ES2609685T3 - Purina nucleósido fosforilasa como activador enzimático de profármacos de nucleósidos - Google Patents

Purina nucleósido fosforilasa como activador enzimático de profármacos de nucleósidos Download PDF

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Abstract

Sustrato escindible de enzima purina nucleósido fosforilasa de Trichomonas vaginalis para su uso en la inhibición de una célula cancerosa de mamífero o una célula viralmente infectada en el que dicho sustrato escindible se convierte en análogo de purina citotóxico mediante la proporción de una enzima purina nucleósido fosforilasa de Trichomonas vaginalis en proximidad a la célula de mamifero o la célula viralmente infectada en el que el sustrato escindible es 9-(β-D-arabinofuranosil)-2-fluoroadenina (fludarabina) y en el que la enzima purina nucleósido fosforilasa de Trichomonas vaginalis tiene la secuencia de SEQ ID NO: 5 o en el que el sustrato escindible se selecciona del grupo que consiste en 9-(β- D-arabinofuranosil)-2-fluoroadenina (fludarabina), cladribina, 5'-metil(talo)-6-metil-purina-ribósido, 5'- metil(talo)-2'-desoxi-6-metilpurina-ribósido, 5'-metil(alo)-6-metilpurina-ribósido, 2-F-5'-desoxiadenosina y 2- F-α-L-lixo-adenina y en el que un mutante con cola de enzima purina nucleósido fosforilasa de Trichomonas vaginalis tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12

Description

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Chem., 263, No. 29:14621-14624 (1988); Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414 (1990); Curiel et al., Human Gene Ther., 3:147-154 (1992); Litzinger, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187 (1992); Trubetskoy et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1131:311-313 (1992)). El presente enfoque, dentro de contexto de un mecanismo de direccionamiento génico o bien dirigido a células tumorales en división o bien a la neovascularización tumoral, ofrece una tecnología mejorada mediante la cual puede establecerse un pequeño subconjunto de células tumorales dentro de una masa tumoral en crecimiento, lo que mediaría en la necrosis e involución tumoral rápida tras la señal apropiada, tal como tras la administración del profármaco de sustrato para una enzima de escisión de nucleósido de análogo de purina de T. vaginalis o tm-PNP presente en, o próxima a, las células diana.
Métodos de tratamiento
El método de tratamiento incluye de manera ilustrativa transfectar o administrar de otra forma un gen de Tv-PNP o tm-PNP de la invención a células junto con la exposición de las células con el gen de Tv-PNP o tm-PNP o proteína a un sustrato apropiado. El sustrato se convierte en un análogo de purina tóxico que inhibe o destruye las células que expresan el gen de Tv-PNP o tm-PNP así como las células inespecíficas en las proximidades de las células que expresan el gen de Tv-PNP o tm-PNP, dependiendo de la concentración de análogo de purina citotóxico. El gen de Tv-PNP o tm-PNP se administra de manera ilustrativa directamente a las células seleccionadas como diana o de manera sistémica en combinación con una composición de direccionamiento, tal como a través de la selección de un vector viral o formulación de suministro particular. Las células se tratan preferiblemente in vivo, dentro del paciente que va a tratarse, o se tratan in vitro, luego se inyectan en el paciente. Tras la introducción del gen de Tv-PNP o tm-PNP en las células en el paciente, se administra el profármaco, de manera sistémica o local, en una cantidad eficaz para convertirse mediante la Tv-PNP o tm-PNP en un análogo de purina citotóxico en relación con células seleccionadas como diana. Se aprecia que el profármaco se suministra opcionalmente antes de, junto con, o posteriormente a la administración de la Tv-PNP o tm-PNP de la invención. Preferiblemente, el profármaco se administra posteriormente a la administración del Tv-PNP o tm-PNP.
Debido a las dificultades en la transfección de grandes números de células dianas o la administración de enzima Tv-PNP o tm-PNP, la cinética de escisión de esta enzima en relación con otras PNP proporciona resultados terapéuticos sorprendentemente beneficiosos con sustratos de importancia clínica tales como F-araA.
Tratamiento de tumores
El gen de Tv-PNP o tm-PNP se usa opcionalmente como parte de una estrategia para tratar tumores sólidos metastásicos, tales como melanoma, carcinoma pancreático, de hígado o colónico. En este método, se usa opcionalmente ADN de plásmido que contiene un gen de Tv-PNP o tm-PNP bajo el control de promotores específicos de tumor. Por ejemplo, el promotor de tirosinasa es altamente específico para mediar en la expresión en células de melanoma y no conduce a expresión génica en la mayoría de los tipos de tejido. El gen de Tv-PNP o tm-PNP bajo el control regulador de este promotor se activa predominantemente dentro de un tumor de melanoma y no en otra parte dentro de un paciente tal como se evidencia para PNP de E. coli en la patente estadounidense n.º
6.017.896. Se usan promotores específicos para otros tipos de tumores, por ejemplo, promotores activos en las células endoteliales que se dividen rápidamente presentes en todos los tumores sólidos para activar específicamente Tv-PNP o tm-PNP sólo dentro de un tumor primario o metastásico. En este procedimiento, se suministra ADN de plásmido que contiene Tv-PNP o tm-PNP bajo el control de un promotor específico de tumor a células usando liposomas catiónicos. Por ejemplo, basándose en estudios con animales, podrían usarse 100-400 mg de ADN de plásmido complejado 1200-3600 micromoles de una mezcla 1:1 de los lípidos DOTMA (bromuro de 1,2dioleiloxipropil-3-trimetilamonio) y DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina) para suministrar el gen de Tv-PNP o tm-PNP a metástasis tumorales en pacientes. Entonces puede administrarse un profármaco en las cantidades descritas anteriormente. El tratamiento médico de tumores puede realizarse para beneficio financiero y terapéutico.
El gen de Tv-PNP se usa opcionalmente para activar profármacos para el tratamiento de cáncer de cerebro humano. En este procedimiento, se inyecta una línea celular que produce partículas retrovirales que contienen el gen de Tv-PNP o tm-PNP en un tumor del sistema nervioso central (SNC) dentro de un paciente. Puede hacerse funcionar un escáner de IRM para inyectar apropiadamente la línea celular productora de retrovirus dentro de la masa tumoral. Debido a que el retrovirus es completamente activo sólo dentro de células en división y la mayoría de las células en división dentro del cráneo de un paciente con cáncer están dentro del tumor, el retrovirus es principalmente activo en el propio tumor, en vez de en células no malignas dentro del cerebro. Las características clínicas del paciente incluyendo la localización y el tamaño tumoral determinan la cantidad de células productoras que han de inyectarse. Por ejemplo, se proporciona un volumen de células productoras en el intervalo de 30 inyecciones de 100 microlitros cada una (volumen total de 3 ml con aproximadamente 1 x 108 células productoras/ml inyectados) bajo orientación estereotáctica para tumores inaccesibles quirúrgicamente. Para tumores a los que puede realizarse una aproximación intraoperatoria, se inyectan alícuotas de 100 l (a aproximadamente 1 x 108 células/ml) con volúmenes inyectados totales de hasta 10 ml usando transferencia génica de Tv-PNP o tm-PNP, seguido por administración de F-araAMP (un profármaco de F-araA). Esta estrategia está diseñada para permitir tanto destrucción inespecífica como toxicidad en células que no se dividen y está diseñada para lograr una involución tumoral mucho mayor que los intentos anteriores usando HSV dThd cinasa y ganciclovir.
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La destrucción de poblaciones seleccionadas de células se logra dirigiendo el suministro del gen de Tv-PNP o tm-PNP. Se aprovecha el tropismo natural o la fisiología de los vectores virales en la selección como diana de tipos de células específicos. Por ejemplo, los retrovirus demuestran una actividad aumentada en células en replicación. La transferencia génica mediada por retrovirus selectiva a células cancerosas en replicación que crecen dentro de un sitio en donde las células normales (no malignas) no están replicándose es un método de direccionamiento terapéuticamente poderoso en estudios clínicos tanto con animales como con seres humanos. Alternativamente, el vector viral se administra directamente a un sitio específico tal como un tumor sólido concentrando de ese modo el gen en las células tumorales en contraposición a los tejidos circundantes. Este concepto de suministro selectivo se ha demostrado en el suministro de genes a tumores en ratones mediante vectores de adenovirus. Pueden desarrollarse conjugados moleculares de modo que el ligando que se une al receptor se una no sólo a tipos de células selectivos, tal como se ha demostrado para la selección como diana mediada por lectina de cáncer de pulmón.
El direccionamiento de un gen que codifica para una Tv-PNP o tm-PNP o la expresión del gen en una fracción pequeña de las células en una masa tumoral seguido administración del sustrato es adecuado para mediar en la involución de la reducción o estasis tumoral.
Tratamiento de células infectadas viralmente
Además de inhibir, y a menudo destruir las células tumorales, los procedimientos descritos en el presente documento también pueden usarse para destruir células infectadas viralmente. En una realización de destrucción de virus, el método de transferencia génica seleccionado se elige por su capacidad para dirigir la expresión de la enzima de escisión en células infectadas viralmente. Por ejemplo, las células infectadas viralmente utilizan secuencias génicas virales especiales para regular y permitir la expresión génica tales como promotores específicos de virus. Tales secuencias no están presentes en células no infectadas. El gen de Tv-PNP o tm-PNP se orienta apropiadamente con respecto a un promotor viral de este tipo para generar expresión selectiva de la enzima de escisión dentro de células infectadas viralmente. Las células infectadas viralmente son susceptibles de ese modo a la administración de F-araA u otros sustratos diseñados para convertirse en una forma tóxica.
Administración de células modificadas por ingeniería genética
También se proporciona una célula huésped transformada con un vector de la presente divulgación.
Para determinadas aplicaciones, se seleccionan células que reciben el gen de Tv-PNP o tm-PNP y se administran a un paciente. Este método implica lo más comúnmente la transferencia ex vivo del gen que codifica para la enzima de escisión Tv-PNP o tm-PNP. Las células que reciben los genes de la invención se administran al paciente huésped en donde producen la proteína terapéutica hasta que el profármaco, tal como F-araA, se administra para eliminar las células modificadas por ingeniería genética. Este método es útil en terapias celulares tales como las usadas mioblastos que no se replican modificados por ingeniería genética para la producción de tirosina hidroxilasa dentro del cerebro (Jiao et al., Nature, 362:450 (1993)).
Suministro directo de la enzima PNP a células
Se administra opcionalmente proteína Tv-PNP o tm-PNP con o sin un profármaco directamente a células diana en vez del gen de Tv-PNP o tm-PNP. De manera ilustrativa, se fabrica una enzima Tv-PNP o tm-PNP que puede escindir nucleósidos de análogo de purina mediante técnicas de proteínas recombinantes disponibles usando un kit disponible comercialmente. Como ejemplo de un método para producir la proteína Tv-PNP bacteriana, se liga la secuencia que codifica para Tv-PNP en el sitio de clonación múltiple de pGEX-4T-1 (Pharmacia, Piscataway, NJ) para que esté “en marco” con la proteína de fusión glutatión-s-transferasa (GST) usando técnicas convencionales (obsérvese que el sitio de clonación de este vector permite la inserción de secuencias codificantes en los tres posibles marcos de lectura de traducción posibles para facilitar esta etapa). El plásmido resultante contiene la secuencia que codifica para la fusión GST-PNP bajo el control transcripcional del promotor tac procariota inducible con IPTG. Se transforman células de T. vaginalis con el plásmido recombinante y el promotor tac inducido con IPTG. Se lisan las células inducidas con IPTG, y se purifica la proteína de fusión GST-PNP mediante cromatografía de afinidad sobre una columna de glutatión Sepharose 4B. Se eluye la proteína de fusión GST-PNP, y se elimina la parte de GST de la molécula mediante escisión con trombina. Todas estas técnicas y reactivos están disponibles comercialmente (Pharmacia, Piscataway, NJ). Otros métodos para la producción de proteínas recombinantes se describen en detalle en manuales de laboratorio publicados.
Puesto que la Tv-PNP o tm-PNP activa profármacos para dar toxinas difusibles, el suministro de la proteína PNP al exterior de las células diana antes de la administración del profármaco es operativo para inducir un efecto terapéutico. La proteína Tv-PNP o tm-PNP puede administrarse a células diana mediante una amplia variedad de técnicas. Un ejemplo es la aplicación directa de la proteína con o sin un portador a un tejido diana tal como inyectando directamente una masa tumoral dentro de un sitio accesible. Otro ejemplo es la unión de la proteína Tv-PNP o tm-PNP a un anticuerpo monoclonal que reconoce un antígeno en el sitio tumoral. (Villa et al., “A high-affinity human monoclonal antibody specific to the alternatively spliced EDA domain of fibronectin efficiently targets tumor neo-vasculature in vivo”. Int. J. Cancer. 1 de junio de 2008; 122(11):2405-13. Nissim et al., “Historical development of
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monoclonal antibody therapeutics”. Handbook of Exp. Pharmacol. 2008; (181):3-18.)
Se han descrito anteriormente métodos para unir proteínas funcionales a anticuerpos monoclonales. El anticuerpo monoclonal conjugado con Tv-PNP o tm-PNP se administra de manera sistémica, por ejemplo por vía intravenosa (i.v.), y se une específicamente al tejido diana. La administración sistémica posterior del profármaco dará como resultado la producción local de toxina difusible en las proximidades del sitio tumoral. Varios estudios demostraron el uso de esta tecnología para dirigir proteínas específicas a tejido tumoral. Otros ligandos, además de anticuerpos monoclonales, pueden seleccionarse por su especificidad por una célula diana y someterse a prueba según los métodos enseñados en el presente documento.
El suministro de proteínas a dianas específicas se logra opcionalmente usando liposomas. Se describen métodos para producir liposomas (por ejemplo, Liposomes: A Practical Approach). Los liposomas pueden dirigirse a sitios específicos mediante la inclusión de ligandos o anticuerpos específicos en su superficie exterior. Un ejemplo ilustrativo son poblaciones de células de hígado específicas seleccionadas como diana por la inclusión de asialofetuina en la superficie liposómica (Van Berkel et al., Targeted Diagnoses and Therapy, 5:225-249 (1991)). Formulaciones liposómicas específicas también pueden lograr un suministro dirigido tal como se ejemplifica de la mejor manera mediante los denominados liposomas furtivos que suministran preferentemente fármacos a tumores implantados (Allen, Liposomes in the Therapy of Infectious Diseases and Cancer, 405-415 (1989)). Tras haberse inyectado o implantado los liposomas, se aclara el liposoma no unido de la sangre, y se trata el paciente con el profármaco de análogo de purina, tal como F-araA, que se escinde por la Tv-PNP en el sitio seleccionado como diana. De nuevo, este procedimiento requiere sólo la disponibilidad de un vehículo de direccionamiento apropiado. En un sentido más amplio, la estrategia de direccionamiento puede extenderse al suministro específico del profármaco tras el suministro de o bien el gen o bien la proteína PNP.
Alternativamente, un compuesto es un fragmento de polipéptido biológicamente activo de proteína Tv-PNP que se administra a un sujeto. Un fragmento de péptido o péptido biológicamente activo es opcionalmente una forma mutante de Tv-PNP. Se aprecia que la mutación del aminoácido conservado en cualquier sitio particular se muta preferiblemente a glicina o alanina. Se aprecia además que la mutación a cualquier aminoácido cargado de manera neutra, cargado, hidrófobo, hidrófilo, sintético, no natural, no humano u otro puede funcionar de manera similar. Un mutante todavía más preferido implica una mutación del marco de lectura para eliminar el codón de terminación terminal TAA y en su lugar expresar una Tv-PNP mutante con cola (tmTv-PNP).
Se hacen opcionalmente modificaciones y cambios en la estructura (primaria, secundaria o terciaria) de la proteína Tv-PNP silvestre que están englobadas dentro del compuesto que pueden dar como resultado o no una molécula que tiene características similares a los polipéptidos a modo de ejemplo dados a conocer en el presente documento. Se aprecia que cambios en residuos de aminoácido conservados tienen un impacto lo más probablemente sobre la actividad de la proteína resultante. Sin embargo, se aprecia además que cambios en aminoácidos que pueden funcionar para la interacción con ligandos, resistencia o promoción de la degradación de la proteína, tráfico intracelular o extracelular, secreción, interacción proteína-proteína, modificación postraduccional tal como glicosilación, fosforilación, sulfatación, y similares, pueden dar como resultado actividad aumentada o disminuida de un compuesto de la invención al tiempo que se retiene parte de la capacidad para alterar o mantener una actividad fisiológica. Se sabe que se producen determinadas sustituciones de aminoácidos para otros aminoácidos en una secuencia sin pérdida de actividad apreciable.
Al hacer tales cambios, se considera el índice terapéutico de los aminoácidos. Según la presente divulgación pueden sustituirse determinados aminoácidos por otros aminoácidos que tienen un índice hidropático similar y todavía dan como resultado un polipéptido con actividad biológica similar. A cada aminoácido se le asigna un índice hidropático basándose en su hidrofobicidad y características de carga. Esos índices son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Sin pretender limitarse a una teoría particular, se cree que el carácter hidropático relativo del aminoácido determina la estructura secundaria del polipéptido resultante, lo que a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas. Se sabe en la técnica que un aminoácido puede sustituirse por otro aminoácido que tiene un índice hidropático similar y todavía obtener un polipéptido funcionalmente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2, se prefieren particularmente los que están dentro de ±1, y se prefieren incluso más los que están dentro de ±0,5.
Tal como se explicó de manera resumida anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral del aminoácido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. Los expertos en la técnica conocen bien sustituciones a modo de ejemplo que pueden tener en consideración diversas de las características anteriores e incluyen(residuo original: sustitución a modo de ejemplo): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) y (Val: Ile, Leu). Aspectos de esta divulgación contemplan por tanto equivalentes funcionales o biológicos equivalentes de un polipéptido tal como se expuso anteriormente. En particular, las realizaciones de los polipéptidos
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Masseyeff et al., John Wiley & Sons, Nueva York, 1992. Se ilustran diversos aspectos de la presente divulgación mediante los siguientes ejemplos no limitativos. Los ejemplos son para fines ilustrativos y no son una limitación sobre cualquier práctica de la presente divulgación. Aunque los ejemplos se refieren generalmente a células, tejido, fluidos o sujetos mamíferos, una persona que tiene un conocimiento habitual en la técnica reconoce que técnicas similares y otras técnicas conocidas en la técnica trasladan fácilmente los ejemplos a otros mamíferos tales como seres humanos. Los reactivos ilustrados en el presente documento reaccionan de manera cruzada comúnmente entre especies de mamífero o están disponibles
comercialmente reactivos alternativos con propiedades similares, y un experto habitual en la técnica entiende fácilmente dónde pueden obtenerse tales reactivos. Selección de sustratos Los sustratos adecuados se caracterizan por ser relativamente no tóxicos para una célula de mamífero en
comparación con el análogo de base de purina escindido citotóxico. A continuación se enumeran algunos ejemplos ilustrativos de sustratos. Se incluyen abreviatura(s) común(es) después de algunos de los compuestos y separados por un punto y coma:
9-(-D-arabinofuranosil)-2-fluoroadenina; F-araA, fludarabina 9-(2-desoxi--D-ribofuranosil]-6-metilpurina; MeP-dR 9-(-D-ribofuranosil)-2-amino-6-cloro-1-deazapurina; ACDP-R 7-(-D-ribofuranosil)-3-deazaguanina 2-fluoro-2’-desoxiadenosina; F-dAdo 9-(5-desoxi--D-ribofuranosil)-6-metilpurina 2-fluoro-5’-desoxiadenosina 2-cloro-2’-desoxiadenosina; Cl-dAdo, cladribina 5’-amino-5’-desoxi-2-fluoroadenosina 9-(5-amino-5-desoxi--D-ribofuranosil)-6-metilpurina 9-(-D-ribofuranosil)-2-fluoroadenina 9-(2,3-didesoxi--D-ribofuranosil)-6-metilpurina 2’,3’-didesoxi-2-fluoroadenosina 9-(3-desoxi--D-ribofuranosil]-6-metilpurina 2-fluoro-3’-desoxiadenosina 9-(-L-lixofuranosil)-2-fluoroadenina 9-(-L-lixofuranosil)-6-metilpurina 9-(6-desoxi--D-alofuranosil)-6-metilpurina 9-(6-desoxi--D-alofuranosil)-2-fluoroadenina 9-(6-desoxi--L-talofuranosil)-6-metilpurina 9-(6-desoxi--L-talofuranosil)-2-fluoroadenina 9-(2,6-didesoxi--D-alofuranosil)-6-metilpurina 9-(2,6-didesoxi--D-alofuranosil)-2-fluoroadenina 9-(2,6-didesoxi--L-talofuranosil)-6-metilpurina 9-(2,6-didesoxi--L-talofuranosil)-2-fluoroadenina 9-(6,7-didesoxi--L-hept-6-inofuranosil)-6-metilpurina
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9-(6,7-didesoxi--L-hept-6-inofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(6,7-didesoxi--D-hept-6-inofuranosil)-6-metilpurina
9-(6,7-didesoxi--D-hept-6-inofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(2,6,7-tridesoxi--L-hept-6-inofuranosil)-6-metilpurina
9-(2,6,7-tridesoxi--L-hept-6-inofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(2,6,7-tridesoxi--D-hept-6-inofuranosil)-6-metilpurina
9-(2,6,7-tridesoxi--D-hept-6-inofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(2,3-didesoxi-3-hidroximetil--D-ribofuranosil)-6-tioguanina
9-(5,5-di-C-metil--D-ribofuranosil)-2-fluoro-adenina
9-(5,5-di-C-metil--D-ribofuranosil)-6-metilpurina
9-(5-desoxi-5-yodo--D-ribofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(5-desoxi-5-yodo--D-ribofuranosil)-6-metilpurina
9-(5-desoxi-5-metiltio--D-ribofuranosil)-2-fluoroadenina
9-(5-desoxi-5-metiltio--D-ribofuranosil)-6-metilpurina
Se encuentran ejemplos adicionales en Ichikawa E. y Kato K., Curr. Med. Chem. 2001 Mar; 8(4): 385-423.
Se aprecia que se esperaría que algunos sustratos se tolerasen mejor que otros. Por ejemplo, FaraA se escinda a una velocidad más rápida por Tv-PNP en comparación con otras enzimas conocidas de modo que se proporcionan mayores opciones terapéuticas.
Ejemplo 1: Síntesis de vectores de expresión de Tv-PNP
Se obtiene ADN genómico de T. vaginalis con un primer clon de ADN a partir de una cepa resistente a metronidazol
(R: CDC955) y un segundo clon de ADN a partir de una cepa sensible (S3: CDC520). Se amplifica el gen de TvPNP mediante PCR usando los siguientes cebadores a partir de ambas muestras usando AccuPrime Pfx supermix (Invitrogen). Los cebadores se diseñan basándose en la secuencia de TvPNP descargada de sitio web del proyecto del genoma de tricomonas TIGR. La secuencia está disponible actualmente en GenBank (XM_001323400). Los cebadores de Tv-PNP usados en el presente documento incluían los sitios de restricción entre paréntesis en los mismos: cebador directo TvPNP-F: 5’-GTTAACGGATCCATGGCAACACCCCATAACTCTGCT-3’ (HpaI y BamHI) (SEQ ID NO: 1). Cebadores inversos de Tv-PNP TvPNP-R: 5’-TCTAGAGTTAACGTCCTTATAATTTGATTGCTGCTTC-3’ (XbaI y HpaI) (SEQ ID NO: 2) y TvPNP-R1: 5’-ATAGTTTAGATCCGAGGACCAATCAT-3’ (SEQ ID NO. 3). La secuencia de nucleótidos de Tv-PNP silvestre se ilustra como SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos de Tv-PNP silvestre es SEQ ID NO: 5.
Se realiza la primera ronda de PCR usando los cebadores TvPNP-F y Tv-PNPR1. Entonces se realiza PCR anidada (segunda ronda) usando el producto de la PCR de primera ronda y los cebadores TvPNP-F y TvPNP-R. El producto de PCR se clona en el vector pCR4Blunt-Topo (Invitrogen) y se secuencia (ID de clon = pCR4 Blunt-TvPNP) tal como se representa en la figura 3. La cepa S contiene un cambio de base con respecto a la secuencia de TIGR, pero no cambia el codón Arg102 (CGC -> CGT). Puesto que el clon R coincide con la secuencia de TIGR, se usa el clon TvPNP(R) para la clonación adicional. Para generar adenovirus que expresan TvPNP, se digiere TvPNP(R) de la figura 3 con EcoRI y XbaI y se clona en los sitios EcoRI y XbaI del vector de transferencia de adenovirus pACCMV.pLpA. Se contransfecta el pACCMV-TvPNP tal como se representa en la figura 4 con pJM17 (Microbix) para obtener Ad-TvPNP recombinante por medio de recombinación homóloga en células 293. Se identifica el Ad-TvPNP resultante mediante PCR específica de Tv-PNP y ensayo de actividad de Tv-PNP.
Se usan dos vectores diferentes para generar virus Lenti-TvPNP. Se clona TvPNP(R) tal como se representa en la figura 3 en un vector pWPI modificado (originalmente de Addgene.org; que se modifica para contener más sitios de restricción para fin de clonación (pWPI-linker(+))). El vector pWPI expresa proteína fluorescente verde (EGFP) potenciada bajo el control del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Se aísla TvPNP(R) de pCR4Blunt-TvPNP usando PmeI y XbaI, luego se clona en los sitios SnaBI y SpeI del vector pWPI-linker(+) de la figura 5. PmeI y SnaBI cortan con extremos romos y XbaI y SpeI generan las mismas proyecciones.
Se clona TvPNP(R) por separado en el vector pHR’CMV Luc W Sin-18 (según J. Bio. Chem., publicado el 1 de octubre de 2004 como manuscrito M410370200) en lugar del gen de luciferasa para generar líneas celulares que expresan TvPNP sin coexpresar EGFP. Se aísla TvPNP(R) de pCR4Blunt-TvPNP usando BamHI y HpaI, luego se
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clona en los sitios BamHI y XhoI (con extremos romos usando el fragmento Klenow) del vector pHR’CMV Luc W Sin18 representado en la figura 6.
Ejemplo 2: Identificación de profármacos candidatos para enzimas Tv-PNP
El siguiente método es útil para identificar sustratos que se escinden más eficazmente por la Tv-PNP silvestre que por la PNP de E. coli silvestre u otras PNP. Los profármacos identificados mediante este método pueden evaluarse adicionalmente entonces en estudios en animales para la determinación de la toxicidad, adecuadamente para su administración con diversos portadores farmacéuticos, y otras propiedades farmacológicas.
El método mide cuantitativamente la escisión de sustratos in vitro. Se combinan los nucleósidos análogos de purina (0,1 mM en 500 l de HEPES 100 mM, pH 7,4, fosfato de potasio 50 mM) con Tv-PNP 100 g/ml o PNP de E. coli silvestre. Se incuban las mezclas de reacción a 25ºC durante 1 hora, y se detienen las reacciones sometiendo a ebullición cada muestra durante 2 minutos. La concentración de proteína y el tiempo de ensayo varían dependiendo de la actividad de la enzima para un sustrato particular. Cada muestra se analiza mediante HPLC de fase inversa para medir la conversión de sustrato en producto. Los análogos de nucleósido y purina se eluyen de una columna Spherisorb ODSI (5 m) (Keystone Scientific, Inc., State College, PA) con un disolvente que contiene dihidrogenofosfato de amonio 50 mM (95%) y acetonitrilo (5%). Se detectan los productos mediante absorbancia a 254 nm, y se identifican comparando sus tiempos de retención y espectros de absorción con muestras de control auténticas.
La tabla 1 muestra la actividad de la enzima PNP de E. coli silvestre en comparación con Tv-PNP silvestre en presencia de diversos sustratos. Se someten a prueba numerosos compuestos para determinar su eficacia como sustrato para Tv-PNP en comparación paralela con PNP de E. coli. Los compuestos incluyen diversos análogos de adenosina, de inosina, de MeP-dR y de adenosina sustituida con flúor o cloro. Se incuban las enzimas con 100 micromolar de cada compuesto enumerado en la tabla y se determina la velocidad de escisión enzimática mediante separación por HPLC de la base del nucleósido. Tal como se muestra en la tabla 1, Tv-PNP escinde F-araA a una velocidad (32.000 nanomoles por miligramo por hora) que es aproximadamente 23 veces la velocidad a la que PNP de E. coli escinde F-araA (1.250 nanomoles por miligramo por hora). El resultado se confirma además tal como se muestra en la figura 1 en que la eficacia catalítica de Tv-PNP con F-araA es 25 veces la eficacia catalítica de PNP de E. coli con FaraA (Vmáx/Km de 944 frente a 38). Se aprecia que una mayor actividad biológica de la enzima Tv-PNP permite una mayor actividad en la alteración del crecimiento celular anómalo cuando la Tv-PNP se usa para el tratamiento de estados patológicos usando F-araA como sustrato de profármaco. Puesto que se notifica que F-araA provoca respuestas completas en tumor que expresa enzima PNP de E. coli silvestre, un aumento de al menos 23 veces en la generación de F-Ade tóxica usando la combinación de Tv-PNP silvestre y F-araA conduce a una actividad antitumoral mejorada.
Se observa también a partir de la tabla 1 que Tv-PNP tiene mayores actividades hacia 2-Cl-2’-desoxiadenosina (CldAdo, cladribina) en comparación con PNP de E. coli. La Tv-PNP escinde Cl-dAdo a una actividad específica de
320.000 nanomoles por miligramo por hora mientras que la misma Cl-dAdo se escinde por E. coli a una actividad específica de sólo 39.000 nanomoles por miligramo por hora.
Tabla 1 Comparación de la actividad de sustratos de Tv-PNP y PNP de E. coli silvestre; un “-” representa ausencia
de escisión detectada.
Sustrato
PNP de T. vaginalis PNP de E. coli
Adenosina
501.000 398.000
9--D-arabinofuranosil-adenina
38.000 610
9--D-xilofuranosil-adenina
2 <2
3’-desoxiadenosina (cordicepina)
2.000 <2
2’,3’-didesoxiadenosina
640 <2
5’-desoxiadenosina
50.000 8.400
5’-amino-5’-desoxiadenosina
4.200 540
5’-carboxamida de adenosina
33 <1
9--D-piranosil-adenina 2’-Ometil-adenosina
2 <10 <1 <1
9--L-lixofuranosil-adenina
22.000 3.700
Inosina
154.000 342.000
2’-desoxiinosina
660.000 733.000
9--D-arabinofuranosil-hipoxantina
48 61
9--D-arabinofuranosil-guanina
16 310
7--D-ribosil-hipoxantina
2.300 5.200
7--D-ribosil-6-tioguanina
435 66
Guanosina
14.000 156.000
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9--D-ribofuranosil-6-metilpurina 155.000 96.000 9-[5-desoxi--D-ribofuranosil]-6-metilpurina 3.600 406 9-[2-desoxi--D-ribofuranosil]-6-metilpurina 484.000 528.000 9-[-D-arabinofuranosil]-6-metilpurina 570 14 9-[2-desoxi--D-ribofuranosil]-6-metilpurina <8 <1 9-[5-metil-(talo)--D-ribofuranosil]-6-metilpurina 8.400 915 9-[5-metil-(alo)--D-ribofuranosil]-6-metilpurina 223 47 9-[5-metil-(talo)-2-desoxi--D-ribofuranosil]-6-metilpurina 103.000 3.600 9-[5,5-dimetil--D-ribofuranosil]-6-metilpurina <8 <1 9--L-lixofuranosil-6-metilpurina 10.000 320 7-[2-desoxi--L-lixofuranosil]-6-metilpurina <8 <1 9-[5-desoxi--L-lixofuranosil]-6-metilpurina 246 20 9-[5-desoxi-5-yodo--L-lixofuranosil]-6-metilpurina <8 <1
2-F-2’-desoxiadenosina (F-dAdo) 400.000 435.000 2-F-adenosina 185.000 215.000 9--D-arabinofuranosil-2-F-adenina (fludarabina) 32.000 1.250 2-F-5’-desoxi-adenosina 50.000 29.000 9--L-lixofuranosil-2-F-adenina 28.200 7.800
2-Cl-2’-desoxiadenosina (Cl-dAdo) 352.000 39.000 2-Cl-2’-desoxiadenosina (-L) <8 <1 2-Cl-2’-desoxiadenosina (-L) <8 <1
Tv-PNP y PNP de E. coli silvestre son sustancialmente similares tanto en estructura como en funcionalidad. El presente descubrimiento y la cuantificación de que Tv-PNP y E. coli difieren enormemente en la eficacia de escisión de profármacos para dar compuestos citotóxicos es contradictoria con la comprensión convencional de que Tv-PNP no tiene actividad apreciable hacia F-araA (Wang et al., id.), indicando la novedad de esta observación.
Mediante este análisis, Tv-PNP tiene más actividad para fludarabina, cladribina, análogo de cordicepina, análogo de 2’,3’-didesoxiadenosina, 5’-metil(talo)-6-metilpurina-ribósido, 5’-metil(talo)-2’-desoxi-6-metilpurina-ribósido, 5’metil(alo)-6-metilpurina-ribósido, 2-F-5’-desoxiadenosina o 2-F--L-lixo-adenina en comparación con PNP de E. coli silvestre. Por tanto, estos sustratos son profármacos candidatos preferidos que pueden elegirse para evaluación adicional para su uso en los métodos y las composiciones descritos en el presente documento para tratar un estado patológico y en particular los profármacos disponibles comercialmente en calidad de USP.
Ejemplo 3: Comparación de la capacidad de diversos PNP para escindir MeP-dR y F-araA.
Se compara la actividad de escisión relativa de PNP de diversos orígenes para determinar la enzima óptima para la escisión de los importantes agentes quimioterápicos MeP-dR y F-araA mediante el procedimiento del ejemplo 2. Se incuban enzimas de diversas purezas con F-araA o MeP-dR 100 M y se determina la tasa de escisión midiendo la producción de producto (MeP o F-Ade) mediante HPLC tal como se describe en el ejemplo 2. Los resultados se proporcionan en la tabla 2.
Tabla 2
Organismo F-araA
MeP-dR nmoles/mg/h MeP-dR/F-araA PNP humana 35 <1 >35 PNP de T.vaginalis 536.000 30.000 18 PNP de E.coli 528.000 1.250 422 PNP de A.areogenes 6.638 10 464 PNP de A.Laidlawii 6.090 19 320 PNP de Klebsiella sp 11.432 32 357 PNP de Salmonella typhimurium 9.150 20 458 PNP de B. cereus 1.400.000 13.000 108 PNP de Tularemia 4.900 18 272 Hidrolasa de T. Bruceii 750 <1 >750 Mutante de PNP de E. Coli M65V 1823 3,9 469 tm-PNP 948 4,8 198
Ejemplo 4: Expresión de PNP de E. Coli con cola terminal de 30 residuos (tm-PNP) y escisión de profármaco
Se clonó una secuencia de nucleótidos derivada de PNP de E. coli silvestre correspondiente a 2.134 bases de nucleótido en los sitios EcoRI y XbaI del vector de transferencia de adenovirus pACCMV.plpA. Esta secuencia varía con respecto a PNP de E. coli silvestre en que carece de una base de adenosina que por lo demás está presente

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