Die konservierte DeaD Sequenz ist hervorgehoben.
6. Subzelluläre Lokalisation der Exp9-PhoA Fusion. Die Membran (Spur 1) und cytoplasmatische (Spur 2) Fraktionen (50 μg Protein für jede Probe) von SPRU17 wurden auf ein 10–15 % SDS Polyacrylamid Gel aufgetragen. Die Proteine wurden auf Nitrocellulose transferiert und mit einem anti-PhoA Antikörper als Sonde inkubiert. Molekulargewichtsstandards sind auf der linken Seite angegeben.
7. Adhärenz von Typ 2 AII (∎) oder nicht verkapselten R6 (O) Pneumokokken an alveolare Typ II Zellen des Kaninchens. Der Adhärenz Assay wurde durchgeführt wie in Beispiel 2, infra beschrieben.
8. Titration der Adhärenz von pneumokokkalen Mutanten gegenüber humanen Nabelschnurvenen endothelialen Zellen (HUVEC). Die getesteten mutanten Stämme sind in Tabelle 1 angegeben. Mutation von exp1, Stamm SPRU98 (•); exp2, Stamm SPRU64 (O); exp3, Stamm SPRU40 (∎); exp10, Stamm SPRU25
und amiA, Stamm SPRU121 (♦) führten zu einem Abfall in der Fähigkeit des mutanten Stammes, zu adhärieren. Stamm R6(∎) ist Wildtyp S. pneumoniae.
9. Adhärenz von pneumokokkalen Mutanten an Lungen Typ II Zellen. Die exportierte Gen Mutation und Stammbezeichnungen sind wie für 8 beschrieben.
10. Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz für den genetischen Locus, der aus der SPRU25 Mutante, exp10 gewonnen wurde. Die Nukleotidsequenz wurde erhalten, wie in 4 und in Beispiel 1, infra beschrieben.
11. Nukleotid (SEQ ID NR: 46) und abgeleitete Protein (SEQ ID NR: 47) Sequenzen von plpA. Die modifizierte Lipoprotein Konsensus Sequenz ist unterstrichen mit einem Sternchen über dem Cystein Rest, wo die Spaltung stattfinden würde. Unterhalb von der kodierenden Region ist ein potenzieller rho unabhängiger Transkriptionsterminator unterstrichen. Die Position der PhoA Fusionen bei Leu₁₉₇ in SPRU58 und Asp₄₉₂ in SPRU98 sind angegeben. (Genbank Zugangsnummer: NOCH NICHT ZUGEWIESEN).
12. Sequenzanalyse von Peptid Bindungsproteinen. A; Sequenz Ausrichtung (Alignment) von PlpA (SEQ ID NR: 47) und AmiA (SEQ ID NR: 48). Identische Reste sind durch Kästchen gekennzeichnet. B; Sequenz Anordnungen für die Substrat Bindungsproteine aus den Permeasen von verschiedenen bakteriellen Spezies: PlpA, S. pneumoniae (diese Studie); AmiA, S. pneumoniae. Die berichtete Sequenz für amiA (Alloing et al., 1990, Mol. Microbiol. 4:633-644) wurde jetzt aufgrund eines Sequenzierfehlers geändert, und die korrigierte Sequenz befindet sich jetzt in der Genbankk); Spo0KA, B. subtilis (Perego et al., 1991, Mol. Microbiol. 5:173-185; Rudner et al., 1991, J. Bacteriol. 173:1388-98); HbpA, H. influenzae (Hanson et al., 1992, Infect. Immun. 60:2257-66); DciAE, B. subtilis (Mathiopoulos et al., 1991, Mol. Microbiol. 5:1903-13); OppA (Ec), E. coli (Kashiwagi et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:8387-91); TraC, E. faecalis (Tanimoto et al., 1993, J. Bacteriol. 175:5260-64); DppA, E. coli (Abouhamad et al., 1991, Mol. Microbiol. 5:1035-47); PrgZ, E. faecalis (Ruhfel et al., 1993, J. Bacteriol. 175:5253-59); OppA (St) S. typhimurium (Hiles, et al., 1987, J. Mol. Biol. 195:125-142) und SarA, S. gordonii. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden mit dem MACAW Softwarepaket ausgerichtet (Schuler et al., 1993, Proteins Struct. Funct. Genet. 9:180-190). Die schwarzen Kästchen und die gepunkteten Kästchen bezeichnen Regionen der großen Sequenz Ähnlichkeit mit Wahrscheinlichkeitswerten von weniger oder gleich 1,3 × 10^–7, mit einer wirksamen Größe des untersuchten Raumes, der von den Längen aller Sequenzen in der Datenbank abgeleitet ist.
13. Subzelluläre Lokalisation und Markierung von PlpA-PhoA. Obere Darstellung: Subzelluläre Fraktionen (50 μg Gesamtprotein) von SPRU98 (PhoA⁺, pHRM104::plpA) wurden auf ein 8–25 % SDS Polyacrylamid Gel aufgetragen, auf eine Nitrocellulose Membran transferiert und mit einem anti-PhoA Antiserum als Sonde inkubiert. Gebundene Antikörper wurden mit einem Peroxidase konjugierten zweiten Antikörper nachgewiesen und mit verstärkter Chemilumineszenz sichtbar gemacht. Die Spuren sind A, Kulturüberstand; B, Membrane; C, Cytoplasma; und D, Zellwand. Untere Darstellung: anti-PhoA Immunpräzipitate von Gesamtzelllysaten aus Bakterien, die in einem chemisch definierten Medium mit [³H] Palmitinsäure angezogen wurden, wurden auf ein 8–25 % SDS Polyacrylamid Gel aufgetragen, auf eine Nitrocellulose Membran transferiert und einer Autoradiographie unterzogen. Die Spuren sind E, parenteraler Stamm R6x; F, SPRU100 (PhoA⁺, pHRM104::zzz); und G, SPRU98 (PhoA⁺, pHRM104::plpA).
Der Pfeil markiert die 93 kDa Bande, die dem immunpräzipitierten PlpA-PhoA Fusionsprotein entspricht.
14. Northern Analyse von pneumokokkalen Peptid Permeasen. RNA (10 μg), hergestellt aus SPRU107 (pJDC9::plpA) (Spuren A und C) und R6x (Spuren B und D) wurden mit DNA Sonden aus plpA (Spuren A und D) oder amiA (Spuren C und D) hybridisiert. Die Molekulargewichte sind angegeben.
15. Transformationseffizienz von pneumokokkalen Permease Mutanten. Verschiedene Stämme, welche die angegebenen chromosomalen Gen Konstrukte mit Läsionen in entweder plpA oder amiA enthalten, wurden hinsichtlich des Einbaus eines chromosomalen Streptomycin Resistenzmarkers als eine Messung der Transformationseffizienz untersucht. Die Transformationseffizienz jedes Stammes ist als ein Prozentsatz des parenteralen Stamms, R6x, angegeben, der für gewöhnlich 0,3 % Str^r Transformanten in der Gesamtpopulation von transformierbaren Zellen liefert. Die angegebenen Werte sind der Durchschnitt von mindestens drei Datenpunkten mit einer Standard Fehlerabweichung. Die Ergebnisse sind repräsentativ für Assays, die zu drei getrennten Gelegenheiten durchgeführt wurden. E ist Erythromycin Resistenz, die von dem Vektor kodiert wird.
16. Kompetenzprofile von pneumokokkalen Permease Mutanten. Der Prozentsatz transformierbarer Zellen wurde bei spezifischen ODs während des logarithmischen Wachstums für R6x n, SPRU107 1 (pJDC9::plpA) und SPRU114 s (pJDC9::amiA) bestimmt. Die Ergebnisse stellen drei getrennte Experimente dar.
17. Wirkung einer Mutation im plpA auf die Expression des Kompetenz regulierten rec Locus. Alkalische Phosphatase Aktivität wurde für SPRU100, n (PhoA⁺, pHRM104::exp10) und SPRU156, s (PhoA⁺, pHRM104::exp10, pWG5::plpA) während des logarithmischen Wachstums von Pneumococcus gemessen, der einen normalen Kompetenzzyklus bildete. Jeder Wert ist der Durchschnitt von zwei Datenpunkten mit einer Standard Fehlerabweichung, die 10 jenes Punktes nicht überschritt. Diese Ergebnisse stellen drei unabhängige Experimente dar.
18. Physikalische Karte von plpA und rekombinanten Plasmiden, die durch verschiedene Klonierungsverfahren gebildet wurden. Plasmide mit der Vorsilbe pH enthalten Inserts in dem PhoA Vektor pHRM104, während Plasmide mit der Vorsilbe pJ Inserts in dem Vektor pJDC9 enthalten. Die meisten Plasmide wurden durch "Chromosomen Walking" mit dem integrierten Plasmid pJplp1 gebildet. Das Plasmid pJplp9 wurde durch "homologes Klonieren" mit den Oligonukleotiden Lipo1 und P1 gebildet. Siehe experimentelle Verfahren für die Details. Restriktionsendonuklease Stellen sind gezeigt: H (HindIII), Hc (HincII), E (EcoRI), K (KpnI), P (PstI), R (EcoRV), Sau (SauIIIa), S (SphI).
19. Adhärenz von R6 Wildtyp (☐) und Pad1 Mutanten (∎) Pneumokokken gegenüber Typ II Lungenzellen. Dieser Assay wurde durchgeführt, wie in Beispiel 2 beschrieben.
20. (A) Subzelluläre Lokalisation der Pad1-PhoA Fusion, die durch Western Analyse mit anti-PhoA Antiserum nachgewiesen wurde. Die Zellen wurden in die Membran Bestandteile (Spuren A–C) und cytoplasmatischen Bestandteile (Spuren D–F) getrennt. Spuren A, D – R6 Wildtyp (Ausgangs) Zellen; B, E – Pad1 mutante Zellen; C, F – Pad1b mutante Zellen. (B) Sonde des bakteriellen Lysats mit Antikörper gegenüber Bakterien durch Western Analyse. Spuren A, B und C entsprechen (A). Die Pad1 Mutanten weisen ein 17 kDa immunogenes Membran assoziiertes Protein nicht auf, das in den R6 Bakterien gefunden wurde.
21. Adhärenz von R6 Bakterien und Pad1 Mutanten, die in der Anwesenheit und Abwesenheit von Acetat angezogen wurden. Das Wachstum in Acetat korrigiert den Pad1 Adhärenz Defekt.
22. Wachstum der Pad1 Mutanten und R6 Bakterien in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Acetat. Die Pad1 Mutante wurde in chemisch definiertem Wachstumsmedium für S. pneumoniae in der Anwesenheit von 0 % (O), 0,1 % (♢) und 0,5 % (☐) Acetat angezogen. R6 wurde in der Anwesenheit von 0 % (Quadrat plus) und 0,5 % (Δ) angezogen.
23. Nukleotid (SEQ ID NR: 55) und abgeleitete Aminosäuresequenzen von Pad1 (SEQ ID NR: 56); auch als poxB bezeichnet. Die putative Ribosomen Bindestelle, die -10 und die -35 Stellen sind unterstrichen, und das Start Kodon ist markiert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie und rekombinanten DNA durch den Fachmann angewendet werden. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur erklärt. Siehe zum Beispiel Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," zweite Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (im Folgenden: "Sambrook et al., 1989"); "DNA Cloning: A Practical Approach," Band I und II (D.N. Glover Hrsg. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait Hrsg. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins Hrsg. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, Hrsg. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
Deshalb, soweit sie hier vorkommen, sollen die folgenden Begriffe die Definitionen aufweisen, die im Folgenden angegeben sind.
Ein "Replikon" ist ein genetisches Element (z.B. Plasmid, Chromosom, Virus), das als eine autonome Einheit der DNA Replikation in vivo funktioniert, d.h. in der Lage ist, unter seiner eigenen Kontrolle zu replizieren.
Ein "Vektor" ist ein Replikon, wie ein Plasmid, Phage oder Cosmid, an das ein anderes DNA Segment angeheftet werden kann, um die Replikation des angehefteten Segments hervorzubringen.
Der Begriff "viraler Vektor" betrifft ein Virus, das eine rekombinante Nukleinsäure enthält, wobei das Virus die rekombinante Nukleinsäure in eine Zelle einführen kann, d.h. das Virus kann die Zelle transformieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung können solche Vektoren für den Transport eines Nukleinsäure basierten Impfstoffs, wie hier beschrieben, verwendet werden.
Eine Zelle wurde durch exogene oder heterologe DNA "transformiert", wenn eine solche DNA in die Zelle eingeführt wurde. Die transformierende DNA kann in chromosomale DNA, die das Chromosom der Zelle bildet, integriert (kovalent gebunden) werden oder nicht. In Prokaryonten, Hefe und Säugertier Zellen kann die transformierende DNA beispielsweise auf einem episomalen Element, wie einem Plasmid, erhalten bleiben. Ein "Klon" ist eine Population von Zellen, die von einer einzelnen Zelle oder einem gemeinsamen Vorläufer durch Mitose abgeleitet sind.
Ein "Nukleinsäure Molekül" betrifft die Phosphatester polymere Form von Ribonukleosiden (Adenosin, Guanosin, Uridin oder Cytidin; "RNA Moleküle") oder Desoxyribonukleoside (Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin oder Desoxycytidin; "DNA Moleküle") in entweder einzelsträngiger Form oder einer doppelsträngigen Helix. Doppelsträngige DNA-DNA, DNA-RNA und RNA-RNA Helices sind möglich. Der Begriff Nukleinsäure Molekül und insbesondere DNA oder RNA Molekül betrifft nur die primäre und sekundäre Struktur des Moleküls und beschränkt sie nicht auf irgendeine bestimmte tertiäre Form. Somit schließt dieser Begriff doppelsträngige DNA ein, die inter alia in linearen oder zirkulären DNA Molekülen (z.B. Restriktionsfragmente), Viren, Plasmide und Chromosomen gefunden wird. Bei der Diskussion der Struktur von bestimmten doppelsträngigen DNA Molekülen können hier beschriebene Sequenzen in der normalen Art und Weise beschrieben werden, indem nur die Sequenz in der 5' nach 3' Richtung entlang des nicht transkribierten Stranges der DNA (d.h. des Stranges, der eine Sequenz homolog zu der mRNA aufweist) angegeben wird. Ein "rekombinantes DNA Molekül" ist ein DNA Molekül, das eine molekularbiologische Manipulation durchlaufen hat.
Ein Nukleinsäure Molekül ist an ein anderes Nukleinsäure Molekül, wie eine cDNA, genomische DNA oder RNA "hybridisierbar", wenn eine einzelsträngige Form des Nukleinsäure Moleküls an das andere Nukleinsäure Molekül unter den geeigneten Bedingungen der Temperatur und Lösungsionenstärke angeordnet (annealed) werden kann (siehe Sambrook et al., 1989, supra). Die Bedingungen der Temperatur und Ionenstärke bestimmen die "Stringenz" der Hybridisierung. Die Hybridisierung benötigt, dass zwei Nukleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, obwohl in Abhängigkeit von der Stringenz der Hybridisierung Fehlpaarung zwischen den Basen möglich sind. Die geeignete Stringenz für die Hybridisierung von Nukleinsäuren hängt von der Länge der Nukleinsäure und dem Grad der Komplementarität ab; Variablen, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Vorzugsweise beträgt eine minimale Länge für eine hybridisierbare Nukleinsäure mindestens ungefähr 10 Nukleotide; vorzugsweise mindestens ungefähr 15 Nukleotide.
Eine DNA "kodierende Sequenz" ist eine doppelsträngige DNA Sequenz, die in ein Polypeptid in vivo transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter der Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen angeordnet wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Start Kodon am 5' (Amino) Terminus und einem Translationsstopp Kodon am 3' (Carboxyl) Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann einschließen, aber ist nicht beschränkt auf prokaryote Sequenzen, cDNA von eukaryonter mRNA, genomische DNA Sequenzen von eukaryonter (z.B. Säuger) DNA und selbst synthetische DNA Sequenzen. Wenn die kodierende Sequenz für die Expression in einer eukaryonten Zelle vorgesehen ist, werden für gewöhnlich ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz 3' der kodierenden Sequenz angeordnet.
Transkriptionelle und translationale Kontrollsequenzen sind DNA regulatorische Sequenzen, wie Promotoren, Enhancer, Terminatoren und ähnliches, welche die Expression einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle ermöglichen. In eukaryonten Zellen sind Polyadenylierungssignale Kontrollsequenzen.
Eine "Promotor Sequenz" ist eine DNA regulatorische Region, die in der Lage ist, RNA Polymerase in einer Zelle zu binden und die Transkription einer unterhalb gelegenen (3' Richtung) kodierenden Sequenz zu initiieren. Für den Zweck, die vorliegende Erfindung zu definieren, ist die Promotor Sequenz an ihrem 3' Terminus durch die Transkriptionsinitiationsstelle gebunden und erstreckt sich oberhalb (5' Richtung), um eine minimale Anzahl von Basen oder Elementen einzuschließen, die notwendig sind, um die Transkription in Mengen zu initiieren, die über dem Hintergrund nachweisbar sind.
Innerhalb der Promotor Sequenz wird eine Transkriptionsinitiationsstelle gefunden (herkömmlich zum Beispiel definiert durch das Kartieren mit Nuklease S1) ebenso wie Protein Bindungsdomänen (Konsensus Sequenzen), die für die Bindung von RNA Polymerase verantwortlich sind. Eurkaryonte Promotoren werden häufig, wenn nicht immer, "TATA" Boxen und "CAT" Boxen enthalten.
Eine kodierende Sequenz befindet sich "unter der Kontrolle" von transkriptionellen und translationalen Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn die RNA Polymerase die kodierende Sequenz in mRNA transkribiert, die anschließend in ein Protein translatiert wird, das durch die kodierende Sequenz kodiert wird.
Eine "Signalsequenz" kann vor die kodierende Sequenz eingeschlossen werden. Diese Sequenz kodiert ein Signalpeptid, N-terminal zu dem Polypeptid, das die Wirtszelle anregt, das Polypeptid an die Zelloberfläche zu translozieren oder das Polypeptid in das Medium abzugeben, und dieses Signalpeptid wird selektiv durch die Zelle nach dem Export degradiert. Signalsequenzen können mit einer Vielzahl von Proteinen, die in Prokaryonten und Eukaryonten nativ sind, assoziiert gefunden werden.
So wie hier verwendet, betrifft der Begriff "exportiertes Protein" ein Protein, das eine Signalsequenz enthält und somit assoziiert mit oder außerhalb der Zellmembran gefunden wird. Somit fallen sekregierte Proteine, integrale Membran Proteine, Oberflächen Proteine, und ähnliches innerhalb die Klasse der exportierten Proteine. Der Begriff "Oberflächen Protein", so wie hier verwendet, betrifft spezifisch ein Protein, das an der Zelloberfläche erreichbar ist, z.B. für die Bindung mit einem Antikörper.
Ein "Adhäsions assoziiertes Protein" ist ein Protein, das direkt oder indirekt in die Adhärenz von Bakterien an Ziel Zellen, wie endotheliale Zellen oder Lungen Zellen, involviert ist. Der Begriff "Adhäsions assoziiertes Protein" schließt Proteine ein, die andere funktionelle Aktivitäten, wie Motilität, Signal Transduktion, Zellwand Zusammenbau oder makromolekularen Transport aufweisen können. Ein "Adhäsin" ist ein Adhäsions assoziiertes Protein, das auf der Oberfläche einer Zelle, wie einem Bakterium, gefunden wird, das direkt in die Adhärenz involviert ist und damit den Grad der Adhärenz oder Adhäsion an eine andere Zelle bewirkt. Besonders wichtig für die vorliegende Erfindung sind Adhäsine von Gram-positiven Bakterien, die eine Adhäsion an eukaryonte Zellen fördern, d.h. die in die bakterielle Virulenz involviert sind. Adhäsine sollten, um in der Förderung der Adhärenz wirksam zu sein, Oberflächenproteine sein, d.h. sie sollten an der Oberfläche der Zelle erreichbar sein. Die Erreichbarkeit ist auch wichtig, um die Antigenität zu bestimmen. Eine Vakzine, die Antikörper gegen ein Adhäsion hervorruft, kann Antikörper bereitstellen, die an eine erreichbare antigene Determinante binden und direkt mit der Adhärenz interferieren, wodurch eine Infektion verhindert wird. Ein erfindungsgemäßes Adhäsin muss nicht nur Adhäsin oder ein Adhäsionsmediator eines Gram-positiven Bakteriums sein, und der Begriff schließt irgendein Protein ein, das einen bestimmten Grad von Adhäsionsaktivität zeigt, egal ob sie relativ stark oder relativ schwach ist.
Eine "Virulenz Determinante" ist ein irgendein bakterielles Produkt, das für bakterielles Überleben innerhalb eines infizierten Wirts benötigt wird. Somit sind Viru lenz Determinanten auch attraktive Impfstoff Kandidaten, weil die Neutralisierung einer Virulenz Determinante die Virulenz der Bakterien verringern kann.
Ein "Toxin" ist ein bakterielles Produkt, das aktiv einen infizierten Wirt schädigt. Somit sind bakterielle Toxine wichtige Ziele für eine Immunantwort, um ihre Toxizität zu neutralisieren.
Ein Molekül ist "antigen", wenn es in der Lage ist, spezifisch mit einem Antigen Erkennungsmolekül des Immunsystems zu interagieren, wie einem Immunglobulin (Antikörper) oder T-Zell-Antigenrezeptor. Ein antigenes Polypeptid enthält mindestens ungefähr 5 und vorzugsweise mindestens 10 Aminosäuren. Ein antigener Abschnitt eines Moleküls kann jener Abschnitt sein, der immundominant für Antikörper- oder T-Zell-Rezeptorerkennung ist, oder es kann ein Abschnitt sein, der verwendet wird, um einen Antikörper gegen das Molekül durch Konjugieren des antigenen Abschnitts an ein Träger Molekül für die Immunisierung zu bilden. Ein Molekül, das antigen ist, muss nicht selbst immunogen sein, d.h. in der Lage sein, eine Immunantwort ohne einen Träger hervorzurufen.
Eine Zusammensetzung umfassend "A" (wobei "A" ein einzelnes Protein, DNA Molekül, Vektor, etc. ist) ist im Wesentlichen frei von "B" (wobei "B" eines oder mehrere kontaminierende Proteine, DNA Moleküle, Vektoren, etc. umfasst) wenn mindestens ungefähr 75 Gew.-% der Proteine, DNA, Vektoren (abhängig von der Kategorie der Spezies, zu der A und B gehören) in der Zusammensetzung "A" ist. Vorzugsweise umfasst "A" mindestens ungefähr 90 Gew.-% der A + B Spezies in der Zusammensetzung, am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99 Gew.-%. Es ist außerdem bevorzugt, dass eine Zusammensetzung, die im Wesentlichen frei von Kontamination ist, nur eine einzige Molekulargewichtsspezies mit der Aktivität oder der Eigenschaft der interessierenden Spezies enthält.
Die Bezeichnung "pharmazeutisch verträglich" betrifft molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die physiologisch tolerabel sind und typischerweise keine allergische oder ähnliche unpassende Reaktion hervorrufen, wie Magenverstim mung, Benommenheit und ähnliches, wenn sie an einen Menschen verabreicht werden. Vorzugsweise, so wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "pharmazeutisch verträglich" zugelassen durch eine regulatorische Stelle des Bundes oder einer Länderregierung oder gelistet in dem US Arzneibuch oder anderen allgemein anerkannten Arzneibüchern für die Verwendung in Tieren, und insbesondere im Menschen. Der Begriff "Träger" betrifft ein Verdünnungsmittel, ein Adjuvans, einen Trägerstoff oder ein Vehikel mit dem die Verbindung verabreicht wird. Solche pharmazeutischen Träger können sterile Flüssigkeiten, wie Wasser und Öle sein, einschließlich jene aus Petroleum, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, wie Erdnussöl, Sojaöl, Mineralöl, Sesamöl und ähnliches. Wasser und wässrige Lösungen, Salzlösungen und wässrige Dextrose und Glycerol Lösungen werden bevorzugt als Träger, insbesondere für injizierbare Lösungen verwendet.
Der Begriff "Adjuvans" betrifft eine Verbindung oder ein Gemisch, das die Immunantwort gegen ein Antigen verstärkt. Ein Adjuvans kann als ein Gewebedepot dienen, das langsam das Antigen abgibt, und auch als ein Aktivator des lymphoiden Systems, der nicht spezifisch die Immunantwort verstärkt (Hood et al., Immunology, Zweite Aufl., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, S. 384). Häufig wird ein chimärer Challenge mit einem Antigen alleine, in der Abwesenheit eines Adjuvans, nicht in der Lage sein, eine humorale oder zelluläre Immunantwort hervorzurufen. Adjuvanzien schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf vollständiges Freund'sches Adjuvans, unvollständiges Freund'sches Adjuvans, Saponin, Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, Oberflächen aktive Substanzen, wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanione, Peptide, Öl und Kohlenwasserstoff Emulsionen, Keyhole Limpet Hämocyanine, Dinitrophenol und möglicherweise nützliche humane Adjuvanzien, wie BCG (bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum. Vorzugsweise ist das Adjuvans pharmazeutisch verträglich.
In ihrem ersten Aspekt beschreibt die vorliegende Anmeldung die Identifizierung und Isolierung eines Gens, das ein exportiertes Protein in einem Gram-positiven Bakterium kodiert. Das exportierte Protein kann ein Protein bekannter oder unbekannter Funktion sein. Hier werden alle solchen exportierten Proteine, egal ob sie bekannter oder unbekannter Funktion sind, als "Exp" (für exportiertes Protein) bezeichnet, und die Gene, die solche Proteine kodieren, werden als "exp" Gene bezeichnet. Insbesondere beschreibt die Anmeldung die Isolierung von Genen, die Gram-positive bakterielle Adhäsions assoziierte Proteine, vorzugsweise Adhäsine, Virulenz Determinanten, Toxine und immundominante Antigene kodieren.
Insbesondere beschreibt die Anmeldung verschiedene exportierte Proteine von S. pneumoniae (siehe Tabelle 1, infra), von denen manche eine Aktivität als Adhäsine zeigen. Beispielsweise beschreibt die Anmeldung Gen Fragmente der folgenden exportierten Proteine: Exp1 [SEQ ID NR: 2] die Gesamtlängen Sequenz, von der, als Plp1 [SEQ ID NR: 47] ebenfalls beschrieben ist, kodiert jeweils von exp1 [SEQ ID NR: 1] und plp1 [SEQ ID NR: 46], ein Protein, von dem es scheint, dass es mit der Permease Familie von Proteinen in Verbindung steht und das deshalb überraschend mit Adhäsion assoziiert ist; Exp2 [SEQ ID NR: 3], kodiert von exp2 [SEQ ID NR: 4], dessen Nukleinsäuresequenz identisch ist zu ponA, welches das Penicillin bindende Protein 1A kodiert (Martin et al., 1992, J. Bacteriol. 174:4517-4523) und das unerwartet mit Adhäsion assoziiert ist; Exp3 [SEQ ID NR: 6], kodiert von exp3 [SEQ ID NR: 5], das mit Adhäsion assoziiert ist; Exp4 [SEQ ID NR: 8], kodiert von exp4 [SEQ ID NR: 7], das mit Adhäsion assoziiert ist; Exp5 [SEQ ID NR: 10], kodiert von exp5 [SEQ ID NR: 9]; Exp6 [SEQ ID NR: 12], kodiert von exp6 [SEQ ID NR: 11]; Exp7 [SEQ ID NR: 14], kodiert von exp7 [SEQ ID NR: 13]; Exp8 [SEQ ID NR: 16], kodiert von exp8 [SEQ ID NR: 15]; Exp9 [SEQ ID NR: 18 und 20], kodiert von exp9 [jeweils SEQ ID NR: 17 und 19]; Exp10 [SEQ ID NR: 22], kodiert von exp10 [SEQ ID NR: 21]; und Pad1 [SEQ ID NR: 56], kodiert von pad1 [SEQ ID NR: 55], das ein Homolog einer Pyruvat Oxidase ist. Die Stammbezeichnungen von mutanten Bakterien, in denen die Exp1–9 Proteine identifiziert wurden, sind in Tabelle 1 offenbart. Die Stammbezeichnung der Mutante, in der Exp10 identifiziert wurde, ist SPRU25. Die Anmelder haben auch ein mutantes S. pneumoniae (SPRU121) isoliert, in dem das amiA Gen, welches das AmiA Protein kodiert, mutiert wurde und haben zum ersten Mal gezeigt, dass dies ein Adhäsions assoziiertes Protein ist und somit, dass dieses Protein als ein Impfstoff verwendet werden kann, um eine anti-Adhäsion assoziierte Protein Immunantwort hervorzurufen.
Sobald die Gene, die exportierte Proteine kodieren, isoliert sind, können sie direkt als ein in vivo Nukleinsäure basierter Impfstoff verwendet werden. Alternativ dazu kann die Nukleotidsequenz der Gene verwendet werden, um Oligonukleotid Sonden oder Primer für Polymerase Kettenreaktion (PCR) für die Diagnostik einer Infektion mit einem bestimmten Stamm oder Spezies eines Gram-positiven Bakteriums herzustellen.
Alternativ dazu können die Proteine, die von den isolierten Genen kodiert werden, exprimiert und verwendet werden, um Impfstoffe für den Schutz gegen den Stamm der Bakterien herzustellen, aus dem das exportierte Protein erhalten wurde. Wenn das exportierte Protein ein Adhäsions assoziiertes Protein ist, wie ein Adhäsin, ist es ein besonders attraktiver Impfstoff Kandidat, weil die Immunität mit der Fähigkeit des Bakteriums wechselwirken kann, an Wirtszellen anzuheften, und somit innerhalb des Wirtsorganismus infizieren, d.h. kolonisieren und überleben kann. Wenn das exportierte Protein eine Virulenz Determinante ist, kann die Immunität mit der Virulenz wechselwirken. Wenn das exportierte Protein ein Toxin ist, kann die Immunität mit der Toxizität wechselwirken. Wenn das exportierte Protein ein Antigen ist, das allen oder den meisten der Stämme einer bestimmten Spezies von Bakterium gemeinsam ist, ist es ein idealer Kandidat für einen Impfstoff gegen alle oder die meisten der Stämme dieser Spezies, z.B. S. pneumoniae.
Alternativ kann das Protein verwendet werden, um ein geeignetes Tier zu immunisieren, um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu bilden, wie unten im Detail beschrieben ist. Solche Antikörper können in Immunassays verwendet werden, um eine Infektion mit einem bestimmten Stamm oder einer bestimmten Spezies von Bakterien zu diagnostizieren. Somit können Stamm spezifische exportierte Proteine verwendet werden, um Stamm spezifische Antikörper für die Diagnose einer Infektion mit diesem Stamm zu bilden. Alternativ dazu können gemeinsame Antigene verwendet werden, um Antikörper für die Diagnose einer Infektion mit dieser Spezies des Bakteriums, z.B. S. pneumoniae herzustellen.
Wenn das Exp ein Adhäsin ist, kann ein lösliches Protein an ein Subjekt verabreicht werden, das im Verdacht steht, an einer Infektion zu leiden, um die Adhärenz des Bakteriums zu inhibieren.
Isolierung von Genen für exportierte Proteine
Die vorliegende Anmeldung beschreibt eine Anzahl von Gen Fragmenten, die verwendet werden können, um das Gesamtlängen Gen zu erhalten, das exportierte Gram-positive bakterielle Antigene kodiert, insbesondere exportierte Adhäsine.
Die Anmeldung beschreibt weiterhin ein Verfahren, unter Verwendung eines Vektors, der ein Indikator Protein kodiert, das nur funktionell ist, wenn es aus einem Bakterium exportiert wird, wie der phoA Vektor, der hier beschrieben ist, um nach Genen zu screenen, die exportierte pneumokokkale Proteine kodieren. Zum Beispiel kann eine verkürzte Form von phoA in einem pneumokokkalen Shuttle Vektor, wie dem Vektor pJDC9, angeordnet werden (Chen und Morrison, 1988, Gene 64:155-164). Eine Klonierungsstelle, die eine einzigartige Restriktionsstelle enthält, z.B. SmaI oder BamHI kann unmittelbar 5' zu phoA angeordnet werden, um die Insertion von DNA zu erlauben, die ein exportiertes Protein kodieren kann. Vorzugsweise werden die Klonierungsstellen in dem Vektor von zwei Restriktionsstellen flankiert, um die einfache Identifizierung eines Inserts zu erleichtern. In einer spezifischen Ausführungsform ist die Restriktionsstelle eine KpnI Stelle, obwohl irgendeine Restriktionsendonuklease verwendet werden kann. Gen Fragmente, die Exp's kodieren, werden auf der Basis der Blaufärbung um das Bakterium ausgewählt, was den Export des PhoA Enzyms anzeigt. Die exp-phoA Fusionsgene können in E. coli exprimiert werden, obwohl eine Promotorfusion in diesem Fall benötigt werden kann. Wenn es in das Genom eines Gram-positiven Organismus integriert ist, ist das exp-phoA Fusionsgen eine translationale Fusion, die eine Duplikationsmutagenese einschließt, und sie wird in einem Gram positiven Bakterium exprimiert. In einer besonderen Ausführungsform werden pneumokokkale Export Proteine mit dieser Technik identifiziert, die das Klonieren eines inneren Gen Fragments innerhalb des Vektors vor der Integration benötigt.
Die Anwendung beschreibt auch das Screenen nach Genen, die exportierte Adhäsions assoziierte Proteine kodieren, was an PhoA-positiven Transformanten durch Testen des Verlustes der Adhärenz eines Gram-positiven Bakteriums an eine primäre Zelle oder eine Zelllinie, an die sie normalerweise anheftet, durchgeführt wird. Solche Adhäsionsassays können an irgendeiner eukaryonten Zelllinie durchgeführt werden. Vorzugsweise, wenn die Infektion von Menschen wichtig ist, ist die Zelle oder Zelllinie von einer humanen Quelle abgeleitet, oder es wurde gezeigt, dass sie sich wie humane Zellen in einem bestimmten in vitro Assay verhalten. Geeignete Zellen und Zelllinien schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf endotheliale Zellen, Lungen Zellen, Leukozyten, bukkale Zellen, adenoide Zellen, Haut Zellen, konjunktivale Zellen, ziliate Zellen und andere Zellen, die für die infizierten Organe repräsentativ sind. Wie in einem Beispiel, infra, gezeigt, kann eine humane Nabelschnurvenen endotheliale Zellinie (HUVEC), die von Clonetics (San Diego, CA) erhältlich ist, verwendet werden. In einem anderen Beispiel, infra, können Lungen Typ II alveolare Zellen, die hergestellt werden können, wie in Beispiel 2 beschrieben ist, oder die als eine Zelllinie von der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Zugangsnummer ATCC A549 erhältlich sind, verwendet werden. Alternativ kann die Adhärenz gegenüber humanen Makrophagen, die von Monozyten abstammen, die aus Blut erhalten werden, untersucht werden. Andere Zielzellen, insbesondere von S. pneumoniae sind oropharyngale Zellen, wie buckale epitheliale Zellen (Andersson et al. (1988), Microb. Pathogen. 4:267-278; 1983, J. Exp. Med. 158:559-570; 1981, Infect. Immun. 32:311-317).
Im Allgemeinen kann irgendein Adhärenz Assay, der im Stand der Technik bekannt ist, verwendet werden, um den Verlust von Adhäsion während der Mutagenese des Exp zu zeigen. Ein solcher Assay folgt: die Zellen, gegen welche die Adhärenz untersucht werden soll, werden für 4–8 Tage kultiviert (Wright und Silverstein, 1982, J. Exp. Med. 156:1149-1164) und anschließend in Terasaki Scha len 24 Stunden vor dem Adhärenz Assay transferiert, um die Bildung eines konfluenten Monolayers zu erlauben (Geelen et al., 1993, Infect. Immun. 61:1538-1543). Die Bakterien sind mit Fluoreszein markiert (Geelen et al., supra), auf eine Konzentration von 5 × 10⁷ cfu/ml eingestellt und werden in einem Volumen von 5 μl zu mindestens 6 Vertiefungen zugegeben. Nach Inkubation bei 37°C für 30 Min. werden die Platten gewaschen und mit PBS/Glutaraldehyd 2,5 % fixiert. Angeheftete Bakterien werden optisch unter Verwendung eines Fluoreszenz Mikroskops, wie einem Nikon Diaphot invertierten Mikroskop, das mit Epifluoreszenz ausgestattet ist, ausgezählt.
Weil zwei Mechanismen, die Zellwand und Adhäsin Proteine, die Adhärenz eines Gram-positiven Bakteriums, insbesondere S. pneumoniae an eine Ziel Zelle bestimmen, kann es wichtig sein, zu unterscheiden, ob die Mutation in dem exportierten Protein, das die Adhärenz inhibiert, eine Mutation an einem Protein ist, das in die Zellwand Synthese oder ein Adhäsin involviert ist. Eine Mutation in dem zuerst genannten hätte eine indirekte Wirkung auf die Adhärenz, während eine Mutation im zuletzt genannten die Adhärenz direkt beeinflussen würde. Die folgenden Assays können verwendet werden, um zu unterscheiden, ob das mutierte Protein ein Adhäsin ist oder nicht: (1) weil die Adhärenz an Makrophagen hauptsächlich durch exportierte Proteine vermittelt wird, werden Adhärenz Assays an Makrophagen unmittelbar anzeigen, ob die Mutation an einem Adhäsin stattgefunden hat; (2) es wird einen minimalen Effekt auf die Adhärenz haben, wenn die bakterielle Zellwand in dem Adhärenz Assay getrennt zugegeben wird, wenn die Mutation an einem Protein stattgefunden hat, das direkt in die Adhärenz involviert ist, und eine weitere Inhibition der Adhärenz, wenn sie zu einer Mutante zugegeben wird, die in einem Adhäsin mutiert ist; (3) die Vorbehandlung der Bakterien mit einer Protease, wie Trypsin, wird zu weiterer Inhibition der Adhärenz führen, wenn die Mutation an einem Protein stattgefunden hat, das direkt in die Adhärenz involviert ist, aber wird keine Wirkung haben, wenn das mutierte Protein ein Adhäsin ist; (4) sobald das Gesamtlängen exp Gen isoliert ist, kann das putative Adhäsin in E. coli oder einem anderen Zelltyp exprimiert werden, oder das gereinigte putative Adhäsin kann kovalent mit verschiedenen Trägern assoziiert werden, wie einem Bakterium, einer Erythrozyte oder einem Agarose Kügelchen, und die Fähigkeit des putativen Adhäsins, die Adhärenz zu vermitteln, kann bewertet werden; (5) die Zellwand Struktur von Mutanten kann unter Verwendung von Standard Techniken, insbesondere HPLC Fingerprinting, bewertet werden, um zu bestimmen, ob die Mutation zu Änderungen in der Zellwand Struktur führte, was eine Mutation in einem Protein anzeigt, das direkt in die Adhärenz involviert ist.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch das Identifizieren von Genen, die exportierte Virulenz Determinanten kodieren. Im Allgemeinen können Virulenz Determinanten identifiziert werden durch Testen des mutanten Stamms in einem Tiermodell für Virulenz, zum Beispiel durch Bewertung des LD₅₀ des Tieres, das mit dem Stamm infiziert ist. Ein Anstieg in dem LD₅₀ zeigt einen Verlust von Virulenz an, und deshalb, dass die Mutation in einem Locus stattgefunden hat, der für Virulenz benötigt wird.
Die Anmeldung beschreibt auch die Identifizierung eines Exp, das ein Antigen ist, das allen oder vielen Stämmen einer Spezies von Bakterien, oder in nahe verwandten Spezies von Bakterien gleich ist. Dies wird einfach erreicht durch die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch gegen ein Exp (dessen Herstellung im Detail infra beschrieben wird) ist. Die Fähigkeit des Antikörpers gegenüber dem bestimmten Stamm oder gegenüber allen oder vielen anderen Stämmen dieser Spezies oder gegenüber nahe verwandten Spezies zeigt, dass das Exp ein gemeinsames Antigen ist. Dieser Antikörper Assay ist insbesondere bevorzugt, weil er immunologisch relevanter ist, weil das Exp, das ein gemeinsames Antigen ist, ein attraktiver Impfstoff Kandidat ist.
Im Allgemeinen beschreibt die Anmeldung auch die Identifizierung einer funktionellen Eigenschaft eines Proteins, das durch ein exp Gen hergestellt wird, durch Vergleichen der Homologie der abgeleiteten Aminosäure oder Nukleotidsequenz mit der Aminosäuresequenz eines bekannten Proteins oder einer Nukleotidsequenz des Gens, welches das Protein kodiert.
Irgendeine Gram-positive bakterielle Zelle kann potenziell als die Nukleinsäurequelle für das molekulare Klonieren eines exp Gens dienen. Die Nukleinsäure Sequenzen können aus Streptococcus, Bacillus, Mycobacterium, Staphylococcus, Enterococcus und anderen Gram-positiven bakteriellen Quellen, etc. isoliert werden. Die DNA kann durch Standard Verfahren, die im Stand der Technik von klonierter DNA bekannt sind (z.B. eine DNA "Bibliothek"), durch chemische Synthese, durch cDNA Klonierung oder durch das Klonieren von genomischer DNA oder Fragmenten davon, gereinigt aus der gewünschten Zelle (siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, supra, Glover, D.M. (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II) erhalten werden. Unabhängig von der Quelle sollte das Gen molekular in einen geeigneten Vektor für die Vermehrung des Gens kloniert werden.
Beim molekularen Klonieren des Gens aus genomischer DNA werden DNA Fragmente gebildet, von denen einige das gewünschte Gen kodieren werden. Die DNA kann an spezifischen Stellen unter Verwendung von Restriktionsenzymen gespalten werden. Alternativ kann DNase in der Anwesenheit von Mangan verwendet werden, um die DNA zu fragmentieren, oder die DNA kann physikalisch geschert werden, zum Beispiel durch Sonifizieren. Die linearen DNA Fragmente können anschließend nach der Größe durch Standard Techniken getrennt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Agarose und Polyacrylamid Gelelektrophorese und Säulen Chromatographie.
Sobald die DNA Fragmente gebildet sind, kann die Identifizierung des spezifischen DNA Fragments, welches das gewünschte exp Gen enthält, auf eine Vielzahl von Wegen erreicht werden. Wenn zum Beispiel eine Menge eines Abschnitts eines exp Gens oder eines Fragments davon zur Verfügung steht und gereinigt und markiert werden kann, können die gebildeten DNA Fragmente durch Nukleinsäure Hybridisierung mit der markierten Sonde gescreent werden (Benton und Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein und Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.k 72:3961). Jene DNA Fragmente mit substanzieller Homologie zu der Sonde werden hybridisieren. Die vorliegende Erfindung stellt spezifische Beispiele von DNA Fragmenten bereit, die als Hybridisierungssonden für pneumokokkale exportierte Proteine verwendet werden können. Diese DNA Sonden können zum Beispiel auf den SEQ ID NR: 1, 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 oder 21 beruhen. Alternativ dazu kann die erfindungsgemäße Screening Technik verwendet werden, um zusätzliche exp Gen Fragmente zur Verwendung als Sonden zu isolieren.
Es ist auch möglich, ein geeignetes Fragment durch Restriktionsenzym Spaltung(en) und Vergleichen der Fragmentgrößen mit jenen, die nach einer bekannten Restriktionskarte erwartet werden, wenn eine solche vorhanden ist, zu identifizieren. Eine weitere Selektion kann auf der Basis der Eigenschaften des Gens durchgeführt werden.
Wie oben beschrieben, kann die Anwesenheit des Gens durch Assays nachgewiesen werden, die auf den physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften ihres exprimierten Produkts beruhen. Zum Beispiel DNA Klone, die ein Protein bilden, das z.B. ähnliche oder identische elektrophoretische Migration, isoelektrisches Fokussierungsverhalten, proteolytische Spaltungskarten, proteolytische Aktivität, antigene Eigenschaften oder funktionelle Eigenschaften, insbesondere Adhäsionsaktivität, wie für ein bestimmtes Exp bekannt ist (oder im Fall eines Adhäsions assoziierten Proteins, unbekannt ist), aufweisen. In einem spezifischen Beispiel, infra, wird die Fähigkeit eines pneumokokkalen Exp Proteins, Adhäsion zu vermitteln, durch Inhibierung der Adhäsion gezeigt, wenn das Protein mutiert ist. Die Expression von Exp in einer anderen Spezies, wie E. coli, kann direkt zeigen, ob das exp ein Adhäsin kodiert.
Alternativen zur Isolierung der exp genomischen DNA schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf das chemische Synthetisieren der Gen Sequenz selbst aus einer bekannten Sequenz, die ein Exp kodiert. Zum Beispiel kann DNA, die für ein exp Gen kodiert, aus Gram-positiven Bakterien durch PCR unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden isoliert werden. Andere Verfahren sind möglich.
Das identifizierte und isolierte Gen kann anschließend in einen geeigneten Klonierungsvektor eingebaut werden. Eine große Anzahl von Vektor-Wirtssystemen, die im Stand der Technik bekannt sind, können verwendet werden. Mögliche Vektoren schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Plasmide oder modifizierte Viren, aber das Vektor System muss mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel sein. Zum Beispiel kann die exp kodierende Sequenz in einen E. coli Klonierungsvektor eingebaut werden. Andere Beispiele von Vektoren schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Bakteriophagen, wie Lambda Derivate, oder Plasmide, wie pBR322 Derivate oder pUC Plasmid Derivate, z.B. pGEX Vektoren, pmal-c, pFLAG, etc. Der Einbau in einen Klonierungsvektor kann zum Beispiel durch Ligieren des DNA Fragments in einen Klonierungsvektor, der komplementäre kohäsive Enden aufweist, erreicht werden. Wenn jedoch die komplementären Restriktionsstellen, die verwendet werden, um die DNA zu fragmentieren, in dem Klonierungsvektor nicht anwesend sind, können die Enden der DNA Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Alternativ dazu kann irgendeine gewünschte Stelle durch das Ligieren von Nukleotidsequenzen (Linker) an die DNA Enden hergestellt werden; diese ligierten Linker können spezifische chemisch synthetisierte Oligonukleotide enthalten, die Restriktionsendonuklease Erkennungssequenzen kodieren. Rekombinante Moleküle können in Wirtszellen über Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation, etc. eingeführt werden, so dass viele Kopien der Gen Sequenz gebildet werden.
In einem alternativen Verfahren kann das gewünschte Gen identifiziert und nach der Insertion in einen geeigneten Klonierungsvektor in einem "Shot Gun" Ansatz isoliert werden. Die Anreicherung hinsichtlich des gewünschten Gens, zum Beispiel durch Größenfraktionierung, kann vor dem Einbau in den Klonierungsvektor durchgeführt werden.
Die Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA Molekülen, die das isolierte exp Gen oder die synthetisierte DNA Sequenz einbauen, erlaubt die Bildung von multiplen Kopien des Gens. Somit kann das Gen in großen Mengen durch das Anziehen von Transformanten, das Isolieren der rekombinanten DNA Moleküle aus den Transformanten und, wo notwendig, das Rückgewinnen des eingebauten Gens aus der isolierten rekombinanten DNA erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Vektoren, die Gene enthalten, die Analoga und Derivate von Exp's kodieren, welche dieselbe funktionelle Aktivität wie ein Exp aufweisen. Die Herstellung und die Verwendung von Derivaten und Analoga, die sich auf ein Exp beziehen, sind vorgesehen. Zum Beispiel kann das Derivat oder Analogon funktionell aktiv, d.h. in der Lage sein, eine oder mehrere funktionelle Aktivitäten, die mit einem Gesamtlängen, Wildtyp Exp assoziiert sind, zu zeigen. Als ein Beispiel zeigen solche Derivate oder Analoga Adhäsin Aktivität.
Insbesondere können Exp Derivate durch Verändern der kodierenden Nukleinsäuresequenzen durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen, die funktionell äquivalente Moleküle bereitstellen, hergestellt werden. Aufgrund der Degeneriertheit der Nukleotid kodierenden Sequenzen können andere DNA Sequenzen, die im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie ein exp Gen kodieren, verwendet werden. Dies schließt ein, aber ist nicht begrenzt auf Nukleotidsequenzen, welche das Gesamte oder Abschnitte von exp Genen aufweisen, die durch die Substitution von verschiedenen Kodons, welche denselben Aminosäure Rest innerhalb der Sequenz kodieren, verändert sind, wodurch ein stiller Austausch hergestellt wird. Genauso schließen die Exp Derivate ein, aber sind nicht beschränkt auf jene, die als eine primäre Aminosäuresequenz die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines Exp enthalten, einschließlich veränderter Sequenzen, in denen funktionell äquivalente Aminosäure Reste gegen Reste innerhalb der Sequenz ausgetauscht sind, die zu einer konservativen Aminosäure Substitution führen. Zum Beispiel kann/können eine oder mehrere Aminosäure Reste innerhalb der Sequenz gegen eine andere Aminosäure mit gleicher Polarität ausgetauscht werden, die als ein funktionelles Äquivalent wirkt, was zu einer stillen Veränderung führt. Die Substituenten für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus anderen Mitgliedern der Klasse ausgewählt werden, zu welcher die Aminosäure gehört. Zum Beispiel schließen die nicht polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminsäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein.
Gene, die Exp Derivate und Analoga kodieren, können durch verschiedene Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Die Manipulationen, die zu ihrer Herstellung führen, können auf der Gen oder Protein Ebene stattfinden. Zum Beispiel kann eine klonierte exp Gen Sequenz durch irgendeine der zahlreichen Strategien, die im Stand der Technik bekannt sind, modifiziert werden (Sambrook et al., 1989, supra). Die Sequenz kann an geeigneten Stellen mit Restriktionsendonuklease/n gespalten, gefolgt durch weitere enzymatische Modifikation, wenn gewünscht, isoliert und in vitro ligiert werden. Bei der Herstellung des Gens, das ein Derivat oder Analog von Exp kodiert, sollte vorsichtig vorgegangen werden, um sicherzustellen, dass das modifizierte Gen innerhalb desselben translationalen Leserahmens wie das exp Gen, nicht durch translationale Stopp Signale unterbrochen, in der Gen Region, wo die gewünschte Aktivität kodiert wird, verbleibt.
Zusätzlich kann die exp Nukleinsäuresequenz in vitro oder in vivo mutiert werden, um Translations-, Initiations- und/oder Terminationssequenzen zu kreieren und/oder zu zerstören, oder um Variationen in kodierenden Regionen zu kreieren und/oder um neue Restriktionsendonuklease Stellen zu bilden oder existierende zu zerstören, um die weitere in vitro Modifikation zu erleichtern. Irgendeine Technik für Mutagenese, die im Stand der Technik bekannt ist, kann verwendet werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf in vitro seitengerichtete Mutagenese (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; Zoller und Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant et al., 1986, Gene 44:177; Hutchinson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:710) und die Verwendung von TAB^® Linkern (Pharmacia), etc. PCR Techniken sind bevorzugt für seitengerichtete Mutagenese (siehe Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA" in PCR Technology Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, Hrsg., Stockton Press, Kapitel 6, S. 61-70).
Expression eines exportierten Proteins
Das Gen, das für ein Exp oder ein funktionell aktives Fragment oder anderes Derivat davon kodiert, kann in einen geeigneten Expressionsvektor, d.h. einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der eingebauten Protein kodierenden Sequenz enthält, eingebaut werden. Ein Expressionsvektor kann vorzugsweise einen Replikationsursprung einschließen. Die notwendigen transkriptionellen und translationalen Signale können auch durch das native exp Gen und/oder seine flankierenden Regionen bereitgestellt werden. Eine Vielzahl von Wirts-Vektorsystemen kann verwendet werden, um die Protein kodierende Sequenz zu exprimieren. Vorzugsweise wird jedoch ein bakterielles Expressionssystem verwendet, um hohe Expressionsmengen des Proteins mit einer höheren Wahrscheinlichkeit der nativen Konformation bereitzustellen. Mögliche Wirts-Vektorsysteme schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Säuger Zellsysteme, die mit Virus infiziert sind (z.B. Vaccinia Virus, Adenovirus, etc.); Insekten Zellsysteme, die mit Virus infiziert sind (z.B. Baculovirus); Mikroorganismen, wie Hefe, die Hefe Vektoren enthalten, oder Bakterien, die mit einem Bakteriophagen, DNA, Plasmid DNA oder Cosmid DNA transformiert sind. Die Expressionselemente der Vektoren variieren in ihrer Stärke und ihren Spezifitäten. In Abhängigkeit von dem verwendeten Wirts-Vektorsystem kann irgendeine Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden.
Vorzugsweise wird die periplasmatische Form des Exp (mit einer Signal Sequenz) für den Export des Proteins in das Escherichia coli Periplasma oder in einem Expressionssystem, das auf Bacillus subtilis beruht, hergestellt. Der Export in das Periplasma kann die richtige Faltung des exprimierten Proteins fördern.
Irgendeines der zuvor beschriebenen Verfahren für die Insertion von DNA Fragmenten in einen Vektor kann verwendet werden, um die Expressionsvektoren zu konstruieren, die ein chimäres Gen bestehend aus geeigneten transkriptionellen/translationalen Kontrollsignalen und den Protein kodierenden Sequenzen, enthalten. Diese Verfahren können in vitro rekombinante DNA und synthetische Techniken und in vivo Rekombinanten (genetische Rekombination) einschließen.
Die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein exportiertes Protein oder Peptid Fragment kodiert, kann durch eine zweite Nukleinsäuresequenz reguliert werden, so dass das exportierte Protein oder Peptid in einem Wirt exprimiert wird, der mit dem rekombinanten DNA Molekül transformiert ist. Zum Beispiel kann die Expression eines exportierten Proteins durch irgendein Promotor/Enhancer Element, das im Stand der Technik bekannt ist, kontrolliert werden, aber diese regulatorischen Elemente müssen in dem gewählten Wirt für die Expression funktionell sein. Für die Expression in Bakterien werden bakterielle Promotoren benötigt. Eurkaryonte virale oder eukaryonte Promotoren, einschließlich gering spezifischen Promotoren, sind bevorzugt, wenn ein Vektor, der ein exp Gen enthält, direkt in ein Subjekt für transiente Expression injiziert wird, was zu einem heterologen Schutz gegen bakterielle Infektion führt, wie unten im Detail beschrieben wird. Promotoren, die für die Kontrolle der exp Gen Expression verwendet werden können, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf die SV40 frühe Promotor Region (Benoist und Chambon, 1981, Nature 290:304-310), den Promotor, der in der 3' langen terminalen Wiederholung des Rous Sarkom Virus enthalten ist (Yamamoto, et al., 1980, Cell, 22:787-797), den Herpes Thymidin Kinase Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein Gens (Bristner et al., 1982, Nature 296:39-42); prokaryonte Expressionsvektoren, wie den β-Lactamase Promotor (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), oder den tac Promotor (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25); siehe auch "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94; und die folgenden tierischen transkriptionellen Kontrollregionen, die folgenden tierischen transkriptionellen Kontrollregionen, die Gewebespezifität zeigen und die in transgenen Tieren verwendet wurden: die Elastase I Gen Kontrollregion, die in pankreatischen Acinar Zellen aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409, MacDonald 1987, Hepatology 7:425-515); die Insulin Gen Kontrollregion, die in pankreatischen Beta Zellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315:115-112), die Immunglobulin Gen Kontrollregion, die in lymphoiden Zellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-638, Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), die Maus Mamma Tumor Virus Kontrollregion, die in testikulären, Brust, lymphoiden und Mast Zellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), die Albumin Gen Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), die Alpha-Fetoprotein Gen Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58), die Alpha 1 Antitrypsin Gen Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), die Beta-Globin Gen Kontrollregion, die in myeloiden Zellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature, 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94), die Myelin basische Protein Gen Kontrollregion, die in Oligodendrozyten Zellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712), die Myosin leichte Kette-2 Gen Kontrollregion, die im Skelettmuskel aktiv ist (Sani, 1985, Nature 314:283-286), und die Gonadotropin Freisetzungshormon Gen Kontrollregion, die im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
Expressionsvektoren, die exp Gen Inserts enthalten, können durch vier allgemeine Ansätze identifiziert werden: (a) PCR Amplifikation der gewünschten Plasmid DNA oder spezifischen mRNA, (b) Nukleinsäure Hybridisierung, (c) Anwesenheit oder Abwesenheit von "Marker" Gen Funktionen, und (d) Expression von eingebauten Sequenzen. In dem ersten Ansatz können die Nukleinsäuren durch PCR mit Einbau von Radionukleotiden amplifiziert oder mit Ethidiumbromid gefärbt werden, um den Nachweis des amplifizierten Produkts zu ermöglichen. In dem zweiten Ansatz kann die Anwesenheit eines Fremdgens, das in einen Expressionsvektor eingebaut ist, durch Nukleinsäure Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, die Sequenzen umfassen, die homolog zu einem eingebauten exp Gen sind, nachgewiesen werden. In dem dritten Ansatz kann das rekombinante Vektor-Wirtssystem basierend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten "Marker" Gen Funktionen (z.B. β-Galactosidase Aktivität, PhoA Aktivität, Thymidin Kinase Aktivität, Resistenz gegenüber Antibiotika, Transformationsphänotyp, Bildung von Einschlusskörpern in Baculovirus, etc.), die durch die Insertion von Fremdgenen in den Vektor verursacht werden, identifiziert und ausgewählt werden. Wenn das exp Gen innerhalb der Marker Gen Sequenz des Vektors eingebaut ist, können die Rekombinanten, die das exp Insert enthalten, durch die Abwesenheit der Marker Gen Funktion identifiziert werden. In dem vierten Ansatz können rekombinante Expressionsvektoren durch Testen hinsichtlich der Aktivität des exp Gen Produkts, das durch die Rekombinante exprimiert wird, identifiziert werden. Solche Assays beruhen zum Beispiel auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des exp Gen Produkts in in vitro Assay Systemen, z.B. Adhärenz gegenüber einer Zielzelle oder Bindung mit einem Antikörper an das exportierte Protein.
Sobald ein geeignetes Wirtssystem und geeignete Wachstumsbedingungen etabliert sind, können rekombinante Expressionsvektoren vermehrt und in Mengen hergestellt werden. Wie zuvor erklärt, schließen die Expressionsvektoren, die verwendet werden können, ein, aber sind nicht beschränkt auf die folgenden Vektoren oder ihre Derivate: humane oder tierische Viren, wie Vaccinia Virus oder Adenovirus; Insekten Viren, wie Baculovirus; Hefe Vektoren; Bakteriophagen Vektoren (z.B. Lambda) und Plasmid und Cosmid DNA Vektoren, um nur einige zu nennen. Die Wahl des Vektors wird von der gewünschten Verwendung des Vektors (z.B. für die Expression des Proteins in prokaryonten oder eukaryonten Zellen, oder als ein Nukleinsäure basierter Impfstoff, abhängen.
Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm ausgewählt werden, der die Expression der eingebauten Sequenzen moduliert, oder der das Gen Produkt in einer spezifischen gewünschten Weise modifiziert und verarbeitet. Die Expression von bestimmten Promotoren kann in der Anwesenheit von bestimmten Induktoren erhöht werden; somit kann die Expression des genetisch veränderten exportierten Proteins kontrolliert werden. Darüber hinaus weisen verschiedene Wirtszellen charakteristische und spezifische Mechanismen für die translationale und posttranslationa le Verarbeitung und Modifikation (z.B. Spaltung von Signal Sequenz) von Proteien auf. Geeignete Zelllinien oder Wirtszellen können ausgewählt werden, um die gewünschte Modifikation und Verarbeitung des exprimierten Fremdproteins sicherzustellen. Verschiedene Vektor/Wirtsexpressionssysteme können die Verarbeitungsreaktionen, wie die proteolytische Spaltung, zu einem bestimmten Ausmaß beeinflussen.
Herstellung von Antikörpern gegen exportierte Proteine
Rekombinantes Exp und Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon oder Zellen, die das zuvor genannte exprimieren, können als ein Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu bilden, die das Exp erkennen. Solche Antikörper schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf polyklonale, monoklonale, chimäre, einzelkettige, Fab Fragmente und eine Fab Expressionsbibliothek.
Verschiedene Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, können für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen ein rekombinantes Exp oder ein Derivat oder Analog davon verwendet werden. Für die Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit dem rekombinanten Exp oder einem Derivat (z.B. Fragment) davon immunisiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kaninchen, Mäuse, Ratten, etc. Beispielsweise kann das rekombinante Exp oder Fragment davon mit einem immunogenen Träger, z.B. Rinderserumalbumin (BSA) oder Keyhole Limpet Hämocyanin (engl.: keyhole limpet hemocyanin (KLH)) konjugiert werden. Verschiedene Adjuvanzien können verwendet werden, um die immunologische Antwort zu steigern, abhängig von der Wirtsspezies, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Freund'sches (vollständiges oder unvollständiges), Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, Oberflächen aktive Substanzen, wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanione, Peptide, Ölemulsionen, Keyhole Limpet Hämocyanine, Dinitrophenol und möglicherweise nützliches humanes Adjuvans, wie BCG (bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die gegen ein Exp oder Analog davon gerichtet sind, kann irgendeine Technik verwendet werden, welche die Herstellung von Antikörper Molekülen durch kontinuierte Zelllinien in Kultur bereitstellt. Diese schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf die Hybridom Technik, die ursprünglich von Kohler und Milstein entwickelt wurde (1975, Nature 256:495-497), ebenso wie die Triom Technik, die humane B-Zellhybridom Technik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) und die EBV-Hybridom Technik, um humane monoklonale Antikörper herzustellen (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96). Monoklonale Antikörper können auch in keimfreien Tieren unter Verwendung einer neueren Technologie (PCT/US90/02545) hergestellt werden. Humane Antikörper können verwendet werden und können unter Verwendung von humanen Hybridomen (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030) oder durch Transformieren von humanen B Zellen mit EBV Virus in vitro (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, A. R. Liss, S. 77-96) erhalten werden. Tatsächlich wurden Techniken für die Herstellung von "chimären Antikörpern" (Morrison et al., 1984, J. Bacteriol. 158-870; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) durch Spleißen der Gene von einem Maus Antikörper Molekül, das spezifisch für ein Exp ist, zusammen mit Genen von einem humanen Antikörper Molekül von geeigneter biologischer Aktivität, entwickelt; solche Antikörper liegen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung. Solche humanen und humanisierten chimären Antikörper sind bevorzugt für die Verwendung in der passiven Immuntherapie (beschrieben infra), weil es für die humanen oder humanisierten Antikörper selbst weniger wahrscheinlich ist als für die xenogenen Antikörper, eine Immunantwort, insbesondere eine allergische Antwort zu induzieren.
Techniken, die für die Herstellung von Einzelketten Antikörpern (US Patent 4,946,778) beschrieben wurden, können angepasst werden, um Exp-spezifische Einzelketten Antikörper herzustellen. Beispielsweise können die Techniken, die für die Konstruktion von Fab Expressionsbibliotheken beschrieben wurden (Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) verwendet werden, um eine schnelle und ein fache Identifizierung von monoklonalen Fab Fragmenten mit der gewünschten Spezifität für ein Exp oder seine Derivate oder seine Analoga zu erlauben.
Antikörper Fragmente, die den Idiotyp des Antikörper Moleküls enthalten, können durch bekannte Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel schließen solche Fragmente ein, aber sind nicht beschränkt auf: das F(ab')₂ Fragment, das durch Pepsin Spaltung des Antikörper Moleküls hergestellt werden kann; die Fab' Fragmente, die durch Reduzieren der Disulfid Brücken des F(ab')₂ Fragments hergestellt werden können, und die Fab Fragmente, die durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel, hergestellt werden können.
In der Herstellung von Antikörpern kann das Screenen hinsichtlich des gewünschten Antikörpers durch Techniken erreicht werden, die im Stand der Technik bekannt sind, z.B. Radioimmunassay, ELISA (Enzym-linked Immunosorbant Assay), "Sandwich" Immunassay, immunradiometrische Assays, Gel Diffusionspräzipitationsreaktionen, Immundiffusionsassays, in situ Immunassays (beispielsweise unter Verwendung von kolloidalen Gold, Enzym oder radioisotopen Markierungen), Western Blots, Präzipitationsreaktionen, Agglutinationsassays (z.B. Gel Agglutinationsassays, Hämagglutinationsassays), Komplement Fixierungsassays, Immunfluoreszenz Assays, Protein A Assays und Immunelektrophorese Assays, etc. In einer Ausführungsform wird die Antikörper Bindung durch Nachweisen einer Markierung auf dem primären Antikörper nachgewiesen. In einer anderen Ausführungsform wird der primäre Antikörper durch Nachweisen der Bindung eines zweiten Antikörpers oder Reagenzes an den ersten Antikörper nachgewiesen. In einer weiteren Ausführungsform ist der zweite Antikörper markiert. Viele Mittel sind im Stand der Technik zum Nachweisen der Bindung in einem Immunassay bekannt und liegen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung. Um beispielsweise Antikörper auszuwählen, die ein spezifisches Epitop eines Exp erkennen, kann man gebildete Hybridome hinsichtlich eines Produkts untersuchen, das an ein Exp Fragment bindet, das ein solches Epitop enthält. Für die Selektion eines Antikörpers, der für ein Exp von einem bestimmten Stamm des Bakteriums spezifisch ist, kann man auf der Basis der positiven Bindung dieses bestimmten Stamms des Bakteriums und einem Mangel an Bindung an ein Exp eines anderen Stamms auswählen. Für die Auswahl eines Antikörpers, der spezifisch ist für ein Exp, das ein Antigen ist, das allen oder vielen Stämmen eines bestimmten Bakteriums oder in nahe verwandten Spezies von Bakterien gemeinsam ist, kann man auf der Basis der Bindung an diesen bestimmten Stamm und an alle oder viele andere Stämme dieser Spezies oder nahe verwandten Spezies auswählen.
Die zuvor genannten Antikörper können in Verfahren, die im Stand der Technik bezüglich der Lokalisierung und Aktivität von Exp bekannt sind, z.B. für Western Blotten, das Darstellen von Exp, das Messen von Mengen davon in geeigneten physiologischen Proben, etc. verwendet werden.
Impfung und passive Immun Therapie
Eine aktive Immunität gegenüber Gram-positiven Bakterien kann durch Immunisieren (Impfung) mit einer immunogenen Menge eines exportierten Proteins oder eines antigenen Derivats oder Fragments davon und einem Adjuvans, induziert werden, wobei das exportierte Protein oder das antigene Derivat oder Fragment davon der antigene Bestandteil des Impfstoffs ist. Vorzugsweise ist das Protein an die Kohlenhydrat Kapsel oder Kapseln von einer oder mehreren Spezies des Gram-positiven Bakteriums konjugiert. Die kovalente Konjugation eines Proteins an ein Kohlenhydrat ist im Stand der Technik gut bekannt. Im Allgemeinen kann die Konjugation über eine Carbodiimid Kondensationsreaktion stattfinden.
Das exportierte Protein alleine oder konjugiert mit einer Kapsel oder Kapseln kann keine bakterielle Infektion verursachen, und die aktive Immunität, die durch Impfung mit dem erfindungsgemäßen Protein hervorgerufen wird, kann sowohl zu einer unmittelbaren Immunantwort als auch zu einem immunologischen Gedächtnis führen und damit einen Langzeitschutz gegen Infektion durch das Bakterium bereitstellen. Die erfindungsgemäßen exportierten Proteine oder antigenen Fragmente davon können in einem Gemisch mit einem Adjuvans hergestellt werden, um einen Impfstoff herzustellen.
Die Selektion eines Adjuvans hängt von dem zu impfenden Subjekt ab. Vorzugsweise wird ein pharmazeutisch verträgliches Adjuvans verwendet. Beispielsweise sollte ein Impfstoff für einen Menschen Öl oder Kohlenhydrat Emulsionsadjuvanzien, einschließlich vollständigem und unvollständigem Freund'schem Adjuvans vermeiden. Ein Beispiel eines geeigneten Adjuvans für die Verwendung im Menschen ist Alum (Alumina Gel). Ein Impfstoff für ein Tier kann jedoch Adjuvanzien enthalten, die für die Verwendung bei Menschen nicht geeignet sind.
Eine Alternative zu einem traditionellen Impfstoff umfassend ein Antigen und ein Adjuvans schließt die direkte in vivo Einführung von DNA, die das Antigen kodiert, in Gewebe eines Subjekts für die Expression des Antigens durch die Zellen des Gewebes des Subjekts, ein. Solche Impfstoffe werden hier als "Nukleinsäure basierte Impfstoffe" bezeichnet. Wie die exp Gene per Definition eine Signal Sequenz enthalten, führt die Expression des Gens in Zellen des Gewebes zu der Sekretion der Membran Assoziation des exportierten Proteins. Alternativ dazu kann der Expressionsvektor verändert sein, dass er eine autologe Signal Sequenz anstelle der exp Signal Sequenz enthält. Zum Beispiel kann ein nackter DNA Vektor (siehe z.B. Ulmer et al., 1993, Science 259:1745-1749), ein DNA Vektor Transporter (z.B. Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu und Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut et al., Kanadische Patentanmeldung NR. 2,012,311, eingereicht am 15. März 1990), oder ein viraler Vektor, der das gewünschte exp Gen enthält, in Gewebe injiziert werden. Geeignete virale Vektoren schließen Retroviren, die in Zellen mit amphotropem Wirtsbereich verpackt sind (siehe Miller, 1190, Human Gene Ther. 1:5-14; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, § 9) und attenuiertes oder defektes DNA Virus, wie, aber nicht beschränkt auf Herpes simplex Virus (HSV) (siehe z.B. Kaplitt et al., 1991, Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330), Papillomvirus, Epstein Barr Virus (EBV), Adenovirus (siehe z.B. Stratford-Perricaudet et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:626-630), Adeno assoziiertes Virus (AAV) (siehe z.B. Samulski et al., 1987, J. Virol. 61:3096-3101; Samulski et al., 1989, J. Virol. 63:3822-3828) und ähnliches, ein. Defekte Viren, die vollständig oder nahezu vollständig keine viralen Gene aufwei sen, sind bevorzugt. Defektes Virus ist nicht infektiös nach der Einführung in eine Zelle.
Vektoren, welche den erfindungsgemäßen Nukleinsäure basierte Impfstoff enthalten, können in den gewünschten Wirt durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, eingeführt werden, z.B. Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduction, Zellfusion, DEAE Dextran, Calciumphosphat Präzipitation, Lipofektion (Lysosom Funktion), Verwendung einer Gen Pistole oder eines DNA Vektor Transporters (siehe z.B. Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu und Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut et al., Kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311, eingereicht am 15. März 1990).
Jede erfindungsgemäße Impfstoff, d.h. ein Impfstoff umfassend ein Exp Antigen oder Antigen Derivat oder Fragment davon, oder ein exp Nukleinsäure Impfstoff kann über irgendeinen parenteralen Weg verabreicht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf intramuskulär, intraperitoneal, intravenös und ähnliches. Vorzugsweise, weil es das gewünschte Ergebnis der Impfung ist, eine Immunantwort gegen das Antigen und damit gegen den pathogenen Organismus hervorzurufen, ist die direkte Verabreichung oder durch das Abzielen oder die Wahl eines viralen Vektors, indirekt auf lymphoides Gewebe, z.B. Lymphknoten oder Milz, bevorzugt. Weil Immunzellen kontinuierlich replizieren, sind sie ein ideales Ziel für einen retroviralen Vektor basierten Nukleinsäure Impfstoff, weil Retroviren replizierende Zellen benötigen.
Die passive Immunität kann einem tierischen Subjekt, das unter dem Verdacht steht, an einer Infektion mit einem Gram-positiven Bakterium zu leiden, durch Verabreichen von Antiserum, polyklonalen Antikörpern oder einem neutralisierenden monoklonalen Antikörper gegen das Gram-positive Bakterium an den Patienten vermittelt werden. Obwohl die passive Immunität keinen Langzeitschutz verleiht, kann sie ein wertvolles Instrument für die Behandlung einer bakteriellen Infektion eines Subjekts sein, das nicht geimpft wurde. Die passive Immunität ist insbesondere wichtig für die Behandlung von Antibiotika resistenten Stämmen von Gram positiven Bakterien, weil keine andere Therapie zur Verfügung steht. Vorzugsweise sind die Antikörper, die für passive Immuntherapie verabreicht werden, autologe Antikörper. Wenn das Subjekt beispielsweise ein Mensch ist, sind die Antikörper vorzugsweise humanen Ursprungs oder wurden "humanisiert", um die Möglichkeit einer Immunantwort gegen die Antikörper zu minimieren.
Die aktiven oder passiven erfindungsgemäßen Impfstoffe können verwendet werden, um ein tierisches Subjekt vor der Infektion mit einem Gram-positiven Bakterium zu schützen. Somit kann der erfindungsgemäße Impfstoff in Vögeln, wie Hühnchen, Truthähnen und Haustieren; in Säugetieren, vorzugsweise einem Menschen, verwendet werden, obwohl der erfindungsgemäße Impfstoff für die Verwendung in anderen Säugetier Spezies, einschließlich aber nicht beschränkt auf domestizierte Tiere (Canine und Feline), landwirtschaftliche Nutztiere (Bovine, Ovine, Equine, Caprine, Porcine, und ähnliches); Nagetiere und nicht domestizierte Tiere umfasst ist.
Diagnose einer Gram-positiven bakteriellen Infektion
Die erfindungsgemäßen Antikörper, die gegen die exportierten Proteine von Gram-positiven Bakterien gebildet werden können, sind wertvolle Reagenzien für die Diagnose einer Infektion mit einem Gram-positiven Mikroorganismus. Gegenwärtig ist die Diagnose einer Infektion mit einem Gram-positiven Bakterium schwierig. Erfindungsgemäß kann die Anwesenheit eines Gram-positiven Bakteriums in einer Probe aus einem Subjekt, das unter dem Verdacht steht, eine Infektion mit einem Gram-positiven Bakterium aufzuweisen, durch Nachweisen der Bindung eines Antikörpers an ein exportiertes Protein an Bakterien in oder aus der Probe nachgewiesen werden.
Die Diagnose einer Infektion mit einem Gram-positiven Bakterium kann irgendein Immunassay Format, das im Stand der Technik bekannt ist, wie gewünscht, verwenden. Viele mögliche Immunassay Formate sind in dem Abschnitt mit der Überschrift "Herstellung von Antikörpern gegen exportierte Proteine" beschrieben. Die Antikörper können für den Nachweis in vitro markiert werden, z.B. mit Markierungen, wie Enzymen, Fluorophoren, Chromophoren, Radioisotopen, Farbstoff, kolloidalem Gold, Latex Partikeln und chemilumineszenten Mitteln. Alternativ dazu können die Antikörper für den Nachweis in vivo markiert werden, z.B. mit Radioisotopen (vorzugsweise Technetium oder Iod), magnetischen Resonanz Shift Reagenzien (wie Gadolinium und Mangan) oder strahlenundurchlässigen Reagenzien.
Alternativ dazu können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und Sequenzen davon in der Diagnostik von Infektionen mit einem Gram-positiven Bakterium verwendet werden. Beispielsweise können die exp Gene oder hybridisierbaren Fragmente davon für in situ Hybridisierung mit einer Probe aus einem Subjekt verwendet werden, das unter dem Verdacht steht eine Infektion mit einem Gram-positiven Bakterium zu tragen. In einer anderen Ausführungsform können spezifische Gen Segemente eines Gram-positiven Bakteriums unter Verwendung von PCR Amplifikation mit Sonden basierend auf den erfindungsgemäßen exp Genen identifiziert werden. In einem Aspekt der Erfindung kann die Hybridisierung mit einer Sonde oder mit den PCR Primern unter stringenten Bedingungen oder mit einer Sequenz, die spezifisch ist für einen einzelnen Stamm oder eine beschränkte Anzahl von Stämmen des Bakteriums, oder beides, durchgeführt werden, wodurch die Diagnose der Infektion mit dem bestimmten Stamm (oder den Stämmen) erlaubt wird. Alternativ dazu kann die Hybridisierung unter weniger stringenten Bedingungen durchgeführt werden, oder die Sequenz kann in vielen oder allen Stämmen eines Bakteriums homolog sein, wodurch die Diagnose einer Infektion mit dieser Spezies erlaubt wird.
Die vorliegende Erfindung wird besser aus einer Übersicht der folgenden beispielhaften Beschreibung verstanden, welche die Details der Konstrukte und Verfahren angibt, die in ihrer Entwicklung und in ihrer Überprüfung befolgt wurden.
BEISPIEL 1: GENETISCHE IDENTIFIZIERUNG VON EXPORTIERTEN PROTEINEN IN STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
Es wurde eine Strategie entwickelt, um exportierte Proteine in Streptococcus pneumoniae zu mutieren und genetisch zu identifizieren. Unter Kopplung der Technik der Mutagenese mit Gen Fusionen mit phoA haben wir ein Werkzeug für die Mutation und genetische Identifizierung von exportierten Proteinen aus S. pneumoniae entwickelt. Vektoren wurden gebildet und verwendet, um pneumokokkale DNA in Escherichia coli und S. pneumoniae für translationale Gen Fusionen mit alkalischer Phosphatase (PhoA) zu screenen. In dieser Studie wird über die Identifizierung von genetischen Loci, welche die exportierten Proteine kodieren, berichtet. Durch die Ähnlichkeit der abgeleiteten Sequenzen von anderen Genen von prokaryonten Organismen kodieren diese Loci möglicherweise Proteine, die eine Rolle in der Signal Transduktion, dem makromolekularen Transport und Zusammenbau, der Aufrechterhaltung einer intrazellulären chemiosmotischen Balance und der Nährstoff Gewinnung spielen.
Fünfundzwanzig PhoA⁺ pneumokokkale Mutanten wurden isoliert, und die Loci von acht dieser Mutanten zeigten eine Ähnlichkeit zu bekannten exportierten oder Membran assoziierten Proteien. Homologe wurden gefunden zu 1] Protein abhängigen Peptid Permeasen, 2] Penicillin bindenden Proteinen, 3] Clp Proteasen, 4] zwei Komponenten Sensor Regulatoren, 5] den Phosphoenolpyruvat:Kohlenhydratphosphotransferase Permeasen, 6] Membran assoziierten Dehydrogenasen, 7] P-Typ (E₁E₂-Typ) Kationentransport ATPasen, 8] ABC Transportern, die für die Translokation der RTX Klasse von bakteriellen Toxinen verantwortlich sind. Unerwarteterweise enthielt eine PhoA⁺ Mutante eine Fusion mit einem Mitglied der D-E-A-D Protein Familie der ATP abhängigen RNA Helikasen, was den Export dieser Proteine vorschlägt.
Materialien und Methoden
Stämme und Medien
Der Ausgangsstamm von S. pneumoniae, der in diesen Studien verwendet wurde, war R6x, was ein Derivat des nicht verkapselten Rockefeller Universitäts Stamms R36A ist (Tiraby und Fox, 1973, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70:3541-3545). Die verwendeten E. coli Stämme waren DH5α, was F^– f80d/acZ Δ(lacZYAΔM15) lacU169 recA1 endA1 hsdR17 (r_K – m_K+) supE44 I^– thy-1 gyrA1 relA1 (Bethesda Research Laboratories) ist; CC118, was Δ(ara leu)7697 ΔlacX74 araD139 phoA20 galE galK thi rpsE rpoB argE recA1 (Manoil und Beckwith, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:8129-8133) ist, S1179, was F^– Δlacu169 dam3 rpsL (Brown, 1987, Cell. 49:825-33) ist; und JCB607, das einen Expressionsvektor für die Herstellung von DsbA (rna met pBJ41 pMS421) (Bardwell et al., 1991, Cell. 67:581-589 enthält. Die Stämme von S. pneumoniae und ihre relevanten Eigenschaften, die in dieser Studie hergestellt wurden, sind in Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1. Bakterielle Stämme von Streptococcus pneumoniae, die in dieser Studie hergestellt wurden.

Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden aus Plasmiden bestimmt, die aus den PhoA⁺ Mutanten gewonnen wurden. Die Homologe wurden durch Durchsuchen einer Protein Datenbank mit dem BLAST Algorithmus identifiziert. Siehe 5 für die Anordnungen.

S. pneumoniae wurde routinemäßig auf trypsinhaltigem Sojaagar ausplattiert, der mit Schafsblut (TSAB) in einer Endkonzentration von 3 % (vol./vol.) ergänzt wurde. Die Kulturen wurden auch in einem flüssigen semisynthetischen Casein Hydrolysat Medium, das mit Hefeextrakt (C + Y Medium) ergänzt wurde, angezogen (Lacks und Hotchkiss, 1960, Biochem. Biophys. Acta. 39:508-517). In einigen Fällen wurde S. pneumoniae in Todd Hewitt Nährlösung (THBY), die mit Hefe in einer Endkonzentration von 5 % (w/v) ergänzt wurde, angezogen. Wo es angegeben ist, wurde S. pneumoniae im C + Y in der Anwesenheit des Disulfid Oxidationsmittels 2-Hydroxyethyldisulfid bei einer Konzentration von 600 μM angezogen, was 5-mal weniger ist als die minimale inhibitorische Konzentration, die für Wachstum benötigt wird. E. coli wurden entweder in flüssigem oder auf einem festen Luria-Bertani (LB) Medium angezogen. Die Selektion von E. coli mit Plasmid Vektoren wurde mit Erythromycin (erm) bei einer Konzentration von 500 μg/ml erreicht. Für die Selektion und Aufrechterhaltung von S. pneumoniae, die chromosomal integrierte Plasmide enthalten, wurden Bakterien in der Anwesenheit von 0,5 bis 1 μg/ml erm angezogen.
Die Transformation von S. pneumoniae wurde wie folgt durchgeführt: Bakterien wurden in C + Y Medium bei 37°C angezogen, und die Proben wurden in 10 Min. Intervallen zwischen einer OD₆₂₀ von 0,07 und 0,15 entnommen und bei –70°C in 10 % Glycerol gelagert. Die Proben wurden auf Eis aufgetaut, und DNA (Endkonzentration 1 μg/ml) wurde vor der Inkubation bei 37°C für 90 Min. hinzugefügt. Die Transformanten wurden durch Selektion auf TSAB, welches das geeignete Antibiotikum enthält, identifiziert.
Rekombinante DNA Techniken
Die Plasmide pHRM100 und pHRM104 (1) wurden durch den Einbau entweder des 2,6 kB Smal oder BamHI Fragments von pPHO7, der das verkürzte Gen von phoA enthält (Guitierrez und Devedjian, 1989, Nucleic Acid Res. 17:3999) in die entsprechende Stelle von pJCD9 (Chen und Morrison, 1988, Gene. 64:155-164), hergestellt. Eine einzelne SmaI Klonierungsstelle für pHRM100 und eine einzelne BamHI Klonierungsstelle für pHRM104 oberhalb des phoA wurden durch selektive Deletion der duplizierten Stellen gebildet.
Chromosomale DNA aus S. pneumoniae wurde durch die folgenden Verfahren hergestellt: die Zellen wurden in 10 ml THBY oder C + Y mit 0,5 μg/ml erm bei einer OD₆₂₀ von 0,7 angezogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation isoliert und einmal in 500 μl TES (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl, 0,1 M Ethylendiamintetra-Essigsäure (EDTA)) gewaschen. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 500 μl frischem TES resuspendiert. Die Bakterien wurden mit der Zugabe von 50 μl 1 % (vol./vol.) Desoxycholat lysiert. Das Lysat wurde aufeinanderfolgend mit RNase (2 μg) und Pronase (400 ng) für 10 Min. bei 37°C inkubiert. Diese Lösung wurde dreimal mit einem gleichen Volumen an Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert, gefolgt durch eine Extraktion mit einem äquivalenten Volumen von Chloroform:Isoamylalkohol (24:1). Die DNA wurde unter der Zugabe von zwei Volumina von kaltem Ethanol präzipitiert, einmal mit 70 % Ethanol gewaschen und in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA resuspendiert. In einigen Fällen wurde dieses Protokoll eingestellt, um 400 ml Bakterien aufzuarbeiten.
Es wurden Plasmid Bibliotheken, die pneumokokkale DNA enthalten, mit pHRM100 und pHRM104 in E. coli für die Insertionsduplikationsmutagenese in S. pneumoniae hergestellt. Chromosomale DNA aus S. pneumoniae wurden 18 hr mit entweder AluI oder RsaI oder für 1,5 hr mit SauIIIa gespalten. Diese DNA wurde auf einem Agarosegel größenfraktioniert, und 400–600 Basenpaar Fragmente wurden extrahiert und mit Glaskügelchen (BIO 101 Inc., La Jolla, CA) nach den Angaben des Herstellers gereinigt. Die DNA wurde für 18 hr bei 4°C in entweder die SmaI oder BamHI Stellen von jeweils pHRM100 oder pHRM104 in einem Insert zu Vektor Verhältnis von 6:1 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in den E. coli Stamm S1179 oder den PhoA^– Stamm CC118 transformiert. Plasmid DNA wurde aus diesen Bibliotheken unter Verwendung des Qiagen Midi Plasmid Präparationssystems (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) nach den Angaben des Herstellers erhalten.
Die Mutagenese Strategie in S. pneumoniae schloss die Insert Duplikation nach der Plasmid Integration (1b) ein. Aufgrund dieser Duplikation bestand eine geringe Ausschneidefrequenz des integrierten Plasmid mit seinem Insert, das chromosomale Präparationen von pneumokokkaler DNA kontaminierte. Deshalb wurden die integrierten Plasmide, die ein pneumokokkales Insert enthalten, einfach aus S. pneumoniae durch Transformation dieser ausgeschnittenen Plasmide direkt aus kompetenten E. coli gewonnen.
Um eine Gen Fusion zwischen den phoA und amiA zu bilden, wurde ein 600 Basenpaar Fragment von amiA durch die Polymerase Kettenreaktion von chromosomaler DNA aus S. pneumoniae unter Verwendung der vorwärts und rückwärts gerichteten Primer erhalten: jeweils
5'AAAGGATCCATGAARAARAAYMGHGTNTTY3' (SEQ ID NR: 40), und
5'TTTGGATCCGTTGGTTTAGCAAAATCGCTT3' (SEQ ID NR: 41), worin R = A/G, Y = T/C, M = C/A, H = T/C/A und N = G/A/T/C. Die Amplifikation von DNA wurde mit 50 ng chromsomaler DNA, 2 mM des vorwärts gerichteten Primers, 1 mM des rückwärts gerichteten Primers und 2,5 U AmpliTaq DNA Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk, CT), dNTPs und Puffer, der vom Hersteller bereitgestellt wurde, durchgeführt. Die Amplifikation (30 Runden) wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens durchgeführt: 1 Min. bei 94°C für die Denaturierung, 2 Min. bei 72°C für die Extension und 1 Min. bei 45°C für die erneute Anlagerung. Ein 600 Basenpaar Fragment wurde erhalten, mit BamHI gespalten und in die entsprechende Stelle von pHRM104 ligiert. Dieses Gemisch wurde in E. coli transformiert, und ein einzelner rekombinanter Klon, der den Vektor mit dem Insert enthielt, wurde identifiziert. Eine innerhalb des Leserahmens liegende kodierende Sequenz über dem Fusionsübergang wurde durch Sequenz Analyse bestätigt. Die Plasmid DNA aus diesem Klon wurde in S. pneumoniae transformiert, und Transformanten wurden hinsichtlich PhoA Aktivität durch den Kolonie Lift Assay gescreent, um die Herstellung und den Export des Fusionsproteins zu bestätigen.
DNA Sequenzierung
Die Oligonukleotide (5'AATATCGCCCTGAGC3', SEQ ID NR: 42; und 5'ATCAC-GCAGAGCGGCAG3', SEQ ID NR: 43) wurden für die Sequenzierung über den Fusionsübergang des pneumokokkalen Inserts in pHRM100 und pHRM104 entwickelt. Es wurde eine doppelsträngige Sequenz Analyse an der Plasmid DNA durch das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467) unter Verwendung des Sequenase Version 2.0 DNA Sequenzierkits (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) gemäß den Angaben des Herstellers, durchgeführt. Dimethylsulfoxid (1 % Vol/Vol) wurde zu den Anlagerungs- und Extensionsschritten zugegeben.
Alkalische Phosphatase Aktivität
Obwohl alkalische Phosphatase in einigen Gram-positiven Organismen, wie Enterococcus faecalis (Rothschild et al., 1991, in "Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci.", Dunny et al., Washington D.C. American Society for Microbiology, S. 45–48) und B. subtilis (Chesnut et al., 1991, Mol. Microbiol. 5:2181-90; Hulett et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:1077-83; Sugahara et al., 1991, J. Bacteriol. 173-1824-6) characterisiert wurde, ist nichts über dieses Enzym in S. pneumoniae bekannt. Die PhoA Aktivität, die mit dem parenteralen Stamm von S. pneumoniae assoziiert ist, wurde mit chromogenen Substraten in den Assays gemessen, die unten beschrieben sind, und ergab normale Ergebnisse. Deshalb wurde der Nachweis der PhoA Aktivität aufgrund der Expression der Fusionsproteine in S. pneumoniae in einem niedrigen oder negativen Hintergrund durchgeführt.
Um hinsichtlich pneumokokkal abgeleiteten PhoA Fusionen in E. coli zu screenen wurden Plasmid Bibliotheken in dem PhoA^– Stamm CC118 gescreent. Die Transformanten wurden auf LB Medium, das mit 40 bis 80 μg/ml des chromogenen Substrats 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (XP) ergänzt wurde, ausplatiert. Blaue Kolonien entwickelten sich in 15 bis 24 hr und zeigten PhoA Aktivität. Einzelne Kolonien wurden auf frischen LB/XP Platten ausgestrichen, um einen blauen Phänotyp zu verifizieren.
Um hinsichtlich PhoA⁺ Mutanten von S. pneumoniae zu screenen, wurden individuelle Kolonien in einem Kolonie Lift Assay mit XP, wie er für ein zuvor beschriebenes Verfahren angepasst wurde (Knapp und Mekalanos, 1988, J. Bacteriol. 170:5059-5066), gescreent. Einzelne zwei Tage alte Kolonien wurden auf Nitrocellulose Filter transferiert (HAHY, Millipore, Bedford, MA) und für zwei bis fünf Min. luftgetrocknet. Die Filter wurden mit der Kolonieseite nach oben auf Nr: 3 Filterpapier (Whatman, Inc. Clifton, NJ) angeordnet, das zuvor in 0,14 M NaCl eingetaucht wurde, und für 10 Min. bei 37°C inkubiert. Dies wurde einmal wiederholt, und anschließend wurden die Membrane auf frische Filterpapiere transferiert, die zuvor in 1 M Tris-HCl, pH 8,0 eingetaucht wurden, und für 10 Min. bei 37°C inkubiert. Abschließend wurden die Membranen auf ein anderes frisches Filterpapier transferiert, das in 1 M Tris-HCl, pH 8,0 mit 200 μg/ml XP eingetaucht wurde und bei 37°C inkubiert. Blaue Kolonien zeigten PhoA⁺ Mutanten und wurden in 10 Min. bis 18 hr nachgewiesen. Die Kolonien wurden entweder direkt von den Filtern oder von den Originalplatten gepickt. Nachdem die Kolonien durch Ausstreichen auf TSAB Platten gereinigt wurden, wurde der blaue Phänotyp in einem anschließenden Kolonie Lift Assay bestätigt.
Die PhoA Aktivität, die in Stämmen von S. pneumoniae exprimiert wurde, wurde aus den exponentiell wachsenden Kulturen bestimmt. Bakterien von 10 ml Kulturen wurden durch Zentrifugation isoliert, einmal in Salzlösung gewaschen und in 1 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 resuspendiert. Die Aktivität wurde durch Hydrolyse auf p-Nitrophenolphosphat in einem kürzlich beschriebenen Assay bestimmt (Brickman und Beckwith, 1975, Mol. Biol. 96:307-316; Guitierrez et al., 1987, J. Mol. Biol. 195:289-297). Gesamt Protein wurde auf lysierten Bakterien mit Coomassie Blue Farbstoff (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72:248-254) bestimmt.
Reinigung von DsbA
DsbA wurde bis zu fast vollständiger Homogenität aus einem E. coli Stamm (JCB607), der einen Expressionsvektor mit dem korrespondierenden Gen enthält (Bardwell et al., 1991, Cell. 67:581-589), gereinigt. Kurz gesagt wurden 2 ml einer frischen Übernacht Kultur zu 400 ml LB Medium zugegeben und für 2 hr bei 37°C angezogen. Die Kultur wurde auf 3 mM Isopropyl β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) eingestellt und für weitere 2 hr angezogen. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation isoliert und in 6 ml 100 mM Tris-HCl, pH 7,6, 5 mM EDTA und 0,5 M Sucrose resuspendiert. Diese Suspension wurde für 10 Min. auf Eis inkubiert, und die Zellen wurden durch Zentrifugation isoliert. Die Bakterien wurden in 6 ml 5 mM MgCl₂ resuspendiert und für 10 Min. auf Eis inkubiert. Der Überstand wurde nach der Zentrifugation isoliert. Dieses Material enthielt eine vorherrschende Coomassie Blue gefärbt Bande mit einem offensichtlichen M_r von 21 kDa auf einem SDS Polyacrylamid Gel, was identisch war zu jenem von DsbA, und es wurde als ungefähr 95 % rein (Daten nicht gezeigt) bewertet.
Subzellulläre Fraktionierung
Pneumokokken wurden in subzelluläre Fraktionen durch eine Modifikation einer zuvor beschriebenen Technik (Hakenbeck et al., 1986, Antimicrobial agents and chemotherapy. 30:553-558) getrennt. Kurz gesagt wurden die Bakterien in 10 ml C + Y Medium auf eine OD₆₅₀ von 0,6 angezogen und durch Zentrifugation bei 17.000 × g für 10 Min. isoliert. Die Zell Pellets wurden in 250 μl TEP (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) resuspendiert. Die Suspension wurde für insgesamt 4 Min. mit 15 Sek. Stößen sonifiziert. Mehr als 99 % der Bakterien wurden aufgeschlossen, wie sich durch visuelle Beobachtung zeigte. Der zelluläre Debris wurde durch Zentriufugation (17.000 × g für 10 Min.) entfernt. Die bakteriellen Membranen und die cytoplasmatischen Inhalte wurden durch Zentrifugation bei 98.000 × g für 4 hr in einer Beckman Airfuge getrennt. Der Überstand aus diesem abschließenden Schritt enthielt die cytoplasmatische Fraktion, während das Pellet die bakteriellen Membranen enthielt. Proben von jeder Fraktion wurden hinsichtlich Protein Gehalt bewertet und in SDS Probenpuffer für anschließende Gelelektrophorese gelöst.
Immunologischer Nachweis von Fusionsproteinen
Gesamtbakterielle Lysate und subzelluläre Fraktionen wurden einer SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese unterzogen, und die Proteine wurden auf Nitrocellulose Membrane (Immobilon, Millipore, Bedford, MA) unter Verwendung eines PhastSystems (Pharmacia LKB, Uppsala Schweden) gemäß den Angaben des Herstellers transferiert. Die Membrane wurden mit polyklonalen anti-PhoA Antikörpern als Sonde (5 Prime – 3 Prime, Boulder, CO) bei einer Verdünnung von 1:1000 mit einem Peroxidase konjugierten zweiten Antikörper bei einer Verdünnung von 1:1000 inkubiert. Immunreaktive Banden wurden mit Wasserstoffperoxid und Diaminobenzidin oder durch verstärkte Chemilumineszenz mit Chemikalien, die von Amersham (Arlington Heights, IL) bezogen wurden, nachgewiesen.
Ergebnisse und Diskussion
Konstruktion von Reporter Plasmiden und pneumokokkalen Bibliotheken
Um genetisch nach exportierten Proteinen in S. pneumoniae durch Insertionsduplikationsmutagenese zu screenen, wurde eine verkürzte Form von phoA (Guitierrez und Devedjian, 1989, Nucleic Acid Res. 17:3999) in dem pneumokokkalen Shuttle Vektor pJDC9 (1a) (Chen und Morrison, 1988, Gene. 64:155:164) angeordnet. Zwei Vektoren wurden mit entweder einer einzelnen SmaI (pHRM100) oder einer einzelnen BamHI (pHRM104) Klonierungssstelle 5' to phoA hergestellt. Die Klonierungsstellen in jedem Vektor wurden durch zwei KpnI Stellen flankiert, um die einfache Identifizierung eines Inserts zu erleichtern.
Die wirksame Insertionsduplikationsmutagenese benötigt die Klonierung eines inneren Gen Fragments in den Vektor vor der Integration (1b). Deshalb wurden Plasmid Bibliotheken in E. coli mit 400 bis 600 Basenpaar Inserts von pneumokokkaler DNA gebildet. Einige Bibliotheken, die ungefähr 2.600 individuelle Klone repräsentierten, wurden hinsichtlich translationalen Fusionen mit phoA in entweder E. coli oder S. pneumoniae gescreent.
Identifizierung von gneumokokkalen PhoA Fusionen in E. coli
Wenn die pneumokokkalen Bibliotheken, die 1.100 unabhängige Klone repräsentierten, in dem PhoA^– E. coli Stamm CC118 gescreent wurden, zeigten fünfundfünfzig Kolonien den blauen Phänotyp, wenn sie auf Medium ausplatiert wurden, das 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (XP) enthielt. Weil die Klonierungsvektoren pHRM100 und pHRM104 keinen intrinsischen Promotor oberhalb von phoA enthalten, müssen die Fusionsproteine, die von diesen Plasmiden abgeleitet sind, von pneumokokkaler DNA gebildet worden sein, die einen Promotor, eine translationelle Startstelle und eine funktionelle Signal Sequenz enthält. Die DNA Sequenz Analyse der Inserts von zwei dieser Plasmide zeigte einen putativen Promotor, Ribosomen Bindestellen und kodierende Sequenzen für 48 und 52 Aminosäuren, die innerhalb des Leserahmens mit der kodierenden Sequenz für phoA lagen. Diese kodierenden Sequenzen weisen Merkmalseigenschaften von prokaryonten Signal Sequenzen, wie eine basische N-terminale Region, einen zentralen hydrophoben Kern und eine polare C-terminale Region auf (von Heijne, 1990, J. Memb. Biol. 115:195-201) (Tabelle 2). Tabelle 2. Vorhergesagte kodierende Regionen für zwei genetische Loci, die PhoA Fusionsproteine in sowohl S. pneumoniae als auch E. coli bildeten.

^a Die kodierenden Regionen wurden aus den DNA Sequenzen 5' zu phoA aus den Plasmiden identifiziert, die aus diesen Stämmen gewonnen wurden. Der Pfeil zeigt die vorhergesagte Signal Peptid Spaltungsstelle basierend auf der "-3, -1 Regel" (von Heijne, 1986, Nucleic Acid Res. 14:4683-4690), und die Aminosäuren in Fettschrift stammen von der kodierenden Region für phoA.

Eine putative Spaltungsstelle wurde in beiden Sequenzen mit einem Algorithmus identifiziert, der gestaltet wurde, um solche Stellen basierend auf der "-3, -1 Regel" zu identifizieren (von Heijne, 1986, Nucleic Acid Res. 14:4684-4690). Die Transformation und Integration dieser Plasmide in S. pneumoniae lieferte Transformanten, die blaue Kolonien in dem Kolonie Lift Assay bildeten, und jede bildete anti-PhoA immunreaktive Fusionsproteine mit einem offensichtlichen M_r von 55 kDa in SDS Polyacrylamid Gelen (nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen klar, dass heterologe Signal Sequenzen aus S. pneumoniae, fusioniert mit PhoA, in sowohl E. coli als auch S. pneumoniae funktionell sind und möglicherweise einen ähnlichen Sekretionsweg verwenden.
PhoA Fusionen mit einem exportierten pneumokokkalen Protein
AmiA ist ein pneumokokkaler Vertreter der Familie von bakteriellen Permeasen, die für den Transport von kleinen Peptiden verantwortlich sind (Alloing et al., 1989, Gene. 76:363-8; Alloing et al., 1990, Mol. Microbiol. 4:633-44; Gilson et al., 1988, EMBO J. 7:3971-3974). AmiA enthält eine Signal Sequenz und sollte ein exportiertes Lipoprotein, angeheftet an die bakterielle Membran durch einen Lipid Rest, der kovalent mit dem N-terminalen Cystein verbunden ist, sein (Gilson et al., 1988, EMBO J. 7:3971-3974). Wir haben eine pneumokokkale Mutante (SPRU121) genetisch verändert, dass sie die 5' kodierende Region von amiA, fusioniert innerhalb des Leserahmens an Kodon 169 an phoA enthält. Kolonien dieser Mutante bildeten den blauen Phänotyp, wenn sie gegenüber XP exponiert wurden, was nahe legt, dass das Hybrid Protein exportiert wurde. Ein immunreaktives Polypeptid mit der vorhergesagten M_r von 67 kDa wurde durch Western Analyse von Gesamt Zelllysat (Daten nicht gezeigt) bestätigt.
Identifizierung von PhoA Fusionen in S. pneumoniae
Ermutigt durch den Nachweis von PhoA Fusionen, die von pneumokokkaler DNA stammen, in sowohl E. coli als auch S. pneumoniae, stellten wir eine Bibliothek von pneumokokkalen Transformanten her, die zufällige chromosomale Insertionen der PhoA Vektoren pHRM100 und pHRM104 enthielten. Aus einer Bank von 1.500 Klonen wurden 75 Mutanten isoliert, die den blauen Phänotyp in dem Kolonie Lift Assay mit XP zeigten. Weil S. pneumoniae spontan während der stationären Phase aufgrund einer endogenen Amidase (LytA) lysiert, hatten wir Bedenken, dass der blaue Phänotyp von einigen der Mutanten das Ergebnis von Zelllyse und nicht aufgrund des Export eines Fusionsproteins aus lebenden Zellen war. Die DNA von 10 zufälligen blauen Mutanten, die SPRU22, 42, 75, 81 und 98 einschlossen, wurden in einen lytA minus Hintergrund transformiert, und alle zeigten immer noch den blauen Phänotyp (Daten nicht gezeigt).
Eine der Mutanten (SPRU98) zeigte den blauen Phänotyp auf XP und exprimierte ein 93 kDa anti-PhoA immunreaktives Polypeptid (2, Spur 2). Weil die kodierende Region von phoA ein Polypeptid mit einer molekularen Masse von 49 kDa liefern würde, konnten wir schlussfolgern, dass das Fusionsprotein von der kodierenden Region gebildet wurde, die einem Polypeptid mit einer molekularen Masse von 44 kDa entspricht. Im Gegensatz dazu bildeten die Mutanten SPRU96 und 97, die zufällig eingebaute Vektoren enthielten und nicht blau wurden, wenn sie gegenüber XP ausgesetzt wurden, kein immunreaktives Material (2; Spuren 3, 4). Das Fusionsprotein aus SPRU98 wurde proteolytisch degradiert, wenn die ganzen Bakterien gegenüber geringen Konzentrationen von Trypsin ausgesetzt wurden, was eine extrazelluläre Anordnung vorschlägt (2, Spur 5). Übereinstimmend mit diesem Ergebnis war die direkte Messung von alkalischer Phosphatase Aktivität, die mit den ganzen Bakterien assoziiert ist. Im Vergleich zu dem parenteralen Stamm und einer PhoA^– Mutante (SPRU97) mit einem zufällig integrierten Plasmid gab es eine drei- bis vierfach größere Enzym Aktivität für SPRU98 (Tabelle 3). Zusammengenommen schlagen diese Ergebnisse vor, dass die PhoA Fusionen mit exportierten Proteinen über die cytoplasmatische Membran von S. pneumoniae transluziert wurde. Tabelle 3. Alkalische Phosphatase Aktivität für eine pneumokokkale Mutante mit einer Gen Fusion von phoA

^a SPRU97 und SPRU98 enthalten den phoA Vektor pHRM104 zufällig integriert in das Chromosom, wie im Text beschrieben ist.
^b Die PhoA⁺ Mutante wurde basierend auf der Expression von alkalischer Phosphatase Aktivität isoliert, die durch Aussetzen von einzelnen Kolonien gegenüber XP in dem Kolonie Lift Assay nachgewiesen wurde.
^c Einheiten von alkalischer Phosphatase Aktivität wurden bestimmt, wie in den experimentellen Verfahren beschrieben ist. Der Assay wurde an gewaschenen Zellen aus exponentiell wachsenden Kulturen durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Einheiten der Enzym Aktivität/mg Gesamtprotein dargestellt.

Disulfid Oxidationsmittel erhöhten die Enzym Aktivität von PhoA Fusionen in S. pneumoniae
In E. coli benötigt die PhoA Aktivität die Protein Translokation über die cytoplasmatische Membran, den Einbau von Zn²⁺, die Disulfid Brückenbildung und die Dimerisierung. Im Anschluss an diesen Aktivierungsvorgang ist das Enzym stark Protease resistent (Roberts und Chlebowski, 1984). Kürzlich haben zwei Gruppen einen einzelnen genetischen Locus, dsbA (Bardwell et al., 1991, Cell. 67:581-589) und ppfA (Kamitani et al., 1992, EMBO J. 11:57-67) identifiziert, der eine Disulfid Oxidoreduktase kodiert, welche die Bildung von Disulfid Brücken in PhoA erleichtert. Ein ähnlicher Locus wurde in V. cholerae (Peek und Taylor, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:6210-6214) identifiziert. Mutationen in dsbA verringerten dramatisch die PhoA Aktivität und machten die Protein Protease sensitiv sowohl in vitro als auch in vivo (Bardwell et al., 1991, Cell. 57:581-589; Kamitami et al., 1992, EMBO J. 11:57-67). Weil die Enzym Aktivität, die mit den PhoA Fusionen in S. pneumoniae assoziiert ist, allgemein 10-fach geringer war als die Werte, die mit Fusionen in E. coli (Daten nicht gezeigt) erhalten wurden und aufgrund der Protease Sensitivität der PhoA Fusion, die in 2 dargestellt ist, nahmen wir an, dass die Zugabe von DsbA oder eines starken Disulfid Oxidationsmittels, die Disulfid Brückenbildung fördern, die Enzym Aktivität steigern und die proteolytische Degradation verzögern würde.
SPRU98, das ein PhoA Fusionsprotein mit einem M_r von 93 kDa bildet, wurde in entweder der Anwesenheit von 10 μM DsbA oder 600 μM 2-Hydroxyethyldisulfid, einem starken Disulfid Oxidationsmittel, angezogen. Unter beiden Bedingungen war die Enzym Aktivität mindestens zweifach erhöht (Tabelle 4). Tabelle 4. Wirkung von Disulfid Oxidationsmittel auf die alkalische Phosphatase Aktivität

^a Der Stamm SPRU98 (10 ml) wurde in der Anwesenheit der angegebenen Mittel zur mittleren logarithmischen Phase (OD₆₂₀: 0,4) angezogen, konzentriert und hinsichtlich alkalischer Phosphatase Aktivität untersucht. Die Hydrolyse von p-Nitrophenolphosphat wurde mit ganzen Bakterien in der Anwesenheit von 1 M Tris-HCl, pH 8,0 für eine hr bei 37°C bestimmt. Aktivitätseinheiten wurden pro mg Gesamt Protein ausgedrückt.

Im Vergleich zu der Kontrolle gab es auch eine erhöhte Menge von immunreaktivem Protein, das in der Anwesenheit der zwei Bestandteile (3) nachgewiesen wurde. Dies schlug eine gesteigerte Proteinstabilität und Resistenz gegenüber intrinsischer Proteolyse vor. Weil es nur einen mittleren Anstieg in der Enzym Aktivität gab, die durch diese Verbindungen verliehen wurde, schlagen wir vor, dass andere Faktoren für die korrekte Faltung von PhoA benötigt werden, die in S. pneumoniae abwesend sind. Es ist bemerkenswert, dass die abgeleiteten Se quenzen von anderen alkalischen Phosphatase Isozymen, die in den Grampositiven Organismen B. subtilis (Chesnut et al., 1991, Mol. Microbiol. 5:2181-90; Hulett et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:1077-84; Sugahara et al., 1991, J. Bacteriol. 173:1824-6) und Enterococcus faecalis identifiziert wurden, nur einen oder keinen Cystein Rest enthalten. Dies könnte vorschlagen, dass die Anwesenheit eines Oxido-Reduktase Systems für die korrekte Faltung dieser intra- oder intermolekularen Disulfid Brücken eine einzigartige Eigenschaft von einigen Gram-negativen Organismen sein könnte, die ein gut definiertes Periplasma enthalten.
Identifizierung von exportierten Proteinen durch Sequenz Analyse der PhoA Fusionen aus S. pneumoniae
Die Plasmide, die pneumokokkale Inserts enthalten, wurden in E. coli aus 48 pneumokokkalen Mutanten gewonnen, die den blauen Phänotyp auf XP zeigten. Die Spaltung dieser Plasmide mit KpnI trennt die pneumokokkalen Inserts von dem Ausgangsvektor. Die Größe der Inserts betrug überall ungefähr 400 bis 900 Basenpaare. Eine vorläufige Sequenz Analyse der 48 Inserts zeigt 21 verschiedene Sequenzen, was ein Verwandschaftsverhältnis zwischen einigen der Mutanten zeigt. Lange kodierende Regionen, die 50 bis 200 Aminosäuren innerhalb des Leserahmens mit PhoA entsprechen, wurden für die meisten der Inserts etabliert, neun von ihnen sind in 4 dargstellt. Unter Verwendung des BLAST Algorithmus (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410) wurden die abgeleiteten Protein Sequenzen hinsichtlich Ähnlichkeit zu Sequenzen analysiert, die in der häufigsten Version der nicht redundanten Protein Datenbank des National Center for Biotechnology Information (Washington D.C.) hinterlegt wurden. Die Sequenz dieser neun Inserts (4) zeigte kodierende Regionen mit Ähnlichkeit zu Familien von acht bekannten exportierten oder Membran assoziierten Proteinen (5). Jene Proteine, die von den Genen kodiert wurden, die den möglichen Leserahmen ohne eine bekannte Funktion entsprechen, wurden mit der Vorsilbe exp (exportiertes Protein) bezeichnet, um die verschiedenen genetischen Loci zu beschreiben.
Es wurde keine Ähnlichkeit zwischen den abgeleiteten Sequenzen der anderen Inserts und jenen in der Datenbank nachgewiesen. Die Sequenzen aller neun Inserts werden in der Genbank (Zugangsnummern: noch zuzuweisen) nach dem Anmeldetag dieser Anmeldung bereitgestellt.
Exp1 zeigte Ähnlichkeit zu der Familie von Permeasen, die für den Transport von kleinen Peptiden in sowohl Gram-negativen als auch Gram-positiven Bakterien (5A) verantwortlich sind. Der identifizierte Leserahmen zeigte die größte Ähnlichkeit zu dem exportierten Protein, AmiA, von S. pneumoniae (Alloing et al., 1990, Mol. Microbiol. 4:633-44). Der ami Locus wurde zuerst in einer spontanen Mutante charakterisiert, die resistent gegenüber Aminopterin ist (Sicard, 1964, Genetics. 50:31-44; Sicard und Ephrussi-Taylor, 1965). Das Wildtyp Allel kann für den intrazellulären Transport von kleinen verzweigtkettigen Aminosäuren verantwortlich sein (Sicard, 1964). Exp1 ist eindeutig verschieden von amiA und stellt ein verwandtes Mitglied der Familie von Permeasen dar, das in den gleichen Bakterien anwesend ist. E. coli weist mindestens drei Peptid Permeasen auf, während B. subtilis mindestens zwei aufweist (für eine Zusammenfassung siehe (Higgins et al., 1990, J. Bioengen. Biomembranes, 22:571-92)). Mutationen in einem analogen Locus Spo0K von B. subtilis inhibiert die Sporulation und verringert dramatisch die Transformationseffizienz in natürlichen kompetenten Zellen (Perego et al., 1991, Mol. Microbiol. 5:173-85; Rudner et al., 1991, J. Bacteriol.). Kürzliche Ergebnisse haben gezeigt, dass Mutationen in exp1 auch die Transformationseffizienz in S. pneumoniae verringern, wohingegen Mutationen in amiA dies nicht tun. Deshalb beeinflussen zwei verschiedene Peptid Permeasen von zwei verschiedenen Gram-positiven Bakterien den Vorgang der Transformation in diesen natürlich kompetenten Bakterien.
Sowohl die DNA als auch die abgeleiteten Protein Sequenzen von exp2 waren identisch zu ponA (Basenpaare 1821-2055), die das Penicillin bindende Protein 1A (PBP1a) kodiert (Martin et al., 1992a, J. Bacteriol. 174:4517-23) (5B). Dieses Protein gehört zu der Familie von Penicillin interagierenden Serin D, D-Peptidasen, welche die letzten Schritte in der Murein Biosynthese katalysieren.
PBP1a wird routinemäßig aus pneumokokkalen Membran Präparationen isoliert und wird allgemein als ein exportiertes Protein erachtet (Hakenbeck et al., 1991, J. Infect. Dis. 164:313-9; Hakenbeck et al., 1986, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 30:553-558; Martin et al., 1992, Embo J. 11:3831-6). In E. coli sind Deletionen in sowohl PBP1a als auch PBP1b lethal für die Zelle, aber die Bakterien sind zur Kompensation in der Lage, wenn eines der Gene deletiert ist (Yousif et al., 1985, J. gen. Microbiol. 131:2839-2845). Es wäre interessant, das Peptidoglykan Profil von SPRU42 mit dem Ausgangsstamm zu vergleichen, um zu bestimmen, ob die Gen Fusion mit PBP1a die Enzym Funktion verändert.
Exp3 zeigte signifikante Sequenz Ähnlichkeit zu PilB aus N. gonorrhoeae (5C) (Taha et al., 1988, EMBO J. 7:4367-4378). Es gab zwei Regionen der Ähnlichkeit, die der C-terminalen Domäne von PilB entsprechen. Es gab eine kurze Lücke von 25 Aminosäuren in Exp3 und 37 Aminosäuren in PilB, die keine Ähnlichkeit zeigten. Dies schlägt ein modulares Strukturfunktionsverhältnis dieser beiden Proteine vor. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis waren die PhoA-PilB Hybride in der Membran Fraktion von N. gonorrhoeae angeordnet (Taha et al., 1991, Mol. Microbiol. 5:137-48), was eine Membran Translokation anzeigt.
Es wurde vorgeschlagen, das PilA und PilB Mitglieder der Familie von Sensor Regulatoren mit zwei Bestandteilen sind, welche die Pilin Gen Expression kontrollieren und das PilB ein Transmembran Sensor mit einer konservierten Transmitter Region ist, welche die Kinase Aktivität in der C-terminalen Region des Proteins enthält (Taha et al., 1991, Mol. Microbiol. 5:137-48; Taha et al., 1992, J. Bacteriol. 174:5978-81). Der konservierte Histidin Rest (H₄₀₈) in PilB, der für die Autophosphorylierung benötigt wird, die für diese Familie charakteristisch ist, ist in Exp3 nicht anwesend. Weil kein Pilin auf S. peumoniae identifiziert wurde, könnte man eine unterschiedliche Zielstelle für die Gen Regulation durch Exp3 annehmen.
Die kodierende Region, die innerhalb Exp4 identifiziert wurde, schlägt vor, dass es ähnlich ist zu der ubiquitären Familie von Clp Proteinen, die sowohl in Eukaryon ten als auch Prokaryonten gefunden wird (5D) (für eine Übersicht siehe Squires und Squires, 1992, J. Bacteriol. 174:1081-1085). Exp4 ist am ähnlichsten zu dem Homolog CD4B aus der Tomate (Gottesman et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3513-7), aber eine signifikante Ähnlichkeit wurde auch zu ClpA und ClpB aus E. coli bemerkt. Es wurde vorgeschlagen, dass diese Proteine entweder als Regulatoren von Proteolyse (Gottesman et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3513-7) oder als molekulare Chaperone (Squires und Squires, 1992, J. Bacteriol. 174:1081-1085) wirken. Ein einzigartiges Merkmal der Clp Proteine ist die lange Leader Sequenz, die eine Membran Translokation (Squires und Squires, 1992, supra, J. Bacteriol. 174:1081-1085) impliziert. Tatsächlich wird pflanzliches ClpC in Chloroplasten transluziert (Moare, 1989, Doktorarbeit, Universität von Wisconsin, Madison). Obwohl wenig über die subzelluläre Lokalisation der anderen Clp Proteine bekannt ist, schlagen unsere Ergebnisse die Translokation des pneumokokkalen Homologs über die bakterielle Membran vor.
Exp5 zeigt eine Ähnlichkeit zu PtsG aus B. subtilis (Gonzy-Tréboul et al., 1991, Mol. Microbiol. 5:1241-1249), das ein Mitglied der Familie von Phosphoenolpyruvat:Kohlenhydratphosphotransferase Permeasen ist, die in sowohl Gram-positiven als auch Gram-negativen Bakterien gefunden wird (für eine Übersicht siehe Saier und Reizer, 1992, J. Bacteriol. 174:1433-1448) (5E). Diese Permeasen sind polytrope Membran Proteine mit verschiedenen translozierten Domänen.
Die Analyse des Inserts, das von Exp6 gewonnen wurde, zeigte eine kodierende Region mit Ähnlichkeit zu Glycerol-3-Phosphatdehydrogenasen von verschiedenen prokaryonten Spezies (5F). Es ist sehr ähnlich zu GlpD aus B. subtilis (Holmberg et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136:2367-2375). Dieses Enzym ist ein Membran assoziiertes Flavoprotein, das einen Komplex mit Cytochrom Oxidasen bildet, die integrale Membran Proteine sind. Neben der Umwandlung von Glycerol-3-Phosphat zu Dihydroxyacetonphosphat und Glyceraldehyd-3-Phosphat für den nachfolgenden Eintritt in die Glykolyse, liefert dieses Enzym Elektronen an die Cytochrom Oxidasen für den anschließenden Transport. Es wurde vorgeschlagen, dass diese Dehydrogenasen an die innere Oberfläche der cytoplasmatischen Membran über nicht spezifische hydrophobe Interaktionen gebunden sind (Halder et al., 1982, Biochemistry. 21:4590-4606; Koland et al., 1984, Biochemistry. 23:445-453; Wood et al., 1984, Biochem. J. 222:519-534). Alternativ dazu wurde vorgeschlagen, dass es eine spezifische und sättigbare Zahl von Bindungsstellen zwischen den Dehydrogenasen und den Cytochromen gibt, die als Anker der Dehydrogenasen an der cytoplasmatischen Membran dienen. Die hier berichteten Daten schlagen vor, dass in S. pneumoniae ein Segment der Dehydrogenase an die äußere Oberfläche der Bakterien transloziert ist (Kung und Henning, 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69:925-929). Die Translokation der katalytischen Domäne würde gewiss die Enzym Funktion nicht verändern. In wiederhergestellten Inside Out Membran Vesikeln fand der Elektronen Transport zu den Cytochromen statt, wenn Dehydrogenasen zu irgendeiner Seite der Vesikel zugegeben wurden (Halder et al., 1982, Biochemistry. 21:4590-4606).
Die Analyse der von Exp7 abgeleiteten Sequenz zeigte Ähnlichkeit mit der Familie von sowohl eukaryonten als auch prokaryonten P-Typ (E₁E₂-Typ) Kationen Transport ATPasen, die für den Transport von Kationen, wie Ca²⁺, Mg²⁺, K⁺, Na⁺ und H⁺ verantwortlich sind (5G). Diese ATPasen sind intrinsische Membran Proteine mit einigen translozierten Domänen. Beispiele wurden in E. faecalis (Solioz et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:7358-7362), Salmonella typhimurium (Snavely et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:815-823), E. coli (Hesse et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:4746-4750), Neurospora crassa (Addison, 1986, J. Biol. Chem. 26:14896-14901; Hager et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:7693-7697), Saccharomyces cerevisiae (Rudolph et al., 1989, Cell. 58:133-145) und dem sarkoplasmatischen Retikulum von Kaninchen Skelettmuskel (Brandi et al., 1986, Cell. 44:597-607; Serrano et al., 1986, Nature. 689-693) identifiziert. Exp7 ist am ähnlichsten zu MgtB aus S. typhimurium, das einer von drei genetischen Loci ist, die für den Transport von Mg²⁺ verantwortlich sind (Snavely et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:815-823). Die identifizierte Region enthält den hoch konservierten Aspartyl Rest, der die Stelle für ATP abhängige Autophosphorylierung darstellt. Basierend auf der Ähnlichkeit zu MgtB tritt die Fusion in Exp7 wahrscheinlich in der C-terminalen Region des Proteins auf. Ein Vorhersagemodell für die Trans membran Schleifen von MgtB schlagen vor, dass diese Region auf der cytoplasmatischen Oberfläche liegen könnte (Snavely et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:815-823). Die Daten der PhoA Fusion mit Exp7 schlagen vor, dass die Lage dieser Region auf der cytoplasmatischen Oberfläche nicht der Fall ist in S. pneumoniae.
Exp8 zeigt Ähnlichkeit zu der Familie von Traffic ATPasen, die alternativ als ATP Bindungskassette (ABC) Superfamilie von Transportern bezeichnet wird, die sowohl in Prokaryonten als auch in Eukaryonten gefunden werden (im Überblick zusammengefasst in Ames und Lecar, 1992, Faseb J. 6:2660-6) (5H). Exp8 ist am ähnlichsten zu den Transmembran Proteinen, die für die Translokation von bakteriellen RTX Proteinen, wie dem α-Hämolysin, verantwortlich sind, die eukaryonte Cytotoxine sind, die sowohl in Gram-negativen als auch Gram-positiven Organismen gefunden werden (als Übersicht zusammengefasst in Welch, 1991, Mol. Microbiol. 5:521-528). Das Fusionsprotein, das Exp8 enthält, ist am ähnlichsten zu CyaB, einem Bestandteil des cya Operons in Bordetella pertussis (Glaser et al., 1988, Mol. Microbiol. 2:19-30; Glaser et al., 1988, EMBO J. 7:3997-4004). Dieser Locus bildet das Adenylatcyclasetoxin, das auch ein Mitglied der RTX Familie von bakteriellen Toxinen ist. Es bleibt nicht unbemerkt, dass der comA Locus in S. pneumoniae auch ein Mitglied dieser Familie ist (Hui und Morrison, 1991, J. Bacteriol. 173:372-81).
Die abgeleitete Sequenz für exp9 aus zwei Regionen des gewonnenen Inserts ist in 4 dargestellt. Die Analyse dieser Sequenz zeigte, dass Exp9 ein Mitglied der D-E-A-D Protein Familie von ATP-abhängigen RNA Helikasen ist (für eine Übersicht siehe (Schmid und Linder, 1992, Mol. Microbiol. 6:282-292)). Es ist am ähnlichsten zu DEAD aus E. coli (5I) (Toone et al., 1991, J. Bacteriol. 173:3291-3302). Eine große Zahl von Helikasen wurden aus vielen verschiedenen Organismen identifiziert. Mindestens fünf verschiedene Homologe wurden in E. coli identifiziert (Kalman et al., 1991, The New Biologist 3:886-895). Das Kennzeichen dieser Proteine ist die konservierte DEAD Sequenz innerhalb des B Motivs einer ATP bindenden Domäne (Walker et al., 1982, EMBO J. 1:945-951). Die DEAD Sequenz wurde in der Sequenz identifiziert, die von dem 5' Ende des Insert von exp9 abgeleitet ist.
Zwei Studien haben vorgeschlagen, dass verschiedene Homologe in E. coli eine Rolle in der Translation durch Beeinflussen des Ribosomen Zusammenbaus spielen könnten (Nishi et al., 1988, Nature, 336:496-498; Toone et al., 1991, J. Bacteriol. 173:3291-3302). Es gab keine veröffentlichten Studien, die entweder über den Export oder die Membran Assoziation dieser Proteine berichtet hätten. Deshalb war es überraschend, eine PhoA⁺ Mutante zu identifizieren, die diese Funktion trägt. Die subzelluläre Fraktionierung zeigt klar, dass der Hauptanteil des Fusionsproteins mit der Membran Fraktion der Bakterien assoziiert ist (6), obwohl diese ein Abnormalität sein könnte, die nur mit dem Fusionsprotein beobachtet wird.
Kürzlich wurde von comF in B. subtilis gezeigt, dass es eine ähnliche RNA/DNA Helikase mit einer DEAD Sequenz (Londonó – Vallejo und Dubnau, Mol. Microbiol.) enthält. Mutationen in diesem Lokus machen die Bakterien transformationsdefizient. Anschließende Studien haben gezeigt, dass die Helikase ein Membran assoziiertes Protein ist, und es wurde vorgeschlagen, dass sie eine Rolle in dem Transport von DNA während der Transformation spielt (D. Dubnau, persönliche Mitteilung). Vorläufige Experimente haben keinen großen Unterschied in der Transformierbarkeit einer Mutante gezeigt, welche die Exp9-PhoA Fusion exprimiert. Wenn es eine Klasse von Helikasen gibt, die mit der Membran assoziiert sind, ist es verlockend zu spekulieren, dass Exp9 in die Translation von Polypeptiden involviert ist, für die vorgesehen ist, dass sie exportiert werden.
Zusammenfassend zeigt dieses Beispiel die Entwicklung einer Technik, die erfolgreich einige genetische Loci in S. pneumoniae mutierte und identifizierte, die Homologe von bekannten exportierten Proteinen kodieren. Es ist klar aus unseren Ergebnissen, dass der Hauptanteil der Loci, die identifiziert wurden, exportierte Proteine kodieren, die eine Rolle in einigen verschiedenen Vorgängen spielen, die entweder an der cytoplasmatischen Membran oder außerhalb der Bakterien statt finden. Wie mit der Verwendung von PhoA Mutagenese in anderen Organismen ist vorsichtiges Vorgehen mit dieser Technik in S. pneumoniae angeraten. Nicht alle identifizierten Loci müssen exportierte Proteine kodieren. Es ist bestimmt möglich, dass aufgrund von einigen Faktoren, wie Zelllyse, einige falsch Positive gebildet werden können. Wie in dem folgenden Beispiel gezeigt wird, können zusätzliche Assays durchgeführt werden, um die funktionelle Aktivität des mutierten putativen exportierten Proteins zu zeigen.
Unter Angabe dieser Ergebnisse kodiert der Hauptanteil der Loci, die bis heute identifiziert wurden, exportierte Proteine, von denen einige eine Rolle in der Signal Transduktion, der Protein Translokation, der Zellwand Biosynthese, der Nährstoffgewinnung oder Aufrechterhaltung einer chemiosmotischen Balance spielen.
BEISPIEL 2: DIE MUTATION VON EINIGEN EXPORTIERTEN PROTEINEN BEEINFLUSST DIE ADHÄRENZ
In diesem Beispiel wurde die Fähigkeit von verkapselten und nicht verkapselten Pneumokokken untersucht, an Lungen Zellen anzuheften. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Arten von Pneumokokken an gemischte Lungen Zellen und Typ II Lungen Zellen anheften, obwohl die Präferenz auf Typ II Zellen lag. Außerdem schlagen die Ergebnisse vor, dass der Typ II verkapselte Stamm eine geringfügig größere Fähigkeit zum Anheften besitzt als die nicht verkapselte Variante.
Die Wirkung von Mutationen in exportierten Proteinen auf die Fähigkeit der mutierten S. pneumoniae Stämme, an humane Nabelschnurvenen endotheliale Zellen (HUVEC) und Lungen Typ II Zellen anzuheften, wurde ebenfalls untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass einige der exportierten Proteine direkte oder indirekte Rollen in der Adhäsion von S. pneumoniae an entweder HUVEC oder Lungen Zellen oder beide aufweisen.
Materialien und Methoden
Herstellung von gemischten und Typ II alveolaren Zellen aus dem Kaninchen
Wie beschrieben bei Dobbs und Mason (1979, J. Clin. Invest. 63:378-387) wurden die Lungen aus dem Kaninchen entfernt, zerkleinert und mit Kollagenase, Elastase und DNase für 60 Min. bei 37°C gespalten. Große Stücke wurden über einen Mullfilter entfernt, und die Zellen wurden pelletiert und zweimal gewaschen. Die gemischten Lungen Zellen wurde in 20 ml Calcium enthaltendem Puffer in einer Dichte von 10⁴ pro ml resuspendiert, der mit 0,5 % Albumin ergänzt worden war. Die Alveolar Typ II Zellen wurden aus der gemischten Lungen Zellsuspension durch Überschichten der Suspension auf einen Albumin Gradienten von 10 ml bei 16,5 g % über 10 ml bei 35 g % gereinigt und bei 1200 rpm für 20 Min. bei 4°C zentrifugiert. Die oberen 26 ml des Gradienten wurden verworfen, und die Zellen in den nächsten 12 ml wurden geerntet, gewaschen und auf eine Konzentration von 10⁴ Zellen pro ml eingestellt. Die Lebensfähigkeit der Zellen war größer als 90 %, wie durch Trypan Blau Auschluss bewertet wurde, und größer als 80 % der Zellen enthielt osmiophile lamellare Körper, die typisch für Typ II Zellen sind, wenn sie im Elektronenmikroskop untersucht wurden.
Adhärenz Assay mit gemischten und Typ II alveolaren Zellen
Ungefähr 10³ bis 10⁹ Typ II (uerkapselte) oder R6 (unverkapselte) Pneumokokken wurden zu 10⁴ Lungen Zellen in einem 1 ml Volumen für 30 Min. bei 37°C zugegeben. Die Lungenzellen wurden von den nicht angehefteten Bakterien durch 5 Waschrunden durch Zentrifugation bei 270 × g für 5 Min. getrennt. Bakterien, die an dem Endzellpellet anhefteten, wurden durch Ausplattieren und durch Gram Färbung ausgezählt.
HUVEC und Typ II Lungen Alveolar Zelladhärenz Assays
HUVEC (Clonetics, San Diego, Kalifornien) und Typ II alveolare Zelllinien Zellen (ATCC Zugangsnummer A549) wurden 4–8 Tage kultiviert und wurden anschließend in Terasaki Schälchen 24 Stunden bevor der Adhärenz Assay durchgeführt wurde transferiert, um die Bildung eines konfluenten Monolayer zu erlauben (Geelen et al., 1993, Infect. Immun. 61:1538-1543). Die Bakterien wurden mit Fluoreszein markiert (Geelen et al., supra) und bei einer Konzentration von 5 × 10⁷ oder bei Konzentrationen von 10⁵, 10⁶ und 10⁷ cfu pro ml eingestellt, und sie wurden in einem Volumen von 5 μl in mindestens 6 Vertiefungen zugegeben. Nach Inkubation bei 37°C für 30 Min. wurden die Platten gewaschen und mit PBS/Glutaraldehyd 2,5 % fixiert. Angeheftete Bakterien wurden visuell unter Verwendung eines Nikon Diaphot Invertierten Mikroskops, das mit Epifluoreszenz ausgestattet war, ausgezählt.
Mutanter Stamm SPRU25
Ein zusätzlicher mutanter Stamm von R6, SPRU25 wurde, wie in Beispiel 1 oben beschrieben, hergestellt.
Ergebnisse und Diskussion
Die Adhärenz von verkapselten Typ 2 und unverkapselten R6 Pneumokokken an gemischte Lungen Zellen (Daten nicht gezeigt) war übereinstimmend 1–2 Logstufen geringer in jedem Inokulum als gegenüber gereinigten Typ II Zellen. Dies zeigte, dass Typ II Zellen das bevorzugte Ziel für die Bakterien waren. Die Konzentrationskurve für Typ II Zellen ist in 7 gezeigt. Ein konsistenter, aber statistisch nicht signifikanter Unterschied wurde zwischen verkapselten und nicht verkapselten Stämmen bemerkt, was nahe legt, dass der Typ II Stamm eine geringfügig größere Fähigkeit zum Anheften aufweisen könnte als die unverkapselte Variante.
Mutante Stämme (Tabelle 1) wurden hinsichtlich der Fähigkeit getestet, an HUVEC und Lungen Typ II Zellen anzuheften. Es wurde gefunden, dass die Stämme SPRU98, SPRU42, SPRU42, SPRU25 und SPRU121 eine verringerte Adhäsionsaktivität im Vergleich zu dem R6 Wildtyp Stamm aufweisen. Die Adhärenz von anderen Stämmen war nicht signifikant durch die Mutation der exportierten Proteine beeinflusst (Daten nicht gezeigt).
Die Bakterien wurden auf 10⁵, 10⁶ und 10⁷ cfu pro ml titriert und hinsichtlich der Fähigkeit, an HUVEC (8) und Lungen Typ II (9) Zellen anzuheften, untersucht. Bei der niedrigsten Konzentration waren die Zahlen der angehefteten Bakterien relativ gleich zwischen der Adhärenz defizienten Mutante und R6. Bei 10⁶ und noch bemerkenswerter bei 10⁷ cfu pro ml schwankte die Differenz zwischen Bindung durch die Mutanten an sowohl HUVEC als auch Lungen Typ II Zellen von signifikant bis dramatisch.
Homologien der exportierten Proteine der Stämme SPRU98, SPRU42 und SPRU40 werden in Beispiel 1 oben diskutiert. SPRU121 stellt eine Mutation in dem amiA Locus dar. Die Ergebnisse dieses Experiments liefern einen unerwarteten Beweis, dass das AmiA exportierte Protein in die Adhäsion involviert ist. SPRU25 ist ein Stamm, der hergestellt wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, mit einer Mutation in exp10. Es wurden keine Gene oder Proteine mit Homologie zu der Nukleinsäure [SEQ ID NR: 21] oder Aminosäure [SEQ ID NR: 22] Sequenzen dieses exportierten Proteins gefunden. Der identifizierte Abschnitt der exp10 Nukleotid- und Exp10 Aminosäuresequenzen sind in 10 gezeigt.
Diese Ergebnissen zeigen eindeutig, dass exportierte Proteine von S. pneumoniae, die eine Rolle in der Adhäsion des Bakteriums an Zellen spielen, identifiziert werden können.
BEISPIEL 3: PEPTID PERMEASEN MODULIEREN DIE TRANSFORMATION
Das vorliegende Beispiel betrifft die weitere Aufklärung der Sequenz und Funktion von Exp1, einer Mutante die konsistent 10-fach geringer als der Ausgangsstamm transformierte. Die vollständige Sequenz Analyse und Rekonstitution des veränderten Locus zeigte ein Gen, das als plpA (Permease ähnliches Protein – engl.: permease like protein) bezeichnet wurde, das ein putatives Substrat bindendes Protein kodiert, das zu der Familie der bakteriellen Permeasen gehört, die für den Peptid Transport verantwortlich sind. Die abgeleitete Aminosäuresequenz für die ses Gen war 80 % ähnlich zu AmiA, einem Peptid bindenden Protein Homolog aus Pneumococcus, und 50 % ähnlich über 230 Aminosäuren zu Spo0KA, das ein regulatorisches Element in dem Vorgang der Transformation und Sporulation in Bacillus subtilis ist. PlpA Fusionen mit alkalischer Phosphatase (PhoA) wurden als Membran assoziiert gezeigt, und sie wurden mit [³H] Palmitinsäure markiert, das wahrscheinlich als ein Membrananker dient. Die Experimente, die durchgeführt wurden, um die Rollen der plpA und ami Determinanten in dem Vorgang der Transformation zu definieren, zeigten dass: 1] Mutanten mit Defekten in plpA > 90 % transformationsdefizient waren, während ami Mutanten einen vierfachen Anstieg in der Transformationseffizienz zeigten. 2] Im Vergleich zu dem Ausgangsstamm der Beginn der Kompetenz in einer ami Mutante früher im logarithmischen Wachstum stattfand, während der Beginn in einer plpA Mutante verzögert war. 3] Die plpA Mutation die Expression eines Kompetenz regulierten Locus verringerte. Weil die Permease Mutanten spezifische Liganden nicht binden würden, ist es wahrscheinlich, dass die Substrat-Permease Interaktion den Vorgang der Transformation moduliert.
Dieses Beispiel zeigt durch Mutationsanalyse, dass diese zwei Peptid Permeasen verschiedene Wirkungen auf die Induktion von Kompetenz ebenso wie auf die Transformationseffizienz ausüben. Deshalb schlagen wir vor, dass Peptid Permeasen den Vorgang der Transformation in Pneumococcus durch Substrat Bindung und anschließenden Transport oder Signal Weiterleitung vermitteln und dass diese Substrate in die Regulation von Kompetenz involviert sein können.
Materialien und Methoden
Stämme und Medien. Die Stämme von S. pneumoniae, die in diesem Beispiel verwendet wurden, sind in Beispiel 1, insbesondere in Tabelle 1 beschrieben. Tabelle 5 listet andere pneumokokkale Stämme auf, die in dieser Studie verwendet wurden und fasst ihre relevanten Eigenschaften zusammen. Escherichia coli Stämme sind in Beispiel 1 beschrieben.
Tabelle 5. Bakterielle Stämme von Streptococcus pneumoniae, die in dieser Studie verwendet wurden.
S. pneumoniae Ausplattier- und Kulturbedingungen sind in Beispiel 1 beschrieben. Für die Markierungsstudien wurden die Kulturen in einem chemisch definierten Medium (C_DEN), das hergestellt wurde wie beschrieben bei (Tomasz, 1964, Bacteriol. Proc. 64:29), angezogen. E. coli wurde in entweder flüssigem Luria-Bertani Medium oder auf festem TSA Medium, das mit 500 μg/ml Erythromycin oder 100 mg/ml Ampicillin, wo notwendig, ergänzt wurde. Für die Selektion und Aufrechterhaltung von Pneumococcus, der chromsomal integrierte Plasmide aufwies, wurden die Bakterien in der Anwesenheit von 0,5 μg/ml Erythromycin angezogen.
Pho⁺ Bibliotheken und Mutagenese. Es wurden Bibliotheken von pneumokokkalen Mutanten, die PhoA Fusionen exprimierten, durch insertionelle Inaktivierung mit den nicht replizierenden pneumokokkalen E. coli Shuttle Vektoren pHRM100 oder pHRM104 hergestellt. Der pneumokokkale E. coli Shuttle Vektor pJDC9 wurde für Gen Inaktivierung ohne die Herstellung von phoA Fusionen verwendet. Die Plasmid Konstrukte, die für die Mutagenese verwendet wurden, sind in 7 gezeigt. Die Details für diese Verfahren sind in Beisipel 1 beschrieben.
Pneumokokkale Transformation. Um eine große Anzahl von Mutanten hinsichtlich einer Verringerung in der Transformationseffizienz zu screenen, wurden einzelne Kolonien in 96 Vertiefungsmikrotiter Platten mit 250 μl Flüssigmedium und chromsomaler DNA (Endkonzentration 1 μg/ml) aus einem Streptomycin resistenten Stamm von Pneumococcus (Str^r DNA) transferiert. Nach Inkubation für 16 h bei 37°C wurden 5 μl Proben auf festes Medium mit und ohne Antibiotika ausplattiert, um die Transformationseffizienz zu bestimmen. Die Kontrollstämme bildeten ungefähr 10⁵ Str^r Transformanten/ml, während transformationsdefiziente Kandidaten weniger als 10⁴ Str^r Transformanten/ml bildeten.
Die Permease Mutanten wurden in einem definierteren Transformationsassay (15) bewertet. Stockkulturen von Bakterien wurden zu einer Zelldichte von ungefähr 10⁶ cfu/ml in C + Y Medium mit Str^r DNA verdünnt. Diese Lösung wurde in 250 μl Aliquots in einer 96 Vertiefungsmikrotiter Platte verteilt, und die Bakterien wurden für 5 Stunden bei 37°C bis zu einer OD₆₂₀ von ungefähr 0,6 angezogen. Gesamt Bakterien und Str^r Transformanten wurden durch eine Verdünnungsreihe der Kulturen auf festem Medium mit und ohne Antibiotika bestimmt. Die Transformationseffizienz wurde als der Prozentsatz von Str^r Transformanten/Gesamtzahl von Bakterien berechnet und mit dem Ausgangsstamm, R6x, verglichen.
Es wurden Kompetenzprofile, welche die Transformation bewerten, von Kulturen, die in Flüssigmedium angezogen wurden, gebildet. Es wurden Stocks von Bakterien auf eine Zelldichte von ungefähr 10⁶ cfu/ml in frischem C + Y Medium (10 ml) verdünnt und bei 37°C angezogen. Proben (500 μl) wurden bei bestimmten Intervallen entnommen, gefroren und in 10 % Glycerol bei –70°C gelagert. Diese Proben wurden auf Eis aufgetaut, anschließend mit Str^r DNA für 30 Min. bei 30°C inkubiert. DNAse wurde in einer Endkonzentration von 10 μg/ml zugegeben, um weitere DNA Aufnahme zu stoppen, und die Kulturen wurden in 37°C für weitere 1,5 h transferiert, um die Expression von Antibiotika Resistenz zu erlauben. Die Transformationseffizienz wurde wie oben beschrieben berechnet.
Rekombinante DNA Techniken. Standard DNA Techniken einschließlich Plasmid Mini Präparation, Restriktionsendonuklease Spaltungen, Ligationen, Transformation in E. coli und Gelelektrophorese wurden nach den Standard Protokollen (Sambrook et al., 1989, supra) durchgeführt. Die Restriktionsfragmente, die in den Klonierungsexperimenten verwendet wurden, wurden aus Agarose Gelen unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio 101) oder Phenol Extraktionen isoliert. Plasmid Präparationen im großen Maßstab wurden unter Verwendung der Affinitätssäulen gemäß den Angaben des Herstellers (Qiagen) hergestellt.
Es wurde eine doppelsträngige DNA Sequenzierung nach dem Verfahren von Sanger (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-67) unter Verwendung von [a-³⁵S]-dATP (New England Nuclear) und dem Sequenase Version 2.0 Kit (United States Biochemical Corp.) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Dimethylsulphoxid (1 % v/v) wurde zu den Anlagerungs- und Extensionsschritten zugegeben.
Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) wurde unter Verwendung des Gene Amp Kit (Perkin Elmer Cetus) durchgeführt. Oligonukleotide wurden durch Oligos Etc. Inc. oder bei der Protein Sequenziereinrichtung der Rockefeller Universität synthetisiert.
In vivo Markierung von PlpA-PhoA. Gefrorene Stocks von Pneumococcus wurden in 4 ml frischem C_DEN Medium resuspendiert und bis zu einer OD₆₂₀ von 0,35 bei 37°C angezogen. Jede Kultur wurde mit 100 μCi [9,10-³H] Palmitinsäure (New England Nuclear) ergänzt und für weitere 30 Min. angezogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und dreimal in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Das Endzellpellet wurde in 50 μl Lyse Puffer (PBS; DNAse, 10 μg/ml; RNAse 10 μg/ml; 5 % [v/v] Desoxycholat) resuspendiert und für 10 Min. bei 37°C inkubiert. Um das PlpA-PhoA Fusionsprotein zu immunpräzipitieren, wurde das Zelllysat mit 20 μl anti-PhoA Antikörpern, konjugiert an Sepharose (5'3' Inc.) für 1 h bei 4°C inkubiert. Die Suspension wurde dreimal mit gleichen Volumina von PBS und einmal mit 100 μl 50 mM Tris-HCl pH 7,8, 0,5 mM Dikaliumethylendia mintetra-Acetat (EDTA) gewaschen. Der Endüberstand wurde verworfen, und das Harz wurde in 30 μl SDS Probenpuffer resuspendiert, für 5 Min. aufgekocht und einer SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese und Autoradiographie unterzogen.
Subzelluläre Fraktonierung. Die Pneumococci wurden in subzelluläre Bestandteile durch eine zuvor beschriebene Technik (Hakenbeck et al., 1986, Antimicrob. Agents Chemother. 30:553-8) fraktioniert. Kurz gesagt wurden die Bakterien in 400 ml C + Y Medium bis zu einer OD₆₂₀ von 0,6 angezogen und durch Zentrifugation bei 17.000 g für 10 Min. isoliert. Das Zellpellet wurde in einem Gesamtvolumen von 2 ml TEPI (25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 20 μg/ml Leupeptin und 20 μg/ml Aprotinin) resuspendiert. Ein halbes Volumen von gewaschenen Glaskügelchen wurde zugegeben, und das Gemisch wurde für 15 bis 20 Min. bei 4°C gevortext, bis die Zellen aufgebrochen waren, wie durch mikroskopische Inspektion dokumentiert wurde. Die Suspension wurde von den Glaskügelchen durch Filtration über einen gesinterten Glastrichter getrennt. Die Kügelchen wurden mit zusätzlichen 5 ml TEPI gewaschen. Die vereinigten Lösungen wurden für 5 Min. bei 500 g zentrifugiert, um den Zelldebris von Zellwand Material, bakteriellen Membranen und cytoplasmatischen Bestandteilen zu trennen. Der Überstand wurde anschließend für 15 Min. bei 29.000 g zentrifugiert. Das Pellet enthielt die Zellwand Fraktion, während der Überstand einer anderen Zentrifugation für 2 h bei 370.000 g unterzogen wurde. Der Überstand aus diesem Verfahren enthielt die cytoplasmatische Fraktion, während das Pellet die bakteriellen Membranen enthielt. Es wurden Proben von jeder Fraktion hinsichtlich Protein Gehalt untersucht, und sie wurden in SDS Probenpuffer für nachfolgende Gelelektrophorese gelöst. PlpA-PhoA Fusionsproteine wurden mit anti-PhoA Antiserum (5'3' Inc.) nachgewiesen und direkt durch verstärkte Chemilumineszenz, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, dargestellt.
Gewinnung und Sequenzierung von plpA. 18 zeigt eine Restriktionsendonuklease Karte von plpA und Fragmenten von verschiedenen Subklonen. Plasmide mit in pHRM104 klonierten Fragmenten tragen die Vorsilbe H, während jene, die in pJDC9 kloniert wurden, die Vorsilbe J tragen. Die integrierten Plasmide pHplp1 und pHplp10 wurden jeweils aus SPRU98 und SPRU58 durch Transformation in E. coli von spontan ausgeschnittenen Plasmiden, die chromosomale Präparationen von DNA kontaminieren, isoliert. "Chromosomen walking" wurde verwendet, um das Meiste von plpA und der unterhalb gelegenen Region zu isolieren. Das 500 bp Insert von pHplp1 wurde über KpnI in pJDC9 kloniert, um pJplp1 herzustellen, das in Pneumococcus zurückgegeben wurde, um SPRU107 herzustellen. Chromosomale DNA aus SPRU107 wurde mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen gespalten, die den Vektor einmal schneiden, aber die nicht in dem Original Fragment schneiden. Die DNA wurde religiert und in E. coli mit Selektion für den Vektor transformiert. Unter Verwendung dieses Verfahrens lieferte PstI pJplp2, und HindIII lieferte pJplp3, die beide die 3' Region des Original Fragments in pJplp1 um 190 bp verlängerten, während SphI pJplp4 lieferte, das zusätzliche 3,8 kb enthielt. Die Subklonierung eines 900 bp inneren Fragments von pJplp4 in pJDC9 ergab Plasmid pJplp5, das 630 bp unterhalb von dem 3' Ende von plpA enthielt. Ein weiteres 450 bp Fragment wurde oberhalb des Original Fragments unter Verwendung von EcoRI (pJplp6) isoliert. Ein 730 bp inneres Fragment von pJplp6 wurde in pJDC9 kloniert, was pJplp 7 ergab, und 200 bp EcoRI/PstI inneres Fragment von pJplp6 wurde in die geeigneten Stellen von pJDC9 kloniert, um pJplp8 herzustellen.
Die Region oberhalb des Original Fragments von plpA wurde durch "Homologie Klonierung" unter Verwendung von degenerierten und spezifischen Oligonukleotiden mit chromosomaler DNA in einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) erhalten. Das degnerierte Oligonukleotid, lipo1, (GCC GGA TCC GGW GTW CTT GCW GCW TGC, wobei W A + T ist) (SEQ ID NR: 49) beruhte auf dem Lipoprotein Vorläufer Konensus Motiv, das in AmiA (Alloing et al., 1990, Mol. Microbiol. 4:633-44) und SarA, einem Peptid Permease bindenden Protein Homolog von S. gordonii (Jenkinson, 1992, Infect. Immun. 60:1225-8) anwesend ist. Das spezifische Oligonukleotid, P1, (TAC AAG AGA CTA CTT GGA TCC) (SEQ ID NR: 50) war komplementär zu dem 5' Ende des Inserts in pJplp6. Um die Amplifikation des hoch homologen amiA Gens zu verhindern, wurde chromosomale DNA aus SPRU114 verwendet, das ein zerstörtes amiA aufweist. Die chromosomale DNA wurde zu nächst mit XhoI gespalten, um kürzere Matrizen zu ergeben. Die PCR Bedingungen waren 40 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden zum Denaturieren, 40°C für 30 Sekunden zum Anlagern und 72°C für 1 Min. für die Extension. Ein 600 bp Produkt wurde erhalten, über Gel gereinigt, mit BamHI gespalten und in Bluescript KS (Stratagene) kloniert, um pBSplp9 zu ergeben. Das BamHI gespaltene Fragment wurde anschließend in pJDC9 subkloniert, um pJplp9 herzustellen. Das Plasmid wurde in Pneumococcus transformiert, um SPRU122 zu ergeben.
Herstellung einer plpA Mutante, die ein Kompetenz reguliertes Gen, fusioniert an alkalische Phosphatase aufweist. Das 600 bp BamHI Fragment aus pBSplp9 wurde in SauIIIa gespaltenen pWG5 (Lacks et al., 1991, GENE 104:11-17) ligiert, was zu pWplp9 führte. Dieses Plasmid wurde in SPRU100 transformiert, der ein Gen, exp10 von dem Kompetenz regulierten rec Locus, enthält, fusioniert an phoA, was SPRU156 ergab. Die korrekte Integration des Vektors in das Chromosom wurde durch PCR bestätigt. Die alkalische Phosphatase Aktivität wurde gemessen wie in Beispiel 1 beschrieben, aber mit einer Endsubstratkonzentration (p-Nitrophenylphosphat, Sigma) von 2,5 mg/ml. Die Aktivitätseinheiten wurden unter Verwendug der folgenden Formel berechnet:
Herstellung von ami Mutanten. Die inneren Fragmente von ami, die durch PCR und Restriktionsendonuklease Spaltung erhalten wurden, wurden in geeignete Shuttle Vektoren ligiert und in Pneumococcus transformiert, um die verschiedenen ami Mutanten herzustellen. Die Konstruktion der Gen Fusion zwischen amiA und phoA wurde zuvor in Beispiel 1 beschrieben, um SPRU121 zu ergeben. Um ein verkürztes amiA zu erhalten, wurden die Oligonukleotide ami1 (ACC GGA TCC TGC CAA CAA GCC TAA ATA TTC) (SEQ ID NR: 51) und ami2 (TTT GGA TCC GTT GGT TTA GCA AAA TCG CTT) (SEQ ID NR: 52) verwendet, um ein 720 bp Produkt an dem 5' Ende von amiA zu bilden. Dieses Fragment wurde mit HindIII und EcoRI gespalten, die innerhalb der kodierenden Region von amiA liegen, und das korrespondierende 500 bp Fragment wurde in pJDC9 kloniert. Das resultierende Plasmid pJamiA wurde in Pneumococcus transformiert, um SPRU114 herzustellen. Um amiC zu inaktivieren, wurden die Oligonukleotide amiC1 (CTA TAC CTT GGT TCC TCG) (SEQ ID NR: 53) und amiC2 (TTT GGA TTC GGA ATT TCA CGA GTA GC) (SEQ ID NR: 54), die innerhalb von amiC liegen, verwendet, um ein 300 bp Produkt unter Verwendung von PCR zu bilden. Das resultierende Fragment wurde mit BamHI gespalten und in pJDC9 kloniert, um das Plasmid, pJamiC1, herzustellen, das in Pneumococcus transformiert wurde, um SPRU148 herzustellen.
Northem Analyse. RNA wurde gemäß den Verfahren, die nach Simpson et al. (1993, FEMS Microbiol. Lett. 108:93-98) angepasst wurden, hergestellt. Die Bakterien wurden bis zu einer OD₆₂₀ von 0,2 in C + Y Medium, pH 8,0 angezogen. Nach Zentrifugation (12.000 g, 15 Min., 4°C) wurde das Zellpellet in 1/40 Volumen Lysepuffer (0,1 % Desoxycholat, 8 % Sucrose, 70 mM Dithiothreitol) resuspendiert. SDS wurde zu 0,1 % zugegeben, und die Suspension wurde bei 37°C für 10 Min. inkubiert. Der Zelldebris wurde entfernt, und ein gleiches Volumen von kaltem 4 M Lithiumchlorid wurde zu dem Überstand zugegeben. Die gemischte Suspension wurde über Nacht auf Eis belassen, anschließend bei 18.500 g für 30 Min. bei 4°C zentrifugiert. Das RNA enthaltende Pellet wurde in 1,2 ml kaltem Natriumacetat (100 mM, pH 7,0) und 0,5 % SDS resuspendiert, dreimal mit einem gleichen Volumen von Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) und einmal mit einem gleichen Volumen an Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Die RNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in sterilem Wasser resuspendiert. Die Ausbeute und Reinheit wurde durch Spektrophotometrie mit einer typischen Ausbeute von 300 μg RNA aus 80 ml Kultur bestimmt.
Proben von RNA wurden durch Elektrophorese in 1,2 % Agarose/6,6 % Formaldehyd Gelen (Rosen und Villa-Komaroff, 1990, Focus, 12:23-24) getrennt. Das Gel wurde in Wasser gespült, und die RNA wurde auf Nitrocellulose Filter (Schleicher und Schuell) durch Kapillar Blotten (Sambrook et al., 1989, supra) transferiert. Die Prähybridisierung wurde 4 h in 0,2 % Denhardts (1 × Denhardts ist 1 % Ficoll, 1 % Polyvinyl-Pyrrolidon, 1 % Rinderserumalbumin), 0,1 % SDS, 3 × SSC (1 × SSC ist 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat), 10 mM HEPES, 18 μg/ml denaturierte Lachssperma DNA und 10 μg/ml Hefe tRNA bei 65°C mit vorsichtiger Bewegung durchgeführt.
Die verwendete DNA Sonde, um plpA Transkripte nachzuweisen, war ein 480 bp HindIII – BamHI Fragment von pJplp9. Zum Nachweisen von amiA Transkripten war die DNA Sonde ein 720 bp PCR Produkt, das mit den Oligonukleotiden ami1 und ami2 (oben beschrieben) hergestellt wurde. Die DNA Fragmente wurden mit [a-³²P]-dCTP unter Verwendung eines Nick Translationssystems (New England Nuclear) markiert. Die Hybridisierung wurde bei 65°C über Nacht durchgeführt. Die Hybridisierungswaschschritte waren 2 × SSC, 0,5 % SDS für 30 Min. bei Raumtemperatur, gefolgt von 3 × 30 Min. Waschschritten bei 65°C in 1 × SSC, 0,5 × SSC und 0,2 × SSC, die alle 0,5 % SDS enthielten.
Ergebnisse
Identifizierung einer transformationsdefizienten Mutante mit einem Defekt in einer Peptid Permease. Um exportierte Proteine in Mutanten zu identifizieren, wie in Beispiel 1, supra, beschrieben, die in dem Vorgang der Transformation teilnehmen, wurden 30 PhoA⁺ Mutanten hinsichtlich einer Verringerung in der Transformationseffizienz untersucht. In einem Assay, der gestaltet war, um große Zahlen von Mutanten zu screenen, lieferte die Transformation einer chromosomalen Mutation für Streptomycin Resistenz (Str^r) in den Ausgangsstamm (R6x) ungefähr 10⁵ cfu/ml Str^r Transformanten. Die PhoA⁺ Mutante, SPRU98 zeigte konsistent eine 90 % Reduktion in der Zahl der Str^r Transformanten (10⁴ cfu/ml). Die Transformation der PhoA⁺ Mutation in den Ausgangs R6x lieferte Stämme, die sowohl PhoA⁺ als auch transformationsdefizient waren, was zeigte, dass die Mutation, die durch die Gen Fusion verursacht wurde, mit dem Defekt in der Transformation verbunden war. Die Wachstumsrate von SPRU98 war identisch zu dem Ausgangsstamm, was vorschlägt, dass der transformationsdefiziente Phänotyp nicht auf einem pliotrophen Effekt beruhte, der mit dem Wachstum des Organismus verbunden ist (Daten nicht gezeigt). Die Gewinnung und Identifizierung des mutierten Locus in SPRU98 zeigte plpA (Permease ähnliches Protein – engl.: permease like protein) (11, SEQ ID NR: 46), das exp1 entspricht. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von plpA (SEQ ID NR: 47) zeigte weitgehende Ähnlichkeit zu den Substrat bindenden Proteinen, die mit bakteriellen Permeasen assoziiert sind (für einen Übersichtsartikel, siehe Tam und Saier, 1993, Microbiol. Rev. 57:320-346), wobei die größste Ähnlichkeit in AmiA (60 % Sequenz Identität) (12A; SEQ ID NR: 48) lag. Die Anordnung von PlpA mit den bindenden Proteinen aus der Familie von bakteriellen Peptid Permeasen zeigte einige Blöcke von Sequenz Ähnlichkeit, die gemeinsame funktionelle Motive in allen Mitgliedern dieser Familie (12B) vorschlägt.
Die meisten Beispiele von Peptid Permeasen weisen eine genetische Struktur auf, die aus fünf Genen besteht, die ein exportiertes Substrat bindendes Protein und zwei integrale Membran Proteine und zwei Membran assoziierte Proteine, die für den Substrat Transport über die cytoplasmatische Membran verantwortlich sind, kodieren (für Übersichtsartikel, siehe Higgins, 1992, Annu. Rev. Cell. Biol. 8:67-113; Tam und Saier, 1993, supra). Die Sequenz Analyse von 630 bp unmittelbar unterhalb und in der Region 3,3 kb unterhalb von plpA zeigte keine kodierenden Sequenzen, die Homologe für diese Transport Elemente sind (Daten nicht gezeigt). Wenn deshalb PlpA mit dem Substrat Transport in Verbindung steht, dann kann dieser durch die Produkte eines anderen Allels stattfinden. Dies ist nicht ohne Beispiel. In Salmonella typhimurium kodieren die hisJ und argT Gene die sehr ähnlichen periplasmatischen Bindungsproteine J und LAO. Beide dieser Proteine liefern ihre Substrate an dieselben Membran assoziierten Bestandteile (Higgins und Ames, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6038-42). Genauso verwenden die periplasmatischen Bindungsproteine LS-BP und LIV-BP von Escherichia coli, die Leucin und verzweigtkettige Aminosäuren transportieren, auch denselben Satz von Membran gebundenen Bestandteilen (Landick und Oxender, 1985, J. Biol. Chem. 260:8257-61).
Wir waren nicht in der Lage, das 5' Ende von plpA zu gewinnen, vielleicht aufgrund der Toxizität des exprimierten Proteins in E. coli. Ähnliche Schwierigkeiten wurden bei der Klonierung der Gene von anderen pneumokokkalen Permeasen, wie amiA und malX angetroffen (Alloing et al., 1989, supra; Martin et al., 1989, Gene 80:227-238). Beruhend auf Sequenz Ähnlichkeit zwischen den abgeleiteten Sequenzen von plpA und amiA wurde das gesamte Gen mit Ausnahme von 51 bp des 5' Endes kloniert.
Membranlokalisierung und posttranslationale kovalente Modifkation von PlpA. Sowohl PlpA als auch AmiA enthalten die LYZCyz (Y = A, S, V, Q, T: Z = G, A: y = S, T, G, A, N, Q, D, F: z = S, A, N, Q, G, W, E) Konsensus Sequenz in dem N-Terminus, was das Signaturmotiv für posttranslationale Lipid Modifikation von Lipoproteinen in Bakterien ist (Gilson et al., 1988, EMBO J. 7:3971-74; Yamaguchi et al., 1988, Cell 53:423-32). In Gram-positiven Organismen dient diese Modifikation dazu, diese Polypeptide in der cytoplasmatischen Membran zu verankern (Gilson et al., 1988, supra). Besondere Beispiele von Permease Substrat Bindungsproteinen, die diese Konsensus Sequenz enthalten, schließen SarA aus Streptococcus gordonii (Jenkinson, 1992, Infect. Immun. 60:1225-8), Spo0KA aus B. subtilis (Perego et al., 1991, Mol. Microbiol. 5:173-185; Rudner et al., 1991, J. Bacteriol. 173:1388-98), TraC und PrgZ aus E. faecalis (Ruhfel et al., 1993, J. Bacteriol. 175:5253-59; Tanimoto et al., 1993, J. Bacteriol. 175:5260-64) und MalX aus S. pneumoniae (Gilson et al., 1988, supra), ein.
Unterstützend für diesen Vorschlag zeigt 13, dass das PlpA-PhoA Protein exportiert wird und primär mit den cytoplasmatischen Membranen assoziiert ist. Kleine Mengen wurden auch in der Zellwand Fraktion und in dem Kultur Überstand nachgewiesen, was vorschlägt, dass einiges des PlpA von der Membran freigesetzt werden kann. Dies wird auch für das Peptid bindende Protein OppA (Spo0KA) aus B. subtilis beobachtet, wo OppA anfänglich mit der Zellwand assoziiert ist, aber steigende Anteile während des Wachstums freigesetzt werden (Perego et al., 1991, supra). So können PlpA und OppA auf der Außenseite der Zelle in einer freisetzbaren Form anwesend sein, wie für andere Lipoproteine in Gram positiven Bakterien vorgeschlagen wurde (Nielsen und Lampen, 1982, J. Bacteriol. 152:315-322). Obwohl nicht ausgeschlossen werden kann, dass die Anwesenheit des Fusionsproteins in diesen Fraktionen nicht die Lage des nativen Moleküls, sondern die Verarbeitung eines Fremd Proteins, wiederspiegelt erscheint dies unwahrscheinlich, weil andere Membran assoziierte PhoA Fusionen fest mit cytoplasmatischen Membranen assoziiert sind.
Schließlich wurde ein [³H] Palmitinsäure markiertes 93 kDa Protein, das dem PlpA-PhoA Fusionsprotein entspricht, aus SPRU98 immunpräzipitiert, das ein plpA-phoA genetisches Konstrukt enthält (13, unten). Im Gegensatz dazu wurde kein ähnlich markiertes Protein in weder der Ausgangskontrolle noch in SPRU100 nachgewiesen, das eine undefinierte PhoA Fusion enthält. Dies zeigt in vivo posttranslationale Lipid Modifikation von PlpA.
Transkriptionelle Analyse von plpA und amiA. Transkripte von 2,2 kb wurden mit Sonden, die spezifisch sind für plpA und amiA in RNA Präparationen aus R6x Zellen nachgewiesen (14). Dies ist gleich in der Größe zu der kodierenden Region für beide Gene. Um die Möglichkeit von Kreuzhybridisierung zwischen den Sonden für plpA und amiA auszuschließen, wurden Waschschritte mit hoher Stringenz nach der Hybridisierung durchgeführt (siehe experimentelle Verfahren). Die Spezifität der Sonden wurde auch gezeigt, wenn RNA, die aus der Mutante SPRU107 hergestellt wurde, die eine Plasmid Insertion in plpA enthält, mit amiA und plpA als Sonde markiert wurde. Das amiA Transkript verblieb bei 2,2 kb, während das plpA Transkript auf 2,6 kb wechselte. In SPRU107 ist plpA bei bp 1474 durch pJDC9 zerstört. Das plpA Transkript wäre 520 bp kleiner als Gesamtlängen Transkript (1,7 kb), mit zusätzlichen 800 bp von pJDC9, was ein Transkript von ungefähr 2,2 kb ergibt, das ähnlich ist zu dem nachgewiesenen 2,6 kb Transkript.
Ein einzelnes Transkript, das in der Größe plpA entspricht, schlägt vor, dass plpA nicht Teil eines Operons ist. Dies wird durch Sequenz Analyse unterhalb von plpA bestätigt, die keine Homologie zu Genen zeigte, die Transport Elemente kodieren, die für gewöhnlich mit Peptid Permeasen assoziiert sind (Daten nicht gezeigt).
Auch ein potenzieller rho unabhängiger Transkriptionsterminator wurde 21 bp unterhalb von dem Translationsstopp Kodon von plpA identifiziert (11).
Mutationen in den PlpA und AmiA Permeasen weisen unterschiedliche Wirkungen in dem Vorgang der Transformation auf. Um die Wirkung von Permeasen während der Kompetenz zu bestimmen, untersuchten wir die Transformationseffizienz von Mutanten mit Defekten in entweder plpA oder ami. In diesem Assay wurden Bakterienstämme mit einem selektierbaren Marker durch einen vollständigen Kompetenz Zyklus transformiert, gefolgt von einem anschließenden Wachsen lassen und anschließenden Ausplattieren für die Selektion der Zellen, welche den Antibiotika Marker aufgenommen hatten. Die Ergebnisse sind somit eine Messung der Gesamtzahl von transformierten Zellen während der Kompetenz. Mutanten, die entweder verkürzte oder PhoA Fusionen von PlpA bildeten, zeigten einen zwei- bis zehnfachen Abfall in der Transformationseffizienz (15). In Mutanten mit einer Zerstörung bei Asp₄₉₂ von PlpA beeinflusste die Anwesenheit (SPRU98) oder Abwesenheit von PhoA (SPRU107) nicht den 90 % Abfall in der Transformationseffizienz. Andererseits zeigte eine Mutante (SPRU122), die ein verkürztes PlpA bei Asp₁₉₂ bildete, einen 90 % Abfall in der Transformationseffizienz, während in SPRU58 die Fusion mit PhoA bei Leu₁₉₇ teilweise den parenteralen Phänotyp wiederherstellte. In diesem Konstrukt ist es möglich, dass PhoA verleiht durch den Beitrag zu der tertiären Struktur der Chimäre Funktionalität, wodurch ihre Fähigkeit, ihr Substrat zu binden, beeinflusst wird.
Im Gegensatz dazu waren Mutanten mit Defekten in ami transformationsprofizient. Mutanten, die AmiA verkürzt an Pro₁₉₁ bildeten, entweder in der Anwesenheit (SPRU121) oder in der Abwesenheit (SPRU114) von PhoA, zeigten einen mäßigen Anstieg in der Transformationseffizienz (15). Darüber hinaus zeigte die Mutante SPRU148 mit einer Zerstörung in AmiC (Ile₁₂₆) einen vierfachen Anstieg in der Transformationseffizienz. In dieser Mutante nehmen wir an, dass AmiA gebildet wird und deshalb in der Lage ist, ihr Substrat zu binden. Deshalb schlägt der beobachtete Anstieg mit der amiC Mutante vor, dass der Substrat Transport über den ami kodierten Transport Komplex die Transformation zusätzlich zu der Sub strat Bindung durch AmiA regulieren kann. Schließlich, obwohl PlpA und AmiA stark verwandte Strukturen (60 % Sequenz Identität) sind, schlagen die gegensätzlichen Wirkungen, die mit plpA und ami Mutationen auf die Transformationseffizenz beobachtet wurden, vor, dass die Substrat Spezifität diese Unterschiede verleiht.
Die Transformation findet während einer einzelnen Kompetenzwelle früh im logarithmischen Wachstum statt (16). Deshalb kann die Regulation dieses Vorgangs entweder durch Modifizieren des Beginns der Kompetenz (ein Wechsel in der Kurve) oder durch Verändern der Expression von Kompetenz induzierten Genen stattfinden, was zu einer Veränderung in der Zahl von erfolgreich transformierten Zellen führt. Um zu bestimmen, ob die Permeasen den Vorgang der Transformation regulieren, haben wir die Kompetenz Profile der Permease Mutanten mit dem Ausgangsstamm verglichen. Diese Analyse misst die Zahl der transformierten Zellen in der Population von Zellen zu verschiedenen Wachstumsstufen während eines Kompetenz Zyklus. 16 zeigt eine einzelne Kompetenzwelle für den Ausgangsstamm (R6x) mit einer maximalen Transformationseffizienz von 0,26 % bei einer OD₆₂₀ von 0,12. Dies entspricht einer Zelldichte von ungefähr 10⁷ cfu/ml. Eine plpA Mutante (SPRU107) durchlief eine ähnliche Transformationswelle mit einer maximalen Transformationseffizienz von nur 0,06 % bei einer höheren Zelldichte. Im Gegensatz dazu durchlief eine amiA Mutante (SPRU114) eine Transformationswelle, die über mehr als die doppelte Zeit mit einer maximalen Transformationseffizienz von 0,75 % bestehen blieb. Der Beginn des Kompetenz Zyklus in SPRU114 fand bei einer früheren Zelldichte, beginnend bei einer OD₆₂₀ von 0,03 statt. Aus diesen Daten schließen wir, dass Mutationen in jeder der Permeasen eine duale Wirkung auf den Vorgang der Transformation aufweisen, die sowohl die Induktion des Kompetenz Zyklus beeinflusst ebenso wie sie die erfolgreiche Zahl von Transformanten moduliert.
Eine Mutation in plpA bewirkt einen Abfall in der Expression eines Kompetenz regulierten Locus. Der rec Locus in Pneumococcus, der für genetische Transformation benötigt wird, enthält zwei Gene, exp10 und recA. Die Ergebnisse einer trans lationalen exp10 – phoA Gen Fusion haben einen 10-fachen Anstieg in der Enzym Aktivität mit der Induktion von Kompetenz gezeigt, was zeigt, dass dies ein Kompetenz regulierter Locus ist. Um zu bestimmen, ob die Peptid Permeasen direkt die Expression dieses Kompetenz induzierten Locus beeinflussen, haben wir eine Mutante (SPRU156) mit einer Null Mutation in plpA und der exp10 – phoA Gen Fusion konstruiert. Durch das Messen der alkalischen Phosphatase Aktivität während des Wachstums haben wir gezeigt, dass im Vergleich zu einem isogenen Stamm (SPRU100) die Mutante, welche die plpA Mutation trägt, einen nahezu zweifachen Abfall in der Expression der exp10 – phoA Fusion (17) zeigte. Deshalb zeigen diese Ergebnisse, dass mindestens plpA die Signal Kaskade direkt beeinflusst, die für die Expression eines Kompetenz regulierten Gens, das für die Transformation benötigt wird, verantwortlich ist.
Diskussion
Das neu identifizierte Export Protein Exp1 wird durch die genetische Determinante, die hier als plpA bezeichnet wird, kodiert. Dieser Locus moduliert, zusammen mit dem ami Locus, den Vorgang der Transformation in S. pneumoniae. Beide Loci kodieren stark ähnliche Peptid bindende Proteine (PlpA, AmiA), die Mitglieder einer wachsenden Familie von bakteriellen Permeasen sind, die für den Transport von kleinen Peptiden verantwortlich sind (12B). Beispiele dieser Peptid bindenden Proteine wurden mit dem Vorgang des genetischen Transfers in verschiedenen Bakterien assoziiert. In B. subtilis bewirkte die Inaktivierung von spo0KA, dem ersten Gen eines Operons mit Bestandteilen, die homolog zu den Peptid Permeasen sind, einen Abfall in der Transformationseffizienz ebenso wie ein Anhalten der Sporulation (Perego et al., 1991, supra; Rudner et al., 1991, supra). Das Substrat für Spo0KA ist nicht bekannt. B. subtilis bildet mindestens einen extrazellulären Differenzierungsfaktor, der für die Sporulation benötigt wird (Grossman und Losick, 1988, supra), und es wurde vorgeschlagen, dass dieses Transport System in die Wahrnehmung dieses extrazellulären Peptid Faktors involviert sein könnte, das für Kompetenz und Sporulation benötigt werden könnte.
Der konjugale Transfer einer Vielzahl von Plasmiden in E. faecalis wird durch kleine extrazelluläre Peptid Pheromone kontrolliert. Kürzliche genetische Analysen haben zwei Plasmid kodierte Gene, prgZ und traC identifiziert, deren abgeleitete Produkte homolog zu den Peptid bindenden Proteinen sind. Experimenteller Beweis schlägt vor, dass diese Proteine die Peptid Pheromone binden können, wodurch das Signal vermittelt wird, das die Konjugation kontrolliert (Ruhfel et al., 1993, supra; Tanimoto et al., 1993, supra). Die Abwesenheit von Membran Transport Elementen ist ein gemeinsames Merkmal zwischen den prgZ, traC und plpA Determinanten, was entweder impliziert, dass der Transport für die Signal Transduktion nicht benötigt wird, oder dass ein anderes Allel für den Transport benötigt wird.
Mutationen in plpA und ami verursachen jeweils einen Abfall oder einen Anstieg in der Transformationseffizienz. Zusätzlich beeinflussen Mutationen in diesen Loci die Induktion des Wachstumsstufen spezifischen Kompetenz Zustands. Im Vergleich zu dem Ausgangsstamm induziert eine Mutation in ami einen früheren Beginn der Kompetenz, während eine Mutation in plpA diese Induktion verzögert. Darüber hinaus hat eine translationale Fusion mit einem Kompetenz regulierten Locus gezeigt, dass eine Mutation in plpA direkt die Expression eines Gens beeinflusst, das für den Vorgang der Transformation benötigt wird. Vorausgesetzt, dass die Induktion der Kompetenz als eine Funktion von Zelldichte stattfindet (Tomasz, 1966, J. Bacteriol. 91:1050-61), ist es vernünftig vorzuschlagen, dass diese Permeasen als regulatorische Elemente dienen, welche die von der Zelldichte abhängige Induktion von Kompetenz durch Vermitteln der Bindung oder des Transports von Signal Molekülen modulieren. Kleine Peptide, welche die vermuteten Substrate für Permeasen in anderen Bakterien sind, oder das extrazelluläre pneumokokkale Aktivator Protein sind wahrscheinliche Kandidaten als Liganden für diese Permeasen. Weil Peptid Permease defekte Mutanten von Salmonella typhimurium und Escherichia coli keine Zellwand Peptide recyceln können, die in das Kulturmedium freigesetzt wurden, wurde vorgeschlagen, dass diese Permeasen an Zellwand Peptide binden und diese transportieren (Godell und Higgins, 1987, J. Bacteriol. 169:3861-65; Park, 1993, J. Bacteriol. 175:7-11). Somit sind Zellwand Peptide wahrscheinliche Kandidaten. Kürzlicher genetischer Beweis schlägt vor, dass der bivalente Kationen (Ni²⁺) Transport ebenfalls an die Peptid Permease Funktion in E. coli (Navarro et al., 1993, Mol. Microbiol. 9:1181-91) gekoppelt ist. Es wurde auch gezeigt, dass extrazelluläres Ca²⁺, das an den intrazellulären Transport gekoppelt ist, die Transformation beeinflussen kann (Trombe, 1993, J. Gen. Microbiol. 139:433-439; Trombe et al., 1992, J. Gen. Microbiol. 138:77-84). Deshalb ist der Peptid Permease vermittelte bivalente Kationen Transport auch ein überlebensfähiges Modell für intrazelluläre Signal Weiterleitung und anschließende Modulation von Transformation.
BEISPIEL 4:
EIN PYRUVAT OXIDASE HOMOLOG REGULIERT ADHÄRENZ
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Isolierung und Sequenz Bestimmung einer Exp Mutante, die ein Pyruvat Oxidase Homolog kodiert. Dieses neue Protein reguliert bakterielle Adhärenz an eukaryonte Zellen.
Bakterielle Adhäsion an epitheliale Zellen des Nasopharynx wird als eine Voraussetzung für Kolonialisierung der Schleimhaut Oberfläche und Infektion erachtet. Die pneumokokkale Zellwand und Proteine der bakteriellen Oberfläche vermitteln die Anheftung an eukaryonte Zellen. Die molekularen Determinanten, die Pneumococcus auf der Oberfläche der eukaryonten Zelle erkennen, sind komplexe Zucker, insbsondere GlcNAcβ1-3Gal oder GalNAcβ1-4Gal Kohlenhydrate Reste.
Mutanten, wie in Beispiel 1 supra beschrieben, wurden hinsichtlich des Verlusts von Bindung an Typ II Lungen Zellen (T2LC), humane endotheliale Zellen (HUVEC) und an GlnNAcβ1-3Gal Zucker Rezeptoren in einem Hämagglutinationsassay gescreent, der die Adhärenz an Zellen im Nasopharynx wiederspiegelt.
Eine von 92 unabhängigen Mutanten, als Pad1 (pneumokokkale Adhärenz 1) bezeichnet, zeigte eine Unfähigkeit, den GlcNAcβ1-3Gal Zucker Rezeptor auf Neuraminidase behandelten Rinder Erythrozyten zu hämagglutinieren, wie beschrie ben wurde (Andersson et al., siehe Beispiel 2). Folglich wurde diese Mutante als PoxB bezeichnet. Die Hämagglutination von Neuraminidase behandelten Rinder Erythrozyten spiegelt die Adhärenz an Zellen im Nasopharynx wieder. Die direkte Mutagenese des Ausgangsstamms, bei der padI inaktiviert wurde, bestätigte, dass der Verlust an Hämagglutination mit dem Locus verbunden war.
Diese Mutante zeigte auch einen größer als 70 % Abfall in der Adhäsion an T2LCs und HUVECs, wie in 19 gezeigt ist.
Die Gewinnung und Rekonstitution des mutierten Locus padI zeigte einen offenen Leserahmen von 1,8 kb mit Sequenz Ähnlichkeit zu Enzymen in der Acetohydroxysäure Synthase Pyruvatoxidase Familie. Insbesondere teilt padI 51 % Sequenz Ähnlichkeit mit rekombinantem pox und 32 % Ähnlichkeit mit poxB. Gezielte genetische Zerstörung des Locus in dem Ausgangsstamm zeigte, dass eine Mutation an diesem Locus für den Verlust von Adhärenz in allen drei Assays verantwortlich war.
Die subzelluläre Fraktionierung einer Mutante, die eine Pad1-PhoA Fusion exprimierte, zeigte, dass das Protein an der Membran und dem Cytoplasma (20A) angeordnet war. Der Vergleich von antigenen Oberflächen Bestandteilen in dem Ausgangs- und dem Mutantenstamm zeigte, dass der Verlust eines 17 kDa Polypeptids nicht Pad1 entsprach (20B).
Diese Ergebnisse zeigen, dass Pad1 die pneumokokkale Adhärenz an multiple Zelltypen beeinflusst, möglicherweise durch Regulieren der Expression von bakteriellen Adhäsinen.
Die Pad1 Mutante benötigte Acetat für das Wachstum in einem chemisch definierten Medium (21 und 22). Wachstum in Acetat stellt die Adhäsionseigenschaften der Bakterien in sowohl Lungen als auch endothelialen Zellen wieder her.
Die Nukleotidsequenz Information für die padI Promotor Region zeigt eine putative -35 Stelle, eine -10 taatat Sequenz, eine Ribosomen Bindestelle und eine Translationsstart Stelle (23) (SEQ ID NR: 55). Die abgeleitete Protein Translation dieser Region wird ebenfalls bereitgestellt (23) (SEQ ID NR: 56).
Diese Erfindung kann in anderen Formen ausgeführt oder in anderen Weisen durchgeführt werden, ohne die wesentlichen Eigenschaften davon zu verlassen. Die vorliegende Offenbarung wird deshalb als in allen Aspekten darstellend und nicht beschränkend erachtet, wobei der Schutzumfang der Erfindung durch die angehängten Patentansprüche definiert wird, und alle Veränderungen, die innerhalb die Bedeutung und den Äquivalenz Bereich fallen, werden als davon umfasst erachtet.
Es wird auch verstanden, dass alle Basenpaar Größen, die für Nukleotide angegeben sind, und alle Molekulargewichtsinformation für Proteine ungefähre Werte darstellen, und sie werden für den Zweck der Beschreibung verwendet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine Nukleinsäure, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 kodiert.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 umfaßt.
Isoliertes Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder ein antigenes Fragment dieses Polypeptids, wobei das antigene Fragment befähigt ist, spezifisch mit einem Antigen-Erkennungsmolekül des Immunsystems, wie ein Immunoglobulin oder ein T-Zell-Antigenrezeptor, zu interagieren und mindestens 5 Aminosäuren enthält.
Antikörper oder ein Fragment davon, das ein spezifisches Epitop eines Proteins mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 bindet.
Impfstoff zum Schutz eines tierischen Patienten vor einer Infektion mit einem Gram-positiven Bakterium, umfassend (entweder): a) einen Vektor, der ein Gen enthält, welches ein freigesetztes bzw. exportiertes Protein eines Gram-positiven Bakteriums kodiert, das funktionell mit einem Promotor, der befähigt ist, die Expression des Gens in dem Patienten zu steuern, assoziiert ist, wobei das freigesetzte Protein eine Permease ist, und/oder b) eine immunogene Menge eines freigesetzten Proteins eines Grampositiven Bakteriums, und einen Hilfsstoff, wobei das freigesetzte Pro tein eine Permease ist, wobei das Gen eine Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 enthält, und/oder das freigesetzte Protein eine Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 enthält.
Impfstoff nach Anspruch 5, wobei der tierische Patient ein Mensch ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 5 bis 6, wobei das Gram-positive Bakterium ein S. pneumoniae ist.
Verfahren zum Diagnostizieren einer Infektion mit einem Gram-positiven Bakterium, umfassend das Nachweisen der Anwesenheit eines Grampositiven Bakteriums: a) mit einem Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 4; b) in einer Probe von einem Patienten mit einer Nukleinsäuresonde; oder c) durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines Primers; wobei die Nukleinsäure-Sonde oder der Primer das DNA-Molekül nach Anspruch 1 ist.