DD294969A5

DD294969A5 - Thermisch stabile cytosin-deaminase

Info

Publication number: DD294969A5
Application number: DD90341470A
Authority: DD
Inventors: Peter D Senter; Peter Ch-D Su; Hans Marquardt; Martha S Hayden; Peter Linsley
Original assignee: Oncogen Limited Partnership,Us
Priority date: 1989-06-09
Filing date: 1990-06-08
Publication date: 1991-10-17
Also published as: ZA904404B; AU5991290A; HU903773D0; KR910001064A; HU210959B; US5338678A; AU642656B2

Abstract

Die Erfindung betrifft thermisch stabile Cytosin-deaminase (CDase), und das sie codierende Gen sowie Methoden zur Isolierung, Reinigung und rekombinanten Produktion derselben werden offenbart. Thermisch stabile CDase kann aus Saccharomyces cerevisiae isoliert werden. Das aus Hefe isolierte Enzym hat eine durch Gelchromatographie bestimmte relative Molekuelmasse von etwa 32 kDa und besteht aus zwei Untereinheiten, von denen jede eine relative Molekuelmasse von etwa 17 kDa aufweist. Auf diese Weise gereinigte thermisch stabile Hefe-CDase zeigt keine signifikante Sequenzhomologie mit anderen bekannten sequenzierten Proteinen.{thermisch stabile Cytosin-deaminase; Hefe; Enzym; Saccharomyces cerevisiae; Isolierung; Reinigung; rekombinante Produktion; Proteine}

Description

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung basiert auf der unerwarteten Entdeckung einer aus Bäckerhefe gewonnenen thermisch stabilen CDase. Die Analyse der Aminosäuresequenz dieses Enzyms ergibt keine signifikante Homologie mit bekannten Sequenzen anderer Proteine.

Die Entdeckung betrifft eine isolierte, ,Nucleotidsequenz, die eine thermisch stabile CDase oder ein derselben funktionell gleichwertiges Protein codiert, sowie rekombinante Expressionsvektoren, die die Expression dieser Sequenz umfassen und daran mitwirken, auf diese Weise transformierte Wirtszellen und Methoden zur rekombinanten Produktion thermisch stabiler CDase oder ihres funktioneilen Äquivalents.

Die Erfindung betrifft ferner isolierte, thermisch stabile CDase oder ein derselben funktionell gleichwertiges Protein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die CDase aus Saccharomyces eerevisiae isoliert.

Aufgrund der vorliegenden Offenbarung werden Personen, die über normale Fachkenntnisse verfügen, weitere Aspekte, Vorteile und Anwendungsgebiete der Erfindung ohne weiteres erkennen.

In den Zeichnungen, die Bestandteil dieser Offenbarung sind, zeigt Figur 1 die SPS-PAGE-Analyse der CDase (14% Polyacrylamid unter nichtreduzierenden Bedingungen). Folgende Substanzen sind in den einzelnenen Spuren dargestellt:

Spuren 1 und 9: Marker-Proteine; Spur 2: Autolyseüberstand aus Schritt 1 in Beispiel 1; Spur 3: Produkt nach (NH₄J₂SO₄-Ausfällung (70%) aus Schritt 2 in Beispiel 1; Spur 4: Produkt nach (NH₄)₂SO₄-Auefällung (50-73%) aus Schritt 2 in Beispiel 1; Spur 5: Produkt nach der Q-Sepharose-Chromatographie aus Schritt 3 in Beispiel 1; Spur 6: Produkt nach der G-75-Säulenchromatographie aus Schritt 4 in Beispiel 1; Spur 7: Produkt nach der Octyl-Sepharose-Reinigung von Schritt 5 in Beispiel 1; Spur 8: Endprodukt, das nach einer zweiten G-75-Säulenchromatographie von Schritt 6in Beispiel 1 gewonnen wurde.

Figur 2 stellt das Elutionsprofil der CDase von einer G-50-Sephadexsäule (1,5 x 100 cm) dar. (A) 27 Einheiten gereinigte CDase wurden mit Ribonuclease A (2mg), Ovalbumin (2 mg) und Chymotrypsinogen (1 mg) gemischt und mit PBS eluiert. Zur Bestimmung des Gesamtproteingehalts wurden die Fraktionen bei 280 nm sowie zur Bestimmung der CDase-Aktivität bei 290 nm mittels 5-FC als Substrat kontrolliert. (B) Die Elution der CDase aus der vorstehend genannten G-50-Sephadexsäule erfolgte ohne Eichstandards.

Figur 3 veranschaulicht die Stabilität der CDase bei 37°C. CDase (72 Einheiten/mg) in PBS, die proteasefreie BSA (1 mg/ml) enthielt, wurde in einem Polypropylenreagenzglas bei 37⁰C inkubiert. Die CDase-Aktivität wurde in verschiedenen Abständen unter Verwendung von 10Ί der Enzymlösung bestimmt.

Figur 4 zeigt das Profil der mit schneller Flüssigchromatographie (HPLC) gereinigten CDase. Die horizontalen Striche stellen die Fraktionen dar, die zur Analyse der Aminosäuresequenz gepoolt wurden.

Figur 5 veranschaulicht die SDS-PAGE-Analyse der CDase nach der HPLC-Reinigung (15% Polyacrylamid unter reduzierenden Bedingungen). Spur 1, Pool A; Spur 2: Pool B.

Figur 6 stellt die partielle Aminosäuresequenz der CDase dar. Aus dem Schnitt mit Bromcyanid (CNBr) (M-Serie), gewonnene Peptide Endoproteinase GIu-C(Ε-Serie), Endoproteinase Lys-C (K-Serie) und Endoproteinase Asp-N (D-Serie) sind ausgewiesen.

Figur 7 zeigt die Nucleotidsequenzen der Starter CDA4R1 und CDA5AS, die entsprechenden Aminosäuresequenzen und die jeweiligen Positionen dieser Starter in der Aminosäuresequenz der CDase. CDA4R1 ist auf die Position 5' bis 3' auf dem Strang orientiert, während CDA5AS auf 5' bis 3' auf dem Anti-Sense-Strang orientiert ist.

Figur 8 stellt die Nucleotidsequenz der DNA dar, die von den CDase codierenden genomischen Klonen deriviert wurde.

Figur 9 stellt die in der genomischen Sequenz der CDase gefundenen offenen Leseraster (ORF) dar.

Figur 10 zeigt die Nucleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz des ORF 2. Weitere Aminosäuren, die anhand der Nucleotidsequenz vorhergesagt wurden, jedoch mittels Peptidsequenzierung nicht nachgewiesen werden konnten, sind fett gedruckt und die START- und STOP-Codons durch Kästchen gekennzeichnet.

Figur 11 veranschaulicht den das CDase-Gen enthaltenen Plasmid-Expressionsvektor „Fusionator".

Figur 12 zeigt die Karte des ргіЗМ-Vektors.

Detaillierte Beschreibung

Wenn nicht anders angegeben, werden bei der praktischen Umsetzung der Erfindung herkömmliche Methoden der Proteinchemie, Molekularbiologie, Mikrobiologie und DNA-Rekombinationstechnik, die allen im Fach Tätigen bekannt sind, genutzt. Diese Methoden werden in der Fachliteratur ausführlich erläutert, vergl. z. B. R. K. Scopes, Protein Purification Principles and Practice, 2. Aufig. (Springer Verlag 1987); Methods in Enzymology (Herausgeg. von S. Colo wick und N. Kaplan, Academic Press, Inc.); Maniatis, Fritsch und Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. AufIg. (1989); Oligonucleotide Sequence (herausgeg. von M. J. Gait, 1984).

A. Definitionen Bei der Beschreibung der Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet, die die aus den nachstehenden Definitionen

hervorgehende Bedeutung haben.

.Thermisch stabile Cytosin-deaminase" betrifft eine CDase, deren Aktivität in freiem, nicht immobilisiertem Zustand 12 Stundenbei 37°C, vorzugsweise länger als 1 Tag bei 37*C und am besten länger als 3 Tage bei 37⁰C mindestens 50% beträgt, was durchdie Kontrolle der Umwandlung von 5-FC zu 5-FU in Gegenwart des isolierten Enzyms durch die nachstehend ausführlichbeschriebene Untersuchung bestimmt wird.

Eine Aminosäuresequenz oder ein Protein ist einer anderen Aminosäuresequenz oder einem Protein „im wesentlichen

homolog", wenn in einem definierten Molekülabschnitt mindestens etwa 50%, vorzugsweise mindestens etwa 85%, am bestenmindestens 90-85% der Aminosäuren übereinstimmen. Die Aminosäurevariationen können ferner Substitutionen, Deletionenoder Additionen einschließen.

Der Ausdruck „funktionell gleichwertig" bedeutet, daß die Aminosäuresequenz oder das Protein eine Kette definiert, die ein

vorstehend beschriebenes thermisch stabiles Enzym produziert, das in der Lage ist, 5-FC zu 5-FU umzuwandeln, wie in den

Beispielen beschrieben wird. Ein Protein, das einer thermisch stabilen CDase funktionell gleichwertig ist, braucht nicht die

gleiche oder die gesamte in den Figuren dargestellte Aminosäuresequenz aufzuweisen. Vielmehr kann das Protein aus einembiologisch aktiven Fragment desselben bestehen, wobei die Aktivität wie vorstehend definiert ist. Solange die biologische

Aktivität des Proteins gesichert ist, kann das Protein ferner Additionen, Deletionen oder Substitutionen zu den dargestellten Sequenzen einschließen. Ein „gereinigtes Protein" ist ein Protein, das im wesentlichen frei von anderen Materialien ist. So ist z. B. Protein A im

wesentlichen frei von B, wenn B ein Gemisch anderer zellulärer Bestandteile und Proteine ist und wenn mindestens etwa 50%,vorzugsweise mindestens 75% und am besten 90-95% oder sogar 99% in Masseanteilen des gesamten A + B A sind.

„Gereinigt" bezieht sich jedoch nicht auf die Methode, mit deren Hilfe das Protein gewonnen wird. So kann ein gereinigtes

Protein durch Rekombinationstechnik oder Synthese gewonnen oder direkt aus einem Organismus isoliert werden, in dem das Protein in der Natur vorkommt. Die Begriffe „Polypeptid" und „Protein" werden in ihrem umfassendsten Sinne genutzt, d. h., sie bezeichnen jedes Polymer der Aminosäuren (Dipeptid oder größer), das durch Peptidbrücken verknüpft ist Sie schließen die Begriffe Oligopeptide, Proteinfragmente, Analoga, Muteine, Fusionsproteine u. ä. ein. Die Begriffe schließen native und rekombinante Proteine ein.

„Rekombinante" Proteine oder Polypeptide beziehen sich auf Proteine, die von einer rekombinanten Nucleotidsequenzexprimiert werden, d. h. die von Zellen produziert werden, die durch ein exogenes, das gewünschte Polypeptid codierende

DNA-Konstrukt transformiert wurden. Der hierin zur Kennzeichnung der die CDase codierenden Nucleotidsequenz genutzte Begriff „rekombinant" beschreibt Nucleinsäure genomischen, cDNA, halbsynthetischen oder synthetischen Ursprungs, bei der es sich aufgrund ihres Ursprungs

oder der Manipulation entweder um eine in der Natur nicht vorkommende Nucleotidsequenz oder um eine Nucleotidsequenzhandelt, die mit anderen Nucleinsäuren als in der Natur verknüpft ist.

Ein „Replikon" ist jedes genetische Element (z. B. Ptasmid, Chromosom, Virus), das sich innerhalb einer Zelle als eigenständige Polynucleotidreplikationseinheit verhält, d. h. das eigenständig zur Replikation fähig ist. Ein „Vektor" ist ein Replikon, dem ein anderes Polynucleotidsegment angeheftet wird, um die Replikation und/oder Expression

des angehefteten Segments zu bewirken. Ein „Expressionsvektor" bezieht sich auf einen Vektor, der zur eigenständigen

Replikation oder Integration fähig ist und der Kontrollsequenzen enthält, die die Transkription und Translation der gewünschten Nucleotidsequenz in einer geeigneten Wirtszelle lenken. Eine „codierende Sequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, die in ein Polypeptid transkribiert und/oder translation wird. Eine „Promotersequenz" ist eine DNA-regelnde Region, die in der Lage ist, RNA-Polymerase zu binden und die Transkription

einer stromabwärts (d. h. in der З'-Richtung) befindlichen codierenden Sequenz zu initiieren.

Eine codierende Sequenz ist „unter Kontrolle" der Promotersequenz in einer Zelle, wenn die Transkription der codierenden Sequenz sich aus der Bindung der RNA-Polymerase an die Promotersequenz ergibt; die Translation der resultierenden mRNA

ergibt dann das Polypeptid, das innerhalb der codierenden Sequenz codiert ist„Operabel gebunden" bezieht sich auf eine Anlagerung, in der die Bestandteile so konfiguriert sind, daß sie ihre normale

Funktion ausüben können. Folglich sind Kontrollsequenzen, die an eine codierende Sequenz operabel gebunden sind, in der Lage, die Expression der codierenden Sequenz zu bewirken.

„Kontrollsequenzen" betreffen Sequenzen, die die Transkription und/oder Translation der codierenden Sequenz(en) steuern;sie können Promotersequenzen, transkriptorische Initiierungs- und Terminationssequenzen einschließen, sind jedoch nicht aufdiese beschränkt. Ferner betreffen „Kontrollsequenzen" Sequenzen, die das Processing des innerhalb der codierenden Sequenzcodierten Polypeptids steuern; diese können Sequenzen, die die Sekretion, Proteasespaltung und Glykosylierung des

Polypeptids steuern, einschließen, sind jedoch nicht auf sie beschränkt. Eine „Signalsequenz" kann vor der codierten Sequenz aufgenommen werden. Diese Sequenz codiert ein in N-terminaler Stellung zum Polypeptid befindliches Signalpeptid, das der Wirtszelle die Information vermittelt, das Polypeptid art die Zelloberfläche zu lenken oder das Polypeptid in die Medien zu sekretieren. Dieses Signalpeptid wird von der Wirtszelle

abgespalten, bevor das Peptid die Zelle verläßt. Signalsequenzen findet man im Zusammenhang mit einer Vielzahl nativer

Proteine in Prokaryoten und Eukaryoten. So wird z.B. der Alpha-Faktor, ein natives Hefeprotein, von der Hefe sekretiert, und

seine Signalsequenz kann an heterologe Proteine, die in die Medien sekretiert werden sollen, angeheftet werden (vgl.

US-PS 4 546082). Ferner wurde festgestellt, daß der Alpha-Faktor und seine Analoga heterologe Proteine aus einer Vielzahl von Hefen, z. B. Saccharomyceten und Kluyveromyceten, sekretieren (vgl. EPO-Publikat. 0301669, veröffentlicht am 1. Februar 1989). „Transformation" ist die Insertion eines exogenen Polynucleotide in eine Wirtszelle. Das exogene Polynucleotid kann entweder als Plasmid beibehalten oder als Alternative in das Genom des Wirts integriert werden.

„Rekombinante Wirtszellen", „WirtszeHen", ,Zellen" und andere derartige Mikroorganismen bezeichnende Begriffe sind untereinander austauschbar und beziehen sich auf Zellen, die als Rezipienten rekombinanter Vektoren oder anderer übertragener ON A verwendet werden können oder verwendet worden sind und schließen die Nachkommen der ursprünglichen transferierten Zelle ein. Es versteht sich, daß die Nachkommen einer einzigen Elternzelle hinsichtlich des genomischen oder vollständigen DNA-Komplements mit dem ursprünglicher Eltern aufgrund zufälliger oder beabsichtigter Mutation nicht unbedingt völlig identisch zu sein brauchen. Folglich bezeichnen die Begriffe Nachkommen der Elternzelle, die der Elternzelle hinreichend ähnlich sind, so daß sie durch die jeweilige Eigenschaft gekennzeichnet werden können, z. B. die Substitution eines nativen, ein essentielles Enzym codierenden Gens mit einem geklonten Gen; das mit einem ein gewünschtes Genprodukt codierenden Strukturgen verknüpft ist.

Eine .therapeutisch wirksame Menge" CDase ist eine Menge, die, wenn sie mit einem Substrat, auf dem die CDase wirkt, verabreicht wird, ausreicht, um das Substrat in eine aktive cytotoxische Agens umzuwandeln, die ihrerseits das Wachstum von Tumorzellen hemmt.

B. Allgemeine Methoden

Die Erfindung betrifft eine aus Hefe isolierte, thermische Stabilität aufweisende CDase. Diese CDase besitzt Eigenschaften, die sie von CDase-Enzymen unterscheiden, die in der Vergangenheit aus Hefe isoliert wurden. Die relative Molekülmasse der neu isolierten Hefe-CDase beträgt etwa 32kDa, wie mittels Gelchromatographie festgestellt wurde. SDS-PAGE zeigt eine Hauptbande bei 17 kDa, was darauf hindeutet, daß die vorliegende CDase aus einem Dimeren besteht wobei jede Untereinheit eine relative Molekülmasse von etwa 17 kDa aufweist. Obwohl nachgewiesen wurde, daß in der Vergangenheit isolierte Hefe-CDase-Enzyme bei 37 ⁰C außerordentlich thermisch labil waren, ist ferner das erfindungsgemäße gereinigte Enzym bei dieserTemperatur stabil. Darüber hinaus zeigt die Aminosäuresequenz dieser neuen CDase keine signifikante Sequenzhomologie mit anderen bekannten sequenzierten Proteinen. Die Klonierung und Expression des diese einzigartige CDase codierenden Gens ergibt eine codierende Sequenz mit einer Länge von etwa 474 Basenpaaren, die ein Protein von 158 Aminosäuren mit einer vorhergesagten relativen Molekülmasse von etwa 17 506 Dahon spezifiziert. Thermisch stabile CDase kann aus Hefen einschließlich der Vertreter der Askosporen bildenden Hefen, Basidiosporen bildenden Hefen und der unvollständigen Hefen isoliert werden, vorzugsweise wird CDase aus Angehörigen der Familie Saccharomycetoidae isoliert, wobei Saccharomyces sp. bevorzugt und Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) besonders bevorzugt werden. Es wurde festgestellt, daß Fleishmanns Preßhefe eine ausgezeichnete Quelle thermisch stabiler CDase ist, die problemlos in Bäckereien und Lebensmittelgeschäften beschafft werden kann. Die gegenwärtig genutzte Methode der CDase-Reinigung unterscheidet sich von Methoden, über die bereits berichtet wurde (vgl. z.B. Katsuragi u.a., 1987; Katsuragi u.a., 1986; Ipata u.a., 1978; Ipata u.a., 1971) sowie von der von Katsuragi 1988 entwickelten Methode. Insbesondere umfaßt das Verfahren verschiedene Reinigungsschritte, einschließlich einer zusätzlichen Reinigung mittels Gelpermeationssäule zwischen den Schritten der Anionenaustausch-und der hydrophoben Chromatographie (nachstehend beschrieben), sowie verschiedenen Bedingungen für die Reinigung, einschließlich unterschiedlicher Puffer, pH-Werte und Pufferbestandteile, wie z.B. EDTA und DTT. Darüber hinaus ergaben die in der Vergangenheit eingesetzten Methoden kein thermisch stabiles Enzym.

Der erste Schritt in der Reinigung thermisch stabiler CDase aus Hefe umfaßt die Auflösung der Hefezellen zu einem CDase enthaltenden Autolysat. Die Autolyse kann mit jeder im Fach bekannten Methode bewirkt werden. So können Hefezellen z. B. nach der Methode von Kunit (1947) mitToluen plasmolysiert werden. Besonders nützlich ist es, ein organisches Lösungsmittel wie z. B. Ethylacetat auf die Hefe einwirken zu lassen und danach einen Puffer zuzügeben, um die Lösung bei etwa pH 7 zu halten. Geeignete Puffer schließen Kaliumphosphatpuffer, Phosphat-gepufferte Saline,Tris-Puffer sowie verschiedene andere im Fachgebiet gut bekannte Puffer ein. Der Puffer enthält vorzugsweise Ammoniumsulfat in Konzentrationen von 1 bis 25%, vorzugsweise 15%, sowie EDTA aus Dhhiothreitol (DTT) zur Stabilisierung der CDase. Als Alternative können EDTA und DTT aus diesem und nachfolgend genannten Puffern weggelassen werden. Wenn EDTA verwendet wird, bewegt sich seine Konzentration zwischen 0,1 mM und 1OmM, wobei 5mM bevorzugt wird, während DTT in Konzentrationen zwischen 0,01 und 1OmM, vorzugsweise 0,1 mM verwendet werden kann. Dieses Gemisch wird mehrere Tage lang gerührt, und der pH-Wert wird bei etwa 7 gehalten. Zelltrümmer können durch Zentrifugation entfernt werden. Nach der Autolyse wird das Gesamtprotein mittels Ammoniumsulfat aus dem Autolysat ausgefällt. Ammoniumsulfat wird in Konzentrationen zugesetzt, die ausreichen, um ein höheres CDase-Protein-Verhältnis zu erzielen. So kann z.B. Ammoniumsulfat zuerst zugegeben werden, um eine Sättigung zwischen 60 und 80%, vorzugsweise von 70% zu erreichen. EDTA ist in einer Konzentration zwischen 1 und 3g/l, vorzugsweise 1,5-2g/t, Bestandteil des Reaktionsgemisches. Man läßt die Reaktion mehrere Stunden lang stattfinden, und der Niederschlag wird nach dem Zentrifugieren gesammelt. Der Rückstand wird in einem geeigneten Puffer, z.B. PBS, bei etwa pH 7,0 gelöst, wobei der Puffer vorzugsweise EDTA und DTT-wie vorstehend beschrieben-enthält, und die Lösung wird mit dem gleichen Puffer dialysiert. Das Dialysat kann ein zweites Mal mit Ammoniumsulfat behandelt werden, um eine Konzentration von etwa 50% zu erzielen, wobei EDTA wie vorstehend beschrieben anwesend ist. Der Niederschlag wird erneut durch Zentrifugieren gesammelt-und Ammoniumsulfat wird bis zu einer Sättigung von etwa 73% zu dem Überstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und in einem geeigneten Puffer mit einem pH von etwa 6,5 bis 8,5, vorzugsweise Tris-Puffer mit pH 8,0, der DTT in der genannten Konzentration enthält, gelöst. Der zur ursprünglichen Konzentration gelöste Niederschlag wird dann mit diesem Puffer mehrere Stunden lang dialysiert. CDase auf dem Dialysat kann durch Anionenaustausch-Chromatographie mittels quervernetzter Agarose- oder Cellulose-Füllkörper weiter gereinigt werden. Besonders geeignet sind Anionenaustausch^, wie z.b. Q-Sepharose und DEAE-Sepharose, die von der Firma Pharmacia erhältlich sind. Geeigneten Gleichgewichtspuffer schließen beispielsweise Tris- oder Phosphatpuffer ein, wobei die Elution im linearen Gradienten erfolgt Besonders geeignet sind 2OmM Tris-Puffer, der 0,1 mM DTT bei pH 8,0 enthält, wobei dieser Puffer einen linearen Gradienten von 0 bis 0,3m KCI aufweist

Nach der Anionenaustausch-Chromatographie werden die Fraktionen mit CDase-Aktivität, die wie nachstehend beschrieben

bestimmt wird, gepoott und durch Ultrafiltration konzentriert, wobei beispielsweise ein Filter verwendet wird, das Teilchen mit einer relativen Molekülmasse von etwa 30000 Dalton (Da) oder weniger zurückhält.

In einem nächsten Schritt wird die COase enthaltende Lösung durch eine Gelpermeationssäule geleitet. Besonders nützlich sind vernetzte Dextran-, Agarose- oder Dextran/Bisacrylamidgele, wobei Sephadex G-75, G-100 oder Sephacryl S-300 der Vorzug gegeben wird. Als Elutionsmittel kann jeder im Fachgebiet bekannte herkömmliche Puffer bei etwa pH 7 verwendet werden, wobei PBS, die wie vorstehend beschrieben DTT enthält, bevorzugt wird. Die CDase-Aktivität enthaltenden Fraktionen werden gepoolt und mit einem Puffer, z. B. Kaliumphosphat, dialysiert Der Puffer enthält vorzugsweise etwa 1 bis 2 M Ammoniumsulfat, und EDTA und DTT, wie vorstehend in bezug auf den Autolysatpuffer beschrieben wurde. Falls gewünscht, kann eine zweite Gelpermeationssäule genutzt werden, und die aktiven Fraktionen können durch Ultrafiltration mittels eines Riters, der Teilchen mit einer relativen Molekülmasse von beispielsweise 5000 Dalton ausschließt, konzentriert werden. Als nächstes kann das CDase enthaltende Material in eine die Substanzen aufgrund der Hydrophobizität trennende Säule gegeben und eluiert werden, wobei man z. B. einen Umkehrgradienten von Ammoniumsulfat in Kaliumphosphatpuffer nutzt. Die Fraktionen mit CDase-Aktivität werden kombiniert und durch Ultrafiltration konzentriert, wobei ein Filter verwendet wird, das Teilchen mit einer relativen Molekülmasse von 5000 Da zurückhält. Das Konzentrat kann in gefrostetem Zustand zur weiteren Verwendung aufbewahrt werden. Wenn eine zweite Behandlung in einer Gelpermeationssäule nicht erfolgt und/oder wenn die spezifische Aktivität der CDase gering ist, kann eine weitere Behandlu ng in der Gelpermeationssäule wie vorstehend beschrieben erfolgen. Die so gereinigte CDase ist thermisch stabil und kann deswegen eingefrostet oder in freier Form lyophilisiert gelagert werden.

Die Aktivität der CDase kann während der Reinigung mit verschiedenen, Fachleuten bekannten Methoden kontrolliert werden. So kann z.B. durch einen unmittelbaren spektrophotometrischen Test die Umwandlung von Cytosin in Uracil oder Derivate desselben in Gegenwart von CDase anhand der Extinktion bei 286nm nach der Umwandlung kontrolliert werden (siehe z.B. Ipata und Cercignani, 1978). Als Alternative kann die Aktivität durch die Kontrolle der Umwandlung von 5-FC zu 5-FU spektrophotometrisch - wie von Nishiyama u.a. 1985 beschrieben - kontrolliert werden. Diese Methode wird hierin zu Vergleichszwecken aufgenommen.

Auf diese Weise gereinigte thermisch stabile CDase wurde wie in dem experimentellen Abschnitt beschrieben sequenziert, und die partielle Aminosäuresequenz ist in Figur 6 dargestellt. Die Sequenz zeigt keine wesentliche Homologie mit anderen bekannten sequenzierten Proteinen. Auf dieser Information basierend kann thermisch stabile CDase rekombinant produziert werden. Beispielsweise können auf der Basis der gewonnenen Aminosäuresequenz CDase codierende DNA-Sequenzen unter Verwendung entsprechender Codons synthetisch präpariert werden. Im allgemeinen wird man für den zur Expression der CDase in Aussicht genommenen Wirt bevorzugte Codons auswählen. Die vollständige Sequenz wird aus überlappenden Oligonucteotiden zusammengesetzt, die nach Standardmethoden präpariert werden. Vergl. z. B. Edge, Nature, 292 (1981), S. 756; Nambair u.a., Science, 223 (1984), S. 1229; Nay u.a., J. Biol. ehem., 259 (1984), S.6311.

Als Alternative kann rekombinante, thermisch stabile CDase auf folgendem Wege hergestellt werden. Oligonucleotidsonden, die Codons für einen Teil der bestimmten Aminosäuresequenz enthalten, können präpariert und zum Screenen der genomischen oder cDNA-Banken auf das die CDase codierende Gen verwendet werden. Die grundlegenden Verfahren zur Präparation von Oligonucleotidsonden und DNA-Banken sowie das Screenen mittels Nucleinsäurehybridisierung sind Personen, die über die üblichen Fachkenntnisse verfugen, gut bekannt, siehe z.B. Oligonucleotide Synthesis, a,o.a. 0.; Maniatis u. а., а. о. а.О. Nachdem ein Klon mittels positiver Hybridisierung in der gescreenten Bank identifiziert wurde, können Restriktionsenzymanalyse und DNA-Sequenzierung vorgenommen werden, um zu bestätigen, daß das bestimmte Bank-Insert das die CDase codierende Gen enthält. Ferner kann die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifizierung und zum nachfolgenden Nachweis der die CDase codierenden Nucleotidsequenz genutzt werden. Diese Methode wird in Saiki u. a. (1936) und in den US-PS 4683195 und 4683202 beschrieben, deren Offenbarungen zu Vergleichszwecken hierin eingeschlossen sind. Die Analyse der Nucleotidsequenz der PCR-amplifizierten Produkte kann durch indirekte Sequenzanalyse, wie von Saiki u. a. beschrieben (1988), vorgenommen werden. Als Alternative kann (können) die amplifizierte(n) Zielsequenz(en) vor der Sequenzanalyse geklont werden. Eine Methode zur direkten Klonierung und Sequenzanalyse enzymatisch amplifizierter genomischer Segmente wurde von Scharf u.a. (1986) beschrieben. Bei dieser Methode werden die in der PCR-Technik verwendeten Starter in der Nähe ihrer 5'-Enden so modifiziert, daß sie bequeme Restriktionsorte für die direkte Klonierung z. B. in einen M13-Sequenzierungsvektor ausbilden. Nach der Amplifizierung werden die PCR-Produkte mit den entsprechenden Restriktionsenzymen geschnitten. Die Restriktionsfragmente werden in den M13-Vektor ligiert und z. B. in einen JM 103 Wirt transformiert, plattiert, und die resultierenden Plaques werden durch Hybridisierung mit einer markierten Oligonucleotidsonde gescreent. Weitere Klonierungs- und Sequenzanalysemethoden sind im Fach bekannt.

Bei einem besonders bevorzugten Anwendungsverfahren der Erfindung wurden zwei Oligonucleotidstarter synthetisiert, wobei die partielle Aminosäuresequenz und die Codonverwendungsmuster aus S. cerevisiae (Guthrie und Abelson, 1982) als Richtlinie („Guide") für die Entwicklung von „Guessmer "-Sequenzen der DNA-Sequenz genutzt wurden. Diese Starter wurden für PCR verwendet, in denen Monierte DNA aus der genomischen Hefebank als Matrize verwendet wurde. Die Oligonucleotide wurden aus Regionen der CDase synthetisiert, in denen die Aminosäuren eine ausgeprägte Bevorzugung der Codonnutzung und/oder wenige Entartungen aufweisen. Der erste Starter, CDA4R1, war ein 33 Nucleotide enthaltendes 42-mer, das einer Aminosäuresequenz mit Aminoende entsprach, während der zweite, CDA5AS, Nucleotide enthielt, die die Sequenz ergänzten, die in der Nähe des Carboxyendes des Proteins angeordnet sind. Die Sequenz dieser Oligonucleotide ist in Figur 7 dargestellt. Zwei genomische Banken wurden bei PCR-Reaktionen als Matrizen-DNA verwendet, und es wurde festgestellt, daß beide ein einziges spezifisches Fragment mit einer Länge von etwa 350 Basenpaaren ergaben, wobei die Größe anhand der verfügbaren Aminosäuresequenz vorhergesagt wurde. Die PCR-Starter wurden zur Erleichterung der Klonierung der durch PCR gescreenten Fragmente an ihren 5'-Enden manipulativ mit EcoRI-Restriktionsorten versehen. Das 350 Basenpaare umfassende PCR-derivierte Fragmente wurde mittels Gelelektrophorese gereinigt und zur DNA-Sequenzbestimmung in einen geeigneten Vektor subkloniert.

Das PCR-derivierte Fragment wurde ebenfalls als eine spezifische CDase-Sonde zum Screenen von Hefebanken mittels Koloniefilter-Hybridisierungstechniken verwendet. Anfängliche Versuche zur Verwendung der Guessmer-Oligonucleotide als Sonden schlugen wegen des geringen Signal/Rausch-Verhältnisses nach der Hybridisierung fehl. Sämtliche potentiellen Klone

wurden ausgelesen und zweimal gescreent, um das positive Hybridisierungssignalzu bestätigen. Die Plasmide wurden von den einzelnen Klonen gereinigt, und die Restriktion mittels Verdauung mit einer Reihe von Restriktionsenzymen sowohl allein als auch in verschiedenen Mehrfach-Verdauungsreaktionen kartiert.

Sowohl an den Monierten PCR-Fragmenten als auch den CDase codierenden genomischen Klonen wurde eine DNA-Sequenzanalyse vorgenommen. Variationen der Reaktionsbedingungen ermöglichten die Analyse von Sequenzen, die von der unmittelbaren Nachbarschaft bis zu mehreren Hundert Basenpaaren Entfernung reichen. Die erhaltene DNA-Sequenz wird in Figur 8 gezeigt. Wie ersichtlich ist, sind die Sequenzen zu 93% homolog, sie wetten 23 fehlende Übereinstimmungen und 330 Übereinstimmungen auf. Die innerhalb dieser Sequenz gefundenen ORF sind in Figur 9 dargestellt. Figur 10 zeigt die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von ORF 2, wodurch die vorher bestimmte Aminosäuresequenz bestätigt und die Addition von nur wenigen Aminosäuren an jedem Ende der durch die Analyse des gereinigten Proteins erhaltenen partiellen Sequenz vorhergesagt wird.

Die DNA-Sequenz-Daten wurden nachfolgend zur Entwicklung neuer PCR-Starter zur Generierung amplifizierter, CDase codierender DNA-Kassetten genutzt. Solche Kassetten können in genetischen Konstruktion verwendet werden, die für ein hohes Maß der Genexpression entweder in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und zur Generierung von Genfusionen zwischen CDase und anderen, biologisch interessanten Molekülen entwickelt werden, die gegen Krebsantigene gerichtete Immunglobuline einschließen, jedoch nicht auf sie beschränkt sind.

Die CDase codierende Sequenz kann in jedem im Fach bekannten geeigneten Vektor oder jedes geeignete Replikon kloniert werden. Beispiele für rekombinante zur Klonierung geeignete DNA-Vektoren und von Wirtszellen, die von ihnen transformiert werden können (in Klammern gegeben) schließen den Lambda-Bakteriophageri (E.coli), pBR322 (E.coli), pACYC177 (E.coli), pKT230 (gram-negative Bakterien), pGV1106 (gram-negative Bakterien), ρ LAFR1 (gram-negative Bakterien), pME290 (nicht-Е.СОІІ gram-negative Bakterien), pHV14 (E.coli und Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pUJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), Ylp5 (Saccharomyces) YCp19 (Saccharomyces) und das Rinderpapillomvirus (Säugetierzellen) ein. Die codierende Sequenz für das CDaseprotein kann unter die Kontrolle eines Starters, einer Ribosomen-Bindungsstelle (für die bakterielle Expression) und gegebenenfalls eines Operators (hierin verwendete Kollektivbezeichnung dafür „Kontrollelement") gestellt werden, so daß die das Protein codierende DNA-Sequenz in der Wirtszelle, die von einem diese Expressionskonstruktion enthaltenden Vektor transformiert wird, in RNA transkribiert wird. Die codierende Sequenz kann gegebenenfalls ein Signalpeptid oder eine Leitsequenz enthalten. Leitsequenzen können von dem bakteriellen Wirt in post-translationaler Processierung beseitigt werden (Vergl. z. B. US-PSen 4431739; 4425437; 4338397).

Es kann wünschenswert sein, neben den Kontrollsequenzen Regulierungssequenzen anzufügen, die die Regulierung der Expressions-CDase-Sequenzen in bezug auf das Wachstum der Wirtszelle ermöglichen. Fachleuten sind Regulierungssequenzen bekannt, und Beispiele dafür schließen diejenigen ein, die bewirken, daß die Expression eines Gens als Reaktion auf einen chemischen oder physikalischen Reiz, einschließlich der Gegenwart einer Regulierungsverbindung, in Gang gesetzt oder eingestellt wird. Andere Typen von Regulierungselementen können in dem Vektor ebenfalls anwesend sein, z. B. Verstärkersequenzen.

Ein Expressionsvektor ist so konstruiert, daß die die CDase codierende Sequenz sich in dem Vektor mit den geeigneten Regulierungssequenzen befindet, wobei die codierende Sequenz in bezug auf die Kontrollsequenzen so positioniert und orientiert ist, daß die codierende Sequenz unter der „Kontrolle" der Kontrollsequenzen transkribiert wird (d. h. die RNA-Polymerase, die sich bei den Kontrollsequenzen an das DNA-Molekül bindet, transkribiert die codierende Sequenz). Um das zu erreichen, kann es wünschenswert sein, die CDase codierenden Sequenzen zu modifizieren. In einigen Fällen kann es z. B. notwendig sein, die Sequenz so zu modifizieren, daß sie mit entsprechender Orientierung an die Kontrollsequenzen angeheftet werden kann, d. h. den Leserahmen beizubehalten. Die Kontrollsequenzen und anderen Regulierungssequenzen können vor der Insertion in einen Vektor, z. B. die vorstehend beschriebenen Klonierungsvektoren, an die codierende Sequenz ligiert werden. Als Alternative kann die codierende Sequenz direkt in einen die Kontrollsequenzen und einen geeigneten Restriktionsort bereits enthaltenden Expressionsvektor kloniert werden.

Eine Reihe prokaryotischer Expressionsvektoren sind im Fach bekannt. Vergl. z.B. US-PSen 4440859; 4436815; 4431740; 4431739; 4428941; 4425437; 4418149; 4411994;4366246; 4342832, vergl.ebenfalls GB-PSen 2121054; 2008123; 2007675 und EP-A 103395. Hefeexpressionsvektoren sind im Fach ebenfalls bekannt. Vergl. z.B. US-PSen 4446235; 4443539; 4430428, ferner EP-Aen 103409; 100561; 96491. Säugetier-Expressionsvektoren sind ebenfalls bekannt.

In Abhängigkeit von dem gewählten Expressionssystem und dem Wirt wird CDase durch Züchtung von durch einen vorstehend beschriebenen Expressionsvektor transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, unter denen die CDase exprimiert wird, produziert. Das Protein wird danach von den Wirtszellen isoliert und gereinigt. Wenn das Expressionssystem das Protein in das Wachstumsmedium sekretiert, kann das Protein direkt vom Medium gereinigt werden. Wenn das Protein nicht sekretiert wird, wird es aus den Zellysaten isoliert. Geeignete Wachstumsbedingungen und Zurückgewinnungsmethoden sind Fachleuten bekannt.

Ein Beispiel für ein Konstrukt zur kontrollierten Induktion von CDase-Sequenzen in Hefe umfaßt die Insertion der CDase-Kassette in einen als „Fusionator" bezeichneten Hefevektor. Dieser Vektor kann vom Department of Genetics, University of Washington, Seattle, Washington sowie vom National Institute of Health bezogen werden. Ein solches Konstrukt ist in Figur 11 dargestellt. In diesem Konstrukt wird die CDase in einen Polylinker inseriert, der ihre Expression unter die Kontrolle des hoch exprimierten und streng regulierten GAL10-Promoters aus der Hefe stellt (M. Johnston, 1987). Der GAL10-Promoter reagiert auf Galactose, wobei eine hohe Expression des von ihm kontrollierten Gens induziert wird. Dieser Vektor kann ebenfalls genutzt werden, um durch geeignete Änderungen der DNA-Sequenz eine CDase-lacZ-Genfusion herbeizuführen. Das generierte Fusionsprotein kann die quantitative Bestimmung der Induktion, Reinigung, und biochemischen Analyse erleichtern. Diese Konstrukte können in einen geeigneten Hefestamm, z. B. denjenigen, der von Hovland u. a. (1989) beschrieben wurde, transformiert werden. Dieser Hefestamm schließt eine Reihe von Mutationen ein, die ihn für die Verwendung zusammen mit einem Konstrukt, wie z. B. dem vorstehenden geeignet erscheinen lassen. Im besonderen ist eine Galle-Mutation anwesend, die einen Mangel des den ersten Schritt der Galactosenutzung katalysierenden Enzyms bewirkt, wodurch die Inducer- (Galactose)-Erschöpfung in den Medien verhindert wird. Eine reg 1 -501-Mutation ist ebenfalls vorhanden, die die Glucoeerepression der Galactose-Genexpression beseitigt und das Anlegen von Kulturen unter optimalen Wachstums- und Übellebensbedingungen ermöglicht. Die Induktion kann problemlos durch Zugabe von Galactose zu kräftigen Medien auf Glucosebasis erreicht werden. Schließlich sind mehrere

proteasearme Mutationen in dem Stamm enthalten, wodurch die Stabilität aller während des Wachstums produzierten heterologen Proteine oder Fragmente derselben erhöht wird. Ein derartiges Expressionskonstrukt müßte die Isolierung und Reinigung der CDase aus Hefe in Mengen, die in der Vergangenheit mit der Expression mit dem endogenen Gen nicht erreicht werden konnten, erleichtern.

Andere Konstrukte können für die Verwendung in Säugetierzellkulturen geschaffen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die COase codierende Kassette mittels PCR-Technik an das sekretorische Signalpeptid für Oncostatin M angeheftet (Malik u. a., 1989) und kann darm in den Säugetier-spezifischen Expressionsvektor рНЗМРу (Stamenkovic u. a., 1990) inseriert werden, der die geeigneten Verstärker, Promoter, Terminations- und Processingsignale für die Expression in Säugetierzeilen enthält. Das Konstrukt kann in COS-Zellen transferiert (Aruffo und Seed, 1987), serumfreies Kulturmedium gesammelt und in einem System, das keine endogene Enzymaktivität aufweist, auf CDase-Aktivität untersucht werden. In gleicher Weise können cDNA-Konstrukte für Genfusionen zwischen CDase und anderen interessanten Molekülen nach Standardtechniken konstruiert, in COS-Zellen transferiert und die Zellextrakte oder Überstände auf die Proteine und ihre Aktivität untersucht werden.

Weitere Genfusionen werden ebenfalls in der rekombinanten CDase-Produktion genutzt So kann z. B. eine CDase oder einen funktioneilen Mutanten oder ein Fragment derselben codierende Nucleotidsequenz mit CDNA codierenden Immunglobulinmolekülen, die gegen Krebsantigene gerichtet sind, fusioniert werden, um ein Antikörper-Enzym-Fusionsprotein zu erhalten. Es wurden monoklonale Antikörper gewonnen, die Determinanten erkennen, die vorzugsweise auf Tumorzellen exprimiert werden (Hellstrom u.a., 1984). Folglich können Fusionsproteine geschaffen werden, die speziell gegen ausgewählte Tumorzellen gerichtet sind. Vergl. z.B. US-PS 4906562 und Hellstrom und Hellstrom, 1985. Das Enzym kann unmittelbar am Ort der Tumorzelle wirken und das als Medikamentenvorstufe dienende 5-FC in das zur Krebsbehandlung dienende Agens 5-FU umwandeln. Die genomische Fusion zwischen den das interessierende Enzym codierenden Genen und dem auf Krebszellen zielenden Antikörper macht die an sich erforderliche chemische Konjugation der zwei Proteine überflüssig. In gleicher Weise können cDNA-Konstrukte zwischen zwei interessierenden Molekülen die Flexibilität derartiger Konstrukte in heterologen Expressionssystemen erhöhen.

In einem System wird die cDNA für die schwere Kette eines Krebsantikörpers aus Zellinien gewonnen, die diesen Antikörper produzieren. PCR-Fragmente, die die gesamte oder Teile dieser cDNA codieren, könenn dann durch Fachleuten bekannte Methoden erzeugt werden. Die Rasterfusion von zwei Kassetten kann an verschiedenen Orten mit Standardmethoden bewirkt und die daraus resultierenden Fusionen auf die Produktion von Proteinen, die die gewünschte biologische Aktivität aufweisen, getestet werden.

Die Co-Transfektion mit einem zweiten Plasmid, das die den leichten Kettenanteil des Antikörpermoleküls codierende cDNA trägt, gestattet die Isolierung eines biologisch aktiven Antikörperfragments, das mit einem aktiven CDase-Enzym fusioniert ist. Auf diese Weise wird das Enzym auf den gewünschten Punkt ausgerichtet.

Ferner ist es wünschenswert, Mutanten oder Analoga thermisch stabiler CDase zu produzieren, die derselben funktionell gleichwertig sind. Mutanten oder Analoga können durch die Deletion eines Teils der CDase codierenden Sequenz, durch Insertion einer Sequenz und/oder durch Substitution eines oder mehrerer Nucleotide innerhalb der Sequenz präpariert werden. Techniken zur Modifizierung von Nucleotidsequenzen, z.B. ortsgerichtete Mutagenese oder PCR-Oligonucleotid-Mutangenese sind Fachleuten gut bekannt. Vergl. T. Maniatis u.a.

Die erfindungsgemäße CDase wird ferner durch chemische Synthese, wie z. B. Festphasen-Peptidsynthese, die bekannte Aminosäuresequenzen oder Aminosäuresequenzen, die aus der DNA-Sequenz des interessierenden Gens deriviert wurden, nutzt, produziert. Die Methoden sind Fachleuten bekannt.

Thermisch stabile CDase kann als Chemotherapeutikum verwendet werden. Speziell kann dieses Enzym in vivo zur Umwandlung der Medikamentenvorstufe 5-FC zum Krebsbekämpfungsmittel 5-FU verwendet werden. Folglich kann CDase zusammen mit 5-FC z. B. durch den chirurgischen Einbau der CDase im Tumor oder in dessen Nähe und parallel zur oralen Verabreichung von 5-FC verabreicht werden, wie von Katsuragi u.a. 1987 beschrieben wurde. Diese Offenbarung wird hierin zu Vergleichszwecken eingeschlossen. Als Alternative kann das Enzym an durch gezielte Bereitstellung eines CDase/Antikörperkomplexes bei Tumoren an den Ort des Tumors gebracht werden, wobei man Antikörper verwendet, die für diese Tumoren spezifisch sind. Dieser Komplex kann chemisch oder genetisch durch Konstruieren von Genfusionen zwischen dem geeigneten Immunglobulin-Gen und dem CDase-Gen - wie vorstehend beschrieben —produziert werden.

Ausführungsbeispiele

Nachfolgend werden Beispiele spezifischer Ausführungsformen der Erfindung beschrieben. Die Beispiele sollen die Erfindung nur veranschaulichen, ihren Umfang jedoch in keiner Weise einschränken.

Beispiel 1

Reinigung des Enzyms, Bestimmung der Aktivität und Kennzeichnung der CDase Mit nachstehend beschriebener Methode wurde die CDase von Fleishmanns gepreßter Bäckerhefe gereinigt. Alle Reinigungsschritte wurden bei 4°C ausgeführt. Die Enzymaktivität wurde mit 5-Fluorcytosin (5-FC) bei 3mM in Phosphatgepufferter Saline (PBS) bei 37°C bestimmt (Nishiyama, u. a. 1985), deren Offenbarung hierin in ihrer Gesamtheit zu Vergleichszwecken eingeschlossen ist. Enzymlösungen wurden zugesetzt und der Reaktionsablauf wurde an aliquoten Teilen, die mit 0,1 N HCI gequencht wurden, kontrolliert. Zur Bestimmung der Menge des gebildeten 5-Fluoruracils (5-FU) wurden Extinktionsverhältnisse von 255 zu 290 genutzt. Die Einheit der Enzymaktivität ist die Bildung von 1 μιηοΙ FU pro Minute bei 37 °C.

Die Proteinkonzentration wurde mittels BCA-Assay, der von der Firma Pierce (Rockford, II.) bezogen werden kann, gemessen. Die Proteinzusammensetzung wurde nach jedem Reinigungsschritt mit SDS-PAGE kontrolliert

Schritt 1. Herstellung des Hof eautolysats

Bäckerhefe (2,25kg) wurde mit Ethylacetat (225 ml) gemischt und 30 Minuten lang gerührt. Danach wurden bei pH 7,2 2,251 eines 5OmM Kaliumphosphatpuffers, der 15% Ammoniumsulfat enthielt, SmM EDTAund0,1 mM Dithiothreitol (DTT) zugegeben. Die Mischung wurde 3 Tage lang gerührt, und der pH wurde täglich mit festen Trihydroxymethytaminomethan (Tris) auf 7,2 eingestellt. Die Zelltrümmer wurden durch 15minütiges Zentrifugieren bei 10000Upm entfernt.

Schritt 2. Ammoniumsulfatfraktionierung Durch Zugabe von EOTA (1,8g/l) und Ammoniumsulfat (371 g/l) bis zu einer endgültigen Konzentration des Ammoniumsulfats,

die einer 70%igen Sättigung entsprach, wurde das Gesamtprotein aus dem Überstand von Schritt 1 ausgefällt. Die Lösungwurde etwa 16 Stunden bei 4°C gehalten,danach wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren gewonnen. Der Rückstand wurdein 1,51 von 5OmM Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,2, der SmM EDTA und 0,1 mM DTT enthielt gelöst und etwa 12 bis 16 Stundenmit diesem Puffer dialysiert.

EDTA (1,8 g/t) wurde dem Dialysat zugesetzt und Ammoniumsulfat wurde zugegeben, bis eine 50%ige Sättigung erreicht war

(314g Ammoniumsulfat pro Liter Dialysat). Nach 1 Stunde wurde der Niederschlag zentrifugiert und weiteres Ammoniumsulfatwurde zu dem Überstand zugegeben, so daß die endgültige Ammoniumsulfatkonzentration 73% betrug. Der Niederschlagwurde gesammelt, in 112OmM Tris-Puffer bei pH 8,0, der 0,1 mM DTT enthielt, gelöst und mit diesem Puffer etwa 12 bis16 Stunden dialysiert.

Schritt 3. Anionenaustauschchromatographie

Das Dialysat aus Schritt 2 wurde in eine 4,8cm x 25cm messende Q-Sepharosesäule (Pharmacia) gegeben, die mit 20mM Tris, das bei pH 8,0 0,1 mM DTT enthielt, äquilibriert wurde. Die Säule wurde gewaschen, und das Enzym wurde mit 0-0,3M KCL als linearer Gradient im vorstehend genannten Puffer eluiert. Die CDase-Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und durch Ultrafiltration (Amicon, PM 30-Filter) auf etwa 15ml konzentriert.

Schritt 4. Gelpermeationschromatographie

Die die CDase enthaltende Lösung aus Schritt 3 wurde in eine G-75-Sephadex-Säule (2,5cm x 100cm) gegeben und mit PBS, die 0,1 mM DTT enthielt, eluiert. Die die CDase-Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und danach mit 4I eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers, der 1,8mM Ammoniumsulfat, 5mM EDTA und 0,1 mM OTT bei pH 7,0 enthielt, dialysiert.

Schritt 5. Hydrophobe Interaktionschromatographie

Das Material aus Schritt 4 wurde in eine 2,5 cm η χ 15cm messende Octyl-Sepharose-Säule (Pharmacia) gegeben, die mit 10OmM Kaliumphosphat, das 1,8M Ammoniumsulfat, 5mM EDTA und 0,1 mM 0TT bei pH 7,0 enthielt, äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit diesem Puffer gewaschen und das Enzym wurde mit einem linearen Gradienten von 1,8-OM Ammoniumsulfat in dem vorstehend genannten Puffer ekiiert. Die CDase-Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert und durch Ultrafiltration (Amicon, YM5-Filter) konzentriert.

Schritt 6. Gelchromatographie

Eine abschließende Gelfiltration des Materials aus Schritt 5 wurde wie in Schritt 4 beschrieben in einer G-75-Sephadex-Säule mit PBS als Elutionsmittel vorgenommen. Das gereinigte Enzym wurde durch Ultrafiltration konzentriert und bei — 70°C gelagert. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse der einzelnen Reinigungsschritte dargestellt. SDS-PAGE-Profile, die zur Kontrolle der Proteinzusammensetzung nach jedem Reinigungsschritt angefertigt wurden, sind in Figur 1 dargestellt. Die endgültige Enzympräparation bestand aus einer Hauptbande bei etwa 17kDa und einer kleineren Bande bei etwa 19kDa.

Tabelle 1 Reinigung der CDase von 2,25kg Bäckerhefe

Schritt	Gesamtprotein	Gesamtaktivität	Spez. Aktivität	Reinigung
	(mg)¹	(U)²	(U/mg)
Zellfreier Extrakt	120 000	1750	0,014	Imal
(NH₄)₂SO₄	36 000	1274	0,035	2,5mal
Q-Sepharose	4 200	685	0,16	11,4m al
G-75-Sephadex	184	648	3,5	250mal
Octyl-Sepharose	20	495	25	1 800mal
G-75-Sephadex	6	394	67	4 800mal

1 Proteinkonzentration mit BCA (Pierce) bestimmt

2 Eine Einheit Enzymaktivität entspricht der Bildung von 1 μηηοΙ 5-FU pro Minute bei 37°C.

Die relative Molekülmasse der CDase wurde durch Aufbringen des greinigten Enzymsauf eine G-50-Sephadex-Säule zusammen mit Ribonuclease A (13,7kDa), Chymotrypsinogen A (25kDa) und Ovalbumin (43kDa) bestimmt. Zur Messung des Gesamtproteins wurden die Fraktionen bei 280nm kontrolliert und für die CDase-Aktivität wurde 5-FC als Substrat genutzt. Die Hauptbande der CDase-Enzymaktivität lag bei etwa 32 kDa (Figur 2 A). Genau das gleiche Volumen Enzym wurde eluiert, wenn es ohne die Eichstandards auf die Säule aufgetragen wurde (Figur 2B).

Die Stabilität der gereinigten CDase bei 37°C in Phosphatgepufferter Saline bei pH 7,2 wurde unter Verwendung von 5-FC als Substrat bestimmt. Nach verlängerter Inkubation (Figur 3) wurde eine langsame Abnahme der Enzymaktivität festgestellt. Unter diesen Bedingungen verlor das Enzym nach 5,2 Tagen die Hälfte seiner Aktivität. In den ersten 4 Stunden der Inkubation war kein augenscheinlicher Verlust der enzymatischen Aktivität zu verzeichnen (Figur 3, Kasten).

Beispiel 2

Aminosäuresequenz der CDase

Die zur Sequenzierung der CDase verwendeten Reagenzien wurden von Applied Biosystems, Inc. bezogen, die in der schnellen Flüssigchromatographie mit Umkehrphase verwendeten Lösungsmittel wurden von der Fa Burdick und Jackson bezogen.

4-Vinylpyridin wurde von Aldrich Chemical CoI, NCBr von Kodak geliefert, alle anderen Chemikalien waren analysenrein.

Endoproteinase GIu-C aus Staphylococcus aureus wurde von Miles Laboratories bezogen. Encoproteinase Asp-N aus Pseudomonas f ragi und Endoproteinase Lys-C wurde von Boehringer Mannheim bezogen.

Die automatisierte Sequenzanalyse wurde auf einem Aminosäuresequenzgerät (ABI), Modell 475 A mit den Programmen RUN470-L oder PRO470-L vorgenommen. Insgesamt 1,5mg BioBrene (ABI) wurde aufgetragen und vor dem Auftragen der Probe zwei oder drei Vorzyklen des Edmann-Abbaus unterzogen. Die Umwandlung der Thiazolinonderivate in Phenylthiohydantoinaminosäuran wurde mit 25%iger TFAC Trifluorethansäure) bei 61 °C vorgenommen. Die Phenylthiohydantoinaminosäurederivate wurden durch schnelle Flüssigchromatographie mit Umkehrphase auf einer PTH CI8-Säule (2,1 mm χ 220 mm, ABI) mit einem 5% (V/V) Tetrahydrofuran enthaltenden Natriumacetatpuffer als Startpuffer und 500 r>M Dimethylphenylthioharnstoff (ABl) enthaltenden Acetonitril als limitierendem Puffer auf einem Analysegerät Modell 120 A (ABI) aufgetrennt.

CDase und Peptidfragmente wurde mittels schneller Flüssigchromatographie mit Umkehrphase auf einem Trennsystem Modell 130 A (Applied Biosystems, Inc.) gereinigt. Die Auftrennung wurde bei 40⁰C auf einer RP-300-Säule (2,1 mm χ 30mm, ABI) vorgenommen. Ein linearer Gradient von 0-60% Acetonitril in 0,1%iger wäßriger Trifluorethansäure (TFA) während 2 Stunden bei 0,1 ml/min wurde zur Elution der Proteine und Peptidfragmente genutzt. CNBr-Peptide, Endoproteinase Lys-C-Peptide, Endoproteinase GIu-C und Endoproteinase Asp-N-Peptide wurden zur Sequenzanalyse ohne weitere Reinigung verwendet.

Umsetzung der CDase mit 4-Vinylpyridin

Die CDase aus Beispiel 1, Schritt 6 wurde durch die Zugabe von 4-Vinylpyridtn auf folgende Weise modifiziert. Die CDase wurde mit 20mM-Dithiothreitol in 0,1 ml von 0,4M Tris-HCI-Puffers, pH 8,5, der 6M Guanidin-HCI, 0,1 % Na₂EDTA enthielt, bei 50⁰C 2 Stunden lang reduziert und danach mit 10OmM 4-Vinylpyridin über Nacht bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 20% TFA bis pH 2,0 angesäuert, entsalzt und wie vorstehend beschrieben durch schnelle Flüssigchromatographie mit Umkehrphase gereinigt.

Die Analyse des erhaltenen Produkts mittels schneller Flüssigchromatographie zeigte das Vorhandensein von zwei ausgeprägten Peaks an (Figur 4), die getrennt und mit SDS-PAGE erneut analysiert wurden (Figur 5). Der kleinere Peak (Pool A) entsprach der 19kDa-Bande in Figur 1, und der größere Peak entsprach der 17kDa Bande.

Die Amino-endständige Aminosäuresequenz für das Protein in Pool A (Figur 4) wurde durch die Identifizierung der Aminosäurephenylthiohydantoinderivate bis zu Rest 27 gewonnen. Es wurde festgestellt, daß die Sequenz mit der N-endständigen Sequenz der Superoxiddismutase der Bäckerhefe identisch ist (EC 1.15.1.1, Steinman, 1980). Dadurch wurde es möglich, die Identität der kleinen Bande zu ermitteln, die in den Gelen der gereinigten CDase festgestellt wurde (Figur 1,5). Aus dem Edman-Abbau des großen Peaks in Figur 4 (Pool B) wurde keine Aminosäuresequenz erhalten, was daraufhindeutet, daß das Aminoende der CDase blockiert war. Die partielle Aminosäuresequenz der CDase wurde deswegen durch die Sequenzierung ausgewählter Fragmente aus dem enzymatischen und Bromcyanabbai^wie nachstehend beschrieben, gewonnen.

Enzymatische und chemische Spaltung der CDase

Die Spaltung der mit 4-Vinylpyridin modifizierten CDase mit Endoproteinase Lys-C und Endoproteinase GIu-C erfolgte in 40 μΙ 0,1 M Tris-Ethansäurepuffer (pH 8,0) bei 37"C für die Dauer von etwa 12 bis 16 Stunden. Das Verhältnis zwischen Enzym und Substrat betrug 1:10 (Masse/Masse). Die Endoproteinase ASp-N-Spaltung wurde in gleicher Weise bei einem Verhältnis von Enzym zu Substrat von 1:1000 bei 37"C und die Dauer von etwa 12 bis 16 Stunden vorgenommen. Die enzymatischen Abbauprodukte wurde mit 20%iger TFA bis zu pH 2,0 angesäuert und durch schnelle Flüssigchromatographie mit Umkehrphase aufgetrennt.

Bromcyan (CNBr) wurde zur Spaltung der CDase an den Methionylresten verwendet. Die CDase (2,25 nmol) wurde mit 4-Vinylpyridin modifiziert, in 40 μΙ 70%iger Methansäure zur ursprünglichen Konzentration verdünnt, und ein 200facher molarer Überschuß von CNBr in 70%iger Methansäure wurde zugegeben. Man ließ die Reaktion 2 Stunden bei 35⁰C und danach etwa 12 bis 16 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen. Das Abbauprodukt wurde mit Wasser verdünnt und zur Entfernung überschüssigen CNBr vakuumgetrocknet. Für die Analyse mittels schneller Flüssigchromatographie mit Umkehrphase wurde eine Lösung in 1%iger TFA hergestellt.

Figur 6 zeigt die partielle Aminosäuresequenz der CDase, die auf den Fragmenten basiert, die mittels Bromcyanspaltung sowie proteolytischer Spaltung mit Hilfe der Enzyme Endoproteinase GIu-C, Endoproteinase Lys-C und Endoproteinase Asp-N gewonnen wurden. Eine Reihe von 154 Aminosäuren wurde identifiziert, die den größten Teil des Proteins umfaßt. Die Numerierung der Aminosäurereste schließt die noch nicht identifizierten Aminosäuren in der Nähe des Aminoendes nicht ein. Ein Vergleich der partiellen CDase-Sequenz mit anderen bekannten Sequenzen, einschließlich der Adenosin-deaminase der Maus (Yeung u. a., 1985) und der dCMP-deaminase der Bäckerhefe (Mclntosh und Haynes, 1986) ergab keine wesentliche Homologie.

Beispiel 3

Klonierung und Expression des CDase-Gens

Das CDase codierende Gen wurde aus Laborstämmen von S.cerevisiae (Bäckerhefe) isoliert und in einer Säugetierzellinie nach folgender Methode exprimiert.

Schritt 1: Generierung einer CDase spezifischen Sonde mittels PCR

Zwei Oligonucleotidstarter wurden auf einem automatisierten DNA-Synthesizer unter Verwendung der partiellen Aminosäuresequenz und der Codonnutzungsmuster von S.cerevisiae (Guthrie und Abelson, 1982) als „Guide" für die Entwicklung der „Guessmer'-Segmente der DNA-Sequenz synthetisiert. Diese Oligonucleotide wurden danach in PCRs als Starter verwendet, wobei die DNA aus der Monierten genomischen Bank der Hefe als Matrize genutzt wurde. Die Starter mit der Bezeichnung CDA4 R1 und CDA5AS waren beide 42-Mere die 33 Nucleotide der Sequenz enthielten, die dem Strang bzw. Anti-Sense-Strang der CDase entsprachen. Der verbleibende Teil jedes Oligonucleotids codierte den Restriktionsenzymort für EcoRI. Die Sequenz der beiden Starter ist in Figur 7 dargestellt

Beide Starter waren entweder in 50 oder lOOpmol pro Reaktion vorhanden. Die zwei als Matrizen-DNA in PCR-Reaktionen verwendeten genomischen Banken wurden aus der genomischen DNA der Hefe durch partiellen Restriktionsabbau mit Sau ЗА, gefolgt von der Ligation in die BamHI-Orte eines der zwei Schaukelvektoren CV13oder YCp 50, konstruiert. Diese zwei Vektoren und die genomischen Banken stehen Fachleuten im allgemeinen zur Verfügung; wir bezogen sie von dem Department of Genetics der University of Washington, Beide Banken waren bereits in Bakterienwirten transformiert. Die DNA der Bank wurde durch alkalische Lyse-Plasmidpräparationen isoliert, die nachfolgend durch Caesiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichtegradienten-Zentrif ugation gereinigt worden waren. PCR-Reaktionen wurden mit 1 Mg der mit CsCI gereinigten CV13 oder YCp 50 genomischen Bank-DNA aus Hefe in Gang gesetzt, wobei von jedem Starter 50 oder lOOpmol, 1/10 Volumen des 1Ox PCR-Reaktionspuffers (Stratagene), 16/100 Volumen 1,25mM dNTP (A, G, T, C), destilliertes Wasser in PCR-Qualität und 0,5 μΙ Tag DN A-Polymerase (5 Ε/μΙ, Stratagene) bis das endgültige Volumen von 100 μΙ erreicht war, verwendet wurden. Die Umsetzung erfolgte in sterilen Mikrozentrifugenröhrchen unter einer 75 μΙ betragenden Schicht aus gereinigtem Mineralöl, um die Verdunstung zus verhindern. Die PCR-Reaktionen wurden in einem Perkin-Elmer Cetus Thermal Cycler nach einem 30 Zyklen umfassenden Programm durchgeführt, das folgende Temperaturverschiebungen umfaßte: ein Zyklus mit einem Schritt bei 94°C, Dauer 30see. zur Denaturierung; bei 55⁰C, Dauer 45see. zur Hybridisierung; und bei 72°C, Dauer 1,5min (90see.) zur Extension.

Zum Nachweis des vorhergesagten 350 Basenpaare umfassenden Fragments, das den Großteil der CDase codiert, wurden a liquote Teile aus den PCR-Reaktionen aufAgarose-Gelen analysiert. Zur Entfernung der Starter und heterologen Fragmente aus der Präparation wurden danach die 350 Basenpaare enthaltenden Fragmente durch präparative Agarose-Gel-Elektrophorese mit nachfolgender Elution nach dem Protokoll und mittels der Reagenzien, die zusammen mit dem GeneClean-Kit (Bl0101) geliefert werden, gereinigt.

Schritt 2: Subklonierung der PCR-Fragmente zur Sequenzierung

Zur Erleichterung der Klonierung aller generierten Fragmente wurden die PCR-Starter aus Schritt 1 durch Manipulation mit EcoRI-Restriktionsorten an ihren 5'-Enden versehen. Ein aliquoter Teil des gereinigten 350 bp PCR-derivierten Fragments wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut, und an den mit EcoRI geschnittenen Phagemid-Vektor pBSII-SK⁺ (Stratagene) ligiert. Die Restiktionsenzyme wurden von Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB) bezogen. Die Verdauungsprodukte wurden 2 Stunden lang bei 37 "C inkubiert; es folgte das Extrahieren mit einem gleichen Volumen Phenol:Chloroform:lsoamylalkohol sowie eine Ausfällung mit Ethanol. Die Fragmente wurden in TE (10mMTris-HCIpH8,0,1 mM EDTA, pH 8,0) suspendiert und mit T4 DNA-Ligase (BMB) zusammenligiert. Kompetente JM 109-Bakterien wurden Ѵб der Ligationsreaktion transformiert und geeignete Verdünnungen auf LB + Ampicillin (100цд/тІ) Platten, die mit XGaI (50μΙ einer 2%igen Stammlösung in Dimethylformamid) und IPTG (10μΙ einer 10OmM Stammlösung) ergänzt waren, plattiert. Weiße Kolonien wurden ausgelesen, und nach den in Sambrook u.a. (1989) aufgelisteten Protokollen wurden kleine Plasmidpräparationen vorgenommen. Die Plasmide wurden durch Verdauung mit EcoRI auf das 350 bp Insert gescreent. Mehrere verschiedene Isolate wurden ausgelesen, Plasmid-DNAwurde isoliert und gereinigt und der DNA-Sequenzanalyse unterzogen.

Schritt 3: Verwendung des PCR-Fragments als CDase-spezifische Sonde für das Screenen der genomischen Banken der Hefe Das in Schritt 1 gewonnene PCR-Fragment wurde ferner beim Screenen genomischer Banken auf das Gen enthaltende Klone als Sonde zum Nachweis der die CDase codierenden Sequenz genutzt. Das gereinigte Fragment wurde mit alpha-³²p-dCTP und mit Hilfe eines Markierungskits für zufallsverteilte Starter-DNA der Firma Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB) markiert. Hefebanken wurden über Nacht in LB + Ampicillin gezüchtet, und Verdünnungen wurden auf LB + Ampicillinplatten so plattiert, daß man Koloniedichten von 250-2000 Kolonien pro Platte erhielt. Die Kolonien wurden mit 0,45 pm Nitrocellulosescheiben oder -quadraten der Firma Schliecher und Schuell abgehoben. Die Filter wurden verarbeitet, indem sie nach Anweisung des Herstellers mit der Kolonieseite auf 3mm starkes Whatman-Papier gelegt wurden, das zum Fixieren (5 Minuten) mit 10%igem SDS (Natriumdodecylsulfat); zum Denaturieren (5 Minuten) mit 0,5M NaOH, 1,5MNaCI; zum Neutralisieren (5 Minuten) mit 1,5NaCI, 0,5M Tris HCI, pH 7,4, und vor der UV-Quervernetzung mit einem Statalinker (Stratagene) mit 2x SSC (5 Minuten) gesättigt war. Die Filter wurden 5 Minuten lang in 2x SSC eingetaucht und in 5x SSC, 0,5% SDS, 1 mM EDTA bei 5O⁰C vorgewaschen.

In verschweißbaren Plastikbeuteln, die pro Beutel 20 ml Lösung von 12 Filtern enthielten wurde die Prä-Hybridisierung vorgenommen. Die Prä-Hybridisierungslösungenthielt50% Formamid,6x SSC,0,01 M NaP,pH6,8,1 mM EDTA (pH8,0), 0,5% SDS, 100цд/тІ denaturierte Lachsspermien-DNA und 5x Denhardtsche Lösung. Die Plastikbeutel wurden in ein 42⁰C warmes Wasserbad eingebracht und etwa 12 bis 16 Stunden inkubiert. Die markierte Sonde wurde durch Elution aus Push-Columns (Stratagene) von nicht eingebauten Nucleotiden gereinigt. Die Sonde wurde etwa zu 10⁶cpm/ml Flüssigkeit zugegeben und etwa 12 bis 16 Stunden bei 42⁰C zur Hybridisierung inkubiert.

Die Filter wurden mehrmals bei Raumtemperatur in 2 χ SSC, 0,1 % SDS gewaschen, dem folgte bei 55°C ein 1 stündiges Waschen in 1 χ SSC, 0,1 % SDS. Die Filter wurden an der Luft getrocknet, in Saran-Verpackungsmaterial verpackt und über Nacht bet -70X mit einem mit Verstärkerfolie versehenen Röntgenfilm in Kontakt gebracht. Die Autoradiographien wurden mit Filtern und Master-Platten in maximale Übereinstimmung gebracht, um Klone auszuwählen, die ein positives Hybridisierungssignal enthielten. Positive Klone wurden vor der Isolierung des Plasmids noch zweimal mit der vorstehend genannten Methode gescreent. Die Plasmid-DNAwurde durch das Wachstum von Chloramphenicol-amplifizierten, 500ml umfassenden LB + Amp.-Kulturen und nachfolgende Reinigung mit der alkalischen Lysetechnik, die in Sambrook u.a., 1989 beschrieben ist, isoliert. Einige Plasmide wurden durch Caesiumchlorid-Ethidiumbromid-Gleichgewichts-Zentrifugation gereinigt, während andere aus PZ253-Säulen (5'-3') eluiert wurden. Danach folgte die Ausfällung mitPolyethylglycol, Phenol:Chloroform-Extrahierung und Ethanol-Ausfällung.

Schritt 4: Sequenzierung PCR-derivterter und genomische CDase-cocRerender Klone

Mehrere 18-mer Oligonucleotide wurden synthetisiert oder für die Sequenzierung der DNA aus PCR und genomischen CDase-Klonen bestellt. Einige Starter generierten die Sequenz von dem codierenden Strang, während andere die Sequenz von dem komplementären Strang ergaben. Die Sequenzierungsreaktionen wurden gemäß den Protokollen und den Reagenzien vorgenommen, die zusammen mit dem Sequenase Version 2,0Kit (United States Biochemical) geliefert wurden. Die DNA wurde vor den Sequenzierungsreaktionen durch alkalische Denaturierung in 0,2 N NaOH denaturiert. Verdünnungen des zur Markierung verwendeten Reaktionsgemische und die Reaktionsdauerwaren je nach der Region, in der man die Sequenz wünschte, verschieden. Bei den meisten Reaktionen wurde pro Reaktion 1-1,5pmol der Matrizen-DNA und Starter mit 10-15 uCi von alpha-³⁵-s-dATP verwendet. Proben wurden auf 8%ige Polyacrylamid-Harnstoff-Sequenzierungsgele aufgebracht und je nach der abzulesenden Sequenz 1-7 Stunden lang behandelt. Die Gele wurden 30 Minuten lang in 10% Methanol, 10% Ethansäure fixiert und mit Hilfe eines Platten-Gel-Trockners, der an eine Vakuumpumpe angeschlossen war, 45 Minuten lang bei 80⁰C getrocknet. Man ließ die getrockneten Gele 18-72 Stunden lang bei Raumtemperatur auf Kodak XAr-5-Film einwirken. Die Sequenzen wurden manuell abgelesen. Die maximale Ausrichtung und die Analyse der Sequenzdaten wurde von einem Computer, der mit Gene Pro Software (Riverside Scientific, Seattle, Washington) arbeitete, vorgenommen. Figur 8 zeigt die Nucleotidsequenz der genomischen CDase codierenden Klone. Figur 10 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz. Wie in den Figuren ersichtlich ist, besteht die codierende Sequenz aus etwa 474 Basenpaaren und spezifiziert ein Protein von 158 Aminosäuren. Die vorhergesagte relative Molekülmasse der so gewonnenen CDase beträgt etwa 17 506 Dalton.

Schritt 5: Konstruktion der CDase codierenden Kassetten zur Expression In Hefe· und Säugetiersystemen Die in Schritt 4 erhaltene DNA-Sequenz wurde zur Konstruktion von Oligonucleotidstartem für CDase codierende PCR-generierte Kassetten verwendet. Einige dieser Oligonucleotide enthielten zusätzliche Sequenzen, wie z.B. sekretorische Signalpeptide und Restriktionsorte, die beim Klonieren oder der Expression genutzt werden können. Oligonucleotidstarter wurden paarweise zur Generierung von PCR-Fragmenten genutzt, an deren Enden die geeigneten Sequenzen angehängt waren. Im besonderen wurde eine CDase codierende Kassette durch PCR konstruiert, wobei zwei Starter verwendet wurden, die sowohl die CDase-spezifische Sequenz als auch eine zusätzliche, Restriktionsorte für das Klonieren codierende Sequenz enthielt. Der 5'-Starter war ein 65-mer, das 45 Sequenzbasen enthielt, die mit dem 5'-Ende der genomischen Kopie der CDase, die an einen die Restriktionsorte Hind III, Sal I und Nco I enthaltenden 5'-Schwanz angeheftet sind, homolog, jedoch nicht völlig identisch sind. Bei dem 3'-Starter handelte es sich um ein mit dem Anti-Sense-Strang an dem C-Ende der CDase identisches 39-mer, wobei ein Xbal-Schwanz an sein 5'-Ende angeheftet war. Der genomische CDase-Klon in einer Menge von etwa 1 ng pro Reaktion wurde als Matrize verwendet Jeder Starter war in einer Konzentration von 75pmol vorhanden. Die PCR-Reaktionen wurden wie für Schritt 1 beschrieben durchgeführt.

Die PCR-Reaktionsprodukte wurden durch Extraktion mit Chloroform und Ethanolausfällung gereinigt. Die DNA wurde mit den Restriktionsenzymen Hind III und Xbal verdaut, der Gel-Elektrophorese unterzogen und durch Elution mit GeneClean (Bl 0101) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt.

Schritt 6: Expression der CDase in einem Säugetiersystem

Das gereinigte Fragment aus Schritt 5 wurde an den mit Hindlll-Xbal digerierten CDM8 oder рНЗМ Plasmidvektor ligiert und in die bakterielle Wirtszellen MC 1061 transformiert (Aruffo und Seed, 1987). Eine Karte des рНЗМ-Vektors ist in Figur 12 dargestellt. 20 Transformanten wurden ausgelesen, kleine alkalische Lyse-Plasmidpräparationen wurden vorgenommen und aliquote Teile mit Hindill + Xbal zur Verifizierung ihrer Struktur verdaut. Das restliche Plasmid aus drei Präparationen wurde zur Transfektion von COS-Zellen nach der DEAE-Dextran-Transfektionsmethode genutzt (Ausubel u. a., Herausg., Current Protocols in Molecular Biology).

Dabei wurden 3,5χ 10⁶ COS-Zellen auf 6cm großen Kulturschalen in DMRM/10% fötalem Rinderserum (FBS) plattiert und über Nacht in 6% CO₂ bei 37°C inkubiert DNA aus den Minipräparaten wurde mit PBS und 50 mg/ml DEAE-Dextran gemischt, bis ein Gesamtvolumen von ΙΟΟμΙ in den nachfolgend angegebenen Mengen erreicht war.

Probe	DNA	FBS	DEAE-Dextran
			(50 mg/ml)
Kontrollen
Scheinkontrollen	ΟμΙ	80 μΙ	20 μΙ
BB1	4μΙ	76 μΙ	20 μΙ
CDase-Transfektanten
1-1	13 μΙ	67 μΙ	20 μΙ
1-4	13 μΙ	67 μΙ	20 μΙ
2-6	13μΙ	67 μΙ	20 μΙ

Jede Transfektion wurde zweimal durchgeführt Einen Tag alte Kulturmedien wurden von den Schalen abgesaugt, und die Zellen wurden dreimal in 2 ml PBS pro Waschvorgang gewaschen. DMEM-Chlorochin-Transfektionsmedium wurden zu 1,7 ml pro Platte zugefügt, und der DNA-Cocktail wurde den Medien tropfenweise zugegeben. Die Transfektionen wurden 3 Stunden inkubiert, die Medien entfernt, die Zellen 2 Minuten lang mit FBS/10% DMSO geschockt, dreimal in serumfreien Medien gewaschen und 3 Tage in 3,5ml DMEM/10% PBS pro Platte inkubiert.

Schritt 7: Charakterisierung der rekombinanten Expressionsprodukte Platten aus Schritt 6, die für die Radioimmunausfällung (RIPS) verwendet werden sollten, wurden etwa 12 bis 16 Stunden in

frischem DMEM/10% FBS, das 200uCi/ml ^S-Methionin enthielt, inkubiert.

RIPS wurde durch Absaugen der markierten Medien nach einer InkubatSonsdauer von etwa 12 bis 16 Stunden bei 37°C, Zugabe

von 1 ml 1%igem OG-PO4RIPAE (5OmM Na₂HPO₄,1 % Nadeoxycholat, 1 % Triton X-100,0,1 % SDS, 15OmM NaCI, 5mM EDTA, 5mM EGTA, 2mM PMSF und 1 pg/ml Aprotisin=PO4-RIPAE mit Octoglucosid Ы» zu 1 %)-Puffer pro Kulturschale und 1Ominütigem Inkubieren auf Eis vorgenommen. Die Lysate wurden in 10 ml fassende Oak Ridge Zentrif ugenröhrchen gefüllt und bei 40000Upm, 4°C, 40 Minuten lang zentrifugiert. Die Überstände wurden in zwei Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis (0,4ml/ Röhrchen) gefüllt. Die BB 1-Transfektanten wurden mit 2μς pro Antikörper inkubiert, während 17,5 bzw. 31,5pg KaninchenantiCDase polyklonales Antiserum zu den anderen Transfektanten gegeben wurde. Die RIPS wurden 1 Stunde lang auf Eis inkubiert. Ziegen-Antimaus wurde als zweiter Antikörper in das BB1 -Röhrchen gegeben und 20 Minuten auf Eis inkubiert. Staphylococcus aureus (Calbiochem) wurde in 0,5 % NP-40/TES-Puffer, danach in 0,05% NP-40/TES-Puffer gewaschen (700 μΙ) und schließlich in PO4-RIPAE-Puffer mit 1 mg/mlOvalbumin (TES = 5OmMΤίβ*Η€Ι, pH7,4,1 mM EDTA, 150mM NaCI) resuspendiert. 50 ml umfassende aliquote Teile der gewaschenen StaphA-Bakterien wurden zu dem RIP-Material zugegeben und 10 Minuten auf Eis inkubiert. RIPS wurden in der Mikrozentrifuge behandelt und dreimal in 0,5 ml TNEN (2OmM Tris-HCI, pH 8,0, 10OmM NaCI, ImM EDTA, 0,5% NP-40) gewaschen. Die von den ursprünglichen 400μΙ umfassenden Duplikatproben gewonnenen Rückstände wurden entweder in 35μΙ reduzierendem oder 35μΙ nichtreduzierendem SDS-PAGE-Laufmittelpuffer resuspendiert. Proben wurden zusammen mhProteinmarkern mit geringer relativerMolekülmasse von Bio-Rad auf ein 10-20% SDS-PAGE Gradient-Gel aufgebracht und bei 300 Volt etwa 2 Stunden elektrophoretisch behandelt. Die Gele wurden 1 Stunde lang in Coomassie-Blau gefärbt, in 10% Methanol, 5% Ethansäure etwa 12 bis 16 Stunden lang entfärbt, 30 Minuten mit einem Verstärker in Kontakt gebracht, danach vor dem Trocknen (1 Stunde bei 60"C) dreimal in Wasser gewaschen. Nachdem das Gel 4 Stunden auf einen Röntgenfilm eingewirkt hatte, wurde bei den Scheinkontrollen keine 17000 Dalton-Bande, bei den BB1-Proben keine 17000 Dalton-Bande, jedoch eine spezifische Bande bei etwa 45000 Datton nachgewiesen, während alle drei Transfektanten eine spezifische Bande bei etwa 17000 Dalton aufwiesen.

2. Western-Analyse

Die jeweils zweiten Transfektionsplatten aus Schritt 6 wurden nicht markiert und nach der dreitägigen Inkubationszeit geerntet. Die Medien wurden abgesaugt, die Zellen in PBS gewaschen, danach in 0,5ml 1OmM Tris-HCI (pH8,0), die 1 μ9/τηΙ Aprotinin und 30pg/ml PMSF enthielt, suspendiert. Die Zellen wurden mittels steriler Schaber von den Schalen entfernt und in sterile Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis gefüllt. Jede Suspension wurde auf Eis beschallt (2-15see. dauernde volle Lautstärke). Die Lysate wurden zur Entfernung der Zelttrümmer 20 Minuten in einer gekühlten Mikrozentrifuge zentrifugiert, und die Überstände wurden in andere Röhrchen umgefüllt. Enzymuntersuchungen wurden wie nachfolgend beschrieben vorgenommen. Aliquote Teile dieser Lysate wurden ferner für Western-Blots genutzt, wobei polygonale Kaninchenantiseren verwendet wurden, die gegen gereinigte CDase gezüchtet worden waren. 25ml umfassende aliquote Teile der unverdünnten Transfektantlysate wurden wie für RIPS beschrieben der SDS-PAGE-Elektrophorese unterzogen, mit eier Ausnahme, daß Reihenverdünnungen des gereinigten CDase-Enzyms als Konzentrationsstandards auf das Gel aufgebracht wurden. 500 ng konzentrierte CDase/Spur wurde in Fünfer-Schritten auf 100ng, 20ng, 4 ng und O,8ng/Spur verdünnt. Das (let wurde dann nach den in dem CSH-Klonierungshandbuch enthaltenen Protokollen (Sambrook u.a. 1989) elektrophoretisch auf ein Nitrocellulosefilter übertragen. Die Blots wurden 1 Stunde in Blotto (Blotto = PBS + 1 % fettfreie Milch + 0,5% NP-40) blockiert. Frisches Blotto, das 2^g/ml polykonales Kaninchen-AntiCdase-Antiserum enthielt, wurde zum Filter zugegeben und bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Das Filter wurde dreimal 5 Minuten in Blotto gewaschen. Es folgte eine Inkubation in alkalischem Phosphatasekonjugat (Boehringer Mannheim Biochemical) das im Verhältnis 1:1000 in Blotto verdünnt war. Überschüssiges Antikörperkonjugat wurde mit drei Waschvorgängen in Blotto und einer abschließenden Wäsche in alkalischem Phosphatasesubstratpuffer (100 mM Tris-HCI, pH9,5,10OmM NaCI, 5mM MgCI₂) entfernt. Das Filter wurde danach 15 Minuten in 40ml Substratpuffer, dem 12 mg Bromochorindolylphosphat und 7mg Nhroblau-Tetrazol zur Farbentwicklung zugesetzt worden waren, inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Waschen des Filters in destilliertem Wasser gestoppt.

Nach der Farbentwicklung zeigten alle drei Transfektanten Banden, die bei etwa 17000 Dalton mit Intensitäten wanderten, die größer als der 0,8 ng Konzentrationsstandard und kleiner als der 4 ng Konzentrationsstandard für gereinigte CDase waren.

3. Aktivitätsmessungen der rekombinant exprimierten CDase

Die Umwandlung von 5-Fluorocytosin (5-FC) in 5-Fluoruracil (5-FU) wurde in Extrakten der transformierten COS-Zellen gemessen. CDase (1-1,1-4,2-6) enthaltende Transfektanten (jeweils 3x 10* Zellen), die Scheintransfektion oder die Kontroll-Plasmidtransfektion (BBD wurden in 0,5ml 1OmM TRIS-Puffer beschallt und zentrifugiert. 170μΙ Phosphat gepufferte Saline (PBS) und 30 μΙ einer 30 mM 5-FC-Lösung wurden jeweils zu 100 μΙ Überstand und 1 \iglm\ CDase-Lösung zugegeben. Das ergab ein Reaktionsgemisch von 300 μΙ mit 3mM 5-FC. Eine Kontrollumsetzung ohne Enzym wurde ebenfalls vorgenommen. Diese Röhrchen wurden 24 Stunden bei 37°C inkubiert, danach wurden 50 μΙ jeder Lösung entnommen und die Reaktion in 1 ml 0,1 N HCI gequencht. Diese Proben wurden bei 255 und 290 nm in einem UV-Spektrophotometer gemessen. Mit Hilfe der Gleichungen

(0,1191 x OD₂₉₀ - 0,02485 x OD₂₆₆) x 20 = mM 5-FC und

(0,1849 x OD₂₆₆ - 0,04907 x OD₂₉₀) X 20 = mM 5-FU

wurde die Menge 5-FC, die zu 5-FU umgewandelt worden war, gemessen. Die Einheiten der Aktivität im ursprünglichen Zellextrakt wurden dann berechnet (1 Einheit = 1 pmol/min 5-FC in 5-FU umgewandelt). Die Schein- und BB1-Transfektionen und die Reaktion ohne Enzym ergaben keine Aktivität, während alle drei CDase-Transfektanten aktiv waren. Transfektant 1-1 hatte 0,41 x 10~³ Einheiten, 1-4 hatte 0,54x 10"³ Einheiten und 2-6 hatte 0,26x 10~⁸ Einheiten. Die Kontrolluntersuchung mit 1 pg/ml CDase wandelte das gesamte 5-FC in 5-FU um. Wenn man davon ausgeht, daß reine CDase eine Aktivität von 40E/mg hat, wurden 10ng (1-1), 13,5ng (1-4) und 7,3ng (2-6) aktive CDase exprimiert. Die Proben wurden ferner in einer selbständigen Untersuchung geprüft. Jedes Reagenzglas enthielt 50μΙ Überstand oder 1 pg/ml CDase, 130μΙ PBS, 20μΙ 3OmM 5-FC und 1 pCi 1³H j 5-FC. Diese Reaktionen wurden 24 Stunden inkubiert, bis zu einem Rückstand eingedampft, der in 20 μΙ Methanol wieder

gelöst und auf Kieselgel-Dünnschichtchromatographie (TLC)-Platten getüpfelt wurde. Die Platten wurden in 96 Teilen Aceton und 4 Teilen Wasser entwickelt, wobei die H, für S-FC und 5-FU 0,2 bzw. 0,8 betrugen. Die geeigneten Teile der TLC-Platten wurden ausgeschnitten und in die Szintillationsflüssigkeit gegeben. Die Szintillationen wurden in einem Szintillationszähler gezählt, und die in jeder Probe enthaltene relative Menge S-FC und 5-FU wurde bestimmt Die Schein- und BB1 -Untersuchungen ergaben kein 5-FU, während alle Transfektanten 14% des 5-FC in 5-FU umgewandelt hatten. Umgerechnet ergibt das 0,6x 1CT³ Einheiten pro Probe, wodurch die im UV-Experiment berechneten Mengen bestätigt werden. Die Kontrollreaktion mit 1 pg/ml CDase wandelte die gesamte Menge S-FC in 5-FU um.

Die Experimente zeigen, daß CDase-Transfektanten tatsächlich aktives Enzym exprimieren. Zusammen mit der Western-Blot-Analyse weist dies darauf hin, daß die spezifische Aktivität des rekombinanten Enzyms der Aktivität des aus der Hefe isolierten Enzyms gleicht.

Folglich wurden eine thermisch stabile CDase sowie Methoden zur Reinigung und rekombinanten Produktion derselben offenbart. Obwohl bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung ausführlich beschrieben wurden, versteht es sich, daß die Beispiele zur Veranschaulichung dienen und die Erfindung nicht einschränken und daß offensichtliche Variationen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung, die in den beigefügten Patentansprüchen definiert ist, abzuweichen.

Verweisungen A. Aruff о u nd B. Seed, PNAS (USA), 84, S. 8573-8577.

F. M. Asubel u. a. (Herausg.), Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates, N.Y., 1988). Edge, Nature 292 (1981), S. 756.

C.Guthrie und J.Abelson, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression, S. 487-528

(herausg. von J. N. Strathern u.a., CSH, 1982).

Hellstrom, Monoclonal Antibodies and Cancer, S.31-47 (herausg. von Wright u.a.. Marcel Dekker, Inc. N.Y., 1984). K. E. Hellstrom und I. Hellstrom, Monoclonal Antibodies for Tumor Detecting and Drug Targeting, S. 17-51 (herausg. von Baldwin

u.a.. Academic Press, N.Y., 1985).

P. Hovland u. al. Gene 83 (1989), S. 57-64. P. L. lpata u.a.. Biochemistry 10 (1971), S.4270-4276. P.L. lpata und G.Cercignani, Meth.Enz.51 (1978), S.394-401. Jayu.a.,J.Biol.Chem.259(1984),S.6311. M.Johnston, Microbiol.Rev.51 (1887), S. 458-476. T.Katsuragi, persönliche Mitteilung (1988). T. Katsuragi u. a., Agric. Biol.Chem.50 (1986), S. 1721-1730. T.Katsuragi u.a., App.Biochem.Biotech. 16(1987),S.61-69. J.Kream und E.Chargaff, J.Amer.Chem.Soc.74 (1952). S.5157-5160. M. J. Kunitz, J.Gen.Physiol.29 (1947), S.393. N.Malik u.a., MCB 9 (1989), S.2847-2853. E. M. Mclntosh, und R. H. Haynes, MoI. Cell Bio», β (1986), S. 1711-1721. Nambair u.a.. Science 223 (1984), S. 1299. I. Nishiyama u.a.. Cancer Res.45 (1985), S. 1735-1761.

G. A. O'Donovan und J. Neuhard, Bart. Rev.34 (1970), S.278-343. T.Sakai u.a., J.Biotech.2 (1985), S.13-21.

T.Sakai u.a.. Nature 324 (1986), S. 163. T. Sakai u. a.. Science 239 (1988), S. 487-491. J.Sambrooku.a., Molecular Cloning: A Loboratory Manual, 2. AufIg. (1989) (CSH Press). Scharf u. a.. Science 233 (1986), S. 1076. R. K. Scopes, Protein Purification Principles and Practice, 2. Aufig. (Springer-Verlag 1987). P.D. Senter u.a., (1987) US Patentanmeldg. 081382. Stamenkovic, 1990 (erscheint demnächst). H. M. Steinman, J.Biol.Chem.255 (1980), S. 6758-6765. T.P. West u.a. Biochem.Biophys.Acta 719 (1982), S.251-258. S.Yergatian u.a. Experientia 33 (1977), S. 1570-1571. C. Y. Yeung u. a., J. Biol. Chem.260 (1985), S. 10299-10307.

Claims

1. Isolierte Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine thermisch stabile Cytosindeaminase oder ein derselben funktionell gleichwertiges Protein codiert.

2. Nucleotidsequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz im wesentlichen wie in Figur 10 dargestellt ist.

3. Rekombinanter Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er die Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 oder 2 umfaßt und ihre Expression bewirkt.

4. Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleotidsequenz an Kontrollsequenzen, die mit einer Wirtszelle kompatibel sind, operabel gebunden ist.

5. Wirtszellen, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit dem rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 4 transformiert sind.

6. Verfahren zur Produktion rekombinanter, thermisch stabiler Cytosin-deaminase oder eines derselben funktionell gleichwertigen Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß es die Züchtung von Wirtszellen nach Anspruch 5 umfaßt.

7. Isolierte, thermisch stabile Cytosin-deaminase oder ein Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es derselben funktionell gleichwertig ist.

8. Cytosin-deaminase nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie die in Figur 6 oder 10 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz umfaßt, die derselben im wesentlichen homolog und funktionell gleichwertig ist.

9. Cytosin-deaminase nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Hefe isoliert wird. 10. Thermisch stabile Cytosin-deaminase, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Saccharomyces cerevisiae isoliert wird.

Hierzu 10 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft im allgemeinen das Enzym Cytosin-deaminase. Im besonderen betrifft die Erfindung die Reinigung und rekombinante Produktion einer thermisch stabilen Cytosin-deaminase aus Saccharomyces cerevisiae.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Cytosin-deaminase (CDase, EC 3.5.4.1.) katalysiert die Hydrolyse von Cytosin zu Uracil durch folgende Reaktion:

NH₂ O

L Cytosin-deaminase И

N^ ^CH *~~ HN^ ^CH

H ^H2O NH₃ g

Cytosin Uracil

(4-Amino-2-oxopyrimidin) (2,4-Dioxopyrimidin)

Das Enzym, das im mikrobiellen Pyrimidinstoffwechsel eine wichtige Rolle spielt (D-Donovan und Neuhard, 1970), wurde aus mehreren verschiedenartigen Mikroorganismen isoliert, scheint in Säugetierzellen jedoch nicht vorhanden zu sein (Nishiyamam

Es wurde nachgewiesen, daß die physikalischen Eigenschaften der CDase aus verschiedenen Organismen hinsichtlich der relativen Molekülmasse, Stabilität und der Zusammensetzung der Untereinheiten stark differieren. So wurde z.B. CDase aus Salmonella typhimurium bis zur Homogenität (mittels SDS-PAGE) gereinigt; sie besteht aus 4 Untereinheiten von jeweils 54 Kilodalton (kDA) (West u.a., 1982), während das Enzym aus Escherichia coti eine relative Molekülmasse von 200 kDA aufweist und aus Untereinheiten von 35 und 46kDA besteht (Katsuragi u.a., 1986). Beide Enzyme weisen hohe thermische Stabilität auf und sind noch bei 55⁰C sehr aktiv.

Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) wurde ebenfalls als CDase-Quelle genutzt. In der Vergangenheit aus Bäckerhefe gewonnene CDase hat eine- durch Gelfiltration bestimmte- relative Molekülmasse von 34 kDa (Ipata u. a., 1971,1978) bzw. von

32-33 kDA, wenn sie mittels SOS-PAGE und Aminosäureanalyse (Yergatian, u.a., 1877) bestimmt wurde. Bei dem in der Vergangenheit aus Bäckerhefe isolierten Enzym CDase scheint es sich folglich um ein monomeres Protein zu handeln. Lösungen von in der Vergangenheit aus Bäckerhefe isolierter CDase behalten mindestens 48 Stunden lang ihre Aktivität, wenn sie bei pH-Werten zwischen S und 9 und 4°C gelagert werden (Ipata u. a. 1971,1987). Es wurde jedoch nachgewiesen, daß ein CDase-Rohpräparat aus Bäckerhefe bei 37°C innerhalb einer Stunde die Hälfteeeiner Aktivität verliert (Kream und Chargaff, 1952) und eine gereinigte Form des Enzyms eine Halbwertszeit von 30 min hat (Katsuragi, 1988). Die Halbwertszeit bei 37 °C kann bis zu 28 Tagen verlängert werden, wenn das Enzym auf Epoxidacrylkugeln immobilisiert wird (Katsuragi u.a., 1987). Folglich unterscheidet sich die aus Bäckerhefe gewonnene CDase durch ihre thermische Instabilität sowie ihre geringe Molekülmasse von den an anderer Stelle beschriebenen bakteriellen Enzymen.

CDase wurde zu therapeutischen Zwecken zur Umwandlung des als Medikamentenvorstufe geltenden 5-Fluorocytosins (5-FC) zu dem zur Krebsbehandlung dienenden 5-Fluoruracil (5-FU) (Katsuragi u.a., 1987; Nishiyama u.a., 1985; Sakai u.a., 1985; Senter u.a., 1987) genutzt. Für eine derartige Verwendung sind jedoch die bakteriellen Quellen unpraktisch, da sie zur Gewinnung einer hinreichenden Aktivität eine Kultivierung in großen Mengen erfordern (Sakai u.a., 1985). Ferner können Mikrobenextrakte bei den Empfängern solcher Produkte unerwünschte Nebenwirkungen auslösen.

Zur Überwindung dieser Probleme kann Hefe als CDase-Quelle genutzt werden. Die thermische Instabilität des aus der Hefe gewonnenen Produktes erfordert jedoch die Immobilisierung des Enzyms vor seiner Verwendung (Katsuragi u.a. 1987). Folglich macht die Isolierung und Reinigung einer thermisch stabilen Hefe-CDase ein verbessertes Enzym, das in der Krebstherapie eingesetzt werden kann, verfügbar. Darüber hinaus ermöglicht die Klonierung des Gens für thermisch stabile CDase aus Hefe definierte Veränderungen und Additionen an dem Gen selbst, den seine Expression kontrollierenden Sequenzen sowie Genfusionen zwischen dem Gen und anderen Molekülen. Solche neuartigen Konstrukte erhöhen die Wirksamkeit oder den Nutzen des Enzyms in der Krebstherapie.