ES2609685T7 - Purina nucleósido fosforilasa como activador enzimático de profármacos de nucleósidos - Google Patents

Purina nucleósido fosforilasa como activador enzimático de profármacos de nucleósidos Download PDF

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Description

DESCRIPCION
Purina nucleosido fosforilasa como activador enzimatico de profarmacos de nucleosidos
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional estadounidense con numero de serie 61/089.235 presentada el 15 de agosto de 2008 y la solicitud provisional estadounidense con numero de serie 61/225.012 presentada el 13 de julio de 2009.
Referencia de subvencion
La investigacion llevada a cabo en relacion con esta invencion estuvo apoyada en parte por la subvencion CA119170 de los National Institutes of Health.
Campo de la invencion
La invencion se refiere a purina nucleosido fosforilasas de Trichomonas vaginalis silvestres y mutantes con cola como activador enzimatico para sustratos de profarmaco y en particular a sustratos de profarmaco tales como 9-(P-D-arabinofuranosil)-2-fluoroadenina (F-araA, fludarabina) y 2-Cl-2'-desoxiadenosina (Cl-dAdo, cladribina).
Antecedentes de la invencion
Una estrategia de activacion de profarmacos para alterar selectivamente celulas tumorales implica la expresion de un gen que codifica para una enzima exogena en las celulas tumorales y la administracion de un sustrato para esa enzima. La enzima actua sobre el sustrato generando una sustancia toxica para las celulas tumorales seleccionadas como diana. Esta tecnica tiene ventajas sobre la expresion de genes directamente toxicos, tales como ricina, toxina difterica o exotoxina de Pseudomonas. Estas ventajas incluyen la capacidad de: 1) valorar la alteracion celular; 2) optimizar el mdice terapeutico ajustando o bien los niveles de profarmaco o bien de expresion de enzima recombinante; y 3) interrumpir la toxicidad omitiendo la administracion del profarmaco. Ademas, esta tecnica usa profarmacos con diferentes efectos sobre diferentes tipos de celulas, permitiendo que se ajuste el tratamiento segun un estado patologico espedfico.
Se han descrito enzimas utiles en un enfoque de activacion de profarmacos e incluyen enzimas tales como timidina cinasa, citosina desaminasa y purina nucleosido fosforilasa (PNP), tal como se describe en las patentes estadounidenses n.os 5.338.678; 5.552.311; 6.017.896 y 6.207.150. Sin embargo, la eficacia del tratamiento tumoral usando tecnicas de activacion de profarmacos es limitada en casos en los que estan presentes efectos secundarios de la administracion del sustrato. Por ejemplo, el profarmaco ganciclovir, usado a menudo en combinacion con timidina cinasa, puede provocar efectos inmunosupresores no deseados.
La busqueda de una purina nucleosido fosforilasa particular con actividad de escision para el importante agente quimioterapico F-araA no ha tenido exito anteriormente debido en parte al gran numero de candidatos a PNP que era necesario investigar y las dificultades que rodeaban al aislamiento y la expresion de cada PNP. Muchos microorganismos generan PNP que pueden escindir nucleosidos que contienen adenina para dar adenina. Para ilustrar, hay al menos 17 microorganismos solos que se notifica que expresan PNP incluyendo: Leishmania donovani; Trichomonas vaginalis; Trypanosoma cruzi; Schistosoma mansoni; Leishmania tropica; Crithidia fasciculata; Aspergillis y Penicillium; Erwinia carotovora; Helix pomatia; Ophiodon elongates (bacalao largo); E. coli, Salmonella typhimurium; Bacillus subtilis; Clostridium; micoplasmas; Trypanosoma gambiense; y Trypanosoma brucei.
Por tanto, existe la necesidad de un metodo de activacion de profarmacos para tratar tumores que mejore la eficacia y supere el problema de los efectos secundarios.
Sumario
Se proporciona un procedimiento para inhibir una celula cancerosa proporcionando una enzima purina nucleosido fosforilasa de Trichomonas vaginalis (tmTv-PNP) silvestre en proximidad a la celula cancerosa y exponiendo la enzima a un sustrato escindido por la enzima para producir un analogo de purina citotoxico, siendo el sustrato fludarabina, cladribina, analogo de cordicepina, analogo de 2',3'-didesoxiadenosina, 5'-metil(talo)-6-metilpurinaribosido, 5'-metil(talo)-2'-desoxi-6-metilpurina-ribosido, 5'-metil(alo)-6-metilpurina-ribosido, 2-F-5'-desoxiadenosina o 2-F-a -L-lixo-adenina. La enzima tmTv-PNP se proporciona mediante expresion en la celula cancerosa, o una celula proxima a la misma, o es a traves de la administracion de la enzima proxima a la celula diana. Las enzimas purina nucleosido fosforilasa mutantes con cola (tm-PNP) derivadas de diversos organismos tambien se proporcionan como composiciones novedosas operativas en el presente documento para la inhibicion de celulas cancerosas. El termino “Tv-PNP” tal como se usa en el presente documento se refiere a purina nucleosido fosforilasa de Trichomonas vaginalis silvestre.
Se proporciona un kit comercial para inhibir una celula cancerosa de mairnfero que incluye una enzima tm-PNP o un vector que contiene una secuencia de ADN que puede expresarse en la celula cancerosa y que codifica para una enzima tm-PNP, o una combinacion de las mismas; y un sustrato de fludarabina, cladribina, analogo de cordicepina, analogo de 2',3'-didesoxiadenosina, 5'-metil(talo)-6-metil-purina-ribosido, 5'-metil(talo)-2'-desoxi-6-metilpurinaribosido, 5'-metil(alo)-6-metilpurina-ribosido, 2-F-5'-desoxiadenosina, o 2-F-a -L-lixo-adenina, o una combinacion de tales sustratos.
Tambien se proporciona una composicion de lisado de celulas diana, tm-PNP y un profarmaco que cuando se escinde por una tm-PNP produce un analogo de purina de producto de escision citotoxico. Esta composicion es particularmente util en la direccion de terapias posteriores.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 representa los parametros cineticos de F-araA con PNP y Tv-PNP de E. coli;
la figura 2 representa la eficacia de F-araAMP (un profarmaco o F-araA) frente a xenoinjertos de tumor en ratones en los que solo el 10% de las celulas expresan Tv-PNP;
la figura 3 es un mapa de sitios de restriccion de un clon de vector de la invencion indicado como pCR4blunt-TvPNP; la figura 4 es un mapa de sitios de restriccion de un vector de adenovirus de la invencion que expresa Tv-PNP indicado como pACCMV-TvPNP y que incluye el clon de la figura 3;
la figura 5 es un mapa de sitios de restriccion de un vector de lentivirus de la invencion que expresa Tv-PNP con coexpresion de EGFP e indicado como pWPI(+)-TvPNP y que incluye el clon de la figura 3;
la figura 6 es un mapa de sitios de restriccion de un vector de lentivirus de la invencion que expresa Tv-PNP sin coexpresion de EGFP e indicado como pHR'CMV-TvPNP y que incluye el clon de la figura 3;
la figura 7 es una secuencia de nucleotidos de tm-PNP expresable en adenovirus que se mapea en relacion con una E. coli silvestre; y
la figura 8 es una secuencia de aminoacidos de tm-PNP codificada por la secuencia de nucleotidos de la figura 7 que muestra la adicion de la cola resultante.
Descripcion detallada de las realizaciones preferidas
El sujeto de la presente invencion es una purina nucleosido fosforilasa aislada de T. vaginalis. Las purina nucleosido fosforilasas y nucleosido hidrolasas estan presentes en diversos organismos incluyendo de manera ilustrativa mairnferos tales como seres humanos, y microorganismos, tales como Leishmania donovani; Trichomonas vaginalis; Trypanosoma cruzi; Schistosoma mansoni; Leishmania tropica; Crithidia fasciculata; Aspergillis y Penicillium; Erwinia carotovora; Helix pomatia; Ophiodon elongates; Salmonella typhimurium; Bacillus subtilis; Clostridium; micoplasmas; Trypanosoma gambiense; Trypanosoma brucei; Sulfolobus solfataricus; y E. coli.
Una nucleosido fosforilasa cataliza la reaccion: purina nucleosido PO4 ^ ribosa-1-PO4 (o desoxirribosa-1-fosfato) base de purina. La presente invencion proporciona secuencias de nucleotidos y secuencias de aminoacidos que codifican para enzimas de escision de purinas de tm-PNP que tienen una actividad biologica sorprendentemente superior en la escision de sustratos espedficos en comparacion con enzimas PNP silvestres relacionadas estructuralmente de otros organismos y la secuencia silvestre de la que se deriva la enzima de mutacion con cola, respectivamente.
El termino “actividad biologica” tal como se usa en el presente documento pretende significar una medicion de la cantidad de producto final producido por la reaccion de una cantidad especificada de una enzima de escision de purina en presencia de un sustrato en un periodo de tiempo medido mediante un metodo apropiado tal como se muestra en el ejemplo 2.
Un compuesto que es un sustrato para la enzima para producir un analogo de purina citotoxico que altera el metabolismo, la funcion o la replicacion de una celula se denomina en el presente documento de manera intercambiable “profarmaco” o “sustrato.”
El termino “infeccion viral patogena” tal como se usa en el presente documento pretende significar infeccion por un virus que provoca una enfermedad o efectos patologicos.
El termino “farmaceuticamente aceptable” tal como se usa el presente documento pretende significar un material que no es biologicamente o de otra forma no deseado, que puede administrarse a un individuo sin provocar efectos biologicos no deseados significativos o interaccionar de una manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composicion farmaceutica en la que esta contenido.
Segun la presente divulgacion la escision de un profarmaco por Tv-PNP o tm-PNP produce un analogo de purina citotoxico que inhibe una celula diana cancerosa (o infectada viralmente). Se aprecia que no es necesario que el analogo de purina citotoxico se genere dentro de la celula cancerosa y en su lugar existe un efecto inespedfico en el que el analogo de purina citotoxico generado dentro de una celula tumoral puede desplazarse a celulas tumorales vecinas y producir su destruccion. La concentracion de analogo de purina citotoxico necesaria para inhibir una celula diana cancerosa o infectada viralmente depende de factores que incluyen la identidad del analogo de purina citotoxico, la velocidad de intercambio de fluido intercelular, la velocidad de transporte por la membrana de analogo de purina citotoxico celular, y las velocidades de incorporacion en el ADN o ARN, y su eficacia como inhibidor de la smtesis de protema.
Tv-PNP o tm-PNP es operativa para inhibir celulas diana infectadas viralmente o cancerosas de mairnfero in vitro o in vivo y en un sujeto humano o no humano. Tv-PNP o tm-PNP se suministra in vivo mediante cualquiera de los procedimientos detallados en la patente estadounidense n.° 6.958.318 B2 como sustituto para la PNP de E. coli descrita en la misma. Estos procedimientos de suministro incluyen de manera ilustrativa vectores virales recombinantes; vectores bacterianos de Clostridium, Salmonella y E. coli; liposomas conjugados con anticuerpos; reintroduccion de celulas del sujeto modificadas geneticamente para expresar la enzima Tv-PNP o tm-PNP; lipofeccion; virus tales como retrovirus, adenovirus, virus del herpes, virus del sarampion, virus adenoasociados, o un vacuvirus; e inyeccion directa de la enzima Tv-PNP o tm-PNP en proximidad a la celula cancerosa de mai^ero. La presente divulgacion proporciona un metodo de al menos inhibir, y normalmente destruir celulas de marnffero que se replican o que no se replican, transfectadas o transducidas y celulas inespedficas a traves de las siguientes etapas: (a) transfectar o transducir celulas de mamffero seleccionadas como diana con un acido nucleico que codifica para una Tv-PNP o tm-PNP o proporcionar tal enzima directamente en proximidad a las celulas seleccionadas como diana; y (b) poner en contacto las celulas seleccionadas como diana que expresan o que estan dotadas de la enzima de escision Tv-PNP con un sustrato para la enzima para producir una base de purina toxica en cantidades mayores que las producidas por PNP de E. coli con sustitucion o silvestre y otras PNP destruyendo de ese modo las celulas seleccionadas como diana y tambien celulas inespedficas que no expresan o no contienen la enzima de escision. Por tanto, en presencia de sustrato, la enzima de escision Tv-PNP o tm-PNP produce un producto toxico. La operacion de la invencion puede producirse in vitro o in vivo, con celulas de mamffero humano o no humano u otras celulas.
Como se usa en el presente documento el termino “inhibir” es una alteracion de una actividad fisiologica normal. Espedficamente, inhibir se define como lisar, reducir la proliferacion, reducir el crecimiento, aumentar o disminuir la expresion o la velocidad de degradacion de un gen, ARN, protema, lfpido u otro metabolito, inducir apoptosis u otros mecanismos de muerte celular, o aumentar, disminuir o alterar de otra forma la funcion de una protema o acido nucleico.
En un aspecto de la presente divulgacion la enzima Tv-PNP o tm-PNP se proporciona dirigiendo la enzima a las celulas. Mas preferiblemente, la enzima Tv-PNP o tm-PNP se dirige a las celulas conjugando la enzima a un anticuerpo.
La enzima puede estar codificada por un gen proporcionado a las celulas. Por ejemplo, el gen proporcionado a las celulas codifica para Tv-PNP o tm-PNP y esta operativamente unido a un promotor de gen de tirosinasa. Alternativamente, el gen se proporciona en una molecula portadora tal como pelmulas polimericas, geles, micropartmulas y liposomas.
En otra divulgacion la presente divulgacion proporciona un metodo de al menos inhibir, y normalmente destruir mediante lisis tanto celulas de mamffero seleccionadas como diana que se replican o que no se replican como celulas inespedficas. El procedimiento incluye las etapas de: (a) suministrar la Tv-PNP o tm-PNP a las celulas de mamffero seleccionadas como diana; y (b) poner en contacto las celulas seleccionadas como diana con una cantidad eficaz de un sustrato de nucleosido para la Tv-PNP o tm-PNP, en el que el sustrato es relativamente no toxico para celulas de mamffero y se escinde por Tv-PNP o tm-PNP para producir una base de purina que es toxica para las celulas de mamffero seleccionadas como diana y celulas inespedficas en proximidad a las mismas y en una cantidad mayor que la proporcionada por PNP de E. coli mutante por sustitucion o silvestre. Los ejemplos representativos de sustratos de analogo de purina incluyen fludarabina, cladribina, analogo de cordicepina, analogo de 2',3'-didesoxiadenosina, 5'-metil(talo)-6-metilpurina-ribosido, 5'-metil(talo)-2'-desoxi-6-metilpurina-ribosido, 5'-metil(alo)-6-metilpurina-ribosido, 2-F-5'-desoxiadenosina o 2-F-a -L-lixo-adenina.
La presente divulgacion tambien proporciona una composicion para destruir celulas de marnffero seleccionadas como diana, que incluye: (a) una enzima Tv-PNP o tm-PNP que escinde un sustrato de purina nucleosido; y (b) una cantidad del sustrato de purina nucleosido eficaz para destruir las celulas seleccionadas como diana cuando se escinden por la enzima.
La presente divulgacion tambien se refiere a un vector que contiene una secuencia de ADN que codifica para una protema Tv-PNP o tm-PNP en donde el vector puede replicarse en un huesped y que incluye en union operativa: a) un origen de replicacion; b) un promotor; y c) una secuencia de ADN que codifica para dicha protema Tv-PNP o tm-PNP. Preferiblemente, el vector es un vector retroviral, un vector adenoviral, un vector viral adenoasociado, un vector de herpes, un vacuvirus, un vector viral o un plasmido.
La presente divulgacion tambien se refiere a una celula huesped transfectada con el vector de la presente invencion de modo que el vector expresa una protema Tv-PNP o tm-PNP. Preferiblemente, tales celulas huesped se seleccionan del grupo que consiste en celulas bacterianas, celulas de mairnfero y celulas de insecto.
Se aprecia en el metodo que una celula huesped se transfecta o transduce opcionalmente con un vector ex vivo o in vitro y posteriormente se administra a un paciente, preferiblemente en o cerca de un sitio tumoral o ubicacion de infeccion viral. Opcionalmente, se suministra una celula de manera sistemica.
Algunos de los procedimientos y las composiciones ejemplificadas en el presente documento implican transfectar celulas con el gen de Tv-PNP o tm-PNP y posteriormente tratar con un profarmaco de purina nucleosido no toxico comparativo que se convierte en un analogo de purina toxico. Un profarmaco particularmente preferido es F-araA, pero se aprecia que otros profarmacos tambien son operativos en la presente invencion.
Tv-PNP o tm-PNP difiere de PNP humana en su aceptacion mas eficaz de adenina y determinados analogos de nucleosidos que contienen guanina como sustratos y se muestra en el presente documento que es sorprendentemente eficaz en la escision de sustratos particulares en comparacion con PNP estructuralmente similares de diferentes ongenes bacterianos y parasitos. PNP expresada en celulas tumorales escinde el nucleosido, liberando un analogo de purina toxico. Los analogos de purina difunden libremente a traves de las membranas celulares en comparacion con monofosfatos de nucleosido tales como los generados usando HSV Thd cinasa que generalmente permanecen dentro de la celula en la que se forman. Un analogo de adenina toxico formado tras la conversion por Tv-PNP o tm-PNP puede convertirse mediante la adenina fosforibosil transferasa en nucleotidos toxicos y destruir todas las celulas transfectadas, y difundir fuera de la celula y destruir las celulas circundantes que no se transfectaron (celulas inespedficas).
La composicion tiene utilidad como sistema biologicamente funcional que puede funcionar para producir destruccion tal como destruccion lttica de una celula infectada viralmente o cancerosa diana. De manera ilustrativa, la composicion y el metodo de la invencion usan la accion enzimatica de Tv-PNP sobre un profarmaco para producir un analogo de purina citotoxico que puede transitar por la membrana celular y provocar lisis celular. A modo de ejemplo, una composicion de este tipo proporciona informacion como el numero de copias de enzimas Tv-PNP o tm-PNP presentes por volumen unitario, mientras que la razon molar de profarmaco: producto de escision citotoxico a partir de la misma es indicativa de la cinetica de la actividad. Estos resultados de ensayo se obtienen facilmente mediante HPLC convencional u otros ensayos. Para celulas diana tumorales, estos resultados cuando se acoplan con barridos de masa tumoral diferenciados en el tiempo proporcionan datos inestimables en cuanto a la naturaleza de los tratamientos posteriores con Tv-PNP o tm-PNP, tratamiento quimioterapico, quirurgico o de adjunto, o una combinacion de los mismos.
Regulacion transcripcional de la secuencia que codifica para PNP
En un aspecto preferido, Tv-PNP o tm-PNP se codifica en un gen procariota de manera que la expresion de la Tv-PNP o tm-PNP en celulas de marnffero se logra mediante la presencia de una secuencia reguladora transcripcional eucariota unida a las secuencias que codifican para PNP. El gen de Tv-PNP o tm-PNP puede expresarse de manera ilustrativa bajo el control de elementos promotores/potenciadores constitutivos fuertes que se obtienen dentro de plasmidos comerciales (por ejemplo, el promotor/potenciador temprano de SV40 (pSVK30 Pharmacia, Piscataway, NJ), repeticion terminal larga del virus del sarcoma murino de Moloney (pBPV, Pharmacia), repeticion terminal larga del virus de tumor mamario de raton (pMSG, Pharmacia), y el promotor/potenciador temprano de citomegalovirus (pCMVp , Clontech, Palo Alto, CA).
Tambien pueden seleccionarse como diana poblaciones de celulas para su inhibicion o destruccion usando secuencias reguladoras de la transcripcion geneticas que restringen la expresion de la secuencia que codifica para Tv-PNP o tm-PNP a determinados tipos de celulas, una estrategia que se denomina seleccion como diana de la transcripcion. Una secuencia reguladora candidata para la seleccion como diana de la transcripcion satisface preferiblemente dos criterios importantes tal como se establece mediante experimentacion: (i) la secuencia reguladora dirige una expresion genica suficiente para dar como resultado la produccion de enzima en cantidades terapeuticas en celulas seleccionadas como diana, y (ii) la secuencia reguladora no dirige la produccion de cantidades suficientes de enzima en celulas no seleccionadas como diana para alterar el enfoque terapeutico. En esta forma de seleccion como diana las secuencias reguladoras estan unidas funcionalmente con las secuencias de Tv-PNP para producir un gen que se activa solo en las celulas que expresan el gen a partir del que se derivaron las secuencias reguladoras. Las secuencias reguladoras que se ha mostrado que cumplen los criterios para la seleccion como diana de la transcripcion en terapia genica incluyen secuencias reguladoras de los genes de inhibidor de leucoproteasa secretora, protema tensioactiva A y a -fetoprotema. Una variacion de esta estrategia es utilizar secuencias reguladoras que confieren “capacidad de induccion” de modo que la administracion local del inductor conduce a expresion genica local. Como ejemplo de esta estrategia, se han descrito secuencias inducidas por radiacion y se han propugnado para aplicaciones de terapia genica (Weichselbaum, et al., Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., 24:565-567 (1992)) y son operativas en el presente documento.
Potenciadores/promotores espedficos de tejido son operativos en la direccion de la expresion de Tv-PNP o tm-PNP, y de ese modo la toxicidad mediada por Tv-PNP o tm-PNP, a tejidos espedficos. Por ejemplo, secuencias reguladoras geneticas de tirosinasa humana son suficientes para dirigir la toxicidad de Tv-PNP o tm-PNP a celulas de melanoma maligno. Secuencias de tirosinasa de raton a partir de la region flanqueante en 5 prima (-769 pb desde el sitio de inicio de la transcripcion) del gen pueden dirigir la expresion del gen indicador a celulas de melanoma maligno. Aunque las secuencias de tirosinasa humana y de raton en la region flanqueante en 5 prima son similares, Shibata et al., Journal of Biological Chemistry, 267:20584-20588 (1992) mostraron que las secuencias flanqueantes en 5 prima humanas en la misma region usada por Vile y Hart (-616 pb desde el sitio de inicio de la transcripcion) no confenan expresion espedfica de tejido. Aunque Shibata et al. sugirieron que la region flanqueante en 5 prima no sena util para dirigir la expresion genica a celulas que expresan tirosinasa (melanomas o melanocitos), un fragmento en el sentido de 5' ligeramente diferente al usado por Shibata et al. puede dirigir de hecho la expresion genica de PNP de E. coli o indicador espedficamente a celulas de melanoma, tal como se muestra en la patente estadounidense n.° 6.017.896, figura 3 y funciona asimismo con Tv-PNP o tm-PNP.
Por tanto, secuencias de tirosinasa humana son utiles para dirigir la expresion de Tv-PNP o tm-PNP a celulas de melanoma humanas. Estas mismas secuencias son utiles para dirigir otra expresion genica terapeutica en celulas de melanoma o melanocitos. Pueden usarse otros elementos o secuencias reguladoras geneticas espedficas de tejido para dirigir la expresion de un gen que codifica para una enzima de escision de nucleosido de analogo de purina adecuada a tipos de celulas espedficos distintos de melanomas.
Suministro del gen de Tv-PNP o tm-PNP
Se proporcionan la construccion de virus recombinantes adecuados y el uso de adenovirus para la transferencia de Tv-PNP o tm-PNP dentro de celulas de mairnfero. Tambien puede usarse suministro genico no viral. Los ejemplos incluyen difusion de ADN en ausencia de cualquier portador o estabilizador (“ADN desnudo”), ADN en presencia de portadores o estabilizadores farmacologicos (“ADN formulado”), ADN complejado con protemas que facilitan la entrada en la celula (“conjugados moleculares”), o ADN complejado con lfpidos. El uso de suministro mediado por lfpidos del gen de PNP bacteriano a celulas de mam^era se ejemplifica en el presente documento. Mas particularmente, se demuestra la transferencia mediada por liposomas cationicos de un plasmido que contiene un gen de PNP no humano. Otros metodos de transferencia genica son tambien generalmente aplicables debido a que el metodo particular para transferir el gen de Tv-PNP a una celula no es el unico determinante del exito de la inhibicion de celulas diana. Por tanto, tambien puede usarse transduccion genica utilizando un vector de transferencia derivado de virus, descrito adicionalmente a continuacion. Tales metodos se conocen bien y pueden adaptarse facilmente para su uso en las terapias de toxinas mediadas por genes descritas en el presente documento.
El metodo de suministro del gen de Tv-PNP o tm-PNP depende de su forma, y un metodo adecuado resultara evidente para un experto en la tecnica. Tales metodos incluyen de manera ilustrativa administracion mediante inyeccion, transformacion biolfstica y lipofeccion. El uso de suministro mediado por lfpidos del gen de PNP a celulas de mamffero se ejemplifica en el presente documento. Mas particularmente, se demuestra la transferencia mediada por liposomas cationicos de un plasmido que contiene un gen de PNP no humano. Sin embargo, tambien podran aplicarse otros metodos de transferencia genica debido a que el metodo particular para transferir el gen de PNP a una celula no es el unico determinante del exito de la alteracion de celulas tumorales. Por tanto, tambien puede usarse transduccion genica, utilizando un vector de transferencia derivado de virus, descrito adicionalmente a continuacion. Tales metodos se conocen bien y pueden adaptarse facilmente para su uso en las terapias de toxinas mediadas por genes descritas en el presente documento. Ademas, estos metodos pueden usarse para seleccionar como diana determinadas enfermedades y poblaciones de celulas usando las caractensticas de direccionamiento de un portador particular del gen que codifica para una enzima de escision de nucleosido de analogo de purina adecuada tal como Tv-PNP o tm-PNP.
Se han usado bacterias anaerobias apatogenas para suministrar selectivamente genes foraneos al interior de celulas tumorales. Por ejemplo, esporas de Clostridium acetobutilicum inyectadas por via intravenosa en ratones que llevan tumores germinaron solo en las zonas necroticas de tumores que teman una baja tension de oxfgeno. Usando el ensayo para la actividad de PNP descrito a continuacion, se encontro que Clostridium perfringens presentaba una actividad enzimatica que podfa convertir MeP-dR en MeP. Este hallazgo sugiere un mecanismo para expresar selectivamente la actividad de PNP en masas tumorales con centros necroticos, anaerobios. Por tanto, pueden infectarse tumores con cepas de Clostridium que expresan Tv-PNP o tm-PNP y luego exponerse a un sustrato apropiado, tal como fludarabina. La actividad de PNP de las bacterias Clostridium que crecen en el centro anaerobio del tejido tumoral convierte entonces el sustrato en un analogo de purina toxico, que entonces se libera localmente alterando las celulas tumorales. Adicionalmente, pueden usarse opcionalmente otras bacterias incluyendo E. coli y Salmonella para suministrar un gen de Tv-PNP o tm-PNP al interior de tumores.
Otros sistemas de suministro que pueden funcionar en la presente divulgacion incluyen de manera ilustrativa vehfculos tales como liposomas “furtivos” y otros liposomas conjugados con anticuerpos (incluyendo direccionamiento de farmacos mediado por lfpidos a carcinoma colonico), direccionamiento mediado por receptor de ADN a traves de ligandos espedficos de celulas, direccionamiento tumoral dirigido por linfocitos y direccionamiento retroviral terapeutico altamente espedfico de celulas de glioma murino in vivo. (S.K. Huang et al., Cancer Research, 52:6774-6781 (1992); R.J. Debs et al., Am. Rev. Respir. Dis., 135:731-737 (1987); K. Maruyama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5744-5748 (1990); P. Pinnaduwage y L. Huang, Biochemistry, 31:2850-2855 (1992); A. Gabizon y Papahadjopoulas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:6949-6953 (1988); S. Rosenberg et al., New England J. Med., 323:570-578 (1990); K. Culver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3155-3159 (1991); G.Y. Wu y C.H. Wu, J. Biol. Chem., 263, No. 29:14621-14624 (1988); Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414 (1990); Curiel et al., Human Gene Ther., 3:147-154 (1992); Litzinger, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187 (1992); Trubetskoy et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1131:311-313 (1992)). El presente enfoque, dentro del contexto de un mecanismo de direccionamiento genico o bien dirigido a celulas tumorales en division o bien a la neovascularizacion tumoral, ofrece una tecnologfa mejorada mediante la cual puede establecerse un pequeno subconjunto de celulas tumorales dentro de una masa tumoral en crecimiento, lo que mediana en la necrosis e involucion tumoral rapida tras la senal apropiada, tal como tras la administracion del profarmaco de sustrato para una enzima de escision de nucleosido de analogo de purina de T. vaginalis o tm-PNP presente en, o proxima a, las celulas diana.
Metodos de tratamiento
El metodo de tratamiento incluye de manera ilustrativa transfectar o administrar de otra forma un gen de tm-PNP de la invencion a celulas junto con la exposicion de las celulas con el gen de tm-PNP o protema a un sustrato apropiado. El sustrato se convierte en un analogo de purina toxico que inhibe o destruye las celulas que expresan el gen de tm-PNP asf como las celulas inespedficas en las proximidades de las celulas que expresan el gen de tm-PNP, dependiendo de la concentracion de analogo de purina citotoxico. El gen de tm-PNP se administra de manera ilustrativa directamente a las celulas seleccionadas como diana o de manera sistemica en combinacion con una composicion de direccionamiento, tal como a traves de la seleccion de un vector viral o formulacion de suministro particular. Las celulas se tratan preferiblemente in vivo, dentro del paciente que va a tratarse, o se tratan in vitro, luego se inyectan en el paciente. Tras la introduccion del gen de tm-PNP en las celulas en el paciente, se administra el profarmaco, de manera sistemica o local, en una cantidad eficaz para convertirse mediante la tm-PNP en un analogo de purina citotoxico en relacion con celulas seleccionadas como diana. Se aprecia que el profarmaco se suministra opcionalmente antes de, junto con, o posteriormente a la administracion de la tm-PNP de la invencion. Preferiblemente, el profarmaco se administra posteriormente a la administracion de la tm-PNP.
Debido a las dificultades en la transfeccion de grandes numeros de celulas dianas o la administracion de enzima tm-PNP, la cinetica de escision de esta enzima en relacion con otras PNP proporciona resultados terapeuticos sorprendentemente beneficiosos con sustratos de importancia clmica tales como F-araA.
Tratamiento de tumores
El gen de tm-PNP se usa opcionalmente como parte de una estrategia para tratar tumores solidos metastasicos, tales como melanoma, carcinoma pancreatico, de tngado o colonico. En este metodo, se usa opcionalmente ADN de plasmido que contiene un gen de tm-PNP bajo el control de promotores espedficos de tumor. Por ejemplo, el promotor de tirosinasa es altamente espedfico para mediar en la expresion en celulas de melanoma y no conduce a expresion genica en la mayona de los tipos de tejido. El gen de tm-PNP bajo el control regulador de este promotor se activa predominantemente dentro de un tumor de melanoma y no en otra parte dentro de un paciente tal como se evidencia para PNP de E. coli en la patente estadounidense n.° 6.017.896. Se usan promotores espedficos para otros tipos de tumores, por ejemplo, promotores activos en las celulas endoteliales que se dividen rapidamente presentes en todos los tumores solidos para activar espedficamente tm-PNP solo dentro de un tumor primario o metastasico. En este procedimiento, se suministra ADN de plasmido que contiene tm-PNP bajo el control de un promotor espedfico de tumor a celulas usando liposomas cationicos. Por ejemplo, basandose en estudios con animales, podnan usarse 100-400 mg de ADN de plasmido complejado a 1200-3600 micromoles de una mezcla 1:1 de los lfpidos DOTMA (bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-trimetilamonio) y DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina) para suministrar el gen de tm-PNP a metastasis tumorales en pacientes. Entonces puede administrarse un profarmaco en las cantidades descritas anteriormente. El tratamiento medico de tumores puede realizarse para beneficio financiero y terapeutico.
El gen de tm-PNP se usa opcionalmente para activar profarmacos para el tratamiento de cancer de cerebro humano. En este procedimiento, se inyecta una lmea celular que produce partmulas retrovirales que contienen el gen de tm-PNP en un tumor del sistema nervioso central (SNC) dentro de un paciente. Puede hacerse funcionar un escaner de IRM para inyectar apropiadamente la lmea celular productora de retrovirus dentro de la masa tumoral. Debido a que el retrovirus es completamente activo solo dentro de celulas en division y la mayona de las celulas en division dentro del craneo de un paciente con cancer estan dentro del tumor, el retrovirus es principalmente activo en el propio tumor, en vez de en celulas no malignas dentro del cerebro. Las caractensticas clmicas del paciente incluyendo la localizacion y el tamano tumoral determinan la cantidad de celulas productoras que han de inyectarse. Por ejemplo, se proporciona un volumen de celulas productoras en el intervalo de 30 inyecciones de 100 microlitros cada una (volumen total de 3 ml con aproximadamente 1 x 108 celulas productoras/ml inyectados) bajo orientacion estereotactica para tumores inaccesibles quirurgicamente. Para tumores a los que puede realizarse una aproximacion intraoperatoria, se inyectan almuotas de 100 |il (a aproximadamente 1 x 108 celulas/ml) con volumenes inyectados totales de hasta 10 ml usando transferencia genica de tm-PNP, seguido por administracion de F-araAMP (un profarmaco de F-araA). Esta estrategia esta disenada para permitir tanto destruccion inespedfica como toxicidad en celulas que no se dividen y esta disenada para lograr una involucion tumoral mucho mayor que los intentos anteriores usando HSV dThd cinasa y ganciclovir.
La destruccion de poblaciones seleccionadas de celulas se logra dirigiendo el suministro del gen de tm-PNP. Se aprovecha el tropismo natural o la fisiologfa de los vectores virales en la seleccion como diana de tipos de celulas espedficos. Por ejemplo, los retrovirus demuestran una actividad aumentada en celulas en replicacion. La transferencia genica mediada por retrovirus selectiva a celulas cancerosas en replicacion que crecen dentro de un sitio en donde las celulas normales (no malignas) no estan replicandose es un metodo de direccionamiento terapeuticamente poderoso en estudios clmicos tanto con animales como con seres humanos. Alternativamente, el vector viral se administra directamente a un sitio espedfico tal como un tumor solido concentrando de ese modo el gen en las celulas tumorales en contraposicion a los tejidos circundantes. Este concepto de suministro selectivo se ha demostrado en el suministro de genes a tumores en ratones mediante vectores de adenovirus. Pueden desarrollarse conjugados moleculares de modo que el ligando que se une al receptor se una no solo a tipos de celulas selectivos, tal como se ha demostrado para la seleccion como diana mediada por lectina de cancer de pulmon.
El direccionamiento de un gen que codifica para una tm-PNP o la expresion del gen en una fraccion pequena de las celulas en una masa tumoral seguido administracion del sustrato es adecuado para mediar en la involucion de la reduccion o estasis tumoral.
Tratamiento de celulas infectadas viralmente
Ademas de inhibir, y a menudo destruir las celulas tumorales, los procedimientos descritos en el presente documento tambien pueden usarse para destruir celulas infectadas viralmente. En una realizacion de destruccion de virus, el metodo de transferencia genica seleccionado se elige por su capacidad para dirigir la expresion de la enzima de escision en celulas infectadas viralmente. Por ejemplo, las celulas infectadas viralmente utilizan secuencias genicas virales especiales para regular y permitir la expresion genica tales como promotores espedficos de virus. Tales secuencias no estan presentes en celulas no infectadas. El gen de tm-PNP se orienta apropiadamente con respecto a un promotor viral de este tipo para generar expresion selectiva de la enzima de escision dentro de celulas infectadas viralmente. Las celulas infectadas viralmente son susceptibles de ese modo a la administracion de F-araA u otros sustratos disenados para convertirse en una forma toxica.
Administracion de celulas modificadas por ingeniena genetica
Tambien se proporciona una celula huesped transformada con un vector de la presente divulgacion.
Para determinadas aplicaciones, se seleccionan celulas que reciben el gen de Tv-PNP o tm-PNP y se administran a un paciente. Este metodo implica lo mas comunmente la transferencia ex vivo del gen que codifica para la enzima de escision Tv-PNP o tm-PNP. Las celulas que reciben los genes de la invencion se administran al paciente huesped en donde producen la protema terapeutica hasta que el profarmaco, tal como F-araA, se administra para eliminar las celulas modificadas por ingeniena genetica. Este metodo es util en terapias celulares tales como las usadas mioblastos que no se replican modificados por ingeniena genetica para la produccion de tirosina hidroxilasa dentro del cerebro (Jiao et al., Nature, 362:450 (1993)).
Suministro directo de la enzima PNP a celulas
Se administra opcionalmente protema Tv-PNP o tm-PNP con o sin un profarmaco directamente a celulas diana en vez del gen de Tv-PNP o tm-PNP. De manera ilustrativa, se fabrica una enzima Tv-PNP o tm-PNP que puede escindir nucleosidos de analogo de purina mediante tecnicas de protemas recombinantes disponibles usando un kit disponible comercialmente. Como ejemplo de un metodo para producir la protema Tv-PNP bacteriana, se liga la secuencia que codifica para Tv-PNP en el sitio de clonacion multiple de pGEX-4T-1 (Pharmacia, Piscataway, NJ) para que este “en marco” con la protema de fusion glutation-s-transferasa (GST) usando tecnicas convencionales (observese que el sitio de clonacion de este vector permite la insercion de secuencias codificantes en los tres posibles marcos de lectura de traduccion posibles para facilitar esta etapa). El plasmido resultante contiene la secuencia que codifica para la fusion GST-PNP bajo el control transcripcional del promotor tac procariota inducible con IPTG. Se transforman celulas de T. vaginalis con el plasmido recombinante y el promotor tac inducido con IPTG. Se lisan las celulas inducidas con IPTG, y se purifica la protema de fusion GST-PNP mediante cromatograffa de afinidad sobre una columna de glutation Sepharose 4B. Se eluye la protema de fusion GST-PNP, y se elimina la parte de GST de la molecula mediante escision con trombina. Todas estas tecnicas y reactivos estan disponibles comercialmente (Pharmacia, Piscataway, NJ). Otros metodos para la produccion de protemas recombinantes se describen en detalle en manuales de laboratorio publicados.
Puesto que la Tv-PNP o tm-PNP activa profarmacos para dar toxinas difusibles, el suministro de la protema PNP al exterior de las celulas diana antes de la administracion del profarmaco es operativo para inducir un efecto terapeutico. La protema Tv-PNP o tm-PNP puede administrarse a celulas diana mediante una amplia variedad de tecnicas. Un ejemplo es la aplicacion directa de la protema con o sin un portador a un tejido diana tal como inyectando directamente una masa tumoral dentro de un sitio accesible. Otro ejemplo es la union de la protema Tv-PNP o tm-PNP a un anticuerpo monoclonal que reconoce un antfgeno en el sitio tumoral. (Villa et al., “A high-affinity human monoclonal antibody specific to the alternatively spliced EDA domain of fibronectin efficiently targets tumor neo-vasculature in vivo". Int. J. Cancer. 1 de junio de 2008; 122(11):2405-13. Nissim et al., “Historical development of monoclonal antibody therapeutics”. Handbook of Exp. Pharmacol. 2008; (181):3-18.)
Se han descrito anteriormente metodos para unir protemas funcionales a anticuerpos monoclonales. El anticuerpo monoclonal conjugado con Tv-PNP o tm-PNP se administra de manera sistemica, por ejemplo por v^a intravenosa (i.v.), y se une espedficamente al tejido diana. La administracion sistemica posterior del profarmaco dara como resultado la produccion local de toxina difusible en las proximidades del sitio tumoral. Varios estudios demostraron el uso de esta tecnologfa para dirigir protemas espedficas a tejido tumoral. Otros ligandos, ademas de anticuerpos monoclonales, pueden seleccionarse por su especificidad por una celula diana y someterse a prueba segun los metodos ensenados en el presente documento.
El suministro de protemas a dianas espedficas se logra opcionalmente usando liposomas. Se describen metodos para producir liposomas (por ejemplo, Liposomes: A Practical Approach). Los liposomas pueden dirigirse a sitios espedficos mediante la inclusion de ligandos o anticuerpos espedficos en su superficie exterior. Un ejemplo ilustrativo son poblaciones de celulas de dgado espedficas seleccionadas como diana por la inclusion de asialofetuina en la superficie liposomica (Van Berkel et al., Targeted Diagnoses and Therapy, 5:225-249 (1991)). Formulaciones liposomicas espedficas tambien pueden lograr un suministro dirigido tal como se ejemplifica de la mejor manera mediante los denominados liposomas furtivos que suministran preferentemente farmacos a tumores implantados (Allen, Liposomes in the Therapy of Infectious Diseases and Cancer, 405-415 (1989)). Tras haberse inyectado o implantado los liposomas, se aclara el liposoma no unido de la sangre, y se trata el paciente con el profarmaco de analogo de purina, tal como F-araA, que se escinde por la Tv-PNP en el sitio seleccionado como diana. De nuevo, este procedimiento requiere solo la disponibilidad de un vedculo de direccionamiento apropiado. En un sentido mas amplio, la estrategia de direccionamiento puede extenderse al suministro espedfico del profarmaco tras el suministro de o bien el gen o bien la protema PNP.
Alternativamente, un compuesto es un fragmento de polipeptido biologicamente activo de protema Tv-PNP que se administra a un sujeto. Un fragmento de peptido o peptido biologicamente activo es opcionalmente una forma mutante de Tv-PNP. Se aprecia que la mutacion del aminoacido conservado en cualquier sitio particular se muta preferiblemente a glicina o alanina. Se aprecia ademas que la mutacion a cualquier aminoacido cargado de manera neutra, cargado, hidrofobo, hidrofilo, sintetico, no natural, no humano u otro puede funcionar de manera similar. Un mutante todavfa mas preferido implica una mutacion del marco de lectura para eliminar el codon de terminacion terminal TAA y en su lugar expresar una Tv-PNP mutante con cola (tmTv-PNP).
Se hacen opcionalmente modificaciones y cambios en la estructura (primaria, secundaria o terciaria) de la protema Tv-PNP silvestre que estan englobadas dentro del compuesto que pueden dar como resultado o no una molecula que tiene caractensticas similares a los polipeptidos a modo de ejemplo dados a conocer en el presente documento. Se aprecia que cambios en residuos de aminoacido conservados tienen un impacto lo mas probablemente sobre la actividad de la protema resultante. Sin embargo, se aprecia ademas que cambios en aminoacidos que pueden funcionar para la interaccion con ligandos, resistencia o promocion de la degradacion de la protema, trafico intracelular o extracelular, secrecion, interaccion protema-protema, modificacion postraduccional tal como glicosilacion, fosforilacion, sulfatacion, y similares, pueden dar como resultado actividad aumentada o disminuida de un compuesto de la invencion al tiempo que se retiene parte de la capacidad para alterar o mantener una actividad fisiologica. Se sabe que se producen determinadas sustituciones de aminoacidos para otros aminoacidos en una secuencia sin perdida de actividad apreciable.
Al hacer tales cambios, se considera el mdice terapeutico de los aminoacidos. Segun la presente divulgacion pueden sustituirse determinados aminoacidos por otros aminoacidos que tienen un mdice hidropatico similar y todavfa dan como resultado un polipeptido con actividad biologica similar. A cada aminoacido se le asigna un mdice hidropatico basandose en su hidrofobicidad y caractensticas de carga. Esos indices son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cistema/cistema (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Sin pretender limitarse a una teona particular, se cree que el caracter hidropatico relativo del aminoacido determina la estructura secundaria del polipeptido resultante, lo que a su vez define la interaccion del polipeptido con otras moleculas. Se sabe en la tecnica que un aminoacido puede sustituirse por otro aminoacido que tiene un mdice hidropatico similar y todavfa obtener un polipeptido funcionalmente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitucion de aminoacidos cuyos indices hidropaticos estan dentro de ±2, se prefieren particularmente los que estan dentro de ±1, y se prefieren incluso mas los que estan dentro de ±0,5.
Tal como se explico de manera resumida anteriormente, las sustituciones de aminoacidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral del aminoacido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamano, y similares. Los expertos en la tecnica conocen bien sustituciones a modo de ejemplo que pueden tener en consideracion diversas de las caractensticas anteriores e incluyen (residuo original: sustitucion a modo de ejemplo): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) y (Val: Ile, Leu). Aspectos de esta divulgacion contemplan por tanto equivalentes funcionales o biologicos equivalentes de un polipeptido tal como se expuso anteriormente. En particular, las realizaciones de los polipeptidos pueden incluir variantes que tienen una identidad de secuencia de aproximadamente el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% y el 95% con el polipeptido de interes.
Se aprecia ademas que cualquier sustitucion de acido nucleico en el gen que codifica para Tv-PNP o un fragmento del mismo que puede funcionar para producir cualquiera de las sustituciones de aminoacidos descritas anteriormente o para actuar como una mutacion silenciosa tal como para producir un codon sinonimo puede hacerse funcionar de manera similar en el presente documento. Tales sustituciones y metodos para su produccion se reconocen facilmente por los expertos en la tecnica.
Se ha encontrado sorprendentemente que una tm-PNP tiene mayor actividad de escision en relacion con la PNP silvestre correspondiente para un organismo dado. Una tm-PNP segun la presente invencion implica preferiblemente una mutacion del marco de lectura dentro de las 150 bases de acido nucleico terminales asociadas con la secuencia de nucleotidos de PNP de manera que se suprime un codon de terminacion comun a todas las secuencias silvestres de PNP conocidas a traves de un desplazamiento del marco y se anade una cola terminal a la secuencia de aminoacidos de tm-PNP expresada, teniendo la cola entre 10 y 50 residuos de aminoacido adicionales. Se aprecia que el desplazamiento del marco en la secuencia de nucleotidos de PNP silvestre se produce facilmente a traves de insercion o delecion de una o mas bases de nucleotido con la condicion de que las inserciones o deleciones de bases de nucleotido no sean un multiplo de 3 en el sentido de 5' del codon de terminacion. La cola resultante corresponde a un aminoacido que se codifica a partir de una region de secuencia de nucleotidos de PMP adyacente en relacion con el codon de terminacion de la secuencia de nucleotidos silvestre o se anade. El valor de mdice terapeutico de la cola de una tm-PNP y la longitud de la cola de entre 10 y 50 residuos de aminoacido de longitud parecen ser factores importantes en la escision preferente que tales enzimas tm-PNP ejercen sobre el sustrato de profarmaco clmicamente importante de F-araA en relacion con MeP-dR. Sin querer restringirse a una teona particular, se cree que la cola de una tm-PNP de la invencion modifica el acceso del ligando al sitio de union al profarmaco de tm-PNP en relacion con la enzima silvestre.
Administracion de sustratos
Se usa opcionalmente la formula de Freidenreich et al., Cancer Chemother. Rep., 50:219-244, (1966) para determinar la dosis tolerada maxima de sustrato para un sujeto humano. Por ejemplo, la administracion de manera sistemica a ratones de 25 mg (MeP-dR) por kg al dfa durante 9 dfas (9 dosis en total) dio como resultado algo de toxicidad pero no mortalidad. A partir de este resultado, se determino una dosificacion para ser humano de 75 mg de MeP-dR/m2 segun la formula: 25 mg/kg x 3=75 mg/m2. Se espera que esta cantidad o ligeramente menor maximice la destruccion de celulas tumorales en seres humanos sin matar al sujeto generando de ese modo un perfil de eficacia con respecto a seguridad favorable. Esta norma de eficacia se acepta en el campo de la terapia contra el cancer. Mas preferiblemente, los niveles de farmacos administrados oscilan entre aproximadamente el 10% y el 1% de la dosificacion tolerada maxima (por ejemplo, 7,5 mg/m2-0,75 mg/m2). Se entiende que los modos de administracion que permiten que el sustrato permanezca localizado en o cerca del sitio del tumor seran eficaces a dosis menores que los sustratos administrados de manera sistemica.
El sustrato puede administrarse por via oral, por via parenteral (por ejemplo, por via intravenosa), mediante inyeccion intramuscular, mediante inyeccion intratumoral, mediante inyeccion intraperitoneal o por via transdermica. La cantidad exacta de sustrato requerida variara de sujeto a sujeto, dependiendo de la edad, el peso, el estado general del sujeto, la gravedad de la enfermedad que esta tratandose, la ubicacion y el tamano del tumor, el compuesto particular usado, su modo de administracion, y similares. Puede determinarse una cantidad apropiada por un experto habitual en la tecnica usando solo experimentacion de rutina dadas las ensenanzas en el presente documento. Generalmente, la dosificacion estara preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0,5-50 mg/m2, cuando se considera MePdR por ejemplo, o un equivalente funcional. Para un profarmaco tal como fludarabina, la dosificacion estara normalmente en, o por debajo de las dosis que ya se sabe que son seguras en el sujeto.
Dependiendo del modo de administracion pretendido, el sustrato puede administrarse en composiciones farmaceuticas en forma de formas de dosificacion solidas, semisolidas o lfquidas, tales como, por ejemplo, comprimidos, supositorios, pfldoras, capsulas, polvos, lfquidos o suspensiones, preferiblemente en forma de dosificacion unitaria adecuada para administracion individual de una dosificacion precisa. Las composiciones incluiran una cantidad eficaz del sustrato seleccionado en combinacion con un portador farmaceuticamente aceptable y, ademas, pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmaceuticos, portadores o diluyentes. El termino “farmaceuticamente aceptable” tal como se usa en el presente documento se refiere a un material que no es biologicamente o de otra forma no deseado, que puede administrarse a un individuo junto con el sustrato seleccionado sin provocar efectos biologicos no deseados significativos o interaccionar de una manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composicion farmaceutica en la que esta contenido.
Para composiciones solidas, los portadores solidos no toxicos convencionales incluyen, por ejemplo, calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. Pueden prepararse composiciones lfquidas administrables farmaceuticamente, por ejemplo, disolviendo o dispersando un compuesto activo con adyuvantes farmaceuticos optimos en un excipiente, tal como agua, solucion salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol, y similares para formar de ese modo una disolucion o suspension. Si se desea, la composicion farmaceutica que va a administrarse tambien puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares no toxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento del pH, por ejemplo, acetato de sodio u oleato de trietanolamina. Se conocen metodos reales de preparacion de tales formas de dosificacion, o resultaran evidentes para los expertos en la tecnica; por ejemplo, vease Remington’s Pharmaceutical Sciences.
Para administracion oral, granulos o polvos finos pueden contener agentes de dilucion, dispersion y/o tensioactivos, y pueden presentarse en agua o en un jarabe, en capsulas o sobres en estado seco o en una suspension o disolucion no acuosa en la que pueden incluirse agentes de suspension, en comprimidos en los que pueden incluirse aglutinantes y lubricantes, o en una suspension en agua o un jarabe. Cuando es deseable o necesario, pueden anadirse agentes saborizantes, conservantes, de suspension, espesantes o emulsionantes. Se prefieren comprimidos y granulos para formas de administracion oral, y estas pueden estar recubiertas.
La administracion parenteral es generalmente mediante inyeccion. Pueden prepararse inyectables en formas convencionales, o bien disoluciones o bien suspensiones lfquidas, formas solidas adecuadas para disolucion o antes de la inyeccion, o como una suspension en lfquido antes de la inyeccion o como emulsiones.
Vectores que contienen acidos nucleicos que codifican para Tv-PNP
La presente divulgacion proporciona un vector que contiene una secuencia de ADN que codifica para una Tv-PNP. El vector puede contener ademas un elemento regulador operativamente unido a la secuencia de nucleotidos de manera que la secuencia de nucleotidos se transcribe y se traduce en un huesped. Preferiblemente, el vector es un virus o un plasmido. Los ejemplos ilustrativos de vectores virales adecuados incluyen un retrovirus, un adenovirus, un virus adenoasociado, un virus vaccinia, un virus del herpes y una construccion viral quimerica tal como un vector adenoretroviral. Entre los vectores de adenovirus utiles estan adenovirus humanos tales como adenovirus de tipo 2 o 5 y adenovirus de origen animal que incluyen manera ilustrativa los de origen aviar, bovino, canino, murino, ovino, porcino o de simios.
El uso de vectores derivados de virus adenoasociados para la transferencia de genes in vitro e in vivo se ha descrito de manera extensa por ejemplo en la patente estadounidense n.° 4.797.368 y la patente estadounidense n.° 5.139.941. En general, se delecionan los genes rep y/o cap y se reemplazan por el gen que va a transferirse. Se preparan partmulas virales recombinantes mediante cotransfeccion de dos plasmidos dentro de una lmea celular infectada con un virus auxiliar humano. Los plasmidos transfectados incluyen un primer plasmido que contiene una secuencia de acido nucleico que codifica para una PNP de la presente invencion que esta flanqueada por dos regiones de repeticiones invertidas del virus, y un segundo plasmido que porta los genes de encapsidacion (rep y cap) del virus. Las partmulas virales recombinantes se purifican entonces mediante tecnicas convencionales.
Expresion de PNP
Las enzimas Tv-PNP de la presente divulgacion se transcriben y se traducen in vivo e in vitro. Con el fin de producir las protemas in vivo, se introduce un vector que contiene acidos nucleicos que codifican para una Tv-PNP espedfica en las celulas, in vivo o ex vivo. Esto puede incluir la reintroduccion de celulas de nuevo en el animal, por medio de un vector tal como se explica resumidamente en el presente documento. En otro aspecto, la protema de interes se produce in vitro, o bien en una celula o bien en un sistema libre de celulas. La protema producida de esta manera se usa in vitro o se introduce en una celula o animal para producir un resultado deseado.
La expresion de una Tv-PNP en celulas de mairnfero puede requerir una secuencia reguladora de la transcripcion eucariota unida a las secuencias que codifican para Tv-PNP. El gen de Tv-PNP puede expresarse bajo el control de elementos promotores/potenciadores constitutivos fuertes que estan contenidos dentro de plasmidos comerciales (por ejemplo, el promotor/potenciador temprano de SV40 (pSVK30 Pharmacia, Piscataway, NJ), la repeticion terminal larga del virus del sarcoma murino de Moloney (pBPV, Pharmacia), la repeticion terminal larga del virus de tumor mamario de raton (pMSG, Pharmacia) y el promotor/potenciador temprano de citomegalovirus (pCMVp, Clontech, Palo Alto, CA).
Pueden usarse otros elementos y secuencias reguladoras geneticas espedficos de tejido para dirigir la expresion de un gen que codifica para una enzima de escision de nucleosido de analogo de purina adecuada a tipos de celulas espedficos distintos de melanomas, por ejemplo, promotores espedficos de tejido incluyendo de manera ilustrativa un promotor de albumina, protema de union a acido graso intestinal, suero lacteo, neurofilamento, piruvato cinasa, vilina y actina alfa de musculo liso.
Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran esquemas de reaccion espedficos y compuestos de la invencion espedficos y productos intermedios segun la presente divulgacion. Se describen en el presente documento metodos que implican tecnicas biologicas convencionales. Tales tecnicas se conocen generalmente en la tecnica y se describen en detalle en tratados de metodologfa tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; y Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York, 1992 (con actualizaciones periodicas). Se describen metodos inmunologicos (por ejemplo, preparacion de anticuerpos espedficos de antfgeno, inmunoprecipitacion e inmunotransferencia), por ejemplo, en Current Protocols in Immunology, ed. Coligan et al., John Wiley & Sons, Nueva York, 1991; y Methods of Immunological Analysis, ed.
Masseyeff et al., John Wiley & Sons, Nueva York, 1992.
Se ilustran diversos aspectos de la presente divulgacion mediante los siguientes ejemplos no limitativos. Los ejemplos son para fines ilustrativos y no son una limitacion sobre cualquier practica de la presente divulgacion. Aunque los ejemplos se refieren generalmente a celulas, tejido, fluidos o sujetos mamnferos, una persona que tiene un conocimiento habitual en la tecnica reconoce que tecnicas similares y otras tecnicas conocidas en la tecnica trasladan facilmente los ejemplos a otros mairnferos tales como seres humanos. Los reactivos ilustrados en el presente documento reaccionan de manera cruzada comunmente entre especies de mamffero o estan disponibles comercialmente reactivos alternativos con propiedades similares, y un experto habitual en la tecnica entiende facilmente donde pueden obtenerse tales reactivos.
Seleccion de sustratos
Los sustratos adecuados se caracterizan por ser relativamente no toxicos para una celula de mamffero en comparacion con el analogo de base de purina escindido citotoxico. A continuacion se enumeran algunos ejemplos ilustrativos de sustratos. Se incluye(n) abreviatura(s) comun/comunes despues de algunos de los compuestos y separados por un punto y coma:
9-(P-D-arabinofuranosil)-2-fluoroadenina; F-araA, fludarabina
9-(2-desoxi-p-D-ribofuranosil]-6-metilpurina; MeP-dR
9-(P-D-ribofuranosil)-2-amino-6-cloro-1-deazapurina; ACDP-R
7-(P-D-ribofuranosil)-3-deazaguanina
2-fluoro-2'-desoxiadenosina; F-dAdo
9-(5-desoxi-p-D-ribofuranosil)-6-metilpurina
2-fluoro-5'-desoxiadenosina
2-cloro-2'-desoxiadenosina; Cl-dAdo, cladribina
5'-amino-5'-desoxi-2-fluoroadenosina
9-(5-amino-5-desoxi-p-D-ribofuranosil)-6-metilpurina
9-(a -D-ribofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(2,3-didesoxi-p-D-ribofuranosil)-6-metilpurina
2',3'-didesoxi-2-fluoroadenosina
9-(3-desoxi-p-D-ribofuranosil]-6-metilpurina
2-fluoro-3'-desoxiadenosina
9-(a -L-lixofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(a -L-lixofuranosil)-6-metilpurina
9-(6-desoxi-p-D-alofuranosil)-6-metilpurina
9-(6-desoxi-p-D-alofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(6-desoxi-a -L-talofuranosil)-6-metilpurina
9-(6-desoxi-a -L-talofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(2,6-didesoxi-p-D-alofuranosil)-6-metilpurina
9-(2,6-didesoxi-p-D-alofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(2,6-didesoxi-a -L-talofuranosil)-6-metilpurina
9-(2,6-didesoxi-a -L-talofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(6,7-didesoxi-a -L-hept-6-inofuranosil)-6-metilpurina
9-(6,7-didesoxi-a -L-hept-6-inofuranosN)-2-fluoroadenina
9-(6,7-didesoxi-p-D-hept-6-inofuranosil)-6-metilpurina
9-(6,7-didesoxi-p-D-hept-6-inofuranosN)-2-fluoroadenina
9-(2,6,7-tridesoxi-a -L-hept-6-inofuranosil)-6-metilpurina
9-(2,6,7-tridesoxi-a -L-hept-6-inofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(2,6,7-tridesoxi-p-D-hept-6-inofuranosil)-6-metilpurina
9-(2,6,7-tridesoxi-p-D-hept-6-inofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(2,3-didesoxi-3-hidroximetil-a -D-ribofuranosil)-6-tioguanina
9-(5,5-di-C-metil-p-D-ribofuranosil)-2-fluoro-adenina
9-(5,5-di-C-metil-p-D-ribofuranosil)-6-metilpurina
9-(5-desoxi-5-yodo-p-D-ribofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(5-desoxi-5-yodo-p-D-ribofuranosil)-6-metilpurina
9-(5-desoxi-5-metiltio-p-D-ribofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(5-desoxi-5-metiltio-p-D-ribofuranosil)-6-metilpurina
Se encuentran ejemplos adicionales en Ichikawa E. y Kato K., Curr. Med. Chem. 2001 Mar; 8(4): 385-423.
Se aprecia que se esperana que algunos sustratos se tolerasen mejor que otros. Por ejemplo, FaraA se escinde a una velocidad mas rapida por Tv-PNP en comparacion con otras enzimas conocidas de modo que se proporcionan mayores opciones terapeuticas.
Ejemplo 1: Sntesis de vectores de expresion de Tv-PNP
Se obtiene ADN genomico de T. vaginalis con un primer clon de ADN a partir de una cepa resistente a metronidazol (R: CDC955) y un segundo clon de ADN a partir de una cepa sensible (S3: CDC520). Se amplifica el gen de TvPNP mediante PCR usando los siguientes cebadores a partir de ambas muestras usando AccuPrime Pfx supermix (Invitrogen). Los cebadores se disenan basandose en la secuencia de TvPNP descargada de sitio web del proyecto del genoma de tricomonas TIGR. La secuencia esta disponible actualmente en GenBank (XM_001323400). Los cebadores de Tv-PNP usados en el presente documento inclrnan los sitios de restriccion entre parentesis en los mismos: cebador directo TvPNP-F: 5'-GTTAACGGATCCATGGCAACACCCCATAACTCTGCT-3' (Hpal y BamHI) (SEQ ID NO: 1). Cebadores inversos de Tv-PNP TvPNP-R: 5'-TCTAGAGTTAACGTCCTTATAATTTGATTGCTGCTTC-3' (XbaI y HpaI) (SEQ ID NO: 2) y TvPNP-R1: 5'-ATAGTTTAGATCCGAGGACCAATCAT-3' (SEQ ID NO. 3). La secuencia de nucleotidos de Tv-PNP silvestre se ilustra como SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoacidos de Tv-PNP silvestre es SEQ ID NO: 5.
Se realiza la primera ronda de PCR usando los cebadores TvPNP-F y Tv-PNPR1. Entonces se realiza PCR anidada (segunda ronda) usando el producto de la PCR de primera ronda y los cebadores TvPNP-F y TvPNP-R. El producto de PCR se clona en el vector pCR4Blunt-Topo (Invitrogen) y se secuencia (ID de clon = pCR4 Blunt-TvPNP) tal como se representa en la figura 3. La cepa S contiene un cambio de base con respecto a la secuencia de TIGR, pero no cambia el codon Arg102 (CGC -> CGT). Puesto que el clon R coincide con la secuencia de TIGR, se usa el clon TvPNP(R) para la clonacion adicional. Para generar adenovirus que expresan TvPNP, se digiere TvPNP(R) de la figura 3 con EcoRI y XbaI y se clona en los sitios EcoRI y XbaI del vector de transferencia de adenovirus pACCMV.pLpA. Se contransfecta el pACCMV-TvPNP tal como se representa en la figura 4 con pJM17 (Microbix) para obtener Ad-TvPNP recombinante por medio de recombinacion homologa en celulas 293. Se identifica el Ad-TvPNP resultante mediante PCR espedfica de Tv-PNP y ensayo de actividad de Tv-PNP.
Se usan dos vectores diferentes para generar virus Lenti-TvPNP. Se clona TvPNP(R) tal como se representa en la figura 3 en un vector pWPI modificado (originalmente de Addgene.org; que se modifica para contener mas sitios de restriccion para fin de clonacion (pWPI-linker(+))). El vector pWPI expresa protema fluorescente verde (EGFP) potenciada bajo el control del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Se afsla TvPNP(R) de pCR4Blunt-TvPNP usando PmeI y XbaI, luego se clona en los sitios SnaBI y SpeI del vector pWPI-linker(+) de la figura 5. PmeI y SnaBI cortan con extremos romos y XbaI y SpeI generan las mismas proyecciones.
Se clona TvPNP(R) por separado en el vector pHR'CMV Luc W Sin-18 (segun J. Bio. Chem., publicado el 1 de octubre de 2004 como manuscrito M410370200) en lugar del gen de luciferasa para generar lmeas celulares que expresan TvPNP sin coexpresar EGFP. Se afsla TvPNP(R) de pCR4Blunt-TvPNP usando BamHI y HpaI, luego se clona en los sitios BamHI y XhoI (con extremos romos usando el fragmento Klenow) del vector pHR'CMV Luc W Sin-18 representado en la figura 6.
Ejemplo 2: Identificacion de profarmacos candidatos para enzimas Tv-PNP
El siguiente metodo es util para identificar sustratos que se escinden mas eficazmente por la Tv-PNP silvestre que por la PNP de E. coli silvestre u otras PNP. Los profarmacos identificados mediante este metodo pueden evaluarse adicionalmente entonces en estudios en animales para la determinacion de la toxicidad, adecuadamente para su administracion con diversos portadores farmaceuticos, y otras propiedades farmacologicas.
El metodo mide cuantitativamente la escision de sustratos in vitro. Se combinan los nucleosidos analogos de purina (0,1 mM en 500 |il de HEPES 100 mM, pH 7,4, fosfato de potasio 50 mM) con Tv-PNP 100 |ig/ml o PNP de E. coli silvestre. Se incuban las mezclas de reaccion a 25°C durante 1 hora, y se detienen las reacciones sometiendo a ebullicion cada muestra durante 2 minutos. La concentracion de protema y el tiempo de ensayo vanan dependiendo de la actividad de la enzima para un sustrato particular. Cada muestra se analiza mediante HPLC de fase inversa para medir la conversion de sustrato en producto. Los analogos de nucleosido y purina se eluyen de una columna Spherisorb ODSI (5 |im) (Keystone Scientific, Inc., State College, PA) con un disolvente que contiene dihidrogenofosfato de amonio 50 mM (95%) y acetonitrilo (5%). Se detectan los productos mediante absorbancia a 254 nm, y se identifican comparando sus tiempos de retencion y espectros de absorcion con muestras de control autenticas.
La tabla 1 muestra la actividad de la enzima PNP de E. coli silvestre en comparacion con Tv-PNP silvestre en presencia de diversos sustratos. Se someten a prueba numerosos compuestos para determinar su eficacia como sustrato para Tv-PNP en comparacion paralela con PNP de E. coli. Los compuestos incluyen diversos analogos de adenosina, de inosina, de MeP-dR y de adenosina sustituida con fluor o cloro. Se incuban las enzimas con 100 micromolar de cada compuesto enumerado en la tabla y se determina la velocidad de escision enzimatica mediante separacion por HPLC de la base del nucleosido. Tal como se muestra en la tabla 1, Tv-PNP escinde F-araA a una velocidad (32.000 nanomoles por miligramo por hora) que es aproximadamente 23 veces la velocidad a la que PNP de E. coli escinde F-araA (1.250 nanomoles por miligramo por hora). El resultado se confirma ademas tal como se muestra en la figura 1 en que la eficacia catalftica de Tv-PNP con F-araA es 25 veces la eficacia catalttica de PNP de E. coli con FaraA (Vmax/Km de 944 frente a 38). Se aprecia que una mayor actividad biologica de la enzima Tv-PNP permite una mayor actividad en la alteracion del crecimiento celular anomalo cuando la Tv-PNP se usa para el tratamiento de estados patologicos usando F-araA como sustrato de profarmaco. Puesto que se notifica que F-araA provoca respuestas completas en tumor que expresa enzima PNP de E. coli silvestre, un aumento de al menos 23 veces en la generacion de F-Ade toxica usando la combinacion de Tv-PNP silvestre y F-araA conduce a una actividad antitumoral mejorada.
Se observa tambien a partir de la tabla 1 que Tv-PNP tiene mayores actividades hacia 2-Cl-2'-desoxiadenosina (CldAdo, cladribina) en comparacion con PNP de E. coli. La Tv-PNP escinde Cl-dAdo a una actividad espedfica de 320.000 nanomoles por miligramo por hora mientras que la misma Cl-dAdo se escinde por E. coli a una actividad espedfica de solo 39.000 nanomoles por miligramo por hora.
Tabla 1 Comparacion de la actividad de sustratos de Tv-PNP y PNP de E. coli silvestre; un “-” representa ausencia de escision detectada.
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0002
Tv-PNP y PNP de E. coli silvestre son sustancialmente similares tanto en estructura como en funcionalidad. El presente descubrimiento y la cuantificacion de que Tv-PNP y E. coli difieren enormemente en la eficacia de escision de profarmacos para dar compuestos citotoxicos es contradictoria con la comprension convencional de que Tv-PNP no tiene actividad apreciable hacia F-araA (Wang et al., id.), indicando la novedad de esta observacion.
Mediante este analisis, Tv-PNP tiene mas actividad para fludarabina, cladribina, analogo de cordicepina, analogo de 2',3'-didesoxiadenosina, 5'-metil(talo)-6-metilpurina-ribosido, 5'-metil(talo)-2'-desoxi-6-metilpurina-ribosido, 5'-metil(alo)-6-metilpurina-ribosido, 2-F-5'-desoxiadenosina o 2-F-a-L-lixo-adenina en comparacion con PNP de E. coli silvestre. Por tanto, estos sustratos son profarmacos candidatos preferidos que pueden elegirse para evaluacion adicional para su uso en los metodos y las composiciones descritos en el presente documento para tratar un estado patologico y en particular los profarmacos disponibles comercialmente en calidad de USP.
Ejemplo 3: Comparacion de la capacidad de diversas PNP para escindir MeP-dR y F-araA.
Se compara la actividad de escision relativa de PNP de diversos ongenes para determinar la enzima optima para la escision de los importantes agentes quimioterapicos MeP-dR y F-araA mediante el procedimiento del ejemplo 2. Se incuban enzimas de diversas purezas con F-araA o MeP-dR 100 |iM y se determina la tasa de escision midiendo la produccion de producto (MeP o F-Ade) mediante HPLC tal como se describe en el ejemplo 2. Los resultados se proporcionan en la tabla 2.
Tabla 2
Figure imgf000015_0001
Ejemplo 4: Expresion de PNP de E. coli con cola terminal de 30 residuos (tm-PNP) y escision de profarmaco Se clono una secuencia de nucleotidos derivada de PNP de E. coli silvestre correspondiente a 2.134 bases de nucleotido en los sitios EcoRI y Xbal del vector de transferencia de adenovirus pACCMV.plpA. Esta secuencia vana con respecto a PNP de E. coli silvestre en que carece de una base de adenosina que por lo demas esta presente

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Sustrato escindible de enzima purina nucleosido fosforilasa de Trichomonas vaginalis para su uso en la inhibicion de una celula cancerosa de mairnfero o una celula viralmente infectada en el que dicho sustrato escindible se convierte en analogo de purina citotoxico mediante la provision de una enzima purina nucleosido fosforilasa mutante con cola en proximidad a la celula de mamffero cancerosa o la celula viralmente infectada
en el que el sustrato escindible se selecciona del grupo que consiste en 9-(P-D-arabinofuranosil)-2-fluoroadenina (fludarabina), cladribina, 5-metil(talo)-6-metil-purina-ribosido, 5'-metil(talo)-2'-desoxi-6-metilpurina-ribosido, 5-metil(alo)-6-metilpurina-ribosido, 2-F-5'-desoxiadenosina y 2-F-a -L-lixo-adenina y en el que la enzima purina nucleosido fosforilasa mutante con cola tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12.
2. Sustrato escindible para su uso segun la reivindicacion 1, en el que se proporciona la enzima mediante la administracion de un vector viral que codifica para una secuencia de nucleotidos para dicha enzima expresable en dicha celula.
3. Sustrato escindible para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que se proporciona dicha enzima mediante inyeccion directa, infeccion, lipofeccion o administracion biolfstica de una secuencia de nucleotidos para la enzima expresable en la celula.
4. Sustrato escindible para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se proporciona dicha enzima mediante inyeccion directa de la enzima proxima a dicha celula.
5. Sustrato escindible para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se proporciona dicha enzima mediante administracion a un sujeto de una celula del sujeto modificada para expresar dicha purina nucleosido fosforilasa mutante con cola.
6. Sustrato escindible para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se proporciona mediante suministro intracelular de una secuencia de nucleotidos expresable que codifica para dicha enzima.
7. Composicion seleccionada del grupo que consiste en:
una primera composicion que comprende una enzima purina nucleosido fosforilasa enzima mutante con cola de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12; y
una segunda composicion que comprende una enzima purina nucleosido fosforilasa mutante con cola de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 y un sustrato escindible por dicha enzima para producir un analogo de purina citotoxico, en la que dicho sustrato se selecciona del grupo que consiste en 9-(P-D-arabinofuranosil)-2-fluoroadenina (fludarabina), cladribina, 5'-metil(talo)-6-metil-purina-ribosido, 5'-metil(talo)-2'-desoxi-6-metilpurina-ribosido, 5'-metil(alo)-6-metilpurina-ribosido, 2-F-5'-desoxiadenosina y 2-F-a -L-lixo-adenina.
8. Composicion segun la reivindicacion 7, en la que dicha enzima purina nucleosido fosforilasa mutante con cola tiene una cola de entre 10 y 50 residuos de aminoacido.
9. Composicion segun la reivindicacion 8, en la que dicha cola se trunca entre 0 y 10 residuos de aminoacido de una enzima purina nucleosido fosforilasa silvestre correspondiente.
10. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende ademas una protema viral.
11. Vector que contiene una secuencia de nucleotidos expresable que codifica para una enzima purina nucleosido fosforilasa mutante con cola de SEQ ID NO: 8, 10 o 12.
12. Vector segun la reivindicacion 11, en el que dicho vector es un retrovirus, adenovirus, virus del herpes, virus del sarampion, virus adenoasociado o un baculovirus.
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