KR101726282B1 - 뉴클레오시드 프로드럭의 효소 활성자로서의 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소 - Google Patents

뉴클레오시드 프로드럭의 효소 활성자로서의 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소 Download PDF

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Abstract

포유류의 암성 세포 또는 바이러스 감염된 세포의 저해 방법은, 상기 포유류의 암성 세포 또는 상기 바이러스 감염된 세포의 근처에, 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis)의 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소 또는 꼬리 돌연변이형 뉴클레오시드 인산화효소를 제공하는 단계, 및 상기 효소를 퓨린 뉴클레오시드 인산화 효소로 절단가능한 기질에 노출시켜, 세포독성의 퓨린 유사체를 수득하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 상기 인산화효소 또는 이를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터를 세포에 도입하는 단계 및 상기 세포에 9-(β-D-아라비노퓨라노실)-2-플루오로아데닌 (F-araA)과 같이 유효량의 기질을 전달하는 단계를 포함한다.

Description

뉴클레오시드 프로드럭의 효소 활성자로서의 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소{PURINE NUCLEOSIDE PHOSPHORYLASE AS ENZYMATIC ACTIVATOR OF NUCLEOSIDE PRODRUGS}
본 출원은 2008년 8월 15일자 미국 가출원 번호 61/089,235 및 2009년 7월 13일자 가출원 번호 61/225,012에 대해 우선권을 주장하며, 이들 출원의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 프로드럭 기질, 특히 9-(β-D-아라비노퓨라노실)-2-플루오로아데닌(F-araA, 플루다라빈) 및 2-Cl-2'-데옥시아데노신 (Cl-dAdo, 클라드리빈) 등의 프로드럭 기질에 대한 효소 활성자로서, 꼬리가 달린 돌연변이형(tailed mutant) 및 야생형 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis) 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소의 이용 방법에 관한 것이다.
종양 세포를 선택적으로 손상시키는 프로드럭 활성화 전략에는, 종양 세포내에서 외인성 효소를 코딩하는 유전자를 발현시키고, 이 효소에 대한 기질을 투여하는 방법이 포함되어 있다. 상기 효소가 상기 기질에 작용하여 타겟화된 종양 세포에 대해 독성인 물질을 만들어낸다. 이러한 기술은 리신, 디프테리아 독소 및 슈도모나스 외독소와 같이, 직접적인 독성 유전자를 발현시키는 것에 비해 유리하다. 이의 이점으로는, 1) 세포 손상을 적정할 수 있으며, 2) 프로드럭의 수준 또는 재조합 효소의 발현 수준을 조절함으로써 치료 지수를 최적화할 수 있으며, 3) 프로드럭의 투여 과정을 생략함으로써 독성을 차단시킬 수 있다는 점이 있다. 또한, 이러한 기술은 여러가지 세포 타입들에 대해 상이한 효과를 나타내는 프로드럭을 사용함으로써, 특정 질환 상태에 맞게 치료를 조절할 수 있다.
프로드럭 활성화 방법에 사용가능한 효소들이 개시되어 있으며, 미국 특허 5,338,678; 5,552,311; 6,017,896 및 6,207,150에 기술된 바와 같이, 티미딘 키나제, 사이토신 탈아미노효소 및 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소(PNP) 등의 효소들이 있다. 그러나, 프로드럭 활성화 기법을 이용한 종양의 치료시, 그 효능은 기질 투여에 따른 부작용이 존재하는 경우에는 제한된다. 예를 들어, 대게 티미딘 키나제와 조합하여 사용되는 프로드럭 간시클로비르는 원하지 않는 면역억제 효과를 야기할 수 있다.
주된 화학요법제인 F-araA에 대해 절단 활성을 가진 특정한 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소를 탐색하고자 하는 시도는, 부분적으로는, 조사가 필요한 PNP 후보체의 수가 많고, 각 PNP의 분리 및 발현의 어려움으로 인해, 이전에는 성공하지 못하였다. 수많은 미생물들이 아데닌-함유 뉴클레오시드를 아데닌으로 절단해낼 수 있는 PNP들을 생산하고 있다. 예컨대, PNP를 발현하는 것으로 보고된 미생물만도 17종이 넘는다: 리슈마니어 도노바니(Leishmania donovani); 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis ); 트립파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi ); 스키스토소마 만소니(Schistosoma mansoni ); 리슈마니어 트로피카(Leishmania tropica ); 크리티디아 패시쿨라타(Crithidia fasciculata ); 아스퍼질러스( Aspergillis ) 및 페니실리움(Penicillium); 에르비니아 카로토보라(Erwinia carotovora ); 헬릭스 포마티(Helix pomatia ); 오피오돈 일롱게이트(Ophiodon elongates)(랑카드: lingcod); 대장균(E. coli ), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium ); 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis ); 클로스트리디움(Clostridium); 마이코플라즈마(mycoplasma); 트립파노소마 감비엔스(Trypanosoma gambiense ); 및 트립파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei).
따라서, 효능은 개선시키고 부작용 문제는 해결하는, 종양을 치료하기 위한 프로드럭의 활성화 방법이 요구되고 있다.
본 발명의 방법은, 야생형 트리코모나스 바기날리스의 퓨린 뉴클레오시드 인산화 효소(Tv-PNP)를 암성 세포(cancerous cell)에 근접하게 제공하는 단계, 및 상기 효소를 효소에 의해 절단되는 기질에 노출시켜 세포독성 퓨린 유사체를 제조하는 단계에 의해, 암성 세포를 저해하며, 상기 기질은 플루다라빈, 클라드리빈, 코르디세핀(cordycepin의 유사체, 2',3'-디데옥시아데노신의 유사체, 5'-메틸(탈로)-6-메틸퓨린-리보시드, 5'-메틸(탈로)-2'-데옥시-6-메틸퓨린-리보시드, 5'-메틸(알로)-6-메틸퓨린-리보시드, 2-F-5'-데옥시아데노신, 또는 2-F-α-L-리소-아데닌이다. 상기 Tv-PNP 효소는, 암성 세포나 상기 세포 근처에서 발현시키거나, 또는 타겟 세포 근처에 상기 효소를 투여함으로써, 제공된다. 다양한 유기체로부터 유래된 꼬리가 달린 돌연변이형 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소(tm-PNP) 효소들 역시 암 세포 저해를 위해 본원에서 사용가능한 신규 조성물로서 제공된다.
Tv-PNP 효소, tm-PNP 효소, 또는 암성 세포에서 발현가능하며 Tv-PNP 효소, tm-PNP 효소 또는 이의 조합을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터; 및 플루다라빈, 클라드리빈, 코르디세핀의 유사체, 2',3'-디데옥시아데노신의 유사체, 5'-메틸(탈로)-6-메틸-퓨린-리보시드, 5'-메틸(탈로)-2'-데옥시-6-메틸퓨린-리보시드, 5'-메틸(알로)-6-메틸퓨린-리보시드, 2-F-5'-데옥시아데노신, 또는 2-F-α-L-리소-아데닌 또는 이들의 조합인 기질을 포함하는, 상업적 키트도, 포유류의 암성 세포를 저해하기 위해, 제공된다.
타겟 세포의 용혈물(lysate), Tv-PNP/tm-PNP, 및 Tv-PNP/tm-PNP 분해시 세포독성을 띄는 절단 산물인 퓨린 유사체를 만드는 프로드럭으로 구성된 조성물도 제공된다. 이 조성물은 특히 후속적인 요법 진행에 유용하다.
본 발명의 대상은 트리코모나스 바기날리스로부터 분리된 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소이다. 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소 및 뉴클레오시드 가수분해 효소는 인간 등의 포유류, 및 리슈마니어 도노바니(Leishmania donovani); 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis ); 트립파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi ); 스키스토소마 만소니(Schistosoma mansoni ); 리슈마니어 트로피카(Leishmania tropica); 크리티디아 패시쿨라타(Crithidia fasciculata ); 아스퍼질러스(Aspergillis) 및 페니실리움(Penicillium ); 에르비니아 카로토보라(Erwinia carotovora); 헬릭스 포마티(Helix pomatia ); 오피오돈 일롱게이트(Ophiodon elongates); 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium ); 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis ); 클로스트리디움(Clostridium); 마이코플라즈마(mycoplasma); 트립파노소마 감비엔스(Trypanosoma gambiense ); 트립파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei); 설폴로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus ); 및 대장균 등의 미생물로 예시되는 다양한 유기체에 존재한다.
뉴클레오시드 인산화효소는 퓨린 뉴클레오시드 + PO4 -> 리보스-1-PO4 (또는 데옥시리보스-1-포스페이트) + 퓨린 염기로의 반응을 촉매한다. 본 발명은, 트리코모나스 바기날리스의 천연 퓨린 절단 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열과, 다른 유기체로부터 유래된 구조적으로 비슷한 야생형 PNP 효소 및 꼬리 첨가된 돌연변이 효소의 기원인 야생형 서열 각각과 비교하여, 특정 절단 기질에 대한 생물학적 활성이 현저하게 높은, tm-PNP 서열을 제공한다.
본원에서, 용어 "생물 활성"은, 실시예 2에 나타낸 적합한 방법에 의해 측정하는 기간 동안, 기질의 존재 중에 특정량의 퓨린 절단 효소의 반응에 의해 제조되는 최종 산물의 양 측정치를 의미하는 것으로 의도된다.
세포의 대사, 기능 또는 복제에 손상을 주는 세포독성의 퓨린 유사체를 제조하기 위한, 효소의 기질인 화합물은, 본원에서 "프로드럭" 또는 "기질"과 상호 호환되게 사용된다.
본원에서, 용어 "병원성 바이러스 감염"은 질환 또는 병리학적 작용을 초래하는 바이러스에 의한 감염을 의미한다.
본원에서, 용어 "제약학적으로 허용가능한"은, 개체에게 투여할 수 있으나, 현저하게 바람직하지 않은 생물학적 효과가 없거나 약학 조성물에 포함된 다른 성분들 중 임의의 성분과 유해하게 상호작용하지 않는, 생물학적이 아니거나 또는 부적절하지 않은 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, Tv-PNP 또는 tm-PNP에 의한 프로드럭의 절단으로 타겟 암성(또는 바이러스 감염된) 세포를 저해하는 세포독성의 퓨린 유사체가 제조된다. 상기 세포독성의 퓨린 유사체는 암성 세포 안에서 생산되어야 하는 것은 아니며, 대신, 종양 세포 안에서 생산된 상기 세포독성의 퓨린 유사체가 이웃한 종양 세포로 이동하여 그 세포를 파괴시킬 수 있는, 방관자 효과도 존재한다. 바이러스에 의해 감염된 세포 또는 암성 타겟 세포를 저해하는데 필요한 세포독성 퓨린 유사체의 농도는, 세포독성 퓨린 유사체의 실체(identity), 세포내 체액 교체율, 세포독성 유사체의 세포막 이송율 및 DNA 또는 RNA로의 통합율 등의 인자, 및 단백질 합성의 저해제로서의 효능에 따라 결정된다.
Tv-PNP 또는 tm-PNP는 포유류의 암성 세포 또는 바이러스 감염된 타겟 세포를 시험관내 또는 생체내에서 저해하도록 인간 또는 비-인간 개체에서 작용한다. Tv-PNP 또는 tm-PNP는, 미국 특허 6,958,318 B2에 상세하게 기술된 임의의 방법에 의해, 상기 특허에 기술된 대장균 PNP에 대한 치환체로서 생체내로 전달된다. 이러한 전달 방법들은, 예시적으로, 재조합 바이러스 벡터; 클로스트리듐, 살모넬라 및 대장균 박테리아 벡터; 항체-접합된 리포좀; Tv-PNP 또는 tm-PNP 효소를 발현하도록 유전자 변형된 대상 세포의 재도입; 리포펙션(lipofection); 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 홍역 바이러스, 아데노-부속 바이러스 또는 베큘로바이러스; 및 포유류 암성 세포의 부근에 Tv-PNP 또는 tm-PNP 효소의 직접 주입을 포함한다.
본 발명은, 하기 단계를 통해, 복제성, 비-복제성, 형질감염되거나 형질전이된 포유류 세포 및 방관자 세포를 적어도 저해 및 전형적으로 사멸시키는 방법을 제공하며, 상기 단계는 (a) Tv-PNP 또는 tm-PNP를 코딩하는 핵산을 타겟 포유류 세포에 형질감염 또는 형질전이시키는 단계; 및 (b) Tv-PNP 절단 효소를 발현하거나 제공하는 상기 타겟 세포를 상기 효소의 기질과 접촉시켜, 야생형 또는 치환형 대장균 PNP 및 다른 PNP에 의해 제조되는 것 보다 많은 양의 독성의 퓨린 염기를 제조함으로써, 타겟 세포 또는 상기 절단 효소를 발현 또는 포함하지 않는 방관자 세포를 사멸시키는 단계를 포함한다. 즉, Tv-PNP 또는 tm-PNP 절단 효소는, 기질의 존재 중에, 독성 산물을 만든다. 본 발명의 실시는 인간 또는 비-인간 포유류 또는 다른 세포를 이용하여 시험관내 또는 생체내에서 수행할 수 있다.
본원에서, 용어 "저해"는 정상적인 생리학적 활성의 변이이다. 구체적으로, 저해는, 용혈, 증식 저하, 생장 저하, 유전자, RNA, 단백질, 지질 또는 그외 대사산물의 발현 또는 분해율 증가 또는 감소, 세포 자살 또는 기타 세포 사멸 기작의 유도, 또는 단백질 또는 핵산의 기능 증가, 감소 또는 변이로 정의된다.
본 발명의 일 구현예에서, Tv-PNP 또는 tm-PNP 효소는 세포를 타겟팅한다. 보다 바람직하게는, Tv-PNP 또는 tm-PNP 효소는 여기에 항체를 접합시켜 세포를 타겟팅한다.
효소는 세포에 제공되는 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 예를 들어, 세포에 제공되는 유전자는 Tv-PNP 또는 tm-PNP를 코딩하며, 티로시나제 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 다른 예로, 유전자는 폴리머 필름, 겔, 미세입자 및 리포솜 등의 캐리어 분자내에 제공된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 복제성 또는 비-복제성의 타겟 포유류 세포 및 방관자 세포 모두를 용혈시킴으로써, 적어도 저해, 전형적으로 사멸시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은, (a) Tv-PNP 또는 tm-PNP를 타겟 포유류 세포에 전달하는 단계; 및 (b) 상기 타겟 세포를 Tv-PNP 또는 tm-PNP에 대한 유효량의 뉴클레오시드 기질과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 기질은 비교적 포유류 세포에 무독성이며, Tv-PNP 또는 tm-PNP에 의해 잘려져, 상기 타겟 포유류 세포와 이의 주변 방관자 세포에 독성인 퓨린 염기가, 야생형 또는 치환 돌연변이 대장균 PNP에 의해 제공되는 수준 보다 다량으로 제조된다. 퓨린 유사체 기질의 예로는, 플루다라빈, 클라드리빈, 코르디세핀, 2',3'-디데옥시아데노신의 유사체, 5'-메틸(탈로)-6-메틸퓨린-리보시드, 5'-메틸(탈로)-2'-데옥시-6-메틸퓨린-리보시드, 5'-메틸(알로)-6-메틸퓨린-리보시드, 2-F-5'-데옥시아데노신 또는 2-F-α-L-리소-아데닌이 있다.
또한, 본 발명은, (a) 퓨린 뉴클레오시드 기질을 자르는 Tv-PNP 또는 tm-PNP 효소; 및 (b) 상기 효소에 의해 잘려졌을 때 타겟 세포를 사멸시키는데 유효한 양의 퓨린 뉴클레오시드 기질을 포함하는, 타겟 포유류 세포를 사멸시키기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, Tv-PNP 또는 tm-PNP 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터에 관한 것으로, 상기 벡터는 숙주에서 복제가능하며, a) 복제 오리진; b) 프로모터; 및 c) 상기 Tv-PNP 또는 tm-PNP 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스, 베큘로바이러스(vacuvirus), 바이러스 벡터 또는 플라스미드이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질감염되어 Tv-PNP 또는 tm-PNP 단백질을 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 숙주 세포는 박테리아 세포, 포유류 세포 및 곤충 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법에서, 숙주 세포에, 벡터를 생체외 또는 시험관내에서 형질감염 또는 형질전이한 다음, 이를 환자에게, 바람직하게는 종양 부위나 그 부근에 또는 바이러스 감염 부위나 그 부근에 투여한다. 선택적으로, 세포는 전신 전달된다.
본원에 예시된 일부 방법 및 조성물은, 세포를 Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자로 형질감염시킨 다음 독성 퓨린 유사체로 변환되는 비교적 무독성의 퓨린 뉴클레오시드 프로드럭와 함께 투여하는 것을 포함한다. 특히 바람직한 프로드럭은 F-araA이지만, 본 발명에서 다른 프로드럭도 사용할 수 있다.
Tv-PNP 또는 tm-PNP는, 기질로서 아데닌 및 특정 구아닌-함유 뉴클레오시드 유사체를 수용하는데 보다 효과적이라는 점에서 인간 PNP와 차이가 있으며, 여러가지 박테리아 및 기생충 오리진의 구조적으로 비슷한 PNP와 비교하여, 특정 기질을 절단하는데 매우 효과적인 것으로, 본원에서 확인되었다. 종양 세포에서 발현되는 PNP는, 뉴클레오시드를 잘라 독성 퓨린 유사체를 방출시킨다. 이 퓨린 유사체는, 일반적으로, 생성된 세포 내에 남아있는 HSV Thd 키나제에 의해 제조되는 산물 등의 뉴클레오시드 모노포스페이트에 비해, 세포 막을 통과하여 자유롭게 확산된다. Tv-PNP 또는 tm-PNP에 의해 변환되어 생성된 독성 아데닌 유사체는, 아데닐 포스포리보실 트랜스퍼라제에 의해 독성 뉴클레오시드로 변환되며, 형질감염된 모든 세포를 사멸시키고, 세포 외부로 확산되어, 형질감염되지 않은 주변 세포(방관자 세포)를 사멸시킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 타겟 암성 세포 또는 타겟 바이러스 감염된 세포의 용혈 파괴 등의 파괴하도록 할 수 있는 생물학적인 기능 시스템으로서 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 프로드럭에 대한 Tv-PNP 효소 작용을 이용하여, 세포 막을 통과하여 세포 용혈을 야기할 수 있는 세포독성의 퓨린 유사체를 제조한다. 예로, 이러한 조성물은, 단위 부피 당 존재하는 Tv-PNP 또는 tm-PNP 효소의 카피 수에 대한 정보를 제공하는데, 프로드럭 : 프로드럭으로부터 유래된 세포독성의 절단 산물의 몰 비율은 활성 카이네틱(kinetic)을 나타낸다. 이러한 분석 결과들은 통상적인 HPLC 또는 기타 분석에 의해 쉽게 수득할 수 있다. 종양 타겟 세포의 경우, 이러한 결과를 시간 경과에 따른 종양 무게 스캔 결과와 조합하면, 이후의 Tv-PNP 또는 tm-PNP를 이용한 치료, 보조 화학치료, 외과적 치료, 방사선 치료 또는 이의 조합의 특성에 대한 매우 유용한 데이타가 제공된다.
PNP 코딩 서열의 전사 조절
바람직한 구현예에서, Tv-PNP 또는 tm-PNP는 원핵생물의 유전자 상에서 코딩되며, 포유류 세포에서의 Tv-PNP 또는 tm-PNP의 발현은 PNP-코딩 서열이 연결되는 진핵생물의 전사 조절 서열의 존재에 의해 달성된다. Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자는, 예컨대 시판 플라스미드 내부에서 수득되는, 강력한 구성(constitutive) 프로모터/인핸서 요소(예, SV40 초기 프로모터/인핸서 (pSVK30 Pharmacia, Piscataway, NJ), 몰로니 뮤라인 사코마 바이러스의 긴 말단 리피트(Moloney murine sarcoma virus long terminal repeat) (pBPV, Pharmacia), 마우스 유방암 바이러스의 긴 말단 리피트(mouse mammary tumor virus long terminal repeat)(pMSG, Pharmacia), 및 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터/인핸서(pCMVβ, Clontech, Palo Alto, CA))의 통제 하에 발현시킬 수 있다.
또한, Tv-PNP 또는 tm-PNP 코딩 서열의 발현을 특정 세포 타입으로만 제한하는 유전자 전사 조절 서열을 이용함으로써, 선택한 세포 집단을 저해 또는 파괴하도록 타겟화할 수 있는데, 이러한 전략을 전사 타겟팅이라고 한다. 전사 타겟팅을 위한 후보 조절 서열은, 바람직하게는 실험을 통해 확립된 2가지의 중요한 기준을 충족시킨다: (i) 조절 서열은 타겟 세포 내에서 치료학적 양으로 효소가 생산되도록 충분한 유전자 발현을 지시하며, (ii) 조절 서열은 비-타겟 세포 안에서 충분한 양으로 효소가 생성되어 치료 방식에 해가되도록 지시하지 않는다. 이러한 타겟팅 형태에 있어서, 조절 서열은, 조절 서열이 유래된 유전자를 발현하는 세포에서만, 활성화되는 유전자를 생산하도록 Tv-PNP 서열과 기능적으로 연결된다. 유전자 요법에서 전사 타겟팅 기준들을 만족시키는 것으로 입증된 조절 서열로는, 분비형 루코프로테아제 저해제, 계면활성제 단백질 A 및 α-테포프로테인 유전자로부터 유래된 조절 서열들이 있다. 이러한 방법에 대한 변형으로는 유도제의 국소 투여가 국소 유전자 발현을 유도하게 하는 "유도성"을 부여하는 조절 유전자를 이용하는 방법이 있다. 이러한 방법의 예로, 방사능-유도성 서열이 유전자 치료 적용 용도로 언급 및 주장되고 있으며(Weichselbaum, et al., Int . J. Radiation Oncology Biol. Phys., 24:565-567 (1992)), 본원에 적용된다.
조직-특이적인 인핸서/프로모터는 Tv-PNP 또는 tm-PNP 발현을 지시하는데 유효하며, 따라서, Tv-PNP 또는 tm-PNP-매개 독성을 특정 조직에 인가하도록 할 수 있다. 예컨대, 인간의 티로시나제 유전자 조절 서열이 Tv-PNP 또는 tm-PNP의 독성을 악성 흑색종 세포에 인가하는데 적합하다. 유전자의 5'-프라임 측면 영역(prime flanking region)(전사 개시부로부터 -769 bp)의 마우스 티로시나제 서열이 악성 흑색종 세포에서의 리포터 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 마우스와 인간 티로시나제 서열에서 5-프라임 측면 영역이 비슷하지만, Shibata et al., Journal of Biological Chemistry, 267:20584-20588 (1992)에 의해, Vile 및 Hart가 사용한, 동일 영역내 인간 5-프라임 측면 서열(전사 개시부로부터 -616 bp)은 조직 특이적인 발현을 부여하지 못하는 것으로 확인되었다. Shibata 등은, 5-프라임 측면 서열이 유전자 발현을 티로시나제 발현 세포(흑색종 또는 멜라닌세포)로 타겟화하는데 유용하지 않을 것이라고 제안하고 있지만, 미국 특허 6,017,896, 도 3에서 확인된 바와 같이, Shibata 등이 사용한 영역으로부터 상류의 약간 차이가 있는 단편이 실제 리포터 또는 대장균 PNP 발현을 특이적으로 흑색종 세포에 지시할 수 있으며, 마찬가지로 Tv-PNP 또는 tm-PNP를 구동할 수 있다.
따라서, 인간 티로시나제 서열은 Tv-PNP 또는 tm-PNP 발현을 인간 흑색종 세포에서 지시하는데 유용하다. 이러한 동일 서열은 흑색종 세포나 멜라닌 세포에서 다른 치료 유전자의 발현을 지시하는데에도 유용하다. 그외 조직-특이적인 유전자 조절 서열 및 요소들을 사용하여, 흑색종 이외의 특정 세포 타입에서 적합한 퓨린 유사체 뉴클레오시드 절단 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있다.
Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자의 전달
적합한 재조합 바이러스의 구축 및 포유류 세포로 Tv-PNP 또는 tm-PNP를 이동시키기 위한 아데노바이러스의 용도를 제공한다. 비-바이러스 유전자 전달도 사용할 수 있다. 그 예로, 임의의 캐리어 또는 안정화제를 사용하지 않은 DNA("노출(naked) DNA"), 제약학적 안정화제 또는 캐리어의 존재 하에 DNA("제형화된 DNA"), 세포내로의 도입을 용이하게 하는 단백질과 복합체를 이룬 DNA("분자 접합체") 또는 지질과의 DNA 복합체의 확산을 포함한다. 본원에는 박테리아 PNP 유전자의 지질-매개성 포유류 세포로의 전달이 예시되어 있다. 보다 상세하게는, 비-인간 PNP 유전자를 포함하는 플라스티드의 리포좀-매개 전달이 기술되어 있다. 또한, Tv-PNP 유전자를 세포에 이동시키는 특정 방법이 성공적인 타겟 세포의 저해를 확정짓는 유일한 방법은 아니므로, 다른 유전자 전달 방법도 일반적으로 적용할 수 있다. 따라서, 아래에 추가로 언급되는 바이러스 유래 전달 벡터를 이용한 유전자 전이도 사용할 수 있다. 이러한 방법들은, 이러한 방법들은 잘 공지되어 있으며, 본원에 기술된 유전자-매개 독소 치료법 용도에 맞게 쉽게 조정할 수 있다.
Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자의 전달 방법은 이의 형태에 의존되며, 적합한 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 방법의 예로는, 주입, 바이올리스틱 형질전환(biolistic transformation) 및 리포펙션에 의한 투여를 포함한다. 본원에서는, 포유류 세포에 대한 PNP 유전자의 지질-매개 전달의 사용이 예시되어 있다. 보다 상세하게는, 비-인간 PNP 유전자를 포함하는 플라스미드의 양이온성 리포좀-매개 전달이 언급되어 있다. 그러나, 세포에 PNP 유전자를 전달하는 특정 방법만이 성공적인 종양 세포의 손상에 결정적인 것은 아니기 때문에, 다른 유전자 전달 방법들도 적용할 수 있을 것이다. 따라서, 하기에 더욱 상세히 기술된, 바이러스-유래 전달 벡터를 이용하는 유전자 전이도 사용할 수 있다. 이러한 방법들은 잘 알려져 있으며, 본원에 기술된 유전자-매개 독소 요법에 사용하기 위해 쉽게 변경할 수 있다. 또한, 이러한 방법들을 이용하여 Tv-PNP 또는 tm-PNP와 같은 적합한 퓨린 유사체 뉴클레오시드 절단 효소를 코딩하는 유전자의 특정 캐리어의 타겟팅 특징을 이용함으로써, 특정 질환 및 세포 집단을 타겟팅할 수 있다.
종양 세포에 외래 유전자를 선택적으로 전달시키는데, 비병원성의 혐기성 박테리아가 사용되고 있다. 예컨대, 클로스트리듐 아세토부틸리컴(Clostridium acetobutylicum) 포자를 산소압이 낮은 종양의 괴사 영역에서만 발생되는 종양을 가지고 있는 마우스에 정맥내 주사한다. 하기 기술된 PNP 활성 분석을 이용하여, 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)가 MeP-dR을 MeP로 변환시키는 효소 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 이러한 사실은, 괴사성의 혐기성 센터를 가진 종양 덩어리에서, PNP 활성을 선택적으로 발현하는 메커니즘을 제안한다. 따라서, 종양에 Tv-PNP 또는 tm-PNP를 발현하는 클로스트리듐 균주를 감염시킨 후 플루다라빈과 같은 적합한 기질에 노출시킬 수 있다. 그러면, 종양 조직의 혐기성 센터에서 생장하는 클로스트리듐 박테리아의 PNP 활성은 상기 기질을 독성의 퓨린 유사체로 변환시키게 되고, 국소 분비되어 종양 세포를 손상시키게 된다. 또한, 대장균 및 살모넬라를 비롯한 다른 박테리아를 선택적으로 사용하여 Tv-PNP 또는 tm-PNP를 종양에 전달할 수 있다.
본 발명에서 작동가능한 다른 전달 시스템으로는, 예컨대 "스텔스(stealth): 및 다른 항체-접합된 리포좀(결장암을 타겟으로 하는 지질-매개 약물 등)과 같은 비히클, 세포 특이적인 리간드를 통한 DNA의 수용체-매개 타겟팅, 림프구-지향성 종양 타겟팅, 및 뮤라인 신경교종 세포의 생체내 고특이적인 치료학적 레트로바이러스 타겟팅을 포함한다(S.K. Huang et al., Cancer Research, 52:6774-6781 (1992); R.J. Debs et al., Am. Rev. Respir . Dis ., 135:731-737 (1987); K. Maruyama et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87:5744-5748 (1990); P. Pinnaduwage and L. Huang, Biochemistry, 31:2850-2855 (1992); A. Gabizon and Papahadjopoulas, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 85:6949-6953 (1988); S. Rosenberg et al., New England J. Med ., 323:570-578 (1990); K. Culver et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 88:3155-3159 (1991); G.Y. Wu and C.H. Wu, J. Biol. Chem ., 263, No. 29:14621-14624 (1988); Wagner et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 87:3410-3414 (1990); Curiel et al., Human Gene Ther ., 3:147-154 (1992); Litzinger, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187 (1992); Trubetskoy et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1131:311-313 (1992)). 이러한 방식은, 분열성 종양 세포 또는 종양 신혈관형성 쪽으로 향하게 하는 유전자 타겟팅 메커니즘과 관련하여, 증식성 종양 덩어리 내부에 소형 종양 세포 서브세트가 잘 확립될 수 있는 개선된 방법을 제공하며, 타겟 세포 안에, 근처에 존재하는 트리코모나스 바기날리스 퓨린 유사체 뉴클레오시드 절단 효소 또는 tm-PNP에 대한 기질 프로드럭을 투여한 후와 같이, 적절한 신호 후, 신속한 종양 감퇴 및 괴사를 매개하게 될 것이다.
치료 방법
치료 방법은 예시적으로 본 발명의 Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자를 세포에 형질감염시키거나 투여하면서 Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자 또는 단백질을 가진 세포를 적정 기질에 노출시키는 방법을 포함한다. 기질은, 세포독성의 퓨린 유사체 농도에 따라, Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자를 발현하는 세포 뿐만 아니라 Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자를 발현하는 세포의 주변의 방관자 세포를 저해 또는 사멸시키는 독성의 퓨린 유사체로 변환된다. Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자는, 예컨대 타겟화된 세포에 직접, 또는 특정 바이러스 벡터 또는 전달 제형의 선택을 통해서와 같이, 타겟팅 조성물과 조합하여 전신으로 투여된다. 세포는 바람직하게는 치료할 환자 신체내에서 생체내 처리되거나, 시험관내에서 처리된 후 환자에게 주입된다. Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자를 환자의 세포에 도입한 후, 타겟화된 세포에 대해, Tv-PNP 또는 tm-PNP가 세포독성의 퓨린 유사체로 변환되는 유효량으로, 프로드럭을 전신 또는 국소 투여한다. 프로드럭은 선택적으로 본 발명의 Tv-PNP 또는 tm-PNP 투여하기 전에, 투여와 함께 또는 투여한 후에 전달되는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 프로드럭은 Tv-PNP 또는 tm-PNP 투여 후에 투여된다.
다수의 타겟 세포에 형질감염시키거나 또는 Tv-PNP 또는 tm-PNP 효소를 투여하는데 있어서의 어려움으로 인해, 다른 PNP에 비해 이들 효소의 절단 카이네틱스는, 놀랍게도 F-araA와 같이 임상적으로 중요한 기질에 대해 유익한 치료학적 성과를 제공한다.
종양 치료
Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자는 선택적으로 흑색종, 췌장암, 간암 또는 결장암과 같은 전이성 고형 종양을 치료하기 위한 전략의 일부분으로 사용된다. 이러한 방법에 있어서, 종양 특이적인 프로모터의 통제 하에 Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA가 선택적으로 사용된다. 예를 들어, 타이로시나제 프로모터는 흑색종 세포에서 발현을 매개하는데 매우 특이성이 높으며, 대부분의 조직 타입들에서는 유전자 발현을 유도하지 않는다. 이러한 프로모터의 조절 통제 하에 있는 Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자는 미국 특허 6,017,896에서 대장균 PNP에 대해 입증된 바와 같이, 흑색종 종양에서 주로 활성화되고, 환자 신체의 어떤 부위에서도 활성화되지 않는다. 다른 종양 타입에 특이적인 프로모터, 예컨대 모든 고형암에 존재하는 빠르게 분열하는 내피 세포에서 활성인 프로모터를 사용하여, 원발암 또는 전이성 암에서만 Tv-PNP 또는 tm-PNP를 특이적으로 활성화한다. 이러한 프로세스에서, 종양 특이적인 프로모터의 통제 하에 Tv-PNP 또는 tm-PNP를 포함하는 플라스미드 DNA는 양이온성 리포좀을 이용하여 세포로 전달된다. 예로, 동물 모델에서, 100-400 mg의 플라스미드 DNA와, 지질 DOTMA (1,2-디올레일옥시프로필-3-트리메틸 암모늄 브로마이드) 및 DOPE (디올레오일 포스파티딜에탄올아민)의 1:1 혼합물 1200 - 3600 μM의 복합체를 이용하여, 환자의 종양 병소에 Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자를 전달할 수 있었다. 그런 다음, 전술한 함량의 프로드럭을 투여할 수 있다. 종양의 의학적 치료는 재정적 및 치료적 효용 측면에서 수행할 수 있다.
Tv-PNP 유전자를 선택적으로 사용하여, 인간 뇌암 치료를 위한 프로드럭을 활성화시킨다. 이러한 방법에 있어서, Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자를 포함하는 레트로바이러스 입자를 생산하는 세포주를, 환자의 중추신경계(CNS) 종양에 주입한다. 종양 덩어리 내부에 레트로바이러스 생산 세포주에 적절하게 주입하는 것은 MRI 스캐너로 수행할 수 있다. 레트로바이러스는 분열하는 세포 내부에서만 충분한 활성을 보이며 암 환자의 두개 내부에 있는 대부분의 분열하는 세포는 종양이므로, 레트로바이러스는 뇌 내부의 비-악성 세포 보다는 종양 자체에서 주로 활성을 나타낸다. 종양의 크기와 국지화 등의 환자의 임상적인 특징이, 주입할 생산 세포의 양을 결정짓게 된다. 예컨대, 외과적으로 접근할 수 없는 종양의 경우, 각 100 ㎕를 30회 주사하는(약 1 x 108 생산 세포 수/주입 ml으로 총 부피 3 ml), 부피의 생산 세포가 주촉성 지도(stereotactic guidance)하에 제공된다. 수술로 접근할 수 있는 종양의 경우, 분액 100 ㎕가 주입되며(약 1 x 108 cells/ml), Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자 전달을 이용하여 총 부피 10 ml로 주입한 후, F-araAMP (F-araA 프로드럭)를 주입한다. 이러한 방법은 방관자 사멸 및 비-분열성 세포에 대한 독성 2가지를 허용하는 식으로 설계되어 있으며, HSV dThd 키나제 및 간시클로비르를 이용한 이전의 시도 보다도 종양을 훨씬 더 많이 퇴화시키기 위한 것이다.
세포의 선택 집단의 파괴는 Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자의 전달 타겟팅에 의해 달성된다. 특이적인 세포 타입의 타겟팅에 바이러스 벡터의 자연 굴성 또는 생리학을 활용한다. 예를 들어, 레트로바이러스는 복제성 세포에서 높은 활성을 나타내었다. 정상(비-악성) 세포가 복제하지 않는 부위에서 증식하는 복제성 암 세포에 대한 선택적인 레트로바이러스-매개 유전자 전달 방법이, 동물과 인간의 임상 실험들 모두에서 치료학적으로 강력한 타겟팅 방법이다. 또한, 바이러스 벡터를 고형암과 같은 특정 부위에 바로 투여하여, 주변 조직에 비해 종양 세포로의 유전자 전달을 집중시킨다. 이러한 선택적인 전달 개념은 아데노바이러스 벡터에 의한 마우스 종양으로의 유전자 전달에서 입증되었다. 분자 접합체들을 개발하여, 수용체 결합 리간드가 폐암의 레시틴-매개 타겟팅에서 입증된 바와 같이, 선택적인 세포 타입에만 결합하게 할 수 있다.
종양 덩어리 중 작은 세포 분획에 Tv-PNP 또는 tm-PNP를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자의 발현을 타겟팅한 후, 기질 투여하는 방법은, 종양 정체(stasis)의 퇴화 또는 감소를 매개하는데 충분하다.
바이러스로 감염된 세포의 치료
본 발명에 기술된 방법들은, 종양 세포의 저해 및 종종 종양 세포 사멸 외에도, 바이러스 감염된 세포의 사멸에 이용할 수 있다. 바이러스 사멸의 일 구현예에서, 바이러스 감염된 세포내에서의 절단 효소의 발현을 타겟팅하는 능력 때문에, 선택 유전자의 전달 방법이 선택된다. 예컨대, 바이러스 감염된 세포는 바이러스 특이적인 프로모터와 같은 유전자의 발현을 조절 및 허용하기 위해 특별한 바이러스 유전자 서열을 이용한다. 이러한 서열들은 무감염 세포에는 존재하지 않는 것이다. Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자는 바이러스 감염된 세포 내에서 절단 효소를 선택적으로 발현시키기 위해, 바이러스 프로모터와 적합한 위치에 있게 된다. 그로 인해, 바이러스 감염된 세포는, F-araA 또는 독성 형태로의 변환이 고안된 다른 기질의 투여에 감수성을 가지게 된다.
유전자 조작 세포의 투여
또한, 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
특별한 이용을 위해, Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자를 수용하고 있는 세포를 선별하여 환자에게 투여한다. 이 방법은 대부분 Tv-PNP 또는 tm-PNP 절단 효소를 코딩하는 유전자의 생체외 전달 방법을 포함한다. 본 발명의 유전자를 수용하고 있는 세포는, F-araA와 같은 프로드럭을 조작된 세포를 사멸시키기 위해 투여하기 전까지, 치료 단백질을 생산하는 숙주 환자에게로 투여된다. 이 방법은 뇌내에서 티로신 하이드록실라제를 생산하도록 조작된 비-복제성 근원 세포에 사용되는 것과 같은 세포 요법에 유용하다.(Jiao et al., Nature, 362:450 (1993)).
세포에 PNP 효소의 직접 전달
프로드럭과 함께, 또는 프로드럭 없이, Tv-PNP 또는 tm-PNP 유전자가 아닌 Tv-PNP 또는 tm-PNP 단백질이 선택적으로 타겟 세포로 직접 전달된다. 예컨대, 퓨린 유사체 뉴클레오시드를 절단할 수 있는 Tv-PNP 또는 tm-PNP 효소는 시판되는 키트를 이용하여 이용가능한 재조합 단백질 기법을 통해 제조한다. 박테리아 Tv-PNP 단백질의 제조 방법의 일 예로서, Tv-PNP 코딩 서열을 pGEX-4T-1 (Pharmacia, Piscataway, NJ)의 다클론 부위에 "인 프래임"이도록 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질과 함께 표준 기법을 사용하여 삽입한다(상기 벡터의 클로닝 부위는 이 단계를 용이하게 수행할 수 있도록 모두 3개의 가능한 번역 리딩 프래임들에 코딩 서열을 삽입할 수 있게 함). 제조되는 플라스미드는 IPTG-유도성 원핵생물의 tac 프로모터의 전사 통제 하에 GST-PNP 융합 코딩 서열을 포함하게 된다. 이러한 재조합 플라스미드를 트리코모나스 바기날리스 세포에 형질전환하고, IPTG로 tac 프로모터를 유도한다. IPTG에 의해 유도된 세포를 용혈시키고, GST-PNP 융합 단백질을 글루타티온 세파로스 4B 컬럼에서 친화성 크로마토그래피로 정제한다. GST-PNP 융합 단백질을 용출시키고, 분자의 GST 부분은 트롬빈 절단을 통해 제거한다. 이러한 기법들과 시약들 모두 시판되고 있다(Pharmacia, Piscataway, NJ). 다른 재조합 단백질 제조 방법들은 공개된 실험 매뉴얼에 상세하게 기술되어 있다.
Tv-PNP 또는 tm-PNP가 프로드럭을 확산성 독소로 활성화시키기 때문에, 프로드럭을 투여하기 전에 타겟 세포의 외부로의 PNP 단백질의 전달은 치료학적 효과를 유도할 수 있다. Tv-PNP 또는 tm-PNP 단백질은 매우 다양한 기법에 의해 타겟 세포로 전달할 수 있다. 일 예로, 접근 가능한 위치에 있는 종양 덩어리에 직접 주사에 의해서와 같이, 타겟 조직에 캐리어와 함께 또는 캐리어 없이 단백질을 직접 적용하는 방법이 있다. 다른 예로는, Tv-PNP 또는 tm-PNP 단백질을, 종양 부위에서 항원을 인지하는 단일클론 항체에 부착시키는 방법이 있다(Villa et al., "A high-affinity human monoclonal antibody specific to the alternatively spliced EDA domain of fibronectin efficiently targets tumor neo-vasculature in vivo." Int . J. Cancer. 2008 Jun 1;122(11):2405-13. Nissim et al., "Historical development of monoclonal antibody therapeutics." Handbook of Exp . Pharmacol . 2008;(181):3-18).
기능성 단백질을 단일클론 항체에 결합시키는 방법은 기존에 개시되었다. Tv-PNP 또는 tm-PNP 접합된 단일클론 항체는, 예컨대 정맥내(IV)로 전신 투여하여, 타겟 조직에 특이적으로 결합시킨다. 이후 프로드럭의 전신 투여에 의해, 종양 부위 주위에 확산성 독소가 국소 생산되게 될 것이다. 다수의 실험들에서 종양 조직으로 특이적인 단백질을 타겟화하는 이러한 기술의 사용이 확인되었다. 단일클론 항체 외에도, 다른 리간드들을 타겟 세포에 대한 이의 특이성으로 선별하여 본원에 기술된 방법에 따라 테스트할 수 있다.
특이적인 타겟으로의 단백질 전달은 선택적으로 리포솜을 이용하여 달성된다. 리포솜 제조 방법은 기술되어 있다(예, Liposomes: A Practical Approach). 리포솜은 이의 외표면에 특이적인 리간드나 항체를 포함시켜 특정 부위로 타겟팅할 수 있다. 그 예로는, 리포솜 표면에 어시알로페튜인(asialofetuin)을 포함시켜 특정 간 세포 집단을 타겟팅하는 방법이 있다(Van Berkel et al., Targeted Diagnosis and Therapy, 5:225-249 (1991)). 또한, 특이적인 리포솜 제형으로 이식된 종양에 우선적으로 약물을 전달하는 이른바 스텔스 리포솜으로 잘 예시되는 바와 같이, 타겟화된 전달을 달성할 수 있다.(Allen, Liposomes in the Therapy of Infectious Diseases and Cancer, 405-415 (1989)). 리포솜을 주사 또는 이식한 후, 미결합 리포좀을 혈액으로부터 소거한 다음, 환자에게 타겟 부위에서 Tv-PNP에 의해 절단되는, F-araA와 같은 퓨린 유사체 프로드럭을 처리한다. 즉, 이러한 과정에는 적절한 타겟팅 비히클의 유용성만 요구될 뿐이다. 좀더 넓은 의미로, 타겟팅 전략은 PNP 단백질 또는 유전자 전달 후 프로드럭의 특이적인 전달로 확장시킬 수 있다.
다른 예로, 화합물은 개체에게 투여되는 Tv-PNP 단백질의 생물학적으로 활성을 나타내는 폴리펩타이드 단편이다. 생물학적으로 활성을 나타내는 펩타이드 또는 펩타이드 단편은 선택적으로 Tv-PNP의 돌연변이 형태이다. 임의의 특정 부위에서의 보존된 아미노산의 치환은, 바람직하게는 글리신 또는 알라닌으로의 돌연변이인 것으로 이해된다. 또한, 임의의 중성으로 하전된, 하전된, 소수성, 친수성, 합성, 반-자연, 비-인간 또는 그외 아미노산에 대한 돌연변이도 마찬가지로 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 보다 더 바람직한 돌연변이는 말단 정지 코돈 TAA를 제거하고 대신 꼬리가 연결된 돌연변이형 Tv-PNP(tmTv-PNP)를 발현하는, 프래임시프트 돌연변이를 포함한다.
선택적으로, 본 발명의 화합물에 포함되는. 야생형 Tv-PNP 단백질은 그 구조에, 본원에 예시된 폴리펩타이드와 비슷한 특징을 가진 분자를 형성시키거나 또는 형성시키지 않을 수 있는, 변형 및 변화가 이루어진다. 보존된 아미노산 잔기에서의 변화는 제조되는 단백질의 활성에 영향을 미칠 가능성이 클 것으로 보인다. 그러나, 리간드 상호작용, 단백질 분해에 대한 내성 또는 촉진, 세포내 또는 세포외 운반, 분비, 단백질-단백질 상호작용, 당화, 인산화, 황화 등의 번역 후 변형에 적용할 수 있는 아미노산 변화는, 생리학적 활성을 변형시키거나 유지하는 일부 능력을 유지하면서 본 발명의 화합물의 활성은 증가 또는 감소되는 결과를 발생시킬 수 있는 것으로 또한 생각된다. 서열에서, 활성을 감소하지 않는 수준에서 이루어지는, 다른 아미노산에 대한 특정 아미노산 치환은 공지되어 있다.
이러한 변화를 가함에 있어서, 아미노산의 친수도(hydropathic index)가 고려된다. 본 발명에서, 특정 아미노산은 친수도가 비슷한 다른 아미노산으로 치환되어 생물학적 활성이 비슷한 폴리펩타이드를 만들 수 있다. 각각의 아미노산에는 이의 소수성과 전하 특징들에 따라 친수도가 배정되어 있다. 이러한 친수도로는, 이소루신(+4.5); 발린(+4.2); 루신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스테인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)이 있다.
특정 이론으로 제한하고자 의도하지 않으며, 아미노산의 상대적인 친수성 특징은 제조되는 폴리펩타이드의 이차 구조를 결정하게 되고, 이로써 이 폴리펩타이드와 다른 분자의 상호작용을 지정하게 되는 것으로 생각된다. 당해 기술 분야에서는, 아미노산을 친수도가 비슷한 다른 아미노산으로 치환시킬 수 있으며 여전히 기능적으로 동일한 폴리펩타이드를 수득할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 이러한 변경에 있어서, 친수성 지수가 +2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, +1 이내 가 더 바람직하며, +0.5 이내가 보다 더 바람직하다.
전술한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄의 치환기의 상대적인 유사성, 예컨대 이의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기초로 한다. 전술한 다양한 특징들을 고려한 치환의 예들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, (오리지날 잔기 : 치환 예)(Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe), 및 (Val: Ile, Leu)이 있다. 이러한 내용에 대한 구현예들은 전술한 바와 같이 폴리펩타이드의 기능적 또는 생물학적 등가체를 포함한다. 특히 본 발명의 구현예들은, 대상 폴리펩타이드와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 95%의 서열 동일성을 가진 변이체들을 포함할 수 있다.
또한, 전술한 아미노산 치환들 중 임의의 치환을 형성할 수 있도록 조작가능하거나, 또는 동일한 의미의 코돈을 제조하는 것과 같이 침묵 돌연변이로서 작용하도록 조작가능한, Tv-PNP 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자에서의 임의의 핵산 치환은 본원에서 비슷하게 실시할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 치환 또는 이의 제조 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 매우 자명하다.
tm-PNP는 해당 유기체에서의 대응되는 야생형 PNP에 비해 절단 활성이 강한 것으로 놀랍게도 확인되었다. 본 발명에 따른 tm-PNP는, 바람직하게는, 모든 공지된 PNP 야생형 서열에 공통적인 말단 코돈이 프래임시프트를 통해 억제되고, 10 내지 50개의 부가적인 아미노산 잔기를 가진 말단 꼬리가 발현된 tm-PNP 아미노산 서열에 부가되는, PNP 뉴클레오티드 서열과 조합된 말단 150개의 핵산 염기내에서의 프래임시프트 돌연변이를 포함한다. 야생형 PNP 뉴클레오티드 서열에서의 프래임시프트는, 1개 이상의 뉴클레오티드 염기의 삽입 또는 결손을 통해 쉽게 이루어지나, 단 뉴클레오티드 염기의 삽입 또는 결손은 종결 코돈으로부터 상류에서의 3의 배수는 아닌 것으로 이해된다. 제조되는 꼬리는 야생형 뉴클레오티드 서열의 정지 코돈에 대해 인접한 PNP 뉴클레오티드 서열 영역으로부터의 코딩되는 아미노산이거나 또는 첨가된다. tm-PNP의 꼬리의 친수도 수치 및 10-50개의 아미노산 잔기 길이의 꼬리 길이는, MeP-dR과 비교하여 F-araA의 임상적으로 중요한 프로드럭 기질에 작용하는, tm-PNP 효소와 같이 선호적인 절단에 중요한 인자인 것으로 보인다. 특정 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니며, 본 발명의 tm-PNP의 꼬리는 야생형 효소에 비해 tm-PNP 프로드럭 결합부에 대한 리간드의 접근을 변형시키는 것으로 생각된다.
기질의 투여
Freidenreich et al., Cancer Chemother . Rep., 50:219-244, (1966)의 공식을 선택적으로 이용하여 인간 개체에 대한 기질의 최고 허용량을 결정한다. 예로, 마우스에 9일 동안 1일 당 1 kg 당 25 mg (MeP-dR)으로 (총 9회) 전신 투여한 경우, 일부 독성은 관찰되지만 치사 효과는 없었다. 이러한 결과로부터, 인간 투여량 75 mg MeP-dR/m2은, 식: 25 mg/kg x 3=75 mg/m2에 따라 결정된다. 이 함량 또는 약간 적은 함량이 개체 사멸없이 인간에서의 종양 세포 사멸을 극대화할 것으로 예상되며, 그에 따라 양호한 효능 내지 안전성 프로파일이 수득된다. 이러한 효능 기준은 암 치료 분야에서 허용된다. 보다 구체적으로, 투여되는 약물 수준은 최대 허용량의 약 10% 내지 1%의 범위이다(예, 7.5 mg/m2 - 0.75 mg/m2). 기질을 종양 부위나 또는 근처에 국소 유지시키는 투여 방식이 전신 투여 방식 보다 적은 기질 투여량으로도 유효할 것으로 보인다.
기질은 경구, 비경구(예, 정맥내), 근육내 주입, 종양내 주입, 복막내 주입 또는 경피로 투여될 수 있다. 필요한 기질의 실제 양은, 개체의 연령, 체중, 전체적인 상태, 치료 중인 질병의 중증도, 종양의 위치와 크기, 사용되는 특정 화합물, 투여 방식 등에 따라 환자에 따라 다를 것이다. 적정량은 당해 기술 분야의 당업자라면 본원이 기술된 내용을 제공하는 일상적인 실험만으로도 결정할 수 있다. 일반적으로, 투여량은, 바람직하게는, 예컨대 MeP-dR 또는 이의 기능 등가체의 경우에는 약 0.5-50 mg/m2의 범위일 것이다. 플루다르빈과 같은 프로드럭의 경우, 투여량은 개체에게 안전한 것으로 이미 확인된 용량이거나 그 미만의 용량이 전형적일 것이다.
의도한 투여 방식에 따라, 기질은 고체, 반고체 또는 액체 투약 형태로, 예컨대, 정제, 좌제, 환제, 캡슐제, 산제, 액제, 또는 현탁제, 바람직하기로는 정확한 투여량을 1회 투여하는데 적합한 단위 투여량으로, 약학 조성물로 투여할 수 있다. 이 조성물에는 유효량의 선택 기질과, 제약학적으로 허용가능한 담체를 조합하여 포함될 것이며, 또한, 다른 의약제, 조제약, 캐리어 또는 희석제를 포함할 수 있다. 용어 "제약학적으로 허용가능한"은 본원에서 개체에게 선택 기질과 함께 투여할 수 있는, 생물학적이 아니거나 부적절하지 않은 물질로서, 현저한 부적절한 생물학적 효과나 약학 조성물에 포함된 다른 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않는, 물질을 의미한다.
고체 조성물의 경우, 통상적인 무독성 고체 캐리어는, 예컨대 제약 등급의 만니톨, 락토스, 스타치, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈크, 셀룰로스, 글로코스, 슈크로스 및 마그네슘 카보네이트를 포함한다. 제약학적으로 투여할 수 있는 액체 조성물은, 예컨대 물, 염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등의 부형제 중에서 활성 화합물을 최적의 제약학적 보강제와 함께 용해 또는 분산시켜, 용액 또는 현탁제를 제조함으로써, 제조할 수 있다. 적절하게는, 투여할 약학 조성물에는 또한 습윤제, 유화제, pH 완충화제, 예컨대 소듐 아세테이트 또는 트리에탄올아민 올레이트와 같은 무독성의 보조 물질이 미량 포함될 수 있다. 이러한 투약 형태의 실제 제조 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있거나, 자명할 것이며, 예로, Remington's Pharmaceutical Sciences를 참조한다.
경구 투여를 위해, 미세 분말 또는 과립에는 희석제, 분산제 및/또는 표면 활성제가 포함될 수 있으며, 수 중에 또는 시럽 중에, 건조 상태나 비-수성 용액 또는 현탁화제가 포함될 수 있는 비-수성 현탁제의 캡슐 또는 사세트(sachet)로, 결합제 및 윤활제가 포함될 수 있는 정제, 또는 수 또는 시럽 중의 현탁제로 제시될 수 있다. 적절하거나 또는 필수적인 경우, 향제, 보존제, 현탁화제, 증점제 또는 유화제를 포함시킬 수 있다. 정제 및 과립제가 바람직한 경구 투여 형태이며, 이에 코팅할 수도 있다.
비경구 투여는 일반적으로 주입에 의한 것이다. 주사제는 통상적인 형태들, 액체 용액제 또는 현탁제 중 어느 하나, 용액에 적합하거나 주사 전의 고형 형태, 또는 주사 전 액체 중의 현탁제 또는 에멀젼제로 제조할 수 있다.
Tv-PNP 코딩 핵산을 포함하는 벡터
본 발명은 Tv-PNP를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 뉴클레오티드 서열이 숙주에서 전사되고 번역되도록 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 인자를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 바이러스 또는 플라스미드이다. 적합한 바이러스 벡터의 예로는, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페르 바이러스 및 아데노-레트로바이러스 벡터와 같은 키메라 바이러스 구조물을 포함한다. 사용가능한 아데노 바이러스 벡터들에는, 2형 또는 5형 등의 인간 아데노바이러스 및 조류, 소, 개, 설치류, 양, 돼지 또는 원숭이 기원 등으로 예시되는 동물 기원의 아데노바이러스가 있다.
시험관내 및 생체내 유전자 전달용 아데노-부속 바이러스로부터 유래된 벡터의 사용은 널리, 예컨대 미국 특허 4,797,368 및 미국 특허 5,139,941에 기술되어 있다. 일반적으로, rep 및/또는 cap 유전자는 삭제되고, 이동시킬 유전자로 치환된다. 재조합 바이러스 입자는, 인간 헬퍼 바이러스로 감염된 세포주로 2종의 플라스미드를 공동-형질감염시켜 제조한다. 형질감염되는 플라스미드는, 바이러스의 2가지의 역위 반복(inverted repeat) 영역이 측면에 위치한, 본 발명의 PNP를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 플라스미드와, 바이러스의 캡슐화 유전자(rep 및 cap)를 가지고 있는 제2 플라스미드를 포함한다. 그 후 재조합 바이러스 입자를 표준 기법으로 정제한다.
PNP 발현
본 발명의 Tv-PNP 효소는 생체내 및 시험관내에서 전사 및 번역된다. 생체내에서 단백질을 제조하기 위해, 특이적인 Tv-PNP를 코딩하는 핵산을 포함하고 있는 벡터를 세포에 생체내 또는 생체외로 도입한다. 이는, 세포를 전술한 벡터를 통해 동물에 다시 재도입하는 과정을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 대상 단백질은 세포 또는 세포 결핍 시스템에서 시험관내에서 제조한다. 이러한 방식으로 제조되는 단백질은 시험관내에서 사용하거나 또는 세포나 동물에 도입하여 원하는 산물을 제조한다.
포유류 세포에서 Tv-PNP를 발현시키는데에는, Tv-PNP 코딩 서열에 연결된 진핵생물의 전사 조절 서열이 필요할 수 있다. Tv-PNP 유전자는 시판 플라스미드에 포함된 강력한 구성적인 프로모터/인핸서 인자들(예, SV40 초기 프로모터/인핸서 (pSVK30 Pharmacia, Piscataway, NJ), 몰로니 뮤라인 사코마 바이러스의 긴 말단 리피트(pBPV, Pharmacia), 마우스 유방암 바이러스의 긴 말단 리피트(pMSG, Pharmacia), 및 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터/인핸서(pCMVβ, Clontech, Palo Alto, CA))의 통제 하에 발현시킬 수 있다.
다른 조직-특이적인 유전자 조절 서열 및 요소들을 이용하여, 흑색종 이외의 다른 특이적인 세포 타입에서 적합한 퓨린 유사체 뉴클레오시드 절단 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있으며, 예컨대, 조직-특이적인 프로모터는 예로 알부민, 장 지방산 결합 단백질, 우유 유장, 뉴로필라멘트, 피루베이트 키나제, 평활근 α-액틴 및 빌린(villin)의 프로모터를 포함한다.
하기 비제한적인 예로는 본 발명에 따른 특이적인 반응 계획 및 특이적인 본 발명의 화합물 및 중간체를 예시한다. 통상적인 생물학적 기법을 포함하는 방법들이 본원에 기술되어 있다. 이러한 기법들은 일반적으로 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; and Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (정기 업데이트됨)와 같은 방법 논문에 상세하게 기술되어 있다. 면역학적 방법(예, 항원-특이적인 항체의 제조, 면역침강 및 면역블롯팅)은 Current Protocols in Immunology, ed. Coligan et al., John Wiley & Sons, New York, 1991; and Methods of Immunological Analysis, ed. Masseyeff et al., John Wiley & Sons, New York, 1992에 기술되어 있다.
본 발명의 다양한 측면들은 하기 비제한적인 실시예로 예시된다. 실시예들은 예시 목적일 뿐 본 발명의 어떠한 실시로 제한하는 것은 아니다. 변이 및 변형은 본 발명의 사상과 범위로부터 이탈되지 않은 범위에서 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 실시예는 일반적으로 포유류 세포, 조직, 체액 또는 개체에 관한 것이지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 당해 기술 분야에 공지된 유사한 기법 및 다른 기법을 인간과 같은 다른 포유류에 대한 예로 쉽게 전환가능하다. 본원에 나타낸 시약은 포유류 간에 일반적으로 교차 반응하거나, 또는 유사한 특성을 가진 대체 시약은 상업적으로 구입가능하며, 당해 기술 분야의 당업자는 이러한 시약을 수득할 수 있는 지를 인지할 것이다.
기질 선택
적정 기질은 세포독성의 절단된 퓨린 염기 유사체와 비교하여 포유류 세포에 상대적으로 무독성인 것이 특징이다. 아래에 일부 기질의 예를 기재한다. 공통 약어(들)를 일부 화합물 다음에 ;에 기재한다:
9-(β-D-아라비노퓨라노실)-2-플루오로아데닌; F-araA, 플루다라빈
9-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실]-6-메틸퓨린; MeP-dR
9-(β-D-리보퓨라노실)-2-아미노-6-클로로-1-데아자퓨린; ACDP-R
7-(β-D-리보퓨라노실)-3-데아자구아닌
2-플루오로-2'-데옥시아데노신; F-dAdo
9-(5-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-6-메틸퓨린
2-플루오로-5'-데옥시아데노신
2-클로로-2'-데옥시아데노신; Cl-dAdo, 클라드리빈
5'-아미노-5'-데옥시-2-플루오로아데노신
9-(5-아미노-5-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-6-메틸퓨린
9-(α-D-리보퓨라노실)-2-플루오로아데닌
9-(2,3-디데옥시-β-D-리보퓨라노실)-6-메틸퓨린
2',3'-디데옥시-2-플루오로아데노신
9-(3-데옥시-β-D-리보퓨라노실]-6-메틸퓨린
2-플루오로-3'-데옥시아데노신
9-(α-L-리소퓨라노실)-2-플루오로아데닌
9-(α-L-리소퓨라노실)-6-메틸퓨린
9-(6-데옥시-β-D-알로퓨라노실)-6-메틸퓨린
9-(6-데옥시-β-D-알로퓨라노실)-2-플루오로아데닌
9-(6-데옥시-α-L-탈로퓨라노실)-6-메틸퓨린
9-(6-데옥시-α-L-탈로퓨라노실)-2-플루오로아데닌
9-(2,6-디데옥시-β-D-알로퓨라노실)-6-메틸퓨린
9-(2,6-디데옥시-β-D-알로퓨라노실)-2-플루오로아데닌
9-(2,6-디데옥시-α-L-탈로퓨라노실)-6-메틸퓨린
9-(2,6-디데옥시-α-L-탈로퓨라노실)-2-플루오로아데닌
9-(6,7-디데옥시-α-L-헵트-6-이노(yno)퓨라노실)-6-메틸퓨린
9-(6,7-디데옥시-α-L-헵트-6-이노퓨라노실)-2-플루오로아데닌
9-(6,7-디데옥시-β-D-헵트-6-이노퓨라노실)-6-메틸퓨린
9-(6,7-디데옥시-β-D-헵트-6-이노퓨라노실)-2-플루오로아데닌
9-(2,6,7-트리데옥시-α-L-헵트-6-이노퓨라노실)-6-메틸퓨린
9-(2,6,7-트리데옥시-α-L-헵트-6-이노퓨라노실)-2-플루오로아데닌
9-(2,6,7-트리데옥시-β-D-헵트-6-이노퓨라노실)-6-메틸퓨린
9-(2,6,7-트리데옥시-β-D-헵트-6-이노퓨라노실)-2-플루오로아데닌
9-(2,3-디데옥시-3-하이드록시메틸-α-D-리보퓨라노실)-6-티오구아닌
9-(5,5-디-C-메틸-β-D-리보퓨라노실)-2-플루오로-아데닌
9-(5,5-디-C-메틸-β-D-리보퓨라노실)-6-메틸퓨린
9-(5-데옥시-5-요오도-β-D-리보퓨라노실)-2-플루오로아데닌
9-(5-데옥시-5-요오도-β-D-리보퓨라노실)-6-메틸퓨린
9-(5-데옥시-5-메틸티오-β-D-리보퓨라노실)-2-플루오로아데닌
9-(5-데옥시-5-메틸티오-β-D-리보퓨라노실)-6-메틸퓨린.
다른 예들은 Ichikawa E. and Kato K., Curr . Med . Chem . 2001 Mar; 8(4): 385-423에 기재되어 있다.
일부 기질들은 다른 기질들 보다 허용성이 더 좋을 것으로 예상할 수 있다. 예로, F-araA는 보다 큰 치료학적 옵션을 제공하기 위해 다른 공지된 효소와 비교하여 Tv-PNP에 의해 빠른 속도로 절단된다.
도 1은 F-araA + 대장균 PNP 또는 Tv-PNP의 카이네틱(kinetic) 파라미터를 나타낸 것이다.
도 2는 세포의 10%만 Tv-PNP를 발현하고 있는 마우스의 종양 이종이식체에 대한 F-araAMP(F-ara의 프로드럭)의 효능을 나타낸 것이다.
도 3은 pCR4blunt-TvPNP로 표시되는 본 발명의 벡터 클론의 제한효소 부위 지도이다.
도 4는 도 3의 클론을 포괄한, pACCMV-TvPNP로 표시되는 Tv-PNP를 발현하는 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 제한효소 부위 지도이다.
도 5는 Tv-PNP와 EGFP를 공동-발현하는 본 발명의 렌티바이러스 벡터의 제한효소 부위 지도로서, 도 3의 클론을 포괄한 pWPI(+)-TvPNP로 표시된다.
도 6은 EGFP의 공동-발현없이 Tv-PNP를 발현하는 본 발명의 렌티바이러스 벡터의 제한효소 부위 지도로서, 도 3의 클론을 포괄하여 pHR'CMV-TvPNP로 표시된다.
도 7은 야생형 대장균과 관련된 아데노 바이러스에서 발현가능한 tm-PNP 뉴클레오티드 서열 지도이다.
도 8은 꼬리 부가를 나타낸 도 7의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 tm-PNP의 아미노산 서열이다.
실시예 1: Tv - PNP 발현 벡터의 제조
트리코모나스 바기날리스 게놈 DNA를, 메트로니다졸-내성 균주(R: CDC955)의 제1 DNA 클론과 민감성 균주(S3: CDC520)의 제2 DNA 클론으로부터 수득하였다. 이 2가지 샘플을 AccuPrime Pfx 슈퍼믹스(Invitrogen)를 이용하여 하기 프로모터로 PCR하여 TvPNP를 증폭하였다. 상기 프라이머는 TIGR 트리코모나스 게놈 프로젝트 웹 사이트에서 다운받은 TvPNP 서열을 기초로 설계하였다. 서열은 현재 GenBank (XM_001323400)에서 이용할 수 있다. 본원에서 사용한 Tv-PNP 프라이머에는 삽입 제한효소 부위를 포함시켰다: 정방향 프라이머 TvPNP-F: 5'-GTTAACGGATCCATGGCAACACCCCATAACTCTGCT-3'(HpaI & BamHI) (서열번호 1). Tv-PNP 역방향 프라이머 TvPNP-R: 5'-TCTAGAGTTAACGTCCTTATAATTTGATTGCTGCTTC -3'(XbaI & HpaI) (서열번호 2) 및 TvPNP-R1: 5'- ATAGTTTAGATCCGAGGACCAATCAT- 3'(서열번호 3). 야생형 Tv-PNP의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4로 기재한다. 야생형 Tv-PNP의 아미노산 서열은 서열번호 5로 기재한다.
1차 PCR을 TvPNP-F 및 Tv-PNPR1 프라이머를 이용하여 수행하였다. 그런 다음, 1차 PCR로 수득한 산물과 프라이머 TvPNP-F 및 TvPNP-R을 이용하여, 네스티드 PCR(2차)을 수행하였다. PCR 산물을 pCR4Blunt-Topo 벡터(Invitrogen)에 클로닝하고, 도 3에 나타낸 바와 같이 서열분석하였다(클론 ID = pCR4 Blunt-TvPNP). S 균주에는 TIGR 서열과 1개의 염기 차이가 있었지만, 코돈 Arg102 (CGC -> CGT) 변화는 없었다. R 클론을 TIGR 서열과 매칭되어, TvPNP(R) 클론을 이후 클로닝에 사용하였다. TvPNP를 발현하는 아데노바이러스를 제조하기 위해, 도 3의 TvPNP(R)을 EcoRI 및 XbaI으로 잘라, pACCMV.pLpA 아데노바이러스 전달 벡터의 EcoRI 및 XbaI 부위에 클로닝하였다. 도 4에 도시한 pACCMV-TvPNP를 pJM17 (Microbix)과 함께 형질감염하여, 293 세포에서 상동성 재조합을 통해 재조합 Ad-TvPNP를 수득하였다. 제조되는 Ad-TvPNP를 Tv-PNP 특이적인 PCR 및 Tv-PNP 활성 분석에 의해 동정한다.
2종의 다른 벡터들을 사용하여 Lenti-TvPNP 바이러스를 제작하였다. 도 3에 나타낸 TvPNP(R)를 변형 pWPI 벡터(Addgene.org으로부터 기원함, 클로닝을 위해 더 많은 제한효소 부위를 포함하도록 변형됨(pWPI-linker(+)))에 클로닝하였다. pWPI 벡터는 내부 리보솜 도입부(IRES) 통제 하에 강화된 그린 형광 단백질(EGFP)를 발현한다. 그런 후, pCR4Blunt-TvPNP로부터 PmeI 및 XbaI을 이용하여 TvPNP(R)을 분리하여, 도 5의 pWPI-linker(+) 벡터의 SnaBI 및 SpeI 부위에 클로닝하였다. PmeI 및 SnaBI는 블런트(blunt) 말단으로 잘리며, XbaI 및 SpeI는 동일한 오버행(overhang)을 만든다.
TvPNP(R)을 각각 pHR'CMV Luc W Sin-18 벡터 (per J. Bio. Chem ., Published on October 1, 2004 as Manuscript M410370200)에 루시퍼라제 유전자 위치에 클로닝하여, EGFP를 공동발현하지 않고 TvPNP를 발현하는 세포주를 제조하였다. TvPNP(R)를 pCR4Blunt-TvPNP로부터 BamHI 및 HpaI를 이용하여 분리하여, 도 6에 나타낸 pHR'CMV Luc W Sin-18 벡터의 BamHI 및 XhoI (클레나우 프레그먼트를 이용하여 블런트 엔드로 바꿈) 부위에 클로닝하였다.
실시예 2: Tv-PNP 효소에 대한 프로드럭 후보물질 동정
아래의 방법은, 야생형 대장균 PNP나 다른 PNP와 비교하여 야생형 Tv-PNP에 의해 보다 효과적으로 절단되는 기질을 동정하는데 사용할 수 있다. 이러한 방법으로 동정되는 프로드럭은 독성, 다양한 제약학적 캐리어와 함께 투여함에 있어서의 적합성 및 그외 약리학적 특성에 대해 동물 연구에서 추가로 평가할 수 있다.
본 발명은 기질의 절단을 시험관내에서 정량적으로 측정한다. 퓨린 유사체 뉴클레오시드(500 ㎕의 100 mM HEPES, pH 7.4, 50 mM 포타슘 포스페이트 중의, 0.1 mM)를, 100 ㎍/ml Tv-PNP 또는 야생형 대장균 PNP와 조합한다. 반응 혼합물을 25℃에서 1시간 인큐베이션하고, 각 샘플을 2분간 끓여 반응을 정지시킨다. 단백질 농도와 분석 시같은 특정 기질에 대한 효소 활성에 따라 다르다. 각 샘플을 역상 HPLC로 분석하여, 기질에서의 산물로의 변환을 측정한다. 뉴클레오시드 및 퓨린 유사체를 Spherisorb ODSI(5 ㎛) 컬럼(Keystone Scientific, Inc., State College, PA)에서 50 mM 암모늄 디하이드로겐 포스페이드(95%) 및 아세토니트릴(5%)이 포함된 용매를 이용하여 용출시킨다. 산물은 254 nm에서 흡광도를 측정하여 검출하고, 양성(authentic) 대조군 샘플과 체류 시간 및 흡광 스펙트럼을 비교하여 동정한다.
표 1에는 야생형 대장균 PNP 효소 활성을 야생형 Tv-PNP와 비교하여 다양한 기질의 존재하에 나타낸다. 다양한 화합물들을 Tv-PNP에 대한 기질로서의 효능을 대장균 PNP를 이용하여 병렬 비교(parallel comparison)로 테스트하였다. 화합물에는, 아데노신, 이노신, MeP-dR, 및 플루오로- 또는 클로로-치환된 아데노신의 다양한 유사체들이 포함된다. 표에 기재한 각 화합물 100 μM과 효소를 함께 인큐베이션하고, 뉴클레오시드로부터의 염기 HPLC 분리에 의해 효소 절단율을 결정하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, Tv-PNP는, 대장균 PNP가 F-araA를 절단하는 비율(1,250 nmol/mg/hour)의 약 23배의 비율(32,000 nmol/mg/hour)로 F-araA를 자른다. 이러한 결과는, 도 1에 나타낸 바와 같이, Tv-PNP의 F-araA에 대한 촉매적 효능이 대장균 PNP의 F-araA에 대한 촉매적 효능의 25배인 것으로 확인된 결과로(Vmax/Km = 944 vs. 38) 검증되었다. 이러한 Tv-PNP 효소의 높은 생물학적 활성으로, Tv-PNP를 프로드럭 기질로서 F-araA를 이용하여 병리학적 증상 치료에 사용하는 경우, 비정상적인 세포의 증식을 파괴하는데 더 큰 활성을 발휘하게 된다. F-araA는 야생형 대장균 PNP 효소를 발현하는 종양에서 완벽한 반응을 초래하는 것으로 보고되어 있어, 야생형 Tv-PNP 및 F-araA 조합 이용시의 독성 F-Ade의 제조의 적어도 23배 증가는 개선된 항종양 활성을 유도하게 된다.
또한, 표 1에서, Tv-PNP는 대장균 PNP와 비교하여 2-Cl-2'-데옥시아데노신 (Cl-dAdo, 클라드리빈)에 대한 활성이 더 높음에 유념한다. Tv-PNP는 Cl-dAdo를 특이 활성(specific activity) 320,000 nmole/kg/hour으로 절단하나, 동일 Cl-dAdo는 대장균에 의해 특이 활성 39,000 nmole/mg/hour으로 절단된다.
Tv-PNP 및 야생형 대장균 PNP의 기질 활성 비교; "-"는 절단 무 검출임
기질 트리코모나스 바기날리스 PNP 대장균 PNP
아데노신
9-β-D-아라비노퓨라노실-아데닌		 501,000
38,000		 398,000
610
9-β-D-자일로퓨라노실-아데닌 2 <2
3'-데옥시아데노신 (cordycepin) 2,000 <2
2',3'-디데옥시아데노신 640 <2
5'-데옥시아데노신
5'-아미노-5'-데옥시아데노신		 50,000
4,200		 8,400
540
아데노신의 5'-카르복스아미드 33 <1
9-β-D-피라노실-아데닌
2'-O메틸-아데노신
9-α-L-리소퓨라노실-아데닌		 2
<10
22,000		 <1
<1
3,700
이노신 154,000 342,000
2'-데옥시이노신 660,000 733,000
9-β-D-아라비노퓨라노실-하이포크산틴
9-β-D-아라비노퓨라노실-구아닌		 48
16		 61
310
7-β-D-리보syl-하이포크산틴
7-β-D-리보syl-6-티오구아닌		 2,300
435		 5,200
66
구아노신 14,000 156,000
9-β-D-리보퓨라노실-6-메틸퓨린 155,000 96,000
9-[5-데옥시-β-D-리보퓨라노실]-6-메틸퓨린 3,600 406
9-[2-데옥시-β-D-리보퓨라노실]-6-메틸퓨린
9-[β-D-아라비노퓨라노실]-6-메틸퓨린		 484,000
570		 528,000
14
9-[2-데옥시-α-D-리보퓨라노실]-6-메틸퓨린 <8 <1
9-[5-메틸-(탈로)-β-D-리보퓨라노실]-6-메틸퓨린 8,400 915
9-[5-메틸-(알로)-β-D-리보퓨라노실]-6-메틸퓨린 223 47
9-[5-메틸-(탈로)-2-데옥시-β-D-리보퓨라노실]-6-메틸퓨린 103,000 3,600
9-[5,5-디메틸-β-D-리보퓨라노실]-6-메틸퓨린 <8 <1
9-α-L-리소퓨라노실-6-메틸퓨린 10,000 320
7-[2-데옥시-α-L-리소퓨라노실]-6-메틸퓨린 <8 <1
9-[5-데옥시-α-L-리소퓨라노실]-6-메틸퓨린 246 20
9-[5-데옥시-5-요오도-α-L-리소퓨라노실]-6-메틸퓨린 <8 <1
2-F-2'-데옥시아데노신 (F-dAdo) 400,000 435,000
2-F-아데노신 185,000 215,000
9-β-D-아라비노퓨라노실-2-F-아데닌 (플루다라빈) 32,000 1,250
2-F-5'-데옥시-아데노신 50,000 29,000
9-α-L-리소퓨라노실-2-F-아데닌 28,200 7,800
2-Cl-2'-데옥시아데노신 (Cl-dAdo) 352,000 39,000
2-Cl-2'-데옥시아데노신 (β-L) <8 <1
2-Cl-2'-데옥시아데노신 (α-L) <8 <1
Tv-PNP 및 야생형 대장균 PNP는 실질적으로 구조와 기능이 비슷하다. 프로드럭을 세포독성의 화합물로 절단하는 효과에 있어, Tv-PNP와 대장균 PNP 간의 큰 차이가, Tv-PNP가 F-araA에 대해 인지가능한 수준의 활성을 가지고 있지 않다는 기존의 지식(Wang et al., id.)과 모순된다는 점을, 본 발명에서 발견하고 정량하였으며, 이는 본 발명의 신규성을 시사한다.
이러한 분석에 의해, Tv-PNP가, 야생형 대장균 PNP에 비해, 플루다라빈, 클라드리빈, 코르디세핀, 2',3'-디데옥시아데노신의 유사체, 5'-메틸(탈로)-6-메틸퓨린-리보시드, 5'-메틸(탈로)-2'-데옥시-6-메틸퓨린-리보시드, 5'-메틸(알로)-6-메틸퓨린-리보시드, 2-F-5'-데옥시아데노신, 또는 2-F-α-L-리소-아데닌에 대한 활성이 더 우수한 것으로 확인되었다. 따라서, 이들 기질들은, 병리 증상을 치료하기 위해, 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용하기 위한, 추가적인 평가에 적합한 바람직한 후보 드로드럭, 특히 USP 단계에서 상업적으로 이용가능한 프로드럭이다.
실시예 3: MeP-dR 및 F-araA를 절단하는 다양한 PNP의 능력 비교.
다양한 기원의 PNP의 상대적인 절단 활성을 비교하여, 실시예 2의 방법에 의해 중요한 화학치료제인 MeP-dR 및 F-araA의 절단에 최적 효소를 결정한다. 다양한 순도의 효소를, 100 μM MeP-dR 또는 F-araA와 인큐베이션하고, 실시예 2에 나타낸 바와 같이 HPLC에 의해 산물(MeP 또는 F-Ade)의 생성을 측정하여 절단율을 결정하였다. 그 결과는 표 2에 나타낸다.
유기체
MeP-dR 		F-araA
nmole/mg/hr
MeP-dR/F-araA
인간 PNP 35 <1 >35
트리코모나스 바기날리스 PNP 536,000 30,000 18
대장균 PNP 528,000 1,250 422
에어로박터 에어로게네스 PNP 6,638 10 464
아코레플라즈마 라이드로우이 PNP 6,090 19 320
클렙시엘라 sp PNP 11,432 32 357
살모넬라 티피무리움 PNP 9,150 20 458
바실러스 시리우스 PNP 1,400,000 13,000 108
툴라레미아 PNP 4,900 18 272
트립파노소마 브루세이 하이드롤라제 750 <1 >750
대장균 PNP 돌연변이 M65V 1823 3.9 469
tm-PNP 948 4.8 198
실시예 4: 30개의 잔기가 말단에 첨가된 대장균 PNP ( tm - PNP ) 발현 및 프로드럭 절단
뉴클레오티드 염기 2,134개인 야생형 대장균 PNP로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 pACCMV.plpA 아데노바이러스 전달 벡터의 EcoRI 및 XbaI 부위에 클로닝하였다. 이 서열에는, 1634번 잔기에 존재하던 아데노신 염기가 없어, 야생형 대장균 PNP와 차이가 생긴다. 야생형 대장균 PNP에서 상기 염기를 결손시켜 "GGTAA"를 만들면, "GAG" (글루탐산에 해당되는 239번째 코돈)와 종결 코돈인 "TAA"를 가지게 될 것이다. 이렇게 발생된 프래임시프트로, 야생형 대장균 PNP에서 발견되는 글루탐산의 말단으로서(239번 잔기)의 글루탐산 대신 30개의 아미노산 꼬리가 달리게 된다. 꼬리가 달린 돌연변이 PNP에 해당되는 코제닉스 서열(cogenics sequence)은 도 7에 나타내며, 꼬리가 달린 돌연변이 PNP의 개시(atg) 및 종결(taa) 코돈을 표시하고 아데노바이러스 전달 벡터 서열의 프래임시프트 영역을 표시하였다. 그 밖에도, 도 7에서 919번 염기에서 1632 염기 사이의 뉴클레오티드 서열은 아생형 PNP 뉴클레오티드 서열에 해당된다.
도 7의 뉴클레오티드 서열을 발현시켜 제조한 tm-PNP의 아미노산 서열은 도 8에 나타낸다. 야생형 대장균 PNP에서의 말단 글루탐산 대신 제공되는 30개의 아미노산 꼬리는 도 8에 강조하여 표시되어 있으며, 이를 서열번호 8로 나타낸다. 아데노바이러스 전달 벡터에 클로닝된 뉴클레오티드 서열(서열번호 6)에는, 야생형 대장균 PNP에서 발견되는 말단 글루탐산 아미노산 잔기 대신, 30개의 아미노산 꼬리 돌연변이(서열번호 8)이 포함된, 919번 염기에서 1722번 염기(서열번호 7) 사이의 뉴클레오티드 서열이 포함된다.
제조된 tm-PNP를 실시예 3에 상세하게 나타낸 바와 같이 MeP-dR 및 F-araA에 대한 절단 능력에 대해 조사하였다. tm-PNP의 MeP-dR/F-araA 비율은 198이었다. 야생형 대장균 PNP의 경우 이 비율은 422(표 2)이므로, F-araA 절단의 선택성이 2.3배 높다는 것을 의미한다. 즉, tm-PNP는 고형 종양의 치료에 있어 프로드럭 F-araAMP를 함께 사용하기 위한 바람직한 효소임을 의미한다.
tm-PNP는 대장균 PNP의 치환 돌연변이와의 절단 능력 비교에서 우수한 것으로 확인된다. 다수의 대장균 PNP 치환 돌연변이들은 WO　03/035012에 상세하게 기재되어 있으며, 이들은 야생형 대장균 PNP 단백질 서열의 65번 위치(fMET에서부터 카운팅)에 메티오닌 대신 아미노산 잔기 발린 치환(M65V)을 포함하고 있다. 정제된 효소에서 본 발명의 아미노산 꼬리가 없는 M65V에 대한, pACCMV.pLpA 아데노바이러스 전달 바이러스의 EcoRI 및 XbaI 부위의 비율은 593이었지만, 치환 돌연변이 대장균 PNP를 코딩하는 아데노바이러스 벡터를 주입한 종양에서 발현되는 효소는, 469±52었다. 모든 절단 비율 결과로, 이러한 결과들을 기질의 동일 몰량에 대해 정규화하였다.
생체내 효능 실험에서, tm-PNP는 M65V에 비해 현저하게 높은 항종양 활성을 나타내며, 이러한 차이는 pACCMV.pLpA 아데노바이러스 전달 벡터의 차별적인 EcoRI 및 XbaI의 절단 비율에 기인함을 의미한다.
실시예 5: 24개의 잔기의 꼬리가 말단에 달린 대장균 PNP(tm-PNP)의 발현 및 프로드럭 절단
도 7의 뉴클레오티드 서열을 변형시켜, 염기 1705번 다음에 아데노신 염기를 삽입하여 종결 코돈(TAA)을 만들고, 아생형 대장균 PNP의 말단에 있는 글루탐산 대신 24개의 아미노산 꼬리를 부가하였다. 이 24개의 아미노산 꼬리가 달린 tm-PNP는, 실시예 4에 상세히 기술된 바와 같이 pACCMV.pLpA 아데노바이러스 전달 벡터에 클로닝한 서열이며, 서열번호 9로 제공한다. 발현되는 아미노산 서열은 서열번호 10으로 제공한다.
실시예 6: 30개 잔기의 말단 꼬리가 달린 tmTv-PNP
실시예 4의 방법을 반복하여 Tn-PNP에서 TAA를 없애고, 아데노바이러스 발현 벡터에 폴리펩타이드 꼬리를 부가하였다. 이러한 30개의 아미노산 꼬리가 첨가된 tmTv-PNP는 실시예 4에 상세히 기술된 바와 같이 pACCMV.pLpA 아데노바이러스 전달 벡터에 클로닝한 서열이며, 서열번호 11로 제공한다. 발현되는 아미노산 서열은 서열번호 12로 제공한다.
본 명세서에 언급된 모든 특허들 또는 공개문헌들은 본 발명이 속하는 당해 기술 분야의 당업자들 수준을 나타낸다. 이들 특허와 공개문헌들은 각각의 공개문헌들이 원용에 의해 포함되는 것으로 특이적이고 개별적으로 표시된 바와 같은 수준으로 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
당해 기술 분야의 당업자는 본 발명이 언급한 목적을 수행하고 목표와 이점 뿐만 아니라 내재된 고유의 특징을 달성하기에 매우 적합하다는 것을 쉽게 인지할 것이다. 본 병세서에 기술된 본 발명의 방법, 절차, 처리, 분자 및 특정 화합물은 현재의 바람직한 구현예를 나타내며, 좋은 예를 제공하지만, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 청구 범위에 의해 규정되는 본 발명의 사상에 포함되는 이에 대한 변화 및 다른 용도들도 당해 기술 분야의 당업자라면 가능할 것이다.
<110> The UAB Research Foundation <120> PURINE NUCLEOSIDE PHOSPHORYLASE AS ENZYMATIC ACTIVATOR OF NUCLEOSIDE PRODRUGS <130> IPP20161944US <150> US 61/089235 <151> 2008-08-15 <150> US 61/225012 <151> 2009-07-13 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer TvPNP-F <400> 1 gttaacggat ccatggcaac accccataac tctgct 36 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer TvPNP-R <400> 2 tctagagtta acgtccttat aatttgattg ctgcttc 37 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer TvPNP-R1 <400> 3 atagtttaga tccgaggacc aatcat 26 <210> 4 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of wild-type TvPNP(R clone) <400> 4 ctttcatggc aacaccccat aactctgctc aggttggcga tttcgctgaa acagtcctca 60 tgtgcggtga tccactccgc gctaagctca ttgctgagac atatcttgaa aatccaaagc 120 ttgtcaacaa tgttcgtggc attcaaggct acaccggcac atacaaggga aagccaatct 180 ctgtcatggg ccatggtatg ggcttgccat caatctgcat ctatgcagag gagctttact 240 ccacatacaa ggtcaagaca atcatccgtg ttggtacatg cggcgcaatt gacatggaca 300 tccacacacg cgatatcgtt atcttcacct ctgctggtac aaactccaag atcaacagaa 360 tccgcttcat ggatcacgat tatccagcca cagcatcttt cgatgttgtt tgcgccttag 420 ttgatgctgc taaggaactc aacatcccag ctaaggtcgg taagggattc tcaacagatc 480 tcttctacaa tccacaaacc gaactcgcac agctcatgaa caagttccac ttcctcgctg 540 ttgaaatgga atctgctggc ctcttcccaa ttgctgacct ttatggcgca agagctggct 600 gcatctgcac agtttcagat cacatcctcc accatgaaga aacaacagcc gaagaacgcc 660 agaactcctt ccaaaacatg atgaagatcg cacttgaagc agcaatcaaa ttataaggac 720 720 <210> 5 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of wild-type TvPNP <400> 5 Met Ala Thr Pro His Asn Ser Ala Gln Val Gly Asp Phe Ala Glu Thr 1 5 10 15 Val Leu Met Cys Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Leu Ile Ala Glu Thr 20 25 30 Tyr Leu Glu Asn Pro Lys Leu Val Asn Asn Val Arg Gly Ile Gln Gly 35 40 45 Tyr Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Lys Pro Ile Ser Val Met Gly His Gly 50 55 60 Met Gly Leu Pro Ser Ile Cys Ile Tyr Ala Glu Glu Leu Tyr Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Lys Val Lys Thr Ile Ile Arg Val Gly Thr Cys Gly Ala Ile Asp 85 90 95 Met Asp Ile His Thr Arg Asp Ile Val Ile Phe Thr Ser Ala Gly Thr 100 105 110 Asn Ser Lys Ile Asn Arg Ile Arg Phe Met Asp His Asp Tyr Pro Ala 115 120 125 Thr Ala Ser Phe Asp Val Val Cys Ala Leu Val Asp Ala Ala Lys Glu 130 135 140 Leu Asn Ile Pro Ala Lys Val Gly Lys Gly Phe Ser Thr Asp Leu Phe 145 150 155 160 Tyr Asn Pro Gln Thr Glu Leu Ala Gln Leu Met Asn Lys Phe His Phe 165 170 175 Leu Ala Val Glu Met Glu Ser Ala Gly Leu Phe Pro Ile Ala Asp Leu 180 185 190 Tyr Gly Ala Arg Ala Gly Cys Ile Cys Thr Val Ser Asp His Ile Leu 195 200 205 His His Glu Glu Thr Thr Ala Glu Glu Arg Gln Asn Ser Phe Gln Asn 210 215 220 Met Met Lys Ile Ala Leu Glu Ala Ala Ile Lys Leu 225 230 235 <210> 6 <211> 2134 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 30 amino acid tail Tm- PNP region nucleotide sequence in Ad-PNP <400> 6 tctaggcggc cgcgatctat acattgaatc aatattggca attagccata ttagtcattg 60 gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat ctatatcata 120 atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttgacat tgattattga 180 ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 240 gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 300 tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 360 aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 420 caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 480 acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 540 ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 600 gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 660 gggactttcc aaaatgtcgt aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 720 tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc cggtcgcgcg 780 aattcgagct cggtacccgg ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt 840 ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg 900 aattgtaccc gcggccgcat ggctacccca cacattaatg cagaaatggg cgatttcgct 960 gacgtagttt tgatgccagg cgacccgctg cgtgcgaagt atattgctga aactttcctt 1020 gaagatgccc gtgaagtgaa caacgttcgc ggtatgctgg gcttcaccgg tacttacaaa 1080 ggccgcaaaa tttccgtaat gggtcacggt atgggtatcc cgtcctgctc catctacacc 1140 aaagaactga tcaccgattt cggcgtgaag aaaattatcc gcgtgggttc ctgtggcgca 1200 gttctgccgc acgtaaaact gcgcgacgtc gttatcggta tgggtgcctg caccgattcc 1260 aaagttaacc gcatccgttt taaagaccat gactttgccg ctatcgctga cttcgacatg 1320 gtgcgtaacg cagtagatgc agctaaagca ctgggtattg atgctcgcgt gggtaacctg 1380 ttctccgctg acctgttcta ctctccggac ggcgaaatgt tcgacgtgat ggaaaaatac 1440 ggcattctcg gcgtggaaat ggaagcggct ggtatctacg gcgtcgctgc agaatttggc 1500 gcgaaagccc tgaccatctg caccgtatct gaccacatcc gcactcacga gcagaccact 1560 gccgctgagc gtcagactac cttcaacgac atgatcaaaa tcgcactgga atccgttctg 1620 ctgggcgata aaggtaagcg gccgcgggga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag 1680 cttgggatct ttgtgaagga accttacttc tgtggtgtga cataattgga caaactacct 1740 acagagattt aaagctctaa ggtaaatata aaatttttaa gtgtataatg tgttaaacta 1800 ctgattctaa ttgtttgtgt attttagatt cacagtccca aggctcattt caggcccctc 1860 agtcctcaca gtctgttcat gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt 1920 gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt 1980 gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 2040 ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat 2100 gtatcttatc atgtctggat cgcggccgcc taga 2134 <210> 7 <211> 804 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coding sequence of SEQ ID. No. 6 <400> 7 atggctaccc cacacattaa tgcagaaatg ggcgatttcg ctgacgtagt tttgatgcca 60 ggcgacccgc tgcgtgcgaa gtatattgct gaaactttcc ttgaagatgc ccgtgaagtg 120 aacaacgttc gcggtatgct gggcttcacc ggtacttaca aaggccgcaa aatttccgta 180 atgggtcacg gtatgggtat cccgtcctgc tccatctaca ccaaagaact gatcaccgat 240 ttcggcgtga agaaaattat ccgcgtgggt tcctgtggcg cagttctgcc gcacgtaaaa 300 ctgcgcgacg tcgttatcgg tatgggtgcc tgcaccgatt ccaaagttaa ccgcatccgt 360 tttaaagacc atgactttgc cgctatcgct gacttcgaca tggtgcgtaa cgcagtagat 420 gcagctaaag cactgggtat tgatgctcgc gtgggtaacc tgttctccgc tgacctgttc 480 tactctccgg acggcgaaat gttcgacgtg atggaaaaat acggcattct cggcgtggaa 540 atggaagcgg ctggtatcta cggcgtcgct gcagaatttg gcgcgaaagc cctgaccatc 600 tgcaccgtat ctgaccacat ccgcactcac gagcagacca ctgccgctga gcgtcagact 660 accttcaacg acatgatcaa aatcgcactg gaatccgttc tgctgggcga taaaggtaag 720 cggccgcggg gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttgggat ctttgtgaag 780 gaaccttact tctgtggtgt gaca 804 <210> 8 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tm-PNP 30 amino acid tailed sequence in Ad-PNP <400> 8 Met Ala Thr Pro His Ile Asn Ala Glu Met Gly Asp Phe Ala Asp Val 1 5 10 15 Val Leu Met Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Tyr Ile Ala Glu Thr 20 25 30 Phe Leu Glu Asp Ala Arg Glu Val Asn Asn Val Arg Gly Met Leu Gly 35 40 45 Phe Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Arg Lys Ile Ser Val Met Gly His Gly 50 55 60 Met Gly Ile Pro Ser Cys Ser Ile Tyr Thr Lys Glu Leu Ile Thr Asp 65 70 75 80 Phe Gly Val Lys Lys Ile Ile Arg Val Gly Ser Cys Gly Ala Val Leu 85 90 95 Pro His Val Lys Leu Arg Asp Val Val Ile Gly Met Gly Ala Cys Thr 100 105 110 Asp Ser Lys Val Asn Arg Ile Arg Phe Lys Asp His Asp Phe Ala Ala 115 120 125 Ile Ala Asp Phe Asp Met Val Arg Asn Ala Val Asp Ala Ala Lys Ala 130 135 140 Leu Gly Ile Asp Ala Arg Val Gly Asn Leu Phe Ser Ala Asp Leu Phe 145 150 155 160 Tyr Ser Pro Asp Gly Glu Met Phe Asp Val Met Glu Lys Tyr Gly Ile 165 170 175 Leu Gly Val Glu Met Glu Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Val Ala Ala Glu 180 185 190 Phe Gly Ala Lys Ala Leu Thr Ile Cys Thr Val Ser Asp His Ile Arg 195 200 205 Thr His Glu Gln Thr Thr Ala Ala Glu Arg Gln Thr Thr Phe Asn Asp 210 215 220 Met Ile Lys Ile Ala Leu Glu Ser Val Leu Leu Gly Asp Lys Gly Lys 225 230 235 240 Arg Pro Arg Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Lys Leu Gly 245 250 255 Ile Phe Val Lys Glu Pro Tyr Phe Cys Gly Val Thr 260 265 <210> 9 <211> 2135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24 amino acid tail Tm- PNP region nucleotide sequence in Ad-PNP <400> 9 tctaggcggc cgcgatctat acattgaatc aatattggca attagccata ttagtcattg 60 gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat ctatatcata 120 atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttgacat tgattattga 180 ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 240 gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 300 tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 360 aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 420 caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 480 acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 540 ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 600 gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 660 gggactttcc aaaatgtcgt aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 720 tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc cggtcgcgcg 780 aattcgagct cggtacccgg ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt 840 ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg 900 aattgtaccc gcggccgcat ggctacccca cacattaatg cagaaatggg cgatttcgct 960 gacgtagttt tgatgccagg cgacccgctg cgtgcgaagt atattgctga aactttcctt 1020 gaagatgccc gtgaagtgaa caacgttcgc ggtatgctgg gcttcaccgg tacttacaaa 1080 ggccgcaaaa tttccgtaat gggtcacggt atgggtatcc cgtcctgctc catctacacc 1140 aaagaactga tcaccgattt cggcgtgaag aaaattatcc gcgtgggttc ctgtggcgca 1200 gttctgccgc acgtaaaact gcgcgacgtc gttatcggta tgggtgcctg caccgattcc 1260 aaagttaacc gcatccgttt taaagaccat gactttgccg ctatcgctga cttcgacatg 1320 gtgcgtaacg cagtagatgc agctaaagca ctgggtattg atgctcgcgt gggtaacctg 1380 ttctccgctg acctgttcta ctctccggac ggcgaaatgt tcgacgtgat ggaaaaatac 1440 ggcattctcg gcgtggaaat ggaagcggct ggtatctacg gcgtcgctgc agaatttggc 1500 gcgaaagccc tgaccatctg caccgtatct gaccacatcc gcactcacga gcagaccact 1560 gccgctgagc gtcagactac cttcaacgac atgatcaaaa tcgcactgga atccgttctg 1620 ctgggcgata aaggtaagcg gccgcgggga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag 1680 cttgggatct ttgtgaagga accttaactt ctgtggtgtg acataattgg acaaactacc 1740 tacagagatt taaagctcta aggtaaatat aaaattttta agtgtataat gtgttaaact 1800 actgattcta attgtttgtg tattttagat tcacagtccc aaggctcatt tcaggcccct 1860 cagtcctcac agtctgttca tgatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact 1920 tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt 1980 tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 2040 tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 2100 tgtatcttat catgtctgga tcgcggccgc ctaga 2135 <210> 10 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tm-PNP 24 amino acid tailed sequence in Ad-PNP <400> 10 Met Ala Thr Pro His Ile Asn Ala Glu Met Gly Asp Phe Ala Asp Val 1 5 10 15 Val Leu Met Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Tyr Ile Ala Glu Thr 20 25 30 Phe Leu Glu Asp Ala Arg Glu Val Asn Asn Val Arg Gly Met Leu Gly 35 40 45 Phe Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Arg Lys Ile Ser Val Met Gly His Gly 50 55 60 Met Gly Ile Pro Ser Cys Ser Ile Tyr Thr Lys Glu Leu Ile Thr Asp 65 70 75 80 Phe Gly Val Lys Lys Ile Ile Arg Val Gly Ser Cys Gly Ala Val Leu 85 90 95 Pro His Val Lys Leu Arg Asp Val Val Ile Gly Met Gly Ala Cys Thr 100 105 110 Asp Ser Lys Val Asn Arg Ile Arg Phe Lys Asp His Asp Phe Ala Ala 115 120 125 Ile Ala Asp Phe Asp Met Val Arg Asn Ala Val Asp Ala Ala Lys Ala 130 135 140 Leu Gly Ile Asp Ala Arg Val Gly Asn Leu Phe Ser Ala Asp Leu Phe 145 150 155 160 Tyr Ser Pro Asp Gly Glu Met Phe Asp Val Met Glu Lys Tyr Gly Ile 165 170 175 Leu Gly Val Glu Met Glu Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Val Ala Ala Glu 180 185 190 Phe Gly Ala Lys Ala Leu Thr Ile Cys Thr Val Ser Asp His Ile Arg 195 200 205 Thr His Glu Gln Thr Thr Ala Ala Glu Arg Gln Thr Thr Phe Asn Asp 210 215 220 Met Ile Lys Ile Ala Leu Glu Ser Val Leu Leu Gly Asp Lys Gly Lys 225 230 235 240 Arg Pro Arg Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Lys Leu Gly 245 250 255 Ile Phe Val Lys Glu Pro 260 <210> 11 <211> 801 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TvPNP+tail (from E.coli PNP) <400> 11 atggcaacac cccataactc tgctcaggtt ggcgatttcg ctgaaacagt cctcatgtgc 60 ggtgatccac tccgcgctaa gctcattgct gagacatatc ttgaaaatcc aaagcttgtc 120 aacaatgttc gtggcattca aggctacacc ggcacataca agggaaagcc aatctctgtc 180 atgggccatg gtatgggctt gccatcaatc tgcatctatg cagaggagct ttactccaca 240 tacaaggtca agacaatcat ccgtgttggt acatgcggcg caattgacat ggacatccac 300 acacgcgata tcgttatctt cacctctgct ggtacaaact ccaagatcaa cagaatccgc 360 ttcatggatc acgattatcc agccacagca tctttcgatg ttgtttgcgc cttagttgat 420 gctgctaagg aactcaacat cccagctaag gtcggtaagg gattctcaac agatctcttc 480 tacaatccac aaaccgaact cgcacagctc atgaacaagt tccacttcct cgctgttgaa 540 atggaatctg ctggcctctt cccaattgct gacctttatg gcgcaagagc tggctgcatc 600 tgcacagttt cagatcacat cctccaccat gaagaaacaa cagccgaaga acgccagaac 660 tccttccaaa acatgatgaa gatcgcactt gaagcagcaa tcaaattagg taagcggccg 720 cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg ggatctttgt gaaggaacct 780 tacttctgtg gtgtgacata a 801 <210> 12 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TvPNP+tail amino acid sequence <400> 12 Met Ala Thr Pro His Asn Ser Ala Gln Val Gly Asp Phe Ala Glu Thr 1 5 10 15 Val Leu Met Cys Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Leu Ile Ala Glu Thr 20 25 30 Tyr Leu Glu Asn Pro Lys Leu Val Asn Asn Val Arg Gly Ile Gln Gly 35 40 45 Tyr Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Lys Pro Ile Ser Val Met Gly His Gly 50 55 60 Met Gly Leu Pro Ser Ile Cys Ile Tyr Ala Glu Glu Leu Tyr Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Lys Val Lys Thr Ile Ile Arg Val Gly Thr Cys Gly Ala Ile Asp 85 90 95 Met Asp Ile His Thr Arg Asp Ile Val Ile Phe Thr Ser Ala Gly Thr 100 105 110 Asn Ser Lys Ile Asn Arg Ile Arg Phe Met Asp His Asp Tyr Pro Ala 115 120 125 Thr Ala Ser Phe Asp Val Val Cys Ala Leu Val Asp Ala Ala Lys Glu 130 135 140 Leu Asn Ile Pro Ala Lys Val Gly Lys Gly Phe Ser Thr Asp Leu Phe 145 150 155 160 Tyr Asn Pro Gln Thr Glu Leu Ala Gln Leu Met Asn Lys Phe His Phe 165 170 175 Leu Ala Val Glu Met Glu Ser Ala Gly Leu Phe Pro Ile Ala Asp Leu 180 185 190 Tyr Gly Ala Arg Ala Gly Cys Ile Cys Thr Val Ser Asp His Ile Leu 195 200 205 His His Glu Glu Thr Thr Ala Glu Glu Arg Gln Asn Ser Phe Gln Asn 210 215 220 Met Met Lys Ile Ala Leu Glu Ala Ala Ile Lys Leu Gly Lys Arg Pro 225 230 235 240 Arg Gly Ser Ser Arg Val Asp Leu Gln Ala Cys Lys Leu Gly Ile Phe 245 250 255 Val Lys Glu Pro Tyr Phe Cys Gly Val Thr 260 265

Claims (5)

  1. 포유류의 암성 세포 또는 바이러스 감염된 세포를 저해하는데 사용하기 위한 조성물로서,
    상기 조성물은 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 12의 서열을 갖는 꼬리 돌연변이형의 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소 및 상기 효소에 의해 절단되어 세포독성의 퓨린 유사체를 생성하는 절단가능한 기질을 포함하며, 상기 기질은 9-(β-D-아라비노퓨라노실)-2-플루오로아데닌 (플루다라빈), 클라드리빈, 5'-메틸(탈로)-6-메틸-퓨린-리보시드, 5'-메틸(탈로)-2'-데옥시-6-메틸퓨린-리보시드, 5'-메틸(알로)-6-메틸퓨린-리보시드, 2-F-5'-데옥시아데노신 및 2-F-α-L-리소-아데닌으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 꼬리 돌연변이형의 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소는 10 내지 50개의 아미노산 잔기로 이루어진 꼬리를 가진 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 꼬리는 대응되는 야생형 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소의 0 내지 10개의 아미노산 잔기를 잘라낸 것인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 상업적 키트로서,
    서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 12의 서열을 갖는 꼬리 돌연변이형의 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소를 코딩하는 발현가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터; 및
    상기 벡터를 세포에 도입하여 상기 꼬리 돌연변이형의 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소를 발현시킨 후, 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소에 의해 절단가능한 기질을 투여하여 세포독성의 퓨린 유사체를 수득하는 것에 관한 설명서를 포함하는 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 홍역 바이러스, 아데노-부속 바이러스 또는 베큘로바이러스인 것을 특징으로 하는 키트.
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